ES2209517T3 - Deteccion de celulas madre mediante dominios especificos de union a pared celular (cbd) de proteinas de union a pared celular. - Google Patents
Deteccion de celulas madre mediante dominios especificos de union a pared celular (cbd) de proteinas de union a pared celular.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección específica de células diana mediante unión, comprendiendo el procedimiento los siguientes pasos: a) selección de proteínas de unión especifica a la célula diana; b) preparación de los dominios de proteína responsables de la unión a la pared celular (CBD) como fragmentos de proteína, careciendo estos fragmentos de proteína de cualquier actividad hidrolítica; y c) puesta en contacto entre los dominios de proteína obtenidos en el paso b) y una muestra que ha de examinarse.
Description
Detección de células madre mediante dominios
específicos de unión a pared celular (CBD) de proteínas de unión a
pared celular.
La presente invención trata de un procedimiento y
una combinación de reactivos para la detección específica de células
diana mediante el uso de dominios específicos de unión a pared
celular (CBD) de proteínas de unión a pared celular de virus,
bacterias o células eucarióticas, y el uso del procedimiento para
marcar, inmovilizar, enriquecer, purificar y detectar células según
las reivindicaciones independientes 1, 22 y 23. En las
reivindicaciones subordinadas se definen ejemplos de realización
preferibles.
Para detectar y determinar células y formas
permanentes de células (esporas) de microorganismos (bacterias,
levaduras, mohos) y células eucarióticas (denominadas en lo
sucesivo de forma abreviada células o células diana) se usan como
moléculas diana a detectar, además de los metabolitos segregados
por las células y/u otros componentes celulares o moléculas,
frecuentemente las propias células. Para ello se usan en la mayoría
de los casos anticuerpos especiales (proteínas de la clase de las
inmunoglobulinas). Los anticuerpos "detectan" antígenos
especiales en la superficie de los organismos diana y pueden se une
arlos de forma reversible. Esta unión puede visualizarse mediante
uno o varios procedimientos conocidos por el experto, por ejemplo
mediante la unión directa del anticuerpo a colorantes
(fluorescentes) (por ejemplo, fluoresceína), moléculas marcadoras
biológicas, marcadores particulares (por ejemplo, partículas de
oro) o los amplificadores más diversos (moléculas de unión
altamente afines (por ejemplo, biotina, unida mediante avidina), o
enzimas (por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa), que catalizan a
continuación a su vez una reacción, que proporciona un precipitado
de colorantes, un desdoblamiento de colorante visible o una
reacción visible de emisión de luz (quimioluminescencia,
bioluminescencia). Otra posibilidad es el uso de un anticuerpo
secundario (marcado), que detecta el anticuerpo (en este caso no
marcado, primario) (por ejemplo, un anticuerpo
anti-conejo de cabra), lo se une a y realiza por sí
mismo mediante conjugación con las partículas de oro, colorantes
mencionados anteriormente o enzimas que catalizan una reacción
medible la reacción (de detección) medible. Aquí, también es posible
el uso de moléculas de unión secundarias, que no pertenezcan a la
clase de las inmunoglobulinas, como por ejemplo avidina (puede
unirse a anticuerpos primarios marcados por biotina), o proteína A
de Staphylococcus aureus, que se une a generalmente
determinadas clases de inmunoglobulinas. Estas moléculas de unión
pueden estar unidas a su vez a una o a varias de múltiples
moléculas de detección (amplificadoras, véase arriba).
Otra posibilidad es la inmovilización de las
moléculas diana o células a detectar en una fase sólida (por
ejemplo, placas de microvaloración de plástico de superficie
tratada o tiras reactivas correspondientemente tratadas). Aquí, las
células diana son unidas por anticuerpos específicos unidos a la
fase sólida de forma selectiva desde una mezcla heterogénea.
Después de un paso de lavado para eliminar las moléculas diana no
unidas (antígenos, células) se usa, a continuación, un segundo
anticuerpo, en este caso un anticuerpo libre, unido a los
colorantes, moléculas marcadoras, marcadores particulares, isótopos
radioactivos o amplificadoras (por ejemplo, enzimas, biotina)
mencionados anteriormente, para se une ar también los antígenos
ahora inmovilizados en la fase sólida (moléculas o células diana) y
detectarlas de la forma descrita arriba. Este tipo y realización de
reacción de detección se denomina sándwich ELISA
(Enzyme-linked-Immunsosorbent
assay; ensayo enzimático inmunoabsorbente).
Otra aplicación de anticuerpos específicos en el
marco de la inmovilización es el enriquecimiento de células diana
mediante una fase sólida móvil. Los anticuerpos o lectinas pueden
acoplarse, por ejemplo, a pequeñas partículas ferromagnéticas, que
después de la unión del antígeno diana en fase líquida pueden
aislarse de ésta con ayuda de un campo magnético, permitiendo de
esta forma un enriquecimiento selectivo de moléculas diana o células
diana con otros pasos de tratamiento posteriores.
Estos procedimientos descritos arriba, basados en
anticuerpos tienen algunos inconvenientes. Deben prepararse
anticuerpos específicos, en primer lugar mediante inmunización de
animales con el antígeno diana o un componente de éste. Aquí no
está garantizado que realmente se consiga la respuesta inmunológica
deseada. En caso de que el suero contenga después de un tiempo
determinado un título suficientemente elevado de anticuerpos
específicos contra el antígeno diana, éstos pueden obtenerse a
partir del suero de los animales mediante los procedimientos
conocidos por el experto para la purificación de inmunoglobulinas.
Estos anticuerpos se denominan anticuerpos policlonales,
independientemente de su grado de pureza. Frecuentemente se observan
reacciones cruzadas no deseadas con antígenos extraños, no
forzosamente derivados del antígeno diana, lo cual representa un
inconveniente fundamental. Además, es posible obtener mediante
técnicas de fusión conocidas por el experto, los llamados
anticuerpos monoclonales en cultivos de células de algunas células
inmunológicas tipo B productoras de anticuerpos y una línea celular
de células tumorales de células hibridoma. No obstante, estas
técnicas de hibridoma son largas y costosas. A continuación, deben
acoplarse, dado el caso en otras reacciones, colorantes, marcadores
particulares o amplificadores a los anticuerpos purificados,
purificándose los productos de reacción. Además, no en todos los
casos es posible obtener sin más un anticuerpo especial contra el
antígeno diana, en particular cuando se trata aquí de células
enteras, intactas. Otro inconveniente fundamental del uso de
anticuerpos es el tiempo de reacción relativamente largo, necesario
para la unión del anticuerpo al antígeno diana. Esto puede tardar
hasta 12 horas.
El experto conoce los procedimientos de este tipo
descritos arriba, así como variantes de estos procedimientos,
además de estar descritos los mismos en la bibliografía. Estas
reacciones se resumen según la invención como procedimientos
habituales de detección. Los reactivos que son necesarios para estos
procedimientos de detección se denominan los agentes indicadores
habituales.
Las proteínas o enzimas que desdoblan de forma
selectiva paredes celulares de células se conocen en distintas
formas por la bibliografía. Se sabe que las proteínas de este tipo
presentan en la mayoría de los casos una estructura de dominios,
siendo capaz un tramo parcial de la cadena de polipéptidos en la
estructura terciaria nativa, acabada de plegar, de detectar
determinadas moléculas o conformaciones moleculares en la
superficie de células y se une arlas a éstas. Moléculas de este
tipo son las hidrolasas de pared celular codificadas por
bacteriófagos (Microbiol. Rev. 56, páginas 430-481
(1992)); hidrolasas de pared celular bacterianas como, por ejemplo,
lisostafina (Mol. Gen. Genet. 209, páginas 563-569
(1987)) y distintas autolisinas. Además pueden se une ar a las
paredes celulares las moléculas receptoras codificadas por el ADN
de bacteriófagos y otros virus específicos para levaduras, mohos y
células eucarióticas y también todas las proteínas de pared celular
asociadas de forma no covalente a la pared celular de células,
codificadas por el ADN propio de la célula.
El objetivo de la invención aquí expuesta es
proporcionar procedimientos en los que las células diana sean
detectadas específicamente por una secuencia de aminoácidos
conocida mediante el uso de polipéptidos definidos (dominios de la
proteína), pudiendo se une arse y marcarse específicamente mediante
la unión de los polipéptidos a estas células. Estos polipéptidos
definidos son tramos subordinados especiales (dominios de unión a
pared celular, en ingl.: cell wall- binding domains, denominados en
lo sucesivo CBD) de proteínas asociadas a la pared celular y de
unión a pared celular o proteínas enzimáticamente activas (enzimas)
de células o virus, así como combinaciones de los mismos entre sí.
Los tramos genéticos codificantes de estos CBD se determinan a
partir de las informaciones genéticas codificantes correspondientes
de las proteínas de unión a pared celular de las células o de los
virus. Estos tramos parciales correspondientes se aíslan y
multiplican a continuación mediante técnicas de la biología
molecular conocidas por el experto. A continuación, estos tramos
genéticos se combinan mediante técnicas conocidas por el experto con
nuevas señales (para la transcripción y traducción) y estructuras
de replicación (por ejemplo, plásmidos), lo que permite la
preparación independiente de estos fragmentos de proteína
(polipéptidos) en organismos heterólogos. Estos tramos genéticos
recombinados, codificantes para proteínas (novedosas), se
incorporan mediante técnicas conocidas por el experto en organismos
adecuados (por ejemplo, bacterias Escherichia coli o
levaduras Pichia pastoris), para la obtención de los
productos génicos recombinantes (proteínas, polipéptidos). A
continuación o también durante la expresión recombinante, las
cadenas de polipéptidos deben acoplarse a marcadores particulares
adecuados, amplificadores enzimáticos, colorantes, isótopos o genes
marcadores, como por ejemplo, proteínas fluorescentes (por ejemplo,
proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa Aequoria
victoria; Science 263, páginas 802-805 (1994); o
preferiblemente GFP modificada con mayor intensidad de emisión
(GFP-mut1, GFP- mut2); Gene 173, páginas
33-38 (1996) o también proteína fluorescente azul
(BFP) u otras proteínas fluorescentes.
Los polipéptidos CBD tienen propiedades
comparables con anticuerpos de unión a pared celular específicos.
Detectan epítopos específicos (proteínas, hidratos de carbono,
lípidos o compuestos con éstos) en o dentro de la pared celular y
se unen a estos epítopos. No obstante, los polipéptidos CBD tienen
ventajas en cuanto a la preparación sencilla y económica. Una
diferencia y ventaja fundamental de los polipéptidos CBD frente a
anticuerpos de la clase de las inmunoglobulinas es la posibilidad
de la unión directa a moléculas reporter adecuadas mediante fusión
genética de la secuencia ADN codificante de CBD obteniéndose
secuencias ADN codificantes de moléculas reporter y/o
amplificadores como, por ejemplo, proteínas GFP o amplificadores
enzimáticamente activos. Este procedimiento permite proporcionar
proteínas de fusión de CBD y las mencionadas moléculas reporter y/o
amplificadores, con dominios funcionales correspondientemente
distintos para la detección y unión a las células diana (dominio
CBD), así como la visualización y la posibilidad de detección de
esta unión específica mediante el dominio molécula
informadora/amplificador.
El objeto de la invención son procedimientos para
la visualización específica y la detección específica de células en
una muestra (procedimientos diagnósticos) mediante la unión
específica de CBD a células diana definidas y mediante una reacción
de detección posterior, que es mediada por marcadores particulares,
amplificadores, colorantes, isótopos o preferiblemente proteínas
fluorescentes (preferiblemente GFP modificada) adecuados, acoplados
a los CBD especiales. Este acoplamiento puede realizarse mediante
fusión directa por traducción o mediante modificación de los CBD
después de la preparación y purificación de los polipéptidos.
Otro objeto de la invención es el uso de los
polipéptidos CBD para procedimientos para la inmovilización
específica de células, uniéndose los polipéptidos CBD mediante
procedimientos conocidos por el experto a una fase sólida, siendo
inmovilizados después del contacto con una muestra (preferiblemente
líquida) que contiene las células diana mediante su capacidad de
unión específica a la pared celular de las células en la fase
líquida. En un paso posterior, puede detectarse ahora mediante CBD
marcados (como se ha explicado anteriormente) a modo de un ensayo
CBD tipo sándwich, la presencia de células diana inmovilizadas. Si
como fase sólida se usan partículas magnéticas, el procedimiento de
inmovilización también es adecuado para el enriquecimiento de
células desde una mezcla heterogénea de otras células y otras
sustancias extrañas.
Finalmente son también objeto de la invención
combinaciones de reactivos (kits) adecuados para los procedimientos
específicos indicados arriba para marcar, detectar, inmovilizar y
enriquecer células, conteniendo las mismas además de los agentes
indicadores habituales, uno o varios polipéptidos CBD especiales, o
purificados, o unidos a fases sólidas o uniones con estos
mismos.
Ejemplos para las hidrolasas de pared celular
codificadas por bacteriófagos conocidas por el experto, hidrolasas
de pared celular bacterianas, autolisinas, las moléculas receptoras
codificadas por el ADN de bacteriófagos y otros virus de forma
específica para levaduras, mohos y células eucarióticas, y también
todas las proteínas de pared celular asociadas a la pared celular de
células de forma no covalente, codificadas por el ADN de la propia
célula, están descritos en los documentos indicados arriba y en la
bibliografía especializada conocida. Las enzimas que hidrolizan la
pared celular de bacteriófagos (lisinas de fagos, endolisinas,
lisinas) pueden ser muy específicas para la hidrólisis de la pared
celular bacteriana. Forman parte de estas enzimas las lisinas que
son codificadas por bacteriófagos para bacterias del género
Listeria y que se forman durante la posterior expresión
génica en la multiplicación de fagos. En el documento DE4326617 se
describe, por ejemplo, el uso de lisinas de fagos de
Listeria como medio específico para combatir listerias; en el
documento DE19506615 se describe el uso de lisinas de fagos para la
desintegración específica de células. Los genes para estas lisinas
de fagos son conocidos (Mol. Microbiol. 16, páginas
1231-1241 (1995); Microbiology 141, página
2577-2584 (1995). En el documento US 4,329,151 se
describe el uso de moléculas estreptolisina O no descompuestas,
adsorbidas en partículas de poliestireno-látex, para
la detección de infecciones patógenas.
Es posible determinar mediante distintos
procedimientos los dominios de unión a pared celular (CBD) dentro de
la estructura, por ejemplo, de estas lisinas de fagos, por ejemplo,
mediante comparaciones de homología de los genes codificantes
(secuencias de nucleótidos) o los productos génicos (secuencias de
aminoácidos) o mediante la expresión independiente de tramos
parciales de los genes codificantes en cultivos de bacterias
recombinantes con posterior determinación de la capacidad de unión
de la pared celular de los fragmentos individuales presentes de la
molécula de proteína original. Aquí es importante que no exista
ninguna actividad hidrolítica de los distintos fragmentos obtenidos
sólo por la expresión del dominio CBD o que la misma se destruya de
forma selectiva mediante mutaciones o deleciones.
El siguiente ejemplo debe explicar más
detalladamente la idea de la invención; no representa ninguna
limitación del alcance de la invención.
Según la invención pudo localizarse el CBD en el
área carboxiterminal de la enzima Ply500, codificada por el fago
A500 Listeria. Para ello se realizaron en primer lugar
comparaciones de la secuencia de aminoácidos de Ply500 con todas
las demás proteínas conocidas en las bases de datos habituales, de
acceso general (GenBank, SwissProt). Se mostró que la parte
aminoterminal de la proteína presenta similitudes con los dominios
enzimáticamente activos de otras enzimas hidrolíticas de pared
celular, mientras que la parte carboxiterminal parece ser
completamente independiente. A continuación, se obtuvieron mediante
cebadores especiales de oligonucleótidos y la reacción en cadena de
la polimerasa fragmentos definidos del gen codificante
(ply500), que en el extremo 5' están provistos de un sitio
de unión de ribosoma propio y un codón iniciador ATG. Este
procedimiento permite la expresión independiente de estos
fragmentos de genes en organismos heterólogos como la bacteria
Escherichia coli. Los fragmentos de genes obtenidos se
introdujeron en un vector plásmido adecuado (pSP72) y se
transformaron en E. coli. Después de la inducción de la
expresión y la comprobación de los productos génicos sintetizados
para verificar si hay una actividad lítica sobre células
Listeria con ayuda de un bioensayo, se mostró que sólo el gen
completo, intacto muestra una actividad hidrolítica. La parte
aminoterminal de Ply500 no pudo desdoblar las paredes celulares de
Listeria sin la parte carboxiterminal. El dominio
carboxiterminal (aminoácido His133 a Lys289) tenía que permitir,
por lo tanto, la unión a la pared celular y representó un posible
CBD. Ahora se preparó con ayuda de técnicas de la biología molecular
conocidas por el experto y procedimientos de clonación una fusión
genética de las secuencias de nucleótidos codificantes de proteína
fluorescente verde (GFP) con la fusión para CBD de Ply500, se clonó
en un vector de expresión controlándose un promotor inducible y se
transformó en bacterias de la especie E. coli. El producto
génico formado por la expresión del gen de fusión en las bacterias
representa una proteína de fusión de una cadena de polipéptidos,
representando la GFP la parte aminoterminal y Ply500 CBD la parte
carboxiterminal. Después de la síntesis en bacterias recombinantes y
el desacoplamiento de éstas mediante procedimientos adecuados por
medio de procedimientos conocidos por el experto, la proteína puede
purificarse de los lisados celulares y prepararse para posteriores
ensayos. La proteína de fusión GFP-CBD500
purificada se absorbe en un tampón acuoso (por ejemplo, 50 mM de
TrisCl, pH 8,0, 200 mM de NaCl, 5 mM de MgSO_{4}) y puede
almacenarse a -20ºC.
Para la unión a la pared celular y la detección
de células Listeria (por ejemplo, Listeria
monocytogenes, cepa ScottA, Serovar 4b) se concentra un cultivo
de crecimiento denso (por ejemplo, 1 ml) concentrado mediante
centrifugación, se resuspende, por ejemplo, en 500 \mul del tampón
indicado arriba, se mezcla con una cantidad correspondiente (por
ejemplo, 20 \mul, que corresponden, por ejemplo, a 20 \mug de
proteína) de GFP-CBD500 y se incuba durante 5
minutos a temperatura ambiente (por ejemplo,
10-35ºC). A continuación, las células de las
bacterias se centrifugan en una microcentrífuga (por ejemplo,
durante 60 s con 13.000 x g), se elimina cuidadosamente el
sobrenadante que contenía la GFP-CBD500 no unida y
se resuspendieron los sedimentos en, por ejemplo, 500 \mul del
tampón indicado arriba. Se aplicó una alícuota (por ejemplo, 10
\mul) en un portaobjetos y se examinó con ayuda de un microscopio
de epifluroescencia usándose un juego de filtros adecuado para la
protección contra luz ultravioleta. Según la invención se mostró
que la molécula se une de forma muy rápida y eficiente a la pared
celular de células de la especie Listeria, por lo que se
mantienen por completo las propiedades deseadas de los dominios
individuales de la molécula (dominio GFP fluorescente, dominio
CBD500 se unen ate de pared celular. En la figura 1 se puede ver la
unión de GFP-CBD500 a células de Listeria
monocytogenes cepa ScottA. Las células se mezclaron con la
proteína de fusión purificada, se separaron mediante
centrifugación, se purificaron mediante centrifugación y se examinó
una pequeña muestra con ayuda de un microscopio de epifluorescencia
como se indica arriba. Las células Listeria están marcadas
con una fluorescencia verde clara (en la foto de blanco y negro
irradian una luz clara). El área de aminoácido His133 a Lys289
forma un CBD capaz de funcionar.
Con un resultado similar puede repetirse el
ensayo usándose otros CBD de lisinas de fagos de Listeria,
por ejemplo, usándose los CBD de Ply118 y los CBD de Ply511. No
obstante, no es posible derivar los dominios CBD a libre elección
unos de otros, es decir, el dominio CBD funcional debe determinarse
y probarse de nuevo para cada proteína individual de forma
independiente, debido a la secuencia especial y la estructura de
proteína secundaria/terciaria.
Claims (23)
1. Procedimiento para la detección específica de
células diana mediante unión, comprendiendo el procedimiento los
siguientes pasos:
a) selección de proteínas de unión especifica a
la célula diana;
b) preparación de los dominios de proteína
responsables de la unión a la pared celular (CBD) como fragmentos
de proteína, careciendo estos fragmentos de proteína de cualquier
actividad hidrolítica; y
c) puesta en contacto entre los dominios de
proteína obtenidos en el paso b) y una muestra que ha de
examinarse.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que las proteínas de unión específica a la célula diana se
seleccionan entre el siguiente grupo:
hidrolasas de pared celular codificadas por
bacteriófagos; hidrolasas de pared celular bacterianas;
autolisinas; moléculas receptoras de bacteriófagos y otros virus
específicos para levaduras, mohos y células eucarióticas; y
proteínas de pared celular asociadas a la pared celular de forma no
covalente.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque se trata de endolisinas, lisinas de
fagos, lisinas, hidrolasas de mureína y/o hidrolasas de
peptidoglicano.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque se codifican las lisinas de
bacteriófagos para bacterias del género Listeria.
5. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células diana se seleccionan entre el grupo formado por bacterias y
esporas bacterianas, levaduras, mohos y esporas de mohos, células
vegetales y células animales.
6. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los
dominios de polipéptido de unión a pared celular (CBD) se derivan y
obtienen de la secuencia de nucleótidos de genes y/o de la
secuencia de aminoácidos de productos génicos (proteínas).
7. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los
productos génicos comprenden también aquellos productos génicos que
no se vuelven funcionales y eficaces hasta después de una
modificación post-traduccional.
8. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los CBD
usados están unidos directamente a un marcador que ha de detectarse
mediante fusiones genéticas traduccionales.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque el marcador que ha de detectarse son
proteínas fluorescentes, en particular GFP, BFP, de forma
especialmente preferible GFP mut-1 o GFP
mut-2.
10. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los CBD
usados están unidos directamente a un amplificador que ha de
detectarse en otras reacciones mediante fusiones genéticas
traduccionales.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque el amplificador es peroxidasa o
fosfatasa u otra enzima con un efecto comparable.
12. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque, después
de modificaciones posteriores, los CBD usados están provistos de
marcadores particulares, colorantes, amplificadores o isótopos
radioactivos que han de detectarse.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el colorante son colorantes fluorescentes.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó
13, caracterizado porque el amplificador es biotina,
peroxidasa, fosfatasa o enzimas comparables.
15. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, en el que los CBD se unen mediante
distintos procedimientos y/o reacciones químicas o físicas a una
fase sólida, permitiendo posteriormente la inmovilización de las
células diana en una superficie sólida mediante unión a las paredes
celulares de las células diana.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que la fase sólida es poliestireno activado, vidrio o silicio
activado, látex activado, oro o compuestos de oro activados,
distintos materiales soporte ferromagnéticos o plásticos
hidrófobos.
17. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células diana inmovilizadas mediante CBD unidos a fase sólida
pueden ser marcadas y detectadas a modo de un ensayo CBD sándwich
con moléculas CBD secundarias marcadas y/o modificadas.
18. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque las células
diana inmovilizadas mediante CBD unidos a fase sólida pueden ser
marcadas y detectadas a modo de un ensayo CBD sándwich ELISA con
anticuerpos secundarios marcados y/o modificados de la clase de las
inmunoglobulinas.
19. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque las células
diana inmovilizadas mediante anticuerpos primarios unidos a fase
sólida de la clase de las inmunoglobulinas pueden ser marcadas y
detectadas a modo de un ensayo IG-CBD sándwich con
moléculas CBD secundarias marcadas y/o modificadas.
20. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque un CBD se une
ado a una fase sólida móvil puede unir células diana a partir de
mezclas de células diluidas o heterogéneas, permitiendo en pasos
posteriores el enriquecimiento selectivo, el aislamiento, la
purificación o la detección de éstas.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que en la fase móvil se trata de partículas ferromagnéticas.
22. Uso del procedimiento según una o varias de
las reivindicaciones 1 a 21 para el marcado, detección,
diagnóstico, inmovilización y enriquecimiento de células.
23. Combinación de reactivos para procedimientos
según una o varias de las reivindicaciones precedentes que, además
de los indicadores habituales, contiene uno o varios CBD
purificado(s) definido(s) según el paso b) en la
reivindicación 1.
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