ES2208384T3 - Forma cristalina de clorhidrato de 6 hidroxi-3-(4-(2-(piperidin-1-il)-etoxi)-fenoxi)2--(4-metoxifenil)-benzo(b)tiofeno. - Google Patents

Abstract

Hidrato de clorhidrato de 6-hidroxi-3-(4-[2-piperidin- 1-il)etoxi]fenoxi)-2-(4-metoxifenil)benzo[b]- tiofeno cristalino (F-III) que tiene un diagrama de difracción de rayos X que comprende los siguientes picos: 4, 6 + 0, 2, 7, 8 + 0, 2, 9, 3 + 0, 2, 14, 0 + 0, 2, 17, 6 + 0, 2, 20, 8 0, 2 y 24, 3 + 0, 2º en 2, cuando se obtienen a 25ºC + 2ºC y una humedad relativa de 35 + 10% con una fuente de radiación de cobre CuK, = 1, 54056 ).

Description

Forma cristalina del clorhidrato de 6-hidroxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)-etoxi]-fenoxi)-2-(4-metoxifenil)-benzo[b]tiofeno.

El clorhidrato de 6-hidroxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)-etoxi]fenoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofeno se describió primero genéricamente en la patente U.S. nº. 5.510.357 y se describió específicamente en la patente U.S. Nº. 5.723.474 (`474) y la solicitud de patente europea 0729956. El arzoxifeno es un antagonista/agonista mixto no esteroideo de estrógenos, útil para, interalia, rebajar el colesterol sérico y para inhibir la hiperlipidemia, osteoporosis, cánceres dependientes de estrógenos, incluidos cáncer de mama y de útero, endometriosis, trastornos del SNC, incluida la enfermedad de Alzheimer, proliferación de células del músculo liso aórtico y restenosis.

Específicamente, el arzoxifeno es útil para el tratamiento, que se está evaluando clínicamente, de cáncer metastático de mama de receptor positivo; el tratamiento coadyuvante de pacientes receptores positivos que siguen terapia sistémica o local; la reducción de la recurrencia de cáncer de mama invasivo o no invasivo; y la reducción de la incidencia de cáncer de mama invasivo y carcinoma ductal in situ (DCIS). El arzoxifeno es también útil en combinación con radioterapia, inhibidores de aromatasa, análogos de LHRH e inhibidores de acetilcolina-estearasa (AChE).

La difracción con rayos X en polvo (XRD), los análisis termogravimétricos y por resonancia magnética nuclear con protón (RMN ^{1}H) y el análisis de Karl Fischer (KF) de arzoxifeno en masa aislado por los procedimientos considerados en `474 revelaron que el mencionado material estaba hidratado, era poco cristalino y contenía cantidades variables de un compuesto orgánico volátil (acetato de etilo) en su red cristalina.

Los materiales poco cristalinos típicamente son menos deseables que los materiales altamente cristalinos para su formulación. Además, generalmente no es deseable formular productos farmacéuticos que contienen cantidades sustanciales de disolvente orgánico (por ejemplo, acetato de etilo) debido a la potencial toxicidad del disolvente para su receptor y a cambios en la potencia del producto farmacéutico en función del disolvente.

Aunque el arzoxifeno preparado por procedimientos propugnados en `474 podría usarse como producto farmacéutico, sería muy deseable y ventajoso encontrar una forma más cristalina de arzoxifeno que no contuviera un disolvente orgánico dentro de su red cristalina, que pudiera prepararse reproductible y eficientemente a escala industrial.

La presente invención se refiere a con nueva forma cristalina hidratada, no estequiométrica, de clorhidrato de 6-hidroxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]fenoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofeno (F-III) que tiene un diagrama de difracción de rayos X que comprende los picos siguientes: 4,6 \pm 0,2, 7,8 \pm 0,2, 9,3 \pm 0,2, 14,0 \pm 0,2, 17,6 \pm 0,2, 20,8 \pm 0,2 y 24,3 \pm 0,2º en 2\theta, cuando se han obtenido a 25 \pm 2ºC y 35 \pm 10% de humedad relativa (HR) usando una fuente de radiación de cobre.

Además, la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende F-III; uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticos; y, opcionalmente, estrógenos, opcionalmente progestina, opcionalmente un inhibidor de aromatasa, opcionalmente un análogo de LHRH y opcionalmente un inhibidor de acetilcolina-estearasa (AChE).

Además, la presente invención se refiere a métodos para usar F-III para inhibir dolencias patológicas tales como: fibrosis uterina, endometriosis, proliferación de células de músculo liso aórtico, restenosis, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna, pérdida ósea, osteoporosis, enfermedad cardiovascular, hiperlipidemia, trastornos del SNC, y enfermedad de Alzheimer, y para usar F-III para la manufactura de un medicamento para inhibir las dolencias mencionadas.

La presente invención se refiere adicionalmente a métodos para usar F-III con el fin de regular por hiperdroducción la colinaacetil-transferasa (ChAT) y para usar F-III en la manufactura de un medicamento para regular por hiperproducción la misma.

La Figura 1 representa DSC/TGA (DSC: calorimetría diferencial por barrido; TGA: análisis termogravimétrico) frente a temperatura para F-III.

La Fig. 2 representa las isotermas de sorción de la humedad para F-III.

El arzoxifeno masivo preparado por el procedimiento descrito en `474 (Ejemplo 43, cristalización a partir de una mezcla de etanol y acetato de etilo, filtración y secado de la torta de filtración en vacío hasta peso constante a temperatura ambiente) se caracterizó por XRD y se encontró que era poco cristalino. La RMN ^{1}H confirmó que el material masivo contenía 6% de acetato de etilo.

De acuerdo con la presente invención, una forma particularmente preferida de arzoxifeno es F-III. La F-III se prepara y aisla fácilmente a temperatura ambiente. Para eliminar niveles bajos de disolvente residual de cristalización en la preparación de F-III, sólo se requieren condiciones moderadas de secado. Estas condiciones moderadas de secado dan consistentemente por resultado un sólido de alta pureza (esto es, exento de disolvente orgánico residual) y cristalinidad y, por tanto el uso de F-III elimina las manifestaciones de toxicidad asociadas con disolvente orgánico residual y en la red cristalina. Además, la preparación de F-III es simple y eficiente, esto es, adecuada para la manufactura masiva.

La F-III se prepara y aisla fácilmente a temperatura ambiente por cristalización de arzoxifeno (o cualquiera de sus polimorfos/solvatos) a partir de una mezcla de alcohol isopropílico (IPA) y agua. Típicamente, el arzoxifeno puede ponerse en suspensión en una mezcla de IPA y agua y calentarse para disolver el material de partida arzoxifeno. Una vez lograda la disolución, se deja que la solución se enfríe lentamente a temperatura ambiente y luego, (con ayuda de un baño de hielo o con enfriamiento), a entre 0 y 5ºC. Después de que haya transcurrido tiempo suficiente para que se produzca la cristalización, se pueden recoger los cristales por filtración en vacío y se secan en vacío hasta peso constante para obtener F-III con rendimientos superiores a 80%.

Entre los materiales de arzoxifeno de partida, adecuados para la cristalización mencionada, están incluidos, aunque no únicamente, arzoxifeno preparado por los procedimientos descritos en `474. No es importante con qué forma de arzoxifeno se inicia, porque la cristalización a partir de IPA y agua, de acuerdo con los procedimientos descritos aquí, da por resultado cristales de F-III. Por lo general, la relación de agua a IPA (v/v) es de aproximadamente 1:1 a 9:1. Muy preferiblemente, la relación es de entre 2,5 y 5,6:1. Muy preferiblemente, la relación es de entre 3 a 5,6:1. Después de recoger los cristales por filtración en vacío, la torta húmeda de F-III puede lavarse con agua fría desionizada antes de secar en vacío. Además, se prefieren temperaturas de secado ligeramente elevadas (aproximadamente 50ºC durante 12 a 24 horas). Para la síntesis de F-III a escala comercial, puede ser ventajoso sembrar la cristalización con F-III.

En un procedimiento preferente, el F-III se prepara, aisla y purifica contiguamente a la eliminación química del grupo protector 6-isopropilhidroxi del clorhidrato de 6-hidroxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]fenoxi-2-(4-metoxi-fenil)benzo[b]tiofeno (precursor A). La reacción de desprotección se controla para la eliminación completa del grupo protector isopropilo y, una vez que se ha determinado que la eliminación es sustancialmente completa, el tratamiento de la mezcla de reacción incluirá, preferiblemente, una cristalización en condiciones que proporcionen F-III como se ha discutido antes y se discute posteriormente. En la patente U.S. nº. 5.723.474 se pueden encontrar métodos para preparar el precursor A y para eliminar el grupo isopropilo.

En otra realización preferente, la F-III se prepara, aisla y purifica contiguamente con la reducción química del S-óxido y la eliminación del grupo protector bencilo del 6-hidroxilo en 6-benciloxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]-fenoxi)-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofeno-(S-óxido) (precursor B). Las reacciones de reducción y desprotección se controlan para la reducción completa del sulfóxido al sulfuro y la eliminación completa del grupo protector bencilhidroxi. Una vez que se ha determinado que la reducción/eliminación es sustancialmente completa, el tratamiento de la mezcla de reacción incluirá, preferiblemente, una cristalización en las condiciones que proporcionen F-III como se ha discutido aquí. Se pueden encontrar métodos para preparar el precursor B, para eliminar el grupo bencilo y para reducir el 1-sulfóxido en el correpondiente sulfuro también en la patente U.S. nº. 5.723.474.

Independientemente de la química utilizada en las etapas de desprotección y reducción, la cristalización de azoxifeno de soluciones IPA/agua descritas produce consistentemente cristales de F-III de alta pureza.

Caracterización y diferenciación de F-III

Se utilizaron métodos de DSC/TGA y XRD para caracterizar la F-III. Frecuentemente, el TGA es muy útil para distinguir entre diferentes formas sólidas de un material porque la(s) temperatura(s) a que se produce el cambio físico en un material usualmente son características del polimorfo o solvato. DSC es una técnica que se usa a menudo para escrutar compuestos en cuanto a polimorfismo y la formación de solvatos. Finalmente, XRD es una técnica que detecta ordenamiento extenso en un material cristalino.

El arzoxifeno preparado por los procedimientos propugnados en `474 dió diagramas de XRD con mediocres relaciones de señal a ruido en una línea de base alzada, lo que es indicativo de un material poco cristalino.

La curva de DSC de la F-III mostrada en la Figura 1, señala una endotermia ancha, a baja temperatura, a aproximadamente 30ºC, seguida de una segunda endotermia ancha y relativamente débil que comienza a aproximadamente 70ºC, y una transición final a aproximadamente 146ºC, que corresponde a una fusión. La abrupta pérdida de peso, de 1,5% (aproxim. 0,5 mol) en la curva de TGA, coincidente con la primera endotermia, corresponde a una pérdida de moléculas de agua mantenidas débilmente, mientras que la pérdida adicional de peso, de aprox. 1,6% por encima de 60ºC, representa pérdida de moléculas de agua fijadas más estrechamente, esto es, las que están presentes a humedades relativamente muy bajas. La pérdida de peso observada después de 170ºC corresponde a la descomposición de F-III.

Los diagramas de XRD de F-III presentan picos agudos y una línea de base plana, lo que indica un material muy cristalino. Las posiciones angulares de los picos en 2\theta y los correspondientes datos de I/I_{0} para una muestra representativa de F-III se indican en la Tabla 1.

Es bien sabido en cristalografía que, para cualquier polimorfo dado, las intensidades relativas de los picos de difracción pueden variar debido a una orientación preferente resultante de factores tales como la morfología del cristal. Cuando están presentes los efectos de una orientación preferente, se alteran las intensidades de los picos, pero quedan invariables las posiciones características de los picos. Véase, por ejemplo, The United States Pharmacopeia nº. 23, National Formulary nº. 18, págs. 1843-1844, 1995. Por tanto, sobre la base de las intensidades de los picos y de la posición de los picos, se puede identificar la F-III por la presencia de picos a 4,6 \pm 0,2, 7,8 \pm 0,2, 9,3 \pm 0,2, 14,0 \pm 0,2, 17,6 \pm 0,2, 20,8 0,2 y 24,3 \pm 0,2º en 2\theta, cuando se obtiene este diagrama a 25ºC \pm 2ºC y una humedad relativa de 35 \pm 10% con una fuente de radiación de cobre.

TABLA 1

1

Caracterización adicional de F-III

Se realizaron estudios de higroscopicidad con F-III. En la Figura 2 se presentan las isotermas de sorción de humedad para F-III. Después de exponer inicialmente las muestras a aproximadamente 5% de HR, hubo una inmediata ganancia de peso, de 1,7% de humedad, de la F-III, equivalente a aproximadamente 0,5 moles de agua. Esta forma muestra una continua sorción de humedad en todo el intervalo de humedad, lo que probablemente es debido a la incorporación de moléculas de agua en los retículos cristalinos.

La falta de histéresis en las isotermas de sorción-desorción de F-III indica que la forma cristalina se equilibra rápidamente a cualquier humedad dada.

El perfil de sorción de humedad para la F-III revela que estas formas son esencialmente hidratos no estequiométricos. A la humedad relativa ambiente (aproximadamente 50% de HR), la F-III ha sorbido aproximadamente 3,0% de agua, lo que corresponde a aproximadamente 0,85 moles de agua. La forma masiva de F-III se equilibra rápidamente con la atmósfera, de manera que el contenido de agua observado por técnicas analíticas es reflejo de la humedad relativa en el momento de recogida de datos. Las diferencias de lote a lote observadas en los datos de DSC, probablemente se deben a que las muestras se han hidratado en cuantías diferentes debido a diferentes condiciones ambiente de almacenamiento.

Los diagramas de XRD se obtuvieron con muestras de F-III almacenadas a diferentes humedades relativas (0, 22, 50 y 80%). Hay un desplazamiento gradual de los picos iniciales (0% de HR) de F-III a aproximadamente 13,8, 17,6, 18,0, 20,5 y 24,0º en 2\theta, así como un ligero desplazamiento de picos menos intensos, a medida que aumenta la humedad relativa. Estos cambios vistos en los diagramas de XRD de F-III indican que las dimensiones de la celda elemental están cambiando, presumiblemente para acomodar las moléculas de agua mantenidas débilmente a medida que aumenta la humedad relativa. El desplazamiento continuo de los picos con la humedad se correlaciona bien con los datos de sorción de humedad que revelan una ganancia gradual de peso en este intervalo de HR, lo que proporciona evidencia de una formación variable de hidratos.

Se encontró que la F-III era estable en todo el intervalo de humedad relativa.

El material generado por cristalización desde una solución de etanol y acetato de etilo, seguida de secado en vacío durante sólo unas pocas horas, como se describe en `474, reveló muy pobre cristalinidad.

La F-III tiene varias ventajas sobre la forma de arzoxifeno de la técnica anterior, descrita en lo que antecede. Compartivamente con el arzoxifeno producido por los procedimientos descritos en `474, la F-III es más estable a temperatura ambiente y, por tanto, es más acomodable al desarrollo de productos farmacéuticos, esto es, al desarrollo de una formulación para dosificación. Además, la F-III es mucho más cristalina que la forma descrita en `474. Por lo general, los materiales cristalinos son menos higroscópicos y más estables (por ejemplo, menos propensos a la degradación química, mantienen consistentemente su potencia) que los materiales amorfos y son, por tanto, más deseables para procesos de formulación. Además, a diferencia de la forma de arzoxifeno producida por los procedimientos descritos en `474, que contenía acetato de etilo y agua en su retículo cristalino, la F-III contenía sólo agua.

Las medidas de DSC se realizaron con un aparato de calorimetría diferencial de barrido TA Instruments 2920 Modulated DSC, acoplado a un Thermal Analyst 3100 y equipado con un sistema de enfriamiento refrigerado. Las muestras (de 3-5 mg) se calentaron en bandejas de aluminio rizado de 10 a 240ºC a una velocidad de calentamiento de 2ºC/min.

Los diagramas de XRD se obtuvieron con un difractómetro de rayos X para polvo Siemens D5000, equipado con una fuente de CuK\alpha (\lambda = 1,54056 \ring{A}) y un detector Kevex de estado sólido que funciona a 50 kV y 40 mA. Cada muestra se barrió a 4º y 35º en 2\theta. Se dejó que las muestras se equilibraran durante al menos 30 minutos a la temperatura y/o humdad relativa deseadas antes de la toma de datos.

Las medidas de higroscopicidad se hicieron para F-III usando el método VTI como sigue. Cada muestra se secó en vacío a 60ºC hasta que ya no se detectó pérdida de peso, momento en que la cámara de la muestra se puso a 0% de humedad relativa. Las isotermas de sorción de la humedad se obtuvieron a 25ºC usando una balanza VTI de humedad en vacío en las condiciones siguientes: tamaño de la muestra 10-15 mg, adsorción/desorción a una humedad relativa en el intervalo de 0-95%, intervalo de etapas 5%, intervalo de muestras 10 minutos.

Los ejemplos siguientes ilustran más los procedimientos para preparar el hidrato de la presente invención. Los ejemplos no tienen en ningún aspecto carácter limitativo del ámbito de estos procedimientos, y han de interpretarse consecuentemente.

Ejemplo 1 F-III a partir de clorhidrato de 6-isopropoxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]fenoxi)-2-(4-metoxifenil)benzo[b]-tiofeno

A una solución en cloruro de metileno (100 ml) de clorhidrato de 6-isopropoxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]fenoxi)-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofeno (10 g, 18 mmol) bajo atmósfera de nitrógeno a entre -10ºC y -20ºC se añadió BCl_{3} gas (4,23 g, 34 mmol) a una velocidad que mantenía la temperatura de la mezcla de reacción por debajo de -10ºC. Terminada la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 2 horas. A la mezcla de reacción se añadió lentamente alcohol isopropílico (IPA, 12,35 ml, 167 mmol) a menos de -10ºC y la agitación se continuó durante 30 minutos. Se cargó un matraz separado con 100 ml de agua y se enfrió con baño de hielo a aproximadamente 0ºC. La solución del producto se pasó a agua mediante una cánula, manteniendo una vigorosa agitación. La suspensión blanca resultante se agitó a 0ºC durante 1 hora. El producto es recuperó por filtración y se enjuagó con 25 ml de CH_{2}Cl_{2} al 40%/agua y luego con 25 ml de agua fría. El producto se puso en suspensión en 60 ml de IPA y 60 ml de agua y se calentó a 60ºC. Se obtuvo una solución a 48ºC. Se añadió más agua (120 ml). Se dejó que la solución se enfriara a 35ºC y la suspensión se enfrió luego lentamente a 0-5ºC y se agitó durante varias horas. El producto se aisló por filtración y se lavó con agua desionizada fría (25 ml). La torta húmeda de F-III se secó en vacío hasta peso constante durante 12-24 horas a 50ºC, obteniéndose F-III.

Ejemplo 2 F-III a partir de 6-benciloxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]fenoxi)-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofeno (S-óxido)

A una botella de Parr de 250 ml se añadió agua desionizada (5,25 ml), HCl 1M (7,74 ml, 7,75 mml), Pd al 10%/C tipo A32110, (1,37 g, 1,29 mmol de Pd), 6-benciloxi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]fenoxi)-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofeno(S-óxido) (3 g, 5,16 mmol) y alcohol isopropílico (32 ml) a temperatura ambiente. La botella se equipó con un sacudidor de Parr, secuencialmente se evacuó y se purgó dos veces con nitrógeno, posteriormente se evacuó y se llenó con hidrógeno gas a una presión de 2,07 bar. Se hizo que comenzara a funcionar el sacudidor y la mezcla de reacción se calentó a 60ºC. Se determinó por análisis de HPLC que la reacción había finalizado, después de aproximadamente 4 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de tierra de diatomeas y se lavó el lecho con HCl 0,1 M (2 x 10 ml). Se eliminó el disolvente en vacío a aproximadamente 50ºC. El residuo resultante se disolvió en una mezcla al 50% de alcohol isopropílico/agua desionixzada (30 ml) y se calentó suavemente en baño de vapor de agua hasta obtenerse una solución. A la solución se añadió agua desionizada (22 ml) y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La suspensión resultante se enfrió más, a 0ºC. El producto se aisló por filtración, se lavó con agua fría desionizada (2 x 15 ml) y se secó en vacío a 50ºC hasta peso constante, obteniéndose la F-III.

Ejemplo 3 F-III a partir de [6-isopropoxi-3-[4-[2-piperidin-1-il)etoxi)fenoxi]-2-(4-metoxifenil)]benzo[b]tiofeno-(S-óxido)

Se combinan cloruro de metileno (105 l) y [6-isopropoxi-3-[4-[2-piperidin-1-il)etoxi)fenoxi]-2-(4-metoxifenil)]
benzo[b]tiofeno-(S-óxido) (10,5 kg) y se enfría a entre -15ºC y -20ºC. Se añade tricloruro de boro (4,6 kg) mientras que se mantiene la temperatura de reacción entre -10ºC y -20ºC. Se continúa agitando hasta que el porcentaje de superficie por HPLC del material de partida es menor que 1%. (Sistema de HPLC: 4,6 mm ID x 25 cm de columna Zorbax SB-Phenyl 30ºC, metanol:ácido sulfúrico 0,01 N 70:30, caudal 1,5 ml/min, detector 300 nm). Se añade isopropanol (10,28 kg) mientras que la temperatura de reacción se mantiene entre -10ºC y -20ºC. Se agita la mezcla de reacción durante 30-45 minutos. El producto de reacción en bruto se aisla añadiendo la mezcla de reacción a 105 l de agua, previamente enfriada a 2-7ºC, mientras que la temperatura de reacción se mantiene a 2-7ºC. La adición es seguida por enjuagadura con cloruro de metileno (20 l) enfriado a 7-2ºC. La suspensión cristalina se agita durante 2 a 3 horas y se filtra, se lava sucesivamente con cloruro de metileno (26 kg) previamente enfriado a 7-2ºC y agua (53 l) enfriada previamente a 7-2ºC. La torta húmeda en bruto se combina con agua (42 l) e isopropanol (40 l) y se calienta a 65-70ºC para efectuar la disolución. Se filtra la solución caliente. Seguidamente a la filtración, se enjuaga con una mezcla de isopropanol (20 l) y agua (21 l) calentada a 65-70ºC y con agua (126 l) precalentada a 65-70ºC. La solución se enfría a 40-45ºC, se siembra y se agita a esta temperatura durante 2-3 horas para que los cristales puedan crecer. La suspensión se enfría a 0-5ºC, se agita durante 3-4 horas y se filtra. Se lava la torta de filtración con agua (122,6 l) enfriada a 2-7ºC. El producto se seca en vacío a una temperatura máxima de 50ºC hasta que el cambio de peso de la torta era inferior a 0,05 kg en un período de 2-4 horas. Rendimiento: 8,468 kg, 87,3%. Potencia de HPLC: 98,5%. Agua según Karl Fischer: 3,0%. Total de sustancias afines, según HPLC: 1,79%.

Ejemplo 4 F-III a partir de [6-benciloxi-3-[4-[2-piperidin-1-il)etoxi)fenoxi]-2-(4-metoxifenil)]benzo[b]tiofeno-(S-óxido)

Se combinaron tetrahidrofurano (261 ml), agua (45 ml), ácido sulfúrico concentrado (6,14 g) y [6-benciloxi-3-[4-[2-piperidin-1-il)etoxi)fenoxi]-2-(4-metoxifenil)]benzo[b]-tiofeno-(S-óxido) (potencia según HPLC 99%, nivel del total de sustancias afines según HPLC 0,35%) y se agitó hasta homogeneidad. Se añadió Pd al 10%/C (5,6 g en suspensión en 22 ml de agua), enjugando con 5 ml de agua. La suspensión resultante se evacuó y se cargó con hidrógeno gas a 4,14 bar. La temperatura de reacción se ajustó a 30ºC. Después de 2 horas, se añadió Pd al 10%/C (5,6 g) con agua (30 ml). Se continuó la hidrogenación a 4,14 bar y 30ºC durante 22 horas más. Se añadieron 4,4 g más de Pd al 10%/C en 30 ml de agua y se continuó la hidrogenación a 4,14 bar y 30ºC durante 2,5 horas más. El catalizador se eliminó por filtración y el pH del filtrado se ajustó a 7,24 con hidróxido sódico al 50%. Se añadió cloruro sódico (8,66 g) disuelto en agua (18 ml) y la solución bifásica se agitó durante 30 minutos. Se separaron las fases y la fase acuosa se sometió a retroextracción con 50 ml de tetrahidrofurano. Se combinaron las fases orgánicas y se concentraron por destilación atmosférica a un volumen de 50 ml. Al concentrado a 24ºC se añadió metanol, 180 ml a lo largo de un período de 1 hora. La suspensión cristalina resultante se agitó durante 30 minutos a 24ºC, se enfrió a 0ºC y se agitó durante 1 hora. Los sólidos se aislaron por filtración y se lavaron sucesivamente con 39 ml de agua y 39 ml de metanol, a lo que siguió secado en vacío a 50ºC durante la noche. Se obtuvieron 15,52 g, 67,8%.

Se combinaron isopropanol (33 ml), agua (66 ml) y 10 g del sólido aislado antes. A la mezcla en agitación a 25ºC se añadió HCl 1,8 M (21 ml). Los sólidos se disolvieron rápidamente y seguidamente se reprecipitó la sal clorhidrato. Después de agitar durante 30 minutos, se calentó la suspensión a 70ºC para disolver todos los sólidos. La solución se enfrió a 60ºC y se añadieron 33 ml de agua. La solución se enfrió a 25ºC a lo largo de un período de 3 horas; durante este tiempo precipitó la sal clorhidrato. La suspensión se agitó durante aproximadamente 3 horas a 25ºC, se filtró, se lavó con agua (30 ml) y se secó en vacío a 50ºC durante la noche, obteniéndose 8,9 g (82,7%) de F-III. Potencia según HPLC: 96,5%. Agua por análisis de Karl Fischer: 2,44%. Sustancias afines según HPLC: 1,09%.

Tal como se usa aquí, el término "cantidad efectiva" significa una cantidad de F-III que es capaz de inhibir dolencias, o sus efectos perjudiciales, descritas aquí. Cuando se administra F-III junto con estrógeno, progestina, un inhibidor de aromatasa, un análogo de LHRH o un inhibidor de AChE, el término "cantidad efectiva" significa también una cantidad de tal agente capaz de producir el efecto pretendido de él.

Los términos "que inhibe" e "inhibe" incluyen su significado generalmente aceptado, esto es, prevenir, prohibir, restringir, aliviar, mejorar, frenar, parar, o invertir la progresión o severidad de una dolencia patológica o una de sus secuelas.

Los términos "que previene", "prevención de", "profilaxis", "profiláctico" y "previene" se usan aquí de forma intercambiable y se refieren a reducir la probabilidad de que el receptor de F-III caiga en cualesquiera dolencias patológicas descritas aquí o las desarrolle.

Los términos "deficiente en estrógenos" y "deficiencia de estrógenos" se refieren a una dolencia, presente naturalmente o inducida clínicamente, en la que una mujer no puede producir suficientes hormonas endógenas estrogénicas para mantener funciones dependientes de estrógenos, por ejemplo, menstruo, homeoestasis de masa ósea, función neuronal, estado cardiovascular, etc. Tales situaciones de deficiencia de estrógenos derivan, aunque no únicamente, de menopausia y ovarioectomía quirúrgica o química, incluida su equivalente funcional, por ejemplo, medicación con un inhibidor de aromatasa, agonistas o antagonistas de GnRH, ICI 182780, etc. Los estados de enfermedad asociados con una deficiencia de estrógenos incluyen, aunque no únicamente, pérdida ósea, osteoporosis, enfermedad cardiovascular e hiperlipidemia.

Tal como se usa aquí, el término "estrógeno" incluye compuestos esteroides que tienen actividad estrogénica como, por ejemplo, 17\beta-estradiol, estrona, estrógeno conjugado (Premarin®), 17\beta-etinil estradiol de estrógeno equino, etc. Un compuesto preferido basado en estrógeno es Premarin®, y noretilnodrel.

Tal como se usa aquí, el término "progestina" incluye compuestos que tienen actividad progestacional, tales como, por ejemplo, progesterona, noretilnodrel, nongestrel, acetato de megestrol, noeretindrona, etc. La noretindrona es un agente preferido basado en progestina.

Tal como se usa aquí, el término "inhibidor de aromatasa" incluye compuestos capaces de inhibir la aromatasa, por ejemplo, inhibidores disponibles comercialmente tales como aminoglutemida (CYTANDREN®), Anastrazol (ARIMIDEX®), Letrazol (FEMARA®), Formestano (LENATRON®), Exemestano (AROMASIN®), etc.

Tal como se usa aquí, el término "análogo de LHRH" se refiere a un análogo de hormona que libera hormona lutenizante que inhibe la producción de estrógenos en una mujer premenopáusica, grupo en el que está incluida, por ejemplo, goserlina (ZOLADEX®, leuprolida (LUPRON®) y similares.

Tal como se usa aquí, el término "inhibidor de AChE" incluye compuestos que inhiben la acetilcolina-estearasa, por ejemplo, salicilato de fisostigmina, clorhidrato de tacrina, clorhidrato de donepezil y similares.

El término "regular por hiperproducción ChAT" se refiere a aumentar la actividad enzimática de ChAT, esto es, promover la conversión de colina en acetilcolina. Esta promoción incluiría un aumento de la eficiencia y/o la velocidad de reacción de ChAT y colina y/o un aumento de la cantidad de ChAT presente en el sitio de reacción. Este aumento de la cantidad de enzima presente puede ser debido a una regulación de genes u otra etapa de síntesis de la formación de enzima y/o una disminución de la desactivación y metabolismo de enzima.

Procedimiento general de preparación de ratas: Se obtienen de Charles River Laboratories (Portage, MI)ratas hembra Sprague Dawley de 75 días de edad (a no ser que se indique lo contrario), de un peso de 200-225 g. Los animales se ovarioectomizan (OVX) bilateralmente o se exponen al procedimiento quirúrgico Sham en Charles River Laboratories y luego se envían después de una semana. Al llegar, se mantienen en jaulas metálicas colgadas en grupos de 3 ó 4 por jaula y tienen acceso ad libitum a alimento (contenido aproximado de calcio 0,5%) y agua durante una semana. La temperatura ambiente se mantiene a 22,2ºC \pm 1,7ºC con una humedad mínima relativa de 40%. El fotoperíodo en la habitación era 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

Recogida de tejido en régimen de dosis: Después de una semana de aclimatación (por tanto, dos semanas después de la OVX) se inicia la dosificación diaria con F-III. Se da oralmente 17\alpha-etinilestradiol o F-III, a no ser que se indique lo contrario, como suspensión en 1% de carboximetilcelulosa o disuelto en 20% de ciclodextrina. Los animales reciben la dosis diariamente durante 4 días. Después del régimen de administración de la dosis, se pesan los animales y se anestesian con una mezcla de cetamina: xilazina (2:1, v/v) y se toma una muestra de sangre por punción cardíaca. Los animales se sacrifican luego por asfixia cono CO_{2}, se extrae el útero a través de una incisión en la línea media y se determina un peso uterino en húmedo. El 17\alpha-etinilestradiol se obtiene de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.

Se dejan coagular las muestras de sangre a temperatura ambiente durante 2 horas y se obtiene el suero después de centrifugación durante 2 horas a 3000 rpm. Se determina el colesterol sérico usando un ensayo de colesterol de alta prestación de Boehringer Mannheim Diagnostics. En resumen, el colesterol se oxida a colest-4-en-3-ona y peróxido de hidrógeno. Se hace reaccionar luego el peróxido de hidrógeno con fenol y 4-aminofenazona en presencia de peroxidasa para producir un colorante p-quinonaimina, que se lee espectrofotométricamente a 500 nm. La concentración de colesterol se calcula luego frente a una curva patrón. El ensayo entero se automatiza usando una Biomek Automated Workstation.

Ensayo de peroxidasa de eosinófilos uterinos

Los úteros mencionados se mantienen a 4ºC hasta que se realiza el análisis enzimático. Los úteros se homogeneizan luego en 50 volúmenes de tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contiene 0,005% de Triton X-100. Después de añadir 0,01% de peróxido de hidrógeno y O-fenilendiamina 10 mM (concentraciones finales) en tampón Tris, se controla el aumento de absorbancia durante 1 minuto a 450 nm. La presencia de eosinófilos en el útero es una indicación de actividad estrogénica de un compuesto. Se determina la velocidad máxima de un intervalo de 15 segundos sobre la porción inicial, lineal, de la curva de reacción.

Procedimiento del ensayo de inhibición de pérdida ósea

Siguiendo el procedimiento general de preparación descrito antes, las ratas se tratan diariamente durante 35 días (6 ratas por grupo de tratamiento) y se sacrifican con dióxido de carbono el día trigésimo sexto. El período de tiempo de 35 días es suficiente para que haya una reducción máxima de la densidad ósea, medida según se describe aquí. En el momento del sacrificio, se extraen los úteros, se diseccionan libres de tejido extraño y se expele el contenido de fluidos antes de determinar el peso húmedo para confirmar la deficiencia de estrógenos asociada con la ovarioectomía completa. El peso uterino se reduce rutinariamente en aproximadamente 75% en respuesta a la ovarioectomía. Los úteros se ponen luego en formalina neutra al 10% tamponada para ulterior análisis histológico.

Se extraen los fémures derechos y se generan rayos X digitalizados que se analizan por un programa de análisis de imagen (imagen NIH) en la metáfisis distal. También se hace un barrido por tomografía cuantitativa computorizada del aspecto proximal de las tibias de estos animales. De acuerdo con los procedimientos anteriores, a los animales de ensayo se administra oralmente F-III o etinilestradiol (EE_{2}) al 20% de hidroxipropil \beta-ciclodextrina. La F-III es también útil en combinación con estrógenos y progestinas.

Ensayo de proliferación de MCF-7

Células MCF-7 de adenocarcinoma de mama (ATCC HTB 22) se mantienen en MEM (medio esencial mínimo, exento de rojo de fenol, St. Louis, MO) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS) (v/v), L-glutamina (2 mM), piruvato sódico (1 mM), HEPES {(N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[ácido 2-etanosulfónico] 10 mM}, aminoácidos no esenciales e insulina bovina (1 ug/ml) (medio de mantenimiento). Diez días antes del ensayo, se cambian las células MCF-7 a un medio de mantenimiento suplementado con suero fetal bovino apurado con carbón vegetal revestido con dextrano, al 10% (medio de ensayo DCC-FBS) en vez de suplementado con FBS al 10% para vaciar depósitos internos de esteroides. Se eliminan células MCF-7 de matraces de mantenimiento usando un medio de disociación (Ca^{++}/Mg^{++} HBSS exento de rojo de fenol) suplementado con HEPES 10 mM y EDTA 2 mM]. Las células se lavan dos veces con medio de ensayo y se ajustan a 80.000 células/ml. Se añaden aproximadamente 100 ml (8.000 células) a pocillos de microcultivo de fondo redondo (Costar 3596) y se incuban a 37ºC, en una incubadora con CO_{2} al 5% humidificada, durante 48 horas para que las células se adhieran y equilibren después de la transferencia. Se preparan en medio de ensayo diluciones seriales de fármacos o DMSO como control de diluyente y se pasan 50 ml a microcultivos triplicados, añadiendo seguidamente 50 ml de medio de ensayo para un volumen final de 200 ml. Después de 48 horas a 37ºC en una incubadora con CO_{2} al 5% humidificada, se pulsan microcultivos con timidina tritiada (1 uCi/pocillo) durante 4 horas. Los cultivos se terminan por congelación a -70ºC durante 24 horas seguida de descongelación y cosecha de los microcultivos usando una cosechadora Skatron Semiautomatic Cell Harvester. Las muestras se someten a recuento por centelleo de líquidos usando un contador de \beta Wallac BetaPlace.

Inhibición de tumores mamarios inducidos por DMBA

Se producen tumores mamarios dependientes de estrógenos en Ratas Sprague-Dawley hembra que se compran de Harlan Industries, Indianopolis, Indiana. A aproximadamente 55 días de edad, las ratas reciben una administración oral única de 20 mg de 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA). Aproximadamente 6 semanas después de la administración de DMBA, se palpan las glándulas mamarias a intervales semanales buscando la aparición de tumores. Siempre que aparezcan un tumor o más, se miden con un calibre métrico los diámetros mayor y menor de cada tumor, se registran las medidas y el animal se selecciona para experimentación. Se ha hecho un intento para distribuir uniformemente los varios tamaños de tumores en los grupos tratados y de control de manera que los tumores de tamaño promediado estén distribuidos de forma equivalente entre los grupos de ensayo. Los grupos de control y los grupos de ensayo para cada experimento contenían de 5 a 9 animales.

Se administra F-III por inyección intraperitoneal en goma arábiga al 2%, u oralmente. Los compuestos administrados oralmente estaban disueltos o en suspensión en 0,2 ml de aceite de maíz. Cada tratamiento, incluidos los tratamientos de control con goma arábiga y aceite de maíz, se administra una vez al día a cada animal de ensayo. Después de la medida del tumor inicial y la selección de los animales de ensayo, se miden los tumores cada semana por el método mencionado. El tratamiento y las medidas de los animales continúan durante 3-5 semanas, a cuyo término se determinan las superficies finales de los tumores. Para cada compuesto y tratamiento de control, se determina el cambio de la superficie media del tumor.

Procedimientos de ensayo de fibrosis uterina

Ensayo 1

Se administra F-III a entre 3 y 20 mujeres que tienen fibrosis uterina. La cantidad de compuesto administrado es de 0,1 a 1000 mg/día y el período de administración es de 3 meses. Se observan en cada mujer los efectos sobre la fibrosis uterina durante el período de administración y hasta 3 meses después de interrumpir la administración.

Ensayo 2

Se usa el mismo procedimiento del Ensayo 1, excepto que el período de administración es de 6 meses.

Ensayo 3

Se usa el mismo procedimiento del Ensayo 1, excepto que el período de administración es de 1 año.

Ensayo 4

Se usa estimulación prolongada por estrógenos para inducir leiomiomata en cobayas hembra sexualmente maduras. A los animales se administra estradiol 3-5 veces por semana por inyección durante 2-4 meses o hasta que se manifiestan tumores. El tratamiento, que es de F-III o vehículo, se administra diariamente durante 3-16 semanas y luego se sacrifican los animales y se cosechan los úteros, que se analizan en cuanto la regresión de los tumores.

Ensayo 5

Se implanta tejido de leiomiomas humano en la cavidad peritoneal y/o miometrio uterino de ratones nude hembra, maduros, castrados. Se suministra estrógeno exógeno para inducir el crecimiento del tejido explantado. En algunos casos, las células tumorales cosechadas se cultivan in vitro antes de la implantación. El tratamiento con F-III o vehículo se suministra por lavado gástrico sobre base diaria durante 3-16 semanas y los implantes se extraen y miden para ver su crecimiento o regresión. En el momento del sacrificio, se cosechan los úteros para estimar el estado del órgano.

Ensayo 6

Se cosecha tejido de fibroide uterino humano y se mantiene in vitro como cultivos primarios no transformados. Se hicieron pasar muestras quirúrgicas a través de un tamiz o malla estéril o, alternativamente, se separan de tejido del entorno para producir una suspensión celular. Las células se mantienen en un medio que contiene 10% de suero y antibiótico. Se determinan las velocidades de crecimiento en presencia o ausencia de estrógeno. Las células se ensayan en cuanto a su capacidad para producir el componente C3 complementario y su respuesta a factores de crecimiento y hormona de crecimiento. Los cultivos in vivo se evalúan en cuanto a su respuesta proliferativa seguidamente al tratamiento con progestinas, GnRH, F-III y vehículo. Los niveles de receptores de hormonas esteroides se estiman semanalmente para determinar si se mantienen in vitro características importantes de células. Se utiliza tejido de 5-25 pacientes.

Ensayo 7

Se mide la capacidad de la F-III para inhibir la proliferación estimulada por estrógenos de líneas de células ELT derivadas de leiomioma, sustancialmente como se describe por Fuchs-Young y otros en Inhibition of Strogen-Stimulated Growth of Uterina Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators, Mol. Car., 17(3):151-159 (1996).

Procedimientos de ensayo de la endometriosis

Ensayo 1

Como animales de ensayo se usan de 12 a 30 ratas hembra adultas de la cepa CD. Se dividen en 3 grupos de igual número de animales. Se controla el ciclo del estro de todos los animales. El día anterior al estro, se realiza cirugía en cada animal. A las hembras de cada grupo se extirpa la trompa uterina izquierda, se corta en cuadrados pequeños y los cuadrados se suturan holgadamente en varios sitios adyacentes a la corriente sanguínea mesentérica. Además, a las hembras del Grupo 2 se extirpan los ovarios. Al día siguiente de la cirugía, los animales de los Grupos 1 y 2 reciben inyecciones intraperitoneales de agua durante 14 días, mientras que los animales del Grupo 3 reciben inyecciones intraperitoneales de 1,0 mg de F-III por kilogramo de peso corporal durante el mismo período de tiempo. Al cabo de 14 días de tratamiento, se sacrifica cada hembra y se extraen y preparan para examen histológico los explantes endometriales, los adrenales, el útero remanente y los ovarios, cuando sea posible. Se pesan los ovarios y adrenales.

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Ensayo 2

Como animales de ensayo se usan de 12 a 30 ratas hembra adultas de la cepa CD. Se dividen en 2 grupos de igual número de animales. Se controla el ciclo del estro de todos los animales. El día anterior al estro, se realiza cirugía en cada animal. A las hembras de cada grupo se extirpa la trompa uterina izquierda, se corta en cuadrados pequeños y los cuadrados se suturan holgadamente en varios sitios adyacentes a la corriente sanguínea mesentérica. Aproximadamente 50 días después de la cirugía, los animales asignados al Grupo 1 reciben inyecciones intraperitoneales de agua durante 21 días, mientras que los animales del Grupo 2 reciben inyecciones intraperitoneales de 1,0 mg de F-III por kilogramo de peso corporal durante el mismo período de tiempo. Al cabo de 21 días de tratamiento, se sacrifica cada hembra y se extraen y pesan los explantes endometriales y los adrenales. Se miden los explantes como indicación del crecimiento. Se controlan los ciclos del estro.

Ensayo 3

Se usan autógrafos de tejido endometrial para inducir endometriosis en ratas y/o conejos. Se efectúa ooforectomía bilateral en animales hembra reproductivamente maduras y se les suministra estrógeno exógenamente, proporcionando así un nivel específico y constante de hormona. Se implanta tejido endometrial autólogo en el peritoneo a 5-150 animales y se les suministra estrógeno para inducir el crecimiento del tejido explantado. El tratamiento consiste en el suministro de un compuesto de la presente invención por lavado gástrico diario durante 3-16 semanas, y los implantes se eliminan y miden en cuanto a su crecimiento o regresión. En el momento del sacrificio, se cosecha la trompa intacta del útero para estimar el estado del endometrio.

Ensayo 4

Se implanta tejido de lesiones endometriales humanas en el peritoneo de ratones nude hembra sexualmente maduros, castrados. Se suministra estrógeno exógeno para inducir el crecimiento del tejido explantado. En algunos casos, las células endometriales cosechadas se cultivan in vitro antes de la implantación. El tratamiento consiste en F-III suministrado por lavado gástrico diariamente durante 3-16 semanas, y los implantes se extraen y miden en cuanto al crecimiento o regresión. En el momento del sacrificio, se cosechan los úteros para estimar el estado del endometrio intacto.

Ensayo 5

Se cosecha y mantiene in vitro tejido de lesiones endometriales humanas y se mantiene como cultivos primarios no transformados. Se hacen pasar muestrasquirúrgicas, empujando, a través de una malla o tamiz estéril o, alternativamente, se separan de tejido del entorno para producir una suspensión celular. Las células se mantienen en un medio que contiene 10% de suero y antibióticos. Se determinan velocidades de crecimiento en presencia o ausencia de estrógeno. Las células se ensayan en cuanto a su capacidad para producir el componente C3 complementario y su respuesta a factores de crecimiento y hormona de crecimiento. Los cultivos in vivo se evalúan en cuanto a su respuesta proliferativa seguidamente al tratamiento con progestinas, GnRH, F-III y vehículo. Los niveles de receptores de hormonas esteroides se estiman semanalmente para determinar si se mantienen in vitro características importantes de las células. Se utiliza tejido de 5-25 pacientes.

Los estrógenos, tales como 17\beta-estradiol, regulan la transcripción de genes por unirse a receptores de estrógenos (ER) que residen en el citoplasma de ciertas poblaciones de células. La activación del ligando de ER es un requisito previo para el transporte nuclear del complejo en el que la unión a una secuencia de consenso de DNA palindrómica de 13 pares-base (elemento de respuesta de estrógeno, o ERE) comienza el montaje de un aparato transcripcional que culmina en la activación de genes diana apropiados. Se han identificado una variedad de genes que son regulados por estrógenos. Entre estos están incluidas proteínas citoesqueléticas, enzimas biosintéticas neurotransmisoras y enzimáticas, y receptores, así como otras hormonas y neuropéptidos. Los EREs se han identificado en muchos genes que responden a estrógenos, incluidos vitelogenina, c-fos, prolactina y hormona luteinizante.

Se han identificado secuencias del tipo ERE, significativas en el sistema nervioso central, en p75^{ngr} y trkA, actuando ambas como moléculas que señalan neurotrofinas: factor de crecimiento de nervios (NGF), factor de crecimiento de nervios derivados del cerebro (BDNGF) y neurotrofina-3.

El BDNF así como el NGF han revelado que promueven la supervivencia de neuronas colinérgicas en cultivo. Se postula que, si las interacciones entre neurotrofinas y estrógenos son importantes para el desarrollo y supervivencia de neuronas basales del cerebro anterior (que se degeneran en la enfermedad de Alzheimer), las condiciones clínicas en las que hay una deficiencia de estrógeno (como es el caso después de la menopausia) pueden contribuir a la pérdida de estas neuronas.

El siguiente experimento se realiza en ratas ovaioectomizadas (preparadas como se ha descrito antes) para determinar las similaridades y/o diferencias entre F-III y estrógenos en la expresión de genes que afecta en varias regiones del cerebro. Se administra diariamente a ratas de 6 semanas de edad benzoato de estradiol (0,03 mg/kg), F-III o vehículo (control) por inyección subcutánea. Después de 5 semanas de tratamiento, se sacrifican los animales, se eliminan sus cerebros y se recogen los hipocampos por microdisección. Se congelan rápidamente los hipocampos en nitrógeno líquido y se almacenan a -70ºC. Se prepara RNA total del tejido recogido del tratamiento apropiado y grupos de control y transcritos inversamente usando un cebador 3'-oligonucleótido que se selecciona para poblaciones específicas de mRNA (poli-A+). Se realizan reacciones de polimerasa en cadena (PCR) en una combinación que consta de: oligonucleótidos 5' al azar, (de una longitud de 10 pares de base; total de 150), tampón de reacción, Taq-polimerasa y un ^{32}PdTCP.

Después de 40 tandas de amplificación, se fraccionan por tamaños los productos de reacción en 6% de TBE-gel de urea, se secan y se exponen a una película de rayos X. Las configuraciones resultantes que muestran mRNA se comparan entre grupos de tratamiento.

Las mujeres perimenopáusicas y postmenopáusicas frecuentemente se someten a una terapia sustitutiva de hormonas (HRT) para combatir consecuencias negativas asociadas con la caída de estrógenos endógenos circulantes, por ejemplo, para tratar destellos calientes. Sin embargo, la HRT ha sido asociada con riesgos incrementados de ciertos cánceres, incluidos cáncer uterino y de mama. Para inhibir estos riesgos se puede utilizar F-III junto con HRT.

Por definición, los ovarios de una mujer postmenopáusica no funcionan. Su única fuente de estrógenos es la conversión de andrógenos adrenales en estrógenos por la enzima-aromatasa, que se encuentra en tejidos periféricos (incluida grasa, músculo y el propio tumor de mama). Así, los fármacos que inhiben la aromatasa (inhibidores de aromatasa) reducen los estrógenos circulantes en mujeres postmenopáusicas. La disminución de estrógenos mediante inhibición de aromatasa es una importante opción de tratamiento para pacientes con cáncer de mama metastático. Durante la terapia con un inhibidor de aromatasa, la falta de estrógenos circulantes puede causar involuntarios efectos secundarios, por ejemplo sobre los niveles de lípidos en suero. Para inhibir estos efectos negativos se puede emplear F-III.

La exposición continua a un análogo de LHRH (hormona que libera hormona luteinizante) inhibe la producción de estrógenos en mujeres postmenopáusicas por desensibilizar la glándula pituitaria, que luego ya no estimula los ovarios para producir estrógenos. El efecto médico es una "oofrectomía médica" que es reversible al cesar el análogo de LHRH. Durante la terapia con un análogo de LHRH, la falta de estrógenos circulantes puede causar involutarios efectos secundarios, por ejemplo sobre lo niveles de lípidos en suero. Para inhibir estos efectos negativos se puede emplear F-III.

Es conocido que los pacientes aquejados por la enfermedad de Alzheimer tienen un nivel marcadamente más bajo de neuronas colinérgicas en el hipocampo que sus semejantes no afectados por la enfermedad de Alzheimer. La pérdida progresiva de estas neuronas colinérgicas parece reflejar la pérdida de memoria y función cognoscitiva en estos pacientes. Se cree que una razón de la decadencia de estas neuronas es la pérdida, o aminoramiento de la función, del neurotransmisor acetilcolina.

El nivel de acetilcolina en una neurona básicamente está determinado por dónde está el equilibrio entre su biosíntesis y su biodegradación. La acetiltransferasa de colina enzimática (ChAT) es principalmente responsable de su síntesis y la acetilcolinaestearasa (AChE) de su degradación.

Con el fin de determinar el efecto de la F-III sobre los niveles de ChAT, se realiza el experimento siguiente: Siguiendo el procedimiento general de preparación de ratas descrito antes, se administra diariamente a 40 ratas, por inyección subcutánea u oralmente, F-III a razón de 3 mg/kg/día en un vehículo que contiene 10% de ciclodextrina, benzoato de estradiol a razón de 0,03 ó 0,3 mg/kg/día, o vehículo control. Los animales se tratan durante 3 ó 10 días. Hay 20 animales para cada régimen de dosificación. Los animales se sacrifican a intervalos de tiempo apropiados y se diseccionan sus cerebros. Las porciones particulares de los cerebros se homogeneizan y ensayan. Se tratan los homogeneizados del hipocampo y el cortex frontal y la determinación de la actividad de ChAT se hace por un ensayo con radiomarcador de la biosíntesis de acetilcolina. Este procedimiento se puede encontrar en Schoepp y otros, J. Neural Transmiss., 78:183-193, 1989.

Como era de esperar, en los animales OVX los niveles de ChAT se reducen en más de 50% (p<0,001) en comparación con los controles.

En otra realización de la presente invención, se usa F-III en combinación con un inhibidor de AChE. El uso de un inhibidor de AChE aumenta los niveles de acetilcolina por bloquear su degradación mediante la inhibición de AChE.

Hiperplasia benigna de próstata (BPH)

Para antecedentes sobre la relación entre la acción de estrógenos y el tratamiento de BHP y el carcinoma de próstata, véase la solicitud de PCT nº. WO 98/07274, fecha de la publicación internacional, 15 de octubre de 1998.

En los experimentos que se describen seguidamente, se evalúa la capacidad de la F-III de fijarse a receptores de estrógenos en varias líneas de células de cáncer prostático humano.

Se preparan lisados de las líneas de células de cáncer prostático humano LNCaP, DU-45 y PC-3, en un medio de TEG que comprende Tris\cdotHCl 50 nM pH 7,4, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) 1,5 mM, KCl 0,4 M, 10% de glicerol, 2-ME 0,5 mM y molibdato sódico 10 mM, que además contiene los inhibidores de proteasa pepstatina (1 mg/ml), leupeptina (2 mg/ml), aprotinina (5 mg/ml) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, 0,1 mM) (TEGP).

Se centrifugan los lisados de células y se vuelven a poner en suspensión los pélets en TEGP frío (1 ml de TEGP/100 mg de pélets) y se sonica durante 30 segundos (ciclo de acción 70%, rendimiento 1,8) en un sonicador Branson modelo 450. Los lisados se peletizan por centrifugación a 10.000 x G durante 15 minutos a 4ºC, después de lo cual se separan los sobrenadentes y se usan inmediatamente o se almacenan a -70ºC.

Ensayo de unión competitiva: El tampón de unión es TEG en el que KCl 0,4 M está reemplazado por NaCl 50 mM y al que además se ha añadido 1 mg/ml de ovalbúmina (TEGO). La F-III se diluye a 20 nM en TEGO, y a partir de esta solución se preparan diluciones seriales de 3 x. Los ensayos se realizan en microplacas de polipropileno de fondo redondo en pocillos triplicados. Cada pocillo recibe 35 ml de 17\beta-estradiol tritiado (0,5 nM, actividad específica 60,1 Ci/mmol, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA) y 35 ml de compuesto del ensayo competitivo en frío (0,1 nM - 5 mM) o TEGO, incubando seguidamente durante 5 minutos a 4ºC con sacudidas, 70 ml de lisado de la línea de células MCF-7.

Las placas se incuban durante 24 horas a 4ºC y, después de este tiempo, se añaden a cada pocillo 70 ml de carbón vegetal revestido con dextrano (DCC), sacudiendo seguidamente, vigorosamente, durante 8 minutos a 4ºC. Las placas se centrifugan luego a 1500 x G durante 10 minutos a 4ºC. Se recoge el sobrenadante de cada pocillo en una microplaca flexible de poliestireno para recuento por centelleo en un contador Wallac Micobeta modelo 1450. La radiactividad se expresa como desintegraciones por minuto (DPM) después de corrección por eficiencia de recuento (35-40%) y fondo. Los controles adicionales son recuentos totales y recuentos totales + DCC para definir el límite inferior de recuentos extraíbles por DCC. Los resultados de estos ensayos de unión competitiva se expresan como unión porcentual media (% unido) \pm desviación estándar usando la fórmula:

% \ unido=\frac{DPM_{compuesto \ ensayo} - DPM_{recuento \ total + DCC}}{DPM_{sin \ compuesto \ ensayo} - DPM_{recuento \ total + DCC}} x 100

Esta invención también se refiere a la administración de F-III a un receptor que tiene riesgo de desarrollar de novo cáncer de mama. El término "de novo", tal como se usa aquí, significa la falta de transformación o metamorfosis de células normales de mama en células cancerosas o malignas en el primer caso. Tal transformación puede acaecer en etapas en las mismas células o en células hija mediante un proceso evolutivo, o puede acaecer en un único evento central. Este proceso de novo es, a diferencia de la metástasis, una colonización o extensión de células ya transformadas o malignas desde el sitio del tumor primario a nuevas localizaciones.

Una persona que no tiene riesgo particular de desarrollar cáncer de mama es una persona que puede desarrollar de novo cáncer de mama, no tiene evidencia o sospecha del potencial de la enfermedad por encima de un riesgo normal y a la que nunca se ha diagnosticado la enfermedad. El factor de riesgo que más contribuye al desarrollo de un carcinoma de mama es una historia personal de que sufre la enfermedad, o una manifestación anterior de la enfermedad, incluso si está remitiendo sin evidencia de su presencia. Otro factor de riesgo es la historia familiar de la enfermedad.

La inducción de tumores mamarios en ratas por administración del carcinogeno N-nitroso-N-metilurea es un modelo animal bien aceptado para el estudio de cáncer de mama y se ha encontrado que se adecuada para analizar el efecto de agentes quimiopreventivos.

En dos estudios separados, se administra a ratas hembra Sprague-Dawley, de 55 días de edad, una dosis intravenosa (Estudio 1) o intraperitoneal (Estudio 2) de 50 mg de N-nitroso-N-metilurea por kilogramo de peso corporal una semana antes de suministrar ad libitum una dieta en la que se mezclan cantidades variables de F-III, base (Z)-2-[4-(1,2-difenil-1-butenil)fenoxi]-N,N-dimetiletanamina (tamoxifen, base) o control.

En el Estudio 1, las dosis dietéticas de 60 mg/kg de dieta y 20 mg/kg de dieta se trasladan a dosis aproximadamente comparables de 3 y 1 mg/kg de peso corporal para los animales de ensayo.

En el Estudio 2, las dosis dietéticas de 20, 6, 2 y 0,6 mg/kg de dieta se trasladan aproximadamente a dosis comparables de 1, 0,3, 0,1 y 0,03 mg/kg de peso corporal para los animales de ensayo.

Se observan las ratas en cuanto a evidencia de toxicidad y se pesan y palpan una vez a la semana en búsqueda de formación de tumores. Los animales se sacrifican después de trece semanas (Estudio 1) o 18 semanas (Estudio 2) y se confirman los tumores y se pesan al hacer la autopsia.

El término "farmacéutico", cuando se usa aquí como adjetivo, significa sustancialmente que no es perjudicial para el mamífero receptor. Por "formulación farmacéutica" se entiende que el vehículo, diluyente, los excipientes y el (los) ingrediente(s) activo(s) deben ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no deben ser perjudiciales para el receptor de ellos.

La F-III preferiblemente se formula antes de la administración. La selección de la formulación debe ser decidida por el médico que atiende al paciente teniendo en cuenta los mismos factores implicados cuando se determina la cantidad efectiva.

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La totalidad de ingredientes activos en tales formulaciones comprende de 0,1% a 99,9% en peso de la formulación. Preferiblemente, la mencionada formulación no contiene más de dos ingredientes activos. Esto es, se prefiere formular la F-III con un segundo ingrediente activo seleccionado entre estrógenos, progestinas, inhibidor de aromatasa, análogos de LHRH e inhibidor de AChE. Las formulaciones más preferidas son aquéllas en las que F-III es el único ingrediente activo.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se preparan por procedimientos conocidos en la técnica usando ingredientes bien conocidos y fácilmente asequibles. Por ejemplo, la F-III, sola o en combinación con un estrógeno, progestina, inhibidor de aromatasa, análogo de LHRH, o un compuesto inhibidor de AChE, se formula con excipientes, diluyentes o vehículos comunes, y se conforman como comprimidos, cápsulas, suspensiones, soluciones, inyectables, aerosoles, polvos y similares.

Las formulaciones farmacéuticas de esta invención para administración parenteral comprenden soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones estériles acuosas o no acuosas, así como polvos estériles que se reconstituyen inmediatamente antes del uso en soluciones o suspensiones estériles. Entre los ejemplos de vehículos, diluyentes, disolventes o excipientes estériles adecuados, acuosos o no acuosos, están incluidos agua, solución fisiológica salina, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, poli(etilenglicol) y similares, y mezclas de ellos; aceites vegetales (tales como aceite de oliva), y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se mantiene una fluidez apropiada, por ejemplo, usando materiales de revestimiento tales como lecitina, manteniendo un tamaño de partícula apropiada en el caso de dispersiones y suspensiones y usando tensioactivos.

Las composiciones parenterales también pueden contener coadyuvantes tales como conservantes, humectantes, emulsivos y agentes dispersivos. La prevención de la acción de microorganismos se asegura con la inclusión de agentes antibacterianos y antihongos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico, etc. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro sódico y similares. La absorción prolongada de formulaciones inyectables puede lograrse incluyendo agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto del fármaco, es deseable hacer más lenta la absorción del fármaco después de una inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede realizarse usando una suspensión líquida de material cristalino de baja solubilidad en agua o disolviendo o poniendo en suspensión el fármaco en un vehículo oleoso. En el caso de una inyección subcutánea o intramuscular de una suspensión que contiene una forma del fármaco con baja solubilidad en agua, la velocidad de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución.

Las formulaciones inyectables "depósito" de F-III se hacen formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos), materiales que están descritos en la técnica. Dependiendo de la relación de fármaco a polímero y las características del polímero particular empleado, se puede controlar la liberación del fármaco.

Las formulaciones inyectables se esterilizan, por ejemplo, por filtración a través de filtros que retienen bacterias, o por preesterilización de los componentes de la mezcla antes de mezclarlos, en el momento de manufactura o justo antes de la administración (como, por ejemplo, como de un envase de jeringa de cámara dual).

Las formas sólidas de dosificación para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosis sólidas, la F-III se mezcla con al menos un vehículo farmacéutico inerte tal como citrato sódico o fosfato dicálcico, y/o (a) cargas o extensores tales como almidones, azúcares, incluidas lactosa y glucosa, manitol y ácido silícico, (b) agentes aglutinantes tales como carboximetilcelulosa y otros derivados celulósicos, alginatos, gelatina, poli(vinilpirrolidina), sacarosa y goma arábiga, (c) humectantes tales como glicerol, (d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato cálcico, bicarbonato sódico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, silicatos y carbonato sódico, (e) agentes hidratantes tales como glicerol, (f) agentes retardadores de disolución tales como parafina, (g) agentes aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, (h) agentes de mojado tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerina, (i) absorbentes tales como caolín y bentonita, y (j) lubricantes tales como talco, estearato cálcico, estearato magnésico, poli(etilenglicoles) sólidos, laurilsulfato sódico y mezclas de ellos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación puede contener también agentes tampón.

Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden comprender el contenido en cápsulas de gelatina blanda o dura usando excipientes tales como lactosa así como polietilenglicoles de alto peso molecular y compuestos similares.

También pueden prepararse formas sólidas de dosificación tales como comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos con revestimientos o envolturas tales como revestimientos entéricos u otros revestimientos bien conocidos en farmacia galénica. Los revestimientos pueden contener agentes opacificantes o agentes que liberan el(los)

\hbox{ingrediente(s)}

activo(s) en una parte particular del tracto digestivo como, por ejemplo, revestimientos solubles en ácido para liberar el (los) ingrediente(s) activo(s) en el estómago, o revestimientos solubles en bases para liberar el (los) ingrediente(s) activo(s) en el tracto intestinal.

\newpage

El (los) ingrediente(s) activo(s) también pueden estar microencapsulado(s) en un revestimiento de liberación sostenida, formando las microcápsulas parte de una píldora de formulación de cápsula.

Las formas líquidas para administración oral de F-III incluyen soluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes y elixires. Además de los componentes activos, las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como agua u otros disolventes farmacéuticos, agentes solubilizantes y emulsivos tales como etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetil-formamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, nuez molida, maíz, gérmenes, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles, ésteres de ácidos grasos de sorbitol y mezclas de ellos.

Además de diluyentes inertes, las formulaciones líquidas orales pueden incluir también coadyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsivos y suspensivos y agentes edulcorantes, saboreadores y perfumantes.

La suspensión líquida, además del (los) ingrediente(s) activo(s) puede contener agentes suspensivos tales como alcoholes de isoestearilo etoxilados, ésteres de polioxietilensorbitol y sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, arcilla bentonítica, agar-agar y tragacanto, y mezclas de ellos.

Las composiciones para administración rectal o intravaginal se preparan mezclando F-III con excipientes no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o cualquier cera para supositorios que es sólida a temperatura ambiente pero que es líquida a la temperatura del cuerpo y que, por tanto, funde en el recto o la cavidad vaginal para liberar el componente activo. Los compuestos se disuelven en la cera fundida, que tiene la forma deseada, y se deja que endurezcan en la formulación de supositorio acabada.

La F-III también puede administrarse en forma de liposomas. Como se sabe en la técnica, generalmente los liposomas derivan de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas. Las formulaciones de liposomas están formadas por cristales hidratados monolaminares o multilaminares que están dispersos en un medio acuoso. Se puede usar cualquier lípido no tóxico, farmacéutico y metabolizable capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposoma pueden contener, además de F-III, estabilizadores, excipientes, conservantes y materiales similares. Los lípidos preferidos son fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), ambas naturales y sintéticas.

Los métodos para formar liposomas son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Methods in Cell Biology, Prescott Ed., vol. XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), pág. 33 y sigts.

Los siguientes ejemplos de formulaciones son sólo ilustrativos y no limitan el ámbito de al presente invención.

Formulación 1

Cápsulas de gelatina

Se preparan cápsulas de gelatina dura usando los siguientes ingredientes:

Ingrediente	\hskip-1cm Cantidad, mg/cápsula
F-III	0,1-1000
Almidón, NF	0-650
Polvo deslizable de almidón	0-650
Fluido de silicona, de 350 cst	0-15

La formulación anterior se puede modificar efectuando variaciones razonables de los datos proporcionados

Formulación 2

Comprimidos

Se prepara una formulación de comprimidos usando los ingredientes siguientes

Ingrediente	\hskip-1.5cm Cantidad, mg/comprimido
F-III	2,5-1000
Celulosa microcristalina	200-650
Dióxido de silicio, ahumado	10-650
Ácido esteárico	5-15

Se mezclan los componentes y se comprimen para formar comprimidos.

Formulación 3

Se preparan como sigue comprimidos que contienen aproximadamente 10 y 50 mg, respectivamente, de F-III:

Ingrediente	\hskip-1cm Cantidad mg/compr.	\hskip-1cm Cantidad mg/compr.
F-III	11,3	56,5
Lactosa anhidra	176,8	128,2
Lactosa secada por proyección	44,2	32,0
Povidona	11,0	13,0
Polisorbato 80	2,5	2,6
Crosspovidona (Interior)	6,25	6,24
Crosspovidona (Exterior)	6,25	6,5
Estearato magnésico	1,5	1,7
Celulosa microcristalina (Exterior)	0,00	13,0

Los componentes se mezclan y comprimen para formar comprimidos

Formulación 4

Comprimidos

Alternativamente, se hacen como sigue comprimidos, cada uno con un contenido de 2,5-100 mg de F-III.

Ingrediente	\hskip-1.5cm Cantidad, mg/comprimido
F-III	25-1000
Almidón	45
Celulosa microcristalina	35
Polivinilpirrolidona como solución acuosa al 10%	4
Carboximetilcelulosa sódica	4,5
Esterarato magnésico	0,5
Talco	1

Se hacen pasar F-III, almidón y celulosa a través de un tamiz de 355 \mum (malla U.S. nº.45) y se mezclan íntimamente. La solución de polivinilpirrolidona se mezcla con los polvos resultantes que luego se hacen pasar a través de un tamiz de 1400 \mum (malla U.S. nº. 14). Los gránulos así producidos se calientan a 50-60ºC y se hacen pasar por un tamiz de 1000 \mum (malla U.S. nº. 18). Se añaden luego a los gránulos el almidón carboximetilsódico, estearato magnésico y talco, que previamente se han hecho pasar a través de un tamiz de 250 \mum (malla U.S. nº. 60) y, después de mezclar, se comprimen los gránulos en una máquina de compresión para producir comprimidos.

Formulación 5

Suspensiones

Se preparan suspensiones como sigue, cada una con un contenido de 0,1-100 mg de médicamente por dosis de
5 ml.

Ingrediente	\hskip-1cm Cantidad, mg/5 ml
F-III	0,1-1000
Carboximetilcelulosa sódica	50
Jarabe	1,25
Solución de ácido benzoico	0,10 ml
Agente saboreador	s.a.
Colorante	s.a.
Agua purificada hasta	5 ml

Se hace pasar el medicamento a través de un tamiz de 355 \mum (malla U.S. nº. 45) y se mezcla con la carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta uniforme. Se diluyen con algo de agua la solución de ácido benzoico, el agente saboreador y el colorante y se añaden mientras que se agita. Se añade luego agua suficiente para producir el volumen requerido.

Formulación 6

Aerosol

Se prepara una solución de aerosol que contiene los ingredientes siguientes

Ingrediente	\hskip-1.5cm Cantidad, % en peso
F-III	0,25
Etanol	25,75
Propulsor 22 (Clorodifluorometano)	70,00

Se mezcla el F-III con etanol y la mezcla se añade a una porción del propulsor 22, enfriado a 30ºC, y se pasa a un dispositivo de llenado. Se suministra luego la cantidad requerida a un recipiente de acero inoxidable y se diluye con el resto del propulsor. Se ajustan luego las unidades de válvula al recipiente.

Formulación 7

Supositorios

Se preparan supositorios como sigue.

Ingrediente	\hskip-1.5cm Cantidad, mg/suposit.
F-III	250
Glicéridos de ácido graso saturado	2.000

Se hace pasar F-III a través de un tamiz de 250 \mum (malla U.S. nº. 60) y se pone en suspensión en los glicéridos de ácido graso previamente fundidos usando el mínimo calor necesario. La mezcla se vierte luego en un molde para supositorios de una capacidad nominal de 2 g y se deja que se enfríe.

Formulación 8

Solución intravenosa

Se prepara como sigue una suspensión intravenosa

Ingrediente	\hskip-0.5cm Cantidad
F-III	25 mg
Solución isotónica salina	1.000 ml

La solución de los ingredientes anteriores se administra intravenosamente a un paciente a la velocidad de aproximadamente 1 ml por minuto.

Formulación 9

Cápsula de combinación I

Ingrediente	\hskip-1.5cm Cantidad, mg/cápsula
F-III	50
Premarina	1
Avicel pH 101	50
Almidón 1500	117,50
Aceite de silicona	2
Tween 80	0,50
Cab-O-Sil	0,25

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Formulación 10

Cápsula de combinación II

Ingrediente	\hskip-1.5cm Cantidad, mg/cápsula
F-III	50
Noretilnodrel	5
Avicel pH 101	82,50
Almidón 1500	90
Aceite de silicona	2
Tween 80	0,50

Formulación 11

Comprimido de combinación

Ingrediente	\hskip-1.5cm Cantidad, mg/cápsula
F-III	50
Premarina	1
Almidón de maíz NF	50
Povidona, K29-32	6
Avicel pH 101	41,50
Avicel pH 102	136,50
Crospovidona XL10	2,50
Estearato magnésico	0,50
Cab-O-Sil	0,50

La dosis específica de F-III administrada de acuerdo con esta invención la determinan las circunstancias particulares que rodean cada situación. Entre estas circunstancias están incluidas la vía de administración, la historia médica previa del paciente, la dolencia o el síntoma patológico que se está tratando, la severidad de la dolencia/el síntoma que se está tratando y la edad y sexo del paciente.

Por lo general, la dosis mínima efectiva diaria de F-III es de aproximadamente 1, 5, 10, 15 o 20 mg. Típicamente, una dosis máxima efectiva es de aproximadamente 800, 100, 60, 50 o 40 mg. Muy típicamente, la dosis varía entre 15 mg y 60 mg. La dosis exacta puede ser determinada, de acuerdo con la práctica estándar en medicina de "evaluación de la dosis" para el receptor; esto es, administrando inicialmente una dosis baja del compuesto y aumentando gradualmente la dosis hasta que se observa el efecto terapéutico deseado.

Aunque puede ser necesario evaluar la dosis para el receptor respecto a las terapias combinadas discutidas antes, las dosis típicas de ingredientes activos que no son F-III son las siguientes: etinilestrógeno (0,01-0,03 mg/día), mestranol (0,05-0,15 mg/día), hormonas estrogénicas combinadas (por ejemplo, Premarin®, Wyeth-Ayerst; 0,3-2,5 mg/día), medroxiprogesterona (2,5-10 mg/día), noertilnodrel (1,0-10,0 mg/día), nonetindrona (0,5-2,0 mg/día), aminoglutemida (250-1250 mg/día, preferiblemente 250 mg cuatro veces al día), anastrazol (1-5 mg/día, preferiblemente 1 mg una vez al día), letrozol (2,5-10 mg/día, preferiblemente 2,5 mg una vez al día), formestano (250-1250 mg por semana, preferiblemente 250 mg dos veces por semana), exemestano (25-100 mg/día, preferiblemente 25 mg una vez al día), goserlin (3-15 mg/tres meses, preferiblemente 3,6-7,2 mg una vez cada tres meses) y leuprolida (3-15 mg/mes, preferiblemente 3,75-7,5 mg una vez al mes).

La F-III se puede administrar por una variedad de vías, incluidas las vías oral, rectal, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intranasal. El método de administración de cada agente basado en estrógenos y progestinas es conforme con el que es conocido en la técnica. La F-III, sola o en combinación con estrógenos, progestinas, o un inhibidor de AChE, por lo general se administrará en una formulación conveniente.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar a personas y otros mamíferos (por ejemplo, perros, gatos, caballos, cerdos, etc.) por vía oral, rectal, intravaginal, parenteral, tópica, bucal o sublingual, o nasal. El término "administración parenteral" se refiere aquí a los modos de administración que incluyen la inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutánea o intraarticular

Para la mayoría de los métodos de la presente invención, la F-III se administra continuamente, de 1 a 3 veces al día o tal frecuentemente como sea necesario para suministrar al receptor una cantidad suficiente de F-III. La terapia cíclica puede ser especialmente útil en el tratamiento de la endometriosis o puede usarse agudamente durante ataques dolorosos de la enfermedad. En el caso de la restenosis, la terapia puede estar limitada a intervalos cortos (1-6 meses) seguidamente a procedimientos médicos tales como angioplastia.

Claims (5)

1. Hidrato de clorhidrato de 6-hidroxi-3-(4-[2-piperidin-1-il)etoxi]fenoxi)-2-(4-metoxifenil)benzo[b]-tiofeno cristalino (F-III) que tiene un diagrama de difracción de rayos X que comprende los siguientes picos: 4,6 \pm 0,2, 7,8 \pm 0,2, 9,3 \pm 0,2, 14,0 \pm 0,2, 17,6 \pm 0,2, 20,8 0,2 y 24,3 \pm 0,2º en 2\theta, cuando se obtienen a 25ºC \pm 2ºC y una humedad relativa de 35 \pm 10% con una fuente de radiación de cobre CuK\alpha, \lambda = 1,54056 \ring{A}).

2. Una formulación farmacéutica que comprende el compuesto cristalino de la reivindicación 1, uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticos.

3. El compuesto de la reivindicación 1 para inhibir una dolencia patológica seleccionada entre el grupo constituido por: fibrosis uterina, endometriosis, proliferación de células de músculo liso aórtico, restenosis, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna, pérdida ósea, osteoporosis, enfermedad cardiovascular, hiperlipidemia, trastornos del SNC, y enfermedad de Alzheimer.

4. El uso de un compuesto de la reivindicación 1 para la manufactura de un medicamento para inhibir una dolencia patológica seleccionada entre el grupo constituido por: fibrosis uterina, endometriosis, proliferación de células de músculo liso aórtico, restenosis, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna, pérdida ósea, osteoporosis, enfermedad cardiovascular, hiperlipidemia, trastornos del SNC, y enfermedad de Alzheimer.

5. Un procedimiento para preparar un compuesto de la reivindicación 1, que comprende cristalizar clorhidrato de 6-hidroxi-3-(4-[2-piperidin-1-il)etoxi]fenoxi)-2-(4-metoxi-fenil)benzo[b]tiofeno de una mezcla de isopropanol y agua.