ES2207812T3 - Procedimiento para la purificacion o el fraccionamiento de factor won willebrand (vwf) y preparados para su obtencion. - Google Patents
Procedimiento para la purificacion o el fraccionamiento de factor won willebrand (vwf) y preparados para su obtencion.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un procedimiento de purificación y de fraccionamiento cromatográfico del factor Willebrand (vWF) contenido en un material de partida, que incluye las siguientes etapas: absorción del contenido vWF de un material de partida con avidez de colágeno inmovilizado sobre un portador, separación de la parte no absorbida y lavado opcional del portador, elución del vWF del colágeno inmovilizado; y extracción del vWF purificado. La invención también se refiere a la preparación farmacéutica que incluye un vWF biológicamente activo que está unido de forma estable al colágeno.
Description
Procedimiento para la purificación o el
fraccionamiento de factor von Willebrand (vWF) y preparados para su
obtención.
La invención se refiere a un procedimiento para
la purificación cromatográfica o el fraccionamiento de factor von
Willebrand (vWF) de un material de partida con contenido de
vWF.
El vWF tiene una importancia especial en la
hemostasia fisiológica. Además de su función como proteína
portadora para el factor VIII, esta proteína plasmática es
necesaria sobre todo para la adhesión de trombocitos al
endotelio/subendotelio dañado y para la aglomeración de los
trombocitos bajo condiciones de esfuerzo de cizallamiento. En el
primer paso de la hemostasia primaria, la adhesión, el vWF actúa
como elemento de enlace entre receptores específicos de la
superficie de los trombocitos, como gpIb, complejo gpIIb/IIIa, y
componentes del endotelio, por ejemplo colágeno.
De acuerdo con el documento EP 0 503 991 A, a
partir de plasma previamente purificado se obtiene vWF purificado
mediante una combinación de tres pasos de purificación
cromatográfica. Estos pasos de purificación cromatográfica incluyen
una cromatografía doble en un intercambiador de iones y, como tercer
paso, una purificación cromatográfica de afinidad en
gelatina-sefarosa. Se comprobó que en la
cromatografía en gelatina-sefarosa se unen proteínas
contaminantes, como por ejemplo fibronectina, y el vWF se puede
obtener en el eluato.
Fischer et al. (Thromb. Res. 84 (1) (1996),
55-66) describieron la purificación de vWF mediante
una cromatografía en
fractogel-EMD-TMAE con cromatografía
subsiguiente en
heparina-fractogel-EMD. El colágeno
es un compañero de enlace fisiológico del vWF. Los estudios de
Kessler et al. (Blood 63 (6) (1984), 1291-1298)
mostraron que el complejo de vWF y factor VIII se une a fibrillas de
colágeno, pero no a colágeno desnaturalizado. Este resultado ha
sido confirmado en varias ocasiones, por ejemplo por Santoro et al.
(Collagen Rel. Res. 2 (1982), 31-43), que
comprobaron que sólo el colágeno nativo y no un colágeno
desnaturalizado representa un compañero de enlace para el vWF (véase
también Santoro, Thromb. Res.. 21 (1981), 689-693,
y BBA 756 (1983), 123-126; confirmado también
mediante el documento EP 0 503 991 A, dado que el vWF pasó sin
impedimento la columna de gelatina-sefarosa). Se
comprobó que las formas de alto peso molecular del vWF se unían
mediante bajas concentraciones de colágeno limitativas. Las formas
de peso molecular alto y medio del vWF también se unieron mediante
altas concentraciones de colágeno no limitativas, mientras que la
fracción de bajo peso molecular del vWF no se unió ni siquiera en
caso de altas concentraciones de colágeno (Santoro (1983)). En el
documento EP 0 023 607 se describe la separación de factor VIII:C,
factor VIII R:AG y vWF de plasma mediante mezcla con una solución de
colágeno.
Este también fue el motivo de que en los métodos
de ensayo basados en la unión de vWF-colágeno
siempre se utilizara colágeno nativo y que dicho carácter nativo
también se conservara en el ensayo, no describiéndose en dichos
ensayos de unión condiciones desnaturalizantes o enlaces fuertes o
covalentes del colágeno a un soporte sólido (Brown et al., Thromb.
Res. 43 (1985), 303-311). Si bien la unión de
colágeno a vWF se ha descrito extensamente e incluso se ha propuesto
incorporar esta unión de vWF a colágeno nativo en un método de
purificación de vWF (Santoro et al. (1982)), hasta el momento no se
ha podido poner a disposición ningún procedimiento preparatorio
adecuado basado en la unión de colágeno-vWF. Esto se
ha debido, por una parte, a que los materiales de cromatografía
basados en colágeno (como por ejemplo
gelatina-sefarosa) han demostrado ser inadecuados
para la unión de vWF y, por otra, a que las fibrillas de colágeno
no son adecuadas para la obtención preparatoria del vWF (véase
Santoro et al., 1982).
El objetivo de la presente invención consiste en
poner a disposición, a pesar de estos inconvenientes, un
procedimiento para purificar o fraccionar vWF, que se base en la
unión fisiológica de vWF a colágeno y, no obstante, sea aplicable a
escala industrial y posibilite la obtención de una alta proporción
de vWF fisiológicamente activo.
Este objetivo se resuelve según la invención
mediante un procedimiento del tipo indicado en la introducción, que
presenta los siguientes pasos:
- -
- adsorción del vWF del material de partida en un colágeno inmovilizado en un soporte, exceptuando gelanina-sefarosa, seleccionándose el colágeno entre colágeno nativo, un derivado de colágeno, en particular colágeno procesado enzimáticamente, o un fragmento de colágeno, sin menoscabar la propiedad de unión del colágeno con respecto al vWF;
- -
- separación de la proporción no absorbida y en caso dado lavado el soporte;
- -
- elución del vWF del colágeno inmovilizado; y
- -
- obtención del vWF purificado.
El colágeno utilizado según la invención es un
colágeno ávido con una gran capacidad de unión con respecto al vWF.
Se caracteriza principalmente por un gran número de sitios de unión
accesibles para el vWF. Los criterios para la selección de un
colágeno adecuado son múltiples. Por una parte se puede partir de un
material que ya posea de forma conocida capacidades de unión
adecuadas y que, en caso dado, se procesa para aumentar la
estabilidad. Pero el procesamiento también se puede realizar para
aumentar u homogeneizar la superficie del colágeno inmovilizado, lo
que es una condición previa para la dimensión reproducible de la
adsorción de vWF. Sorprendentemente, a diferencia de las
investigaciones del estado actual de la técnica, la avidez del
colágeno se ha podido aprovechar en caso de colágeno inmovilizado,
aunque la inmovilización produce forzosamente una desnaturalización
de la molécula de colágeno, en particular cuando la inmovilización
tiene lugar mediante enlace covalente y mediante fuerzas de
interacción grandes.
La inmovilización del colágeno al soporte sólido
puede tener lugar directa o indirectamente, por ejemplo a través de
distanciadores (denominados "spacer"). De este modo se evitan
en gran medida los problemas que se podrían producir a causa del
impedimento estérico de los soportes y los ligandos a inmovilizar.
Como distanciadores se utilizan por ejemplo sustancias reticulantes
homo-bifuncionales o
hetero-bifuncionales, como
hexametilén-diamina, 3,3'-
diamino-propil-amina, ácido 6-amino-hexanoico o el reactivo SPDP hetero-bifuncional de la firma Pharmacia (Uppsala, Suecia).
diamino-propil-amina, ácido 6-amino-hexanoico o el reactivo SPDP hetero-bifuncional de la firma Pharmacia (Uppsala, Suecia).
En una forma de realización preferente, el
material de soporte se activa previamente mediante métodos usuales,
por ejemplo mediante tratamiento con carbodiimida o anhídrido de
ácido maleico.
Sorprendentemente se comprobó que el vWF, a pesar
de la unión del colágeno con el soporte sólido, posibilitaba una
unión suficiente mediante una fuerte interacción no covalente o
mediante un enlace covalente. Esto resultó sorprendente en
particular teniendo en cuenta los resultados de Santoro et al. y
también del documento EP 0 503 991 A1, dado que en dichas
investigaciones se comprobó de forma coincidente que el vWF no se
unía a colágeno desnaturalizado.
La presencia de este enlace fuerte covalente o no
covalente se puede confirmar por ejemplo mediante el ensayo
descrito a continuación: El colágeno inmovilizado en un soporte
sólido, que en caso dado ha absorbido vWF, se trata con 0,4 mol/l
de NaOH durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después se
determina el contenido de colágeno o vWF del material tratado con
NaOH y del material no tratado, y a partir de la diferencia de los
dos valores se calcula la pérdida de colágeno unido y en caso dado
vWF o la disminución de la capacidad de unión con respecto al vWF.
El colágeno inmovilizado utilizado según la invención está presente
cuando la pérdida de colágeno o vWF después del tratamiento con NaOH
no es superior al 20%, preferentemente no superior al 10%.
Se ha comprobado que con el procedimiento según
la invención no sólo se puede obtener vWF con un gran rendimiento,
sino también fracciones de vWF con actividades de unión muy bien
definidas. Por consiguiente, el vWF se obtiene preferentemente en
más de una fracción, conteniendo dichas fracciones vWF con
actividades diferentes, principalmente con actividades de unión de
colágeno diferentes. Sorprendentemente se ha comprobado que en el
procedimiento según la invención el vWF no se fracciona
exclusivamente en función del peso molecular. No obstante, las
fracciones de vWF de alta actividad son habitualmente aquellas que
contienen esencialmente vWF con una proporción de alto peso
molecular, en particular multímeros de vWF de alto peso molecular
con integridad estructural elevada.
Estas fracciones diferentes se pueden obtener por
ejemplo aumentando la intensidad iónica o la intensidad de elución
(pH, caotropismo) en la elución. Preferentemente, el vWF se obtiene
en una primera fracción y como mínimo en una segunda fracción,
realizando la elución de la segunda fracción ventajosamente con una
solución que presenta una intensidad iónica como mínimo un 20%
superior a la de la solución de elución para la primera
fracción.
La elución se lleva a cabo por ejemplo como
elución de gradiente. Preferentemente se obtiene una primera
fracción en la que el vWF presenta una actividad de unión de
colágeno inferior a 0,4 E vWF:CB/E vWF:Ag, o una segunda fracción
en la que el vWF presenta una actividad de unión de colágeno
superior a 0,6 E vWF:CB/E vWF:Ag.
Se ha comprobado que la elución del vWF con el
procedimiento según la invención se puede llevar a cabo con un
tampón con una intensidad iónica correspondiente a una
concentración de cloruro sódico de como mínimo 150 mM, en particular
correspondiente a una concentración de NaCl entre 150 mM y 400
mM.
De acuerdo con otra variante de procedimiento
preferente, la elución del vWF se lleva a cabo con un tampón con
una intensidad iónica correspondiente a una concentración de NaCl
inferior a 200 mM, en particular correspondiente a una concentración
de NaCl entre 50 mM y 150 mM, preferentemente en un medio con
intensidad iónica fisiológica.
De acuerdo con la invención, mediante la elución
bajo condiciones fisiológicas se puede mantener la estructura
nativa del vWF en una medida muy superior, lo que no sólo
posibilita preparados de vWF más uniformes, sino que también
garantiza unas reacciones secundarias mínimas, por ejemplo por
neoantígenos, en la administración de un preparado de vWF de este
tipo a seres humanos.
En otra forma de realización preferente, el
tampón contiene iones de Ca^{2+}. El contenido de iones de
Ca^{2+} en el tampón es por ejemplo inferior a 10 mM,
preferentemente inferior a 5 mM, de modo que el colágeno
inmovilizado absorbe complejo de factor VIII-vWF.
En caso dado, el contenido de iones de Ca^{2+} se puede aumentar
durante la elución a 150 - 200 mM para disociar el complejo y
obtener vWF del mismo.
El tampón de elución presenta preferentemente un
valor pH de 5 a 9. No obstante, se ha comprobado que también
resulta ventajoso un tampón con un pH de 3 a 4, en particular con
una intensidad iónica de NaCl 150 mM. El tampón de elución también
incluye preferentemente sales caotrópicas, en particular tiocianato
amónico y/o tiocianato potásico, siendo especialmente preferente una
concentración de 1 a 3 M.
Dado que la fibronectina presenta igualmente una
afinidad por el colágeno, pero también por el colágeno
desnaturalizado (véase el documento EP 0 503 991 A1), de acuerdo
con el procedimiento según la invención también es posible obtener
fibronectina de forma preparatoria en otra fracción. Por
consiguiente, el procedimiento según la invención también es
adecuado para la purificación cromatográfica de fibronectina.
Como material de partida para el procedimiento
según la invención se puede utilizar cualquier solución que
contenga vWF. Principalmente, el material de partida con contenido
de vWF consiste en plasma humano, una fracción de plasma o un
cultivo celular. Sin embargo, preferentemente se utiliza un
concentrado de vWF o un preparado comercialmente disponible con
contenido de complejo de factor VIII/vWF.
Preferentemente, antes del paso de adsorción en
colágeno inmovilizado según la invención se lleva a cabo una
purificación previa del material de partida con contenido de vWF.
Para ello son especialmente adecuados los procedimientos ya
descritos en el estado actual de la técnica de la cromatografía por
intercambio de iones, la cromatografía de filtración en gel y/o una
precipitación, preferentemente una precipitación con glicina o
sulfato amónico.
En una forma de realización preferente, el
procedimiento según la invención es adecuado como procedimiento de
purificación terminal. De este modo se simplifica la formulación
como preparado farmacéutico, dado que, a causa de la intensidad
iónica fisiológica (0,13-0,16 M) o la osmolalidad
fisiológica (240-350, preferentemente 275 mOs/kg)
del medio utilizado, para la elución no se requiere ningún paso de
purificación adicional. Este procedimiento resulta particularmente
ventajoso con respecto a la cromatografía de afinidad inmune, dado
que en este caso es absolutamente necesario llevar a cabo pasos de
purificación adicionales debido al posible sangrado de
inmunoglobulina.
Se ha comprobado que de acuerdo con la invención
se puede utilizar toda una serie de tipos de colágeno, en
particular colágeno de tipo I o de tipo III (véase, por ejemplo,
Hörmann H., Hämostaseologie 1990, 10; 138-46).
Precisamente la gelatina-sefarosa obtenible
comercialmente ha demostrado ser inadecuada (véase por ejemplo el
documento EP 0 503 991 A1) para el procedimiento según la
invención, si bien en el procedimiento según la invención se pueden
emplear sin problemas otras colágeno-sefarosas
comercialmente disponible, por ejemplo
colágeno-agarosa de Sigma.
Como colágeno se utiliza bien colágeno de origen
humano o un colágeno lo más alejado posible del colágeno humano,
por ejemplo procedente de cerdo, vacuno, rata o caballo.
El soporte de colágeno es preferentemente un
material de cromatografía al que se une el colágeno de forma
covalente para que el procedimiento según la invención se pueda
utilizar principalmente a escala industrial.
Preferentemente, el colágeno utilizado según la
invención presenta una modificación mediante la cual se forma una
inmovilización estable en el soporte sólido. Evidentemente, en este
caso no se ha de menoscabar la propiedad de unión de la proteína a
purificar. Esta modificación puede consistir por ejemplo en prever
la presencia de grupos aldehído reactivos en la molécula de
colágeno.
Sorprendentemente se ha comprobado que en el
presente procedimiento también se puede utilizar colágeno procesado
si la avidez del colágeno se mantiene esencialmente intacta con el
procesamiento. El colágeno ávido que se puede utilizar según la
invención se deriva preferentemente de colágeno de bajo peso
molecular, de colágeno procesado proteolíticamente, por ejemplo
digerido con pepsina, desintegrado u homegeneizado. El colágeno
también puede estar tratado o modificado (derivado) químicamente. De
acuerdo con la invención también se pueden utilizar fragmentos de
colágeno. Ventajosamente se utiliza colágeno nativo o un derivado
de colágeno, por ejemplo un péptido derivado de colágeno. En una
forma de realización preferente, el vWF y/o el colágeno se tratan
para la inactivación y/o el empobrecimiento de patógenos, en
particular virus.
Para la inactivación de virus se conoce una serie
de métodos físicos, químicos o químico-físicos que
incluyen, por ejemplo, un tratamiento térmico, por ejemplo de
acuerdo con el documento EP-0 159 311 A o el
documento EP-0 637 451 A, un tratamiento con
hidrolasa según el documento EP-0 247 998 A, un
tratamiento por radiación o un tratamiento con disolventes
orgánicos y/o agentes tensioactivos, por ejemplo de acuerdo con el
documento EP-0 131 740 A. En el documento
EP-0 506 651 A o en el documento
WO-94/13329-A se describen otros
pasos de inactivación de virus adecuados para la producción de los
preparados según la invención.
Los procesos para la inactivación o el
empobrecimiento de virus también pueden incluir un proceso de
filtración, por ejemplo una filtración de lecho profundo,
ultrafiltración o nanofiltración. Además del vWF, el colágeno
también se puede tratar correspondientemente solo o junto con el
vWF, por ejemplo el colágeno se puede someter a tratamiento
térmico.
Si el material de partida con contenido de vWF se
trata por ejemplo mediante la adición de un detergente, este
material de partida con contenido de detergente también se puede
absorber directamente en el colágeno inmovilizado. De este modo,
la capacidad de unión del colágeno con respecto al vWF se puede
incluso aumentar. De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención se refiere a un preparado para la producción de un vWF
purificado que incluye vWF biológicamente activo unido a colágeno
inmovilizado, así como a un preparado farmacéutico que incluye vWF
biológicamente activo unido de forma estable a colágeno.
Una forma de realización especial de los
preparados según la invención se caracteriza porque el vWF presenta
una actividad hemostática primaria expresada mediante una actividad
de unión de colágeno de como mínimo 0,9 E vWF:CB/E
vWF-antígeno, preferentemente como mínimo 1 E
vWF:CB/E vWF-antígeno, y una pureza de como mínimo
70 E vWF-antígeno/mg de proteína, preferentemente
como mínimo 80 E vWF-antígeno/mg de proteína. Este
tipo de preparados de vWF se pueden producir ventajosamente con el
procedimiento según la invención, pero no están limitados a
éste.
Ventajosamente, el vWF de los preparados según la
invención presenta una actividad hemostática primaria, expresada en
unidades de cofactor de ristocetina (E vWF:RCo) por unidad de
vWF:Ag, de como mínimo 0,3, preferentemente como mínimo 0,4, en
particular como mínimo 0,6. Además, el vWF de acuerdo con los
preparados según la invención debería presentar capacidad de unión
de factor VIII.
De acuerdo con otras formas de realización
ventajosas, los preparados según la invención contienen un
preparado de vWF que está libre de proteínas plasmáticas, o un vWF
que se encuentra en forma de complejo de factor
VIII-vWF.
Ventajosamente, el colágeno de los preparados
según la invención está inmovilizado en un soporte sólido que se
puede seleccionar entre el grupo formado por partículas de
colágeno, material de soporte sintético, material a base de
hidratos de carbono, fosfolípido y liposoma. También entran en
consideración materiales inorgánicos, como por ejemplo los
compuestos de hidróxidos metálicos usuales como adyuvantes. Las
partículas de colágeno pueden ser de naturaleza globular, pero
también puede estar formado por cadenas, fibrillas o fibras. Como
soporte sólido también se puede utilizar colágeno de por sí, siempre
que esté procesado de tal modo - como se ya se ha indicado
anteriormente - que sea adecuado como soporte.
Las posibilidades de utilización médica adecuada
incluyen la utilización del preparado según la invención para
producir un preparado para el tratamiento de la hemofilia A y de
enfermedades que acompañan a una deficiencia congénita o adquirida
de vWF. Estas enfermedades se han de incluir bajo el concepto de los
trastornos funcionales del vWF.
Mediante la preparación de vWF en forma unida a
colágeno se pone a disposición un medicamento fisiológico que in
vivo imita por ejemplo un vWF unido a trombocitos. Por
consiguiente, las posibilidades de aplicación especiales también
incluyen todas aquellas funciones fisiológicas en los que la unión
de vWF a superficies de trombocitos está perturbada o en las que se
requiere una actividad adicional de este tipo.
El preparado farmacéutico se pone a disposición
ventajosamente en forma liofilizada, en particular cuando esté
previsto su almacenamiento durante un tiempo determinado.
El preparado farmacéutico se encuentra
preferentemente en una forma adecuada para la administración por
vía parenteral (por ejemplo i.v., i.m. o s.c.), mucosa (por ejemplo
oral) o tópica (por ejemplo en forma de pomada). Por ejemplo se
pone a disposición como una suspensión o solución.
La formulación del preparado utilizado según la
invención puede tener lugar de forma habitual y conocida en sí, por
ejemplo con ayuda de sales y en caso dado aminoácidos, pero también
se puede llevar a cabo en presencia de agentes tensioactivos.
Preferentemente se utilizan sales, como por ejemplo cloruro sódico
o cloruro de calcio, y se elige un pH entre 6 y 8. Como aminoácidos
son preferentes la glicina o la lisina. También se puede elegir un
tampón farmacéuticamente aceptable.
La dosis a administrar depende principalmente de
la enfermedad a tratar y corresponde esencialmente a las cantidades
administradas para los preparados de vWF o de complejo de factor
VIII-vWF.
Principalmente gracias al colágeno presente se
logra un ventajoso efecto de depósito o de larga duración del
preparado farmacéutico según la invención.
Convenientemente, los preparados según la
invención también están tratados para la inactivación de los
patógenos eventualmente presentes, en particular virus.
La presente invención se explica más
detalladamente mediante los siguientes ejemplos y las figuras de
los dibujos, sin por ello limitarla a los mismos.
La figura 1 muestra el cromatograma para la
purificación por cromatografía de afinidad de vWF a través de
colágeno-agarosa.
Un concentrado de complejo de factor
VIII-vWF, preparado de acuerdo con la AT 391 808,
que contenía factor von Willebrand en una concentración de 260 E/ml
vWF:Ag y una actividad específica de 13,5 E vWF:Ag/mg de proteína,
se diluyó con 20 mmol/l de tampón tris, pH 7,4 (= tampón A), a una
concentración de vWF de 6 E/ml vWF:Ag. En una columna de afinidad
(1,0 x 4,0 cm), rellenada con colágeno-agarosa
(Sigma C-0286), se cargaron 20 ml de la solución
obtenida. Después de lavar la columna con 10 ml del tampón A, se
efectuó una elución con NaCl. Para ello se aplicó un gradiente
lineal de 0 a 1 mol/l de NaCl en tampón A sobre 30 ml. Después se
lavó de nuevo con 10 ml de tampón B (20 mmol/l tris, 1 mol/l NaCl,
pH 7,4). Toda la cromatografía se llevó a cabo con un caudal de 1
ml/min. Se recogieron fracciones de 1 ml y se determinó su densidad
óptica a 280 nm. Se determinó el contenido de antígeno de vWF de
todas las fracciones con ayuda de un ELISA (ASSERACHROM vWF, de la
firma Boehringer, Mannheim). Las mediciones mostraron que en el
recorrido no se pudo detectar ningún vWF en el ensayo de antígeno y
que se había unido una cantidad de antígeno de vWF de 40 E por ml
de colágeno agarosa. El factor von Willebrand se eluyó con una
concentración de sal común de 100 mmol/l. El diagrama de elución
está representado en la figura 1: Según la determinación del
contenido proteínico con ayuda del ensayo Bradford (Anal. Biochem.
72, 248-254, 1976) en el valor máximo de
elución resultó una pureza del vWF de 85 E vWF:Ag/mg de proteína.
Para la actividad del vWF se obtuvieron valores de 0,47 E vWF:RCo/E
vWF:Ag y 0,45 E vWF:CB/E vWF:Ag.
Un concentrado de vWF altamente purificado según
el documento EP 0 567 448, que contenía factor von Willebrand en
una concentración de 105 E/ml vWF:Ag y una actividad específica de
60 E vWF:Ag/mg de proteína, se diluyó con 20 mmol/l de tampón tris,
pH 7,4 (= tampón A), a una concentración de vWF de 4 E/ml vWF:Ag.
En una columna de afinidad (1,0 x 4,0 cm), rellenada con
colágeno-agarosa (Sigma C-0286), se
cargaron 20 ml de la solución obtenida. Después de lavar la columna
con 10 ml del tampón A, se efectuó una elución con gradiente
escalonado de NaCl. Para ello, la columna se sometió a elución con
10 ml en cada caso de tampón B (0,15 mol/l de NaCl en tampón A),
tampón C (0,3 mol/l de NaCl en tampón A), tampón D (0,5 mol/l de
NaCl en tampón A) y tampón E (1 mol/l de NaCl en tampón A). El
tampón E sirve para regenerar la columna. Toda la cromatografía se
llevó a cabo con un caudal de 1 ml/min. Se recogieron fracciones de
1 ml y se determinó su densidad óptica a 280 nm. Se determinó el
contenido de antígeno de vWF de todas las fracciones con ayuda de
un ELISA (ASSERACHROM vWF, de la firma Boehringer, Mannheim). Las
mediciones mostraron que se había unido una cantidad de antígeno de
23 E por ml de colágeno-agarosa y que en el
recorrido se había eluido una cantidad de antígeno en 3 E en total.
El factor von Willebrand se eluyó de la columna con los tampones B,
C y D y presentaba una pureza de 75 E vWF:antígeno/mg de proteína.
En los diferentes eluatos se determinaron las siguientes
actividades:
| Actividad | ||
| E vWF:RCo/E vWF:Ag | E vWF:CB/E vWF:Ag | |
| Eluato tampón B: | 0,41 | 0,46 |
| Eluato tampón C: | 0,68 | 0,70 |
| Eluato tampón D: | 0,91 | 0,87 |
Para aislar un complejo de factor
VIII-vWF, un crioprecipitado, preparado según Pool
et al. (N. Engl. J. Med. 273, 1443-1447,
1965), se disolvió en 20 mmol/l de tampón tris, pH 7,4. En una
columna rellenada con colágeno-agarosa se cargaron
10 ml de una solución que contenía 6 E vWF:Ag/ml y 5,5 E/ml de
factor VIII:c (IMMUNOCHROM F VIII:c-Test, de la
firma Immuno). La cromatografía de afinidad se llevó a cabo
análogamente al Ejemplo 1. Se determinó el contenido de antígeno de
factor von Willebrand y de factor VIII:c de cada fracción. El factor
von Willebrand se eluyó de la columna en el complejo junto con
factor VIII:c con una concentración de sal común de 100 mmol/l.
Para preparar un concentrado de factor von
Willebrand altamente purificado para uso farmacéutico se llevó a
cabo una purificación por cromatografía de afinidad según el
Ejemplo 1. La aplicación de las muestras en la columna de afinidad
tuvo lugar en 20 mmol/l de tampón de citrato sódico, pH 7,3. Se
recogieron las fracciones con una actividad específica superior a
70 E vWF:Ag/mg de proteína, se estabilizaron mediante adición de 5
g de glicina y 5 g de L-lisina por litro, se ajustó
un valor pH de 7,0 con 0,1 mol/l NaOH y a continuación se
liofilizaron. Después de reconstituirlo con H_{2}O, en este
preparado se determinó una osmolalidad (Pharmak. Europ. 2ª Ed.
V.6.25) de 350 mOsmol/kg
H_{2}O.
H_{2}O.
Para preparar una resina de afinidad con colágeno
inmovilizado de forma covalente, 25 mg de colágeno de tipo soluble
en ácido de placenta humana (Sigma C-4407) se
disolvieron en 10 ml de ácido acético 0,1 M a 4ºC y la solución se
agitó cuidadosamente durante más de 6 h a dicha temperatura. Después
se filtró por un filtro con un diámetro de poro de 0,4 \mum, el
filtrado se añadió a una suspensión de 5 ml de
ECH-Sepharose® 4B (Pharmacia) y se ajustó un valor
pH de 4,5 mediante adición de 0,1 mol/l de NaOH. A una temperatura
de 4ºC y a lo largo de 2 horas se añadieron en porciones de 30 mg un
total de 300 mg de clorohidrato de
1-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida
(EDC/firma Pierce) bajo agitación continua empleando una barra
agitadora accionada por electromotor. A continuación, la mezcla se
agitó durante otras 6 horas a 4ºC. El valor pH se controló durante
todo el tiempo de reacción con ayuda de un electrodo de pH y se
mantuvo en un intervalo de 4,5 a 5,0 mediante la adición de 0,1
mol/l de NaOH. El gel de afinidad así preparado se lavó primero con
20 ml de tampón de acetato sódico (0,1 mol/l acetato, 0,5 mol/l
NaCl, pH 4,3) y con 20 ml de tampón tris (0,1 mol/l tris, 0,5 mol/l
NaCl, pH 7,8) a temperatura ambiente y este proceso se repitió dos
veces. Después de lavar el gel con H_{2}O y con el sistema tampón
utilizado en la cromatografía de afinidad subsiguiente para unir el
vWF se utilizó el gel tal como se describe en los Ejemplos 1 a 4
para la purificación de vWF.
Un colágeno humano de tipo III se disolvió a 5
mg/ml en ácido acético 500 mM a 4ºC y a continuación se diluyó con
agua a 1 mg/ml. El colágeno disuelto se almacenó a -20ºC.
Para la modificación química, el colágeno del
Ejemplo 6 a) se diluyó a 10 \mug/ml en tampón de acetato de Na 10
mM, pH 4. Después se añadieron 32 mg de NaIO_{4} a 10 ml de esta
solución y la reacción se llevó a cabo durante 0,5 horas a
temperatura ambiente. Esta reacción resulta en una modificación
química con formación de grupos aldehído reactivos en la molécula de
colágeno.
Un colágeno humano se activó con peryodato de Na
de acuerdo con el Ejemplo 6 b). El colágeno activado se acopló de
forma covalente con un soporte con contenido de grupos amino,
adipina-hidrazida-sefarosa (de la
firma Pharmacia) a través de la proporción de hidrato de carbono del
colágeno y el grupo amino del soporte.
Para purificar el vWF, 10 ml de una solución con
contenido de vWF con una actividad inicial de vWF de 900 mU/ml
vWF:RistoCoF se pusieron en contacto con el soporte consistente en
colágeno-ácido
adípico-hidrazida-sefarosa, y el vWF
se unión al soporte. Las proteínas no unidas se retiraron del
soporte mediante lavado con un tampón que contenía tris/HCl 50 mM,
pH 7,4, NaCl 150 mM. El vWF se eluyó del soporte con un tampón que
contenía tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, KSCN 1,5 M. El eluato se
ensayó en cuanto a la actividad de vWF. La actividad de vWF en el
eluato era de 1.500 mU/ml vWF:RistoCof. El análisis electroforético
en gel muestra que el eluato contiene principalmente multímeros de
vWF de alto peso molecular.
Claims (30)
1. Procedimiento para la purificación
cromatográfica o el fraccionamiento de factor von Willebrand (vWF)
a partir de un material de partida con contenido de vWF, que
incluye los siguientes pasos:
- -
- adsorción del vWF del material de partida en un colágeno inmovilizado en un soporte, exceptuando gelanina-sefarosa, seleccionándose el colágeno entre colágeno nativo, un derivado de colágeno, en particular colágeno procesado enzimáticamente, o un fragmento de colágeno, sin menoscabar la propiedad de unión del colágeno con respecto al vWF;
- -
- separación de la proporción no absorbida y en caso dado lavado el soporte;
- -
- elución del vWF del colágeno inmovilizado; y
- -
- obtención del vWF purificado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el vWF se obtiene en más de una
fracción.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el vWF se obtiene en una primera
fracción y como mínimo en una segunda fracción, realizando la
elución de la segunda fracción con una solución que presenta una
intensidad iónica como mínimo un 20% superior a la de la solución de
elución para la primera fracción.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la elución se
lleva a cabo como elución de gradiente.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se obtiene una
primera fracción en la que el vWF presenta una actividad de unión
de colágeno inferior a 0,4 E vWF:CB/E vWF:Ag, o una segunda fracción
en la que el vWF presenta una actividad de unión de colágeno
superior a 0,6 E vWF:CB/E vWF:Ag.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la elución de
la segunda fracción se lleva a cabo con un tampón con una
intensidad iónica correspondiente a una concentración de NaCl de
como mínimo 150 mmol/l, en particular correspondiente a una
concentración de NaCl entre 150 y 400 mmol/l.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la elución de
la primera fracción se lleva a cabo con un tampón con una
intensidad iónica correspondiente a una concentración de NaCl
inferior a 200 mmol/l, en particular correspondiente a una
concentración de NaCl entre 50 y 150 mmol/l, preferentemente en un
medio con intensidad iónica fisiológica.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en otra
fracción se obtiene fibronectina.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el material de
partida con contenido de vWF es un concentrado de vWF o un
preparado con contenido de complejo de factor
VIII-vWF.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque antes del paso
de adsorción en colágeno inmovilizado se lleva a cabo una
purificación previa del material de partida con contenido de vWF, en
particular una cromatografía por intercambio de iones, una
cromatografía de filtración en gel y/o una precipitación,
preferentemente una precipitación con glicina o sulfato
amónico.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el vWF
purificado se obtiene en un medio con intensidad iónica fisiológica
u osmolalidad fisiológica y se procesa en un preparado farmacéutico
sin pasos de purificación adicionales.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el colágeno es
un colágeno de tipo I o un colágeno de tipo III.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se utiliza un
colágeno de origen humano o de cerdo, vacuno, rata o caballo.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el colágeno
presenta como mínimo una modificación mediante la cual se forma una
inmovilización estable en el soporte sólido.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque la modificación del colágeno consiste
en la formación de grupos aldehído reactivos.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque como soporte
se utiliza un material de cromatografía en el que el colágeno está
unido preferentemente de forma covalente.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13 y 16, caracterizado porque el
soporte incluye colágeno procesado.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, 16 y 17, caracterizado porque el
vWF y/o el colágeno están tratados para la inactivación y/o el
empobrecimiento de patógenos, en particular virus.
19. Procedimiento según la reivindicación 14 ó
15, caracterizado porque la elución del vWF se lleva a cabo
con un tampón con un valor pH entre 5 y 9.
20. Procedimiento según la reivindicación 19,
caracterizado porque la elución del vWF se lleva a cabo con
un tampón con un valor pH entre 3 y 4.
21. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 14, 15, 19 ó 20, caracterizado porque la
elución del vWF se lleva a cabo con un tampón que contiene una sal
caotrópica, preferentemente tiocianato amónico y/o potásico,
presentando la sal caotrópica preferentemente una concentración
entre 1 y 3 M.
22. Preparado para la producción de un vWF
purificado que incluye vWF biológicamente activo, que está unido a
colágeno inmovilizado.
23. Preparado según la reivindicación 22,
caracterizado porque el vWF presenta una actividad
hemostática primaria expresada mediante una actividad de unión de
colágeno de como mínimo 0,9 E vWF:CB/E vWF-Ag,
preferentemente como mínimo 1 E vWF:CB/E vWF-Ag, y
una pureza de como mínimo 70 E vWF-Ag/mg de
proteína, preferentemente como mínimo 80 E vWF-Ag/mg
de proteína.
24. Preparado según la reivindicación 22 ó 23,
caracterizado porque el vWF presenta una actividad
hemostática primaria expresada en E vWF:CB/E vWF:Ag de como mínimo
0,3, preferentemente como mínimo 0,4, en particular como mínimo
0,6.
25. Preparado según una de las reivindicaciones
22 a 24, caracterizado porque el vWF se encuentra en forma
de complejo de factor VIII-vWF.
26. Preparado según una de las reivindicaciones
22 a 25, caracterizado porque el vWF o el complejo de factor
III-vWF está libre de proteínas plasmáticas.
27. Preparado según una de las reivindicaciones
22 a 26, caracterizado porque el colágeno está inmovilizado
en un soporte sólido seleccionado entre el grupo formado por
partículas de colágeno, material de soporte sintético, material a
base de hidratos de carbono, fosfolípido y liposoma.
28. Preparado según una de las reivindicaciones
22 a 27, caracterizado porque el colágeno es colágeno nativo
o un derivado de colágeno, en particular un colágeno procesado
enzimáticamente, o un fragmento de colágeno.
29. Preparado según una de las reivindicaciones
22 a 28, caracterizado porque se encuentra en forma
liofilizada.
30. Preparado según una de las reivindicaciones
22 a 29, caracterizado porque está tratado para la
inactivación y/o el empobrecimiento de los patógenos eventualmente
presentes.
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