ES2209961T3

ES2209961T3 - Lipoproteina de alta densidad utilizada para luchar contra la disfuncion de un organo tras un choque hemorragico.

Info

Publication number: ES2209961T3
Application number: ES00956651T
Authority: ES
Inventors: Gillian Cockerill; Norman Miller; Christoph Thiemermann; Michelle Macdonald
Original assignee: Queen Mary and Westfiled College University of London
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-16
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2020-08-16
Also published as: EP1369124A1; GB9919713D0; DE60006548D1; DE60039130D1; EP1369124B1; EP1210105A1; AU779578B2; CA2376260C; ATE397454T1; WO2001013939A1; DE60006548T2; ATE253931T1; EP1210105B1; US6998388B1; AU6852500A; ES2307869T3; CA2376260A1; DK1210105T3

Abstract

Utilización de lipoproteína de alta densidad y/o un derivado de la misma, para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención o tratamiento de la disfunción orgánica tras un choque hemorrágico.

Description

Lipoproteína de alta densidad utilizada para luchar contra la disfunción de un órgano tras un choque hemorrágico.

La presente invención se refiere a la fabricación de medicamentos para la protección frente al daño orgánico tras un choque hemorrágico, que utiliza lipoproteínas de alta densidad (HDL) y derivados de las mismas. En particular, se refiere a la fabricación de medicamentos para el tratamiento y prevención del fallo orgánico terminal tras choque hemorrágico.

Muchas víctimas de daño físico súbito (por ejemplo, víctimas de accidentes de circulación) mueren debido al fallo orgánico terminal. En pacientes con esta condición, ocurren cambios bioquímicos y biológicos (tal como cambios hemodinámicos y formación de microtrombos) en la sangre y órganos (tal como el hígado y riñones) debido al choque y pérdida de sangre; ésta es una acción diferente al choque "endotóxico" que se produce debido a infección bacteriana. Si no se detiene o previene el fallo orgánico terminal, conducirá al fallo orgánico permanente y a la muerte del paciente. Existe una necesidad de un agente farmacéutico que pueda administrarse lo antes posible tras el daño físico, preferiblemente en el sitio del accidente, con el fin de evitar el fallo orgánico terminal, y que también pueda utilizarse posteriormente durante el transporte de la víctima desde el sitio del accidente a urgencias/hospital, y mientras se tratan las heridas físicas.

Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) forman una serie de partículas lipoproteicas que se encuentran en el suero normal. Las partículas de HDL maduras están presentes en forma de una estructura globular que contiene proteínas y lípidos. En el interior de la capa externa de estas partículas se encuentran los lípidos más polares, los fosfolípidos y colesterol libre, todos con grupos cargados que apuntan hacia fuera, hacia el ambiente acuoso. Los lípidos más hidrofóbicos, tal como el colesterol esterificado y los triglicéridos, residen en el núcleo de la partícula. Las partículas de HDL de nueva formación, o nacientes, carecen del núcleo lipídico y son de forma discoidal. Los componentes proteicos se encuentran inmersos en la capa externa. El componente proteico principal es la apolipoproteína A-I (apo A-I), con cantidades menores de apo A-II, apo A-IV, apo CIII, apo D, apo E y apo J. Otras diversas proteínas residen sobre la partícula de HDL, tal como la lecitin-colesterol acetil transferasa, la PAF acetilhidrolasa y la paraoxonasa.

La unión de leucocitos activados al endotelio es el suceso celular observable más temprano en una serie de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas. La unión está mediada por la expresión de moléculas de adhesión sobre la superficie de las células endoteliales que se unen a moléculas correspondientes de función similar sobre los leucocitos. Recientemente se ha demostrado que el pre-tratamiento de células endoteliales in vitro con HDL fue capaz de inhibir la expresión inducida por citoquinas de estas moléculas de adhesión (Cockerill G.W., Rye K-A, Gamble J.R., Vadas M.A., Barter P.J., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1995, 15:1987-1994, 1995; Cockerill G.W., Reed S., Int. Rev. Cytol: A survey of cell biology, 1999). Además, recientemente hemos demostrado que los HDL pueden inhibir la expresión de moléculas de adhesión inducida por citoquinas en un modelo de inflamación aguda en cerdo (Cockerill et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1999, 19, 910-917). Los efectos antiinflamatorios de los HDL han sido demostrados de esta manera en estos modelos en los que se pre-trataban células/animales con lipoproteínas.

La solicitud de patente nº EP-A-0 780 128 da a conocer la utilización de HDL en combinación con derivados de ácido crotónico para el tratamiento de diversas enfermedades, entre ellas el rechazo agudo de transplante.

La patente nº JP-A-10025248 da a conocer la utilización de apolipoproteína AI para el tratamiento de la restenosis tras angioplastia.

La patente nº WO-A-9706822 da a conocer un método de reducción de la probabilidad de incidencia de fallo orgánico tras un suceso politraumático, que comprende la administración de un anticuerpo anti-selectina.

El fallo orgánico terminal tras el choque hemorrágico resulta de la adhesión de los leucocitos polimorfonucleares (PMN) al endotelio tras su activación, causada por la isquemia y daño por reperfusión. Ahora se ha descubierto que la administración de HDL, o derivados de las mismas, evita el fallo orgánico terminal tras el choque hemorrágico.

Según la presente invención, se utilizan lipoproteínas de alta densidad,y/o derivados de las mismas, en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la disfunción orgánica tras el choque hemorrágico.

Preferentemente, el medicamento es para el tratamiento del daño o fallo orgánico terminal.

Hemos demostrado que, tras el choque hemorrágico, las HDL son capaces de alterar los efectos dañinos cuando se proporcionan cuando ya ha ocurrido la hipovolemia inicial. Nuestro trabajo sugiere que, a los niveles fisiológicos (in vitro e in vivo), las partículas nativas de HDL son activas en la inhibición de la expresión de proteínas de adhesión sobre células endoteliales. La prevención de la expresión de proteínas de adhesión sobre las células endoteliales evita la unión de los PMN al endotelio; la administración de HDL evita de esta manera el fallo orgánico terminal.

La lipoproteína de alta densidad puede ser el componente de las HDL que inhibe la adhesión a las células endoteliales y la posterior activación de los leucocitos, o de un derivado, molécula, homólogo, o mimético de los mismos.

\newpage

El efecto inhibitorio no sólo está presente en células endoteliales venosas sino también sobre células endoteliales arteriales y es independiente de la naturaleza del lípido presente en las partículas de HDL. Dos moléculas efectoras intermedian en el efecto inhibitorio, la apolipoproteína A-I (apo A-I) y la apolipoproteína A-II (apo A-II) (Brouillette C.G. y Anatharamaiah G.M:, Biochem. Biophys. Acta. 1256:103-129, 1995; Massey J.B., Pownall H.J., Biochem. Biophys. Acta. 999:111-120, 198); estas dos moléculas tienen diferente eficacia de inhibición.

Preferentemente, la lipoproteína de alta densidad o derivado de la misma es un péptido o derivado proteico de la secuencia de apo A-I o apo A-II, o un péptido o derivado proteico funcionalmente homólogo con las partes activas de apo A-I o apo A-II.

El medicamento puede administrarse a un paciente de cualquier manera convencional. Preferentemente, el medicamento se administra intravenosamente. Preferentemente, el medicamento se administra utilizando solución salina como vehículo.

Preferentemente, el medicamento se proporciona en un dispensador portátil, por ejemplo para su utilización en el sitio de un accidente.

A continuación, se ilustra la presente invención con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Figura 1 muestra alteraciones en la presión sanguínea arterial media (MAP) en ratas sometidas a (i) procedimiento quirúrgico sin provocar hemorragia y tratadas con vehículo para HDL (FALSO, rombos vacíos, solución salina, 3 mg/kg bolus i.v.; n=9)

o (ii) hemorragia durante 1,5 horas, y tras resucitación con la sangre perdida, se trataron las ratas de control con el vehículo (HS círculos vacíos, solución salina 3 ml/kg bolus i.v.; n=10)

ó HDLn (HS-HDLn, triángulos vacíos, inyección i.v. de bolus de 80 mg/kg)[HDLn = HDL nativo]

Figura 1A muestra una Tabla de tasa cardíaca en latidos por minuto (lpm) en todos los grupos experimentales estudiados previamente a la hemorragia -1,5 h y 1, 2, 3 y 4 horas tras la resucitación, Grupo 1 (FALSO): las ratas se sometieron al procedimiento quirúrgico sin causar hemorragia y se trataron con un vehículo para HDL (solución salina, bolus i.v. de 1 ml/kg seguido de una infusión i.v. de 1,5 ml/kg/h; n=9);

Grupo 3 (HS): las ratas se sometieron a una hemorragia durante 1,5 horas y tras la resucitación con la sangre perdida, se les proporcionó una infusión de 1,5 ml/kg/h i.v., n=9); Grupo 5 HS-HDLn: las ratas se sometieron al mismo procedimiento que el grupo 3, pero se trataron con HDLn (inyección i.v. de bolus de 80 mg/kg seguido de una infusión i.v. de solución salina 1,5 ml/kg/h; n=9) previamente a la resucitación. No se dieron diferencias significativas en las tasas cardíacas entre cualesquiera de los grupos experimentales.

Figura 2 muestra los niveles en plasma de (A) urea, (B) creatina, (C) AST, (D) ALT, (F) creatinina quinasa (CQ) y (E) lipasa, en ratas sometidas al procedimiento quirúrgico y al experimento 2 descrito posteriormente;

Figura 3 muestra el efecto de la infusión de HDL en secciones histológicas de pulmón, intestino y riñón tras el choque hemorrágico;

Figura 4A muestra el efecto de las HDL sobre los niveles de mieloperoxidasa (MPO) en el pulmón para medir la activación de neutrófilos;

Figura 4B muestra el efecto de las HDL sobre los niveles de MPO en el riñón;

Figura 5A muestra el efecto de las HDL sobre el nivel de malonaldehído (MAD) enel pulmón;

Figura 5B muestra el efecto de las HDL sobre el nivel de malonaldehído en el riñón;

Figura 6 muestra un gráfico de la intensidad media de fluorescencia (dependiente de la inhibición de la selectina E), como se describe posteriormente;

Figura 7A muestra un gráfico de la intensidad media de fluorescencia de HUVEC (EC venosa) frente a concentración de lipoproteínas apo A-I y apo A-II, para el experimento 3, posteriormente; y

Figura 7B muestra un gráfico de la intensidad media de fluorescencia de HuAEC (EC arterial) frente a la concentración de lipoproteína apo A-I y apo A-II para el experimento 3, posteriormente.

Como demostración de una realización de la invención, el Experimento 1 describe los efectos de la lipoproteína humana de alta densidad (HDL) sobre el fallo circulatorio y el daño de disfunción orgánica múltiple (MODS), tal como la disfunción renal y disfunción hepática causadas por hemorragia severa, y la resucitación de rata anestesiada. Debe remarcarse que éste es un modelo de fallo orgánico terminal generado por choque hemorrágico, y no se conoce que sea resultado de la liberación de endotoxinas.

Todos los experimentos descritos en el presente documento se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del National Institute of Health para la utilización de animales experimentales y de acuerdo con Home Office Guidance on the Operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, publicado por HMSO, Londres.

Experimento 1

El estudio se llevó a cabo sobre ratas Wistar (Tuck, Rayleigh, Essex, Reino Unido) que pesaban 250 mg-320 g y que recibían una dieta estándar y agua ad libitum. Todos los animales se anestesiaron con tiopentona (120 mg/kg i.p.) y se mantuvo la anestesia mediante inyecciones suplementarias de tiopentona según se requirió. Se canuló la tráquea para facilitar la respiración y se mantuvo la temperatura rectal a 37ºC con una manta homeotérmica. Se cateterizó la arteria femoral derecha y se conectó a un transductor de presión (Senso-Nor 840, Senso-Nor, Horten, Noway) para medir la presión sanguínea arterial fásica y media (MAP) y la tasa cardíaca (HR). Estas mediciones se visualizaron en un sistema de adquisición de datos (MacLab 8e, ADI Instruments, Hasting, Reino Unido) instalado en un ordenador Apple Macintosh. Se canuló la arteria carótida derecha para sangrar los animales (ver a continuación en el presente documento). Se canuló la vena yugular para la administración de fármacos. También se canuló la vejiga para facilitar el flujo de orina y evitar la posibilidad del desarrollo de fallo post-renal. Tras completar el procedimiento quirúrgico, se permitió la estabilización de los parámetros cardiovasculares durante 15 minutos. A continuación, se retiró sangre por el catéter situado en la arteria carótida con el fin de conseguir una caída en la MAP hasta 50 mmHg en 10 minutos. A continuación, se mantuvo la MAP a 50 mmHg durante un periodo total de 90 minutos mediante retirada (durante el periodo de compensación) o re-inyección de sangre. Debe remarcarse que en estos experimentos la cantidad de sangre perdida que se re-inyectó durante el periodo de 90 minutos de hemorragia no excedió el 10% de la cantidad total de sangre retirada. La cantidad de sangre retirada en ratas sometidas a hemorragia y tratadas con vehículo (grupo de control) fue de 7,0 \pm 0,4 ml (SD); la cantidad de sangre retirada de ratas sometidas a hemorragia y tratadas con HDL (grupo de tratamiento) fue de 7,0 \pm 0,3 ml (p>0,05). 90 minutos después de iniciarse la hemorragia, se re-inyectó en el animal la sangre perdida y un volumen equivalente de solución lactato de Ringer.

Se muestran los resultados en las figuras 1, 1A (Tabla 1), 2, 3 y 4.

La Figura 2 muestra los niveles en plasma de (A) urea, (B) creatinina, (C) AST, (D) ALT, (F) creatinina quinasa (CQ), y (E) lipasa en ratas sometidas a (i) FALSO, el procedimiento quirúrgico sin causar una hemorragia y tratadas con vehículo para HDL (falso+solución salina, solución salina, bolus i.v. de 3 ml/kg; n=9), o (ii) hemorragia durante 1,5 horas y, tras la resucitación con la sangre perdida, tratamiento de las ratas de control con el vehículo (hs{+solución salina}, bolus i.v. de solución salina 3 ml/kg, n=9) o HDLn (HS-HDLCn, inyección i.v. de bolus 80 mg/kg, n=9). Los regímenes de administración se describen en mayor detalle en el texto que acompaña a la figura 1A. La hemorragia y resucitación resultaron en incrementos significativos en los niveles séricos de urea y creatinina (n=9), como demuestra el incremento en la concentración de urea y creatinina entre "falso" y hs (control). Esta disfunción renal quedó atenuada por la administración (5 minutos antes de la resucitación) de HDL (80 mg/kg, i.v., n=9; p=0,05; ANOVA seguido de test de Dunnett para comparaciones múltiples), como demuestra la concentración de urea y creatinina para HS-HDLn. De manera similar, las HDL atenuaron el daño hepático (según seguimiento del incremento en AST y ALT séricos) -(C) y (D)- y el daño pancreático (según atestigua el incremento en lipasa sérica -(E)) causado por la hemorragia y resucitación. En contraste, las HDLn no afectaron al daño circulatorio retardado asociado con la hemorragia y resucitación (ver figura 1 y figura 1A (Tabla 1)). La administración de HDL a ratas no sometidas a hemorragia no resultó en alteraciones en los niveles séricos de urea, creatinina, AST, ALT o lipasa (n=4) y, por lo tanto, no resultó tóxico a la dosis utilizada.

El tratamiento con HDL redujo la disfunción orgánica según mediciones del grado de alteración de la arquitectura de los tejidos

Microscopía óptica: Se realizaron biopsias de órganos (pulmón, riñón e intestino delgado) al final del Experimento 1 y se fijaron durante una semana en solución tamponada de formaldehído (10% en PBS) a temperatura ambiente, se deshidrataron con etanol en gradación creciente, y se incluyeron en Paraplast^{TM} (Sherwood Medical, Mahwah, NJ, USA). Se desparafinaron secciones (de 7 \mum de grosor) con xileno, y se tiñeron utilizando tricromía Van Gieson o fucsina, y se examinaron utilizando microscopía óptica (Dialux 22, Leitz).

Figura 3: muestra fotomicrografías de secciones representativas de pulmón (paneles superiores), intestino delgado (paneles intermedios), y riñón (paneles inferiores) de animales tras hemorragia durante 90 minutos que recibieron vehículo (solución salina) junto con la sangre perdida al inicio de la resucitación (A), o HDLCn (inyección intravenosa de bolus de 80 mg/kg) previamente a la resucitación (B).

Las secciones se visualizaron utilizando tinción tricrómica de Van Geison. Magnificación original x100.

En comparación con los órganos obtenidos de ratas operadas falsamente, que no habían sido sometidas a hemorragia y resucitación (datos no mostrados), la figura 3 demuestra que el pulmón (paneles superiores), intestino delgado (paneles intermedios) y riñón (paneles inferiores), al someterse a hemorragia y resucitación (A), mostraban edema con pérdida de la estructura normal del tejido. En contraste, los órganos procedentes de animales que habían recibido HDLn (B) previamente a la resucitación no mostraron cambios significativos en morfología, y no eran significativamente diferentes de las ratas falsamente operadas (no se muestra).

Los HDL redujeron la infiltración de neutrófilos en los pulmones y riñones tras hemorragia y resucitación

La actividad de la mieloperoxidasa (MPO), un indicador de la acumulación de leucocitos polimorfonucleares (PMN), se determinó como se ha descrito anteriormente [Anderson, B.O.; Brown, J.M.; Shanley, P.F.; Benserd, D.D. y Harken, A.H. (1991, Marginating neutrophils are reversibly adherent to normal lung endothelium, Surgery 109:51-61). Se obtuvieron y pesaron muestras de pulmón y riñón. Cada trozo de tejido se homogeneizó en una solución que contenía bromuro de hexadecil-trimetil-amonio al 0,5% disuelto en tampón fosfato potásico 10 mM (pH 7,0) y se centrifugó durante 30 minutos a 20000xg a 4ºC. Se permitió que una alícuota del sobrenadante reaccionase con una solución de tetra-metil bencidina (1,6 mM) y H_{2}O_{2} 0,1 mM. Se midió espectrofotométricamente a 650 nm la tasa de cambio de la absorbancia. Se definió 1 mU de actividad MPO como la cantidad de enzima que degradaba 1 \mumol de peroxidasa por minuto a 37ºC, y se expresó en mU por miligramo de tejido húmedo.

Figura 4: Gráfico que muestra el efecto de los HDL sobre los niveles de mieloperoxidasa (MPO) en (A) pulmón, o (B) riñón, como medida de la actividad de los neutrófilos. Los valores son medias y errores estándar, n=9; *p<0,05 en la comparación con los choques hemorrágicos (HS).

La capacidad de los HDL de inhibir la expresión de moléculas de adhesión en este modelo se encuentra fuertemente respaldada por los datos séricos e histología. Además, se investigó la capacidad de los HDL de inhibir la infiltración de neutrófilos mediante la medición de los niveles MPO en el pulmón (figura 4A) y en el riñón (figura 4B). En comparación con los tejidos obtenidos de ratas falsamente operadas, las ratas sometidas a hemorragia y resucitación (barras rellenas) mostraron un incremento en la actividad MPO de los tejidos. Esta actividad se había reducido en ratas tratadas con HDLn previamente a la resucitación con sangre perdida.

Los HDL redujeron los niveles de malondialdehído en pulmones y riñones tras hemorragia y resucitación

Determinación del malondialdehído: Se determinaron los niveles de malondialdehído (MDA) en el pulmón y riñón como indicador de la peroxidación de lípidos. Se homogeneizaron los tejidos en solución KCl al 1,15%. Se añadió una alícuota (100 \mul) del homogenato a una mezcla de reacción que contenían 200 \mul de SDS al 8,1%, 1500 \mul de ácido acético al 20% (pH 3,5), 1500 \mul de ácido tiobarbitúrico al 0,8% y 700 \mul de agua destilada. A continuación, se hirvieron las muestras durante 1 hora a 95ºC y se centrifugaron a 3.000xg durante 10 minutos. Se midió espectrofotométricamente a 650 nm la absorbancia del sobrenadante.

Figura 5: Gráfico de barras que muestra el efecto de los HDL sobre el nivel de malondialdehído (MAD) en pulmón (A) y (B) en el riñón, como medida de las propiedades antioxidantes de los HDL. Los valores son medias y errores estándar, n=9; *p<0,05 en la comparación con el choque hemorrágico (HS).

Se ha demostrado que los HDL tienen propiedades antioxidantes. Se investigó la capacidad de los HDL de influir sobre los niveles de MDA en el pulmón (figura 5A) y en el riñón (figura 5B). En comparación con los tejidos obtenidos de ratas falsamente operadas, las ratas sometidas a hemorragia y resucitación (barras rellenas) mostraron un marcado incremento en la actividad de MDA en los tejidos. Esta actividad se vio reducida en ratas tratadas con HDLn previamente a la resucitación [HS-HDLn].

En conclusión, la administración de HDLn atenúa la disfunción renal, hepática y pancreática tras el choque hemorrágico.

Experimento 2

Este experimento demuestra qué componentes del agente terapéutico efectivo (HDL) son responsables de la protección contra el choque hemorrágico; en este experimento se compara la capacidad del HDL nativo de inhibir la expresión inducida por citoquinas de la molécula de adhesión sobre las células endoteliales, con la capacidad de la proteína apo A-I libre de lípidos o de las vesículas de lípidos libres de proteínas.

Cultivo celular: Se cultivaron células endoteliales humanas venosas (HUVEC) y arteriales (HUAEC) derivadas de cordón umbilical (Cockerill, G.W.; Meyer, G.; Noack, L.; Vadas, M.A.; Gamble, J.R. Lab. Invest. 71:497-509, 1994) en frascos de cultivo de tejido recubiertos de gelatina (Costar, High Wycombe, Bucks, Reino Unido) en medio 199 con sales de Earle (Gibco, Paisley, Escocia) suplementadas con suero de feto bovino (FCS) al 20% (Gibco, Australia), HEPES 20 mM, glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales, penicilina y estreptomicina, 50 \mug/ml de suplemento de cultivo celular endotelial (Sigma, Dorset, Reino Unido) y 50 \mug/ml de heparina (medio normal de cultivo).

Citometría de flujo: Se prepararon placas con 1 x 10^{5} células/pocillo de 30 mm y se incubaron durante la noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. A continuación, se incubaron cultivos monocapa confluentes (a las concentraciones indicadas) durante 19 horas con solución tampón fosfato salina (PBS)(vehículo de control), HDL nativo, apo A-I nativo, vesículas fosfolipídicas o HDL discoidal preparado con solamente apo A-I o apo A-II. Tras estos tratamientos, las células se lavaron suavemente en medio completo y se añadieron 10 ng/ml de TNF\alpha (Miles Scientific). A continuación, se tiñeron las células 4 horas después de la estimulación, de la manera siguiente. Se lavaron las células en medio libre de suero y se añadieron 200 \mul de selectina anti-E (1,2B6) durante 1 hora a 37ºC. A continuación, se lavaron las células en solución tampón fosfato salina (PBS) que contenía suero bovino de neonato al 5%, y se añadió azida sódica al 0,02%, y 200 \mul de anticuerpo secundario conjugado con isotiocinato de fluoresceína durante 1 hora a 37ºC. A continuación, se lavaron las células tres veces en PBS y se tripsinizaron, centrifugando a continuación para formar un pellet. A continuación, se resuspendió el pellet en formaldehído al 2,5% en PBS que contenía glucosa al 2% y azida al 0,02% y se analizó en un citómetro de flujo Coulter Epics Profile II.

Figura 6: muestra que ni apo A-I libre, ni vesículas unilamelares (SUV) fueron capaces de inhibir la expresión de selectina E inducida por TNF\alpha. Esto sugiere que Apo A-I, la apolipoproteína más abundante en HDL, debe encontrarse en una partícula lipídica para poder mediar en la inhibición de la expresión de moléculas de adhesión inducida por citoquinas en células endoteliales. Las células endoteliales humanas de cordón umbilical venosas (HUVEC) y arteriales (HUAEC) fueron capaces de dar soporte a la inhibición dosis-dependiente por HDL de la expresión de selectina E inducida por citoquinas (como demuestra la reducción en intensidad con el incremento de apo AI HDL de 0,25 a 1,0 mg/ml).

La acción terapéutica de HDL la proporciona la apolipoproteína que se presenta en las partículas lipídicas, y no puede mimetizarse con la proteína completa o con el lípido por sí solos.

Experimento 3

Con el fin de determinar la eficacia de las partículas discoidales de HDL reconstituidas que contienen cualquiera de las apolipoproteínas más abundantes (apo A-I ó apo A-II), se llevó a cabo la comparación de la capacidad de estas partículas de inhibir la expresión de moléculas de adhesión inducida por citoquinas en HUVEC y HUAEC.

Cultivo celular: Se cultivaron células endoteliales humanas venosas (HUVEC) y arteriales (HUAEC) derivadas de cordón umbilical (Cockerill et al., 1994) en frascos de cultivo de tejido recubiertos de gelatina (Costar, High Wycombe, Bucks, Reino Unido) en medio 199 con sales de Earle (Gibco, Paisley, Escocia), suplementado con suero de feto bovino (FCS) al 20% (Gibco, Australia), HEPES 20 mM, glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales, penicilina y estreptomicina, 50 \mug/ml suplemento de crecimiento celular endotelial (Sigma, Dorset, Reino Unido) y 50 \mug/ml de heparina (medio de cultivo normal).

Citometría de flujo: Se prepararon placas de 1 x 10^{5} células/pocillo de 30 mm y se incubaron durante la noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. A continuación, se incubaron cultivos monocapa confluentes (a las concentraciones indicadas) durante 19 horas con HDL discoidal reconstituido o con solamente apo A-I o apo A-II. Tras estos tratamientos, las células se lavaron suavemente en medio completo y se añadieron 10 ng/ml de TNF\alpha (Miles Scientific). Con posterioridad, se tiñeron las células cuatro horas después de estimulación en la manera descrita a continuación. Se lavaron las células en medio libre de suero y se añadieron 200 \mul de selectina anti-E (1,2B6) durante 1 hora a 37ºC. Después, se lavaron las células en solución tampón fosfato salina (PBS) que contenía suero bovino de neonato al 5%, azida sódica al 0,02%, y se añadieron 200 \mul de anticuerpo secundario conjugado con isotiocianato de fluoresceína durante 1 hora a 37ºC. A continuación, se lavaron las células tres veces en PBS y se tripsinizaron. A continuación, se resuspendió el pellet en formaldehído en PBS al 2,5% que contenía glucosa al 2% y azida al 0,02% y se analizó en un citómetro de flujo Coulter Epics Profile II.

Preparación de partículas reconstituidas de HDL: Se preparó HDL A-I discoidal reconstituido mediante el método de diálisis del colato a partir de fosfatidicolina de yema de huevo, colesterol no esterificado, y apo A-I/apo A-II (Matz, C.E.; Jonas, A., Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidycholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersion. J. Biol. Chem. 1982; 257:4535-4540). Se obtuvo la fosfatidicolina de yema de huevo, colesterol no esterificado y colato sódico de Sigma y se utilizó sin purificación adicional. Se midió el tamaño de partícula mediante electroforesis de gel gradiente no desnaturalizante, y se midió la concentración de apo A-I y apo A-II por inmunoturbidimetría.

Resultados: Las partículas reconstituidas de HDL discoidal que contenían apo A-I (cuadrados vacíos) o apo A-II (cuadrados rellenos), como proteína única, fueron capaces de inhibir la expresión inducida por TNF\alpha de células endoteliales arteriales y venosas VCAM-1. Las figuras 7a (HUVEC) y 7b (HuAEC) muestran HDL reconstituido que contiene apo A-I, como únicas proteínas, con una t_{1/2} máximo de aproximadamente 3 \muM, mientras que HDL reconstituido que contenía apo A-II como única proteína tenía un t_{1/2} máximo aproximadamente 5 veces mayor de 15 \muM.

Conclusión: La acción terapéutica de HDL puede mimetizarse mediante la utilización de apo A-I ó apo A-II en partículas de lipoproteína reconstituida.

Claims

1. Utilización de lipoproteína de alta densidad y/o un derivado de la misma, para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención o tratamiento de la disfunción orgánica tras un choque hemorrágico.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el medicamento está destinado al tratamiento del daño o fallo orgánico terminal.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que la lipoproteína de alta densidad, o un derivado de la misma, es un péptido o derivado proteico de la secuencia de la apolipoproteína A-I o de la apolipoproteína A-II, o un péptido o derivado proteico funcionalmente homólogo con las partes activas de la apolipoproteína A-I o de la apolipoproteína A-II.

4. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que la lipoproteína de alta densidad es HDL nativo.