ES2208285T3 - Metodo para la identificacion de patrones de metilacion de citosina en muestras genomicas de adn. - Google Patents

Abstract

Método para la identificación de patrones de metilación de citosina en muestras genómicas de ADN, que se caracteriza porque: a) se trata de tal forma una muestra genómica de ADN que reaccionan de forma distinta la citosina y la 5-metilcitosina y se obtiene en el Duplex (DNA de doble hebra) un comportamiento distinto de apareamiento de bases de los dos productos; b) se amplifican enzimáticamente partes de la muestra de ADN así tratada; c) se unen a una superficie las partes amplificadas de la muestra de ADN así tratada; d) se hibridiza en las muestras inmovilizadas de ADN un conjunto de sondas de distintas secuencias de bases nucleicas que contienen como mínimo en cada caso el dinucleótido 5¿-CpG-3¿; e) se separan las sondas no hibridizadas; f) se analizan las sondas hibridizadas en un espectrómetro de masas, permitiendo la posición de las sondas en el soporte de muestras una correlación con respecto a la muestra de ADN hibridizante; g) transferencia del patrón de picos obtenido a partir de los espectros de masas al patrón de metilación y comparación de los nuevos datos con un banco de datos.

Description

Método para la identificación de patrones de metilación de citosina en muestras genómicas de ADN.

La invención hace referencia a un método para la identificación de patrones de metilación de citosina en muestras genómicas de ADN.

La información genética, que se obtendrá como secuencia de bases mediante una secuenciación completa de ADN genómico, solamente describe el genoma de una célula de manera incompleta. Los ácidos nucleicos de 5-metilcitosina, que se generan mediante metilación reversible de ADN en la célula, son un soporte de informaciones epigenético y sirven, por ejemplo, para la regulación de promotores. El estado de metilación de un genoma representa el estado actual de la expresión génica, de forma parecida a como lo hace un patrón de expresión mRNA.

5-metilcitosina es la base covalentemente modificada más frecuente en el ADN de células eucariotas. Juega un papel, por ejemplo, en la regulación de la transcripción, el Imprinting genómico y en la génesis tumoral. La identificación de 5-metilcitosina como parte integrante de la información genética es, por tanto, de especial interés. No obstante no pueden identificarse posiciones de 5-metilcitosina mediante secuenciación, dado que la 5-metilcitosina muestra el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Aparte de ello, cuando se trata de una amplificación por PCR, se pierde completamente la información epigenética que llevan las 5-metilcitosinas.

Se conocen varios métodos que intentan solucionar estos problemas. Generalmente se realiza una reacción química o un tratamiento enzimático del ADN genómico, pudiéndose diferenciar gracias a ello las bases de citosina de las bases de metilcitosina. Un método corriente consiste en la transformación del ADN genómico con bisulfito que conduce, tras una hidrólisis alcalina en dos pasos, a una transformación de las bases de citosina en uracilo (Shapiro, R., Cohen, B., Servis, R. Nature 227, 1047 (1970). La 5-metilcitosina permanece invariable bajo estas condiciones. La transformación de C en U conduce a una modificación de la secuencia de las bases a partir de la cual se pueden determinar ahora, mediante secuenciación, las 5-metilcitosinas originarias (solamente éstas suministran todavía una banda dentro del carril de las citosinas).

Una visión general de otras posibilidades conocidas de comprobación de 5-metilcitosinas pueden verse, por ejemplo, en el siguiente artículo de carácter general: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 26, 2255 (1988).

La técnica del bisulfito solamente se utiliza hasta ahora, con muy pocas excepciones (p. ej. Zeschnigk, M. y otros, Eur. J. Hum, Gen. 5, 94-98; Kubota T. y otros, Nat. Genet. 16, 16-17) en investigaciones. Siguen amplificándose, no obstante, segmentos específicos de un gen conocido tras un tratamiento con bisulfito, procediéndose bien sea a su secuenciación completa (Olek, A. and Walter, J., Nat. Genet. 17, 275-276) o bien a la detección de posiciones concretas de citosina a través de una "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. and Jones, P.A., Nucl. Acids. Res. 25, 2529-2531) o de una digestión enzimática (Xiong, Z. and Laird, P.W., Nucl. Acids. Res. 25, 2532-2534). Todas estas referencias son del año 1997. El concepto de emplear patrones complejos de metilación para la correlación con datos fenotípicos de enfermedades genéticas complejas solamente se menciona en la DE-19543065 A1. En ella, por ejemplo, no se realiza la detección propiamente dicha a través del análisis de la hibridización de muestras de ácido nucleico en el espectrómetro de masas.

No siempre se hace necesario el determinar realmente la secuencia completa de un gen o de un fragmento de gen, tal y como ocurre cuando se trata de una secuenciación. Este es el caso, especialmente, cuando han de explorarse unas pocas posiciones de 5-metilcitosina dentro de una secuencia larga de bases para una multiplicidad de muestras distintas. La secuenciación suministra aquí, dentro de un ámbito amplio, una información redundante y resulta, además, muy cara. Este es también el caso cuando se conoce ya la secuencia y han de representarse exclusivamente las posiciones de metilación. Puede pensarse también en que, en algunos casos, tan solo son de interés las diferencias dentro del patrón de metilación entre distintas muestras de ADN genómico y en que puede renunciarse a la determinación de toda una serie de posiciones metiladas coincidentes. Para los interrogantes que aquí se plantean no existe hasta ahora método alguno que suministre de manera económica los resultados deseados sin secuenciación de cada una de las muestras.

La información de la secuencia deberá volverse a determinar de nuevo mucho menos dado que los proyectos relacionados con el genoma, cuyo objetivo es la secuencia completa de distintos organismos, van avanzando o progresando de forma rápida. Es cierto que del genoma humano solamente se ha realizado una secuenciación completa hasta ahora de un 5% aproximadamente, aunque se avanza cada año en otro 5% por el hecho de que hay otros proyectos sobre el genoma que se están finalizando, liberándose por tanto recursos de secuenciación. Se calcula que el año 2006 se habrá completado la secuenciación del genoma humano.

La espectrometría de masas MALDI es un método nuevo, muy eficaz, empleado para el análisis de biomoléculas (Karas, M. and Hillenkamp, F. 1988. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10.000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301). Se incorpora una molécula de analito en una matriz que absorbe las radiaciones UV. Con ayuda de un impulso corto de láser se evapora la matriz en vacío y se hace pasar el analito no fragmentado a la fase gaseosa. Una tensión aplicada acelera los iones dentro de un tubo sin campo que permite el vuelo. A causa de sus distintas masas se ven acelerados los iones con distinta intensidad. Los iones más pequeños alcanzan el detector antes que los mayores. Se realiza una conversión del tiempo de vuelo en la masa de los iones.

Novedades técnicas del Hardware han mejorado el método de manera significativa. Es digno de mencionarse al respecto el método "delayed extraction" (DE). Para el DE se conecta la tensión de aceleración con un cierto retraso con respecto al impulso del láser, consiguiéndose con ello una mejor resolución de las señales al reducirse la cantidad de impactos.

El método MALDI resulta especialmente apropiado para el análisis de péptidos y proteínas. Para ácidos nucleicos es la sensibilidad unas 100 veces peor que para péptidos y se va reduciendo de forma sobreproporcional conforme va aumentando el tamaño de los fragmentos. La explicación de ello ha de verse en el hecho de que para la ionización de péptidos y proteínas únicamente es necesario capturar un único protón. Para ácidos nucleicos que presentan un esqueleto muy cargado negativamente resulta sustancialmente ineficiente el proceso de ionización a través de la matriz. Para el método MALDI juega un papel de eminente importancia la elección de la matriz. Para la desorción de péptidos se han encontrado algunas matrices muy eficientes que permiten una cristalización muy fina. Es cierto que para el ADN se han encontrado en el entretanto algunas matrices apropiadas, aunque con ello no se ha reducido la diferencia de sensibilidad. Los ácidos nucleicos de fosforotioato, en los que se sustituyen los fosfatos usuales del esqueleto por tiofosfatos, se pueden transformar mediante una química sencilla de alquilización en un AND sin carga.

El acoplamiento de una etiqueta de carga "charge tag" a este ADN modificado da como resultado un incremento de la sensibilidad dentro del mismo rango que se encuentra cuando se trata de péptidos. Gracias a estas modificaciones se ha abierto también la posibilidad de utilizar matrices similares a las que se utilizan para la desorción de péptidos. Otra de las ventajas del charge tagging consiste en la elevada estabilidad del análisis frente a impurezas que dificultan enormemente la detección de sustratos no modificados. Con MALDI se han examinado PNAs y oligonucleótidos de metilfosfonato y pueden analizarse de este modo.

Actualmente se encuentra la tecnología en situación de diferenciar, dentro de un rango de masas de 1.000 hasta 4.000 Da, moléculas con una diferencia de masa de 1 Da. Debido a la distribución natural de isótopos presentan ya, sin embargo, la mayoría de las biomoléculas una amplitud o anchura de aproximadamente 5 Da. Técnicamente resulta por tanto este método de espectrometría de masas extraordinariamente apropiado para el análisis de biomoléculas. Los productos que han de analizarse deberían hallarse razonablemente distanciados o separados 5 Da como mínimo. Dentro de este rango de masas se han podido diferenciar, por tanto, 600 moléculas.

Un Array con muchos miles de ADNs diana se puede inmovilizar en una fase sólida, pudiéndose analizar a continuación todos los ADNs diana conjuntamente por medio de una sonda para detectar la presencia de una secuencia (ácido nucleico con secuencia complementaria).

Mediante una hibridación de las dos partes entre sí se consigue una concordancia en el ADN diana con la sonda. Las sondas pueden consistir en las secuencias que se quiera de ácidos nucleicos con una longitud cualquiera. Existen distintos métodos para la selección de bibliotecas (librerías) óptimas de secuencias de sondas que se solapan mínimamente. Se pueden agrupar también selectivamente secuencias de sondas con el fin de encontrar determinadas secuencias de ADN diana. Oligofingerprinting constituye un preparado en el que se aplica esta tecnología. Se explora una biblioteca de ADNs diana con sondas cortas de ácido nucleico. Las sondas suelen presentar aquí generalmente una longitud de tan solo 8-12 bases. Se hibridizará en cada caso una sonda en una biblioteca de ADN diana inmovilizada una vez sobre una membrana de nylon. La sonda se encuentra radioactivamente marcada y la hibridación se valorará teniendo en cuenta la localización de la radioactividad. Para la exploración de un Array de ADN inmovilizado se utilizan también sondas marcadas fluorescentemente.

En US 5,605,798 se describe la explotación de ácidos nucleicos diana inmovilizados mediante hibridación con sondas de ácidos nucleicos y espectrometría de masas. En este caso, sin embargo, ni se realiza una identificación selectiva de patrones de metilación, ni se utilizan ácidos nucleicos modificados (p. ej. PNAs, Charge Tags), ni se realiza una amplificación genómica.

La US 5,605,798 describe por tanto un método para la detección de determinadas secuencias de ácidos nucleicos dentro de una muestra con ayuda de una amplificación y una espectrometría de masas posterior como método de secuenciación. En este caso ha de conocerse la secuencia de los ácidos nucleicos a determinar, con el fin de que se puedan fabricar o preparar los Primer hibridizantes. En este documento no se utiliza ninguna sonda que contenga CpG. Tampoco figura indicación alguna de que la espectrometría de masas sea apropiada para la identificación de patrones de metilación.

En Biotechniques, Tomo 21, Nº 1, 1996, páginas 126-133 y en la WO-A-9737041 se describen técnicas clásicas de secuenciación que utilizan una elongación de Primer como en la secuenciación Sanger.

Como sondas puede tomarse en consideración cualquier molécula que pueda interactuar específicamente con la secuencia de un ADN diana. Los más usuales son los oligodeoxiribonuleótidos. Puede recurrirse no obstante a cualquier modificación de ácidos nucleicos, p. ej. Peptide Nucleic Acids (PNA), oligonucleótidos de fosforotioato o oligonucleótidos de metilfosfonato. La especificidad de una sonda resulta fundamental. Los oligonucleótidos de fosforotioato no resultan tan apropiados debido a que su estructura, y con ella la propiedad de hibridación, se ve perturbada por los átomos de azufre. Una explicación de ello podría ser el hecho de que los oligonucleótidos de fosforotioato no se sintetizan normalmente de forma diestereométicamente pura. Tratándose de oligonucleótidos de metilfosfonato existe un problema similar, aunque estos oligonucleótidos se sintetizan cada vez más de forma diestereométicamente pura. Una diferencia fundamental de esta modificación la constituye el esqueleto neutro que conduce a una dependencia más reducida de la hibridación de las sales presentes en la disolución o en el tampón y conduce en su conjunto, gracias a una menor repulsión, a una afinidad mayor. Los Peptide Nucleic Acids presentan igualmente un esqueleto neutro o sin carga que difiere al mismo tiempo químicamente de forma muy importante de la estructura corriente de fosfato y azúcar de los ácidos nucleicos. El esqueleto de un PNA tiene una secuencia amídica en lugar del esqueleto de fosfato y azúcar de un ADN usual. PNA hibridiza muy bien con una secuencia complementaria de ADN. La temperatura de fusión de un híbrido de PNA/ADN es mayor que la del correspondiente híbrido de ADN/ADN y nuevamente es muy pequeña la dependencia de la hibridación de las sales presentes en la disolución o tampón.

Se realizan síntesis combinatorias, es decir la preparación de bibliotecas de sustancias a partir de una mezcla de productos previos, tanto en fase sólida como también en fase líquida. Sobre todo la síntesis combinatoria en fase sólida se ha establecido ya en un momento muy temprano ya que en este caso resulta especialmente sencilla la separación de subproductos. Solamente los compuestos diana unidos al soporte se verán retenidos en un paso de lavado y se aislarán al final de la síntesis mediante la disociación o ruptura selectiva de un Linker. Esta técnica permite realizar, por una vía sencilla, la síntesis simultánea de un gran número de compuestos distintos en una fase sólida y, por tanto, la obtención de bibliotecas de sustancias químicamente "puras".

Consiguientemente resultan accesibles de forma relativamente fácil par la química combinatoria las clases de combinaciones o uniones, que se sintetizan también en síntesis convencionales, no combinatorias, en una fase sólida, por lo que se utilizan también ampliamente. Esto resulta aplicable sobre todo a las bibliotecas de PNA, ácidos nucleicos y péptidos.

La síntesis de péptidos se realiza mediante una unión del primer aminoácido protegido en el extremo amino (p. ej. Bock) al soporte, una posterior desprotección y una reacción del segundo aminoácido con el grupo NH2 liberado del primero. Las funciones amino que no hayan reaccionado se extraerán en un nuevo paso "Capping" de una reacción posterior en el siguiente ciclo de síntesis. Se quitará el grupo de protección en la función amino del segundo aminoácido, pudiéndose acoplar el siguiente aminoácido. Para la síntesis de bibliotecas de péptidos se utilizará una mezcla de aminoácidos en uno o varios pasos. La síntesis de bibliotecas de PNA y PNA se realizará de forma análoga.

Las bibliotecas de ácido nucleico se obtendrán generalmente mediante una síntesis en fase sólida con mezclas de distintos nucleósidos de fosforoamidita. Esto se puede realizar con sintetizadores de ADN de tipo comercial sin modificaciones en los protocolos de síntesis.

Se han publicado distintos trabajos sobre síntesis combinatorias de bibliotecas de PNA. Estos trabajos abordan la estructura de secuencias combinatorias, es decir la síntesis de PNAs en las que se sustituyen bases concretas, específicas, dentro de la secuencia por bases degeneradas, consiguiéndose consiguientemente con ello una variación aleatoria de secuencias.

El empleo de métodos espectrométricos de masas para el análisis de bibliotecas combinatorias se ha descrito ya en múltiples ocasiones.

Existen distintos métodos para inmovilizar ADN. El método más conocido consiste en la unión fija de un ADN, que se funcionaliza con biotina, a una superficie recubierta de estreptavidina. La intensidad de la unión de este sistema es equivalente a una unión química covalente sin serlo. Para poder unir un ADN diana covalentemente a una superficie preparada químicamente, será necesario contar con una funcionalidad correspondiente del ADN diana. El ADN en cuanto tal no dispone de funcionalización alguna que sea apropiada. Existen distintas variantes para introducir una funcionalización apropiada en un ADN diana: dos funcionalizaciones fáciles de manejar son tioles y aminas alifáticas, primarias. Estas aminas se transforman cuantitativamente con ésteres de N-hidroxisuccinimida y los tioles reaccionan cuantitativamente con yoduros de alquilo bajo condiciones apropiadas. Plantea dificultades la introducción de una funcionalización de este tipo en un ADN. La variante más sencilla consiste en la introducción a través de un Primer en una PCR. Las variantes mostradas utilizan Primer 5'-modificados (NH2 y SH) y un Linker bifuncional.

Una componente fundamental de la inmovilización sobre una superficie la constituyen sus características. Los sistemas descritos hasta ahora son principalmente de silicio o metal (magnetic vedas). Otro método para la unión de un ADN diana se basa en el empleo de una secuencia de reconocimiento corta (p. ej. 20 bases) en el ADN diana para la hibridación en un oligonucleótido inmovilizado en la superficie.

Se han descrito también variantes enzimáticas para la introducción de posiciones químicamente activadas en un ADN diana. En este caso se realiza en un ADN diana enzimáticamente una funcionalización 5'-NH2.

El objetivo que se plantea la presente invención consiste en crear un método que supere los inconvenientes que presenta el estado actual de la técnica y se halle en disposición de mostrar metilaciones de citosina efectivas y paralelas múltiples en un Array de muestras genómicas de ADN inmovilizadas.

El objeto de la presente invención lo constituye, por tanto, un método para la identificación de soportes epigenéticos de informaciones en forma de bases de 5-metilcitosina dentro del ADN genómico, utilizando simultáneamente toda una serie de sondas para un análisis espectrométrico de masas de un Array de ácidos nucleicos diana.

La tarea planteada según la invención se resuelve gracias a que se facilita un método para la identificación de patrones de metilación de citosina en muestras genómicas de ADN, en el que:

a) se trata de tal forma una muestra genómica de ADN que reaccionan de forma distinta la citosina y la 5-metilcitosina y se obtiene en el Duplex (DNA de doble hebra) un comportamiento distinto de apareamiento de bases de los dos productos;

b) se amplifican partes de la muestra de ADN así tratada;

c) se unen a una superficie las partes amplificadas de la muestra de ADN así tratada;

d) se hibridiza en las muestras inmovilizadas de ADN un conjunto de sondas de distintas secuencias de bases nucleicas que contienen como mínimo en cada caso el dinucleótido 5'-CpG-3';

e) se separan las sondas no hibridizadas;

f) se analizan las sondas hibridizadas en un espectrómetro de masas, permitiendo la posición de las sondas en el soporte de muestras una correlación con respecto a la muestra de ADN hibridizante;

g) transferencia del patrón de picos obtenido a partir de los espectros de masas al patrón de metilación y comparación de los nuevos datos con un banco de datos.

Resulta preferente según la invención el que se inmoviliza en c) uno o varios fragmentos genómicos amplificados de ADN mediante la hibridación con secuencias complementarias de PNA o oligonucleótidos que se unen covalentemente a la superficie.

Resulta además preferente según la invención la realización, tras la hibridización se realiza un Cross-Linking de los fragmentos genómicos de ADN con las secuencias de PNA o de los oligonucleótidos unidas a la superficie. Especialmente preferente resulta a este respecto el que para el Cross-Linking se forman uniones químicas covalentes. Resulta además preferente según la invención el que para el Cross-Linking se forman o configuran interacciones electrostáticas.

Resulta además ventajoso el hecho de que las secuencias de PNA o oligonucleótidos unidas a la superficie contienen unidades estructurales de 5-bromuracilo.

Resulta preferente según la invención que las secuencias complementarias inmovilizadas de oligonucleótidos incluyen unidades estructurales, ribosas o bases modificadas.

El método según la invención se caracteriza además por el hecho de que en b) se multiplica la muestra genómica de ADN en forma de varios fragmentos amplificados, amplificándose como mínimo un 0,01% de todo el genoma.

Resulta también preferente según la invención el que se une la mezcla de fragmentos amplificados de ADN sobre una superficie en la que se ha dispuesto un gran número de puntos distintos que se hallan en situación, en cada caso, de unir diversas partes de la muestra de ADN amplificada.

Resulta además preferente según la invención el que en d) se utiliza un conjunto de sondas que únicamente contiene una vez por sonda la secuencia del dinucleótido 5'-CpG-3' y las sondas, por lo demás, no contienen en cada caso base alguna de citosina o base alguna de guanina.

Resulta además preferente según la invención el que en el paso a) se utiliza una solución de disulfito, pirosulfito o bisulfito, o una mezcla de las soluciones indicadas, juntamente con otros reactivos para la transformación específica o suficientemente selectiva de citosina en uracilo.

Resulta también ventajoso el hecho de que la superficie utilizada para la inmovilización de muestras de ADN amplificadas es al mismo tiempo el soporte de las muestras para un espectrómetro de masas. Resulta preferente al respecto el que la superficie empleada para la inmovilización de muestras de ADN amplificadas se aplica como un todo, antes de f), sobre un soporte de muestras para un espectrómetro de masas. Resulta también preferente en este caso el que se separan las sondas hibridizadas antes del, después del o por medio del contacto con una matriz de las muestras amplificadas inmovilizadas de ADN.

Resulta además preferente según la invención el que las sondas son ácidos nucleicos que llevan una o varias etiquetas (tags) de masa. Según la invención resulta ventajoso también que una o varias de las etiquetas de masa sean al mismo tiempo etiquetas de carga. O que las sondas llevan adicionalmente una etiqueta de carga.

Resulta preferente según la invención que las sondas son moléculas modificadas de ácidos nucleicos. Resulta especialmente preferente al respecto el hecho de que las moléculas de ácidos nucleicos modificadas son PNAs, ácidos nucleicos alquilizados de fosforotioato o ácidos nucleicos de alquilfosfonato.

Resulta preferente según la invención el hecho de que las sondas se preparan o fabrican por medio de una síntesis combinatoria. A este respecto resulta especialmente preferente según la invención el hecho de que se marcan distintas bases de forma tal que las sondas sintetizadas a partir de las mismas resultan diferenciables en cada caso a través de sus masas en el espectrómetro de masas.

Resulta además ventajoso según la invención el hecho de que se fabrican o preparan las sondas como bibliotecas parciales y se dota a las mismas de distintas etiquetas de masas y/o de carga.

Resulta muy especialmente preferente según la invención el hecho de que en f) se aplica el método MALDI.

Otro objeto de la presente invención lo constituye un juego o kit para la realización del método según la invención, que comprende un soporte de muestras para el espectrómetro de masas, el cual se ha modificado de forma tal que pueden inmovilizarse en él las partes que se desee seleccionar de un genoma y/o bibliotecas de sondas con las que analiza con el espectrómetro de masas el ADN inmovilizado en el soporte de muestras, y/o otros productos químicos, disolventes y/o productos auxiliares, así como, en caso necesario, un manual de instrucciones de empleo.

El método según la invención sirve para la identificación de posiciones de 5-metilcitosina en un ADN genómico que puede ser del origen o procedencia más diversa. El ADN genómico se somete primeramente a un tratamiento químico de tal naturaleza que provoca una diferencia en la reacción de las bases de citosina con respecto a las bases de 5-metilcitosina. Como posibles reactivos pueden utilizarse en este caso, p. ej., disulfito (que se designa también como bisulfito), hidracina y permanganato. Según una variante preferente del método o procedimiento se trata el ADN genómico con disulfito en presencia de hidroquinona o derivados de hidroquinona, transformándose selectivamente, tras una hidrólisis alcalina final, las bases de citosina en uracilo. La 5-metilcitosina se mantiene sin variación alguna bajo estas condiciones. Tras un proceso de purificación, que sirve para la separación del disulfito sobrante, se amplifican determinados fragmentos del ADN genómico pretratado en una reacción de la polimerasa. En una variante preferente del método o procedimiento se utiliza al respecto la reacción en cadena de la polimerasa. En una variante especialmente preferente del método se realiza de tal forma la reacción en cadena de la polimerasa que al menos un 0,01% de todo el genoma se amplifica en forma de varios fragmentos.

La muestra de ADN previamente tratada, amplificada, se puede inmovilizar a continuación en una superficie de acuerdo con diversas variantes del método. En una variante preferente del método se realiza la inmovilización en la superficie de forma tal que se modifica previamente con oligonucleótidos o secuencias cortas de PNA (Peptide nucleic acids), realizándose con ello una hibridización de secuencias complementarias en la muestra de ADN. Básicamente se pueden modificar los oligonucleótidos inmovilizados tanto en las bases como en las (desoxi) ribosas y/o en el esqueleto con respecto al ADN corriente. Si se unen ahora distintas secuencias de oligonucleótidos o PNA en forma de un Array a esta superficie o si se sintetizan sobre ella, podrá unir cada una de estas distintas secuencias distintas partes de los fragmentos de ADN amplificados. En una variante especialmente preferente del método se realiza, tras la hibridización, un Cross-Linking de las dos hebras. Se podrá realizar mediante la configuración de una unión química covalente o de una interacción estable electrostática. En otra variante preferente se realiza un Cross-Linking fotoquímico a través de unidades estructurales de bromuracilo.

Se tiene también la posibilidad de amplificar separadamente fragmentos del ADN genómico previamente tratado e inmovilizar los productos individualmente en distintos puntos sobre la superficie. En una variante preferente del método se realiza esto de forma tal que uno de los Primer usados en la PCR lleva una función apropiada para la inmovilización que puede unirse con una funcionalidad existente sobre la superficie.

La superficie a la que se unirán los fragmentos amplificados de ADN o bien ha de poderse transferir al soporte de muestras de un espectrómetro de masas MALDI o bien constituir ella misma dicho soporte de muestras. La construcción o diseño y el Software del espectrómetro de masas garantiza al respecto que el punto examinado en cada sobre el soporte de muestras se pueda asignar o correlacionar con las muestras originariamente unidas en dicho lugar.

En los fragmentos de ADN amplificados, inmovilizados, se hibridizará ahora un conjunto de sondas, siendo así que dichas sondas contienen una vez como mínimo en cada caso la secuencia 5'-CpG-3' y por lo demás no contienen en cada caso ninguna base de citosina o bien ninguna base de guanina. Las sondas pueden ser oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados o PNAs (Peptide nucleic acids). En una variante preferente del método se fabrica este conjunto de sondas en un preparado de síntesis combinatoria en forma de biblioteca combinatoria. En otra variante preferente del método pueden diferenciarse claramente las sondas a través de su masa de forma que resulta posible sacar conclusiones sobre la secuencia a través de la masa. Para ello pueden equiparse las sondas con etiquetas de masa que impiden la igualdad de masas de distintas sondas. Las sondas puede equiparse con etiquetas de carga con el fin de conseguir una mejor representación en el espectrómetro de masas y con el fin de incrementar la estabilidad del análisis en presencia de sales y detergentes. Las etiquetas de masa pueden ser simultáneamente etiquetas de carga. Las sondas se pueden preparar también como bibliotecas combinatorias parciales que llevan nuevamente distintas etiquetas de masas o de cargas. Las sondas pueden ser PNAs, moléculas de ácido nucleico no modificadas o moléculas de ácido nucleico modificadas, como ácidos nucleicos de fosforotioato, ácidos nucleicos alquilados de fosforotioato o ácidos nucleicos de alquilfosfonato, sin perjuicio de una posterior modificación por medio de etiquetas de masas o de cargas.

Las sondas no hibridizadas se separarán en uno o varios pasos de lavado. Las sondas hibridizadas permanecerán en este caso en sus posiciones.

La superficie se fijará sobre el soporte de muestras MALDI y se transferirá al espectrómetro de masas o se transferirá directamente si el método se realiza o aplica sobre el mismo soporte de muestras MALDI. El Array de muestras se analizará ahora mediante el espectrómetro de masas para comprobar la presencia de sondas hibridizadas. Las sondas hibridizadas se deshibridizarán al respecto en una variante preferente del método a través del contacto con la matriz MALDI y se incorporarán en la misma; a través de la velocidad con la que se aplicará la matriz no se producirá sin embargo contaminación alguna de los puntos adyacentes. En cada punto darán lugar las sondas hibridizadas a un patrón de picos a través del cual se podrán sacar conclusiones respecto a las secuencias en las que se haya realizado una hibridación. Debido al tratamiento previo (preferentemente con bisulfito) darán lugar a secuencias distintas los fragmentos de ADN metilizados de distintas formas en la citosina. Por ello son los patrones de picos generados a través de las sondas en el espectrómetro de masas muestras características de metilación de la muestra de ADN examinada en cada caso. Se realiza una comparación de estas muestras de metilación con las de un banco de datos.

Claims (23)

1. Método para la identificación de patrones de metilación de citosina en muestras genómicas de ADN, que se caracteriza porque:

a) se trata de tal forma una muestra genómica de ADN que reaccionan de forma distinta la citosina y la 5-metilcitosina y se obtiene en el Duplex (DNA de doble hebra) un comportamiento distinto de apareamiento de bases de los dos productos;

b) se amplifican enzimáticamente partes de la muestra de ADN así tratada;

c) se unen a una superficie las partes amplificadas de la muestra de ADN así tratada;

d) se hibridiza en las muestras inmovilizadas de ADN un conjunto de sondas de distintas secuencias de bases nucleicas que contienen como mínimo en cada caso el dinucleótido 5'-CpG-3';

e) se separan las sondas no hibridizadas;

f) se analizan las sondas hibridizadas en un espectrómetro de masas, permitiendo la posición de las sondas en el soporte de muestras una correlación con respecto a la muestra de ADN hibridizante;

g) transferencia del patrón de picos obtenido a partir de los espectros de masas al patrón de metilación y comparación de los nuevos datos con un banco de datos.

2. Método según la reivindicación 1, que se caracteriza porque se inmoviliza en c) uno o varios fragmentos genómicos amplificados de ADN mediante la hibridación con secuencias complementarias de PNA o oligonucleótidos que se unen covalentemente a la superficie.

3. Método según la reivindicación 2, que se caracteriza porque tras la hibridización se realiza un Cross-Linking de los fragmentos genómicos de ADN con las secuencias de PNA o de oligonucleótidos unidas a la superficie.

4. Método según la reivindicación 3, que se caracteriza porque para el Cross-Linking se forman uniones químicas covalentes.

5. Método según la reivindicación 3, que se caracteriza porque para el Cross-Linking se forman interacciones electrostáticas.

6. Método según alguna de las reivindicaciones 3 hasta 5, que se caracteriza porque las secuencias de PNA o de oligonucleótidos unidas a la superficie contienen unidades estructurales de 5-bromuracilo.

7. Método según una al menos de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque las secuencias complementarias inmovilizadas de oligonucleótidos incluyen unidades estructurales, ribosas o bases modificadas.

8. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque en b) se multiplica la muestra genómica de ADN en forma de varios fragmentos amplificados, amplificándose como mínimo un 0,01% de todo el genoma.

9. Método según una al menos de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque se une la mezcla de fragmentos amplificados de ADN sobre una superficie en la que se ha dispuesto un gran número de puntos distintos que se hallan en situación, en cada caso, de unir diversas partes de la muestra de ADN amplificada.

10. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores que se caracteriza porque en d) se utiliza un conjunto de sondas que únicamente contiene una vez por sonda la secuencia del dinucleótido 5'-CpG-3' y las sondas, por lo demás, no contienen en cada caso base alguna de citosina o base alguna de guanina.

11. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque en el paso a) se utiliza una solución de disulfito, pirosulfito o bisulfito, o una mezcla de las soluciones indicadas, juntamente con otros reactivos para la transformación específica o suficientemente selectiva de citosina en uracilo.

12. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque la superficie utilizada para la inmovilización de muestras de ADN amplificadas es al mismo tiempo el soporte de las muestras para un espectrómetro de masas.

13. Método según una al menos de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque la superficie utilizada para la inmovilización de muestras de ADN amplificadas se aplica como un todo, antes de f), sobre un soporte de muestras para un espectrómetro de masas.

14. Método según alguna de las reivindicaciones 1 hasta 13, que se caracteriza porque se separan las sondas hibridizadas antes del, después del o por medio del contacto con una matriz de las muestras amplificadas inmovilizadas de ADN.

15. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque las sondas son ácidos nucleicos que llevan una o varias etiquetas de masa.

16. Método según la reivindicación 15, que se caracteriza porque una o varias de las etiquetas de masa son al mismo tiempo etiquetas de carga.

17. Método según la reivindicación 15, que se caracteriza porque las sondas llevan adicionalmente una etiqueta de carga.

18. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque las sondas son moléculas de ácido nucleico modificadas.

19. Método según la reivindicación 20****(?), que se caracteriza porque las moléculas de ácidos nucleicos modificadas son PNAs, ácidos nucleicos alquilizados de fosforotioato o ácidos nucleicos de alquilfosfonato.

20. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque las sondas se preparan por medio de una síntesis combinatoria.

21. Método según la reivindicación 20, que se caracteriza porque se marcan distintas bases de forma tal que las sondas sintetizadas a partir de las mismas resultan diferenciables en cada caso a través de sus masas en el espectrómetro de masas.

22. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque se preparan las sondas como bibliotecas parciales y se dota a las mismas de distintas etiquetas de masas y/o de carga.

23. Método según alguna de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque en f) se aplica el método MALDI.