ES2207970T3 - Contulaquina-g, analogos de la misma y usos para los mismos. - Google Patents

Abstract

Una contulaquina-G sustancialmente pura que comprende la secuencia de aminoácidos Xaa1-Ser-Glu-Glu-Gly- Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa2-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1) en la que Xaa1 es piro-Glu, Xaa2 es prolina o hidroxiprolina y Thr10 se encuentra modificada para contener un O-glucano y en la que dicho O-glucano es Gal(a1>3)GalNAc(á1>).

Description

Contulaquina-G, análogos de la misma y usos para los mismos.

Referencia a solicitudes relacionadas

La presente invención está relacionada con las solicitudes de patentes provisionales de Estados Unidos Nº de serie 60/105.015, presentada el 20 de octubre de 1998, Nº de serie 60/128.561, presentada el 9 de abril de 1999 y Nº de serie 60/130.661, presentada el 23 de abril de 1999.

Esta invención se realizó con ayuda del Gobierno, mediante la subvención Nº GM-48677 concedida por el National Institute of Health, Bethesda, Maryland. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

La presente invención trata de la contulaquina-G (que es el péptido glicosilado nativo), una contulaquina-G desglicosilada (denominada Thr_{10}-contulaquina-G), y derivados de los mismos, de un clon de ADNc que codifica un precursor de este péptido maduro y de un péptido precursor. Además, la invención trata del uso de este péptido como un agente terapéutico para anticonvulsivo, antiinflamatorio, antichoque, anti-trombos, hipotensor, analgesia, anti-psicótico, enfermedad de Parkinson, trastornos gastrointestinales, estados depresivos, disfunción cognitiva, ansiedad, discinesia tardía, drogodependencia, ataques de pánico, manías, síndrome del intestino irritable, diarreas, úlceras, tumores GI, síndrome de Tourette, corea de Huntington, escape vascular, antiarteriosclerosis, trastornos vasculares y de vasodilatación, así como trastornos neurológicos, neurofarmacológicos y neuropsicofarmacológicos.

Las publicaciones y otros materiales que se usan en la presente invención para aclarar los antecedentes de la invención, y, en particular, los casos para proporcionar detalles adicionales respecto a la práctica llevan una referencia numérica en el texto que sigue y están respectivamente agrupados en las referencias adjuntas.

Los moluscos del género Conus producen un veneno que les permite llevar a cabo su estilo de vida depredador sin igual. Las presas están inmovilizadas por el veneno que se inyecta mediante un aparato venenoso altamente especializado, un diente hueco desechable que funciona a la vez como un arpón y como una aguja hipodérmica.

Hay pocas interacciones entre organismos que sean más llamativas que las que hay entre un animal venenoso y su víctima envenenada. El veneno puede usarse como arma principal para capturar presas o como mecanismo de defensa. Muchos de estos venenos contienen moléculas dirigidas contra receptores y canales de iones de sistemas neuromusculares.

Varios péptidos aislados a partir de los venenos de Conus han sido caracterizados. Éstos incluyen a las \alpha-, \mu- y \omega-conotoxinas que tienen por diana a los receptores nicotínicos de acetilcolina, los canales de sodio de los músculos, y los canales de calcio de las neuronas, respectivamente (Olivera y col., 1985). Las conopresinas, que son análogos de la vasopresina, han sido identificadas igualmente (Cruz y col., 1987). Además, se han aislado péptidos denominados conantoquinas a partir de Conus geographus y Conus tulipa (Mena y col., 1990; Haack y col., 1990). Estos péptidos tienen efectos fisiológicos poco corrientes que dependen de la edad: inducen un estado semejante al sueño en ratones de edad inferior a dos semanas y un comportamiento hiperactivo en ratones de edad superior a 3 semanas (Haack y col., 1990). El aislamiento, la estructura y la actividad de las \kappa-conotoxinas se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.633.347. Recientemente, se han aislado péptidos denominados contrífanos que contienen residuos de D-triptófano de Conus radiatus (Nº de serie de Estados Unidos 09/061.026), y conopéptidos con bromo-triptófano se han aislado de Conus imperialis y Conus radiatus (Nº de serie de Estados Unidos 08/785.534).

La patente de Estados Unidos Nº 5.432.155 describe la síntesis de varias conotoxinas que incluye la síntesis de un péptido denominado J-004 que tiene la secuencia Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1) en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Xaa_{2} es prolina y Thr_{10} se puede encontrar glicosilado. Esta patente no describe la naturaleza de la glicosilación.

Se desea identificar conopéptidos adicionales que tengan actividades de los conopéptidos anteriores, así como péptidos conotoxina que tengan actividades suplementarias.

Sumario de la invención

La presente invención trata de péptidos glicosilados contulaquina-G, de derivados de los mismos, de un clon de ADNc que codifica un precursor de dichos péptidos y de un péptido precursor como se define en las reivindicaciones adjuntas. Además, la invención trata del uso de dichos péptidos como un agente terapéutico para anticonvulsivo, antiinflamatorio, antichoque, anti-trombos, hipotensor, analgesia, anti-psicótico, enfermedad de Parkinson, trastornos gastrointestinales, estados depresivos, disfunción cognitiva, ansiedad, discinesia tardía, drogodependencia, ataques de pánico, manías, síndrome del intestino irritable, diarreas, úlceras, tumores GI, síndrome de Tourette, corea de Huntington, escape vascular, antiarteriosclerosis, trastornos vasculares y de vasodilatación, así como trastornos neurológicos, neurofarmacológicos y neuropsicofarmacológicos.

La contulaquina G tiene la siguiente fórmula: Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina y Thr_{10} se encuentra modificada para contener un O-glucano como se define en las reivindicaciones. X_{2} es preferiblemente prolina. Según la presente invención, un glucano se referirá a cualquier mono, di, tri, poli u oligosacárido unido mediante enlace N-, S- u O- que se puede unir a cualquier grupo hidroxi, amino o tiol de aminoácidos naturales o modificados mediante metodologías sintéticas o enzimáticas conocidas en la técnica. Los monosacáridos que componen el glucano pueden incluir a la D-alosa, la D-altrosa, la D-glucosa, la D-manosa, la D-gulosa, la D-idosa, la D-galactosa, la D-talosa, la D-galactosamina, la D-glucosamina, la D-N-acetil-glucosamina (GlcNAc), la D-N-acetil-galactosamina (GalNAc), la D-fucosa o la D-arabinosa. Estos sacáridos se pueden modificar estructuralmente como se describe en la presente invención, por ejemplo, con uno o más grupos O-sulfato, O-fosfato, O-acetil u ácidos tales como el ácido siálico, incluido combinaciones de los mismos. El glucano puede incluir también grupos polihidroxi similares, tales como la D-penicilamina 2,5 y derivados halogenados de la misma o derivados del polipropilenglicol. El enlace glucosídico es beta y 1-4 ó 1-3, preferiblemente 1-3. El enlace entre el glucano y el aminoácido puede ser alfa o beta, preferiblemente alfa y es 1-. Se describen más a fondo los glucanos preferidos en la presente invención, siendo el glucano más preferido Gal(\betal\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow).

En una segunda realización, la presente invención trata de una contulaquina-G genérica que tiene la siguiente fórmula general: Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{3}-Gly-Gly-Xaa_{2}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Xaa_{9}-Xaa_{10}-Ile-Leu (SEC ID

\hbox{Nº: 2),}

en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Glu, Gln o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{2} es Ser, Thr o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{3} es Glu o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{4} es Asn, Asn modificada con un N-glucano o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{5} es Ala o Gly; Xaa_{6} es Thr, Ser, Cys modificada con un S-glucano, Tyr o cualquier aminoácido no natural que contiene hidroxilos (tal como 4-hidroximetil-Phe, 4-hidroxifenyl-Gly, 2,6-dimetil-Tyr, 3-nitro-Tyr y 5-amino-Tyr); Xaa_{7} es Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina o cualquier aminoácido básico no natural (tal como N-1-(2-pirazolinil)-Arg); Xaa_{8} es Ala, Gly, Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina, cualquier aminoácido básico no natural (tal como N-1-(2-pirazolinil)-Arg) o X-Lys donde X es (CH_{2})_{n}, fenil, -(CH_{2})_{m}-(CH=CH)-(CH_{2})_{m}H o -(CH_{2})_{m}-(C\equivC)-(CH_{2})_{m}H en los que n es 1-4 y m es 0-2; Xaa_{9} es Pro o hidroxi-Pro; y Xaa_{10} es Tyr, mono-yodo-Tyr, di-yodo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr, nitro-Tyr, Trp, D-Trp, bromo-Trp, bromo-D-Trp, cloro-Trp, cloro-D-Trp, Phe, L-neo-Trp, cualquier aminoácido aromático no natural (tal como nitro-Phe, Phe sustituido en 4 en el que el sustituyente es alquilo C_{l}-C_{3}, carboxilo, hidroximetilo, sulfometilo, halo, fenilo, -CHO, -CN, SO_{3}H y -NHAc, 2,6-dimetil-Tyr y 5-amino-Tyr). El extremo C-terminal contiene un grupo carboxilo libre, se encuentra amidado, se encuentra acilado, contiene un glucano o contiene un aldehído. Se prefiere que el extremo C-terminal contenga un carboxilo libre. Además este péptido puede contener uno o más glucanos como los descritos anteriormente. Los glucanos se pueden encontrar en los residuos 2, 7, 8, 10 y 16. Los anteriores y otros aminoácidos básicos no naturales, aminoácidos no naturales que contienen hidroxilos o aminoácidos aromáticos no naturales están descritos en Building Block Index, Versión 2.2, por y que se puede conseguir de RSP Amino Acid Analogues, Inc., Worcester, MA.

En una tercera realización, la presente invención trata de análogos de la contulaquina-G o de la contulaquina-G genérica. Estos análogos incluyen truncamientos N-terminales de la contulaquina-G o de la contulaquina-G genérica hasta la Thr_{10} inclusive. Cuando el truncamiento N-terminal incluye a la Thr_{10}, la Lys_{11} se N-glicosila mediante el uso de un conector carboxilado modificado. Esta Lys_{11} N-glicosilada se puede representar como se muestra en la figura 1 (Toth y col., 1999), en la que R_{2}, R_{3} y R_{4} son como se describe en la presente invención. En estos truncamientos, se prefiere que el residuo proximal al truncamiento esté sustituido con una serina glicosilada. Análogos adicionales incluyen a péptidos en los que Ser-O-glucano, Thr-O-glucano o Cys-S-glucano sustituyan a un residuo en la

\hbox{posición 1-9.}

En una cuarta realización, la presente invención trata de usos de los péptidos descritos en la presente invención como agente terapéutico para anticonvulsivo, antiinflamatorio, antichoque, anti-trombos, hipotensor, analgesia, anti-psicótico, enfermedad de Parkinson, trastornos gastrointestinales, estados depresivos, disfunción cognitiva, ansiedad, discinesia tardía, drogodependencia, ataques de pánico, manías, síndrome del intestino irritable, diarreas, úlceras, tumores GI, síndrome de Tourette, corea de Huntington, escape vascular, antiarteriosclerosis, trastornos vasculares y de vasodilatación, así como trastornos neurológicos, neurofarmacológicos y neuropsicofarmacológicos. En un aspecto de esta realización, se induce la analgesia en un mamífero mediante el uso de uno de los péptidos que se describen en la presente invención. En un segundo aspecto de esta realización, se tratan la epilepsia o las convulsiones en un mamífero. En un tercer aspecto de esta realización, se trata la esquizofrenia en un mamífero. En un cuarto aspecto de esta realización, se tratan la discinesia tardía y reacciones distónicas agudas en un mamífero. En un quinto aspecto de esta realización, se trata la inflamación en un mamífero.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 presenta la estructura de una N-glicosilación de Lys mediante el uso de un conector carboxilado modificado.

La figura 2 presenta el O-glucano nativo unido a la Thr_{10} de la contulaquina-G.

La figura 3 presenta análogos del glucano que se puede unir a uno o más residuos de la contulaquina-G.

La figura 4 muestra los O-glucanos nucleares preferidos (Van de Steen y col., 1998). Los oligosacáridos de tipo mucina unidos por enlaces O- se unen a Ser o Thr (u otros residuos hidroxilados de los presentes péptidos) mediante un residuo GalNAc. Los bloques de construcción monosacarídicos y el enlace unido a este primer residuo GalNAc definen los "glucanos nucleares", de los que se han identificado ocho. El tipo de enlace glucosídico (orientación y conectividades) está definido para cada glucano nuclear.

La figura 5 presenta la purificación de la contulaquina-G. Se extrajo un gramo de veneno crudo liofilizado de Conus geographus y se aplicó a una columna de Sephadex G-25 como se ha descrito con anterioridad (Olivera y col., 1984). Se mezclaron tres fracciones consecutivas que contenían actividades paralíticas y somníferas (Ve/Vo = 1,37 a 1,41), se aplicaron a una columna preparativa en fase inversa Vydac C_{18} y se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 0,1%. El componente señalado con una flecha en el cuadro A provocó temblores y la muerte cuando se administró a ratones por vía icv.

La figura 6 presenta un espectro EM/EM de nano-ESI (precursor m/z 1035) de la contulaquina-G (286-1886 Da) (el experimento EM/EM se indica mediante el uso de una taquigrafía sugerida (Mcluckey y col., 1991) donde el círculo cerrado representa al precursor m/z 1035 [M+2H]^{2+} y las flechas apuntan hacia los círculos abiertos que representan los fragmentos que se generan a partir del precursor). Por encima del espectro, se representa la estructura del glicoaminoácido donde las flechas indican 2 sitios que llevan a iones principales de los fragmentos que se observan en el espectro EM/EM (Craig y col., 1993).

Las figuras 7A-7C presentan las respuestas a dosis de CGX-1063 (Thr_{10}-contulaquina-G) sobre comportamientos nociceptivos de mediación medular (retirada de las extremidades) y de mediación supramedular (lametazo de las extremidades posteriores) provocados por un calor nocivo. Los datos se expresan como segundos hasta la respuesta (figuras 7A y 7B) o hasta la primera caída (figura 7C). En la figura 7A, se muestra la latencia para la primera respuesta perceptible después de la colocación encima de una placa calentadora a 50ºC. La figura 7B presenta la latencia para el primer lametazo de pata trasera. La figura 7C presenta la latencia para la primera caída después de la colocación encima del rotarod con aceleración (en las figuras 7A-7C, n = 3-10).

Las figuras 8A-8B presentan el efecto de la CGX-1063 sobre la respuesta nociceptiva al dolor persistente. En la figura 8A, los datos se presentan como la cantidad de tiempo que los animales dedicaron a lamerse la pata trasera a la que se inyectó formalina (n = 7-10 animales/grupo de tratamiento). La CGX-1063 intratecal disminuyó de manera dependiente de la dosis la respuesta nociceptiva de fase 2 en la prueba de la formalina en comparación con los controles a los que se inyectó solución salina intratecal. La figura 8B presenta la latencia para la primera caída desde un rotarod con aceleración inmediatamente después de la prueba de la formalina.

La figura 9 presenta el umbral de retirada de la pata en respuesta a una estimulación mecánica una semana después de la ligadura parcial del nervio ciático. Los datos se presentan como el umbral de retirada del 50% en gramos determinados con filamentos de von Frey calibrados (n = 3-9 animales por grupo).

Las figuras 10A-10B presentan una comparación de la CGX-1160 (contulaquina-G), la CGX-1063 y la NT en la prueba del coletazo. Se muestran las respuestas a las dosis de estos tres compuestos en la figura 10A. La figura 10B presenta la duración del efecto a las dosis más altas que se probaron para cada compuesto (CGX-1160 = 100 pmol; CGX-1063 = 100 pmol; NT = 10 nmol).

Las figuras 11A-11B presentan el efecto de la CGX-1160, la CGX-1063 y la NT sobre la fase 1 (figura 11A) y la fase 2 (figura 11B) de la prueba de la formalina. Los tres compuestos disminuyeron de manera dependiente de la dosis el comportamiento nociceptivo después de la formalina i.pl. En la fase 2 (figura 11B), la CGX-1160 era 10 veces más potente que la CGX-1063, y 600-700 veces más potente que la NT.

Las figuras 12A-12C presentan el efecto de la CGX-1160, la CGX-1063 y la NT sobre la alodinia mecánica inducida por la inflamación crónica. Los valores entre paréntesis indican el porcentaje de cada valor control correspondiente. En la figura 12A, la CGX-1160 invirtió potentemente y de manera dependiente de la dosis la alodinia inducida por CFA. En la figura 12B, la CGX-1063 invirtió la alodinia inducida por CFA, pero fue aproximadamente 100 veces menos potente en este modelo que la CGX-1160. En la figura 12C, la NT invirtió la alodinia inducida por CFA a 1.000 pmol, pero no 100 pmol, aproximadamente 10.000 veces menos potente que CGX-1160.

Las figuras 13A-13B presentan los efectos de deterioro de la locomoción de la CGX-1160, la CGX-1063 y la NT. La figura 13A presenta el tiempo hasta el efecto máximo y la duración del efecto de los tres compuestos a las dosis más altas probadas (aproximadamente 100 veces la DE_{50} en la fase 2 de la prueba de la formalina). La figura 13B presenta la respuesta a la dosis de cada componente sobre la discapacidad locomotora.

Las figuras 14A-14C presentan el efecto de la dosis y el tiempo hasta el efecto máximo y la duración de la discapacidad locomotora de la CGX-1160, la CGX-1063 y la NT. La figura 14A muestra que la CGX-1160 provocó una discapacidad motora de larga duración únicamente a dosis de 100 veces o más su DE_{50}. La figura 14B muestra que la CGX-1063 provocó una discapacidad motora de larga duración a dosis de 10 veces o más su DE_{50}. La figura 14C muestra que la NT provocó una discapacidad motora de larga duración a dosis 100 veces superiores a su DE_{50}.

Las figuras 15A-15B presentan una comparación de la CGX-1160, la CGX-1063 y la NT sobre el cambio de temperatura corporal. La figura 15A presenta el tiempo hasta el efecto máximo y la duración de cada compuesto, y la figura 15B presenta la respuesta a la dosis de cada compuesto.

Las figuras 16A-16C presentan el efecto de la dosis y la duración hipotérmicas de la CGX-1160, la CGX-1063 y la NT. En la figura 16A, la CGX-1160 provocó hipotermia únicamente a dosis 100-500 veces superiores a la DE_{50}. La figura 16B muestra el efecto hipotérmico de larga duración de la CGX-1063 a dosis 10 veces superiores a la DE_{50} (100 pmol). En la figura 16C, La NT tenía un efecto hipotalámico a dosis 10-100 veces superiores a su DE_{50}.

La figura 17 presenta los efectos de la Thr_{10}-g contulaquina-G (CGX-1160; 100 pmol i.c.v.) sobre la actividad locomotora estimulada por las D-anfetaminas medida por la distancia recorrida. Abreviaturas: sal-sal: el tratamiento i.p. fue con solución salina, el tratamiento i.c.v. fue con solución salina; anfet (3 mg/kg)-sal: el tratamiento i.p. fue con sulfato de D-anfetamina (3 mg/kg), el tratamiento i.c.v. fue con solución salina; anfet (10 mg/kg)-sal: el tratamiento i.p. fue con sulfato de D-anfetamina (10 mg/kg), el tratamiento i.c.v. fue con solución salina; sal-ctl: el tratamiento i.p. fue con solución salina, el tratamiento i.c.v. fue con Thr_{10}-g contulaquina-G (100 pmol); anfet (3mg/kg)-ctl: el tratamiento i.p. fue con sulfato de D-anfetamina (3mg/kg), el tratamiento i.c.v. fue con Thr_{10}-g contulaquina-G (100 pmol). Cada barra presenta la media \pm EEM de 3-7 ratones por grupo. a: P < 0,05 vs. grupo tratado con solución salina-solución salina (sal-sal); b: P < 0,05 vs. grupo D-anfetamina-solución salina (anfet (3 mg/kg)-sal).

La figura 18 presenta los efectos de la Thr_{10}-g contulaquina-G (CGX-1160; 100 pmol i.c.v.) sobre la actividad locomotora estimulada por las D-anfetaminas medida por el tiempo dedicado a deambular (s). Abreviaturas: sal-sal: el tratamiento i.p. fue con solución salina, el tratamiento i.c.v. fue con solución salina; anfet (3 mg/kg)-sal: el tratamiento i.p. fue con sulfato de D-anfetamina (3 mg/kg), el tratamiento i.c.v. fue con solución salina; anfet (10 mg/kg)-sal: el tratamiento i.p. fue con sulfato de D-anfetamina (10 mg/kg), el tratamiento i.c.v. fue con solución salina; sal-ctl: el tratamiento i.p. fue con solución salina, el tratamiento i.c.v. fue con Thr_{10}-g contulaquina-G (100 pmol); anfet (3 mg/kg)-ctl: el tratamiento i.p. fue con sulfato de D-anfetamina (3 mg/kg), el tratamiento i.c.v. fue con Thr_{10}-g contulaquina-G (100 pmol). Cada barra presenta la media \pm EEM de 3-7 ratones por grupo. a: P < 0,05 vs. grupo tratado con solución salina-solución salina (sal-sal); b: P < 0,05 vs. grupo D-anfetamina-solución salina (anfet (3 mg/kg)-sal).

La figura 19 muestra que la CGX-1160 y la CGX-1063 protegen de manera dependiente de la dosis frente a ataques audiogénicos después de la administración i.c.v. en ratones Frings, a dosis bien por debajo de las dosis mínimas que deterioran la motilidad. Cada punto representa el tanto por ciento de protección (tóxico en grupos de por lo menos cuatro ratones).

La figura 20 presenta la eficacia de larga duración de la CGX-1160 en el bloqueo de los ataques audiogénicos después de la administración i.c.v. en ratones Frings. La neurotensina sólo tiene una eficacia del 50% tras la administración i.c.v. de hasta 5 nmol. Cada punto representa el tanto por ciento de protección en un grupo de cuatro ratones.

La invención trata además del uso de los péptidos que se reivindican como agente terapéutico para anticonvulsivo, antiinflamatorio, antichoque, anti-trombos, hipotensor, analgesia, anti-psicótico, enfermedad de Parkinson, trastornos gastrointestinales, estados depresivos, disfunción cognitiva, ansiedad, discinesia tardía, drogodependencia, ataques de pánico, manías, síndrome del intestino irritable, diarreas, úlceras, tumores GI, síndrome de Tourette, corea de Huntington, escape vascular, antiarteriosclerosis, trastornos vasculares y de vasodilatación, así como trastornos neurológicos, neurofarmacológicos y neuropsicofarmacológicos.

La presente invención trata de la contulaquina-G y análogos de la contulaquina-G tal y como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Estos péptidos pueden contener modificaciones postraduccionales sencillas o múltiples con glucanos en uno o más, hasta en todos, los sitios hidroxilo de los péptidos. Los glucanos son como se describe en la presente invención. El O-glucano nativo unido a la contulaquina-G se presenta en la figura 2. La figura 3 presenta análogos del glucano que se pueden unir a uno o más residuos de la contulaquina-G. En esta figura, R_{1} es un amino que se puede derivatizar con un glucano tanto químicamente como enzimáticamente; R_{2} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, u O-glucano; R_{3} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo, ácido siálico o monosacárido; R_{4} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{5} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, O-monosacárido u O-acetilo; R_{6} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{7} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{8} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; n es 0-4 y m es 1-4.

Los glucanos nucleares preferidos que se pueden usar para modificar la contulaquina-G o análogos que se describen en la presente invención se muestran en la figura 4. También se pueden hacer ramificaciones adicionales a partir de estos núcleos mediante el uso de los monosacáridos que se describen en la presente invención. Los enlaces glucosídicos preferidos están especificados por los núcleos 5 y 7 de la figura 4 con homologación adicional del glucano en las posiciones 3, 4 y 6 de la plantilla de GalNAc mediante el uso de los monosacáridos que se describen en la presente invención. Cualquier función hidroxilo libre se puede O-sulfatar, O-fosforilar u O-acetilar.

El conopéptido glicosilado (contulaquina-G o CGX-1160) tiene una mayor potencia in vivo que el conopéptido no glicosilado (Thr_{10}-contulaquina-G o CGX-1063), aunque sus potencias in vitro sean aproximadamente iguales. Puede que la glicosilación sea importante para una mejor unión con el receptor, y/o la entrega mejorada del conopéptido en su sitio de acción, y/o la inhibición de la degradación del conopéptido.

La presente invención trata además de la secuencia de ADN que codifica la contulaquina-G como se describe con más detalle en la presente invención. La invención trata además del propéptido para la contulaquina-G como se describe con más detalle en la presente invención.

La presente invención se refiere a una novedosa contulaquina-G glicosilada lineal, y derivadas de la misma que son útiles como agentes farmacéuticos, a procedimientos para su producción, a composiciones farmacéuticas que incluyen a estos compuestos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos novedosos de la presente invención son agentes del sistema nervioso central y sus acciones biológicas se efectúan en un novedoso "sitio de unión para la contulaquina-G en el receptor de la neurotensina". Más concretamente, los compuestos novedosos de la presente invención son analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antipsicóticos para el tratamiento de psicosis tales como la esquizofrenia y exhiben potentes propiedades anticonvulsivas en determinados modelos animales de epilepsia.

Dolor

El dolor crónico o intratable, tal como el que se puede producir en dolencias tales como las enfermedades degenerativas de los huesos y el cáncer, es un estado debilitante que se trata con una diversidad de agentes analgésicos, y a menudo compuestos opioides, tales como la morfina.

Por lo general, las vías del cerebro que rigen la percepción del dolor están aún incompletamente comprendidas, las conexiones sinápticas sensoriales aferentes a la médula espinal, llamadas "vías nociceptivas" han sido documentadas en cierto detalle. En el primer tramo de tales vías, las fibras A y C que se proyectan desde los sitios periféricos hasta la médula espinal llevan señales nociceptivas. Los empalmes polisinápticos en el asta dorsal de la médula espinal están implicados en la transmisión y la modulación de las sensaciones de dolor hacia diversas regiones del cerebro, incluida la región gris periacueductal. La analgesia, o la reducción de la percepción del dolor, se pueden lograr directamente mediante la disminución de la transmisión a lo largo de tales vías nociceptivas. Se piensa que los opiáceos analgésicos actúan imitando los efectos de neuronas que contienen péptidos endorfina o encefalina, que forman sinapsis presinápticamente en la terminación de la fibra A o C y que, cuando disparan, inhiben la liberación de neurotransmisores, incluida la sustancia P. Las vías descendientes desde el cerebro son también inhibidoras de los disparos de las fibras A y C.

Algunos tipos de dolor tienen etiologías complejas. Por ejemplo, el dolor neuropático es generalmente un estado crónico atribuible a la lesión o la sección transversal parcial de un nervio periférico. Este tipo de dolor se caracteriza por una hiperestesia, o sensibilidad aumentada a estímulos nocivos externos. El componente hiperestésico del dolor neuropático no responde a las mismas intervenciones farmacéuticas que las formas de dolor más generalizadas y agudas.

Los compuestos opioides tales como la morfina, aunque sean eficaces para producir analgesia para numerosos tipos de dolor, no son siempre eficaces, y pueden producir tolerancia en los pacientes. Cuando un caso es tolerante a los narcóticos opioides, se necesitan mayores dosis para conseguir un efecto analgésico satisfactorio. Estos compuestos pueden producir efectos secundarios, tales como la depresión respiratoria, que pueden ser mortales. Además, los opioides provocan a menudo una dependencia física en los pacientes. La dependencia parece relacionada con la dosis del opioide que se toma y del periodo de tiempo durante el cual lo toma el sujeto. Por este motivo, se están buscando ampliamente terapias alternativas para la gestión del dolor crónico. Además, los compuestos que sirven o bien de sustituto de o bien de adjunto al tratamiento con opioides para disminuir la posología del compuesto analgésico necesaria, tienen utilidad en el tratamiento del dolor, en particular dolor del tipo crónico, intratable.

Puesto que se ha demostrado que la contulaquina-G actúa en un sitio en ciertos receptores para la neurotensina, y que se ha demostrado que la neurotensina tiene efectos analgésicos (Clineschmidt y col. 1979), entonces los conopéptidos semejantes a la contulaquina-G son útiles para el tratamiento del dolor y trastornos emparentados.

Esquizofrenia

La esquizofrenia es un trastorno neurogénico que actualmente se trata principalmente con compuestos neurolépticos tales como las fenotiacinas y las butirofenonas, que bloquean los receptores para la dopamina. Puesto que se ha demostrado que la contulaquina-G actúa en un sitio en ciertos receptores para la neurotensina, y que los efectos de la neurotensina están implicados en la etiología de la esquizofrenia (Nemeroff y col. 1992), entonces los conopéptidos semejantes a la contulaquina-G son útiles para el tratamiento de la esquizofrenia y trastornos emparentados.

Los criterios de selección in vitro para conopéptidos útiles en el tratamiento de la esquizofrenia, incluyen: a) la activación de sitios para la contulaquina-G; b) una unión reversible de alta afinidad a un sitio de unión para la contulaquina-G localizado en la región límbica del cerebro, y c) la inhibición de la liberación de dopamina por las regiones del cerebro, en particular las regiones límbicas del cerebro.

Los compuestos que exhiben actividades suficientemente altas en los ensayos de cribado in vitro anteriores se prueban a continuación en un modelo animal que se usa en el cribado de compuestos antipsicóticos.

Discinesia tardía y otras reacciones distónicas agudas

La discinesia tardía y las reacciones distónicas agudas son trastornos del movimiento que se producen a menudo como efectos secundarios de la terapia antipsicótica que emplea antagonistas de la dopamina, tales como el haloperidol. Estos trastornos se caracterizan por una supersensibilidad de los receptores para la dopamina en ciertas regiones del cerebro asociadas con el control del movimiento, en particular, los ganglios basales. Actualmente, se usa la terapia antipsicótica intermitente en un intento de evitar la aparición del trastorno, y tales trastornos se tratan por retirada de la terapia.

Los criterios de selección para conopéptidos omega útiles en el tratamiento de la discinesia tardía, incluyen: a) la activación de sitios para la contulaquina-G; b) una unión reversible de alta afinidad al sitio de unión para la contulaquina-G; c) la inhibición de la liberación de dopamina por las regiones estriadas del cerebro, y otras regiones de los ganglios basales, y d) una relación entre la inhibición de la liberación de dopamina en los ganglios basales y la inhibición de la liberación de dopamina en las regiones límbicas.

Los compuestos que exhiben actividades suficientemente altas en ensayos de cribado in vitro se prueban a continuación en el modelo de rata giratoria estriada, que se describe arriba. Los compuestos útiles en el procedimiento de tratar tales trastornos del movimiento, cuando se inyectan en el núcleo estriado del lado del cerebro contralateral a la lesión, corrigen el comportamiento giratorio.

Inflamación

Se ha descrito un componente de inflamación neurogénico, puesto que el bloqueo del sistema nervioso simpático, y en particular el bloqueo de los receptores beta-adrenérgicos, es eficaz para la reducción de los daños articulares inflamatorios. Cabría esperar que los compuestos útiles para el tratamiento de la inflamación tuvieran las siguientes propiedades in vitro: a) activación de sitios novedosos para la contulaquina-G; b) unión de alta afinidad a los sitios de unión para la contulaquina-G, y c) inhibición de la liberación de norepinefrina a partir de los tejidos nerviosos. Los compuestos que exhiben actividades suficientemente altas en tales ensayos de cribado in vitro se prueban en un modelo animal de reumatismo articular.

Epilepsia

Epilepsia es un término general que describe trastornos del sistema nervioso central que se caracterizan por episodios repetidos de ataques. Tales ataques pueden implicar los sistemas nerviosos sensorial, autónomo o motor, y se reconocen electrofisiológicamente por la presencia de descargas eléctricas anormales en el cerebro. La fisiopatología de una actividad de descargas anormal semejante no está bien comprendida; sin embargo, hay pruebas de que la pérdida de entradas neurales inhibidoras, tal como las entradas de GABA, está implicada en por lo menos algunos ataques epilépticos.

La capacidad de ciertas benzodiacepinas (por ejemplo, el diazepam) para reprimir o inhibir los episodios epilépticos está considerada por algunos como una prueba de una fisiopatología GABAérgica en la actividad de los ataques, puesto que se sabe que estos medicamentos potencian la inhibición neural GABAérgica a través de un efecto sobre el canal de iones cloruro asociado al receptor para GABA. Los efectos bioquímicos de otros compuestos antiepilépticos incluyen la estabilización de membranas excitables mediante la inhibición de canales de sodio o potasio sensibles al voltaje (fenitoína), y la depresión general de la función neuronal caracterizada por la facilitación de la transmisión GABAérgica, la inhibición de los efectos de la neurotransmisión excitadora (glutaminérgica) y la depresión de la liberación de neurotransmisores (fenobarbital).

Cabría esperar que los compuestos útiles para el tratamiento de la epilepsia tuvieran las siguientes propiedades in vitro: a) activación de sitios novedosos para la contulaquina-G; b) unión de alta afinidad a los sitios de unión para el conopéptido contulaquina-G, y c) inhibición de la liberación de neurotransmisores excitadores a partir de los tejidos nerviosos. Los compuestos que exhiben actividades suficientemente altas en tales ensayos de cribado in vitro se prueban en un modelo animal consolidado de epilepsia.

Además de los trastornos específicos anteriores, puesto que se ha encontrado que los péptidos, derivados y análogos de la presente invención se unen al receptor para la neurotensina, estos compuestos son también útiles en relación a estados asociados con el receptor para la neurotensina y para los cuales se ha mostrado que compuestos con semejanza a la neurotensina u otros compuestos tienen actividad. Estas actividades incluyen: antagonistas de metanfetaminas, agentes antipsicóticos, medicamentos cerebrales, agentes analgésicos, efecto choque antiendotóxico, efecto inhibidor de las proteasas (un efecto antitrombina, un efecto antiplasmina), un efecto hipotensor, un efecto anti-DIC, un efecto antialérgico, un efecto de curación de heridas, edema cerebral, un edema pulmonar, un edema de la tráquea, un trombo, una arteriosclerosis, una quemadura, y una hipertensión, enfermedades alérgicas (tales como un asma bronquial y una polenosis), la reducción de una hemorragia causada por un traumatismo agudo tal como una porción de tejido lesionada en el curso de una operación quirúrgica, una herida lacerada de un cerebro u otros tejidos provocada por un accidente de tráfico y similares, y para relajar y curar el hinchazón, la inflamación de dolor provocada por traumatismos, la supresión de una hemorragia interna provocada por un traumatismo sordo, edemas e inflamaciones que se acompañan de la hemorragia interna, la supresión y la mejoría de edemas cerebrales mediante la supresión de una fuga de componentes de la sangre hacia una matriz de tejido que se encuentra en enfermedades isquemiales cerebrales que incluyen los infartos cerebrales (por ejemplo, un trombo cerebral y una embolia cerebral), las hemorragias intracraneales (por ejemplo, una hemorragia cerebral y una hemorragia subaracnoidea), un ataque isquémico cerebral transitorio, trastornos agudos de los vasos sanguíneos cerebrales en una encefalopatía hipertensa, supresión y mejoría de quemaduras, sabañones, otras inflamaciones e hinchazones de la piel, una inflamación de la tráquea superior, un asma, una congestión nasal, un edema pulmonar, y trastornos que producen inflamación provocados por factores endógenos y exógenos, que dañan directamente al endotelio vascular y a las membranas mucosas, tales como una sustancia química medioambiental, agentes quimioterapéuticos para el cáncer, una endotoxina, y un mediador de la inflamación.

Los conopéptidos de la presente invención se identifican por aislamiento a partir del veneno de Conus. Si no, los conopéptidos de la presente invención se identifican mediante el uso de técnicas de ADN recombinante por el cribado de bibliotecas de ADNc de diversas especies de Conus mediante el uso de técnicas convencionales con sondas degeneradas. Se analizan los clones que hibridan con estas sondas para identificar aquellos que satisfacen los requisitos de tamaño mínimo, es decir, los clones que tienen aproximadamente 300 nucleótidos (para un propéptido), determinados mediante el uso de cebadores para PCR que flanquean los sitios de clonación del ADNc para la biblioteca de ADNc concreta que se está examinando. A continuación, se establece la secuencia de estos clones de tamaño mínimo. Luego se examinan las secuencias para la presencia de un péptido que tenga las características indicadas anteriormente para los conopéptidos. La actividad biológica de los péptidos que se identifican mediante este procedimiento se comprueba como se describe en la presente invención, en la patente de Estados Unidos Nº 5.635.347 o de manera convencional en la técnica.

Estos péptidos son suficientemente pequeños para poderse sintetizar químicamente. Se describen más adelante síntesis químicas generales para preparar los conopéptidos anteriores, junto con síntesis químicas específicas de conopéptidos e indicaciones de las actividades biológicas de estos productos sintéticos. También se pueden obtener varios de estos conopéptidos por aislamiento y purificación a partir de especies de Conus específicas mediante el uso de las técnicas que se describen en las patentes de Estados Unidos No 4.447.356 (Olivera y col., 1984), 5.514.774 (Olivera y col., 1996) y 5.591.821 (Olivera y col., 1997).

Aunque se puedan obtener los conopéptidos de la presente invención por purificación a partir de caracoles cono, puesto que las cantidades de conopéptidos que se pueden conseguir de caracoles individuales son muy pequeñas, es más práctico obtener los conopéptidos sustancialmente puros deseados en cantidades comercialmente valiosas por síntesis química mediante el uso de una estrategia en fase sólida. Por ejemplo, la producción a partir de un único caracol cono puede ser de aproximadamente 10 microgramos o menos de conopéptido. Con "sustancialmente puro" se quiere decir que el péptido se encuentra presente en la ausencia sustancial de otras moléculas biológicas del mismo tipo; preferiblemente se encuentra presente en una cantidad de como mínimo aproximadamente una pureza del 85% y preferiblemente como mínimo aproximadamente una pureza del 95%. La síntesis química de conopéptidos biológicamente activos depende desde luego de la determinación correcta de la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, los conopéptidos de la presente invención se pueden aislar, sintetizar y/o sustancialmente puros.

También se pueden producir los conopéptidos mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidos en la técnica. Tales técnicas están descritas por Sambrook y col. (1989). Los péptidos que se producen de esta manera se aíslan, se reducen si es necesario, y se oxidan para formar los enlaces disulfuro correctos, si se encuentran presentes en la molécula final.

Se sintetizan los péptidos mediante un procedimiento adecuado, tal como por técnicas exclusivamente de fase sólida, por técnicas parcialmente de fase sólida, por condensación de fragmentos o por acoplamientos en solución clásicos.

En la síntesis de péptidos en fase líquida convencional, se puede preparar la cadena peptídica mediante una serie de reacciones de acoplamiento en las que se añaden los aminoácidos constitutivos a la cadena peptídica en crecimiento en la secuencia deseada. El uso de diversos reactivos de acoplamiento, por ejemplo, la diciclohexilcarbodiimida o el diisopropil-carbonildiimidazol, diversos ésteres activos, por ejemplo, ésteres de N-hidroxiftalimida o N-hidroxisuccinimida, y los diversos agentes de escisión, para llevar a cabo la reacción en solución, con el aislamiento y la purificación posteriores de intermedios, es bien conocida en la metodología clásica de los péptidos. Se describe la síntesis en solución clásica en detalle en el tratado "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", (1974). Las técnicas de síntesis exclusivamente en fase sólida se exponen en el libro de texto "Solid-Phase Peptide Synthesis", (Stewart y Young, 1969), y están ilustradas por la descripción de la patente de Estados Unidos 4.105.603 (Vale y col., 1978). El procedimiento de síntesis por condensación de fragmentos se ilustra en la patente de Estados Unidos 3.972.859 (1976). Otras síntesis disponibles se ilustran en las patentes de Estados Unidos Nº 3.842.067 (1974) y 3.862.925 (1975). La síntesis de péptidos que contienen residuos de ácido \gamma-carboxiglutámico está ilustrada por Rivier y col. (1987), Nishiuchi y col. (1993) y Zhou y col. (1996). Se han descrito síntesis de conopéptidos en las patentes de Estados Unidos Nº 4.447.356 (Olivera y col., 1984), 5.514.774 (Olivera y col., 1996) y 5.591.821 (Olivera y col., 1997).

Tales síntesis químicas tienen en común la protección de los grupos de cadenas laterales lábiles de los distintos restos de aminoácidos con grupos protectores adecuados que impedirán que se produzca una reacción química en ese sitio hasta que el grupo se retire finalmente. Habitualmente también es común la protección de un grupo \alpha-amino en un aminoácido o un fragmento mientras que esa entidad reacciona en el grupo carboxilo, seguida de la retirada selectiva del grupo protector del \alpha-amino para permitir que una reacción posterior pueda tener lugar en ese sitio. Por consiguiente, es común que, como etapa en una síntesis de este tipo, se produzca un compuesto intermedio que incluye cada uno de los residuos de aminoácidos localizados en su secuencia deseada en la cadena peptídica con grupos protectores de cadenas laterales adecuados unidos a varios de los residuos que tienen cadenas laterales lábiles.

En lo que se refiere a la selección de un grupo protector de aminos de una cadena lateral, por lo general se elige uno que no se retira durante la desprotección de los grupos \alpha-amino durante la síntesis. Sin embargo, para ciertos aminoácidos, por ejemplo, His, generalmente no es necesaria protección alguna. En la selección de un grupo protector de cadena lateral concreto que se vaya a usar en la síntesis de los péptidos, se siguen las reglas generales siguientes: (a) preferiblemente el grupo protector conserva sus propiedades protectoras y no se separa en condiciones de acoplamiento, (b) el grupo protector debería ser estable en las condiciones de reacción que se escogen para retirar el grupo \alpha-amino protector en cada etapa de la síntesis, y (c) se debe poder retirar el grupo protector de cadena lateral, al haberse finalizado la síntesis que contiene la secuencia de aminoácidos deseada, en condiciones de reacción que no modificarán indeseablemente la cadena peptídica.

Debería ser posible preparar muchos de, o incluso todos, estos péptidos mediante el uso de tecnología del ADN recombinante. Sin embargo, cuando no se preparan los péptidos así, se preparan preferiblemente mediante el uso de la síntesis en fase sólida de Merrifield, aunque se puedan usar también otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica como se mencionó anteriormente. La síntesis en fase sólida empieza desde el extremo C-terminal del péptido por acoplamiento de un \alpha-aminoácido protegido a una resina adecuada. Se puede preparar un material de partida semejante mediante la unión de un aminoácido con el \alpha-amino protegido por un enlace éster a una resina clorometilada o una resina de hidroximetilo, o por un enlace amida a una resina de benzhidrilamina (BHA) o una resina de parametilbenzhidrilamina (MBHA). La preparación de la resina de hidroximetilo está descrita por Bodansky y col. (1966). Las resinas clorometiladas se pueden adquirir en el mercado de Bio Rad Laboratories (Richmond, CA) y de Lab. Systems, Inc. La preparación de una resina de este tipo está descrita por Stewart y Young (1969). Los soportes de resinas de BHA y de MBHA están disponibles en el mercado, y se usan por lo general cuando el polipéptido deseado que se está sintetizando tiene una amida no sustituida en el extremo C-terminal. Por lo tanto, los soportes de resinas sólidos pueden ser cualquiera de los conocidos en la técnica, tal como uno que tiene las fórmulas soporte de resina -O-CH_{2}-, soporte de resina-NH-BHA, o soporte de resina-NH-MBHA. Cuando se desea una amida no sustituida, se prefiere el uso de una resina de BHA o MBHA, porque la escisión proporciona directamente la amida. En el caso de que se desee la N-metil amida, se puede generar a partir de una resina de N-metil BHA. Si se desearan otras amidas sustituidas, se pueden usar las enseñanzas de la patente de Estados Unidos Nº 4.569.967 (Kornreich y col., 1986), o si se desearan otros grupos todavía que el ácido libre en el extremo C-terminal, puede ser preferible sintetizar el péptido mediante el uso de procedimientos clásicos como se exponen en el texto de Houben-Weyl (1974).

El aminoácido C-terminal, protegido por Boc o Fmoc y por un grupo protector de cadena lateral, si fuera necesario, se puede acoplar primero a una resina clorometilada según el procedimiento expuesto en Horiki y col. (1978), mediante el uso de KF en DMF a aproximadamente 60ºC durante 24 horas con agitación, cuando se quiere sintetizar un péptido que tiene un ácido libre en el extremo C-terminal. Después del acoplamiento del aminoácido protegido por BOC- al soporte de resina, se retira el grupo \alpha-amino protector, como mediante el uso de ácido trifluoracético (TFA) en cloruro de metileno o TFA solo. Se lleva a cabo la desprotección a una temperatura entre aproximadamente 0ºC y la temperatura ambiente. Se pueden usar otros reactivos de escisión corrientes, tales como el HCl en dioxano, y condiciones para la retirada de grupos \alpha-amino protectores específicos tal como se describe en Schroder y

\hbox{Lubke (1965).}

Tras la retirada del grupo \alpha-amino protector, se acoplan los aminoácidos con los \alpha-amino y las cadenas laterales protegidos restantes por etapas en el orden deseado para obtener los compuestos intermedios que se han definido anteriormente, o como alternativa a la adición de cada aminoácido por separado en la síntesis, se pueden acoplar algunos de ellos el uno al otro antes de añadirlos al reactor en fase sólida. La selección de un reactivo de acoplamiento apropiado cabe dentro de los conocimientos de la técnica. La N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, DIC, HBTU, HATU, TBTU en presencia de HoBt o HoAt) es particularmente adecuada como agente de acoplamiento.

Los reactivos activadores que se usan en la síntesis de los péptidos en fase sólida son bien conocidos en la técnica de los péptidos. Son ejemplos de reactivos activadores adecuados las carbodiimidas, tales como la N,N'-diisopropilcarbodiimida y la N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Otros reactivos activadores y su uso en el acoplamiento de péptidos están descritos por Schroder y Lubke (1965) y Kapoor (1970).

Cada aminoácido o secuencia de aminoácidos protegidos se introduce dentro del reactor de fase sólida en un exceso de aproximadamente dos veces o más, y el acoplamiento se puede llevar a cabo en un medio de dimetilformamida (DMF):CH_{2}Cl_{2} (1:1) o en DMF o CH_{2}Cl_{2} solo. En los casos en los que se produce acoplamiento de intermedios, se repite el procedimiento de acoplamiento antes de retirar el grupo \alpha-amino protector antes del acoplamiento del siguiente aminoácido. El éxito de la reacción de acoplamiento en cada etapa de la síntesis, si se realiza manualmente, se sigue preferiblemente mediante la reacción de la ninhidrina, como está descrito por Kaiser y col. (1970). Las reacciones de acoplamiento se pueden llevar a cabo automáticamente, como en un sintetizador automático Beckman 990, mediante el uso de un programa como el que comunican Rivier y col. (1978).

Después de que se haya acabado la síntesis de la secuencia de aminoácidos deseada, se puede retirar el péptido intermedio del soporte de resina por tratamiento con un reactivo, tal como el fluoruro de hidrógeno líquido o el TFA (si se usa química de Fmoc), el cual no sólo escinde el péptido de la resina, sino que también escinde todos los grupos protectores de cadenas laterales que quedaban y también el grupo \alpha-amino protector del extremo N-terminal si no se hubiera retirado anteriormente para obtener el péptido en forma del ácido libre. Si la Met se encuentra presente en la secuencia, se prefiere retirar el grupo protector Boc primero mediante el uso de ácido trifluoracético (TFA)/etanoditiol antes de escindir el péptido de la resina con HF para eliminar las S-alquilaciones potenciales. Cuando se usa el fluoruro de hidrógeno o el TFA para la escisión, se incluyen uno o más barredores tales como el anisol, el cresol, el sulfuro de dimetilo y el metiletilsulfuro en el recipiente de reacción.

Se realiza preferiblemente la ciclación del péptido lineal, en vez de la ciclación del péptido mientras forma parte de la péptido-resina, para crear enlaces entre residuos de Cys. Para llevar a cabo un enlace disulfuro ciclado de este tipo, se puede escindir el péptido enteramente protegido de un soporte de resina hidroximetilada o de resina clorometilada por amonolísis, como bien se sabe en la técnica, para producir el intermedio amida enteramente protegido, el cual se cicla apropiadamente después y se desprotege. Si no, la desprotección, así como la escisión del péptido de las resinas anteriores o de una resina de benzhidrilamina (BHA) o de metilbenzhidrilamina (MBHA), puede tener lugar a 0ºC con ácido fluorhídrico (HF) o TFA, seguidas de una oxidación como se ha descrito anteriormente. Un procedimiento adecuado para la ciclación es el procedimiento descrito por Cartier y col. (1996).

También se contemplan aquí a las muteinas, los análogos o fragmentos activos de la contulaquina-G o la Thr_{10}-g contulaquina-G anteriores. Véase, por ejemplo, Hammerland y col. (1992). Se pueden sintetizar muteinas, análogos o fragmentos activos de derivados de los péptidos conotoxinas según técnicas conocidas, incluidas sustituciones conservadoras de aminoácidos, tal como se resume en las patentes de Estados Unidos Nº 5.545.723 (véase en particular col. 2, línea 50 hasta col. 3, línea 8); 5.534.615 (véase en particular col. 19, línea 45 hasta col. 22, línea 33); y 5.364.769 (véase en particular col. 4, línea 55 hasta col. 7, línea 26).

Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la presente invención como ingrediente activo se pueden preparar según técnicas convencionales de composición farmacéutica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). Típicamente, se mezclará una cantidad antagonista del ingrediente activo con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede tomar una amplia diversidad de formas según la forma de preparación deseada para la administración, por ejemplo, intravenosa, oral o parenteral.

Para la administración oral, se pueden formular los compuestos en preparaciones líquidas o sólidas tales como cápsulas, píldoras, comprimidos, pastillas, crisoles, polvos, suspensiones o emulsiones. En la preparación de las composiciones en formas posológicas orales, se pueden emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales, tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes, agentes de suspensión, y similares en el caso de preparaciones orales líquidas (tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones); o vehículos tales como almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, agregantes, agentes de desintegración y similares en el caso de preparaciones orales sólidas (tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos). Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma unitaria posológica oral más ventajosa, en cuyo caso se emplean obviamente vehículos farmacéuticos sólidos. Si se desea, se pueden revestir los comprimidos con azúcar o una película entérica mediante técnicas corrientes.

Para la administración parenteral, se puede disolver el compuesto en un vehículo farmacéutico y administrarlo o bien como una solución o bien como una suspensión. Son ejemplos de vehículos adecuados, el agua, una solución salina, soluciones de dextrosa, soluciones de fructosa, el etanol, o aceites de origen animal, vegetal o sintético. El vehículo puede contener también otros ingredientes, por ejemplo, conservantes, agentes de suspensión, agentes de solubilización, tampones y similares. Cuando los compuestos son para administración intratecal, se pueden disolver también en fluido cefalorraquídeo.

La administración del agente activo según esta invención se puede conseguir mediante el uso de cualquier medio de administración adecuado, incluidos:

(a) bomba (véanse, por ejemplo, Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984));

(b) microencapsulación (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 4.352.883; 4.353.888; y 5.084. 350);

(c) implantes de polímeros de liberación continua (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.883.666);

(d) macroencapsulación (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 5.284.761, 5.158.881, 4.976.859 y 4.968.733 y las solicitudes de patente PCT publicadas WO92/19195, WO95/05452);

(e) injertos de células desnudas o no encapsuladas en el SNC (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 5.082.670 y 5.618.531);

(f) inyección, bien sea por vía subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, o en cualquier otro sitio adecuado; o

(g) administración oral, en formulación en cápsula, líquida, en comprimido, en píldora, o de liberación prolongada.

En una realización de esta invención, se administra un agente activo directamente en el SNC, preferiblemente a los ventrículos cerebrales, el parénquima cerebral, el espacio intratecal, u otro lugar adecuado del SNC, más preferiblemente intratecalmente.

Si no, se pueden usar terapias dirigidas para administrar el agente activo más específicamente a ciertos tipos de células, mediante el uso de sistemas de direccionamiento tales como anticuerpos o ligandos específicos para células. El direccionamiento puede ser deseable por una diversidad de motivos, por ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico, si de otra manera requiriera una posología demasiado alta, o si de lo contrario no fuera capaz de entrar en las células diana.

Los agentes activos, que son péptidos, se pueden administrar también en un sistema de administración basado en células en el cual se introduce una secuencia de ADN que codifica un agente activo dentro de células diseñadas para su implantación en el cuerpo del paciente, en particular en la región de la médula espinal. Se describen sistemas de administración adecuados en la patente de Estados Unidos Nº 5.550.050 y en las solicitudes PCT publicadas Nº WO92/19195, WO94/25503, WO95/01203, WO95/05452, WO96/02286, WO96/02646, WO96/40871, WO96/40959 y WO97/12635. Se pueden preparar secuencias de ADN adecuadas sintéticamente para cada agente activo en base a las secuencias desarrolladas y el código genético conocido.

Se prefiere administrar el agente activo en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad realmente administrada, y la velocidad y la evolución en el tiempo de la administración dependerán de la naturaleza y de la gravedad de la dolencia que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones en cuanto a la posología, la periodicidad, etc., cabe dentro de la responsabilidad de los médicos de cabecera o especialistas, y toma típicamente en cuenta el trastorno que se tiene que tratar, el estado del paciente individual, el sitio de administración, el procedimiento de administración, y otros factores conocidos por los médicos. Se pueden encontrar ejemplos de técnicas y de protocolos en Remington's Pharmaceutical Sciences. Típicamente, los agentes activos de la presente invención exhiben su efecto a un intervalo posológico de desde aproximadamente 0,001 \mug/kg hasta aproximadamente 500 \mug/kg, preferiblemente desde aproximadamente 0,01 \mug/kg hasta aproximadamente 100 \mug/kg, del ingrediente activo, más preferiblemente, desde aproximadamente 0,10 \mug/kg hasta aproximadamente 50 \mug/kg, y muy preferiblemente, desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 10 \mug/kg. Se puede administrar una dosis adecuada en múltiples subdosis por día. Típicamente, una dosis o subdosis puede contener desde aproximadamente 0,1 \mug hasta aproximadamente 500 \mug del ingrediente activo por forma posológica unitaria. Una posología más preferida contendrá desde aproximadamente 0,5 \mug hasta aproximadamente 100 \mug de ingrediente activo por forma posológica unitaria. Las posologías empiezan por le general a niveles inferiores y se incrementan hasta que se consigan los efectos deseados.

Ejemplos

La presente invención se detalla más aún en los siguientes ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustración y no se pretende que restrinjan la invención de modo alguno. Se utilizan técnicas corrientes bien conocidas en la técnica o las técnicas que se describen específicamente más adelante. Las abreviaturas que se utilizan son: Bop, hexafluorofosfato de benzotriazoiloxi-tris(dimetilamino)fosfonio; Boc, tert butiloxicarbonilo; Fmoc, 9-fluoroenilmetoxicarbonilo; Gal, galactosa; GalNAc, N-acetilgalactosamina; hNTR1, receptor humano para la neurotensina de tipo 1; Hex, hexosa; HexNAc, N-acetilhexosamina; icv, intracerebroventricular; ISL, ionización secundaria líquida; MALD, desorción por láser con ayuda matricial; EM, espectrometría de masas; mNTR3, receptor de ratón para la neurotensina de tipo 3; nano-ESI, nanoelectropulverización; NMP, N-metilpirrolidona; RMN, resonancia magnética nuclear; ppm, partes por millón; rNTR1, receptor de rata para la neurotensina de tipo 1; rNTR2, receptor de rata para la neurotensina de tipo 2; RP-HPLC, cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa. Los aminoácidos se indican mediante las abreviaturas típicas de una o tres letras.

Ejemplo 1 Procedimientos experimentales para el análisis inicial de la contulaquina-G 1. Veneno crudo

Se recogieron especímenes de Conus geographus de las Islas Marinduque en las Filipinas. Se obtuvo el veneno crudo por disección de la glándula de canales de veneno y luego se liofilizó y se almacenó a -70ºC.

2. Purificación de péptidos

Se extrajo el veneno (1 g) de C. geographus liofilizado con ácido acético al 1,1% y se realizó una cromatografía en una columna de Sephadex G-25 que se eluyó con ácido acético al 1,1% como se ha descrito anteriormente (Olivera y col., 1984). Se purificó un péptido que vuelve a los ratones perezosos e insensibles mediante una serie de purificaciones por RP-HPLC en columnas C_{18} de fase inversa preparativas y semipreparativas y analíticas. Se usó un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 0,1% para eluir el péptido de las columnas. Las especies más importantes se volvieron a purificar antes de su caracterización más detallada. Brevemente, se extrajo un gramo de veneno crudo liofilizado de Conus geographus y se aplicó a una columna de Sephadex G-25 como se ha descrito anteriormente (Olivera y col., 1984). Se mezclaron tres fracciones consecutivas que contenían actividades paralíticas y somníferas (Ve/Vo = 1,37 a 1,41), se aplicaron a una columna preparativa en fase inversa Vydac C_{18} y se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 0,1% (Figura 1). El componente señalado con una flecha en la figura 1 provocó temblores y la muerte cuando se administró a ratones por vía icv. Este se aplicó a una columna C_{18} semipreparativa, se eluyó con un gradiente de 12-42% de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 0,1%. El componente que volvía a los ratones insensibles cuando se administraba por vía icv, se purificó más aún con una elución isocrática a 20,4% de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 0,1%. Un ratón al que se le inyectó por vía icv una alícuota del componente tenía dificultades para enderezarse al cabo de 5 min y se volvió muy perezoso al cabo de 12 min. En aproximadamente 25-30 min, el ratón estaba estirado y descansaba sobre el estómago.

3. Bioactividad

Típicamente, los ratones a los que se les inyectó el péptido nativo parcialmente purificado por icv tenían dificultades para enderezarse al cabo de 5 min, se volvieron perezosos al cabo de 12 min y luego descansaban sobre su estómago al cabo de 30 min. Estos síntomas se usaron como ensayo para identificar el péptido biológicamente activo durante la purificación.

4. Hidrólisis enzimática

Se incubó aproximadamente 180 pmol del péptido (6 \mul) con 7 mU de \beta-galactosidasa (testículos bovinos) (2 \mul) en 50 \mul de tampón citrato/fosfato 50mM (pH 4,5) durante 53 h a 32ºC. Se incubó aproximadamente 60 pmol del péptido (2 \mul) con 2 mU de O-glucosidasa (Diplococcus pneumoniae) (2 \mul) en 50 \mul de ácido cacodílico 20 mM (pH 6,0) durante 19 h a 32ºC.

5. Análisis de la secuencia química y de los aminoácidos

Se llevó a cabo el análisis automatizado de la secuencia química en un 477A Protein Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se llevó a cabo el análisis de aminoácidos mediante el uso de una derivatización anterior a la columna. Se selló aproximadamente 500 pmol de contulaquina-G en vacío con HCl concentrado, se hidrolizó a 110ºC durante 24 h, se liofilizó y luego se derivatizó con o-ftalaldehído. Los aminoácidos derivatizados se analizaron a continuación por RP-HPLC.

6. Espectrometría de masas

Se midieron los espectros de masa por desorción por láser con ayuda matricial (MALD) (Hillenkamp y col., 1993) mediante el uso de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (Cotter, 1989) "Bruker REFLEX" (Bruker Daltonics, Billerica, MA) provisto de un reflectron sin rejilla, un láser de N_{2} y un digitalizador de 100 MHz. Se emplearon un voltaje de aceleración de +31 kV y un voltaje de reflector de entre 1,16 y 30 kV para las medidas de desintegración después de la fuente (Spengler y col., 1992). Se aplicó la muestra (en ácido trifluoracético acuoso al 0,1%) con ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico. Se midieron los espectros de masa por ionización secundaria líquida (ISL) (Barber y col., 1982) mediante el uso de un espectrómetro de masas de doble focalización Jeol HX110 (Jeol, Tokio, Japón) que se hizo funcionar a un voltaje de aceleración de 10 kV, con una resolución de 1000 ó 3000. La muestra (en ácido trifluoracético acuoso al 0,1% y acetonitrilo al 25%) se mezcló en una matriz de tioglicerol y ditiotreitol. Se midieron los espectros de masas por nanoelectropulverización (nano-ESI) mediante el uso de un espectrómetro de masas de trampa de iones Esquire (Bruker Daltonics, Billerica, MA). La muestra purificada por RP-HPLC, recogida en ácido trifluoracético acuoso al 0,1% y acetonitrilo se diluyó en metanol 1% ácido acético, se transfirió a un capilar de nanopulverización y se analizó. La precisión de la masa fue típicamente mejor que 1000 ppm para el instrumento de tiempo de vuelo, 200 ppm para el instrumento de trampa de iones, y 20-100 ppm para el espectrómetro de masas de doble focalización según los ajustes del poder de resolución del instrumento de sector magnético empleado.

7. Síntesis de contulaquina-G

La síntesis del glicopéptido en fase sólida se llevó a cabo manualmente mediante el uso de la química del Fmoc, con protección de la cadena lateral por t-butiléter para la tirosina y la serina, protección de la cadena lateral por N-t-Boc para la lisina, y protección de la cadena lateral por t-butiléster para el ácido glutámico (los aminoácidos protegidos se adquirieron de Bachem, Torrance, CA). Con una resina Wang de partida, se acoplaron los aminoácidos con Bop/diisopropiletilamina/N-metilpirrolidona/diclorometano (Stewart y col., 1984; LeNguyen y col., 1986) y las N-desprotecciones se llevaron a cabo con N-metilpirrolidona/piperidina (Stewart y col., 1984; LeNguyen y col., 1986). La resina Wang se preparó en el Salk Institute con una sustitución de 0,2 nmol/g. Después del acoplamiento de los seis primeros aminoácidos, se acopló la resina con Fmoc-O\beta-D-Galp-(1\rightarrow3)-\alpha-D-GalpNAc-(1\rightarrowO)-treonina peracetilada, que se sintetizó según se describe en otra parte (Luning y col., 1989), seguido del acoplamiento individual de los nueve aminoácidos restantes en la secuencia. Se tomó la precaución de eliminar las impurezas de ácido acético y acetato de los aminoácidos glicosilados; esto incluyó la purificación por cromatografía en gel de sílice mediante el uso de diclorometano-etilacetato 4:1 como eluyente, la concentración y la liofilización final del producto a partir de benceno. De modo similar, se sintetizó el péptido no glicosilado mediante el uso de Fmoc-treonina (Bachem, Torrance, CA). Se sometió la resina a condiciones de escisión (95% ácido trifluoracético/5% anisol (Stewart y col., 1984)), y en el caso del glicopéptido, se aisló el glicopéptido peracetilado obtenido por RP-HPLC, la m/z 2322,3 (análisis por MALD) del componente principal correspondiendo al producto deseado (2322,0 Da). Después de la liofilización, se trató el glicopéptido peracetilado con 20 \mul de metóxido de sodio (Sigma, St Louis, MO)(50 mM) en metanol seco durante 1 minuto (para retirar los grupos O-acetilo del azúcar (Norberg y col., 1994)) y se liofilizó a -20ºC. Se cargó la muestra desacetilada en un sistema de cromatografía Prep LC/System 500A de Waters provisto de un controlador de gradiente, un detector de longitud de onda variable Modelo 450 de Waters, y una columna (65,5 x 320 mm) de cámara para cartuchos 1000 PrepPack de Waters empaquetada con partículas Vydac C_{18} de 15-20 \mum. Condiciones de caudal: longitud de onda 230 nm, AUFS 2,0, caudal 100 ml/min, gradiente 20-60% B/60 min; (donde el tampón A fue ácido trifluoracético al 0,1% en agua y el tampón B fue ácido trifluoracético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 60%). Se recogieron las fracciones (200 ml) manualmente. El componente principal, m/z 2069,9 (análisis por ISL), correspondía al producto deseado (2069,98 Da). Después de la purificación por RP-HPLC preparativa, se obtuvo suficiente contulaquina-G purificada para la caracterización analítica y estudios biológicos. Se presentará una caracterización más amplia de la contulaquina-G sintética que incluye datos de ^{1}H RMN en otra parte.

8. Co-elución

La contulaquina-G nativa y sintética se analizaron por separado y co-eluyeron por RP-HPLC, mediante el uso de una columna Vydac C_{18} de 2,1 x 150 mm y un gradiente de 0,5%/min desde 0% B hasta 40% B (donde el tampón A fue ácido trifluoracético al 0,55% en agua y el tampón B fue ácido trifluoracético al 0,05% en acetonitrilo acuoso al 90%).

9. Estudios de unión

Se ensayaron la Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada y la contulaquina-G sintética con el receptor humano para la neurotensina de tipo 1 (hNTR1) mediante el uso de una terminal de trabajo robotizada Biomek 1000 para todos los pasos de pipeteo en los ensayos de unión de ligandos radiactivos, como se ha descrito con anterioridad (Cusack y col., 1993). Los ensayos de unión por competición con [^{3}H] neurotensina_{1-13} (1 nM) y concentraciones variables de neurotensina_{1-13}, Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada o contulaquina-G sintética se llevaron a cabo con preparaciones de membranas de la línea celular HEK-293. Se determinó la unión no específica con neurotensina_{1-13} 1 \muM no marcada en tubos de ensayo con un volumen total de 1 ml. La incubación se hizo a 20ºC durante 30 min. El ensayo se detuvo de forma rutinaria por adición de NaCl frío al 0,9% (5 x 1,5 ml), seguido de una rápida filtración a través de una tira de filtro GF/B que se había tratado previamente con polietilenimina al 0,2%. Los detalles de los ensayos de unión se han descrito con anterioridad (Cusack y col., 1991). Se analizaron los datos mediante el uso del programa LIGAND (Munson y col., 1980).

Se ensayaron la Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada y la contulaquina-G sintética por separado con los receptores de rata para la neurotensina de tipo 1 y de tipo 2 (rNTR1 y rNTR2) y el receptor de ratón para la neurotensina de tipo 3 (mNTR3). Se preparó y se purificó la [^{125}I-Tyr^{3}] neurotensina_{1-13} según se ha descrito con anterioridad (Saadoul y col., 1984). Se hicieron crecer células CHO a las que se realizó una transfección permanente que expresan o bien el rNTR1 (Tanaka y col., 1990) o el rNTR2 (clonado en el laboratorio de J. Mazella mediante el cribado de una biblioteca de ADNc cerebral de rata (Stratagene)) en DMEM que contenía suero de ternera fetal al 10% y 0,25 mg/ml de G418 (Sigma, Francia). Se prepararon productos homogeneizados de membranas celulares como se describió inicialmente (Chabry y col., 1994). Se determinó la concentración en proteínas mediante el procedimiento de Bio-Rad con ovoalbúmina como patrón.

10. Experimentos de unión en membranas celulares

Se incubaron las membranas (25 \mug para NTR2 y 10 \mug para NTR1) con [^{125}I-Tyr^{3}] neurotensina_{1-13} (2000 Ci/mmol) 0,4 nM y concentraciones crecientes de neurotensina_{1-13}, Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada o contulaquina-G sintética durante 20 min a 25ºC en 250 \mul de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía sueroalbúmina bovina al 0,1% y 1-10-fenantrolina 0,8 mM. Se detuvieron los experimentos de unión mediante la adición de 2 ml de tampón helado seguida de la filtración a través de filtros de acetato de celulosa (Sartorius) y dos lavados. Se contó la radiactividad retenida en los filtros con un contador \gamma.

11. Experimentos de unión con extractos solubilizados

Se incubaron extractos (100 \mug) solubilizados con CHAPS con [^{125}I-Tyr^{3}] neurotensina_{1-13} 0,2 nM durante 1 h a 0ºC en 250 \mul de tampón Tris-glicerol que contenía CHAPS al 0,1%. Se separó el ligando unido del ligando libre por filtración a través de filtros GF/B que se trataron previamente con polietilenimina al 0,3%. Los filtros se lavaron rápidamente dos veces con 3 ml de tampón helado y se contó su radiactividad.

Para los experimentos de unión con mNTR3, se volvieron a poner en suspensión productos de homogeneización de membrana procedentes de cerebros de ratón en tampón Tris-HCl 25 mM (pH 7,5) que contenía glicerol al 10% (p/v), fenilmetilsulfonilfluoruro 0,1 mM, pepstatina 1 \muM, iodoacetamida 1 mM, y EDTA 5 mM (tampón Tris-glicerol). Se llevó a cabo la solubilización mediante la incubación de los productos de homogeneización a una concentración de 10 mg/ml en el tampón Tris-glicerol con CHAPS al 0,625% que contenía CHS al 0,125% (Mazella y col., 1988). Se recuperaron los extractos solubilizados por centrifugación a 100.000 x g durante 30 min a 4ºC y se usaron inmediatamente o se almacenaron a -20ºC.

12. Determinación de fosfoinositidos

Se hicieron crecer células que expresan rNTR1 o NTR2 en placas de 12 pocillos durante 15-18 h en presencia de 1 \muCi de mio-[^{3}H]inositol (ICN) en un medio exento de suero HAM-F-10. Se lavaron las células con tampón de Earle, pH 7,5, (Hepes 25 mM, Tris 25 mM, NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, MgCl_{2} 0,8 mM, glucosa 5 mM) que contenía sueroalbúmina bovina al 0,1%, y se incubaron durante 15 min a 37ºC en 900 \mul de LiCl 30 mM en tampón de Earle. A continuación, se añadió neurotensina_{1-13} a las concentraciones que se indican durante 15 min. Se detuvo la reacción mediante 750 \mul de HCOOH 10 mM helado, pH 5,5. Al cabo de 30 min a 4ºC, se recogió el sobrenadante y se neutralizó con 2,5 ml de NH_{4}OH 5 mM. Se separaron los [^{3}H]fosfoinositidos (PIs) del [^{3}H]inositol libre por cromatografía en Dowex AG-X8 (Bio-Rad) (Van Renterghem y col., 1988) por elución consecutiva con 5 ml de agua y 4 ml de formato de amonio 40 mM y 1 M, pH 5,5. Se contó la radiactividad contenida en la fracción de 1 M después de la adición de 5 ml de Ecolume (ICN).

13. Identificación de un clon de ADNc que codifica la contulaquina-G

Se escogieron clones que codifican la contulaquina-G a partir de una biblioteca de ADNc fraccionada por tamaños que se construyó mediante el uso de ARNm obtenido a partir de un canal de veneno de Conus geographus según se ha descrito con anterioridad (Colledge y col., 1992). Se cribó la biblioteca mediante el uso de una sonda específica que corresponde a los aminoácidos números 10-15 del péptido (5'-ATR ATN GGY TTY TTN GT-3'; SEC ID Nº: 3). Se marcó el oligonucleótido en un extremo, se hibridó y se llevó a cabo un cribado secundario mediante la reacción en cadena de la polimerasa de 10 clones que hibridaron con esta sonda como se ha descrito con anterioridad (Jiménez y col., 1996). Se prepararon los clones identificados en el cribado secundario para el establecimiento de la secuencia de ADN como se ha descrito con anterioridad (Monje y col., 1993). La secuencia del ácido nucleico se determinó según el protocolo típico para el kit de establecimiento de secuencias de ADN Sequenase versión 2.0 como se ha descrito con anterioridad (Jiménez y col., 1996).

Ejemplo 2 Purificación de la contulaquina-G

Se detectó una fracción del veneno de Conus geographus que volvía a los ratones extremadamente perezosos. Normalmente, cuando se pincha a unos ratones sentados con una barra, éstos se levantan inmediatamente y corren una distancia considerable. Tras una inyección i.c.v. de la fracción de Conus geographus que se indica en la figura 5, había que pinchar a los ratones con una fuerza mucho mayor antes de que se levantaran mínimamente, y después de levantarse, darían uno o dos pasos y se sentarían inmediatamente de nuevo. Este "comportamiento perezoso" se siguió a través de varias etapas de purificación, y se analizó más en detalle el péptido aparentemente homogéneo. Este péptido se denominó contulaquina-G (la palabra filipina tulakin' significa "tiene que ser empujado o pinchado", de la palabra raíz tulak, empujar). La "G" indica que el péptido procede de Conus geographus.

Ejemplo 3 Caracterización bioquímica de la contulaquina-G purificada

El análisis intentado de la secuencia de aminoácidos del péptido purificado reveló que el péptido estaba bloqueado en el extremo N-terminal. Puesto que la mayoría de los péptidos de Conus bloqueados en el extremo N-terminal tienen un residuo piroglutamato en la posición 1, se trató el péptido con la piroglutamato aminopeptidasa. Esto dio como resultado un desplazamiento del tiempo de retención lo cual sugiere la retirada del residuo de piroglutamato. Después del tratamiento enzimático, se obtuvo la secuencia Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Xaa-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 4) mediante métodos de Edman corrientes lo cual confirmó la retirada del residuo de piroglutamato, donde Xaa indica que no se asignó aminoácido en el 9º ciclo (en la posición 10) aunque se obtuvo una señal muy debil indicadora de treonina. Los análisis de aminoácidos concordaban con la presencia de un residuo de treonina en el péptido.

Para confirmar la naturaleza del residuo de aminoácido en la posición 10, se aisló un clon de ADNc que codifica el péptido. La secuencia nucleotídica y la supuesta secuencia de aminoácidos que el clon reveló se muestran en la Tabla I y en la SEC ID Nº: 5 y la SEC ID Nº: 6, respectivamente. Se encuentra que la secuencia de aminoácidos de la contulaquina-G que se obtuvo por establecimiento de la secuencia de Edman directo está codificada hacia el extremo C-terminal del único marco abierto de lectura significativo en el clon (en los residuos 51-66); la secuencia de aminoácidos pronosticada revela que la posición 10 del péptido maduro (residuo 60 del precursor) está codificada por un codón para la treonina. Por lo tanto, el establecimiento de la secuencia por Edman, junto con los resultados de la clonación, sugiere que había un residuo de treonina modificada presente en la posición 10.

TABLA 1 Secuencias de ADN (SEC ID Nº: 5) y peptídica (SEC ID Nº: 6) de la contulaquina-G

1

Los análisis por espectrometría de masas (MALD, ISL y nano-ESI) de la fracción purificada de contulaquina-G pusieron al descubierto una diversidad de especies intactas como se resume en la Tabla 2. Se observó alguna variación en la intensidad de las distintas especies con distintas técnicas de ionización, que se atribuyeron a diferencias en el sesgo (Craig y col., 1994) con cada técnica de ionización. En el análisis siguiente, los autores se han concentrado en la forma glicosilada principal de masa intacta M_{i} = 2069 que se observó con todas las técnicas de ionización estudiadas. La diferencia entre la masa observada (2069 Da) y la masa calculada para la secuencia en el supuesto de una Thr en el residuo 10 (1703,83 Da) era de 365 Da. Puesto que una de las posibles modificaciones de la treonina es una O-glicosilación, los autores propusieron, basándose en esta diferencia de masa, que el residuo no identificado era hexosa-N-acetil-hexosamina-treonina (Hex-HexNAc-Thr) lo cual daría por resultado la adición de 365,13 Da. Las masas observadas (Tabla 2) concuerdan con la masa monoisotópica calculada de la [M_{i} + H]^{+} o [M_{i} + 2H]^{2+} del péptido unido al disacárido que se propone (2069,98 ó 1035,5 Da respectivamente). Se observaron intensos iones de fragmentos en el espectro de masas por nano-ESI EM/EM del ión de la molécula intacta doblemente cargado [M_{i} + 2H]^{2+} de la contulaquina-G (Figura 6) que corresponden a la pérdida del glucano Hex-HexNAc entero (indicado p(\chi_{3})_{10} (Craig y col., 1993) o la pérdida del residuo de hexosa terminal (p(\chi_{8})_{10}).

TABLA 2 Especies observadas por análisis por MALD, ISL y nano-ESI de la contulaquina-G purificada

2

^{a}

se observaron igualmente m/z 2091 y 2107 que corresponden a [M_{1}+Na]^{+} y [M_{1}+K]^{+}.

^{b}

se observaron igualmente m/z 2210 y 2225 que corresponden a [M_{3}+Na]^{+} y [M_{3}+K]^{+}.

^{c}

se observaron iones doblemente cargados m/z 1035,3 y 1075,3.

^{d}

se calcularon las masas monoisotópicas [M+H]^{+} basadas en las secuencias propuestas para el glucano y la contulaquina-G.

^{e}

se calcularon las masas [M+H]^{+} medias basadas en las secuencias propuestas para el glucano y la contu- laquina-G.

Ejemplo 4 Pruebas de que la Thr-10 se encuentra O-glicosilada

Se trató la contulaquina-G nativa con \beta-galactosidasa aislada a partir de testículos bovinos. Esta enzima hidroliza de manera preferencial los residuos \beta 1\rightarrow3 galactopiranosilo terminales desde el extremo no reductor de los glicoconjugados. Tras el tratamiento de la muestra nativa con la \beta-galactosidasa, se observó un nuevo componente en RP-HPLC. Se recogió este componente y se analizó por EM-MALD en la que se observó una especie a m/z 1907. La diferencia de masa y la especificidad de la enzima concuerdan con la liberación de un residuo galactosa terminal. Basándose en los resultados de la hidrólisis con la \beta-galactosidasa, los autores razonaron que el resto glucano podría ser susceptible de tratamiento con la O-glucosidasa, que libera el disacárido Gal(\beta 1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow) unido a la serina o la treonina como unidad nuclear de glicopéptidos. De hecho, el tratamiento de la contulaquina-G nativa con la O-glucosidasa dio como resultado una nueva especie después de que se analizara la mezcla de hidrólisis enzimática en RP-HPLC. Se recogió el nuevo componente y se analizó por EM-MALD en la que se observó una especie a m/z 1704 coherente con la pérdida de Hex-HexNAc (es decir, la masa concordaba con la que se pronostica para el péptido con un residuo de treonina no modificada en la posición 10). Los resultados de la hidrólisis enzimática concuerdan con la presencia de un glucano Gal(\beta 1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow). Basándose en los resultados de las hidrólisis con O-glucosidasa y con \beta-galactosidasa, la estructura del glicopéptido más abundante es:

3

Ejemplo 5 Síntesis de las contulaquina-G glicosilada y no glicosilada

Se sintetizó químicamente el péptido no glicosilado de 16 aminoácidos. Se encontró que el material sintético tenía el mismo tiempo de retención en RP-HPLC que la contulaquina-G desglicosilada enzimáticamente. También se sintetizó la contulaquina-G glicosilada de 16 aminoácidos que contenía Gal(\beta 1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow) unido a la Thr_{10}. Esta contulaquina-G glicosilada sintética co-eluyó con la contulaquina-G nativa en RP-HPLC. Los espectros de fragmentación por desintegración después de la fuente que se observaron para la contulaquina-G tanto nativa como sintética presentaron patrones de fragmentación muy similares.

Ejemplo 6 Potencia biológica de las contulaquina-G glicosilada y no glicosilada sintéticas

La pérdida del control motor por el cual se aisló originalmente a la contulaquina-G nativa, junto con las contracciones intestinales, la ausencia de arreglos/acicalamiento, y la sensibilidad reducida a la presión sobre el rabo fueron síntomas que se observaron cuando se administró neurotensina_{1-13}, Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada o contulaquina-G sintética por vía icv. Para estudiar estas observaciones más detalladamente, se realizó una comparación de la respuesta a la dosis como se detalla en la Tabla 3. Mientras que el análogo Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada era activo a dosis de 1 nmol y superiores, no tenía efecto a dosis de 300 pmol. Por contraste, se encontró que la contulaquina-G provocaba una pérdida del control motor a dosis de 30 pmol o aproximadamente 5 pmol/g.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Efecto de la administración de icv de neurotensina_{1-13}, Thr_{10}-contulaquina-G o contulaquina-G en ratones de 14-18 días de edad

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}  \+ Número de ratones afectados.\cr   ^{b}  \+ Edad media
(días) y peso (g).\cr   ^{c}  \+
 \begin{minipage}[t]{145mm}Tiempo medio tras el cual se observó
el comportamiento específico (las observaciones se hicieron cada 2
min durante los primeros 15 min y cada 15 min a partir de entonces).
Los síntomas A y B se observaron después de colocar un ratón encima
de una poyata tras levantarlo por el rabo durante un segundo.
Síntoma A: El ratón se movía como mucho unos pocos pasos y
descansaba con las patas traseras estiradas. El ratón se quedaba
inmóvil a menos que se le empujara o levantara. Síntoma B: El ratón
se quedaba perezoso pero la posición de la parte trasera del cuerpo
en descanso se parecía a la de los controles NSS. Síntoma R:
Recuperación, el ratón se movía libremente cuando se
soltaba.\end{minipage} \cr   ^{d}  \+ No se observó
síntoma.\cr}

Los seis aminoácidos C-terminales de la contulaquina-G presentan una similitud significativa con las secuencias de la neurotensina_{1-13}, la neuromedina, la xenina y el extremo C-terminal de la xenopsina (véase la Tabla 4). Debido a que se observaban síntomas similares cuando se administraba la contulaquina-G o la neurotensina_{1-13} por vía icv, y a la homología significativa entre la contulaquina-G y la neurotensina_{1-13}, los autores analizaron la afinidad de la contulaquina-G para varios de los receptores para la neurotensina clonados. Como se muestra en la Tabla 5, se encontró que el análogo Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada se unía al receptor humano para la neurotensina de tipo I (hNTR1) con una afinidad 10 veces inferior a la de la neurotensina_{1-13}, y con afinidades incluso inferiores con los otros NTR. La contulaquina-G exhibió una afinidad significativamente inferior a la del análogo Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada con todos los NTR probados.

Tanto la contulaquina-G como el análogo Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada actuaron como agonistas cuando se probaron en células CHO que expresaban el rNTR1. No se observó respuesta con células CHO que expresaban el rNTR2. El análogo Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada dio como resultado una potencia ligeramente inferior (0,6 nM) pero con una eficacia similar en comparación a la neurotensina_{1-13}. La potencia de la contulaquina-G glicosilada sintética era significativamente menor (20-30 nM) y su eficacia agonista era aproximadamente la mitad de la que se observaba para la neurotensina_{1-13}.

TABLA 4 Comparación de las secuencias de la contulaquina-G y de miembros de la familia neurotensina de péptidos

5

\text{*}

Indica un residuo de treonina/serina glicosilado con enlace O-.

^{a}

Porcentaje de identidad de los 6 aminoácidos C-terminales en comparación con la contulaquina-G_{11-16}.

^{b}

Porcentaje de similitud de los 6 aminoácidos C-terminales en comparación con la contulaquina-G_{11-16}.

Referencias

(1) Carraway y col., 1973; (2) Minamino y col., 1984; (3) Araki y col., 1973; (4) Feurle y col., 1992.

TABLA 5 Comparación de la afinidad de unión de la neurotensina_{1-13}, la Thr_{10}-contulaquina-G y la contulaquina-G para el receptor clonado humano y de rata para la neurotensina de tipo 1 (NTR1), el receptor de rata para la neurotensina de tipo 2 (rNTR2), y el receptor solubilizado de ratón para la neurotensina de tipo 3 (mNTR3)

Compuesto	CI_{50} (nM)
	Receptor
	hNTR1	rNTR1	rNTR2	mNTR3
neurotensina_{1-13}	1,4	3,2	6,0	1,4
Thr_{10}-contulaquina-G	23	79	170	71
contulaquina-G	960	524	730	250

Ejemplo 7 Actividad biológica de análogos de la contulaquina-G

Se analizó la actividad biológica de diversos análogos peptídicos de la contulaquina-G de un modo similar al que se describió anteriormente mediante inyección icv en ratones. Estos péptidos se sintetizaron como se describió en la presente invención, e incluyen los siguientes análogos:

Ser_{10}-contulaquina-G que contiene la glicosilación nativa en la Ser_{10} (análogo A); y

\Delta1-9-Ser_{10}-contulaquina-G que contiene la glicosilación nativa en la Ser_{10} (análogo B).

Se encontró que el análogo A era ligeramente más activo que la contulaquina-G nativa. También se encontró que el análogo B tenía la misma actividad, es decir, tiempo de aparición y de recuperación que el análogo A cuando se probó en ratones de dos semanas de edad a una dosis de 100 pmol. En esta prueba, los ratones seguían sin poderse enderezar al cabo de 75 minutos. Cuando se probaron en ratones de tres semanas de edad a dosis de 1 nmol y 300 pmol, se observó la misma actividad para ambos análogos y estos ratones estaban somnolientos durante 100 minutos. Estos experimentos demuestran que los análogos glicosilados de la contulaquina-G en los que se han eliminado residuos de aminoácidos N-terminales, conservan actividad. Se alcanzaron resultados similares para otros análogos, tales como la \Delta1-5-Ser_{6}-contulaquina-G que contiene la glicosilación nativa en la Ser_{6} con o sin la glicosilación nativa en la Thr_{10}. Estos resultados demuestran que la colocación de un residuo de serina glicosilada a proximidad del sitio de truncamiento produce análogos activos.

El péptido de Conus que se caracterizó anteriormente, la contulaquina-G, tiene una característica bioquímica novedosa: una treonina O-glicosilada postraduccionalmente que no se ha encontrado con anterioridad en los péptidos de Conus. Mediante el uso de espectrometría de masas y de hidrólisis enzimáticas específicas, se encontró que la Thr_{10} estaba modificada con el disacárido Gal(\beta 1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow). Se sintetizaron las formas glicosiladas y no glicosiladas correspondientes de la contulaquina-G que confirmaron la estructura molecular de esta forma glicosilada principal de la molécula nativa basada en criterios de co-elución en RP-HPLC y fragmentación en EM. Las masas de las demás especies moleculares secundarias que se observaron por espectrometría de masas concuerdan con variaciones estructurales de glucano en sitios periféricos en la unidad nuclear oligosacarádica que se caracterizó (Baenziger, 1994).

Un análisis del clon de ADNc que codifica la contulaquina-G revela que la organización prepropeptídica del precursor de la contulaquina-G es similar a la de otros precursores de péptidos de Conus (Olivera y col., 1997). Se encuentra una secuencia señal típica, y en posición inmediatamente N-terminal respecto a la secuencia de la contulaquina-G se encuentran dos aminoácidos básicos que indican supuestamente una escisión proteolítica para generar el extremo N-terminal del péptido maduro (el residuo de glutamina se ciclaría en piroglutamato o bien espontáneamente o bien debido a la acción de la glutaminil ciclasa (Fischer y col., 1987)). Aunque en la mayoría de los aspectos el precursor de la contulaquina-G tiene la misma organización que todos los demás precursores peptídicos de venenos de Conus y que se pronosticaría que se procesara de la misma forma, los diez aminoácidos C-terminales pronosticados por el clon no se encuentran presentes en la contulaquina-G purificada a partir de veneno. Una posibilidad es que el clon represente una variante distinta, por ejemplo una que se ayustó de otra forma. Si no, puede que sea necesario un procesamiento proteolítico adicional en el extremo C-terminal para generar la contulaquina-G madura.

A lo largo de los últimos 20 años se han identificado un número creciente de glicopéptidos y glicoproteínas biológicamente importantes. La vespulaquinina 1, identificada por vez primera por Pisano y col. (Yoshida y col., 1976), es, que los autores sepan, la única otra toxina peptídica O-glicosilada que se haya aislado de un veneno distinto de Conus. La vespulaquinina 1 se extrajo de las bolsas de veneno de la avispa chaqueta amarilla, Vespula maculifrons. El péptido (TAT*T*RRRGRPPGFSPFR-OH (SEC ID Nº: 12) donde los asteriscos indican un residuo de treonina glicosilado por enlace O-) contiene dos sitios consecutivos de glicosilación por enlace O-. El extremo C-terminal de la vespulaquinina es idéntico a la secuencia de la bradiquinina (RPPGFSPFR-OH (SEC ID Nº: 13)) y se encontró que el péptido provocaba varios síntomas que la bradiquinina provoca también. Por lo tanto, la vespulaquinina es otro ejemplo de una toxina peptídica glicosilada por enlace O- en la que el extremo C-terminal parece dirigir hacia un receptor de neurotransmisores de mamíferos. Así, tanto la contulaquina-G como la vespulaquinina I contienen extensiones N-terminales glicosiladas de secuencias con una homología muy alta respecto a neuropéptidos de mamíferos. La \kappaA-conotoxina SIVA, un inhibidor de los canales de K^{+} es excepcional entre los péptidos de Conus ricos en disulfuros en que tiene una larga cola N-terminal, que tiene un residuo O-glicosilado (Craig y col., 1998).

Para la mayoría de los péptidos de Conus, parece que un conformación específica está estabilizada por múltiples enlaces disulfuro o por el espaciamiento apropiado entre residuos de \gamma-carboxiglutamato para fomentar la formación de hélices \alpha (Olivera y col., 1990). Los péptidos de Conus sin múltiples disulfuros comprenden un conjunto de familias muy ecléctico, que incluye a las conopresinas, las conantoquinas, los contrífanos y ahora a la contulaquina-G. Las conopresinas son probablemente péptidos endógenos de moluscos, claramente homólogos de la familia de péptidos vasopresina/oxitocina; éstos están más ampliamente distribuidos dentro de los tejidos de moluscos que en los canales de veneno de Conus. Sin embargo, puede que los demás péptidos no ricos en disulfuros (conantoquinas, contrífanos y contulaquina-G) sean péptidos especializados de veneno que exhiben modificaciones postraduccionales poco corrientes. Además del resto de treonina O-glicosilado de la contulaquina-G que se describe aquí, se descubrió la \gamma-carboxilación de residuos de glutamato y la epimerización y la bromación de residuos triptófano postraduccionales en las conantoquinas y los contrífanos.

Hay varias series de pruebas que concuerdan con que la contulaquina-G es el primer miembro de la familia de péptidos neurotensina que se aísle de una fuente de invertebrados. En primer lugar, la región C-terminal de la contulaquina-G exhibe un notable grado de similitud con otro miembros de la familia de la neurotensina (todos de vertebrados), como se muestra en la Tabla 4. Además, se mostró anteriormente que la contulaquina-G compite en la unión con los tres subtipos de receptores para la neurotensina conocidos; también se presentan pruebas arriba de que la contulaquina-G actúa como un agonista sobre un receptor para la neurotensina clonado. Sin embargo, lo que es más convincente, cuando se inyecta la contulaquina-G a ratones, se provocan los mismos síntomas conductuales que con la administración de neurotensina. Así, los datos estructurales, los datos de unión y la sintomatología conductual in vivo concuerdan todos con la asignación de la contulaquina-G a la familia de péptidos neurotensina.

Claramente, tanto la contulaquina-G y la Thr_{10}-contulaquina-G no glicosilada son agonistas del rNTR1 a concentraciones fisiológicamente relevantes (20-30 y 0,6 nM, respectivamente). Los efectos agonistas observados tanto para la contulaquina-G como para el análogo no glicosilado, así como la ausencia de efecto agonista alguno de estos ligandos en células CHO que expresan el rNTR2 mediante el uso de un ensayo de acumulación de IP no está en correlación con los datos de unión in vitro: ambos péptidos son agonistas a concentraciones significativamente por debajo de su afinidad de unión CI_{50} (524 y 79 nM, respectivamente). Por lo tanto, dado su afinidad de unión aparentemente más baja, la mayor potencia de la contulaquina-G glicosilada en comparación con el análogo no glicosilado tras su administración icv fue de lo más inesperado.

Así, el papel del glucano es algo paradójico. In vitro, el glucano no aumenta ni la afinidad de unión, ni la potencia agonista, ni la eficacia agonista. Por contraste, in vivo, el glucano aumenta significativamente la potencia del péptido. Una explicación sencilla es que la mayor potencia de la contulaquina-G en comparación con el análogo no glicosilado se debe a una mayor estabilidad. Un mecanismo alternativo para la mayor potencia es el transporte hasta el sitio de acción facilitado por el glucano. Además, puede que el péptido glicosilado actúe con alta afinidad en un subtipo de receptor para la neurotensina todavía por definir (Tyler y col., 1998), o puede que sea un ligando de alta afinidad selectivo para un estado particular de un subtipo de receptor para la neurotensina. Otra posibilidad aún es que puede que los receptores para la neurotensina relevantes fijados como blanco se encuentren estrechamente colocalizados con sitios de unión para hidratos de carbono, y que el glucano haga las veces de "etiqueta de dirección", un mecanismo postulado para ciertos péptidos opiáceos. Se han obtenido datos preliminares que apoyan la hipótesis de la mayor estabilidad - la degradación proteolítica de la contulaquina-G se encuentra inhibida por la presencia del resto glucano. Puede que la mayor estabilidad tenga como resultado un suministro aumentado del glicopéptido al receptor. Sin embargo, la mayor potencia in vivo de la contulaquina-G que le confiere la O-glicosilación requiere claramente una evaluación más equilibrada de las posibilidades esbozadas anteriormente.

Ejemplo 8 Materiales y procedimientos para evaluar la actividad analgésica de la Thr_{10}-contulaquina-G 1. Dolor agudo (placa calentadora)

Se administró Thr_{10}-contulaquina-G (CGX-1063) o vehículo por vía intracerebroventricular (icv) en un volumen de 5 \mul. Quince minutos después de la inyección, se colocaron a los animales encima de una placa calentadora a 55ºC. Se registraron la latencia para la primera respuesta (estremecimiento), una respuesta conductual mediada por la médula, y el primer lametazo de extremidad posterior, una respuesta motora al dolor agudo organizada a nivel central. Los ratones se retiraron de la placa calentadora al cabo de 60 segundos si no se observaba respuesta. Inmediatamente antes de que se colocaran encima de la placa calentadora, se comprobó la función motora mediante la determinación de la latencia para la primera caída desde un rotarod con aceleración.

2. Dolor persistente (prueba de la formalina)

Se realizaron inyecciones de medicamentos intratecales (it) según lo describen Hyldon y Wilcox (1980). Se administró CGX-1063 (10 ó 100 pmol) o vehículo en un volumen de 5 \mul. Quince minutos después de la inyección it, se inyectó 20 \mul de formalina al 5% en la pata trasera derecha. Se colocaron los animales en cilindros de plexiglás claro respaldados con espejos para facilitar la observación. Los animales se observaron atentamente durante 2 minutos por periodo de 5 minutos, y se registró la cantidad de tiempo que el animal dedicó a lamer la pata inyectada de esta manera durante un total de 45-50 minutos. Los resultados se expresan como tiempo de lamedura en segundos por 5 minutos. Al final del experimento, todos los animales se colocaron encima de un rotarod con aceleración y se registró la latencia para la primera caída.

3. Dolor neuropático

Se usó el modelo de ligadura parcial del nervio ciático para evaluar la eficacia de la CGX-1063 en el dolor neuropático. Se produjo la lesión nerviosa según los métodos de Malmberg y Basbaum (1998). Se anestesiaron los animales con una solución de ketamina/xilazina, se expuso el nervio ciático y se ligó firmemente con una sutura de seda 8-0 alrededor de 1/3 a ½ del nervio. En los ratones con operación simulada se expuso el nervio, pero no se ligó. Se dejó que los animales se recuperaran durante por lo menos 1 semana antes de realizar las pruebas. El día de las pruebas, se colocaron los ratones en cilindros de plexiglás encima de una estructura de malla metálica y se dejó que se acostumbraran durante por lo menos 60 minutos. Se evaluó la alodinia mecánica con filamentos de von Frey calibrados mediante el uso del procedimiento arriba-abajo según lo describen Chaplan y col. (1994), y se calculó el umbral de retirada del 50%. A los animales que no respondían a ninguno de los filamentos de la serie se les asignó un valor máximo de 3,6 gramos, que es el filamento que típicamente levantaba la extremidad posterior sin doblarse, y que corresponde a aproximadamente 1/10 del peso corporal del animal.

Ejemplo 9 Actividad analgésica de la Thr_{10}-contulaquina-G

La CGX-1063 (10 fmol-10 nmol, icv) aumentó de manera dependiente de la dosis la latencia para el primer lametazo de la pata trasera y la primera respuesta provocada por la placa calentadora (Figuras 7A-7B). Es de interés la diferencia de potencia de la CGX-1063 para aumentar la latencia para el primer lametazo de pata trasera en comparación con la latencia para la primera respuesta. La CGX-1063 disminuyó también de manera dependiente de la dosis la latencia para la primera caída en el rotarod (Figura 7C). Sin embargo, esta discapacidad motora aparente no parecía ser la consecuencia de la pérdida de función motora, puesto que los animales eran capaces de actividad locomotora normal cuando se les estimulaba. Por lo tanto, el efecto de la CGX-1063 en la placa calentadora era claramente un efecto analgésico.

La CGX-1063 (10 ó 100 pmol, it) disminuyó significativamente y de manera dependiente de la dosis la segunda fase de la prueba de la formalina (Figura 8A). Curiosamente, la dosis más baja (10 pmol) era más eficaz para disminuir el tiempo de respuesta de primera fase que la dosis más alta. Esto se investigará más detalladamente en experimentos futuros. Tras la administración it, los animales tratados con CGX-1063 no presentaron discapacidad motora en comparación con los animales tratados con vehículo (Figura 8B), lo cual indica que el efecto de la CGX-1063 icv (que se observó en la prueba de la placa calentadora anterior) sobre la discapacidad motora está mediado en regiones cerebrales superiores, no a nivel de la médula, y que los efectos analgésicos de la CGX-1063 se pueden separar de la toxicidad motora al usar esta vía (it) de administración. El desplazamiento hacia abajo de los resultados del rotarod en comparación con los de los animales que se usaron en la prueba de la placa calentadora reflejan una discapacidad general en estos animales debido a la alodinia y la inflamación de la pata trasera inducidas por la formalina.

Una semana después de la ligadura parcial del nervio ciático, los animales presentaron una disminución acusada del umbral de retirada de la pata del lado operado (ipsilateral) en comparación con el lado no operado (contralateral), lo cual indica un aumento de la sensibilidad a los estímulos mecánicos (Figura 9). La administración intratecal de CGX-1063 (100 pmol) aumentó radicalmente el umbral de retirada del lado ligado (un aumento de aproximadamente seis veces). Curiosamente, el umbral mecánico del lado contralateral no estaba significativamente modificado. En los animales con operación simulada, no hubo diferencia en el umbral de retirada entre los lados operado y no operado. Después de la CGX-1063 intratecal, el umbral de retirada había aumentado uniformemente en ambas patas traseras de estos animales.

Los presentes datos demuestran que la CGX-1063 tiene potentes propiedades analgésicas en tres modelos de dolor de uso extendido: los modelos de dolor agudo, persistente/inflamatorio y neuropático. La CGX-1063 administrada centralmente (icv) redujo de manera dependiente de la dosis la latencia de respuesta en le modelo de dolor agudo de la placa calentadora, y fue eficaz en el intervalo desde los pocos picomoles hasta los muchos femtomoles. Los datos preliminares indican que el efecto analgésico de la CGX-1063 en este modelo no está mediado a través de un mecanismo opioideo. La CGX-1063 fue también eficaz para reducir la actividad nociceptiva en el modelo de dolor persistente/inflamatorio con formalina. La CGX-1063 redujo de manera dependiente de la dosis la segunda fase (inflamatoria) de la prueba de la formalina, mientras que a la dosis más baja, redujo la actividad de la fase uno. Finalmente, la CGX-1063 presentó una profunda actividad analgésica en un modelo de dolor neuropático. Los umbrales de retirada mecánicos en este modelo se aumentaron de casi seis veces en comparación con los valores antes del tratamiento, mientras que no modificaron la sensibilidad en la pata no lesionada, lo cual indica tal vez que la CGX-1063 reduce la alodinia neuropática mientras que no afecta la transmisión sensorial normal.

Ejemplo 10 Materiales y procedimientos para evaluar la actividad analgésica de la contulaquina-G 1. Dolor agudo (coletazo)

Se administró el medicamento (contulaquina-G (CGX-1160) o Thr_{10}-contulaquina-G (CGX-1063)) o solución salina por vía intratecal (i.t.) según el método de Hylden y Wilcox (Hylden y Wilcox, 1980) en un volumen constante de 5 \mul. Se envolvieron los ratones con cuidado en una toalla con el rabo expuesto. En distintos momentos después de la inyección i.t., se sumergió el rabo en un baño de agua mantenida a 54ºC y se registró el tiempo hasta una retirada enérgica del rabo. Si no había retirada al cabo de 8 segundos, se retiraba el rabo para evitar dañar a los tejidos.

2. Dolor persistente (prueba de la formalina)

Se administró i.t. CGX-1160, CGX-1063 (1, 10 ó 100 pmol), neurotensina (NT) (1, 10, 100 ó 10000 pmol), o vehículo en un volumen de 5 \mul. Quince minutos después de la inyección i.t., se inyectó 20 \mul de formalina al 5% en la pata trasera derecha. Se colocaron los animales en cilindros de plexiglás claro respaldados con espejos para facilitar la observación. Los animales se observaron atentamente durante dos minutos por periodo de cinco minutos, y se registró la cantidad de tiempo que el animal dedicó a lamer la pata inyectada de esta manera durante un total de 45-50 minutos. Los resultados se expresan como tiempo de lamedura en segundos por 5 minutos. Al final del experimento, todos los animales se colocaron encima de un rotarod con aceleración y se registró la latencia para la primera caída.

3. Alodinia inflamatoria crónica (modelo CFA)

Se dieron inyecciones intraplantares (i.pl.) de 20 \mul de CFA a los ratones en la pata trasera derecha y se devolvieron a su jaula de origen. Tres días después, se colocaron los ratones en cilindros de plexiglás encima de una estructura de malla metálica y se dejó que se acostumbraran durante por lo menos 60 minutos. Se evaluó la alodinia mecánica con filamentos de von Frey calibrados mediante el uso del procedimiento arriba-abajo como se ha descrito (Chaplan y col., 1994), y se calculó el umbral de retirada del 50%. A los animales que no respondían a ninguno de los filamentos de la serie se les asignó un valor máximo de 3,6 gramos, que es el filamento que típicamente levantaba la extremidad posterior sin doblarse, y que corresponde a aproximadamente 1/10 del peso corporal.

4. Pruebas de toxicidad

Para evaluar con precisión los efectos de discapacidad motora de la CGX-1160, la CGX-1063, y la NT, se dividieron 50 ratones en grupos que recibieron i.t. CGX-1160 o CGX-1063 (1, 10, 100, 500 y 1000 pmol), NT (0,1, 1, 10 y 100 nmol), o solución salina (n = 5 por grupo salvo para la dosis más alta de cada compuesto donde n = 3). A partir de 15 minutos después de la inyección, se colocaron los animales encima de un rotarod con aceleración y se registró la latencia para la primera caída. Se volvió a poner los animales a prueba a los 30, 60, 120, 240 y 300 minutos (o hasta que la latencia para la caída hubiese vuelto a valores control). También se registró la temperatura rectal de estos animales en los mismos tiempos.

Ejemplo 11 Actividad analgésica de la contulaquina-G

La CGX-1160 aumentó la latencia para el coletazo de manera dependiente de la dosis (Fig. 10A) con un tiempo hasta el efecto máximo de \leq 30 minutos (el primer tiempo probado, Fig. 10B). Además, el aumento de la latencia era de larga duración con tiempos de retirada elevados 5 horas después de la inyección que volvieron al punto de referencia 24 horas después de la inyección (Fig. 10B). La CGX-1063 mostró también un aumento dependiente de la dosis, aunque más variable, de la latencia para la retirada, y mostró sólo una eficacia antinociceptiva moderada en este modelo en comparación con la CGX-1160 (Fig. 10A-10B). En comparación, la NT no aumentó significativamente la latencia para la retirada en el ensayo del coletazo (Fig. 10A-10B).

Todos los compuestos que se probaron presentaron propiedades antinociceptivas de manera dependiente de la dosis en ambas fases de la prueba de la formalina, pero con potencias distintas. La CGX-1160 era el más potente de los tres compuestos. En la fase 1 de la prueba de la formalina (Fig. 11A), la CGX-1160 tenía una DE_{50} de aproximadamente 30-40 pmol mientras que la NT tenía una DE_{50} de \approx 1 nmol. La CGX-1063 no alcanzó el umbral de 50% de antinocicepción en la fase 1, sin embargo, la respuesta a la dosis irregular en esta prueba justifica el que se vuelva a probar la dosis de 100 pmol en este ensayo. En la fase 2 de la prueba de la formalina, los tres compuestos redujeron el tiempo de lamedura de la pata de manera dependiente de la dosis (que se indica en las figuras como un aumento en el tanto por ciento de antinocicepción; Fig. 11B). De nuevo, la CGX-1160 era más potente que los otros compuestos con una DE_{50} estimada de 1 pmol. Se evaluarán dosis más bajas de este compuesto en el futuro para completar la curva de respuesta a la dosis necesaria para calcular una DE_{50} más exacta. La CGX-1063 fue también eficaz para reducir el comportamiento nociceptivo en la fase 2, con una DE_{50} estimada de 10-20 pmol. La NT era notablemente menos potente que cualquiera de las contulaquinas con una DE_{50} estimada de 600-700 pmol (Fig. 11B).

La CGX-1160 mostró una inversión de la alodinia mecánica inducida por CFA extremadamente potente y dependiente de la dosis (Fig. 12A). Cien (100) fmol de CGX-1160 administrada i.t. invirtió por completo la alodinia mecánica inducida por CFA. Curiosamente, a esta dosis, la sensibilidad contralateral a la presión mecánica no se modificaba lo cual indica una posible modificación unilateral de los receptores para la NT en la inflamación crónica. A dosis más elevadas de CGX-1160, el umbral de retirada tanto en la pata inyectada con CFA como en la pata contralateral no inyectada era considerablemente elevado. En las figuras 12A y 12B, los valores encima de las barras indican el tanto por ciento de incremento del umbral mecánico en comparación con los niveles antes del medicamento. Como se indica, a todas las dosis que se probaron, la CGX-1160 tenía un efecto antialodínico mucho mayor en el lado inyectado con CFA en comparación con el lado no inyectado. La CGX-1063 era menos potente que la CGX-1160, pero también invirtió por completo la alodinia inducida por CFA (Fig. 12B). La dosis mínimamente eficaz era de 10 pmol, sin embargo, a esta dosis, a diferencia de la CGX-1160, el lado contralateral era también elevado en comparación con las medidas del punto de referencia antes del medicamento. En concordancia con los demás modelos examinados en este estudio, la NT mostró eficacia en el modelo CFA a 1 nmol, pero no a 100 pmol (Fig. 12C). Se examinarán otras dosis de CGX-1160 y NT en el futuro para determinar DE_{50} exactas para estos compuestos.

La CGX-1160, -1063, y la NT mostraron todas efectos dependientes de la dosis sobre la discapacidad motora y la temperatura corporal. Para los tres compuestos, la discapacidad máxima se produjo 15 minutos (discapacidad motora, Fig. 13A) o 30 minutos (efectos hipotérmicos, Fig. 14A) después de la inyección i.t. La CGX-1063 no tenía toxicidad motora a la dosis probada más baja (1 pmol, Fig. 13B), pero a dosis más elevadas los animales presentaron una toxicidad motora significativa (DT_{50} estimada de 10 pmol, Fig. 13B y 15A). A 10 pmol esta toxicidad duró 30 minutos, pero se resolvió a los 60 minutos. Cuando se administraba 100 pmol o 1 nmol, los animales sufrían discapacidad motora durante 2-3 horas (Fig. 14A). La CGX-1160 era igual de potente que la CGX-1063 para provocar la discapacidad motora (DT_{50} estimada de 10 - 20 pmol, Fig. 13B). De manera similar a la CGX-1063, a dosis más elevadas (100-500X su DE_{50}) la CGX-1160 mostró discapacidad motora que se resolvió al cabo de 5 horas (Fig. 13A y 14B). La DT_{50} estimada para la discapacidad motora inducida por la NT era de 3 nmol (Fig. 13B). De manera similar a las contulaquinas, a dosis elevadas, la NT inducía una discapacidad motora que duraba 2-4 horas (Fig. 13A y 14C).

Los efectos hipotérmicos de estos compuestos fueron similares a la toxicidad motora. Los tres provocaron una disminución de la temperatura corporal que dependía de la dosis. La CGX-1160 y -1063 eran iguales de potentes con una DT_{50} estimada de 100 pmol (Fig. 15B). Sin embargo, a esta dosis, la CGX-1063 provocaba una caída de la temperatura corporal que duraba 2-3 horas (Fig. 15A y 16A), mientras que el efecto hipotérmico provocado por la CGX-1160 se resolvió a los 60 minutos (Fig. 15A y 16B). A la dosis más elevada de CGX-1160 (500 pmol, 500X la DE_{50}), el efecto hipotérmico seguía sin resolverse a las seis horas después de la inyección (Fig. 16B). La NT mostró una respuesta a la dosis y un evolución en el tiempo muy similares a las contulaquinas. A las dosis más bajas, la NT no tenía efecto o mostró un efecto hipotérmico de corta duración (Fig. 16C). A la dosis más elevada, sin embargo (100 nmol), la NT provocó una hipotermia considerable y de larga duración que seguía sin resolverse a las tres horas (Fig. 15A y 16C).

Los presentes datos muestran que la CGX-1160 y la CGX-1063 son agentes analgésicos potentes, de amplio espectro eficaces en varios modelos animales de dolor agudo y crónico. La CGX-1160 es típicamente 10 veces más potente que la CGX-1063, y 1000 veces más potente que la NT (Tabla 6). La CGX-1160 es particularmente potente en el modelo de dolor inflamatorio crónico donde la CGX-1160 aumenta selectivamente el umbral de retirada mecánico únicamente en la pata que recibe la inyección de CFA, mientras que no modifica el umbral de la pata no inyectada. Este hallazgo indica que la inflamación crónica puede llevar a una reorganización de los receptores para la NT en las vías nociceptivas que corresponden a la pata inflamada. Puesto que la CGX-1160 era el único compuesto que mostrara una mayor potencia en estos experimentos, puede que esto indique una regulación desde arriba de un subtipo de receptor para el cual puede que CGX-1160 tenga una selectividad y especificidad particular. A favor de esta hipótesis de una selectividad de CGX-1160 para un subtipo están los hallazgos de que este compuesto presenta antinocicepción a dosis 10-100 veces más bajas que para la discapacidad locomotora y para la hipotermia, mientras que la CGX-1063 y la NT provocan antinocicepción, discapacidad locomotora, e hipotermia a dosis aproximadamente iguales cuando se administran i.t. El efecto hipotérmico de larga duración de CGX-1063 es particularmente interesante. Cuando se administraba i.t. a 100 pmol (aproximadamente 10 veces su DE_{50} en la fase 2 de la prueba de la formalina, véase la Fig. 16A), la CGX-1063 provocaba una hipotermia de larga duración en comparación con dosis antinociceptivas comparables de CGX-1160 (compárese con la dosis de 10 pmol en la Fig. 16B) y NT (compárese con la dosis de 10 nmol en la Fig. 16C). Esto indica potencialmente que la CGX-1063 es selectiva par el subtipo de receptor para la NT implicado en el efecto hipotérmico de los análogos de la NT. Por lo tanto, puede que la O-glicosilación de la Thr_{10} en la CGX-1160 confiera una selectividad para el subtipo de NTR antinociceptivo, del que se piensa actualmente que es NTR2, así como una resistencia metabólica a las peptidasas.

TABLA 6 Comparación de los efectos antinociceptivos, efectos de discapacidad motora, e índice de protección de la CGX-1160, la CGX-1063, y la NT en la prueba de la formalina (fase 2) y la prueba de alodinia inducida por CFA

Prueba de la formalina (fase 2)
Compuesto	DE_{50}, pmol	DT_{50}, pmol	IP
CGX-1160	1	10 - 20	10 - 20
CGX-1063	10 - 20	10 - 20	1 - 2
NT	600 - 700	3000	5 - 4,3
Prueba de la alodinia inducida por CFA
Compuesto	DE_{50}, pmol	DT_{50}, pmol	IP
CGX-1160	<0,1	10 - 20	>100
CGX-1063	<10	10 - 20	1 - 5
NT	\approx 500-600	3000	5 - 6
DE_{50}, pmol, estimada a partir de las pruebas antinociceptivas.
DT_{50}, pmol, estimada a partir de la prueba del rotarod de mínima discapacidad motora
Índice de protección, IP = (DT_{50}/DE_{50})

Ejemplo 12 Materiales y procedimientos para evaluar la actividad antipsicótica de la contulaquina-G 1. Materiales

Se obtuvo D-anfetamina de Sigma (St. Louis, MO). Se sintetizó la contulaquina-G (CGX-1160; un glicopéptido sintético de 16 aminoácidos con enlace O-) como se describió anteriormente.

2. Animales

Se usaron ratones CF-1 machos (30-35 g; Charles River Laboratories). Todos los animales fueron alojados en una habitación de temperatura controlada (23º \pm 3ºC) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con libre acceso a alimentos y agua. Se produjo la eutanasia en todos los animales de acuerdo con las políticas de los servicios de sanidad pública en materia de cuidado humano de animales de laboratorio.

3. Actividad locomotora

Se colocaron los animales en jaulas de plástico claro (40 cm x 22 cm, 20 cm de fondo) y se les dejó acostumbrarse durante 30 minutos. A continuación los animales recibieron o bien contulaquina-G (100 pmol) o bien solución salina (vehículo) mediante inyección intracerebroventricular (icv) hecha a pulso (volumen de 5 \mul) a través de una jeringa Hamilton de 10 \mul. Al cabo de 5 minutos, los animales recibieron solución salina o sulfato de D-anfetamina (3 mg/kg) vía administración intraperitoneal (i.p.). Se siguieron la distancia recorrida (cm) y el tiempo dedicado a deambular (s) durante 30 minutos mediante el uso de un sistema de seguimiento Videomex-V (Columbus Instruments, Columbus, OH). Todas las pruebas se hicieron en una habitación conductual aislada, poco iluminada.

4. Estadísticas

Los datos se analizaron mediante el uso del análisis de la varianza unidireccional (ANOVA) con el tratamiento con el medicamento como único factor, seguido de una prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls para la comparación de grupos individuales, aceptando a P<0,05 como estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el software PRISM de GraphPad (Versión 2.01, GraphPad, San Diego, CA).

Ejemplo 13 Actividad antipsicótica de la contulaquina-G

En el presente estudio, se encontró un efecto significativo del tratamiento con el medicamento sobre la actividad locomotora medida tanto por la distancia recorrida [F(4,21) = 7,87, P<0,05] como por el tiempo dedicado a deambular [F(4,21) = 6,17, P<0,05]. La administración de D-anfetamina tuvo como resultado un aumento dependiente de la dosis tanto de la distancia recorrida como del tiempo dedicado a deambular (Figuras 17-18). El tratamiento previo de los ratones con contulaquina-G (100 pmol i.c.v.) redujo significativamente los aumentos estimulados por la anfetamina (3 mg/kg i.p.) de la distancia recorrida y del tiempo dedicado a deambular. Se observó una disminución de la actividad locomotora basal (tanto la distancia recorrida como el tiempo dedicado a deambular) después del tratamiento previo con contulaquina-G (100 pmol i.c.v.), sin embargo, esta reducción no alcanzó significación estadística.

Una serie de pruebas convergentes implican que puede que la neurotensina tenga propiedades antipsicóticas sin los perfiles de efectos secundarios adversos relacionados de los medicamentos neurolépticos normales (revisados en (Nemeroff y col., 1992)). Posteriormente, muchos grupos se han concentrado en análogos de la neurotensina como medicamentos antipsicóticos novedosos. Puesto que la contulaquina-G comparte una homología C-terminal con la neurotensina, y se parece a la neurotensina en ensayos tanto in vivo como in vitro, se evaluó la capacidad de la contulaquina-G para inhibir la actividad locomotora estimulada por las anfetaminas, un cribado preclínico de predicción de la eficacia antipsicótica. Este ejemplo demuestra que el tratamiento previo de ratones con contulaquina-G reducía significativamente los aumentos de actividad locomotora estimulados por las anfetaminas. Estos datos indican que la contulaquina-G tiene una actividad antipsicótica similar a la neurotensina. Sin embargo, como se mostró anteriormente, mientras que la neurotensina era mucho más potente que la contulaquina-G en los receptores de rata para la neurotensina rNTR1 (CI_{50}: 3,2 nM para la neurotensina; 524 nM para la contulaquina-G) y rNTR2 (CI_{50}: 6,0 nM para la neurotensina; 730 nM para la contulaquina-G), y el receptor de ratón para la neurotensina mNTR3 (CI_{50}: 1,4 nM para la neurotensina; 250 nM para la contulaquina-G), la contulaquina-G era 1 a 2 órdenes de magnitud más potente en un ensayo in vivo (una evaluación de la actividad locomotora valorada visualmente) tras administración i.c.v. Estos resultados indican que puede que la contulaquina-G y la neurotensina interactúen con poblaciones solapadas pero diferentes de subtipos o estados de activación de receptores para la neurotensina. Así, la contulaquina-G no compartiría los efectos secundarios restrictivos de la neurotensina.

Ejemplo 14 Materiales y procedimientos para evaluar la actividad anticomicial de la contulaquina-G 1. Animales

Se alojaron Frings macho (20-25 g) en una habitación de temperatura controlada (23º \pm 1ºC) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con libre acceso a alimentos y agua. Los ratones fueron alojados, alimentados, y manipulados de un modo coherente con las recomendaciones en la publicación HEW (NIH) Nº 8623, "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals". Se produjo la eutanasia en todos los ratones de acuerdo con las políticas de los servicios de sanidad pública en materia de cuidado humano de animales de laboratorio.

2. Evaluación anticomicial

Se colocaron los ratones Frings en una jarra de plexiglás redonda (diámetro 15 cm, altura 18 cm) y se expusieron a un estímulo sonoro de 110 decibelios (11 Khz). A continuación se observaron los ratones durante 25 segundos para la presencia o la ausencia de una extensión tónica de las extremidades posteriores. Se consideró que los animales que no exhibían extensión tónica de las extremidades posteriores estaban protegidos.

3. Prueba del rotarod

Se evaluó la discapacidad motora en el momento del efecto máximo mediante la colocación de los ratones encima de un rotarod que giraba a 6 rpm. Se consideraron discapacitados a los animales que caían tres veces en un minuto.

Ejemplo 15 Actividad anticomicial de la contulaquina-G

La contulaquina-G (CGX-1160) y la Thr_{10}-contulaquina-G (CGX-1063) bloquearon potentemente y de manera dependiente de la dosis los ataques audiogénicos en ratones Frings después de su administración i.c.v. (Figura 19). Al igual que sucedía con la eficacia en los modelos de dolor, la CGX-1160 era más potente que la CGX-1063 con unas DE_{50} de 7,1 pmol y 27,0 pmol, respectivamente (Tabla 7). También en concordancia con estudios anteriores, la NT era notablemente menos potente que la CGX-1160 o -1063. Aunque no se haya acabado aún una curva de respuesta a la dosis para NT, la NT presentaba una protección del 50% después de que se administrara 1 nmol i.c.v. Cuando se comprobó su toxicidad motora, la CGX-1160 no alcanzó el nivel de toxicidad del 50% a dosis hasta 200 pmol (Figura 19), mientras que se estima que la DT_{50} para la CGX-1063 es de aproximadamente 375 pmol dando como resultado un IP estimado de 14 para las dosis probadas.

TABLA 7 Perfil anticomicial de la CGX-1160 y la CGX-1063 en ratones AGS Frings tras administración i.c.v.

Compuesto	Tiempo de prueba	DT_{50} (pmol)	DE_{50} (pmol)	I.P.^{b}	veces más potente
	(min)^{a}				que la NT
CGX-1160	15, 60	>200	7,1 (4,9-8,5)	>28	\approx 140
CGX-1063	15, 60	\approx375	27,0 (18,6-34,9)	\approx14	\approx 37
Neurotensina	15, 60	aún sin determinar	\approx1000	N.D.
^{a} La primera vez, DT_{50}; la segunda vez, DE_{50}
^{b} Índice de protección = DT_{50}/DE_{50} (pmol)
() Intervalo de confianza a 95%

En un experimento independiente, se examinó el tiempo hasta el efecto máximo y la duración de acción de la CGX-1160. La administración i.c.v. de 100 pmol (aproximadamente 14X la DE_{50}) de CGX-1160 no presentó actividad alguna a los 30 minutos, pero era protectora al 100% a los 60 minutos, y seguía mostrando una protección del 50% en animales puestos a prueba 4 horas después de la inyección i.c.v. (Figura 20).

Se apreciará que los procedimientos y composiciones de la presente invención se pueden incorporar en forma de una diversidad de realizaciones, de las cuales sólo se describen algunas en la presente invención. Por eso, las realizaciones descritas son ilustrativas y no se deberían interpretar como restrictivas.

Lista de referencias

Annals of Pharmacotherapy 27:912 (1993).

Araki, K. y col. (1973). Chem. Pharm. Bull. (Tokio) 21:2801-2804.

Barber, M. y col. (1982). Anal. Chem. 54:645A-657A.

Benziger, J.U. (1994). Faseb. J. 8:1019-1025.

Cancer 41:1270 (1993).

Cancer Res. 44:1698 (1984).

Carraway, R. y col. (1973). J. Biol. Chem. 248:6854-6861.

Cartier, G.E. y col. (1996). J. Biol. Chem. 271:7522-7528.

Chabry, J. y col. (1994). J. Neurochem. 63:19-27.

Chaplan, S.R. y col. (1994). J. Neurosci. Methods 53:55-63.

Clineschmidt, B. V. y col. (1979). Eur. J. Pharmacol. 54:129-139.

Colledge, C.J. y col. (1992). Toxicon. 30:1111-1116.

Cotter, R.J. (1989). Biomed. Mass Spectrom. 18:513-532.

Craig, A.G. y col. (1993). Biol. Mass Spectrom. 22:31-44.

Craig, A.G. y col. (1994). Biol. Mass Spectrom. 23:519-528.

Craig, A.G. y col. (1998). Biochemistry 37:16019-16025.

Cruz, L.J. y col. (1987). Conus geographus toxins that discriminate between neuronal and muscle sodium

\hbox{channels.}

J. Biol. Chem. 260:9280-9288.

Cusack, B. y col. (1993). J. Recept. Res. 13:123-134.

Cusack, B. y col. (1991). Eur. J. Pharmacol. 206:339-342.

Feurle, G.E. y col. (1992). J. Biol. Chem. 267:22305-22309.

Fischer, W. y col. (1987). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3628-3632.

Haack, J.A. y col. (1990). Contryphan-T: a gamma-carboxyglutamate containing peptide with N-methyl-d-aspartate antagonist activity. J. Biol. Chem. 265:6025-6029.

Hammerland, L.G. y col. (1992). Eur. J. Pharmacol. 226:239-244.

Hillenkamp, F. y col. (1993). Anal. Chem. 63:1193A-1203A.

Horiki, K. y col. (1978). Chemistry Letters 165-68.

Hylden, J.L.K. y col. (1980). Eur. J. Pharmacol. 67:313-316.

Jiménez, E.C. y col. (1996). J. Biol. Chem. 271:28002-28005.

Kaiser y col. (1970). Anal. Biochem. 34:595.

Kapoor (1970). J. Pharm. Sci. 59:1-27.

LeNguyen, D. and Rivier, J. (1986). Intl. J. Pep. Prot. 27:285-292.

Luning, B. y col. (1989). Glycoconjugate J. 6:5-19.

Malmberg, A.B. y col. (1998). Pain 76:215-222.

Mazella, J. y col. (1988). J. Biol. Chem. 263:144-149.

Mcluckey, S.A. y col. (1991). Anal. Chem. 63:375-383.

Mena, E.E. y col. (1990). Contryphan-G: a novel peptide antagonist to the N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) receptor. Neurosci. Lett. 118:241-244.

Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl). Synthese von Peptiden, E. Wunsch (Ed.), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania. (1974).

Minamino, N. y col. (1984). Biochem. Biophys. Res. Commun. 122:542-549.

Monje, V.D. y col. (1993). Neuropharmacology 32: 1141-1149.

Munson, P. J. y col. (1980). Anal. Biochem. 107:220-239.

Nishiuchi, Y. y col. (1993). Synthesis of gamma-carboxyglutamic acid-containing peptides by the Boc strategy. Int. J. Pept. Protein Res. 42:533-538.

Nemeroff, C. B. y col. (1992). Ann. N. Y. Acad. Sci. 668:146-156.

Norberg, T. y col. (1994). En: Methods in Enzymology, Y. C. Lee Eds., Academic Press, Nueva York, NY, pp. 87-107.

Olivera, B.M. y col. (1984). Biochemistry 23:5087-5090.

Olivera, B.M. y col. (1985). Science 230:1338-1343.

Olivera, B.M. y col. (1990). Science 249:257-263.

Olivera, B.M. y col. (1997). Mol. Biol. Cell 8:2101-2109.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).

Rivier, J.R. y col. (1978). Biopolymers 17:1927-38.

Rivier, J.R. y col. (1987). Biochem. 26:8508-8512.

Sadoul, J.L. y col. (1984). Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:812-819.

Sambrook, J. y col. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Schroder y col. (1965). The Peptides 1:72-75, Academic Press, NY.

Spengler, B. y col. (1992). Rapid Commun. Mass Spectrom. 6:105-108.

Stewart, J.M. y col. (1984). En: Pierce Chemical Company, Rockford, IL., pp 176.

Stewart, J.M. y col., Solid-Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco, CA (1969).

Tanaka, K. y col. (1990). Neuron 4:847-854.

Toth, I. y col. (1999). J. Med. Chem. (JMC ASAP edición para web del 22 Sept. 1999).

Van Renterghem, C. y col. (1988). Biochem. Biophys. Res. Comm. 157:977-985.

Yoshida, H. y col. (1976). Biochemistry 15:61-64.

Zhou L.M., y col. (1996). Synthetic Analogues of Contryphan-G: NMDA Antagonists Acting Through a Novel Polyamine-Coupled Site. J. Neurochem. 66:620-628.

Patente de Estados Unidos 3.972.859.

Patente de Estados Unidos 3.842.067.

Patente de Estados Unidos 3.862.925.

Patente de Estados Unidos 4.105.603.

Patente de Estados Unidos 4.352.883.

Patente de Estados Unidos 4.353.888.

Patente de Estados Unidos 4.447.356.

Patente de Estados Unidos 4.569.967.

Patente de Estados Unidos 4.883.666.

Patente de Estados Unidos 4.968.733.

Patente de Estados Unidos 4.976.859.

Patente de Estados Unidos 5.082.670.

Patente de Estados Unidos 5.084.350.

Patente de Estados Unidos 5.158.881.

Patente de Estados Unidos 5.284.761.

Patente de Estados Unidos 5.364.769.

Patente de Estados Unidos 5.514.774.

Patente de Estados Unidos 5.534.615.

Patente de Estados Unidos 5.545.723.

Patente de Estados Unidos 5.550.050.

Patente de Estados Unidos 5.591.821.

Patente de Estados Unidos 5.618.531.

Patente de Estados Unidos 5.633.347.

Solicitud de Estados Unidos de Nº de serie 08/785.534.

Solicitud de Estados Unidos de Nº de serie 09/061.026.

Solicitud PCT publicada WO 92/19195.

Solicitud PCT publicada WO 94/25503.

Solicitud PCT publicada WO 95/01203.

Solicitud PCT publicada WO 95/05452.

Solicitud PCT publicada WO 96/02286.

Solicitud PCT publicada WO 96/02646.

Solicitud PCT publicada WO 96/11698.

Solicitud PCT publicada WO 96/40871.

Solicitud PCT publicada WO 96/40959.

Solicitud PCT publicada WO 97/12635.

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<110> Craig, A. Grey

\hskip1cm

Griffen, David

\hskip1cm

Olivera, Baldomero M.

\hskip1cm

Watkins, Maren

\hskip1cm

Hillyard, David R.

\hskip1cm

Imperial, Julita

\hskip1cm

Cruz, Lourdes J.

\hskip1cm

McIntosh, J. Michael

\hskip1cm

Wagstaff, John D.

\hskip1cm

Layer, Richard T.

\hskip1cm

Jones, Robert M.

\hskip1cm

McCabe, R. Tyler

\hskip1cm

Cognetix, Inc.

\hskip1cm

University of Utah Research Foundation

\hskip1cm

Salk Institute

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<120> Contulaquina-G, análogos de ella y usos para ella

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<130> Contulaquina-G

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<140>

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<141>

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<150> US 60/130.661

\vskip0.333000\baselineskip

<151> 23-04-1999

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<150> US 60/128.561

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<151> 09-04-1999

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<150> US 60/105.015

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<151> 20-10-1998

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<160> 13

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Conus geographus

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<220>

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<221> PÉPTIDO

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<222> (1)..(13)

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<223> Xaa en el residuo 1 es piro-Glu; Xaa en el residuo 13 es Pro o hidroxi-Pro; Thr en el residuo 10 se encuentra modificada para contener un O-glucano.

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<400> 1

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\sa{Xaa Ser Glu Glu Gly Gly Ser Asn Ala Thr Lys Lys Xaa Tyr Ile Leu}

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<210> 2

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de una secuencia artificial: secuencia de la contulaquina-G genérica.

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<220>

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<221> PÉPTIDO

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<222> (1)..(7)

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<223> Xaa en el residuo 1 es piro-Glu, Glu, Gln o gamma-carboxi-Glu; Xaa en los residuos 2 y 7 es Ser, Thr, o Cys modificada con un S-glucano; Xaa en los residuos 3 y 4 es Glu o gamma-carboxi-Glu.

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<220>

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<221> PÉPTIDO

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<222> (8)..(10)

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<223> Xaa en el residuo 8 es Asn, Asn modificada con un N-glucano o Cys modificada en S-; Xaa en el residuos 9 es Ala o Gly; Xaa en el residuo 10 es Thr, Ser, Cys modificada con un S-glucano, Tyr o un aminoácido no natural que contiene hidroxilo.

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<220>

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<221> PÉPTIDO

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<222> (11)..(12)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Xaa en el residuo 11 es Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homo-Arg o cualquier aminoácido básico no natural; Xaaen el residuo 12 es Ala, Gly, Lys, N-metil-Lys,

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<220>

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<221> PÉPTIDO

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<222> (12)..(13)

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<223> N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homo-Arg, cualquier aminoácido básico no natural o X-Lys; Xaa 13 es Pro o hidroxi-Pro.

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<220>

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<221> PÉPTIDO

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<222> (14)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Xaa en el residuo 14 es Tyr, mono-yodo-Tyr, di-yodo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr, nitro-Tyr, Trp, D-Trp, halo-Trp, halo-D-Trp, Phe, L-neo-Trp o un aminoácido aromático no natural, halo es Br o Cl.

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

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\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Leu}

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<210> 3

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Conus geographus

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

atratnggyt tyttngt

\hfill

17

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 4

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Conus geographus

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

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<222> (9)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Xaa en el residuo 9 es desconocido

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<400> 4

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\sa{Ser Glu Glu Gly Gly Ser Asn Ala Xaa Lys Lys Pro Tyr Ile Leu}

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<210> 5

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<211> 231

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<212> ADN

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<213> Conus geographus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(228)

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<400> 5

6

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<210> 6

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<211> 76

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<212> PRT

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<213> Conus geographus

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<400> 6

7

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<210> 7

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Conus geographus

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<220>

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<221> PÉPTIDO

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<222> (1)..(10)

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<223> Xaa en el residuo 1 es piro-Glu; Thr en el residuo 10 contiene un O-glucano.

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<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ser Glu Glu Gly Gly Glu Asn Ala Thr Lys Pro Tyr Ile Leu}

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Bos sp.

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Xaa en el residuo 1 es piro-Glu.

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Leu Tyr Glu Asn Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Ilr Leu}

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> porcino

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ile Pro Tyr Ile Leu}

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gly Lys Arg Pro Trp Ile Leu}

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Leu Thr Lus Phe Glu Thr Lys Ser Ala Arg Val Lys Gly Leu Ser}

\sac{Phe His Pro Lys Arg Pro Trp Ile Leu }

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Vespula maculifrons

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ala Thr Thr Arg Arg Arg Gly Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg}

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg}

Claims (39)

1. Una contulaquina-G sustancialmente pura que comprende la secuencia de aminoácidos Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1) en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina y Thr_{10} se encuentra modificada para contener un O-glucano y en la que dicho O-glucano es Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow).

2. La contulaquina-G sustancialmente pura de la reivindicación 1, en la que Xaa_{2} es prolina.

3. Una contulaquina-G genérica, sustancialmente pura, que tiene la siguiente fórmula general: Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{3}-Gly-Gly-Xaa_{2}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Xaa_{7}-Xaa_{9}-Xaa_{10}-Ile-Leu (SEC ID Nº: 2), en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Glu, Gln o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{2} es Ser, Thr o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{3} es Glu o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{4} es Asn, Asn modificada con un N-glucano o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{5} es Ala o Gly; Xaa_{6} es Thr, Ser, Cys modificada con un S-glucano, Tyr o cualquier aminoácido no natural que contiene hidroxilos; Xaa_{7} es Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina o cualquier aminoácido básico no natural; Xaa_{8} es Ala, Gly, Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina, cualquier aminoácido básico no natural o X-Lys donde X es (CH_{2})_{n}, fenil, -(CH_{2})_{m}-(CH=CH)-(CH_{2})_{m}H o -(CH_{2})_{m}-(C\equivC)-(CH_{2})_{m}H en los que n es 1-4 y m es 0-2; Xaa_{9} es Pro o hidroxi-Pro; y Xaa_{10} es Tyr, mono-yodo-Tyr, di-yodo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr, nitro-Tyr, Trp, D-Trp, bromo-Trp, bromo-D-Trp, cloro-Trp, cloro-D-Trp, Phe, L-neo-Trp, o cualquier aminoácido aromático no natural,

con la salvedad de que la contulaquina-G genérica no es un péptido de fórmula Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu y Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina.

4. Una contulaquina-G genérica, sustancialmente pura, que tiene la siguiente fórmula general: Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{3}-Gly-Gly-Xaa_{2}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Xaa_{7}-Xaa_{9}-Xaa_{10}-Ile-Leu (SEC ID Nº: 2) que se ha modificado para que contenga un O-glucano, un S-glucano o un N-glucano, en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Glu, Gln o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{2} es Ser, Thr o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{3} es Glu o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{4} es Asn, Asn modificada con un N-glucano o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{5} es Ala o Gly; Xaa_{6} es Thr, Ser, Cys modificada con un S-glucano, Tyr o cualquier aminoácido no natural que contiene hidroxilos; Xaa_{7} es Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina o cualquier aminoácido básico no natural; Xaa_{8} es Ala, Gly, Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina, cualquier aminoácido básico no natural o X-Lys donde X es (CH_{2})_{n}, fenil, -(CH_{2})_{m}-(CH=CH)-(CH_{2})_{m}H o -(CH_{2})_{m}-(C\equivC)-(CH_{2})_{m}H en los que n es 1-4 y m es 0-2; Xaa_{9} es Pro o hidroxi-Pro; y Xaa_{10} es Tyr, mono-yodo-Tyr, di-yodo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr, nitro-Tyr, Trp, D-Trp, bromo-Trp, bromo-D-Trp, cloro-Trp, cloro-D-Trp, Phe, L-neo-Trp, o cualquier aminoácido aromático no natural,

con la salvedad de que cuando la contulaquina-G genérica es un péptido de fórmula Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu y Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina y únicamente la Thr_{10} está modificada para contener un O-glucano, entonces el glucano es Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow) o un glucano que tiene la estructura de la fórmula (3):

8

en la que R_{1} es un aminoácido que se puede derivatizar con un glucano tanto química como enzimáticamente; R_{2} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, u O-glucano; R_{3} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo, ácido siálico o monosacárido; R_{4} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{5} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, O-monosacárido u O-acetilo; R_{6} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{7} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{8} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; n es 0-4 y m es 1-4.

5. La contulaquina-G genérica sustancialmente pura de la reivindicación 3 en la que el glucano es Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow).

6. La contulaquina-G genérica sustancialmente pura de la reivindicación 4 en la que el glucano es Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow).

7. La contulaquina-G genérica sustancialmente pura de la reivindicación 3 en la que el glucano tiene la estructura de la fórmula (3) como se proporciona en la reivindicación 4, en la que R_{1} es un aminoácido que se puede derivatizar con un glucano tanto químicamente como enzimáticamente; R_{2} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, u O-glucano; R_{3} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo, ácido siálico o monosacárido; R_{4} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{5} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, O-monosacárido u O-acetilo; R_{6} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{7} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{8} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; n es 0-4 y m es 1-4.

8. La contulaquina-G genérica sustancialmente pura de la reivindicación 4 en la que el glucano tiene la estructura de la fórmula (3), en la que R_{1} es un aminoácido que se puede derivatizar con un glucano tanto químicamente como enzimáticamente; R_{2} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, u O-glucano; R_{3} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo, ácido siálico o monosacárido; R_{4} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{5} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, O-monosacárido u O-acetilo; R_{6} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{7} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{8} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; n es 0-4 y m es 1-4.

9. Un análogo de la contulaquina-G sustancialmente puro que comprende un truncamiento N-terminal de 1 a 9 aminoácidos de la contulaquina-G genérica de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8.

10. El análogo de la contulaquina-G sustancialmente puro de la reivindicación 9, en el que un Ser-O-glucano, Thr-O-glucano o Cys-S-glucano sustituye al residuo de aminoácido en el extremo N-terminal truncado.

11. El análogo de la contulaquina-G sustancialmente puro de la reivindicación 9, en el que un Ser-O-glucano, Thr-O-glucano o Cys-S-glucano sustituye a un residuo en las posiciones 2-9 de la contulaquina-G genérica.

12. Un análogo de la contulaquina-G sustancialmente puro que comprende un truncamiento N-terminal de 10 aminoácidos de la contulaquina-G genérica de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8 que está modificado adicionalmente para contener un Lys-N-glucano en el residuo 11 de dicha contulaquina-G genérica.

13. Un ácido nucleico aislado que comprende un ácido nucleico que codifica el precursor de la contulaquina-G que comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº: 6.

14. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 13 que comprende una secuencia nucleotídica que se expone en la SEC ID Nº: 5.

15. Un péptido precursor de la contulaquina-G aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº: 6.

16. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente activo escogido de entre el grupo que consiste en:

(a) la contulaquina-G que comprende la secuencia de aminoácidos Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina y Thr_{10} se encuentra modificada para contener un O-glucano y en la que dicho O-glucano es Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow);

(b) una contulaquina-G genérica que tiene la siguiente fórmula general: Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{3}-Gly-Gly-Xaa_{2}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Xaa_{7}-Xaa_{9}-Xaa_{10}-Ile-Leu (SEC ID Nº: 2), en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Glu, Gln o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{2} es Ser, Thr o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{3} es Glu o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{4} es Asn, Asn modificada con un N-glucano o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{5} es Ala o Gly; Xaa_{6} es Thr, Ser,Cys modificada con un S-glucano, Tyr o cualquier aminoácido no natural que contiene hidroxilos; Xaa_{7} es Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina o cualquier aminoácido básico no natural; Xaa_{8} es Ala, Gly, Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina, cualquier aminoácido básico no natural o X-Lys donde X es (CH_{2})_{n}, fenil, -(CH_{2})_{m}-(CH=CH)-(CH_{2})_{m}H o -(CH_{2})_{m}-(C\equivC)-(CH_{2}

\hbox{) _{m} }

H en los que n es 1-4 y m es 0-2; Xaa_{9} es Pro o hidroxi-Pro; y Xaa_{10} es Tyr, mono-yodo-Tyr, di-yodo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr, nitro-Tyr, Trp, D-Trp, bromo-Trp, bromo-D-Trp, cloro-Trp, cloro-D-Trp, Phe, L-neo-Trp, o cualquier aminoácido aromático no natural,

con la salvedad de que la contulaquina-G genérica no es un péptido de fórmula Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu y Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina;

(c) una contulaquina-G genérica que tiene la siguiente fórmula general: Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{3}-Gly-Gly-Xaa_{2}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Xaa_{7}-Xaa_{9}-Xaa_{10}-Ile-Leu (SEC ID Nº: 2) que se ha modificado para que contenga un O-glucano, un S-glucano o un N-glucano, en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Glu, Gln o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{2} es Ser, Thr o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{3} es Glu o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{4} es Asn, Asn modificada con un N-glucano o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{5} es Ala o Gly; Xaa_{6} es Thr, Ser, Cys modificada con un S-glucano, Tyr o cualquier aminoácido no natural que contiene hidroxilos; Xaa_{7} es Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina o cualquier aminoácido básico no natural; Xaa_{8} es Ala, Gly, Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina, cualquier aminoácido básico no natural o X-Lys donde X es (CH_{2})_{n}, fenil, -(CH_{2})_{m}-(CH=CH)-(CH_{2})_{m}H o -(CH_{2})_{m}-(C\equivC)-(CH_{2})_{m}H en los que n es 1-4 y m es 0-2; Xaa_{9} es Pro o hidroxi-Pro; y Xaa_{10} es Tyr, mono-yodo-Tyr, di-yodo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr, nitro-Tyr, Trp, D-Trp, bromo-Trp, bromo-D-Trp, cloro-Trp, cloro-D-Trp, Phe, L-neo-Trp, o cualquier aminoácido aromático no natural,

con la salvedad de que cuando la contulaquina-G genérica es un péptido de fórmula Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu y Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina y la Thr10 está modificada para contener un O-glucano, entonces el glucano se escoge de entre el grupo que consiste en Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow) y un glucano que tiene la estructura:

9

en la que R_{1} es un aminoácido que se puede derivatizar con un glucano tanto químicamente como enzimáticamente; R_{2} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, u O-glucano; R_{3} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo, ácido siálico o monosacárido; R_{4} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{5} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, O-monosacárido u O-acetilo; R_{6} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{7} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{8} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; n es 0-4 y m es 1-4.

(d) un análogo de la contulaquina-G que comprende un truncamiento N-terminal de desde 1 hasta 9 aminoácidos de la contulaquina-G genérica de (b) o (c);

(e) un análogo de la contulaquina-G de (d), en el que un Ser-O-glucano, Thr-O-glucano o Cys-S-glucano sustituye al residuo de aminoácido en el extremo N-terminal truncado;

(f) un análogo de la contulaquina-G de (d), en el que un Ser-O-glucano, Thr-O-glucano o Cys-S-glucano sustituye a un residuo en las posiciones 2-9 de la contulaquina-G genérica; y

(g) un análogo de la contulaquina-G que comprende un truncamiento N-terminal de 10 aminoácidos de la contulaquina-G genérica de (b) o (c) que está modificado adicionalmente para contener un Lys-N-glucano en el residuo 11 de la contulaquina-G genérica,

para preparar un medicamento para la modulación del sitio para la contulaquina-G en el receptor para la neurotensina en un sujeto que lo necesite.

17. El uso de la reivindicación 16 en el que el glucano es Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow).

18. El uso de la reivindicación 16 en el que el glucano tiene la estructura de la fórmula (3), en la que R_{1} es un aminoácido que se puede derivatizar con un glucano tanto químicamente como enzimáticamente; R_{2} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, u O-glucano; R_{3} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo, ácido siálico o monosacárido; R_{4} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{5} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, O-monosacárido u O-acetilo; R_{6} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{7} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{8} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; n es 0-4 y m es 1-4.

19. El uso de la reivindicación 16, en el que dicha modulación de receptor para la neurotensina es para uso en el tratamiento de ataques, inflamaciones, choques, trombosis, hipertensión, dolor, psicosis, enfermedad de Parkinson, trastornos gastrointestinales, estados depresivos, disfunción cognitiva, ansiedad, discinesia tardía, drogodependencia, ataques de pánico, manías, síndrome del intestino irritable, diarreas, úlceras, tumores gastrointestinales, síndrome de Tourette, corea de Huntington, escape vascular, arteriosclerosis, dilatación vascular y vasodilatación.

20. El uso de la reivindicación 16, en el que dicha modulación del receptor para la neurotensina es para uso en el tratamiento de la epilepsia, ataques o convulsiones.

21. El uso de la reivindicación 16, en el que dicha modulación del receptor para la neurotensina es para uso en el tratamiento del dolor.

22. El uso de la reivindicación 16, en el que dicha modulación del receptor para la neurotensina es para uso en el tratamiento de la esquizofrenia.

23. El uso de la reivindicación 16, en el que dicha modulación del receptor para la neurotensina es para uso en el tratamiento de la inflamación.

24. El uso de la reivindicación 16, en el que dicha modulación del receptor para la neurotensina es para uso en el tratamiento de la discinesia tardía o de reacciones distónicas agudas.

25. El uso de la reivindicación 16, en el que el agente activo se administra mediante el uso de un sistema de administración que se escoge de entre el grupo que consiste en infusión, administración mediante bomba, administración mediante un polímero biodegradable, administración mediante células microencapsuladas, inyección y administración mediante células macroencapsuladas.

26. El uso de la reivindicación 25, en el que la administración se hace dentro del sistema nervioso central.

27. El uso de la reivindicación 26, en el que se selecciona el sistema nervioso central dentro del grupo que consiste en el espacio intratecal, los ventrículos cerebrales y el parénquima cerebral.

28. El uso de la reivindicación 25, en el que la administración se escoge de entre el grupo que consiste en subcutánea, intravenosa, intraarterial e intramuscular.

29. Un agente activo que se escoge de entre el grupo que consiste en:

(a) la contulaquina-G que comprende la secuencia de aminoácidos Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina y Thr_{10} se encuentra modificada para contener un O-glucano y en la que dicho O-glucano es Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow);

(b) una contulaquina-G genérica que tiene la siguiente fórmula general: Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{3}-Gly-Gly-Xaa_{2}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Xaa_{7}-Xaa_{9}-Xaa_{10}-Ile-Leu (SEC ID Nº: 2), en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Glu, Gln o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{2} es Ser, Thr o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{3} es Glu o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{4} es Asn, Asn modificada con un N-glucano o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{5} es Ala o Gly; Xaa_{6} es Thr, Ser, Cys modificada con un S-glucano, Tyr o cualquier aminoácido no natural que contiene hidroxilos; Xaa_{7} es Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina o cualquier aminoácido básico no natural; Xaa_{8} es Ala, Gly, Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina, cualquier aminoácido básico no natural o X-Lys donde X es (CH_{2})_{n}, fenil, -(CH_{2})_{m}-(CH=CH)-(CH_{2})_{m}H o -(CH_{2})_{m}-(C\equivC)-(CH_{2}

\hbox{) _{m} H}

en los que n es 1-4 y m es 0-2; Xaa_{9} es Pro o hidroxi-Pro; y Xaa_{10} es Tyr, mono-yodo-Tyr, di-yodo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr, nitro-Tyr, Trp, D-Trp, bromo-Trp, bromo-D-Trp, cloro-Trp, cloro-D-Trp, Phe, L-neo-Trp, o cualquier aminoácido aromático no natural,

con la salvedad de que la contulaquina-G genérica no es un péptido de fórmula Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu y Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina;

(c) una contulaquina-G genérica que tiene la siguiente fórmula general: Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{3}-Gly-Gly-Xaa_{2}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Xaa_{7}-Xaa_{9}-Xaa_{10}-Ile-Leu (SEC ID Nº: 2) que se ha modificado para que contenga un O-glucano, un S-glucano o un N-glucano, en la que Xaa_{1} es piro-Glu, Glu, Gln o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{2} es Ser, Thr o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{3} es Glu o \gamma-carboxy-Glu; Xaa_{4} es Asn, Asn modificada con un N-glucano o Cys modificada con un S-glucano; Xaa_{5} es Ala o Gly; Xaa_{6} es Thr, Ser, Cys modificada con un S-glucano, Tyr o cualquier aminoácido no natural que contiene hidroxilos; Xaa_{7} es Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina o cualquier aminoácido básico no natural; Xaa_{8} es Ala, Gly, Lys, N-metil-Lys, N,N-dimetil-Lys, N,N,N-trimetil-Lys, Arg, ornitina, homoarginina, cualquier aminoácido básico no natural o X-Lys donde X es (CH_{2})_{n}, fenil, -(CH_{2})_{m}-(CH=CH)-(CH_{2})_{m}H o -(CH_{2})_{m}-(C\equivC)-(CH_{2})_{m}H en los que n es 1-4 y m es 0-2; Xaa_{9} es Pro o hidroxi-Pro; y Xaa_{10} es Tyr, mono-yodo-Tyr, di-yodo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr, nitro-Tyr, Trp, D-Trp, bromo-Trp, bromo-D-Trp, cloro-Trp, cloro-D-Trp, Phe, L-neo-Trp, o cualquier aminoácido aromático no natural,

con la salvedad de que cuando la contulaquina-G genérica es un péptido de fórmula Xaa_{1}-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa_{2}-Tyr-Ile-Leu (SEC ID Nº: 1), en la que Xaa_{1} es piro-Glu y Xaa_{2} es prolina o hidroxiprolina y la Thr10 está modificada para contener un O-glucano, entonces el glucano se escoge de entre el grupo que consiste en Gal(\beta1\rightarrow3)GalNAc(\alpha1\rightarrow) y un glucano que tiene la estructura

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en la que R_{1} es un aminoácido que se puede derivatizar con un glucano tanto químicamente como enzimáticamente; R_{2} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, u O-glucano; R_{3} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo, ácido siálico o monosacárido; R_{4} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{5} es OH, NH_{2}, NHSO_{3}Na, NHAc, O-sulfato, O-fosfato, O-monosacárido u O-acetilo; R_{6} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{7} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; R_{8} es H, SO_{3}, P0_{3}, acetilo o monosacárido; n es 0-4 y m es 1-4;

(d) un análogo de la contulaquina-G que comprende un truncamiento N-terminal de desde 1 hasta 9 aminoácidos de la contulaquina-G genérica de (b) o (c);

(e) un análogo de la contulaquina-G de (d), en el que un Ser-O-glucano, Thr-O-glucano o Cys-S-glucano sustituye al residuo de aminoácido en el extremo N-terminal truncado;

(f) un análogo de la contulaquina-G de (d), en el que un Ser-O-glucano, Thr-O-glucano o Cys-S-glucano sustituye a un residuo en las posiciones 2-9 de la contulaquina-G genérica; y

(g) un análogo de la contulaquina-G que comprende un truncamiento N-terminal de 10 aminoácidos de la contulaquina-G genérica de (b) o (c) que está modificado adicionalmente para contener un Lys-N-glucano en el residuo 11 de la contulaquina-G genérica,

para uso como medicamento.

30. El agente activo de la reivindicación 29, en el que dicho medicamento es para el tratamiento del dolor, en particular el dolor agudo.

31. El agente activo de la reivindicación 30, en el que dicho dolor es postraumático.

32. El agente activo de la reivindicación 30, en el que dicho dolor es un dolor crónico.

33. El agente activo de la reivindicación 32, en el que dicho dolor crónico es resultado de cáncer.

34. El agente activo de la reivindicación 32, en el que dicho dolor crónico es un dolor neuropático.

35. El agente activo de la reivindicación 32, en el que dicho dolor crónico es inflamatorio.

36. El agente activo de una cualquiera de las reivindicaciones 29-35, en el que el agente activo se administra mediante el uso de un sistema de administración que se escoge de entre el grupo que consiste en infusión, administración mediante bomba, administración mediante polímero biodegradable, administración mediante células microencapsuladas, inyección y administración mediante células macroencapsuladas.

37. El agente activo de la reivindicación 36, en el que la administración se hace dentro del sistema nervioso central.

38. El agente activo de la reivindicación 37, en el que se selecciona el sistema nervioso central dentro del grupo que consiste en el espacio intratecal, los ventrículos cerebrales y el parénquima cerebral.

39. El agente activo de la reivindicación 36, en el que la administración se escoge de entre el grupo que consiste en subcutánea, intravenosa, intraarterial e intramuscular.