ES2208547T3 - Suministro de sustancias a organismos invertebrados. - Google Patents

Suministro de sustancias a organismos invertebrados.

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ES2208547T3 ES01901252T ES01901252T ES2208547T3 ES 2208547 T3 ES2208547 T3 ES 2208547T3 ES 01901252 T ES01901252 T ES 01901252T ES 01901252 T ES01901252 T ES 01901252T ES 2208547 T3 ES2208547 T3 ES 2208547T3
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Abstract

Partículas (10) para ingestión por un organismo invertebrado, incluyendo dichas partículas al menos un ingrediente (13) que tiene actividad biológica deseada en el organismo cuando se ingiere por el organismo, y al menos un material vehículo (12), caracterizadas porque el ingrediente activo (13) es sólido, tóxico para la toxina, y está revestido con o encapsulado en un material vehículo (12) ligeramente soluble en agua.

Description

Suministro de sustancias a organismos invertebrados.
La presente invención se refiere a una composición y a un método para uso en el suministro de una sustancia deseada a organismos invertebrados. La invención es particularmente aplicable, pero no se restringe a, cebadores filtradores acuáticos tales como moluscos bivalvos (por ejemplo, mejillones y almejas) y larvas de insectos, y se puede usar para suministrar cualquier sustancia deseada que tenga actividad biológica en el organismo implicado, por ejemplo uno o más agentes tóxicos, promotores del crecimiento, nutrientes, agentes antiparasitarios, controladores del crecimiento, o promotores/inhibidores de la reproducción.
La presente invención se refiere a la manipulación de cualquier aspecto de la fisiología, crecimiento, reproducción, resistencia o vulnerabilidad a la enfermedad o infección parasitaria, o comportamiento de los invertebrados, incluyendo el exterminio de organismos invertebrados invasores suministrando una cantidad efectiva de un agente tóxico a los mismos. "Manipulación" se ha de interpretar también como restauración de la función y/o crecimiento normal que de otro modo no soportaría la función y/o crecimiento normal, por ejemplo un medioambiente carente de nutrientes.
Se pueden usar agentes tóxicos que tienen el efecto de exterminar, debilitar o inducir de hecho cualquier efecto que permita que se desplace o se elimine más fácilmente la plaga del área o del medio que se controla.
Convencionalmente, se sabe cómo afrontar el problema de infestaciones de moluscos bivalvos que se adhieren por medio de sus hebras filamentosas o "barbas" a sustratos duros, tales como entradas de agua de refrigeración de plantas de energía y equipo auxiliar asociado, inyectando una disolución acuosa de toxina en la corriente de agua. Las toxinas adecuadas incluyen agentes a base de cloro tales como hipoclorito sódico a una concentración de aproximadamente 3 ppm.
Desde hace cierto tiempo se sabe que poniendo simplemente la sustancia deseada, por ejemplo una toxina, en el agua en la que se alimentan los moluscos bivalvos, particularmente mejillones, se puede provocar que los moluscos cierren sus conchas y detengan su alimentación, con lo que la sustancia se ha de añadir continuamente al agua durante alrededor de tres semanas hasta que se fuerza a los mejillones a reanudar la alimentación. Esto significa que hay una cantidad considerable e indeseable de contaminación del agua por la toxina.
Se han realizado diversos intentos de encontrar una forma más aceptable medioambientalmente de suministrar una sustancia tal como una toxina a moluscos bivalvos. Por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.252.330 de The University of Toledo, los mejillones Cebra (Dreisssena polymorpha) se controlan poniendo en contacto los mejillones con cantidades letales efectivas de un producto químico acuoso para tratar el medio, que comprende porciones molusquicidamente efectivas de la baya de Phytolacca dodecandra (también conocida como Endod) que contiene una toxina ("Lemmatoxina") que tiene la fórmula estructural descrita en la patente británica nº 1.227.417. Cuando se usa como un agente de tratamiento en agua, el tratamiento de Phytolacca se incuba preferiblemente para aumentar su actividad química.
Sin embargo, incluso tal toxina a base de plantas y biodegradable puede provocar un daño medioambiental considerable, y exterminará organismos distintos del organismo diana.
The Journal of Shellfish Research (v. 17, p. 79-83) plantea el uso de microcápsulas con paredes lipídicas, de 3-30 \mum de diámetro, y que contienen disoluciones a base de agua, como una técnica potencial de control frente a gusanos sabélidos en abulón cultivado. La biología de la alimentación de los mejillones Cebra se describe en Freshwater Biology (v. 12, p. 553-558), e identifica el tamaño de partículas ingeribles. La toxina de potasio para mejillones Cebra se da a conocer en Aquatic Toxicology (v. 20, p. 219-234), y la toxicidad de Endod (lemmatoxina) se da a conocer en Journal of Shellfish Research (v. 10, p. 361-366).
Un método alternativo para controlar mejillones Cebra, que implica el revestimiento de cubiertas de tubería, se plantea en la patente US-A-5.375.626, titulada "Method of and Lining for Water Intake Pipes" ("Método y revestimiento para tuberías de toma de agua"). Además, un método alternativo adicional para controlar organismos bioobstructores, usando agentes contra la obstrucción, se trata en el documento JP-A-07242507, titulado "An antifoulant agent contains 2-hydroxy phenyl-2',4'-dichlorobenzyl ether as the active ingredient" ("Agente contra la obstrucción, que contiene éter 2-hidroxifenil-2',4'-diclorobencílico"). La patente WO-A-97/41742, titulada "Oil containing vesicle with marine applications" ("Vesícula que contiene aceite con aplicaciones marinas"), describe la producción de "liposoaceites" que se producen a partir de huevos y se usan como un alimento potencial para organismos marinos. En la patente US-A-5.052.340, titulada "Chitin based diet for bivalves" ("Dieta a base de quitina para bivalvos"), también se protege un nuevo alimento para alimentar moluscos bivalvos, que usa quitina procedente de exoesqueletos de artrópodos molidos. En Proceedings of the European Symposium on Marine Biology (v. 1, p. 127-141) se plantea el diseño y la aceptabilidad de partículas encapsuladas con glicoproteínas y nailon-proteínas como un alimento para organismos marinos.
En consecuencia, es uno de los objetivos de la presente invención afrontar problemas con composiciones conocidas y métodos de suministro de sustancias a organismos invertebrados, ya sea que se citen aquí o en otra parte.
Se ha encontrado sorprendentemente que se puede dirigir una o más sustancias deseadas contra los organismos destinados (particularmente mejillones y almejas) más eficazmente si se puede inducir a los organismos a seguir ingiriendo la sustancia, permitiendo de ese modo que se use una cantidad total más pequeña de la sustancia para lograr el efecto deseado, minimizando de ese modo el impacto medioambiental de la sustancia.
Según un primer aspecto de la presente invención se proporcionan partículas para ingestión por un organismo invertebrado, incluyendo dichas partículas al menos un ingrediente que tiene actividad biológica deseada en el organismo cuando se ingiere por el organismo y al menos un material vehículo, caracterizadas porque el ingrediente activo es sólido, tóxico para el organismo, y está revestido con o encapsulado en un material vehículo ligeramente soluble en agua.
De forma conveniente, el ingrediente anterior está embebido en el material vehículo, o como alternativa el ingrediente activo puede estar revestido con o encapsulado en (por ejemplo, mediante técnicas de microencapsulamiento conocidas) el material vehículo.
Preferiblemente, el organismo es un organismo invertebrado acuático, por ejemplo un cebador filtrador, tal como un molusco bivalvo. Ejemplos de moluscos bivalvos a los que se les puede aplicar la invención incluyen mejillones, particularmente mejillones Cebra, almejas, particularmente la almeja asiática (Corbicula fluminea), y otros. Ejemplos de otros invertebrados acuáticos a los que se puede aplicar la invención incluyen larvas de insectos tales como larvas de mosca negra. En el África tropical, la mosca negra Simulin damnosum es el vector de oncoceriasis (ceguera de los ríos) así como un reductor de la cantidad de población de ganado debido al hábito de chupar sangre de las moscas adultas lo que evita el forraje eficaz. El único método actual para controlar la mosca negra es trata el agua con DDT (diclorodifeniltricloroetano) lo que representa importantes riesgos medioambientales.
Por "actividad biológica" se quiere decir cualquier efecto, o combinación de efectos, en cualquier aspecto de la fisiología, crecimiento, reproducción, resistencia o vulnerabilidad d enfermedad o parásitos, o comportamiento de los organismos, e incluye provocar o apresurar la muerte del organismo bien directa o indirectamente. Un ingrediente que tenga tal actividad biológica en el organismo se denominará en lo sucesivo como "el ingrediente activo", e incluye sustancias, tales como nutrientes, que restauran la función y/o crecimiento normal, en un medioambiente que de otro modo inhibiría o restringiría dicha función y/o crecimiento normal, por ejemplo debido a la insuficiencia, o falta completa, de nutrientes esenciales.
Particularmente, se prefiere que el efecto sea un efecto fisiológico.
Para hacer ingeribles a las partículas, primeramente se escoge el tamaño de las particulas para que sea adecuado para la ingestión por el organismo diana. Por ejemplo, para moluscos bivalvos, tales como mejillones, el tamaño medio de partículas está preferiblemente en la región de 1 a 200 micrómetros o más de diámetro, más preferiblemente entre 2 y 150 micrómetros de diámetro.
Los mejillones Cebra son cebadores filtradores, que filtran alrededor de 1 galón de agua al día, y que seleccionan para ingestión partículas de hasta 200 micrómetros de diámetro. Las estructuras filtrantes son las grandes agallas carnosas que están en cada lado del cuerpo, dentro de la cavidad del manto, y estas agallas están cubiertas de diferentes tipos de cilios. Los cilios frontales en la cara externa de las agallas recorren la ranura marginal que corre a lo largo del borde libre ventral de la agalla - las partículas gruesas mayores que 200 micrómetros pasan hacia abajo de las crestas de la superficie de las agallas y son excluidas de la ranura marginal, mientras que las partículas más pequeñas son dirigidas a lo largo de la ranura y llegan a los palpos labiales. Una proporción de las partículas que llegan a los palpos labiales pasan a la boca.
Por ejemplo, al proporcionar el ingrediente activo en forma de partículas que son compatibles con este mecanismo de alimentación selectivo y que no son detectadas por el organismo como tóxicas, el ingrediente activo se recoge de forma más eficaz y se concentrará en el organismo diana.
Preferiblemente, el material vehículo no sólo es inocuo para el organismo diana sino que preferiblemente también es nutritivo y/o atractivo para el organismo diana, potenciando de ese modo la ingestión de las partículas.
En la realización preferida, el ingrediente activo se proporciona como un núcleo rodeado por un revestimiento de material vehículo inocuo y/o nutritivo y/o atractivo, alrededor de dicho núcleo.
Como alternativa, el medio de tratamiento se puede fabricar mediante técnicas de encapsulamiento, tales como coacervación compleja, que es capaz de producir microcápsulas de entre 10 y 800 micrómetros de diámetro.
Dos posibles técnicas de encapsulamiento son el revestimiento por pulverización en lecho fluidizado y la congelación por pulverización.
Usando el revestimiento por pulverización en lecho fluidizado ha sido posible producir partículas encapsuladas en el intervalo correcto de tamaño, por ejemplo que constan de 75% en peso de ácido palmítico o esteárico y 25% de cloruro de potasio o permanganato de potasio (el material sólido fluidizado tenía 43\pm10 \mum o 98\pm10 \mum).
Usando las técnicas de congelación por pulverización, se suspendieron partículas de cloruro de potasio molidas en fluido menores que 10 \mum de diámetro en ácido palmítico, y la dispersión se pulverizó para producir partículas en el intervalo de 10 a 100 \mum.
Si se embebe en la partícula ingerible, el ingrediente activo se proporciona preferiblemente en forma de "subpartículas" mucho más pequeñas, uniformemente distribuidas en toda la partícula ingerible.
Si se encapsula dentro de un revestimiento ingerible externo, el ingrediente activo comprende preferiblemente un núcleo de entre alrededor de 40 a 60 micrómetros de diámetro. El grosor del revestimiento está preferiblemente entre 5 y 40 micrómetros, más preferiblemente alrededor de 10 micrómetros.
Cuando el ingrediente activo es tóxico para el organismo diana, la toxina preferida es un sólido inorgánico tal como cloruro de potasio que induce el ataque al corazón en ciertas especies invasoras tales como mejillones y almejas. El cloruro de potasio se proporciona preferiblemente en forma de cristales de tamaño apropiado. Una alternativa al cloruro de potasio es permanganato de potasio.
Toxinas alternativas incluyen saponinas, más preferiblemente "lemmatoxinas" derivadas de bayas de Endod, o una forma sinterizada de esos ingredientes activos. Se puede usar una combinación de dos o más toxinas diferentes, o una toxina combinada con uno o más ingredientes activos adicionales.
Las partículas son preferiblemente al menos parcialmente resistentes al agua, de forma que se pueden suspender en agua sin lixiviación indebida del ingrediente activo en el agua; por ejemplo, deben retener al menos 75% del ingrediente activo cuando se sumergen en agua durante varias horas.
El material vehículo se puede fabricar convenientemente a partir de almidón, tal como almidón de patata, que se puede proporcionar en forma de una pasta, o chocolate que tiene preferiblemente 70% de sólidos de cacao. Los materiales vehículo ingeribles alternativos, adecuados para obtener las partículas, incluyen cera de abejas, ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico, aceites, grasas y ceras o derivados de los mismos, o plancton seco, por ejemplo fitoplancton seco o zooplancton seco. Claramente, la naturaleza de la sustancia ingerible variará dependiendo del organismo diana, y preferiblemente es un material que es tanto nutritivo como atractivo para el organismo diana particular. Se puede usar cualquier combinación de dos o más de las sustancias anteriormente mencionadas. Se prefiere particularmente un material vehículo que incluye o comprende uno o más ácidos grasos, puesto que forma un revestimiento duro y es ligeramente soluble en agua, permitiendo de este modo que las partículas permanezcan activas durante su tiempo de residencia en el agua. Por ejemplo, una partícula de ácido esteárico de 100 \mum se disolverá en agua estancada en 124 horas.
Preferiblemente, las partículas tienen una flotabilidad neutra en agua fresca, que corresponde a una densidad óptima para las partículas de 1 g/cm^{3}, que se puede lograr usando, por ejemplo, KCl al 26% en ácido palmítico o KCl al 11% en ácido esteárico. La hidrofobia de tales partículas inhibe la dispersión en agua, pero la dispersión se puede facilitar mediante el uso de un tensioactivo tal como palmitato de sodio a alrededor de 1% en peso de las partículas.
Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para inducir a un organismo invertebrado a que ingiera una sustancia que tiene actividad biológica deseada en el organismo cuando es ingerida por el organismo, incluyendo el método introducir en el medioambiente del organismo partículas ingeribles por el organismo y que incluyen la sustancia y al menos un material vehículo, en el que la sustancia es sólida y está revestida con o encapsulada en el material vehículo, y en el que la sustancia es tóxica para el organismo diana.
El método incluye preferiblemente la etapa de poner en contacto los organismos con las partículas durante al menos 4 horas, más preferiblemente entre 4 y 8 horas.
Según este segundo aspecto de la presente invención, se proporciona además un método para concentrar, hasta una concentración biológicamente activa dentro de un organismo invertebrado, al menos una sustancia, comprendiendo el método proporcionar en el medioambiente del organismo partículas que contienen la sustancia y al menos un material vehículo, siendo ingeridas las partículas por el organismo a fin de efectuar dicha concentración de la sustancia, en el que la sustancia es sólida y está revestida con o encapsulada en el material vehículo, y en el que la sustancia es tóxica para el organismo diana.
Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para evitar que se detenga la alimentación en un organismo invertebrado, lo que de otro modo ocurriría debido a la presencia de una sustancia en el medioambiente del organismo, incluyendo el método la etapa de proporcionar la sustancia en forma de partículas ingeribles por el organismo, incluyendo también dichas partículas un material vehículo, en el que la sustancia es sólida y está revestida con o encapsulada en el material vehículo, y en el que la sustancia es tóxica para el organismo diana.
De este modo, debido a que el organismo continúa alimentándose, la sustancia se concentra efectivamente en el organismo y reduce la cantidad total de sustancia requerida a añadir en el medioambiente del organismo para que tenga el efecto deseado sobre el organismo.
Según un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para controlar una población invasora o potencialmente invasora de organismos invertebrados, que comprende alimentar a dicha población con una cantidad efectiva de una composición que comprende partículas que contienen un material vehículo y al menos un ingrediente activo, en el que el ingrediente activo es sólido y está revestido con o encapsulado en el material vehículo, y en el que el ingrediente activo es tóxico para el organismo diana.
Por "cantidad efectiva" se quiere decir suficiente para tener un efecto biológico deseado sobre la población o sobre los individuos de la población.
Preferiblemente, dicho ingrediente activo es tóxico para el organismo diana, y la cantidad efectiva es una cantidad suficiente para exterminar un número significativo de individuos de la población, o para reducir la tendencia de la población a ser o permanecer invasora, por ejemplo en el caso de mejillones, su tendencia a adherirse entre sí (agregación) y/o al sustrato subyacente.
Cuando los organismos individuales son exterminados, la muerte puede aparecer durante el tratamiento de la presente invención o algún tiempo después del tratamiento, como resultado directo o indirecto del tratamiento.
Según un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar agua que contiene organismos invertebrados, que comprende añadir al agua partículas que contienen al menos un material vehículo y al menos un ingrediente activo, siendo ingeribles dichas partículas en una cantidad efectiva por los organismos invertebrados, en el que el ingrediente activo es sólido y está revestido con o encapsulado en el material vehículo, y en el que el ingrediente activo es tóxico para el organismo diana.
Preferiblemente, las partículas, o al menos el material vehículo, son/es al menos parcialmente resistente al agua de forma que se inhibe la lixiviación del ingrediente activo en el agua durante un tiempo suficiente para una cantidad efectiva de la composición a ser ingerida por los organismos diana.
Según un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para controlar parásitos o simbiontes en o sobre un organismo invertebrado hospedante, comprendiendo el método alimentar al organismo hospedante con partículas que incluyen al menos un material vehículo y al menos un ingrediente activo que tiene actividad biológica en el hospedante y/o en el parásito o simbionte, en el que el ingrediente activo es sólido y está revestido con o encapsulado en el material vehículo, y en el que el ingrediente activo es tóxico para el organismo diana.
Según un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para hacer a un medioambiente adecuado para la crianza de organismos invertebrados, comprendiendo el método añadir al medioambiente partículas que contienen al menos un material vehículo y al menos un ingrediente activo, siendo ingeribles dichas partículas por los organismos, en el que el ingrediente activo es sólido y está revestido con o encapsulado en el material vehículo, y en el que el ingrediente activo es tóxico para el organismo diana.
Preferiblemente, dicho ingrediente activo es un nutriente o factor de crecimiento.
Según un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona un producto alimentario para la crianza de organismos invertebrados, comprendiendo el producto alimentario partículas ingeribles por los organismos que tienen al menos un ingrediente activo y al menos un material vehículo, en el que el ingrediente activo es sólido y está revestido con o encapsulado en el material vehículo, y en el que el ingrediente activo es tóxico para el organismo diana.
Preferiblemente, las partículas incluyen varios nutrientes apropiados para los requisitos nutricionales de los organismos a criar.
Cualquier característica de cualquier aspecto de cualquier invención o realización descrita aquí se puede combinar con cualquier otra característica de cualquier aspecto de cualquier invención o realización descrita en este documento.
Las realización de la presente invención se describirán ahora, a título de ejemplo sólo, con referencia a los dibujos que se acompañan, en los que:
la figura 1 ilustra una partícula que tiene un ingrediente activo embebido homogéneamente en ella, según la presente invención,
la figura 2 ilustra una partícula que tiene un núcleo de ingrediente activo rodeado de un revestimiento comestible,
la figura 2a ilustra un método para producir partículas con un material vehículo a base de almidón,
la figura 3 ilustra los resultados mostrados en la tabla 2, en forma de una gráfica,
la figura 4 es una gráfica de tiempo que toma a tres mejillones Cebra morir cuando se exponen a diferentes concentraciones de Endod,
la figura 5 es una gráfica del tiempo medio que toma a los mejillones Cebra para morir con diferentes concentraciones de Endod,
la figura 6 comprende dos gráficas del tiempo medio que toma a los mejillones Cebra para morir cuando se exponen a 30 mg/l de Endod, que se ha dejado descomponer en agua durante diferentes números de días. La Endod se descompuso a 15ºC y 40ºC. (Los asteriscos representan experimentos que se realizaron en los que no murieron mejillones Cebra, ª representa un experimento en el que sólo murió un mejillón Cebra,
la figura 7 es una gráfica de la proporción de mejillones Cebra que se observó que estaban abiertos o cerrados cuando se colocaron en agua de lago filtrada, o agua de lago filtrada con dosis letales de Endod,
la figura 8 es una fotografía de un mejillón Cebra que ha sido expuesto a agua que contiene una suspensión de pintura al óleo en aceite vegetal. La flecha indica el intestino, que se ha manchado con las partículas de pigmento ingeridas,
la figura 9 es una gráfica del número medio de mejillones vivos durante el experimento 8,
la figura 10 es una gráfica de las longitudes medias de mejillones que quedan, a intervalos, durante el experimento 8,
la figura 11 es una comparación de los tamaños medios de los supervivientes de las muertes tras el experimento 8,
las figuras 12 a 16 son micrografías electrónicas de barrido (SEM) de partículas según la presente invención,
la figura 17 es una serie de microfotografías de partículas procedentes de dos muestras diferentes de partículas durante el fraccionamiento de los tamaños.
Cada una de las partículas, o al menos un porcentaje sustancial de las mismas, que forman la composición, y para uso en el método de la presente invención, puede comprender una partícula 10 (véase figura 1) de un material vehículo 12, tal como chocolate (una sustancia comestible por el organismo diana, por ejemplo, el mejillón Cebra (Dreissena polymorpha)), en la que están embebidas "subpartículas" 13 mucho más pequeñas de un ingrediente activo; en el caso del mejillón Cebra, cristales de cloruro potásico KCl. El tamaño preferido de la partícula 10 es alrededor de 100 micrómetros de diámetro.
Otros materiales vehículo preferidos incluyen fitoplancton seco y zooplancton seco.
Un tipo más preferido de partícula 10' es aquella mostrada en la figura 2 en la que existe un núcleo 14 de un único cristal de KCl de alrededor de 53 micrómetros de diámetro, rodeado de un revestimiento 16 de material vehículo (por ejemplo, chocolate), siendo entonces el conjunto molido nuevamente hasta aproximadamente 90 micrómetros de diámetro.
La figura 2a ilustra un método alternativo para producir partículas según la presente invención, en el que se mezcla polvo de almidón 20 con agua destilada 22 (o disolución de KCl, para una partícula tóxica), se extruye a través de una matriz 24 para obtener copos 26 que entonces se hacen pasar con bolas de circonia a través de un pulverizador 28 y se hacen pasar a través de un tamiz 30 de 75 \mum para producir partículas de \leq 75 \mum de diámetro.
Experimento 1
La toxicidad de KCl sólo para mejillones Cebra se ilustra en la tabla 1 a continuación, que da los resultados del siguiente experimento.
1) Se llenó una serie de cazuelas con 20 ml de agua destilada más una masa específica de cristales de KCl, molidos hasta menos de 53 micrómetros. Las masas de KCl se escogieron para que representaran la cantidad total de KCl que sería ingerida por un mejillón que filtra un litro de agua por día.
2) Se colocó un mejillón en cada cazuela (se supone que el mejillón refiltra continuamente la cantidad limitada de disolución en la cazuela, y de este modo ingiere la cantidad requerida de KCl).
3) Los mejillones se observaron a intervalos durante los siguientes dos días, y se anotó su estado (vivo, muerto o cerrado, es decir el mejillón aún vive pero deja de comer temporalmente).
TABLA 1
Toxicidad de diferentes masas de KCl para mejillones cebra durante dos días
Fecha 17/03/99 18/03/99 18/03/99 19/03/99
Tiempo
masa de KCl 16H30 11H30 13H30 16H00
(mg)
0 (control) Vivo Cerrado Vivo Muerto
50 Vivo Muerto Muerto Muerto
25 Vivo Muerto Muerto Muerto
10 Vivo Vivo Cerrado Muerto
5 Vivo Vivo Vivo Vivo
1 Vivo Vivo Vivo Vivo
0,5 Vivo Vivo Cerrado Vivo
0,1 Vivo Vivo Vivo Vivo
Como se puede observar a partir de la tabla anterior, el uso de KCl solo no es efectivo durante el período de ensayo a concentraciones más bajas. El objetivo de la invención es reducir las concentraciones hasta menos de 1% de concentración másica, lo que corresponde a la masa de 0,5 mg en la tabla 1, lo que claramente no tendría el efecto deseado de controlar los mejillones usando KCl solo.
Experimento 2
También se investigó la toxicidad de una toxina alternativa, y se comparó con la de KCl. En otro experimento, cuyos resultados se muestran en la tabla 2 y se ilustran en la gráfica de la figura 3, se trituró Endod hasta aproximadamente 75 micrómetros de tamaño de partículas, y entonces se alimentó a un grupo de muestra de cinco mejillones, y mostró que se lograba una mortalidad total de los mejillones a bajas concentraciones de Endod durante un período de aproximadamente 5 días.
TABLA 2
Toxicidad de Endod para mejillones cebra comparada con KCl
Toxina Masa de toxina (mg) Tiempo para la muerte de todos
los mejillones (horas)
Endod 0 -
Endod 0,5 102
Endod 7,5 30,5
Endod 25 23
Endod 100 102 (80% de mortalidad)
Cloruro de potasio 100 8 (60% de mortalidad)
Una ventaja particular de Endod como toxina es su capacidad para lograr una mortalidad latente (muerte después de que la Endod haya abandonado el sistema) en mejillones Cebra. El polvo procedente de bayas de Endod secas es letal para los mejillones Cebra, y aquellos que no mueren fracasan en su reagregación y reunión (Lemma y col., 1991). Una dosis pequeña durante 4-8 horas proporciona una mortalidad del 50% más la continuación resultante de la mortalidad. La Endod también se puede adsorber fácilmente usando perlas de carbón activado, pero aún no tiene la autorización de las autoridades para su uso en sistemas de agua de refrigeración. En la tabla 3 se muestra la toxicidad de Endod para otros organismos no dianas comparada con mejillones Cebra, tabla la cual da el valor de LC_{50} a las 48 horas así como el intervalo de confianza del 95% (la LC_{50} a las 48 horas es la concentración de toxina requerida para inducir la mortalidad en el 50% de la población dentro de las 48 horas).
TABLA 3
1
Experimento 3
En el siguiente experimento se identificaron las concentraciones letales de Endod.
Se llenaron seis cazuelas, que contienen cada una tres mejillones Cebra de aproximadamente 2 cm de longitud, con 100 ml de agua de lago filtrada. Cada cazuela se aireó continuamente, y se mantuvo a una temperatura constante de 15ºC. Se dejó a los mejillones que se aclimataran durante dos horas antes de que se añadieran diferentes masas de polvo de Endod (procedente de bayas secas) de \leq 75 \mum a cinco de las cazuelas (0,002 g, 0,005 g, 0,01 g, 0,03 g, 0,1 g). La sexta cazuela sirvió como control. Se monitorizó regularmente durante 4,5 días el número de mejillones que murieron en cada cazuela. Las observaciones se muestran más abajo en la tabla 4, y estos resultados se presentan gráficamente en las figuras 4 y 5.
Resultados TABLA 4
2
3
4
En la cazuela de control no murió ningún mejillón, ni con Endod a 2 mg/l (figuras 4 y 5). Todos los mejillones murieron dentro de las 36 horas cuando los mejillones experimentaron 30 y 100 mg/l de Endod, y todos los mejillones murieron a las 84 horas a 5 ml/l de Endod (figura 4). Los mejillones murieron de la forma más rápida a las concentraciones más altas de Endod (figura 5).
Experimento 4
En este experimento se analiza cuán rápidamente se biodegrada Endod en diferentes regímenes de temperatura. Una vez que se estableció, a partir del experimento 3, que 30 mg/litro de Endod era letal para mejillones Cebra, se rellenaron seis conjuntos de tres cazuelas con 100 ml de agua de lago filtrada y 0,03 g de polvo de Endod de \leq 75 \mum, y se mantuvo a una temperatura constante de 15ºC. Se dejó que la planta de Endod se descompusiera en las cazuelas durante 6, 4, 3, 2, 1 y 0 días, tras lo cual el agua se vertió a través de papel de filtro, y el residuo se resuspendió en 100 ml de agua de lado filtrada. Esto aseguró que las toxinas asociadas con la ruptura bacteriana de Endod no interfirieron con el experimento. Se añadieron tres mejillones Cebra (de aproximadamente 2 cm de longitud) a cada cazuela, las cazuelas se mantuvieron a una temperatura constante de 15ºC, y los mejillones se observaron a intervalos regulares. En cada inspección, se registró el número de mejillones que estaban muertos. Las observaciones se realizaron durante seis horas o hasta que todos los mejillones murieron.
El experimento se repitió con Endod que se dejó descomponer a una temperatura constante de 40ºC durante 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 y 0 días. Una vez que los mejillones se añadieron a las cazuelas, se transfirieron a una temperatura constante de 15ºC. Se realizaron observaciones durante 33 horas. Las observaciones se muestran en las tablas 5 y 6, y estos resultados se muestran gráficamente en la figura 6.
Resultados TABLA 5
5
6
7
TABLA 6
8
La Endod permaneció activa hasta dos días, tras los cuales la Endod no exterminó a ningún mejillón. Este resultado se mantuvo cierto en ambos regímenes de temperatura (Fig. 6). A 15ºC, los mejillones murieron más rápidamente con Endod que se había mantenido en agua durante sólo un día comparado con los dos días. Los mejillones colocados con Endod, que se dejó descomponer durante 0 días (es decir, la Endod se suspendió en agua y después se filtró inmediatamente), dieron como resultado sólo una mortalidad de las seis cazuelas (dieciocho mejillones). En las cazuelas de control no murió ningún mejillón.
Experimento 5
En este experimento se analizaron los mejillones Cebra para ver si mostraban esta respuesta de cierre en presencia de Endod.
En cada inspección durante el experimento 4, se registraron cuántos mejillones estaban cerrados o estaban abiertos y respiraban normalmente.
Resultados
Después de 77,5 horas, todos menos uno de los nueve mejillones expuestos a Endod murieron. Los mejillones expuestos a Endod permanecieron cerrados durante casi todo el período experimental, mientras que una gran proporción de los mejillones en las cazuelas de control estaban abiertos durante la mayoría del tiempo (figura 7).
Experimento 6
En este experimento se analizó si las nuevas partículas orgánicas marcadas eran ingeridas por mejillones Cebra vivos.
Se produjo una suspensión de partículas orgánicas marcadas mezclando aceite vegetal con pintura al óleo pigmentada de color rojo, y agitando esto en agua de lago filtrada. Se añadieron a la susppensión aproximadamente veint mejillones Cebra (longitudes de aproximadamente 0,5-3 cm), y se dejaron durante 48 horas, después de las cuales se exterminó a los mejillones y se abrieron.
Resultados
Se observó que una gran proporción de mejillones Cebra estaban abiertos en todo momento durante el transcurso del experimento. Al abrir los mejillones, estaba claro que muchos habían ingerido las partículas marcadas por la presencia de un intestino rojo que se muestra a través de la pared de la masa visceral (figura 8). Era menos claro observar a simple vista los intestinos rojos de los mejillones más pequeños, aunque la disección de la masa visceral reveló a menudo la presencia de partículas rojas en el lumen de los intestinos.
Los resultados de los experimentos 3 a 6 proporcionan un buen apoyo para la factibilidad de un producto encapsulado. Se ha demostrado que los mejillones Cebra se cierran en presencia de toxinas brutas, no encapsuladas, tales como Endod, y por lo tanto un producto encapsulado debe reducir enormemente la cantidad de toxina que se requeriría para inducir la mortalidad en comparación con el simple vertido de las toxinas en el agua. También se ha demostrado que se pueden recoger nuevas partículas orgánicas en los intestinos de los mejillones Cebra de todos los tamaños.
Endod demostró ser una toxina efectiva, induciendo mortalidad a concentraciones de >2 mg/l. En teoría esta concentración letal de Endod se puede reducir significativamente si la toxina es encapsulada como se propone. Es prometedor que Endod se biodegrada después de dos días en la columna de agua, independientemente de la temperatura del agua. Esto significa que la Endod no se bioacumulará en el ecosistema y por lo tanto le hace un producto altamente adecuado para uso en sistemas cerrados tales como los Grandes Lagos. También es prometedor que Endod permanece activo a temperaturas tan altas como 40ºC, debido a que esto significa que permanecerá activo dentro de las aguas calientes de las plantas de energía.
Experimento 7
Se prepararon dos tipos de partículas que contienen mezclas de KCl y chocolate. Un tipo de partícula comprendió un sustrato de chocolate comestible de alrededor de 100 micrómetros de diámetro, en el que estaba embebido un número de cristales mucho más pequeños de KCl (figura 1), mientras que el otro tipo de partícula comprendió un único cristal de KCl de alrededor de 53 micrómetros de diámetro revestido con chocolate y después molido nuevamente hasta alrededor de 90 micrómetros de diámetro (figura 2). Cuando estas partículas se suspendieron en el agua en la que se mantuvieron los mejillones, tres de cuatro mejillones murieron en dos días.
Experimento 8
Se fabricó un lote de partículas ("lote 7") mediante un método de revestimiento en lecho fluidizado. Se hicieron pasar partículas de KCl de 98 \mum a través de un tamiz de 350 \mum con sílice al 1% para ayudar a la fluidización. Se pulverizaron 800 g de sólidos con ácido palmítico (p.f. 61ºC) durante 20 minutos a aproximadamente 12 ml.min^{-1}. Entonces se revistieron posteriormente 400 g de los sólidos resultantes con ácido palmítico para producir finalmente partículas que contienen entre 20 y 25% en peso de KCl.
Se rellenaron 40 vasos de precipitados de 1 litro con 500 ml de agua del grifo, y se airearon toda la noche en una habitación de temperatura controlada a 25ºC. Se colocaron diez mejillones Cebra grandes en cada vaso de precipitados, intentando mantener un intervalo similar de tamaños en todos. Se aplicaron cinco tratamientos diferentes (de forma que cada uno tuvo ocho réplicas)
1. Se añadieron 5 g de (Lote 7).
2. Se añadieron 0,5 g de (Lote 7).
3. Se añadieron 0,05 g de (Lote 7).
4. Se añadieron 5 g de ácido palmítico solo.
5. Se añadieron 1,15 g de KCl (la misma cantidad en masa como en 5 g de lote 7).
Cada sustancia de tratamiento se agitó a conciencia en cada vaso de precipitados, y se continuó la aireación durante la duración del experimento. A intervalos razonablemente regulares, se contó el número de mejillones muertos (según se indica por la abertura de la boca) en cada cazuela, antes de ser retirados y medidos. Se continuó así hasta que murió la mayoría, o hasta que transcurrieran 72 horas.
Los resultados se muestran en las Tablas 7, 8 y 9, más abajo, y se representan gráficamente en las Figuras 9, 10 y 11. Las líneas 1 a 5 corresponden a tratamientos 1 a 5, respectivamente.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 7
9
10
11
TABLA 8
Nº de mejillones vivos en cada cazuela a lo largo del tiempo cuando se exponen a 5 g de Lote 7 (1,15 g
de KCl)
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11
Tiempo 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 5,5 8,5
(horas)
1 10 10 7 6 5 4 4 3 1 0 0
2 10 9 4 3 3 2 1 1 1 0 0
3 10 8 6 4 2 1 1 1 1 1 0
4 10 9 8 7 6 5 4 4 3 2 0
5 10 9 5 4 3 3 2 2 1 0 0
6 10 10 9 8 6 4 4 3 2 1 0
7 10 8 5 4 4 4 4 2 2 2 0
8 10 10 8 8 7 6 5 4 3 3 0
TABLA 9
Nº de mejillones vivos en cada cazuela a lo largo del tiempo (1,15 g de KCl)
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13
Tiempo 0,5 1 1,5 2 3 3,5 4,5 5 6 7,5 9 11,5 24
(horas)
1 10 10 9 9 8 7 7 6 6 3 3 3 0
4 10 10 10 9 9 8 8 7 7 5 4 4 0
3 10 9 9 7 7 6 6 4 4 3 3 3 0
4 10 10 10 10 10 9 9 8 7 6 3 3 0
5 10 10 10 10 9 9 8 7 6 6 5 5 0
6 10 9 9 9 8 8 7 6 4 4 3 3 1
7 10 10 10 9 9 7 5 4 4 3 2 2 0
8 10 10 10 10 9 9 7 5 5 3 2 2 1
Como se puede observar en la Figura 9 (número medio de mejillones vivos por vaso de precipitados a intervalos en las primeras 24 horas tras los cinco tratamientos diferentes), con 0,5 g y 0,05 g de Lote 7, y con sólo ácido palmítico añadido, no hay mortalidad dentro de las primeras 24 horas (aunque hay una ligera mortalidad con ambas concentraciones de Lote 7 durante los siguientes dos días). Tanto los 5 g del Lote 7 como los 1,15 g del KCl provocaron una rápida mortalidad, especialmente durante las primeras 8 horas. El Lote 7 pareció que era el que actuaba más rápidamente de estos dos tratamientos, incluso aunque ambos contienen la misma cantidad de sal.
La figura 10 (las longitudes medias de mejillones que quedan a intervalos tras la adición del tratamiento 1) muestra que con el tratamiento 1 hay diferencias significativas en los tamaños de los mejillones que mueren a diversos tiempos en el experimento (ANOVA de una vía, df=9, p=0,05).
\newpage
Entonces se compararon los tamaños medios de las muertes y de los supervivientes con la adición de los tratamientos 2 y 3. La figura 3 resume los resultados con los dos tratamientos reunidos. El tamaño medio de los supervivientes es significativamente más pequeño que el de aquellos que murieron (test t de dos muestras, df=158, p=0,0001).
Las figuras 12 y 13 son micrografías electrónicas de barrido (SEM) de partículas que comprenden permanganato potásico de 90 micrómetros revestido con ácido palmítico, siendo fabricadas las partículas mediante congelación por pulverización en lecho fluidizado. Las partículas mostradas están en el intervalo de tamaños de 150 a 200 micrómetros (según se determina por fraccionamiento de tamaños mediante tamizado).
Las figuras 14 y 15 son SEM de partículas similares pero de un tamaño mayor que 250 micrómetros.
La figura 16 es una SEM de partículas de un tamaño mayor que 250 micrómetros que comprenden cloruro de potasio de 98 micrómetros revestido en ácido palmítico, fabricado mediante congelación por pulverización en lecho fluidizado.
La figura 17 comprende una serie de microfotografías de partículas procedentes de dos muestras diferentes indicadas por (7) y (9), durante el fraccionamiento de tamaños por tamizado (los números 90, 150, 250 indican el tamaño en micrómetros del tamiz en el que se retuvo la muestra, mientras que Res indica que la muestra pasó a través de un tamiz de 90 micrómetros). Las barras mostradas son iguales a 400 \mum. La muestra (7) es la misma muestra que la usada en el experimento 8, mientras que la muestra (9) comprende partículas de cloruro de potasio de 43 \mum a las que se añaden 4 g de sílice antes de pulverizar con ácido esteárico durante 30 minutos.

Claims (13)

1. Partículas (10) para ingestión por un organismo invertebrado, incluyendo dichas partículas al menos un ingrediente (13) que tiene actividad biológica deseada en el organismo cuando se ingiere por el organismo, y al menos un material vehículo (12), caracterizadas porque el ingrediente activo (13) es sólido, tóxico para la toxina, y está revestido con o encapsulado en un material vehículo (12) ligeramente soluble en agua.
2. Partículas (10) según la reivindicación 1, en las que el ingrediente activo (13) está embebido en el material vehículo (12).
3. Partículas (10) según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que el organismo es un invertebrado acuático.
4. Partículas (10) según cualquier reivindicación precedente, en las que el organismo comprende mejillones Cebra (Dreissena polymorpha).
5. Partículas (10) según cualquier reivindicación precedente, que tiene un tamaño medio de partículas en el intervalo de 1 a 200 micrómetros de diámetro.
6. Partículas (10) según cualquiera de las reivindicaciones precedentes y fabricadas usando técnicas de coacervación compleja, de revestimiento por pulverización en lecho fluidizado, o de congelación por pulverización.
7. Partículas (10) según cualquier reivindicación precedente, en las que el ingrediente activo (13) es cloruro de potasio o permanganato de potasio.
8. Partículas (10) según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que el ingrediente activo (13) es una saponina.
9. Partículas (10) según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que el material vehículo (12) se selecciona del grupo que incluye almidón, chocolate, ceras, cera de abeja, ácidos grasos, aceites, grasas o derivados de los mismos, y plancton seco.
10. Partículas (10) según cualquier reivindicación precedente, en las que el material vehículo (12) comprende uno o más ácidos grasos tales como ácido palmítico o ácido esteárico.
11. Partículas (10) según cualquiera de las reivindicaciones precedentes y que tienen flotabilidad neutra en agua fresca.
12. Partículas (10) según cualquiera de las reivindicaciones precedentes y que incluyen un tensioactivo tal como palmitato de sodio.
13. Un método para inducir a un organismo invertebrado a ingerir una sustancia (13) que tiene actividad biológica deseada en el organismo cuando es ingerida por el organismo, incluyendo el método introducir en el medioambiente del organismo partículas (10) ingeribles por el organismo y que incluyen la sustancia (13) y al menos un material vehículo (12), en el que la sustancia es sólida, tóxica para el organismo diana y está revestida con o encapsulada en un material vehículo (12) ligeramente soluble en agua.
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