ES2209869T3 - Procedimiento para retardar la desactivacion de glutarilamidasa durante una catalisis enzimatica. - Google Patents
Procedimiento para retardar la desactivacion de glutarilamidasa durante una catalisis enzimatica.Info
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Abstract
Procedimiento para retardar la desactivación de la glutarilamidasa durante una catálisis enzimática, caracterizado porque la enzima se pone en contacto con al menos un tiol. La glutarilamidasa está acoplada a un soporte polímero para lo que se utiliza un poliacrilato activado con oxirano.
Description
Procedimiento para retardar la desactivación de
glutarilamidasa durante una catálisis enzimáticas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para retardar la desactivación de glutarilamidasa
durante una catálisis enzimática.
La síntesis enzimática del precursor de
antibiótico ácido 7-aminocefalosporínico
(7-ACS) tiene lugar - como se representa en la Fig.
1 - en dos etapas de reacción. Primero se oxida cefalosporina C,
bajo la acción de
D-aminoácido-oxidasa (DAO), en
\alpha-cetoadipil-ACS. En la etapa
siguiente se hidroliza este compuesto a 7-ACS
mediante la glutarilamidasa (GAE). El 7-ACS es de
gran interés comercial para la producción de antibióticos de
cefalosporina semisintéticos.
La síntesis tiene lugar con las enzimas
D-aminoácido-oxidasa o
glutarilamidasa inmovilizadas, por lo regular, sobre soportes. Estas
enzimas, después de finalizar la reacción, se separan de la solución
de producto y pueden emplearse de nuevo en la carga siguiente. La
utilización repetida de las enzimas conduce, no obstante, a su
desactivación y equivale a un consumo de enzimas.
Es conocido en la bibliografía que las
oxidaciones que alteran la estructura en las proteínas pueden
inhibirse con el empleo de reactivos tiólicos, tales como p. ej.,
2-mercaptoetanol (P. Golini et al. Enzyme and Microbial
Technology, 17, 1995, 324-329; Int. J.
Peptide Protein Res., 48, 1996, 532-538).
Por ejemplo, la
D-aminoácido-oxidasa (DAO) puede
regenerarse con tioles. La flavoproteína DAO cataliza la
desaminación estereoespecífica de D-aminoácidos en
los correspondientes \alpha-cetoácidos y amonio
como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 1 la reacción de
cefalosporina C en ácido
\alpha-cetoadipil-7-aminocefalosporínico
(\alpha-ceto-adipil-7-ACS).
El
\alpha-cetoadipil-7-ACS
se descarboxila in situ en
glutaril-7-ACS (P. Golini et al.
Enzyme and Microbial Technology 17, 1995, 324-329).
En la aplicación técnica la utilización frecuentemente no tiene
lugar en disolución, sino en forma inmovilizada por unión a
polímeros tales como, p.ej., polímeros aminoalquilados o polímeros
activados con oxirano. Con ello puede separarse por filtración el
catalizador enzimático después de la reacción y se encuentra
disponible para su reutilización. El catalizador inmovilizado DAO
sufre una inactivación parcial. Si el catalizador enzimático, ya
usado, se utiliza de nuevo en una reacción ulterior, por lo demás
bajo iguales condiciones, se prolonga el tiempo de reacción
necesario para la reacción máxima del sustrato. Esta prolongación
del tiempo de reacción que se presenta en cada reutilización es una
medida de la estabilidad del catalizador en el proceso de
preparación de, p. ej.,
glutaril-7-ACS. La magnitud de la
modificación del tiempo de reacción hasta la conversión máxima del
sustrato, calculada a lo largo de varios ciclos de producción, se
designa como estabilidad operacional. La estabilidad operacional de
la DAO inmovilizada se puede mejorar si después de la reacción se
separa por filtración el catalizador enzimático de la mezcla de
reacción y se mezcla con un tiol, por ejemplo
2-mercaptoetanol. La DAO contiene algunos grupos
sulfhidrilo fácilmente oxidables, principalmente como grupos
funcionales de los aminoácidos cisteínicos de la proteína. La acción
del 2-mercaptoetanol se basa en la acción reductora
del tiol frente a los grupos sulfhidrilo sensibles a la oxidación de
las cisteínas. La regeneración de estos grupos sulfhidrilo oxidados
da como resultado una notable mejora de la estabilidad operacional.
En el caso particular de la DAO la regeneración debe producirse
después de separar la enzima de la mezcla de reacción, dado que
durante la catálisis enzimática se genera H_{2}O_{2}. Este
compuesto, como oxidante fuerte, inactivaría un tiol que se
añadiera.
La adición de tiol puede reducir también la
actividad de las proteínas. También este efecto puede explicarse
por la existencia de restos cisteína. Un ejemplo de ello es la
aminoacilasa. La aminoacilasa es una enzima dímera con un átomo de
Zn^{2+} por subunidad. Cada subunidad de la enzima contiene 2
grupos SH de cisteína y 2 enlaces disulfuro. La modificación
química de los grupos SH así como la ruptura de las uniones
disulfuro puede conducir a una inactivación de la enzima. Se ha
podido demostrar que por adición de 2-mercaptoetanol
se reduce la actividad de la aminoacilasa, mientras que, por el
contrario, después de separar el 2-mercaptoetanol
por diálisis o por filtración en gel se puede restablecer casi por
completo la actividad enzimática original (W. Kördel y F. Schneider
Biochem. Biophys. Acta 445, 1976, 446-457).
Puesto que evidentemente la acción del tiol se
induce por la oxidación, o la reducción, de grupos sulfhidrilo de
restos cisteína, la adición de tioles a enzimas, de las que se sabe
que no contienen restos cisteína, no tendría en consecuencia que
conducir a ninguna modificación de la actividad enzimática.
En el marco de la utilización repetida de GAE en
las reacciones catalíticas del catalizador tiene lugar, como se ha
descrito al principio para la síntesis de 7-ACS
(véase la Fig. 1), una desactivación de la enzima que equivale a un
consumo. La estabilidad del catalizador se correlaciona con
importantes costes de producción del proceso como la demanda de
tiempo, la generación de residuos y los costes de catalizadores.
Hasta el momento no se conoce un procedimiento adecuado, comparable
con el descrito anteriormente para la DAO, para estabilizar la GAE
o para aumentar su estabilidad operacional. La enzima GAE consta de
2 cadenas peptídicas (proteína A y proteína B). La interacción de
las cadenas tiene lugar a través de enlaces de puente de hidrógeno,
así como a través de interacciones hidrófilas e hidrófobas de
dominios proteínicos. Applied Biochemistry and Biotechnology,
69(1), 1998, 53-67, Battistel da a conocer un
procedimiento para la purificación de
glutaril-7-ACA acilasa y su
desactivación mediante guanidina.
La clonación del gen a partir de Pseudomonas, así
como la expresión en E.coli se ha descrito, p. ej., en el
documento de patente EP-P-0504798
(US 5830743), así como en el documento de patente
EP-A-0708180 (US 5766881). La
utilización de microorganismos o de enzimas de éstos para la
preparación de 7-ACS se encuentra en el documento de
patente EP-A-0275901 (US 4990444),
así como en el documento de patente EP 0525861 B1 (US 5332663). Un
procedimiento de purificación de la enzima partiendo de una cepa
sobre productora de E. coli está descrito en D. Bianchi et
al., Enzyme and Microbiological Technology 20, 1997,
368-372.
El cometido de la presente invención es poner a
disposición un procedimiento para retardar la desactivación de la
glutarilamidasa durante una catálisis enzimática.
Como puede deducirse del análisis de aminoácidos
(Tabla 1), a la glutarilamidasa (GAE) le falta el aminoácido
cisteína. Según esto el uso de reactivos tiólicos para la
estabilización no debería producir en este biocatalizador ningún
aumento de la estabilidad operacional. Sorprendentemente, en la
experimentación se pudo demostrar lo contrario. La adición de
diferentes reactivos que contenían tioles (p. ej.
2-mercaptoetanol, cisteína) dio lugar en la
GAE, dependiendo de la concentración, a un aumento drástico de la
estabilidad operacional.
De acuerdo con esto, se resuelve el cometido de
la presente invención mediante un procedimiento para retardar la
inactivación durante una catálisis enzimática de glutarilamidasa,
que se caracteriza porque la enzima se pone en contacto con al menos
un tiol. Opcionalmente, en este caso la enzima puede estar presente
en forma libre o unida a un material de soporte. Un material de
soporte preferido es, por ejemplo, un poliacrilato activado con
oxirano.
Se entiende por tiol o mercaptano un compuesto
químico tal como 2-mercaptoetanol, glutation o el
aminoácido cisteína, cuya característica común es que contienen un
grupo tiol (-SH) en la molécula. La GAE acoplada a un soporte consta
de un catalizador enzimático GAE, que se presenta unido, por
ejemplo, a poliacrilatos (= soportes) -activados con oxirano o
también aminoalquilados. En D. Bianchi et al., Enzyme and Microbial
Technology 20, 1997, 368-372, se encuentra un
procedimiento para la preparación de GAE acoplada a un soporte.
Ejemplos de soportes son Eupergit®, Amberlite® XAD7 o Duolite® A365
(todos Röhm und Haas).
La presente invención se refiere a un
procedimiento para retardar la desactivación de glutarilamidasa
durante una catálisis enzimática, que se caracteriza por que la
enzima se pone en contacto con al menos un tiol.
En una forma preferida de realización del
procedimiento la glutarilamidasa está acoplada a un soporte
polímero, que puede tratarse en especial de un poliacrilato activado
con oxirano. Preferentemente se emplea como tiol el
2-mercaptoetanol, que se emplea preferentemente en
el intervalo de concentraciones de 1 a 100 mM. En otra forma de
realización preferida del procedimiento se emplea como tiol la
cisteína, que se aplica preferentemente en el intervalo de
concentraciones de 1 a 100 mM.
Un tiol como el descrito anteriormente puede
utilizarse en forma continua o discontinua. En la utilización
continua el tiol está presente durante la reacción, mientras que en
la utilización discontinua el tratamiento se efectúa entre las
etapas de reacción. En una forma de ejecución preferida del
procedimiento de la presente invención se utiliza como sustrato
ácido
glutaril-7-aminocefalosporínico. El
ácido glutaril-7-cefalosporínico
está presente preferentemente en el intervalo de
5-500 mM.
El procedimiento de la presente invención es
especialmente adecuado para la preparación de ácido
7-aminocefalosporínico utilizando glutarilamidasa
como catalizador enzimático, efectuándose la desactivación de la
glutarilamidasa de la forma descrita anteriormente.
La invención se refiere, además, a la utilización
de al menos un tiol para retardar la desactivación de la
glutarilamidasa de acuerdo con un procedimiento tal como el
descrito anteriormente.
Una posibilidad de aplicación práctica para una
catálisis enzimática mediante glutarilamidasa consiste, por ejemplo,
en la preparación de ácido 7-aminocefalosporínico
(7-ACS) a partir de ácido
glutaril-7-aminocefalosporínico
(véase la Fig. 1). La catálisis enzimática se efectuó del modo
siguiente:
El sustrato ácido
glutaril-7-aminocefalosporínico(G-7-ACS)
a una concentración de 40 mM se hizo reaccionar, a 40ºC y pH 8,3,
en un volumen de reacción de 120 ml, con la GAE inmovilizada (de
Pseudomonas diminuta). Con ayuda de un sistema periférico
automático existía la posibilidad de medir en línea parámetros
relevantes del proceso (pH, temperatura) y controlarlos mediante
una técnica de regulación adecuada. Así, el viraje del pH a ácido
que aparece debido a la reacción se registró por auto titulación
con álcali. La velocidad de la adición de álcali se correspondía con
la velocidad de reacción y podía estimarse como medida para el
grado de reacción del sustrato
(G-7-ACS). El procesamiento de los
datos asistido por PC permitió la determinación en línea de la
transformación y estableció el criterio para la finalización de la
reacción. La finalización de la reacción se llevó a cabo cuando se
había conseguido el grado máximo de transformación. La llegada al
grado máximo de transformación se manifestaba porque ya no era
necesaria ninguna adición de álcali. Después de alcanzar el grado
máximo de transformación se separó el catalizador de la solución de
producto a través de un filtro y, a continuación, se introdujo una
nueva solución de sustrato. Los tiempos de reacción de cada una de
las reacciones consecutivas (= tandas) se pudieron registrar como
función de las tandas. Mediante regresión lineal se obtuvo una
pendiente de la recta (= coeficiente-X
[min/tanda]), que podía estimarse como medida de la desactivación
del catalizador. Cuanto menor era este valor, tanto mayor era la
estabilidad operacional del catalizador.
En varias series de ensayos se añadió a la
solución sustrato cisteína como reactivo tiólico en
diferentes concentraciones, y se llevó a cabo la reacción tal como
se ha descrito. Como puede verse en la tabla siguiente, al aumentar
la concentración de cisteína disminuía la pendiente de la
recta y con ella el coeficiente-X. Admitiendo una
desactivación lineal en las reacciones efectuadas pudo calcularse
para cada serie de mediciones el número de tandas posibles hasta
la duplicación del tiempo de reacción. Los valores se deducen de la
Tabla siguiente. Se observa un notable aumento de la estabilidad
operacional, cuando la tanda de reacción contiene adicionalmente
cisteína. Esto se manifiesta en el aumento del número de tandas de
reacción (= tandas) efectuadas, que pueden llevarse a cabo, hasta
que el tiempo de reacción se haya duplicado hasta el grado máximo
de transformación del sustrato.
Los parámetros de reacción se seleccionaron del
modo siguiente:
| V_{R} | = | 120 ml |
| T | = | 40ºC |
| pH | = | 8,3 [amoníaco 1,66%] |
| [G-7-ACS] | = | 40 mM [KPP 100 mM] |
| [cisteína]_{en \ el \ sustrato} | = | variable |
| Cantidad (GAE) | = | 500 U |
| sin | con | con | con | con | |
| cisteína | cisteína | cisteína | cisteína | cisteína | |
| [1 mM] | [6 mM] | [8 mM] | [10 mM] | ||
| Coeficiente-X [min/tanda] | 0,414 | 0,131 | 0,077 | 0,046 | 0,016 |
| Número de tandas hasta | 36 | 114 | 195 | 326 | 938 |
| duplicar el tiempo de | |||||
| reacción (con desactivación | |||||
| lineal) [-] |
Comparación del coeficiente-X
(esto es, el aumento de tiempo por tanda) para alcanzar la
transformación cuantitativa o el número de tandas hasta duplicar el
tiempo de reacción en función de la concentración de cisteína
en la solución sustrato.
El 2-mercaptoetanol como
reactivo tiólico conduce al aumento de la estabilidad operacional
de la GAE. La Tabla siguiente muestra la comparación del transcurso
de los ensayos con o sin 2-mercaptoetanol.
Los resultados con tiol muestran en cuanto a la estabilización de
la estabilidad operacional un transcurso parecido al observado con
la cisteína.
Los parámetros de reacción seleccionados se
ajustaron del modo siguiente:
| V_{R} | = | 120 ml |
| T | = | 40ºC |
| pH | = | 8,3 [amoníaco 1,66%] |
| [G-7-ACS] | = | 40 mM |
| Cantidad (GAE) | = | 500 U |
| [Mercaptoetanol] | = | 1 \mul/ml |
Tiempo de reacción hasta la transformación
cuantitativa en función del número de tandas sin o con
mercaptoetanol
| sin mercaptoetanol | con mercaptoetanol [1\mul/ml] | |
| Coeficiente-X [min/tanda] | 0,44 | 0,08 |
| Número de tandas hasta duplicar el tiempo | 41 | 225 |
| de reacción (con desactivación lineal) [-] |
Comparación del coeficiente-X
(esto es el aumento de tiempo por tanda, por consiguiente la
pendiente de la recta) para alcanzar la transformación cuantitativa
sin o con mercaptoetanol
Peso molecular = 79685,47 Número de restos =
720
Peso molecular medio por resto = 110.674 Carga =
-18
Punto isoeléctrico = 5,20
Coeficiente de extinción = 132000
| Resto | Número | Porcentaje molecular |
| A = Ala | 85 | 11,806 |
| B = Asx | 0 | 0,000 |
| C = Cys | 0 | 0,000 |
| D = Asp | 49 | 6,806 |
| E = Glu | 32 | 4,444 |
| F = Phe | 31 | 4,306 |
| G = Gly | 55 | 7,639 |
| H = His | 13 | 1,806 |
| I = Ile | 23 | 3,194 |
| K = Lys | 11 | 1,528 |
| L = Leu | 57 | 7,917 |
| M = Met | 14 | 1,944 |
| N = Asn | 30 | 4,167 |
| P = Pro | 55 | 7,639 |
| Q = Gln | 34 | 4,722 |
| R = Arg | 52 | 7,222 |
| S = Ser | 37 | 5,139 |
| T = Thr | 45 | 6,250 |
| V = Val | 49 | 6,806 |
| W = Trp | 16 | 2,222 |
| Y = Tyr | 32 | 4,444 |
| Z = Glx | 0 | 0,000 |
| A+G | 140 | 19,444 |
| S+T | 82 | 11,389 |
| D+E | 81 | 11,250 |
| D+E+N+Q | 145 | 20,139 |
| H+K+R | 76 | 10,556 |
| D+E+H+K+R | 157 | 21,806 |
| I+L+M+V | 143 | 19,861 |
| F+W+Y | 79 | 10,972 |
Claims (13)
1. Procedimiento para retardar la desactivación
de la glutarilamidasa durante una catálisis enzimática,
caracterizado porque la enzima se pone en contacto con al
menos un tiol.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque la glutarilamidasa está acoplada a un
soporte polímero.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 2,
caracterizado porque como soporte polímero se utiliza un
poliacrilato activado con oxirano.
4. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como tiol se
utiliza 2-mercaptoetanol.
5. Procedimiento conforme a la reivindicación 4,
caracterizado porque la concentración de mercaptoetanol en
la tanda de reacción se encuentra en el intervalo de 1 a 100
mM.
6. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como tiol se
utiliza cisteína.
7. Procedimiento conforme a la reivindicación 6,
caracterizado porque la concentración de cisteína se
encuentra en el intervalo de 1 a 100 mM.
8. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en la catálisis
enzimática se encuentra presente continuamente al menos un tiol en
la solución sustrato.
9. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la enzima,
después de su separación de la solución sustrato, se pone en
contacto con al menos un tiol.
10. Procedimiento conforme a una o varias de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se utiliza
ácido
glutaril-7-aminocefalosporínico como
sustrato de la catálisis enzimática.
11. Procedimiento conforme a la reivindicación
10, caracterizado porque se utiliza ácido
glutaril-7-aminocefalosporínico en
el intervalo de concentraciones de 5 a 500 mM.
12. Procedimiento para la preparación de ácido
7-aminocefalosporínico utilizando glutarilamidasa
como catalizador enzimático, caracterizado porque la
desactivación de la glutarilamidasa se retarda mediante un
procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a
11.
13. Utilización de al menos un tiol en un
procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a
12 para retardar la desactivación de la glutarilamidasa.
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