ES2210249T3

ES2210249T3 - Vacuna alogenica y metodo para su sintesis.

Info

Publication number: ES2210249T3
Application number: ES94909636T
Authority: ES
Inventors: Bernd Gansbacher
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1993-02-17
Filing date: 1994-02-17
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2014-02-17
Also published as: CA2156273C; AU6240594A; NZ262630A; EP0684831A4; AU693435B2; DE69433110T2; EP0684831B1; DE69433110D1; EP0684831A1; WO1994018995A1; US20050249711A1; CA2156273A1; US20110257367A1; ATE248914T1

Abstract

EN ESTA INVENCION SE PRESENTA UN VECTOR RETROVIRAL QUE CONTIENE (A) UN 3''LTR; Y (B) UN INSERTO QUE TIENE (I) UN PROMOTOR, (II) UNA SECUENCIA QUE CODIFICA UNA INMUNOMOLECULA SELECCIONADA DEL GRUPO QUE CONSISTE EN CITOQUINAS, MOLECULAS DE ADHESION, FACTORES CONSTREÑIDORES, ANTIGENOS ASOCIADOS A TUMORES Y ANTIGENOS ESPECIFICOS A TUMORES Y (II) UNA SEÑAL POLI A, RESPECTIVAMENTE, EN DONDE DICHO PROMOTOR, LA SECUENCIA QUE CODIFICA UNA INMUNOMOLECULA Y LA SEÑAL POLI A SE ENCUENTRAN ALINEADOS EN UNA ORIENTACION 5'' A 3'', EL INSERTO SE COLOCA DENTRO DEL 3''LTR EN UNA ORIENTACION OPUESTA A LA DEL 3''LTR. EN ESTA INVENCION TAMBIEN SE PRESENTA UNA CELULA GENETICAMENTE MANIPULADA UTIL PARA EL TRATAMIENTO O PREVENCION DE UN TUMOR MALIGNO EN UN PACIENTE QUE A) EXPRESA AL MENOS UNA INMUNOMOLECULA SELECCIONADA DEL GRUPO QUE CONSISTE EN CITOQUINAS, MOLECULAS DE ADHESION, FACTORES CONSTREÑIDORES, ANTIGENOS ASOCIADOS A TUMORES Y ANTIGENOS ESPECIFICOS A TUMORES; Y B) ES ALOGENICA AL PACIENTE.

Description

Vacuna alogénica y método para su síntesis.

Antecedentes de la invención

Las estrategias terapéuticas actuales para el melanoma metastásico son inadecuadas. Las estrategias terapéuticas que pretenden amplificar la respuesta inmune del propio paciente han recibido una considerable atención basándose en las evidencias en modelos animales de respuestas inmunes protectoras frente a la exposición a células tumorales después de una inmunización apropiada (Borberg et al., 1972; Smith et al., 1977; Fernandez-Crus et al., 1979; Cheever et al., 1980; Shu et al., 1985).

Aunque que los protocolos de vacunación en pacientes con cáncer no han mostrado un claro impacto sobre la supervivencia del paciente, las evidencias de varios ensayos sugieren que pacientes que desarrollan respuestas inmunes tienen un aumento significativo de la supervivencia sin enfermedad y de la supervivencia total en comparación con los que no responden (Livingston, 1991; Livingston et al., 1985a; Livingston et al., 1985b; Livingston et al., 1987; Livingston et al., 1979; Livingston et al., 1983; Livingston y Watanabe, 1982; Livingston et al., 1985c). Un objetivo principal de los ensayos de vacunación ha sido inducir respuestas serológicas y citotóxicas de células T (CTL). Aunque la sangre y los infiltrados pulmonares en pacientes con melanoma y carcinoma renal contienen células precursoras citotóxicas circulantes con reactividad restringida para el melanoma autólogo (Darrow et al., 1989; Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Kawakami et al., 1992; Crowley et al., 1992) y carcinomas renales (Belldegrun et al., 1990; Radrizzani et al., 1989; Belldegrun et al., 1989; Ikemoto et al., 1992; Belldegrun et al., 1988; Koo et al., 1991; Alexander et al., 1990), ha sido difícil demostrar que la vacunación induce o amplifica las respuestas serológicas o CTL. Existen varias hipótesis, tales como que las células tumorales son células presentadoras de antígenos deficientes, tienen pocas o ausencia de moléculas MHC expresadas en la superficie celular, secretan factores supresores o que el compromiso del receptor de la célula T (TCR) por los antígenos tumorales sin una señal coestimuladora induce anergia. La IL-2 puede revertir dos de estos mecanismos. En primer lugar, la IL-2 puede revertir la supresión de las respuestas CTL inducidas por el factor de crecimiento tumoral \beta (TGF-\beta) (Inge et al., 1992). En segundo lugar, el compromiso del TCR sin una señal proliferativa puede inducir anergia, pero la presencia de IL-2 puede prevenir el desarrollo de esta anergia (Harding et al., 1992; Liu et al., 1992).

Algunos estudios han demostrado que la introducción de genes de citoquinas en células tumorales murinas inducía el incremento de la inmunogenicidad y el descenso de la tumorogénesis (Gansbacher et al., 1990a; Fearon et al., 1990; Ley et al. 1991; Watanabe et al., 1989; Gansbacher et al., 1990b; Gansbacher et al., 1992; Tepper et al., 1989; Hock et al., 1991; Porgador et al., 1992). La secreción de IL-2 o de IFN-\gamma por un fibrosarcoma murino condujo a una respuesta mediada por células T que tuvo como resultado el rechazo del tumor (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b). El melanoma humano (Crowley et al., 1990) es un candidato especialmente prometedor para esta estrategia de inmunización activa. Pueden generarse clones de células T citotóxicas específicos para células de melanoma autólogo en pacientes estimulando células mononucleares de sangre periférica con células tumorales en presencia de IL-2. Además, se han identificado antígenos de melanoma compartidos reconocidos por CTL en el contexto de los haplotipos de MHC específicos (por ejemplo, HLA-A1 y HLA-A2) (Darrow et al., 1989; Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Kawakami et al., 1992; Crowley et al., 1992). Recientemente, se ha clonado un gen que codifica para un antígeno de melanoma reconocido por CTL autólogos a partir de una biblioteca de cósmidos obtenida a partir del ADNc de células de melanoma (Van Der Bruggen et al., 1991). Estos estudios y otros proporcionan evidencias de que existen epítopos de melanoma compartidos que son reconocidos por células T, lo que supone que las células alogénicas de melanoma podrían ser adecuadas para usarse en protocolos de vacunación (Crowley et al., 1990; Wolfel et al., 1989; Knuth et al., 1989).

Basándose en las evidencias de que existen antígenos tumorales compartidos en los melanomas (Crowley et al., 1990; Kawakami et al., 1992; Wolfel et al., 1989; Knuth et al., 1989), que la secreción de citoquinas por las células tumorales incrementa la inmunogenicidad (Inge et al., 1992; Harding et al., 1992; Liu et al., 1992; Gansbacher et al., 1990a; Feraon et al., 1990; Ley et al., 1991; Watanabe et al., 1989; Gansbacher et al., 1990b; Gansbacher et al., 1992; Tepper et al., 1989; Hock et al., 1991), que la frecuencia de precursores de CTL en pacientes con melanoma puede ser tan alta como de 1:900 (Coulie et al., 1992), y que la secreción in vivo de IL-2 por las células tumorales incrementa la frecuencia de precursores citotóxicos circulantes y de CTL específicos para la inmunización tumoral en un modelo murino (Ley et al., 1991), el solicitante decidió usar la tecnología de transferencia génica para inducir la secreción de IL-2 o IFN-\gamma en células de melanoma. Estas células se podrían administrar a pacientes con HLA compatibles apropiados y conducir a la amplificación de precursores de células T citotóxicas existentes.

Una clara característica de esta invención es que se usa una vacuna alogénica que expresa al menos una inmunomolécula seleccionada entre el grupo formado por citoquina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor, en lugar de la estrategia de vacuna singénica descrita previamente.

Breve descripción de las figuras

Figuras 1A y 1B: Estructura de los vectores retrovirales que contiene los ADNc de la IL-2 o del IFN-\gamma humanos. (Si se desean detalles adicionales véase la sección de Materiales y métodos en la primera serie de experimentos).

Figura 2: Análisis por transferencia de Southern de SK-MEL-29 transducido. El ADN genómico se escindió con Bgl II, se sometió a electroforesis, se transfirió y se incubó con la sonda del ADNc de NeoR. Como control de tamaño, se mezcló el plásmido DC/AD/R/IL2 cortado con SpeI con el ADN de SK-MEL-29. BgI II corta una vez en el polienlazador de la región 3' LTR.

Figura 3: Análisis por transferencia de Northern del ARNm poli(A) de células SK-MEL-256 transducidas. El ARN poli(A), fraccionado en un gel de formaldehído/agarosa al 1% y transferido a filtros de nylon, se hibridó con una sonda específica de MoMuLV U3. "V" y "N" son transcritos iniciados de LTR, el virión de ARN no ayustado (V) y el ARNm de Neo ayustado (N). "P" es un transcrito de ARN iniciado por promotor interno.

Figura 4: Secreción de IL-2 por células SK-MEL-256 irradiadas y SK-MEL-245. Un millón de células SK-MEL-256 o SK-MEL-245 se pusieron en una placa de 60 mm, se irradiaron con 5.000 ó 10.000 rad y se recogió el sobrenadante cada 3 días. Se determinó la IL-2 en el sobrenadante de ensayo usando un bioensayo y un ELISA como se describe en Materiales y métodos.

Figuras 5A a 5D: Expresión de MHC de clase I de células SK-MEL-131, SK-MEL-19, SK-MEL-245 y SK-MEL-256 parentales y secretoras de citocina. Las células vivas se marcaron con el anticuerpo monoclonal W6/32 dirigido contra un determinante monomórfico de la molécula de MHC de clase I, seguido del anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón purificado por afinidad y conjugado con fluoresceína isotiocianato (GaM-FITC) y analizado con un clasificador de células activadas por fluorescencia EPICS V (Coulter Electronics, Inc.).

Figura 6. Ensayo de amplificación de NIH3T3. Se hizo RT en los sobrenadantes recogidos de las células que habían sido transducidas 28 días antes. SK-MEL-29, SK-RC-28 y SK-RC-39: sobrenadantes tomados de las líneas celulares de carcinoma renal y melanoma transducidos con DC/AD/R/IL2. SAX-2: SN de las células NIH3T3 transducidas con SAX-2 y de las que se sabe tienen un virus auxiliar. La línea celular empaquetadora para generar SAX-2 fue PA 317. SN 3T3: SN tomado de las células NIH3T3 no transducidas. AM12/DC/AD/R/IL2 SN 3T3: SN tomado de las células 3T3 transducidas con DC/AD/R/IL2. AM12/ETAR29: SN tomado de la línea celular productora AM12/ETAR29.

Figura 7: Estructura de los vectores retrovirales que contiene el ADNc humano de IL-2 o de IFN-\gamma (para detalles véase Materiales y métodos en la tercera serie de experimentos).

Figura 8: Detección de retrovirus murinos competentes de replicación usando el ensayo de amplificación de NIH3T3. No se pudo detectar actividad transcriptasa inversa en los sobrenadantes de los cultivos celulares obtenidos de las células NIH3T3, los cuales habían sido expuestas a sobrenadantes de las líneas celulares de RC transducidas SK-RC-9, SK-RC-28, SK-RC-29 y SK-RC-39, y la línea celular productora AM12 que porta la construcción del vector DC/AD/R/IL2. Los cultivos de la línea celular productora AM12/ETAR29 y de las líneas productoras de virus auxiliares SAX-2 y SAX-3 se usaron como controles positivos. Medios consumidos por las células NIH/3T3 sin modificar (controles 1 y 2) o medio de Eagle modificado por Dulbecco solo sirvieron como controles negativos.

Figuras 9A a 9 C: Supervivencia de las células SK-RC-29 después de la irradiación in vivo con 5.000 ó 10.000 rad: se pusieron 0,25 x 10^{6} células tumorales en placas por duplicado irradiadas con 5.000 ó 10.000 rad (día 0), y se tripsinizaron 1, 12 y 22 días después de la irradiación. El porcentaje de células viables se comprobó por tinción con azul de tripan usando un hemocitómetro. Los círculos rellenos indican las células parentales: Los triángulos rellenos indican DC/TKIL2: Los cuadrados rellenos indican N2/CMVIFH.

Figura 10. Efecto de la irradiación \gamma (R) sobre la liberación de IFN-\gamma de las células SK-RC-29 que portan la construcción N2/CMVIFN\gamma: se recogieron antes los sobrenadantes a las 72 horas de cultivo (día 0: barras blancas), y 3, 13 y 22 días después de la irradiación. La concentración de IFN-\gamma en los sobrenadantes se determinó por bioensayo y radioinmunoensayo. Los resultados representan la media de valores duplicados obtenidos por radioinmunoensayo.

Figura 11A, 11B. Efecto de la irradiación \gamma en la expresión de HLA-DR. La expresión del antígeno HLA-DR en células (A) parentales y (B) SK-RC-29 que portan la construcción N2/CMVIFN\gamma se evaluó los días 1, 7 y 14 después de la irradiación \gamma por inmunofluorescencia indirecta. La media de la intensidad de fluorescencia como se determina por FACS se expresa en unidades arbitrarias en una escala logarítmica (muestra de prueba-control negativo). Como control negativo, se sustituye el anticuerpo primario por PBS.

Figuras 12A a 12C: Formación de tumor in vivo por células SK-RC-29 parentales y que liberan linfocina. La formación de tumores en ratones desnudos BALB/c se evaluó 5 semanas después de la inoculación subcutánea de células de tumor. *Se usaron tres ratones por cada experimento. **A los niveles de mayores dosis, las células SK-RC-29 que portan la construcción DC/TKIL2 sólo formaban pequeños agregados celulares subcutáneos en el sitio de inyección (peso medio \pm desviación estándar: 0,02 \pm 0 g): los animales que recibieron las inyecciones de células parentales o células SK-RC-29 que secretan IFN-\gamma que porta la construcción N2/CMVIFN\gamma desarrollaron tumores subcutáneos más grandes (peso medio \pm desviación estándar: 3,63 \pm 0,8g).

Figuras 13A a 13F: Análisis inmunohistoquímicos del crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones BALB/c nu/nu. a. Células RC humanas SK-RC-29 parentales (b, d y f) células SK-RC-29 que portan la construcción DC/TKIL2, o (c y e) células SK-RC-29 que portan las construcciones N2/CMVIFN\gamma, a y b. mAB sustituido por PBS y la etapa de H_{2}O_{2} se omite (tinción para la peroxidasa endógena): c y d, mAB de rata anti-macrófagos tisulares de ratón biotinilado: ó e y f, mAB de ratón anti-HLA-DR biotinilado. Nótese el impresionante número de (b) células mononucleares del hospedador positivas a la peroxidasa, (d) predominantemente macrófagos en el estroma que rodea a las células SK-RC-29 que portan la construcción DC/TKIL2, pero no (a) parental o (c) células SK-RC-26 que producen IFN-\gamma. Inmunotinción heterogénea positiva para HLA-DR de (e) células SK-RC-29 que producen IFN-\gamma pero no de (f) células SK-RC-29 que liberan IL-2; Barra, 100 \mum.

Figura 14: Construcciones que muestran dos citoquinas pueden introducirse en un vector retroviral.

Figura 15: Crecimiento tumoral de células CMS5 que secretan citocina en ratones BALB/c.

Figuras 16-1 a 16-3: Estructuras de los vectores retrovirales que contiene el ADNc de la IL-2 humana, IFN-\gamma de ratón o GM-CSF de ratón y del vector control que contiene el minigen ADA humano (Para detalles adicionales véase Material y método de la sexta serie de experimentos).

Figura 17: Proliferación in vitro de células CM-5 parentales y transducidas con un vector.

Figura 18: Análisis por citometría de flujo de la expresión de MHC en células CMS-5 parentales y secretoras de citocina. Las células se marcaron con anticuerpos monoclonales anti-MHC de clase I o II, seguido por la incubación con un anti-IgG de rata de cabra conjugado con FITC y análisis por FACS. La expresión de MHC de clase I en las células CMS-5 secretoras de IFN-\gamma e IL-2/IFN-\gamma no estaba regulada, mientras que no se vio regulación por incremento de MHC de clase II en las células transducidas (datos no mostrados).

Figura 19: Crecimiento de clones CMS-5 parentales y secretores de citocina en ratones BALB/c. Grupos de tres ratones en cada categoría se inyectaron con 2,5 x 10^{5} células tumorales parentales ó 1 x 10^{6} transducidas como se indica. Los resultados se expresan como la media del diámetro (en milímetros) de los tumores. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. El crecimiento del tumor se monitorizó como se describe en Materiales y métodos.

Figura 20: Crecimiento de una mezcla de clones CMS-5 secretores de IL-2 e IFN-\gamma en ratones BALB/c. Un grupo de ratones BALB/c se inyectó con una mezcla de 5 x 10^{5} células CD/TKIL2/CMS5 y 5 x 10^{5} células DC/RIFN\gamma/CMS5, como se indica. Los resultados se expresan como la media del diámetro (en milímetros) del tumor. Las barras de error representan la desviación estándar de la media.

Figura 21: Crecimiento de las células CMS-5 transfectadas en masa secretoras de cantidades grandes, medias o bajas de GM-CSF. Ratones BALB/c se inyectaron con 2,5 x 10^{5} células tumorales CMS-5 transducidas con GM-CSF o células CMS-5 parentales y se monitorizó el crecimiento del tumor. Los resultados se expresan como la media del diámetro (en milímetros) de los tumores. Las barras de error representan la desviación estándar de la media.

Figura 22: Crecimiento de células CMS-5 secretoras de IL-2/IFN-\gamma en ratones BALB/c no deplecionados o deplecionados de células efectoras. Se deplecionaron grupos de tres ratones en cada categoría de las subpoblaciones de células efectoras indicadas por inyección i.p. con el correspondiente anticuerpo e inyectados con 1 x 10^{6} células CMS5 N/CIL2/TIFN\gamma. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento. (Para detalles adicionales véase Materiales y métodos).

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona un vector retroviral que comprende (a) una 3' LTR; y (b) una inserción que tiene (i) un promotor, (ii) una secuencia que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por en citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor, y (iii) una señal poli A, respectivamente, estando alineados dicho promotor, secuencia codificadora para una inmunomolécula y señal poli A en orientación 5' a 3', en el que la inserción se coloca dentro de la 3' LTR en la orientación opuesta a la de 3' LTR.

En esta invención "inmunomolécula" significa moléculas que pueden afectar al sistema inmune. Un ejemplo de tal molécula es la citocina. Otro ejemplo de tal molécula son los antígenos asociados o específicos de tumor.

Las citoquinas son moléculas biológicas bien conocidas por un especialista en la técnica. Ejemplo de citoquinas son las interleucinas que son secretadas por los linfocitos. Entre otras citoquinas se incluyen, pero no de forma limitantes, los interferones. Ejemplos de interferones son interferón alfa, interferón beta e interferón gamma.

Las moléculas de adhesión también son conocidas por un especialista en la técnica. Las moléculas de adhesión endotelial han sido identificadas como estructuras que ayudan a la localización y adhesión de los linfocitos a las paredes de los vasos sanguíneos. Normalmente, neutrófilos, monocitos y linfocitos circulan libremente por todo el cuerpo. Pero cuando tiene lugar un daño tisular o una inyección, los leucocitos necesitan un mecanismo para adherirse estrechamente al sitio de inflamación.

Como tal, las moléculas de adhesión se expresan en las superficies de las células endoteliales en la proximidad de los tejidos inflamados.

Se han identificado y caracterizado varias estructuras distintas de moléculas de adhesión. La lista incluye a la molécula de adhesión de leucocitos al endotelio (ELAM), molécula de adhesión intercelular (ICAM), moléculas de adhesión de plaquetas a células endoteliales (PECAM) y molécula de adhesión de células vasculares (VCAM).

Los factores coestimuladores son bien conocidos en la técnica. El significado de la coestimulación es bien conocido (revisada en Schwartz, 1992). Un ejemplo de factor de coetimulación es B7 (Chen L. et al., 1992).

En una realización, esta invención proporciona una vacuna alogénica que comprende una célula manipulada genéticamente que expresa al menos una inmunomolécula seleccionada de entre el grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor, en el que la inmunomolécula es un factor coestimulador. En una realización adicional, el factor coestimulador es B7/BB1 (CD80) o B70/B7-2 (Clarck, E.A., et al. (Feb. 1994) Nature, 367: 425-428).

Los antígenos asociados a tumor y específicos de tumor son bien conocidos en la técnica. Los antígenos asociados a tumor no están sólo presentes en un tipo de tumor. Un ejemplo de antígeno asociado a tumor es el Antígeno Asociado a Melanoma E-1 (MAGE-1). MAGE-1 no se encuentra sólo en melanoma sino también en carcinoma de mama. Sin embargo, los antígenos específicos de tumor se encuentran sólo en las células del tumor.

Esta invención además proporciona el vector retroviral descrito anteriormente, en donde el promotor se deriva del grupo formado por el gen ADA, gen TK y gen CMV. Esta invención no se limita sólo a los promotores derivados de los genes ADA, TK y CMV. Un especialista en la técnica conoce varias secuencias promotoras y pueden usarse en las reivindicaciones de la invención.

En otra realización, el promotor se deriva del gen ADA. En otra realización, la inmunomolécula es una citocina. En otra realización más, la citocina es interleucina. En otra realización, la citocina es interleucina-2.

Esta invención además proporciona un vector retroviral que contiene (a) una 3' LTR; y (b) una inserción que tiene (i) un promotor, (ii) una secuencia que codifica para una inmunomolécula seleccionada de entre el grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor, y (iii) una señal poli A, respectivamente, estando dicho promotor, secuencia codificadora de una inmunomolécula y señal poli A alineados en una orientación 5' a 3', en donde la inserción se coloca dentro del 3' LTR en la orientación opuesta a la de 3' LTR, en el que la secuencia promotora se deriva del gen ADA, la secuencia que codifica para una inmunomolécula que es interleucina-2. En una realización preferida, el retroviral se designa como DC/AD/R/IL2 y el gen de la IL-2 está contenido en DC/AD/R/IL2.

Esta invención proporciona una célula productora de retrovirus de mamífero que comprende una célula empaquetadora del retrovirus y un vector retroviral que comprende (a) una 3' LTR; y (b) una inserción que tiene (i) un promotor, (ii) una secuencia que codifica para una inmunomolécula seleccionada de entre el grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor, y (iii) una señal poli A, respectivamente, estando dicho promotor, secuencia codificadora de una inmunomolécula y señal poli A alineados en una orientación 5' a 3', en donde la inserción se coloca dentro del 3' LTR en la orientación opuesta a la de 3' LTR,

En una realización, la célula productora de retrovirus de mamífero anteriormente descrita comprende el vector retroviral DC/AD/R/IL2.

En otra realización, la célula empaquetadora de retrovirus es AM12. En una realización más, la célula productora de retrovirus de mamífero anteriormente descrita se designa como AD/ILA/AM12Nº12 (DC/AD/R/IL2/AM12Nº12, Nº de designación de la ATCC CRL 11210) que comprende el vector retroviral DC/AR/R/IL2 y la célula empaquetadora AM12.

Esta línea celular, AD/IL2/AM12Nº12 (DC/AD/R/IL2/AM12Nº12) se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA el 1 de diciembre de 1992 bajo las Disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. A la línea celular, AD/IL2/AM12Nº12 (DC/AD/R/IL2/AM12Nº12) se le concedió el número de designación de la ATCC CRL 11210.

Esta invención además proporciona una célula tumoral que está infectada por el retrovirus producido por la célula productora de retrovirus de mamífero descrita anteriormente.

Esta invención también proporciona una célula tumoral que está infectada por el retrovirus producido por la célula productora de retrovirus de mamífero designada como AD/AL2/AM12Nº12.

Otras células tumorales pueden ser infectadas con virus generados por la célula productora de retrovirus de mamífero descrita anteriormente.

En otra realización, la célula de tumor infectada deriva de un melanoma. En una realización preferida, la célula tumoral se designa como SK-MEL-29/AD/IL2 (SK-MEL-29/DC/AD/R/IL2, Nº de designación de la ATCC CRL 11208).

Esta línea celular, SK-MEL-29/AD/IL2 (SK-MEL-29/IL2) se depositó en la American Type Culture Collection (ATC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 28052, USA el 1 de diciembre de 1992 bajo las Disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. A la línea celular, SK-MEL-29/AD/IL2 se le concedió el número de designación de la ATCC CRL 11208.

Esta invención además proporciona una célula tumoral infectada, en la que la célula tumoral deriva de un carcinoma renal. En una realización, la célula tumoral se designó como SK-RC-28/AD/IL2 (SK-RC-28/DC/AD/IL2, Nº de designación de la ATCC CRL 11209).

Esta línea celular, SK-RC-28/AD/IL2 (SK-RC-28/DC/AD/IL2) se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 28052, USA el 1 de diciembre de 1992 bajo las Disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. A la línea celular, SK-RC-28/AD/IL2 se le concedió el número de designación de la ATCC CRL 11209.

En otra realización, la célula tumoral se designó como SK-RC-39/AD/IL2 (SK-RC-39/DC/AD/R/IL2, Nº de designación de la ATCC CRL 11210).

Esta línea celular, SK-RC-39/AD/IL2 (SK-RC-39/DC/AD/IL2) se depositó en la American Type Culture Collection (ATC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 28052, USA el 1 de diciembre de 1992 bajo las Disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. A la línea celular, SK-RC-39/AD/IL2 se le concedió el número de designación de la ATCC CRL 11210.

Esta invención proporciona una célula tumoral manipulada genéticamente útil para el tratamiento o prevención de un tumor maligno en un paciente (a) que exprese al menos una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor y (b) es alogénico con relación al paciente.

Esta invención proporciona un método para tratar un tumor maligno en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un número grande de células manipuladas genéticamente que (a) expresan al menos una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor y (b) es alogénico con relación al sujeto, para inhibir la proliferación del tumor maligno.

En esta invención, "manipulación genética" se define como la modificación de la estructura genética existente que está presente en la célula por inserción de material genético exógeno. Los métodos para conseguir tal modificación son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el material de ADN exógeno puede introducirse dentro de la célula por tecnología de precipitación con fosfato de calcio. Pueden usarse otras tecnologías tales como tecnología de vector retroviral, electroporación, lipofección, otros sistemas de vectores virales como el sistema del virus asociado a adeno, o micro inyección. El resultado de tal manipulación genética es que la célula manipulada genéticamente ahora podría ser capaz de expresar cierto producto de gen que no se expresaba antes.

El término "alogénico" significa de la misma especie. Células alogénicas son células derivadas de la misma especie pero antigénicamente diferentes. En una realización, las células elegidas para los usos de esta invención serán compatibles en parte o todo el Antígeno Linfocítico Humano (HLA) con los pacientes vacunados. Pueden usarse diferente grado de compatibilidad. Por ejemplo, puesto que hay moléculas de HLA de clase I y II y dentro de la clase I, hay DR, DP y DQ, la compatibilidad puede ser cualquiera, uno o todas estas subclases. Un especialista en la técnica será capaz de diseñar experimentos para probar qué compatibilidad tendrá efectos óptimos. Uno de estos experimentos es inocular diferentes grupos de animales/pacientes con diferentes grados de compatibilidad y entonces reinmunizar con el tumor para examinar el efecto. Alternativamente, la prueba puede hacerse a pacientes con tumor.

Esta invención además proporciona el método descrito anteriormente, en el que la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno no profesional.

En esta invención, las células presentadoras de antígeno no profesionales se definen como células que normalmente no se usan para presentar el antígeno en la generación de respuesta inmune contra el antígeno. Ejemplo de células presentadoras de antígeno no profesionales son las células tumorales y los fibroblastos. Las células presentadoras de antígeno no profesionales son bien conocidas en la técnica.

Entre las células presentadoras de antígenos no profesionales pueden incluirse, pero no de forma limitante, otras células tumorales como células derivadas de cánceres de próstata, linfoma, carcinoma de colon y cánceres de vejiga.

Esta invención también proporciona el método descrito anteriormente en el que la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno no profesional que es una célula tumoral. En una realización, la célula tumoral deriva de un melanoma. Es otra realización, la célula de melanoma es SK-MEL-29.

Esta invención además proporciona un método de tratamiento de tumor maligno en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un gran número de células modificado genéticamente que (a) expresa al menos una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor y (b) es alogénico con respecto al sujeto, para inhibir la proliferación del tumor maligno, en donde la inmunomolécula es una citocina que es interleucina-2.

En una realización preferida, la célula manipulada genéticamente se designa como SK-MEL-29/AD/IL2 (SK-MEL-29/DC/AD/R/IL2, Nº de designación de la ATCC CRL 11208).

En otra realización, la célula manipulada genéticamente puede ser derivada de SK-MEL-131.

En una realización, la inmunomolécula es citocina que es interferón gamma.

En una realización más, la célula manipulada genéticamente se designa como DC/TKHIFN\gamma/MEL131 (SK-MEL-131/DC/TK/IFN\gamma, Nº de designación de la ATCC CRL 11255).

Esta línea celular, DC/TKHIFN\gamma/MEL131 (SK-MEL-131/DC/TKIFN\gamma) se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 28052, USA el 2 de febrero de 1993 bajo las Disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. A la línea celular, DC/TKHIFN\gamma/MEL131 se le concedió el número de designación de la ATCC CRL 11255.

En otra realización, la célula de tumor deriva de un carcinoma renal. En una realización más, la célula de carcinoma renal es SK-RC-28.

Esta invención proporciona el método descrito anteriormente en el que la inmunomolécula es una citocina que es interleucina-2.

En una realización del método descrito anteriormente, la célula manipulada genéticamente se designa como SK-RC-28/AD/IL2 (SK-RC-28/DC/AD/R/IL2, Nº de designación de la ATCC CRL 11209).

En otra realización, la célula de carcinoma renal es SK-RC-39. En una realización más, la inmunomolécula es una citocina que es interleucina-2.

En una realización preferida del método descrito anteriormente, la célula manipulada genéticamente se designa como SK-RC-39/AD/IL2 (SK-RC-39/DC/AD/R/IL2, Nº de designación de la ATCC CRL 11210).

El método descrito anteriormente puede practicarse en células tumorales derivadas de un tumor de mama, tumor de vejiga y tumor cerebral.

Esta invención además proporciona el método descrito anteriormente en donde la inmunomolécula es una interleucina-2 y la interleucina-2 es la interleucina-2 contenida en DC/AD/R/IL2.

Esta invención además proporciona el método descrito anteriormente, en donde la citocina es un interferón. En una realización, en interferón es interferón gamma. En otra realización, la citocina es GM-CSF. En una realización adicional, la célula manipulada genéticamente expresa interleucina e interferón. Aún en otra realización más, la célula manipulada genéticamente expresa interleucina-2 e interferón gamma. En otra realización, la célula manipulada genéticamente expresa un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor o ambos y al menos una citocina.

Esta invención además proporciona el método descrito anteriormente en donde la inmunomolécula es un factor coestimulador que es B7/BB1 (CD80) ó B70/B7-2 (Clark, E.A., et al. (Feb. 1994) Nature, 367:425-428). En otra realización del método descrito anteriormente, el antígeno asociado al tumor es el antígeno asociado a melanoma
E-1.

En una realización, la célula tumoral deriva de un melanoma. En otra realización, la célula tumoral deriva de un carcinoma renal. En una realización más, la célula tumoral deriva de cáncer de mama. En otra realización, la célula tumoral deriva del cáncer de cerebro.

En una realización preferida, la citocina usada es GM-CSF.

Esta invención proporciona un método para el tratamiento de un tumor maligno en un sujeto que (a) comprende la administración al sujeto de un gran número de células manipuladas genéticamente que expresan al menos una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citoquinas, proteínas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor, y (b) es alogénico con respecto al sujeto, para inhibir la proliferación del tumor maligno en donde la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno profesional.

En esta invención, la célula presentadora de antígeno profesional significa células que normalmente presentarán un antígeno para generar una respuesta inmune. Un ejemplo de tales células es las células dendríticas como células de Langerhans o macrófagos (Vidard et al., 1992).

Esta invención también proporciona un método de tratamiento de un tumor maligno en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un gran número de células manipuladas genéticamente que (a) expresan al menos una inmunomoléculas seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor y (b) es alogénica con respecto al sujeto, para inhibir la proliferación del tumor maligno, en donde la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno profesional tal como una célula B normal, macrófago peritoneal u otras células presentadoras de antígeno
esplénicas.

Esta invención también proporciona un método de tratamiento de un tumor maligno en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un gran número de células manipuladas genéticamente que (a) expresan al menos una inmunomoléculas seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumores y (b) es alogénica con respecto al sujeto, para inhibir la proliferación del tumor maligno, en donde la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno profesional y la citocina es una interleucina. Un ejemplo de tal interleucina es interleucina-2.

Esta invención también proporciona un método de tratamiento de un tumor maligno en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un gran número de células manipuladas genéticamente que (a) expresan al menos una inmunomoléculas seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumores y (b) es alogénica con respecto al sujeto, para inhibir la proliferación del tumor maligno, en donde la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno profesional y la citocina es un interferón. Un ejemplo de tal interferón es interferón gamma.

Esta invención también proporciona un método de tratamiento de un tumor maligno en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un gran número de células manipuladas genéticamente que (a) expresan al menos una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumores y (b) es alogénica con respecto al sujeto, para inhibir la proliferación del tumor maligno, en donde la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno profesional y expresa interleucina-2 e interferón gamma. En otra realización, la célula manipulada genéticamente expresa un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor o ambos y al menos una citocina.

Pueden usarse diferentes cantidades efectivas de las células manipuladas genéticamente según esta invención. Un especialista en la técnica puede realizar unos experimentos sencillos de titulación para determinar que cantidad efectiva se requiere para una inmunización efectiva. Un ejemplo de tales experimentos de titulación es inyectar diferentes cantidades de la vacuna alogénica en el paciente y examinar entonces la respuesta inmune.

En una realización preferida del método descrito anteriormente, se administraron al sujeto aproximadamente de diez a cincuenta millones de células manipuladas genéticamente.

Es bien conocido para un especialista en la técnica que serán tenidos en consideración otros efectos secundarios cuando se determina la cantidad efectiva de los reactivos.

Para los propósitos de esta invención "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa cualquier vehículo farmacéutico estándar. Hay ejemplos de vehículos adecuados bien conocidos en la técnica y puede incluirse, pero no de forma limitante, cualquier de los vehículos farmacéuticos estándar tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato solución salina tamponada con fosfato con Polysorb 80, agua, emulsiones tales como emulsión aceite/agua y varios tipos de humectantes.

Las células manipuladas genéticamente de esta invención pueden administrarse vía intradérmica, subcutánea e intramuscular. También pueden usarse otros métodos bien conocidos por un especialista en la técnica.

Esta invención proporciona un método para prevenir la formación de un tumor en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un gran número de células manipuladas genéticamente que (a) expresan al menos una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumor y (b) es alogénica con respecto al sujeto, para prevenir la formación del tumor.

Esta invención además proporciona un método par prevenir la formación de un tumor en un sujeto, en donde la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno no profesional. En otra realización, la célula presentadora de antígeno no profesional es una célula tumoral. En otra sealización, la célula tumoral deriva de un melanoma. En otra realización más, la célula de melanoma es SK-MEL-29.

Esta invención proporciona un método para prevenir la formación de un tumor, en donde la citocina es interleucina-2.

Esta invención proporciona un método para prevenir la formación de un tumor, en donde la célula genéticamente manipulada se designa como SK-MEL-29/AD/IL2 (SK-MEL-29/DC/AD/R/IL2, Nº de designación de la ATCC CRL 11208).

Esta invención proporciona un método para prevenir la formación de un tumor, en donde la célula es SK-MEL-131.

Esta invención además proporciona un método para prevenir la formación de un tumor, en donde el interferón es interferón gamma.

En una realización preferida de este método para prevenir la formación de un tumor, la célula manipulada genéticamente se designa como DC/TKHIFN\gamma, Nº de designación de la ATCC CRL 11255.

Esta invención proporciona un método para prevenir la formación de un tumor, en el que la célula tumoral deriva de un carcinoma renal. En una realización, la célula de carcinoma renal es SK-RC-28.

En una realización preferida de este método par prevenir la formación de tumores, la célula manipulada genéticamente se designa como SK-RC-28/AD/IL2 (SK-RC-28/DC/AD/R/IL2, Nº de designación de la ATCC CRL 11209).

Esta invención proporciona un método para prevenir la formación de un tumor, en donde la célula de carcinoma renal es SK-RC-39.

En una realización de este método para prevenir la formación de tumores, la célula genéticamente manipulada se designa como SK-RC-39/AC/IL2 (SK-RC-39/AD/R/IL2, Nº de designación de la ATTC CRL 11210).

En una realización de este método para prevenir la formación de tumores, la célula tumoral deriva de un cáncer de mama o deriva de un cáncer de cerebro.

En una realización de este método para prevenir la formación de tumores, en donde la interleucina es la interleucina-2 contenida en DC/AD/R/IL2.

En una realización de esta invención reivindicada para prevenir la formación de un tumor, la citocina es un interferón. En una realización más, el interferón es interferón gamma. En otra realización, la citocina es GM-CSF. En una realización más de esta invención reivindicada para prevenir la formación de tumores, la célula genéticamente manipulada expresa interleucina e interferón. Aun en otra realización más, la célula manipulada genéticamente expresa interleucina-2 e interferón gamma.

En otra realización de esta invención reivindicada para prevenir la formación de tumores, la célula manipulada genéticamente expresa un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor o ambos y al menos una citocina.

En otra realización de esta invención reivindicada para prevenir la formación de tumores, en donde la inmunomolécula es un factor coestimulador que es B7/BB1 (CD80) ó B70/B7-2 (Clark, E.A., et al. (Feb. 1994) Nature, 367:425-428).

En otra realización, en donde la inmunomolécula es un antígeno asociado a tumor. En una realización más, el antígeno asociado a tumor es el antígeno asociado a melanoma E-1.

Esta invención además proporciona un método para prevenir la formación de tumores en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un gran número de células manipuladas genéticamente que (a) expresan al menos una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citoquinas, moléculas de adhesión, factores coestimuladores, antígenos asociados a tumor y antígenos específicos de tumores y (b) es alogénica con respecto al sujeto, para prevenir la formación del tumor, en donde la célula manipulada genéticamente es una célula presentadora de antígeno profesional.

En una realización, la célula presentadora de antígeno profesional es una célula dendrítica. En otra realización, la citocina expresada en la célula presentadora de antígeno profesional es una interleucina o interferón. En una realización más, la interleucina es interleucina-2. Aún en otra realización más, el interferón es interferón gamma.

En otra realización, la célula manipulada genéticamente expresa interleucina-2 e interferón gamma.

En una realización, la célula manipulada genéticamente expresa interleucina-2 e interferón gamma. En otra realización, la célula genéticamente manipulada expresa un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor o ambos y al menos una citocina. Aún en otra realización, se administran al sujeto aproximadamente de diez a cincuenta millones de células manipuladas genéticamente.

Esta invención proporciona un método para hacer células manipuladas genéticamente que comprende las etapas de a) introducir al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor en las células; b) probar la expresión de los genes introducidos en las células; y c) seleccionar las células que expresan el gen introducido.

Un especialista en la técnica podría seleccionar la preparación apropiada de las células manipuladas genéticamente que se sintetiza introduciendo al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor y probar la expresión del gen introducido en las células introducidas. Un criterio para tal selección puede ser el número de células que expresan el gen introducido. Otro criterio puede ser la cantidad de expresión del gen introducido en las células. Los métodos para determinar del número de células que contiene el gen introducido son bien conocidos en la técnica. Los métodos para cuantificar la expresión del gen en la célula también son bien conocidos.

El término "expresar" en esta invención significa no sólo la expresión estable, sino también transitoria. Esta invención no se limita a la célula que pueden expresar de forma estable al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor, sino también a las células que expresan de forma transitoria el gen o genes introducidos.

Esta invención proporciona un método para hacer células manipuladas genéticamente para usos en el tratamiento de tumores malignos o en la prevención de la formación de tumores que comprende las etapas de a) introducir al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor en una célula; b) probar la expresión del gen introducido en la célula; y c) seleccionar las células que expresan el gen introducido y además comprende el aislamiento de la célula que porta de forma estable el gen introducido. Los métodos para aislar tales células son bien conocidos por un especialista en la técnica.

Esta invención además proporciona el método descrito para hacer una célula manipulada genéticamente, en donde la etapa a) además comprende: i. clonar al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, un factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor de cada gen en un vector retroviral, ii. transfectar el vector en una célula empaquetadora generando una línea celular productora que produce virus que contiene el gen de la citocina o molécula de adhesión de un gen coestimulador, y iii. transducir una célula con el virus producido en ii.

Esta invención además proporciona un método para hacer una célula manipulada genéticamente en la que el vector se selecciona de un grupo formado básicamente por AD, DC y N2. Otros vectores retrovirales conocidos en la técnica puede usarse de forma similar.

Esta invención también proporciona un método para hacer una célula manipulada genéticamente usando la célula empaquetadora AM12. Podría usarse otras células empaquetadoras que son bien conocidas por un especialista en la técnica.

En una realización preferida, el vector usado es AD y la citocina es IL2. La línea productora generada se denomina AD/IL2/AM12Nº 12 (DC/AD/R/IL2/AM12Nº 12).

En otra realización de este método para hacer células manipuladas genéticamente, el vector usado es DC y la citocina es interferón gamma. La línea productora generada se denomina DC/TKHIFN\gamma/AM12Nº 6 (DC/TKIFN\gamma/AM12Nº 6). Esta línea DC/TKHIFN\gamma/AM12Nº 6 (DC/TKIFN\gamma/AM12Nº 6) se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA el 2 de febrero de 1992 bajo las Disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. A la línea celular, DC/TKHIFN\gamma/AM12Nº 6 (DC/TKIFN\gamma/AM12Nº 6) se le concedió el número de designación de la ATCC CRL 11256.

En otra realización de este método para hacer células manipuladas genéticamente, el vector usado es N2 y la citocina es interferón. La línea productora generada se denomina N2/CMVHIFN\gamma/AM12Nº 5 (N2/CMVIFNV\gamma/AM12Nº 5). Esta línea N2/CMVHIFN\gamma/AM12Nº 5 (N2/CMVIFNV\gamma/AM12Nº 5) se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA el 2 de febrero de 1992 bajo las Disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. A la línea celular, N2/CMVHIFN\gamma/AM12Nº 5 (N2/CMVIFNV\gamma/AM12Nº 5) se le concedió el número de designación de la ATCC CRL 11257.

En otra realización de este método para hacer células manipuladas genéticamente, el vector usado es N2 y la citocina es el Factor Estimulante de Colonias Granulocito-Macrófago (GM-CSF). La línea productora generada se denomina N2/CMVGM-CSF/AM12Nº 8. Esta línea N2/CMVGM-CSF/AM12Nº 8 se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA el 2 de febrero de 1992 bajo las Disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes. A la línea celular, N2/CMVGM-CSF/AM12Nº8 se le concedió el número de designación de la ATCC CRL 11258.

Esta invención proporciona un método para hacer células manipuladas genéticamente que comprende las etapas de a) introducir al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, una molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor dentro de células; b) probar la expresión del gen introducido en las células; y c) seleccionar las células que expresan el gen introducido. Los métodos para introducir un gen dentro de una célula son bien conocidos en la técnica y no deberían interpretarse como limitantes del método descrito anteriormente a través de un vector retroviral. Otros métodos tales como la transfección por precipitación con fosfato cálcico, lipofección, micro inyección y otros sistemas de vector viral se incluyen en esta invención. En una realización preferida, el gen se introduce en la célula por electroporación.

Esta invención proporciona un método para hacer células manipuladas genéticamente que comprende las etapas de a) introducir al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, una molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor dentro de una célula; b) probar la expresión del gen introducido en las células; y c) seleccionar las células que expresan en gen introducido en el que la célula es una célula presentadora de antígeno no profesional o una célula presentadora de antígeno profesional.

Esta invención además proporciona un método par hacer una célula manipulada genéticamente, en donde la célula presentadora de antígeno no profesional es una célula tumoral. Las células tumorales son bien conocidas por un especialista en la técnica.

En realizaciones preferidas, la célula tumoral se selecciona del grupo formado básicamente por SK-MEL-29, SK-MEL-131, SK-RC-28 y SK-RC-39.

Esta invención proporciona un método para hacer una célula manipulada genéticamente que comprende las etapas de a) introducir en las células al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, una molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor; b) probar la expresión del gen introducido; y c) seleccionar las células que expresan el gen introducido en donde la citocina se selecciona de un grupo formado básicamente por IL-2, interferón gamma y GM-CSF.

Esta invención proporciona un método para hacer una vacuna celular manipulada genéticamente que comprende las etapas de a) introducir en las células al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor; b) probar la expresión del gen introducido en las células; y c) seleccionar las células que expresan el gen introducido, en donde las células son células presentadoras de antígeno profesionales o células presentadoras de antígeno no profesionales y se introduce en las células un gen de interleucina y un gen de interferón. Uno de dichos genes de interleucina es el gen de la interleucina-2 y uno de dichos genes de interferón es el gen del interferón gamma.

Esta invención proporciona un método para hacer una célula manipulada genéticamente que comprende las etapas de a) introducir en las células al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor; b) probar la expresión del gen introducido en las células; y c) seleccionar las células que expresan el gen introducido, en donde las células son células presentadoras de antígeno profesionales o células presentadoras de antígeno no profesionales y en donde se introduce en las células un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor o ambos y un gen de citocina.

Esta invención proporciona un método para hacer una célula manipulada genéticamente que comprende las etapas de a) introducir en las células al menos un gen que codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor; b) probar la expresión del gen introducido en las células; y c) seleccionar las células que expresan el gen introducido, en donde las células son células presentadoras de antígeno profesionales o células presentadoras de antígeno no profesionales y en donde el gen introducido codifica para B7/BB1 (CD80) o B70/B7-2 (Clark, E.A., et al. (Feb. 1994) Nature, 367:425-428).

Esta invención proporciona un método para hacer una célula manipulada genéticamente que comprende las etapas de a) introducir en las células al menos un gen de codifica para una inmunomolécula seleccionada del grupo formado por citocina, molécula de adhesión, factor coestimulador, antígeno asociado a tumor y antígeno específico de tumor; b) probar la expresión del gen introducido en las células; y c) seleccionar las células que expresan el gen introducido, en donde las células son células presentadoras de antígeno profesionales o células presentadoras de antígeno no profesionales y en donde el gen introducido codifica para el antígeno asociado a melanoma E-1.

En esta invención, la palabra "vacuna" se usa en este contexto como la fuente de antígeno para la activación de las respuestas inmunes contra tumores establecidos, y para la inmunización profiláctica. Por tanto, las células manipuladas genéticamente reivindicadas en esta invención pueden llamarse vacunas.

Esta invención se entenderá mejor con los Detalles experimentales que siguen. Sin embargo, un especialista en la técnica fácilmente apreciará que los métodos específicos y los resultados discutimos son simplemente ilustrativos de la invención como se describe de forma más completa en las reivindicaciones que siguen de aquí en adelante.

Detalles experimentales

Primera serie de experimentos

Expresión constitutiva de IL-2 o IFN-\gamma inducida por transferencia de gen retroviral en células de melanoma humano irradiadas

Los resultados de esta serie de experimentos demuestran que las células de melanoma secretan de forma estable estas citoquinas tras la transferencia del gen por mediación retroviral. Además, la secreción de linfocina se mantenía después de la irradiación de las células, una importante precaución cuando estas células se inyectan in vivo en ensayos clínicos. Finalmente, estas citoquinas han demostrado un efecto biológico in vitro e in vivo en ratones desnudos. Estos hallazgos proporcionan una base lógica par el diseño de aproximaciones para inmunoterapia activa en humanos.

Líneas celulares y cultivo de tejidos

Se seleccionaron para este estudio cinco líneas celulares de melanoma humano. Las líneas celulares SK-MEL-19,
-29, -131, -245, -256 se establecieron a partir de muestras de tumor primario o de lesiones metastásicas y se obtuvieron a partir de un banco de células (Houghton et al., 1982; Houghton et al., 1984; Houghton et al., 1987). Las líneas celulares se cultivaron el Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM), glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 \mug/ml complementado con suero fetal bovino (FCS) al 10%. Los cultivo se testaron regularmente para micoplasma.

Diseño del vector retroviral e infección de la célula del tumor

Los vectores retrovirales N2/IL2, DC/TK/IL2, N2/CMVIL2 y DCA usados en este proyecto son idénticos a los usados en el modelo previo de tumor de fibrosarcoma murino (Gansbacher et al., 1990b). DC/AD/R/IL2 se generó por clonación de un minigen que contenía el promotor ADA humano, el ADNc de la IL-2 humana y las secuencias poli-A en la región 3' LTR en orientación inversa. El promotor ADA es un fragmento de 832 pb derivado del gen ADA humano por digestión con los enzimas de restricción SspI y NcoI y se clonó en orientación inversa en el sitio Mlu I tratado con Klenow. La señal poli A que contiene un fragmento SmaI-AluI de 275 pb, se derivada del plásmido pBC/CMV/IL2 y se clonó en el sitio ApaI tratado con Klenow del polienlazador de 3' LTR (Cullen et al., 1988). El ADNc de la IL-2 humana usado para esta construcción se clonó por PCR a partir de linfocitos periféricos de un voluntario sano. La secuenciación del ADNc de IL-2 reveló un sitio polimórfico en la posición 456 (G para A), que no conduce a un cambio en la secuencia de aminoácidos. Las construcciones del vector retroviral se convirtieron en los correspondientes virus usando los procedimientos establecidos. Brevemente, el vector de ADN (N2/IL2, DC/TKIL2, DC/TKIFN\gamma, DCA y DC/AD/R/IL2) se transfectó una línea celular empaquetadora anfotrópica y sin auxiliar (Markowitz et al., 1988; Markowitz et al., 1988). Las colonias se aislaron por selección G418, se expandieron en líneas celulares y se probó la presencia de virus en el sobrenadante libre de células. Las líneas celulares que secretaban un alto título de virus (10^{5}-10^{6} unidades formadoras de colonias Neo por ml) se usaron para infectar líneas celulares de melanoma. Los derivados en masa y clonales de las células de melanoma se aislaron por selección con G418, se expandieron en las líneas celulares y se midió la secreción de IL-2 o IFN-\gamma en el sobrenadante de las células. La ausencia de virus competentes para la replicación en las células de melanoma productoras de citocina se mostró por la incapacidad para transferir resistencia a G418 a las células NIH 3T3 y por un ensayo de transcriptasa inversa negativo en los ensayos de amplificación de HeLa y NIH3T3.

Transferencia de Southern y Northern

El ADN de alto peso molecular se preparó a partir de las células tumorales por técnicas estándar que implican al dodecil sulfato sódico (SDS), digestión con proteína quinasa, extracción con fenol y precipitación con etanol. Cada análisis se llevó a cabo con 10 \mug de ADN. Las muestras se sometieron a electroforesis y se transfirieron a un filtro de nylon (Biotrans, ICN). Los filtros se hibridaron por un método de cebador aleatorio (Feinberg et al., 1983) usando la sonda NeoR marcada. Después de la hibridación, los filtros se lavaron y expusieron a películas de rayos X XAR de Kodak.

El ARN poli A se preparó a partir de ARN total usando columna de oligo(dT)-celulosa. El ARN se fraccionó por tamaño en un gel de agarosa al 1% que contenía formaldehído, se transfirió a filtros de nylon (Biotrans, ICN) y se entrecruzó al filtro con UV. La hibridación se llevó a cabo durante 24 horas como se ha descrito previamente (Gansbacher et al., 1989) por el método del cebador aleatorio (Feinberg et al., 1983) usando una sonda de ADNc para U3 marcada. El filtro se lavó bajo condiciones rigurosas, se secó, se envolvió en Saran Warp y se expuso a -70ºC a una película de rayos X XAR de Kodak con una pantalla intensificadora.

Ensayo de IL-2

Los sobrenadantes de 2 x 10^{6} células en semiconfluencia no modificadas o secretoras de IL-2 se recogieron después de 24 ó 48 horas y se ensayó la IL-2. Se probó la actividad biológica de las preparaciones de IL-2 valorando su capacidad para inducir la incorporación de timidina ^{3}H (TdR) en el ADN de células T cultivadas dependientes de IL-2 (CTC) en un ensayo de proliferación como se describió previamente (Zier, 1982). Las unidades se dan como Unidades Cetus. Los resultados se confirmaron por inmunoensayo usando un kit de ELISA (Genzyme). Brevemente, cincuenta mil CTC se mezclaron con diluciones seriadas de las muestras problema y se cultivaron a 37ºC con CO_{2} al 5%. Después de aproximadamente 60 horas, se dio un pulso de 1 \muCi de ^{3}H-TdR a los cultivos (New England Nuclear, actividad específica 6,7 Ci/\muM) durante las 12 horas finales de crecimiento.

Ensayo del IFN-\gamma humano

Se analizó el IFN-\gamma de los sobrenadantes en un bioensayo basado en la actividad antiviral en los sobrenadantes de los cultivos celulares, determinado por la reducción de los efectos citopáticos del virus de la estomatitis vesicular en células WISH (Rubinstein et al., 1987). Los resultados se confirmaron usando un radio inmunoensayo disponible comercialmente (RIA) para el IFN-\gamma humano (Centocor, Malvern, PA). La bioactividad de IFN-\gamma humano en los sobrenadantes se bloqueó con un anticuerpo monoclonal murino específico para el IFN-\gamma humano (Olympus Corp., Lake Success, NY).

Citometría de flujo

Doscientas mil células se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía FBS al 2%, azida sódica al 0,02% y se distribuyeron en pocillos de microtitulación. Las células se centrifugaron y el sobrenadante se eliminó. Entonces, se añadieron 100 \mul por 10^{6} de células de anticuerpo W6/32 diluido, dirigido contra un determinante monomórfico de la molécula de MHC de clase I, y las células se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron tres veces con 100 \mul de PBS frío como se describe anteriormente y, después de disgregar suavemente el botón de células, se añadieron 100 \mul/10^{6}de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) por cada muestra. Las células se incubaron en hielo, en la oscuridad, durante otros 30 minutos y se lavaron como se describe anteriormente. Entonces, se analizó inmediatamente el porcentaje de fluorescencia con un citómetro Epics C equipado con un amplificador logarítmico para medidas de fluorescencia. La fluorescencia originada por las células muertas se eliminó mediante la selección del umbral de las señales de dispersión de luz frontal y a 90 grados (Gansbacher et al., 1986)

Irradiación

Las células de melanoma parental y secretoras de linfocina se irradiaron a temperatura ambiente con un acelerador lineal 6 MV Varian CL6-100 a una tasa de dosis de 100 rad/min y entonces se ponen en varias placas de 60 mm a idénticas concentraciones. Las células irradiadas se cultivaron a 37ºC con una atmósfera de CO_{2} al 5%. Las células se realimentaron con 3 ml/placa de RPMI fresco que contenía FCS al 10% cada 3 ó 4 días y los sobrenadantes se recogen en los puntos de tiempo indicados. El medio gastado se congeló a -20ºC hasta su valoración. Tras la recogida de los sobrenadantes, las células se tripsinizaron y contaron.

Ensayo de detección de retrovirus murino competente de replicación

Se mezcló 1 ml de la muestra experimental con 3 ml de DMEM, 10% de FCS, glutamina 5 mM y 8 \mug/ml de polibreno y luego se añadió a una placa de 60 mm que contenía 10^{5} células NIH3T3 pasadas 12 horas previamente. Se cultivaron las células NIH3T3 infectadas durante 21 días, pasando las células a una dilución 1:5 cada 3 días. La mitad de esta población celular se testó para la resistencia a G418, la otra muestra se usó para recoger sobrenadante para la determinación de la actividad transcriptasa inversa. La actividad transcriptasa inversa se determinó incubando 10 \mul de los medios muestra con 40 \mul de Tris 20 mM, pH 8,0, DTT 20 mM, MnCl_{2} 0,6 mM, NaCl 60 mM, NP al 0,05%, oligodT 5 \mug/ml, poli A 10 \mug/ml, dTTP 62 \muM, ^{32}P dTTP (3.000 Ci/mmol) 10 \muM. Entonces se colocaron 10 ml de la mezcla de reacción sobre un disco de filtro de DEAE DE81, se lavó con SSC a 25ºC durante 15 min 2 veces, se aclaró con etanol al 95% y se secó al aire. Se midió la radioactividad del filtro por la exposición de la película de rayos X durante 3 a 5 horas y se cuantificó mediante recuento por centelleo.

Resultados Generación de líneas celulares tumorales que expresan IL-2 o IFN-\gamma

La figura 1 muestra las construcciones de virus retrovirales que se usaron para introducir y expresar los genes IL-2 o IFN-\gamma humanos en células tumorales. Todos se derivaron del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) y se basan en el alto título del vector retroviral N2, que también contiene el gen seleccionable bacteriano de resistencia a neomicina (Neo). En la tabla 1 se listan las 5 líneas celulares de melanoma humano que se transdujeron con las construcciones de vectores de IL-2 o IFN-\gamma. Estas líneas celulares incluyen tanto cepas pigmentadas como no pigmentadas, y representan las etapas temprana y tardía de la diferenciación de melanocitos (Houghton et al., 1982; Houghton et al., 1984; Houghton et al., 1987). Tras el crecimiento en medio con G418, se usó el análisis por transferencia de Southern para demostrar que estaba presente un provirus intacto. Un análisis por transferencia de Southern de células SK-MEL-29 transducidas con DC/AD/R/IL2 se muestra en la figura 2 para demostrar que el ADN proviral se integró de una forma no reordenada y que la transferencia de la miniunidad del LTR de 3' a 5' ha tenido lugar. Una transferencia de Northern de SK-MEL-256 transducida, representativa de las obtenidas con 3 de los vectores usados, se muestra en la figura 3 para demostrar que las células transducidas expresaban el transcrito de ARN de tamaño adecuado específico del vector. Estos incluyen un transcrito "V" sin ayustar formado por el ARN del virión y un transcrito "N" ayustado formado por el ARNm de Neo, ambos derivados del LTR, así como un transcrito "P" pequeño originado del promotor interno. Las células sin infectar no expresaban ninguno de estos transcritos.

Secreción de IL-2 e IFN-\gamma por células tumorales

La secreción de IL-2 o IFN-\gamma por células de melanoma transducidas con los vectores retrovirales se determinó usando un bioensayo y un ELISA para IL-2 y un bioensayo y un RIA para IFN-\gamma (tabla 1).

TABLA 1

1

Los datos dados en la tabla 1 son representativos de la mayoría de las poblaciones celulares infectadas transducidas. También se aislaron y analizaron poblaciones clonales. La IL-2 producida por poblaciones clonales únicas variaba ampliamente, oscilando desde 691 U/ml/10^{6} células a 0 U/ml/10^{6} células (tabla 2).

TABLA 2

2

Como se esperaba de resultados previos, las líneas celulares variaban en su expresión y secreción de citoquinas dependiendo del vector retroviral particular usado. En todos los casos la actividad de IL-2 o IFN-\gamma humanos pudo neutralizarse con el apropiado anticuerpo monoclonal (datos no mostrados).

Las células de melanoma transducidas con el vector control DCA no secretó cantidades apreciables de IL-2 o IFN-\gamma (datos no mostrados). La secreción de IL-2 o IFN-\gamma humanos no tenía efectos apreciables sobre la morfología, pigmentación o sobre la tasa de crecimiento celular en cultivo, comparado con las células parentales o células transducidas con DCA (datos no mostrados). Algunas de estas líneas celulares transducidas han estado en cultivo más de 6 meses y han continuado secretando cantidades estables de IL-2 o IFN-\gamma.

Las células de melanoma irradiadas continúan secretando IL-2

En el contexto de inmunoterapia, las células transducidas inyectadas vía intradérmica podrían servir como una fuente de producción de citoquinas local continua y de antígeno tumoral. Aunque las células tumorales secretoras de citoquinas exhiben una tumorogénesis reducida y no crecerían muy probablemente in vivo, se han diseñado experimentos para probar si irradiándolas como precaución adicional podría afectar a la producción de citoquinas. Los resultados demostraron que después de la irradiación con hasta 10.000 rad, la producción de citoquinas persistía durante 3 a 4 semanas (tabla 3 y figura 4).

TABLA 3

3

Tras la irradiación, la secreción de IL-2 aumentaba, posiblemente debido a un mayor escape de las células dañadas por irradiación (tabla 3). La duración de la secreción de IL-2 estaba influenciada por la cantidad de radiación administrada a las células y en este sentido, definido por la radiosensibilidad de cada línea celular. Las líneas celulares irradiadas eran incapaces de crecer en cultivo, como se demostró por el número descendente de células a lo largo del tiempo (tabla 3). Además, las células tumorales irradiadas secretoras de IL-2 no son capaces de formar tumores en ratones desnudos. Este ha sido un hallazgo regular en los diferentes tipos de tumores. La secreción de IFN-\gamma no se testó después de la irradiación, pero en un modelo de carcinoma renal humano usado para estudiar el efecto de la transducción del gen de IFN-\gamma, la secreción de IFN-\gamma persistía durante varias semanas después de la irradiación (Gastl, et al., 1992). Estos resultados ilustran que es posible irradiar letalmente células antes de inyectarlas en pacientes y continuar secretando citoquinas durante varias semanas.

Regulación por incremento del MHC de clase I por IFN-\gamma

El IFN-\gamma es capaz de regular por incremento la expresión de superficie de antígenos MHC en varios tipos celulares (Wallach et al., 1982; Collins et al., 1984; Rosa et al., 1983). Puesto que un antígeno es reconocido por células T sólo cuando se presentan en el contexto de moléculas MHC de clase I o II, se cree que un mecanismo importante por el cual el IFN-\gamma ejerce un efecto antitumoral es regular por incremento la presentación antigénica aumentando la expresión de MHC. Para testar si había un efecto biológico del IFN-\gamma sobre la expresión de MHC por células de melanoma, se examinó la expresión del antígeno MHC de clase I tras la transducción de IFN-\gamma. Se observó una regulación por incremento variable del MHC de clase I sobre las líneas celulares de melanoma secretoras de IFN-\gamma. De forma semejante a las observaciones descritas para IL-2, se observó una amplia variación en la expresión de IFN-\gamma. Otros investigadores usando uno de los vectores de IFN-\gamma descritos ene este informe observaron un hallazgo similar en un sistema murino experimental (Restifo et al., 1992). El MHC clase I se expresaba en células tumorales SK-MEL-131 parentales antes de la infección y los niveles estaban regulados por incremento después de la transducción del gen de IFN\gamma (figura 5). SK-MEL-245 y SK-MEL-256 también expresan moléculas de HLA clase I en la superficie celular. La secreción de IFN-\gamma inducía una regulación por incremento modesta en células SK-MEL-245, pero no en SK-MEL-256. SK-MEL-19 no expresan moléculas HLA de clase I y la secreción de IFN-\gamma no tenía efecto (figura 5). Así, la regulación por incremento de moléculas de clase I tras la transducción de IFN-\gamma era variable, y la inducción de MHC debe ser evaluada en una base individual.

Crecimiento en ratones desnudos

Para testar células que representan un intervalo de secreción de IL-2, se eligieron células SK-MEL-29 y SK-MEL-245 que secretan 40 y 2 U de IL-2/ml/10^{6}, respectivamente, para ser inyectadas en ratones desnudos. Grupos de tres ratones BALB/c nu/nu se inyectaron vía subcutánea con 2,5 x 10^{5}, 5 x 10^{5} y 1 x 10^{6} células de poblaciones celulares de melanoma parentales o seleccionadas de entre las secretoras de IL-2. Todos los ratones inyectados con células parentales desarrollaron tumores palpables en 4 semanas, mientras que todos los ratones inyectados con células tumorales secretoras de IL-2 se mantuvieron sin tumor durante un período de observación de 3 meses (datos no mostrados). Ninguna de las líneas celulares de melanoma secretoras de IL-2 generaron tumores en los ratones desnudos, demostrando que la IL-2 secretada era biológicamente activa y sugiriendo que células efectoras, posiblemente células NK, se activaban in vivo. Células tumorales secretoras de IL-2 o IFN-\gamma irradiadas con 10.000 rads e inyectadas inmediatamente en ratones desnudos no formaron tumores ninguna de las dos. Las células tumorales secretoras de IFN-\gamma sin irradiar formaron tumores como se esperaba, ya que la acción de IFN-\gamma es específica de especie (Langer et al., 1988).

Retrovirus competentes de replicación no se generan

Los retrovirus murinos competentes de replicación pueden surgir durante los procedimientos experimentales por recombinación con secuencias endógenas semejantes a las retrovirales. La presencia de retrovirus murino competente de replicación se ensayó en un grupo de líneas celulares tumorales transducidas. Las líneas celulares de melanoma y carcinoma renal se habían transducido 21 a 28 días previamente con DC/AD/R/IL2 y los sobrenadantes se han usado para infectar células NIH3T3. Después de crecer las células NIH3T3 durante 21 días, se valoraron la resistencia a G418 y la actividad transcriptasa inversa. No se detectó resistencia a G418. No se vio actividad transcriptasa inversa usando el Ensayo de Amplificación de HeLa y NIH3T3 (figura 6).

Discusión

En este informe, se demostró que es posible transducir células de melanoma humanas con el gen de IL-2 o IFN-\gamma usando vectores retrovirales e inducirlas a que secreten citoquinas constitutivamente. La expresión de varios genes de citoquinas, incluyendo IL-2 (Gansbacher et al., 1990b; Fearon et al., 1990; Ley et al., 1991), IL-4 (Tepper et al., 1989), IFN-\gamma (Gansbacher et al., 1990a; Watanabe et al., 1988), IL-6 (Porgador et al., 1992) e IL-7 (Hock et al., 1991) se ha demostrado que ejercen efectos antitumorales en modelos animales. Varios de estos estudios han demostrado una función para los linfocitos T citotóxicos en el rechazo tumoral (Gansbacher et al., 1990a; Fearon et al., 1990; Ley et al.,1991; Gansbacher et al., 1990b; Hock et al., 1991; Porgador et al., 1992). Se examinó la terapia con genes de citoquinas en melanoma, con el objetivo de usar células transducidas en un protocolo de inmunoterapia activo. Entre los cánceres humanos mejor estudiados, el melanoma se demostró que expresa antígenos tumorales (Van Der Bruggen et al., 1991) y estos antígenos tienen epítopos reconocidos por CTL (Coulie et al., 1992). Ambos determinantes, compartido y únicos (por ejemplo, expresado únicamente por células tumorales autólogas) pueden ser reconocidos por CTL en una forma restringida al MHC sobre células de melanoma, junto con HLA-A1 o con HLA-A2 (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Kawakami et al., 1992; Crowley et al., 1992). Lo más importante, desde una perspectiva terapéutica, uno de los genes clonados a partir de una células de melanoma humano se expresaba en varias células tumorales, incluyendo células no de melanoma, pero todavía no se ha detectado en células normales (Van Der Bruggen et al., 1991).

Se ha demostrado que los CTL ejercen un efecto tumoricida sobre células de melanoma (de Vries et al., 1984; Anichini et al., 1985; Mukherji et al., 1983). Coulie et al. publicaron que podían detectarse precursores de CTL en sangre periférica de pacientes con melanoma, con una frecuencia que oscilaba desde 1/900 a 1/33.000 (Coulie et al., 1992). La frecuencia de precursores citotóxicos en estos pacientes con melanoma está en el intervalo de la observada tras respuestas inmunes eficaces contra virus tales como citomegalovirus (CMV), virus del herpes simple (HSV) y varicela zoster (Hickling et al., 1987; Borystewicz et al., 1988). Estos hallazgos son importantes porque sugieren protocolos de vacunación con el fin de incrementar la frecuencia de CTL, en lugar de inducirlos de novo. La evidencia de que tal expansión puede ocurrir se publicó en el modelo de tumor P815 donde la secreción in vivo de IL-2 por las células tumorales incrementaba la frecuencia de CTL circulantes específicos de tumor de 2 a 4 veces (Ley et al., 1991).

Se usaron cuatro construcciones de IL-2 y dos construcciones de IFN-\gamma en estos estudios (figura 1). Se eligieron IL-2 e IFN-\gamma porque previamente demostraron ser eficaces disminuyendo la tumorogénesis delas células que las secretaban y porque actúan tanto sobre las células efectoras como tumorales, posiblemente de forma sinérgica (Gansbacher et al., 1990a; Fearon et al., 1992; Ley et al., 1991; Gansbacher et al., 1990b; Watanabe et al., 1988). Como se esperaba, las células infectadas con los vectores recombinantes variaban con respecto a la cantidad de citocina secretada (tabla 1). En la masa de las células infectadas, se encontraron clones que secretaban desde 0 U/ml a 691 U/ml/10^{6} células. Si las células tumorales transducidas expresaban un antígeno tumoral conocido como MAGE-1 se puede seleccionar el clon que exprese los niveles más altos de IL-2 y MAGE-1 para la vacunación en un intento de maximizar la expansión clonal de la población de CTL específica de MAGE-1 in vivo. Si no se conoce el antígeno tumoral es razonable usar una masa de células tumorales secretoras de citoquinas seleccionadas como vacuna para mantener la heterogenicidad antigénica.

Tras la irradiación con 10.000 rad, las células continuaban produciendo cantidades significativas de IL-2 durante 3 a 4 semanas (figura 4 y tabla 3). La irradiación gamma realmente causaba un incremento de la liberación de citoquinas durante un período corto, posiblemente debido al escape de citoquinas desde las células muertas. Estas observaciones pueden ser importantes en la aplicación clínica donde es deseable evitar inyectar células tumorales viables en los pacientes.

La secreción de IFN-\gamma por las células tumorales se observó que incrementaba la expresión de MHC de clase I en algunas líneas, pero no en otras, aunque la base de este fenómeno no es aparente (figura 5). Ya que los antígenos tumorales se presentan a las células T en el contexto de HLA de clase I (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Van Der Bruggen et al., 1991) será importante seleccionar células tumorales que sean sensibles a IFN-\gamma para protocolos de vacunación.

Los resultados de esta serie de experimentos demostraron un efecto biológico in vivo, ya que las células secretoras de IL-2 fueron rechazadas en ratones BALB/c nu/nu, mientras que los homólogos normales formaban tumores. Puesto que a los ratones desnudos les faltan las células T, pero tienen células NK, se asumió que la activación de células NK participada en el rechazo del tumor. Estos resultados apoyan sólo la noción de que la IL-2 secretada es biológicamente activa y no predice el efecto sobre una población de CTL. El IFN-\gamma humano sería responsable del rechazo del tumor. La acción de IFN-\gamma es específica de especie (Langer et al., 1988) y las células de melanoma que secretan IFN-\gamma humano formaban tumores de forma idéntica a las células de melanoma parentales.

Estos datos experimentales demuestran que las células de melanoma secretoras de IL-2 o IFN-\gamma están disponibles para uso clínico. Las células autólogas pueden o no ser preferibles a las células alogénicas para protocolos de vacunación, sin embargo, sólo en el 20 al 30% de los pacientes con melanoma se pueden establecer líneas celulares tumorales. Puesto que los antígenos tumorales compartidos están restringidos al MHC de clase I (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Van Der Bruggen et al., 1991) debería ser posible usar líneas celulares alogénicas establecidas transducidas con genes de citoquinas para vacunación. Al menos se han descrito dos moléculas de MHC de clase I, HLA-A1 y HLA-A2, que presentan antígenos de melanoma compartidos (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Van Der Bruggen et al., 1991). Ya que el 40% de la población caucasiana expresa las moléculas HLA-A2, el uso de células de melanoma alogénicas que expresan HLA-A2 y antígenos de melanoma compartidos es una estrategia atractiva. En este estudio, SK-MEL-29, SK-MEL-245 y SK-MEL-256 (tabla 1) expresan la molécula HLA-A2. HLA-A2 compatible de/con pacientes de melanoma serían candidatos para tal protocolo de vacunación puesto que la mayoría de los melanomas HLA-A2 positivos expresan antígenos de melanoma compartidos (Kawakami et al., 1992). HLA-A compatible con células tumorales irradiadas alogénicas que secretan IL-2 tienen el potencial de activar y amplificar las células efectoras citotóxicas que reconocen péptidos presentados por células tumorales autólogas en el contexto de HLA compatible. Datos publicados recientemente muestran una expansión 80 veces más potente de los clones específicos de antígeno si las células presentadoras de antígeno expresan el antígeno con una señal coestimuladora (Liu et al., 1992).

Una de las líneas celulares descritas en este informe, SK-MEL-29, se ha usado ya como vacuna alogénica en 17 pacientes con melanoma (Livington et al., 1985). SK-MEL-29 expresa antígenos de diferenciación de melanocitos bien caracterizados. Ninguno de los pacientes vacunados desarrolló una respuesta de anticuerpos contra estos antígenos de diferenciación, documentando que las células tumorales irradiadas sólo son inadecuadas como estimuladoras de una respuesta humoral antitumoral. La inducción de respuestas IgG de alta afinidad requiere la cooperación de células T CD4^{+}. Así, la producción de IgG de alta afinidad contra antígenos de diferenciación de melanocitos sería también una indicación de que tal vacunación podría activar células T hospedadoras.

A pesar de los datos experimentales que lo apoyan, un protocolo de vacunación usando células tumorales secretoras de IL-2 puede fallar. Por ejemplo, la irradiación puede disminuir la inmunogenicidad de las células tumorales, los vectores diseñados pueden no ser óptimos y las cantidades de IL-2 secretadas podrían ser insuficientes, o las células tumorales podrían secretar factores supresores previniendo la expansión eficaz de CTL. Serán necesarias aproximaciones sistemáticas a cada uno de los problemas potenciales. Los presentes resultados demuestran que los vectores retrovirales pueden usarse para introducir genes de citoquinas en células tumorales humanas. Las líneas celulares tumorales humanas transducidas se pueden mantener en cultivo durante varios meses, durante cuyo tiempo continúan secretando citoquinas de una forma estable. El rechazo de tumores secretores de IL-2 por ratones desnudos y la regulación por incremento de los genes del MHC de clase I en algunas de las células tumorales demuestra que las citoquinas secretadas son biológicamente activas.

Estos datos proporcionan el apoyo científico y práctico para protocolos de vacunación activos usando transferencia retroviral de genes de citoquinas en un intento de incrementar la frecuencia de precursores citotóxicos preexistentes en la circulación de los pacientes portadores de tumores.

Las citoquinas son importantes moduladores de las respuestas antitumorales del hospedador. Dos de estas citoquinas, interleucina-2 (IL-2) e interferón-gamma (IFN-\gamma), se producen tras la activación inducida por antígeno (Ag) de linfocitos cooperadores. Las citoquinas se liberan en los alrededores más cercanos donde interaccionan con los receptores adecuados en las poblaciones de células efectoras o son degradadas rápidamente. Para mimetizar esta liberación fisiológica de citoquinas en el sitio efector-diana, se usaron vectores retrovirales para transducir células de melanoma con el ADNc de IL-2 o IFN-\gamma. Se transdujeron cinco líneas celulares de melanoma con IL-2 o IFN-\gamma que contenían vectores y secretaban IL-2 de 1 a 40 U/ml/10^{6} células/48 h o IFN-\gamma de 1 a 8 U/ml/10^{6} células/48 h, respectivamente. Tras la irradiación gamma, estas células continuaron secretando citoquinas durante aproximadamente 3 a 4 semanas. La secreción de IFN-\gamma inducía la regulación por incremento de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I en un subgrupo de líneas celulares de melanoma. La producción de IL-2 por xenoinjertos de melanoma humano inducían el rechazo tumoral en ratones BALB/c nu/nu demostrando el efecto in vivo de esta citocina. Este estudio demuestra que a) las células de melanoma humano se pueden transducir de forma estable con vectores retrovirales que contienen citoquinas, b) las citoquinas son secretadas constitutivamente por las células tumorales transducidas y tienen los efectos biológicos esperados in vitro e in vivo, y c) tras la irradiación gamma, las citoquinas continúan secretándose durante varias semanas. Estos datos sugieren que las células tumorales alogénicas o autólogas secretoras de citoquinas irradiadas pueden usarse en protocolos de vacunación para pacientes con cáncer.

Segunda serie de experimentos

Un estudio piloto de inmunización con HLA-A2 compatible con células de melanoma alogénicas que secretan interleucina-2 en pacientes con melanoma metastásico

El objetivo de esta serie de experimentos es inmunizar pacientes HLA-A2 positivos con células de melanoma alogénicas HLA-A2 compatibles que se han alterado para secretar interleucina-2.

Antecedentes Melanoma maligno

Anualmente se diagnostican más de 32.000 casos de melanoma en los Estados Unidos, lo que tiene como resultado más de 8.000 muertes (American Cancer Society, 1989). La actual terapia sistémica para melanoma metastásico es inadecuada. Dacarbazina (DTIC) es el agente quimioterapéutico único más activo y se emplea mucho en el tratamiento de pacientes con enfermedades metastásicas, con proporciones de respuesta que oscilan desde 14 a 20% (Comis, 1976; Carbone et al., 1976; Luikart et al., 1984; Costanza et al., 1977; Bellet et al., 1979). Clínicamente no es común una regresión significativa de las metástasis viscerales. Las nitrosoureas se han usado con iguales resultados decepcionantes (Comis, 1976; Carbone et al., 1976; Luikart et al., 1984; Costanza et al., 1977; Bellet et al., 1979). La quimioterapia de combinación no ha mejorado claramente la proporción de respuesta observada con terapia de agente único, y tiene mayor toxicidad (Luikart et al., 1984; Costanza et al., 1977; Bellet et al., 1979).

El fallo de los agentes quimioterapéuticos convencionales para impactar sobre el tratamiento del melanoma metastásico ha dado lugar al uso de modificadores de la respuesta biológica en ensayos clínicos. Los estudios han usado interleucina-2 (IL-2) con o sin células LAK (Rosenberg, 1988; Parkinson et al., 1990), interferón (Creagan et al., 1984) y anticuerpos monoclonales (Vadhan-Raj et al., 1988), con proporciones de respuestas que oscilaban desde 19 a 23%. Estas proporciones de respuesta son modestas en los regímenes de tratamiento empleados actualmente, a veces con considerable toxicidad.

Estudios de vacunación

Cada década, desde el cambio de siglo, se han visto esfuerzos para desarrollar vacunas contra el cáncer, y éstos han tomado la forma de tejidos tumorales frescos autólogos o alogénicos, células tumorales en cultivo o células tumorales modificadas por agentes químicos, enzimas o infección viral. El melanoma maligno ha sido de lejos el principal tipo de cáncer en estos estudios. En general, estos ensayos no han producido evidencias convincentes de la eficacia terapéutica cuando se controlaban apropiadamente (Oettgen et al., 1991).

Las pruebas de vacunas contra el cáncer humano implican incertidumbres que van desde el tipo apropiado, dosis, ruta y frecuencia de vacunación hasta la selección del paciente adecuado y evaluación de la respuesta clínica. Dadas la serie de variables, un análisis secuencial de la eficacia, si se evaluaran en repuesta tumoral clínica aislada, consumiría muchísimo tiempo. Para el desarrollo de una vacuna contra el cáncer inmunogénica se requieren métodos para evaluar la eficacia que sean rápidos y objetivos, y que guíen el proceso etapa por etapa de la construcción y prueba de la vacuna. Con respecto a las vacunas contra enfermedades infecciosas, las respuestas serológicas a antígenos bacterianos y virales han sido una etapa esencial en su desarrollo. La falta de pruebas comparables de inmunidad humoral y celular para monitorizar la inmunogenicidad de las vacunas contra el cáncer en humanos ha sido un impedimento principal para investigar esta estrategia a la terapia del cáncer.

A principios de los años 70, varios grupos hicieron intentos para demostrar una respuesta inmune específica a la vacunación en pacientes que recibieron vacunas contra el cáncer. La mayoría de estos estudios se hicieron en pacientes con melanoma, e implicaban pruebas de hipersensibilidad cutánea retardada, citotoxicidad de linfocitos, inhibición de la migración de linfocitos y varios ensayos serológicos. Debido a las dificultades que se encontraron en el análisis de las reacciones alogénicas (en la mayoría de los casos el suero, los linfocitos testados, las células de melanoma usadas para la construcción de la vacuna o la preparación de las células diana no venían del mismo paciente), estos estudios no proporcionaban evidencias inequívocas que una respuesta inmune específica del tumor a las vacunas (Oettgen et al., 1991).

Una imagen más clara surgió cuando el análisis se restringió a reacciones serológicas autólogas. Aunque esta estrategia depende del establecimiento de las líneas celulares tumorales de cada paciente del estudio, las pruebas de combinaciones autólogas de células tumorales y sueros eliminaba las reacciones confusas con antígenos normales alogénicos de la superficie celular. El tipaje autólogo define tres clases de antígenos de superficie en las células de melanoma. Los antígenos de clase I están restringidos a los tumores autólogos. Los antígenos de clase II son antígenos tumorales compartidos que se encuentra en células tumorales autólogas así como en alogénicas; algunos antígenos de clase II se encuentran en un grupo restringido de tipos de células normales y por tanto, se pueden considerar como antígenos de diferenciación autoantigénica. Los antígenos de clase III están ampliamente distribuidos tanto en células malignas como en normales (Old, 1981). Con el desarrollo de los sistemas de tipaje autólogo para definir los antígenos de la superficie celular de melanomas, se dispuso de pruebas serológicas con los requisitos de sensibilidad y especificidad que pudieron usarse para calibrar la inmunogenicidad de las vacunas contra melanoma. Una serie de ensayos con vacunas que contenían antígenos de melanoma de clase I o II mostraron, sin embargo, que por vacunación se inducía una respuesta anticorpal contra los antígenos relevantes de clase I o II sólo en casos excepcionales, aunque no faltaba respuesta inmune humoral contra otros componentes de la vacuna (Livingston et al., 1985). La especulación sobre las razones de las dificultades encontradas en estos intentos de inducir una respuesta anticorpal contra antígenos de melanoma de clase I o clase II produce un intervalo de posibilidades que incluyen insuficiente sensibilidad de las pruebas serológicas, presentación de antígeno poco propicia en las vacunas, restricción genética de la reactividad con los antígenos del melanoma y supresión de la producción de anticuerpos por células supresoras o anticuerpos antiidiotipo.

Con la llegada de la tecnología de hibridomas, se identificaron varias proteínas, glicoproteínas y glicopéptidos como constituyentes de la superficie celular del melanoma humana, candidatos para la construcción de vacunas. Destacan entre ellos los gangliósidos GM2, GD2 y GD3. Vacunas que contenían GM2 purificado han mostraron que provocaba la producción de anticuerpos GM2 en pacientes con melanoma (Livingston et al., 1987; Tai et al., 1985) cuando se administran con BCG como adyuvante después del pretratamiento con baja dosis de ciclofosfamida para contrarrestar la actividad supresora.

La inmunidad celular de los antígenos del cáncer, en oposición a la inmunidad humoral, ha sido de mayor interés desde que se mostró a principios de los años 60 que la inmunidad específica a la reinmunización con sarcomas inducidos químicamente, puede transferirse al ratón con linfocitos de donantes inmunizados, pero no con el suero. Definir la especificidad de las reacciones de inmunidad celular contra el cáncer ha sido mucho más difícil que definir las reacciones de inmunidad humoral contra los antígenos del cáncer. Con respecto a esto, el descubrimiento del factor de crecimiento de células T, interleucina-2, que permite el cultivo y la clonación de linfocitos T, ha sido un paso principal hacia delante y ha abierto una nueva era en el estudio de la inmunidad de la célula T. Se han aislado clones de células T citotóxicas con reactividad restringida a melanoma autólogo de la sangre de los pacientes en varios laboratorios, y se han obtenido resultados similares en estudios de clones derivados de linfocitos infiltrados en tumor (TIL) (Hainaut et al., 1990). En algunos casos estos clones han mostrado una especificidad exquisita para melanoma autólogo (Oettgen et al., 1991). En algunos caos, las moléculas de MHC presentadoras pueden identificarse como moléculas de clase I por inhibición de la lisis con anticuerpos dirigidos contra los determinantes HLA. En el caso de la línea celular de melanoma SK-MEL-29 (paciente AV de Livingston et al., 1979), establecida en esta institución, al menos dos antígenos son reconocidos por clones de células T autólogos y citotóxicos en asociación con HLA-A2 (Wolfel et al., 1989).

HLA-A2 y HLA-A1 han sido identificados como elementos de restricción en otros melanomas y también en sarcomas (Knuth et al., 1991). Se ha demostrado que el HLA-A2 expresado en células de melanoma humano presenta antígenos de melanoma compartidos reconocidos por células T derivadas de sangre periférica, nódulo linfático regional e infiltrados en tumores. Por tanto, HLA-A2 es capaz de presentar antígenos que están compartidos entre las células de melanoma, pero aparentemente no expresados por otros tipos de células. El reto por resolver, con respecto al campo de la inmunidad celular, es la definición estructural de las dianas reconocidas por las células citotóxicas en las células tumorales humanas. Un avance principal en este área ha sido la clonación del gen que codifica para un antígeno tumoral de ratón reconocido por células T citotóxicas y la identificación de su mutación (Deplaen et al., 1988). La misma estrategia está siendo aplicada ahora al melanoma humano, y se ha identificado un gen que codifica para un antígeno reconocido por células T citolíticas en un melanoma humana. En este caso, el antígeno aparece presentado por HLA-A1 (T. Boon, comunicación personal H. Oettgen ) (Van Der Brugeen, 1991).

Efectos biológicos in vitro de la interleucina-2

La interleucina-2 es una linfocina producida por las células T cooperadoras y estimula a las células T, células B y células asesinas (NK). En estudios in vitro, se ha demostrado que la IL-2 inducía la proliferación de células T específicas de antígeno. Las células T cooperadoras, citotóxicas y supresoras de pacientes con melanoma se crecieron in vitro cultivándolas en presencia de IL-2 y de células presentadoras de antígeno (Glasebrook et al., 1982). Las respuestas B in vitro también aumentaban con IL-2 (Roehm et al., 1983). El crecimiento de células T con IL-2 también puede llevar a las células T a secretar otras linfocinas, incluyendo interferón-\gamma, IL-1, IL-4, IL-6, GM-CSF y TNF-\alpha.

Interleucina-2 en estudios humanos

Varios investigadores han estudiado la administración sistémica de IL-2 en pacientes con cáncer avanzado (Rosenberg, 1985; Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1989). La IL-2 sistémica ha mostrado una actividad modesta en pacientes con melanoma avanzado y con otros tumores, con una tasa de respuesta publicada de un 15 a 20% (Rosenberg et al., 1987). El principal efecto de la IL-2 parece ser la expansión de las poblaciones celulares efectoras que tienen la capacidad para matar los tumores in vitro. Sin embargo, debido a la corta vida media de la IL-2, se usaron altas dosis que eran muy tóxicas. La hipotensión y el síndrome de permeabilidad capilar con descenso de la resistencia vascular sistémica conducían a un edema pulmonar intersticial, azotemia prerrenal, arritmias cardíacas e infarto de miocardio (Rosenberg, 1985; Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1989).

Transferencia de genes en modelos animales

Varios laboratorios han demostrado que la introducción de genes de citoquinas, tales como IL-2, IL-4 (Tepper et al., 1989), IFN\gamma (Watanabe et al., 1989; Gansbacher et al., 1990), TNF-\alpha (Asher et al., 1991) y G-CSF (Colombo et al., 1991) en células tumorales lleva a su rechazo por un hospedador inmunológicamente competente en sistemas de modelos animales. La secreción de G-CSF o de IL-4 ha conducido a respuestas inflamatorias localizadas en el lugar del tumor sin inducción aparente de memoria inmunológica (Tepper et al., 1989; Colombo et al., 1991). Estudios iniciales de Tepper et al. (Tepper et al., 1989) demostraron que la secreción localizada de IL-4 en el lugar del tumor se caracterizaba por un acumulo de eosinófilos y macrófagos. IL-2, interferón-\gamma y TNF-\alpha por otro lado, han inducido respuestas inmunes a largo plazo que conducen al rechazo de reinmunizaciones tumorales potencialmente letales en puntos posteriores de tiempo (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b; Tepper et al., 1989; Watanabe, et al., 1989). Fearon et al. (Fearon et al.,1989) introdujeron el gen de IL-2 en un carcinoma de colon murino pobremente inmunogénico. Los tumores secretores de IL-2 fueron rechazados y, posteriormente indujeron una respuesta de células T citolítica efectiva. La depleción de células CD8+ in vivo anulaba la respuesta antitumoral celular, que implica una función central de las células CD8 positivas restringidas al MHC de clase I.

Para aproximarse más de cerca al modo fisiológico de la secreción de citocina generada durante una respuesta inmune, el gen de la IL-2 se introdujo directamente en una línea celular de fibrosarcoma murino (CMS5). De esta forma se alcanzó una secreción localizada de bajos niveles de citocina que llevaron a la regresión de las células tumorales inyectadas (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b). Cuando los ratones controles fueron reinmunizados con el tumor, murieron antes de 45 días. Los ratones reinmunizados con células tumorales secretoras de IL-2 rechazaron las células tumorales implantadas y se curaron. Estos ratones desarrollaron memoria inmunológica específica. La reinmunización con dosis potencialmente letales de células tumorales CMS5 parentales después de varios meses llevó al rechazo del tumor, mientras que un tumor no relacionados creció y mató a los ratones inmunizados, demostrando la especificidad de la respuesta. Los linfocitos tomados de los bazos de animales inmunizados eran capaces de matar al tumor in vitro a través de extender la vida de los ratones. Digno de mención es que solo se generaron respuestas citolíticas débiles contra las células tumorales CMS5 después de la reinmunización con células tumorales parentales; estas respuestas fueron transitorias y desaparecieron tres semanas después de la implantación del tumor. Sin embargo, los ratones inyectados con las células tumorales secretoras de IL-2 generaron actividad citolítica específica de tumor que duró durante más de 75 días.

Rosenberg et al. (datos no publicados) han reproducido estos resultados en el tumor pobremente inmunogénico MCA-102. A pesar de muchos intentos, nunca fueron capaces de generan una respuesta antitumoral celular usando células tumorales no modificadas. La introducción del gen de la IL-2 en estas células incrementaba su inmunogenicidad hasta un nivel en el cual se generaba un rechazo del tumor y memoria. Además, la coinyección de las células tumorales productoras de IL-2 con células tumorales parentales no modificadas producía una respuesta suficientemente fuerte para rechazar no sólo las células tumorales secretoras de linfocinas sino también las células tumorales no modificadas.

Estos hallazgos también se han reproducido en el MSKCC en diferentes tipos de tumores de ratón, incluyendo el melanoma B16, el linfoma de células B 38C13, y el carcinoma de vejiga MBT2. Se ha observado toxicidad relacionada con IL-2 en cualquiera de los animales reinmunizados con las células tumorales secretoras de IL-2. Experimentos adicionales usando células CMS5 secretoras de IL-2 irradiadas han demostrado que no había diferencia en su capacidad para inducir memoria inmunológica in vivo si se comparaba con las células tumorales secretoras de IL-2 no irradiadas.

En resumen, la introducción y expresión constitutiva de IL-2 por las mismas células tumorales incrementaba la inmunogenicidad de varios cánceres histológicamente diferentes. A partir de estos estudios parece que la expresión persistente localizada y la secreción a bajos niveles de IL-2 puede tener un impacto en la respuesta antitumoral del hospedador con ausencia de cualquier toxicidad detectable.

Transferencia de genes en humanos

Más recientemente, Rosenberg et al. tomaron linfocitos infiltrados en tumores autólogos alterados genéticamente y entonces los inyectaron en pacientes con tumores metastásicos refractarios (Rosenberg et al., 1990). Un vector retroviral que contenía el gen de la resistencia a la neomicina se introdujo en linfocitos autólogos para monitorizar la reinfusión de las células en los pacientes. Las células de cuatro pacientes de los cinco informados crecieron de forma eficaz en cultivos tisulaes con G418, un análogo de neomicina. Estas células que mostraban resistencia a la neomicina se inyectaron por vía intravenosa a los pacientes junto con IL-2 sistémica. Se recogió periódicamente la sangre periférica y se detectaron células mononucleares circulantes con resistencia a neomicina. No se vieron toxicidades adicionales como resultado de la alteración genética. No se recuperaron virus intactos de ningún paciente. Rosenberg concluyó que este procedimiento era viable y seguro (Rosenberg et al., 1990).

Estudios previos de seguridad demostraron que la exposición de primates a infusiones grandes de virus anfotrópicos murinos infecciosos no producían efectos patológicos graves (Cornetta et al. 1990). Veintiún primates trasplantados con médula ósea modificada por gen retroviral no mostraron pruebas de toxicidad relacionada con la transferencia del gen durante cinco años después de la infusión (Kantoff et al., 1987). El primer paciente deficiente en adenosina deaminasa con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) experimentó una transferencia eficaz del gen de la adenosina diaminasa por mediación retroviral aproximadamente hace un año en el NCI (Kantoff et al., 1987). Hasta ahora, los investigadores observaron en el paciente una reconstrucción parcial de la función inmune celular sin ningún efecto adverso.

Para investigar si los hallazgos en el sistema murino puede hacerse extensivos, se infectados líneas celulares tumorales humanas con genes de citoquinas usando vectores retrovirales. Hasta la fecha, el gen de la IL-2 humana, el gen del IFN-\gamma humano y el gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico se han transducido con éxito en varias líneas celulares humanas en el MSKCC. En colaboración con el Dr. Ray Taetle (Universidad de Arizona), se introdujo el gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico en la línea celular de linfoma de Burkitts, Namalwa; se mostró que el receptor se expresaba en la superficie de las células y era completamente funcional (Oval et al., 1991). La estimulación de estas células transducidas con el factor del crecimiento epidérmico llevaba a la unión apropiada del ligando y a la transducción de la señal (Oval et al., 1991). Además, el gen de la IL-2 o del IFN-\gamma se introdujeron y se expresaron en líneas celulares de melanoma humano primario establecido. Estas células de melanoma humana modificado genéticamente secretaban constitutivamente al sobrenadante hasta 20 U/ml de IL-2 recombinante. La expresión constitutiva de IFN-\gamma llevaba a la regulación por incremento de los antígenos de HLA de clase I y clase II en la superficie de las células de melanoma. La inyección de las células tumorales secretoras de IL-2 en ratones desnudos llevaba al rechazo del tumor mientras que las células parentales no modificadas no eran rechazadas. La irradiación del melanoma alterado genéticamente no anulaba la secreción de IL-2 (véase el apéndice F). La IL-2 se secretó de forma continuada durante 2 ó 3 semanas después de la irradiación letal en cantidades comparables a las células transducidas no irradiadas.

Fundamento

Se propone un estudio para determinar si la inmunización con células de melanoma alogénico que expresan un gen de IL-2 humana recombinante puede ser bien tolerada sin toxicidad evidente. Hay una experiencia sustancial en el MSKCC y en otras instituciones que de se ha establecido la seguridad general de la inmunización usando células tumorales alogénicas irradiadas. La elección de células tumorales HLA-A2 positivas alogénicas se basa en dos consideraciones. Primera, el uso de una única línea celular inmunizante establecida evita la necesidad de infectar células tumorales autólogas para cada paciente. Crecer células tumorales autólogas en cultivos tisulares puede ser un procedimiento difícil y requiere mucho tiempo. Puesto que aproximadamente el 40% de los norteamericanos son HLA-A2 positivos, una vacuna tumoral producida a partir de líneas celulares de melanoma HLA-A2 compatible podría ser utilizada en una subpoblación sustancial de pacientes con melanoma. Se han llevado a cabo estudios preclínicos con una única línea celular, SK-MEL-29. Esta línea celular expresa varios antígenos restringidos de diferenciación de melanocito, como se ha determinado por tipaje con anticuerpo monoclonales, y antígenos MHC de clase II. Además, SK-MEL-29 se derivó a partir de un paciente (AV) con melanoma en el estadio extensivo III que mostró tener células T citotóxicas CD8 positivas en su sangre periférica que lisaban el tumor autólogo de una manera restringida a HLA-A2 (Roehm et al., 1983; Basham et al., 1983) (véase estudios de vacunación y protocolo clínico). A pesar del melanoma extensivo y recurrente, el paciente AV está vivo y libre de la enfermedad desde hace más de 15 años de su tratamiento inicial. En segundo lugar, hay evidencias sustanciales de que las células de melanoma pueden presentar antígenos compartidos restringidos (es decir, antígenos expresados por melanomas autólogos y alogénicos pero no por ciertos tipos de células de no-melanoma) a células T autólogas. El protocolo estará restringido a pacientes que sean HLA-A2 positivos.

Líneas celulares de melanoma

Una línea celular de melanoma bien caracterizada y establecida, SK-MEL-29, se ha usado para la expresión de IL-2. SK-MEL-29 es una línea celular de melanoma bien caracterizada de la que se sabe que expresa varios antígenos de diferenciación de melanocitos y gangliósidos (Wolfel et al., 1989; Houghton et al., 1982). SK-MEL-29 se estableció a partir de un paciente, AV, en 1975 a partir de metástasis de nódulo linfático regional (véase Livingston et al., 1979). El paciente AV originalmente fue diagnosticado con melanoma de Clark en estadio IV de la pared torácica anterior en 1974 a la edad de 18 años. En marzo de 1974, el melanoma recurrió en múltiples nódulos linfáticos de la axila izquierda con una invasión profunda de tejidos blandos. Esta enfermedad se reseccionó y recibió inmunoterapia adyuvante experimental con Corynebacterium parvum En agosto de 1975, la enfermedad recurrió en el área subclavícular e infraclavicular izquierdo. Tuvo una resección quirúrgica e inició el tratamiento de vacunación con células de melanoma autólogo irradiado y adyuvante BCG. En diciembre de 1975, el paciente tuvo una tercera recurrencia de tumores en la parte izquierda del cuello con invasión de la vena axilar y del plexo branquial. Fue tratado con resección quirúrgica seguida de radioterapia, luego con quimioterapia adyuvante con dacarbazina en 1976 y 1977. En 1977, reinició la vacunación con células tumorales autólogas y BCG. Desarrolló un melanoma recurrente en la parte derecha del cuello en febrero de 1978 que fue reseccionado. La vacuna se continuó hasta 1980. A partir de 1991, no ha tenido ninguna recurrencia posterior del melanoma. Se obtuvieron células T CD8 positivas de sangre periférica después de la vacunación que lisaban de forma efectiva a las células tumorales SK-MEL-29 autólogas de un modo restringido a HLA-A2, y se ha publicado ampliamente por Knuth y colaboradores (Wolfel et al., 1989; Knuth et al., 1984)

La línea celular de melanoma SK-MEL-29 se infectó con el vector retroviral, NAP-AD/IL2 (DC/AD/R/IL2). Estas células tumorales secretan IL-2 de forma constitutiva y estable. Las células serán irradiadas con 10.000 rads antes de la inyección, para asegurar su incapacidad para proliferar. Se usarán dos niveles de dosis para las vacunas.

Protocolo clínico

Este es un estudio piloto de inmunización con células de melanoma alogénicas SK-MEL-29 que han sido alteradas para secretar IL-2, dadas como vacuna a pacientes con melanoma metastásico en estadio IV, para probar la seguridad de este procedimiento. Los pacientes serán tipados para el HLA del tejido. Los pacientes que sean HLA-A2 positivos recibirán vacunaciones de células SK-MEL-29 alogénicas que secretan IL-2. El número esperado para este estudio es de doce pacientes. La duración esperada del ensayo será de seis a doce meses.

Los cultivos tisulares de células SK-MEL-29 (DC/AD/R/IL2) se crecerán en los laboratorios de los Dres. Bernd Gansbacher y Alan Houghton. Las células de melanoma han sido infectadas con el vector retroviral NAP-AD/IL2. Las células que secretan IL-2 serán irradiadas (10.000 rads) y dadas en una serie de cuatro vacunaciones. Si el paciente tiene una respuesta clínica según se define en la sección criterios para una respuesta terapéutica, entonces se darán reinmunizaciones adicionales hasta un año o hasta la progresión de la enfermedad. Seis pacientes recibirán una vacuna de dosis baja y los seis adicionales recibirán dosis alta.

Criterios de participación del paciente

Los pacientes deberán cumplir los siguientes criterios para participar en la admisión al estudio:

1. Pacientes con confirmación histológica del melanoma maligno metastásico en el MSKCC.

2. Enfermedad en estadio IV que no es curable por resección quirúrgica.

3. Los pacientes han de tener una enfermedad mensurable o evaluable.

4. Estado funcional según Karnofsky mayor o igual al 70% y esperanza de vida superior a 4 meses.

5. Función hematológica adecuada con WBC \geq 3.000/mm^{3}, recuento absoluto de linfocitos > 1.000/mm^{3}, hemoglobina \geq 9 y plaquetas \geq 100.000/mm^{3}.

6. Función renal y hepática adecuada (creatinina en suero \leq 2,5 mg/dl y bilirrubina \leq 1,7 mg/dl).

7. Al menos 4 semanas desde cualquier radioterapia, inmunoterapia o quimioterapia anterior (6 semanas para nitrosureas) y recuperación completa de dicho tratamiento.

8. La capacidad para dar consentimiento informado por escrito.

9. Edad \geq18 años.

10. No historia de otras enfermedades concurrentes excepto carcinoma celular basal, carcinoma de células escamosas de la piel o carcinoma in situ de cervix.

11. No esteroides sistémicos desde al menos una semana antes del tratamiento.

12. No metástasis intracraneales o hepáticas múltiples.

13. Los pacientes han de ser HLA-A2 positivos.

Criterios de exclusión

Las siguientes condiciones y situaciones harán que los pacientes no participen en este estudio:

1. Enfermedades médicas intercurrentes serias, incluyendo enfermedad cardiaca significativa (New York Heart Association Class III o IV), angina de pecho o infarto de miocardio durante los 6 meses previos.

2. La presencia de una infección activa, incluyendo infección del tracto urinario.

3. La presencia de metástasis activas intracraneales o hepáticas múltiples.

4. Mujeres embarazadas o en lactancia.

5. Pacientes que han recibido más de dos regímenes de quimioterapia sistémica. El uso de bajas dosis de ciclofosfamida como parte de un programa de vacunación tumoral previo no debería constituir como un régimen quimioterapéutico sistémico previo.

6. Los pacientes que requieran de terapia continuada con corticoesteróides no podrán participar.

Terapia concurrente

Las siguientes terapias están prohibidas mientras que los pacientes estén siendo tratados con este protocolo: radioterapia, quimioterapia, corticoesteroides (excepto los administrados en circunstancias en que peligre la vida del paciente) u otra inmunoterapia.

Evaluación pretratamiento

1. Historia y examen físico, incluyendo documentación de todas las enfermedades mensurables.

2. Altura, peso y estado funcional.

3. Perfil de selección, BUN y creatinina.

4. CDC, diferencial y recuento de plaquetas.

5. Radiografía del pecho.

6. EKG.

7. Barrido CT craneal.

8. Se obtendrá un barrido CT abdominal si el paciente tiene unas pruebas de función hepática anormal y una LDH elevada.

9. Se obtendrá sangre periférica para inmunoensayos (seis tubos de tapa verde y dos tubos de tapa roja). Estos se almacenarán en los laboratorios de los Drs. Gansbacher y Houghton.

10. Pruebas adicionales, rayos X y barridos según esté indicado en los pacientes que presenten signos y síntomas y requeridos para definir la extensión de la enfermedad del paciente.

Plan de tratamiento

Los pacientes recibirán al menos cuatro vacunaciones. Los primeros seis pacientes recibirán una vacunación de dosis baja (definido a continuación). Los seis subsecuentes recibirán los niveles de dosis más altos de vacuna. La vacuna consistirá en células tumorales alogénicas SK-MEL-29 irradiadas que habrán sido diseñadas por ingeniería genética para secretar IL-2.

Dosis baja: Aproximadamente 10 millones de células tumorales.

Dosis alta: Aproximadamente 50 millones de células tumorales.

Se dará una serie de cuatro vacunaciones de forma subcutánea en el muslo o en el brazo del paciente. Los sitios variaban con cada vacunación. Una extremidad que haya sufrido la disección de los ganglios linfáticos no se usará como sitio de vacunación. Se dará una vacuna cada dos semanas durante cuatro semanas. Se dará una vacuna de reinmunización dos meses después de la tercera. Si un paciente tiene respuesta clínica principal (CR o PR como se define en los criterios de respuesta terapéutica), se darán reinmunizaciones adicionales cada tres meses durante un año o hasta la progresión de la enfermedad. La vacunación puede continuar más de un año en los pacientes que respondan, a discreción de los investigadores principales. Los pacientes con respuesta menor o enfermedad estable recibirán estimulaciones a discreción de los investigadores principales. Se obtendrán las muestras de sangre antes de cada vacunación (véase la evaluación durante el estudio).

Si un paciente desarrolla una reacción grave a la vacuna definida como toxicidad de grado 4 (véase los criterios de toxicidad) o se deteriora su estado funcional necesitando hospitalización, este paciente no recibirá vacunaciones posteriores.

Criterios para el abandono del estudio

A) Enfermedad progresiva con la aparición de pequeñas metástasis (< 2 cm de diámetro) superficiales cutáneas, subcutáneas o de tejidos blandos. Si aparece enfermedad superficial, el paciente puede continuar con la vacunación a discreción del investigador.

B) Enfermedad intercurrente grave.

C) Alteración general o específica en la condición del paciente que puede convertir los tratamientos adicionales en inaceptables según la opinión de los investigadores.

Formulación de vacunas

Se ha demostrado que la línea celular SK-MEL-29de melanoma HLA-A2 infectada con el retrovirus NAP-AD/IL2 (DC/AD/R/IL2) secretan IL-2 por encima de 20 U/ml. El stock de la línea celular infectada con IL-2 se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó en el laboratorio del Dr. Bernd Gansbacher. Aproximadamente una semana antes de la fecha de vacunación, los viales que contenían 10 millones de células tumorales (uno para la dosis baja y cinco para la dosis alta) serán descongelados, expandidos en cultivo celular y se reanalizará la producción de IL-2. Estos cultivos se mostrarán libres de virus auxiliares, micoplasma, bacterias y hongos.

El día de la vacunación, las células se tripsinizarán, contarán y resuspenderá en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (USP) en una jeringa estéril. La jeringa y su contenido se irradiarán con 10.000 rads y se entregarán en consultas externas para la inyección subcutánea por un investigador principal o un coinvestigador designado.

Evaluación durante el estudio

1. Examen físico antes de cada vacunación.

2. CDC, recuento de plaquetas, y se hará un diferencial antes de cada vacuna.

3. Se hará un perfil químico incluyendo pruebas de función hepática, bilirrubina, creatinina y LDH cada cuatro semanas durante dos meses, y luego después de cada vacuna.

4. Se obtendrá sangre periférica para inmunoensayos (véase la sección 6.9). Se obtendrán seis tubos de tapa verde y dos tubos de tapa roja antes de la primera vacunación y una o dos semanas después de la cuarta vacunación

5. Se repetirá la radiografía del pecho cada 4 semanas durante dos meses, luego después de cada vacunación.

6. Si se observa toxicidad moderada (grado 3), se llevarán a cabo las pruebas pertinentes más frecuentemente que lo indicado en la tabla.

Evaluación de la respuesta inmune Estudios serológicos

El método más directo para medir las respuestas inmunes contra el melanoma es la detección de anticuerpos. Aproximadamente un tercio de los pacientes con melanoma metastásico tienen anticuerpos que reaccionan con células tumorales autólogas (Oettgen et al., 1991). La mayoría de estos autoanticuerpos son IgM, pero ocasionalmente hay anticuerpos de clase IgG. Varios antígenos reconocidos por estos autoanticuerpos han sido definidos en el ámbito molecular, incluyendo los glicolípidos acídicos GM2 y GD2, y la glicoproteína melanosomal gp75. La línea celular inmunizante SK-MEL-29 expresa GD2 y gp75. La detección de anticuerpos IgG inducidos por inmunización también es una posible medida indirecta de respuestas de células T cooperadoras, debido a que la inducción de respuestas IgG maduras de alta afinidad requiere de la ayuda de células T CD4 positivas. Se tendrá suero de sangre periférica de todos los pacientes para análisis serológico de anticuerpos dirigidos contra la línea celular SK-MEL-29 (incluyendo anticuerpos contra GD2 y gp75) y células tumorales autólogas cuando estén disponibles. Además, se hará un control de respuesta inmune positiva con anticuerpos contra antígenos MHC de clase I y clase II alogénicos expresados por SK-MEL-29. Se espera que la mayoría de los pacientes desarrollen fuertes respuestas IgG contra los aloantígenos de clase I y clase I expresados por SK-MEL-29. El desarrollo de anticuerpos IgG proporcionará una medida indirecta de la inducción de una respuesta cooperadora de células T contra SK-MEL-29. Se detectarán los anticuerpos contra antígenos de la superficie celular e intracelulares por:

A. Inmunoprecipitación de lisados celulares en NP40 al 1% de SK-MEL-29 metabólicamente marcadas con ^{35}metionina.

B. Ensayos de hemadsorción variada para anticuerpos IgG e IgM dirigidos contra antígenos de la superficie celular (23-27). La especificidad de las repuestas contra antígenos MHC se testarán usando linfocitos B de AV transformados con el virus de Epstein-Barr o fibroblastos de AV autólogos

Respuestas de inmunidad celular

En pacientes seleccionados, cuando se dispone de células tumorales autólogas, se pueden evaluar las respuestas inmunes celulares restringidas a MHC. Se hará un intento para incluir a aquellos pacientes de los que se tienen cultivos establecidos de células de melanoma autólogo, pero estos no están disponibles en muchos pacientes. Aunque las respuestas inmunes celulares son una medida crítica de la respuesta inmune contra el melanoma, tienen las siguientes limitaciones: a) son necesarias células tumorales autólogas para detectar las respuestas, b) son necesarias células normales autólogas y células alogénicas MHC compatibles para evaluar la especificidad de las respuestas, y c) las pruebas de citoxicidad o de respuestas cooperadores no son evidentes sin estimulación in vitro con células tumorales autólogas -este requerimiento hace difícil discernir entre las células T que han respondido al tumor y las células T precursoras que son capaces de reconocer el tumor sin respuesta in vivo. Se purificarán células mononucleares de sangre periférica por centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque. Las células se cultivarán con células tumorales autólogas, interleucina-2, de 20 a 100 unidades/ml, y células estimuladoras autólogas o alogénicas como se ha descrito, durante 7 a 14 días (Wolfel et al., 1989). Los ensayos siguientes para evaluar la función inmune celular se harán cuando se disponga de células tumorales autólogas.

A. Ensayos de células T cooperadoras

Se cultivarán linfocitos de sangre periférica con células tumorales autólogas, células normales autólogas y células tumorales alogénicas (por ejemplo SK-MEL-29) durante 48 horas. Se medirá la proliferación por captación de ^{3}H-timidina en un pulso de 4 horas al final del ensayo. Medidas adicionales son la secreción de citoquinas durante el cocultivo con las células diana. La producción de IL-2 se mide por ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y estimulación de la línea celular CTL de referencia. La producción de interferón-\gamma se mide por ELISA. La liberación de citoquinas adicionales puede medirse por ELISA, incluyendo la interleucina-4, interleucina-6, factor de necrosis tumoral-\alpha y factor estimulante de colonias granulocito monocito.

B. Ensayo de células T citotóxicas

La citotoxicidad se mide a las 4 horas ó 18 horas por el ensayo de liberación de ^{51}-cromo (como se describe en la referencia Wolfel et al., 1989).

Criterios de respuesta terapéutica

1. Respuesta completa (CR): Desaparición de toda evidencia clínica del tumor por examen físico, rayos-X y evaluación bioquímica, durante un mínimo de 4 semanas.

2. Respuesta parcial (PR): Descenso mayor del 50% en el examen físico o radiográfico (incluyendo barrido CT y/o ultrasonidos) de los productos sumados de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones medidas mantenidos durante un mínimo de 4 semana. No puede darse un incremento simultáneo en el tamaño de ninguna lesión o la aparición de cualquier nueva lesión.

3. Respuesta menor (MR): descenso entre 25 y 49% en los productos sumados de los diámetros de las lesiones medidas durante un mínimo de 4 semanas.

4. Enfermedad estable (STAB): Menos del 25% de descenso, o incremento del tamaño durante al menos 3 meses.

5. Progresión (PROG): Incremento mayor del 50% en la suma de todas las lesiones medidas o aparición de nuevas lesiones. Nótese que si aparece enfermedad superficial cutánea, subcutánea y en tejidos blandos < 2 cm de diámetro, el paciente puede continuar con la vacunación a discreción del investigador.

6. Duración de la respuesta: Medida desde el inicio de la terapia hasta un incremento del 50% o mayor de la suma menor de todas las medidas del tumor obtenidas durante la mejor respuesta (CR, PR, MR o STAB).

Criterios de toxicidad

La toxicidad será graduada y clasificada según los criterios de toxicidad común por el siguiente esquema:

0

\hskip0.15cm

No toxicidad.

1+ Toxicidad leve, normalmente transitoria, que no requiere tratamiento especial y generalmente no interfiere con las actividades diarias habituales.

2+ Toxicidad moderada mejorada por maniobras sencillas.

3+ Toxicidad grave que requiere de intervención terapéutica e interrupción de las actividades habituales. Puede requerir o no hospitalización.

4+ Toxicidad que pone en peligro la vida del paciente y que requiere hospitalización. Una toxicidad que causa una muerte relacionada con fármaco se llamará una 4F.

Experiencia adversa

Hasta la fecha ha habido efectos secundarios mínimos por vacunaciones con células tumorales alogénicas (Livingston, 1991). Los pacientes han tenido induración y eritema en el sitio de vacunación. No ha habido casos de anafilaxis in vivo contra las células tumorales alogénicas. En el estudio inicial de administración a pacientes de células humanas genéticamente alteradas, no se vieron efectos secundarios adicionales como resultado del procedimiento y no se transmitieron retrovirus viables (Rosenberg et al., 1990).

Se informará de los efectos adversos serios del tratamiento al Memorial Sloan-Kettering IRB así como a la Oficina del NIH para la Protección de los Riesgos de Investigación antes de las 24 horas e irá seguido de un informe escrito antes de diez. Se enviará también una copia a la Oficina de Actividades con ADN Recombinante del NIH.

Consideraciones bioestadísticas

El punto final de este estudio se ha definido como citotoxicidad clínica. Como se indicó en el plan de tratamiento, se han programado seis pacientes para cada nivel de dosis. Si se observa que tres pacientes tienen toxicidad de grado III o IV (según se define en los criterios de toxicidad común), entonces se definirá una dosis tolerada máxima y se acabará el estudio. Se evaluará la respuesta inmune de todos los pacientes según se describe en evaluación de la respuesta inmune, si bien esta evaluación no será un punto final mensurable.

Diseño y tamaño de la muestra

Aproximadamente doce pacientes se enrolarán en este estudio piloto de vacunaciones con células tumorales. Se usarán dos niveles de dosis de células tumorales.

dosis baja: 10 millones de células tumorales.

dosis alta: 50 millones de células tumorales.

La dosis máxima tolerada se definirá como la dosis de vacuna para la cual tres o más pacientes tienen toxicidad de grado III o IV. El ensayo se parará tras la determinación de la dosis máxima tolerada o tras la finalización de ambos niveles de dosis. Se anticipa que puede no establecerse una MTD en este estudio.

Procedimientos consentidos

Se requerirá a todos los pacientes la firma de una declaración de informe consentido que ha de ajustarse a las directrices del IRB. Este estudio de investigación ha sido revisado por el IRB del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center así como por el Comité del ADN Recombinante del NIH. El investigador informará al IRB y al RAC de los cambios en el protocolo de investigación y todos los problemas no esperado que impliquen riesgos para sujetos humanos u otros, y no se harán cambios en la actividad sin aprobación de IRB.

Tercera serie de experimentos

Transferencia del gen de linfocina mediado por vector retroviral en las células de cáncer renal humano Introducción

La administración de citoquinas puede inducir la regresión de tumores primarios y metastásicos en modelos experimentales animales y en pacientes (Malkovska et al. 1989). Las evidencias de crecimiento indican que ciertas citoquinas pueden demostrar una eficacia antitumoral incrementada si se llevan directamente al sitio del tumor (Forni et al. 1988), y la terapia con un gen de citocina dirigida a la diana de la célula tumoral representa una nueva estrategia para conseguir este objetivo (Russel et al. 1990). Los genes de citoquinas transferidos a las células tumorales, llevando a la liberación altamente localizada de citoquinas, aproximan mucho más la topología fisiológica de la secreción de citocina en el curso de una respuesta inmune. De hecho, las células tumorales murinas modificadas por ingeniería genética para producir IL-2 (Gansbacher et al., 1990; Fearon et al., 1990b; Karasuyama et al., 1988), IL-4 (Tepper et al., 1989), IL-7 (Hock et al., 1991), IFN-\gamma (Gansbacher et al., 1990a; Myatake et al., 1990), factor de necrosis tumoral-a (Asher et al., 1991), o factor de estimulación de colonias de granulocitos (Colomo et al., 1991) demuestran un crecimiento in vivo retardado o inhibido.

La trasferencia de gen por mediación retroviral es un método eficiente para introducir genes en células de mamíferos, teniendo como resultado una integración estable en el genoma de la célula hospedadora y la expresión persistente de la proteína codificada (McLachlin et al., 1990). Usando estas metodología, se ha demostrado recientemente que la secreción local de IL-2 humana o de IFN-\gamma murino anula la tumorogenicidad del fibrosarcona murino CMS-5 productor de citocina (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b), un tumor débilmente inmunogénico inducido por metilcolantreno derivado del ratón BALB/c. Además, se indujo una inmunidad protectora duradera contra una posterior inmunización tumoral (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b).

RRC se mantiene como un tumor quimioterapéuticamente resistente, la supervivencia media de los pacientes publicada con RCC metastásico es de aproximadamente 10 meses (Maldazys et al., 1986). Recientemente, evidencias experimentales y clínicas han mostrado que RCC responde relativamente a varias formas de inmunoterapia (Graham 1989), incluyendo el tratamiento con IL-2 con o sin células LAK (Rosenberg et al., 1987), e IFN-\gamma (Aulitzky et al., 1989). Sin embargo, la administración sistemática de dosis terapéuticamente efectivas de citocina frecuentemente se asocia con toxicidad severa (Rosenberg et al., 1987). Un posible modo para mejorar la inmunoterapia de RCC sería dirigir la citocina liberada directamente a las células tumorales in vitro. Para lograr esto, la línea celular RC humana se transdujo con los ADNc del IL-2 e IFN-\gamma humanos usando vectores retrovirales. En este informe, se demostró que la expresión de IL-2 e IFN-\gamma es eficaz en células RC humanas. Usando estas células, se examinó la influencia del gen de linfocina transferido en el perfil antigénico de las células tumorales y el efecto de la alta dosis de irradiación \gamma en la viabilidad de la la célula tumoral, fenotipo de la superficie celular, la producción de linfocina in vitro. Finalmente, se investigó la tumorogenicidad de las células RC parentales xenoinjertadas y liberadoras de linfocinas en un modelo de ratón desnudo.

Materiales y Métodos Líneas celulares y cultivo de tejidos

Siete líneas celulares RC humanas se seleccionaron para este estudio. Las líneas celulares SK-RC-1, -9, -28, -29, -39, -44 y -49 se establecieron a partir de muestras de nefrectomía primaria o lesiones metastásicas como se describió previamente (Ebert et al., 1990). Varios marcadores de la superficie celular se resumen en la Tabla 4. Las células se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle complementado con glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, 100 unidades/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y FBS al 10%.

Diseño del vector retroviral e infección de células tumorales

DC/AD/R/IL2 se generó por clonación de un minigen que contenía el promotor ADA humano, ADNc de IL-2, secuencias poli A en la secuencia larga de repetición 3' en orientación inversa. El promotor ADA es un fragmento de 832 pares de bases derivado del gene ADA humano por digestión con los enzimas de restricción SspI y NcoI (Wingington et al., 1983). La señal poli A que contenía un fragmento SmaI-AluI e 275 pares de bases de longitud se derivó a partir del plásmido PBC/CMV/IL (Cullen, 1986). Un fragmento de ADN de 528 pares de bases de longitud que codifica para el ADNc de la IL-2 humana se obtuvo a partir del plásmido PBCII/RSV/T (Cullen, 1988) por digestión con los enzimas de restricción RamHI y HindIII. Un fragmento de ADN de 852 pares de bases de longitud que codifica el promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simples se obtuvo a partir del plásmido PHSV106 (McKnight, 1980) por digestión con los enzimas de restricción RamHI y BglII. Un fragmento de ADN de 794 pares de bases de longitud que codifica para el promotor principal inmediato temprano del citomegalovirus humano, se obtuvo a partir del plásmido PRR23 (Wano et al., 1987) por digestión con los enzimas de restricción BalI y SmaI. N2 es un vector retroviral derivado del genoma del virus de la leucemia murina de Moloney, que contiene el gen bacteriano de resistencia a neomicina (neo), que se usa como marcador seleccionable (Armentano et al., 1987). Los productos de fusión TKIL2 y TNIFN\gamma se clonaron en el sitio MluI presente en el polienlazador dentro de la secuencia larga de repetición 3' de un vector N2 modificada como describieron Hantzopoulos et al. (Hantzopoulos et al., 1989); para generar las construcciones de vectores DC/TKIL2 y DC/TKIFN\gamma, respectivamente. El producto de fusión CMVIFN\gamma se clonó en el sitio único XhoI presente secuencia abajo de las secuencias que codifican para el gen neo para genera la construcción del vector N2/CMVIFN\gamma, respectivamente (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b). Un diagrama esquemático que presenta las distintas construcciones de vectores usadas en este estudio se muestra en la figura 7.

Las construcciones retrovirales se convirtieron en el correspondiente virus, usando procedimientos establecidos. Brevemente, el vector de ADN se transfectó en la línea celular empaquetadora anfotrópica sin auxiliar AM12 (Markowitz et al., 1988). Se aislaron colonias por selección G418 y se expandieron en líneas celulares, y se testó la presencia de virus en los sobrenadantes sin células. Las líneas celulares secretoras de un alto título de virus (10^{5} a 10^{6}unidades formadoras de colonias neo/ml) se aislaron por selección G418 y se expandieron a líneas celulares, y se midió la secreción IL-2 o IFN-\gamma en el sobrenadante celular por bioensayo e inmunoensayo. La ausencia de virus competentes de replicación en las células tumorales que producen citocina se demostró por la incapacidad para transferir resistencia a G418 a las células NIH 3T3.

Ensayo de detección de retrovirus murinos competentes de replicación

Para detectar la presencia de retrovirus murinos replicantes en los sobrenadantes de los cultivos celulares de células RC modificadas con un gen, se usó el ensayo de amplificación de NIH3T3. Este ensayo está basado en el hallazgo de que la replicación del retrovirus competente ecotrópico y anfotrópicos prolifera en células NIH3T3. Brevemente, las células NIH3T3 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con FBS al 10% y L-glutamina 5 mM; las células se crecieron a 1 x 10^{5} células/pocillo en placas de 6 pocillo 12 horas antes de la exposición a la muestra. Entonces, se añadió por pocillo 1 ml de muestras de sobrenadantes tomados de las células RC humanas modificadas con un gen, se añadió polibreno (8 \mu/ml) parar aumentar la infección viral. Los medios consumidos de las células NIH3T3 y de la línea celular empaquetadora AM12, así como medio de Eagle modificado por Dulbecco solo se incluyeron como controles negativos; los sobrenadantes de las líneas celulares productoras de virus auxiliares SAX-2 y SAX-3 la línea celular productora AM12/ETAR29, se usaron como controles positivos. Después de la infección, los medios se eliminaron y se añadieron 5 ml de medio fresco. Las células se dividieron 1:5 cuando confluían y mantenidas durante 3 semanas. Cuando las placas estaban confluentes al final de la tercera semana, se añadió medio fresco a los pocillos y se recogió 12 horas después para determinar la actividad transcriptasa inversa.

La actividad transcriptasa inversa se determinó incubando 10 \mul de muestra de los medios con 40 \mul de Tris 50 mM, pH 8,0, ditiotreitol 20 mM, MnCl2 0,6 mM, NaCl 60 mM, Nonidet P-40 al 0,05%, oligo dT 5 \mug/ml, poly A 10 \mug/ml, dTTP 62 \muM y [^{32}P]dTTP 10\muM (3.000 Ci/m; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA) durante 1 h a 37ºC. Los controles negativos con los medios solos añadidos se usaron para determinar los blancos. Entonces se pusieron 10 \mul de la mezcla de reacción en un filtro circular de DEAE DE81 y se lavaron dos veces con solución salina citrato estándarx1 (citrato sódico 0,15 M, pH 7,4) a 25ºC durante 30 minutos. Después de aclarar con etanol al 95%, los filtros circulares se secaron al aire, y se detectó entonces la radiactividad del filtro con exposición a una película de rayos X durante 3 a 5 horas y se cuantificó por recuento de centelleo.

Ensayo de IL-2 humana

Los sobrenadantes de las células tumorales parentales o secretoras de linfocina en semiconfluencia en una placa de 6 cm se recogieron después de 48 ó 72 h y se ensayó en ellos la IL-2 humana usando linfoblastos primarios humanos dependientes de IL-2 en un ensayo de proliferación como se ha descrito previamente (Gansbacher et al., 1990b). Los resultados obtenidos del bioensayo se confirmaron por ensayo de inmunoabsorción enzimática (Genzyme, Boston, MA). DMS-1, un mAB neutralizante para la IL-2 humana (Smith et al., 1983) se usó para inhibir la actividad de la IL-2 en el bioensayo.

Ensayo de IFN-\gamma humano

En los sobrenadantes probados en el ensayo de la IL-2 humana también se analizó el IFN-\gamma humano. El bioensayo para el IFN-\gamma humano se basó en la actividad antiviral en los sobrenadantes de los cultivos celulares, determinado como la reducción de los efectos citopáticos del virus de la estomatitis vesicular en células WISH (Rubinstein et al., 1987). Los resultados se confirmaron usando un radioinmunoensayo del IFN-\gamma disponible comercialmente (Centocor, Malvern, PA). La bioactividad del IFN-\gamma humano en los sobrenadantes se bloqueó por un mAB murino neutralizante específico para el IFN-\gamma humano (Olympus, Lak Success, NY).

Análisis del antígeno de la superficie celular por inmunofluorescencia indirecta y FACS

La expresión de los antígenos asociados a riñón, determinantes de clase I y clase II, ICAM-1 (CD54) y VLA-\beta1 en líneas celulares RC se determinó por inmunofluorescencia indirecta (Ebert et al., 1990; Finstad et al., 1985). Los mAB murinos siguientes se usaron como anticuerpos primarios: URO-2, URO-3, URO-4, URO-8 y G250, todos para detectar antígenos asociados a riñón (Finstad et al., 1985; Bander, 1989); W6/32 (anti HLA-A, B, C) (Brodsky y Parham, 1982); NAMB-1 (anti \beta-2 microglobulina; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN); anti-HLA-DR, -DP y -DQ (Olympus); OKT 27 (anti-ICAM-1; Ortho Diagnostics, Raritan, NJ) y AJ2 (anti-VLA-B1) (Cairncross et al., 1982). Las células dispuestas en placas de Terasaki de 60 pocillo o suspendidas en PBS, se incubaron con el anticuerpo primario durante 60 min, se lavaron con PBS y, entonces, se incubaron con anticuerpo de conejo anti IgG de ratón purificado por afinidad y conjugado con isotiocianato de fluoresceína (dilución 1:50; Dako Corp., Santa Barbara, CA) durante 45 min. Las células unidas a las placas de Terasaki se evaluaron usando un microscopio de fluorescencia, y las células en suspensión se analizaron usando un sistema de FACS 440 (Becton Dickinson FACS Division, Sunnyvale, CA). Como control se sustituyó el reactivo mAB por PBS.

Irradiación de los cultivos celulares

Las células SK-RC-29 parentales y productoras de linfocinas (0,25 x 10^{6} células/pocillo) se dispusieron, 24 horas antes de la irradiación, en placas de cultivo tisular multipocillo 3045 de Falcon (Falcon Labware, Oxnard, CA) y se irradiaron a temperatura ambiente con un acelerador lineal 6-MV Varian CL6-100 a una tasa de dosis de 100 rad/min. Se aplicaron dosis de prueba de 5.000 ó 10.000 rad. Las células irradiadas se cultivaron durante 22 días a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Tres, 12 y 22 días después de la irradiación se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y las células se realimentaron con 1 ml/pocillo de medio esencial mínimo fresco que contenía 10% de FBS. Los medios gastados se congelaron a -20ºC hasta que se testaron. En paralelo, las células de los cultivos triplicados se tripsinizaron a los días 1, 12 y 22 después de la irradiación y se determinó el número de células viables por microscopia directa usando exclusión con azul Tripan. Las células irradiadas cultivadas en pocillos individuales se recogieron a los días 1, 7 y 14 después de la irradiación para análisis por FACS.

Formación de tumor en ratones desnudos

Células SK-RC-29 (0,005 x 10^{6}, 0,05 x 10^{6} ó 0,5 x 10^{6}) se inyectaron vía s.c. en ratones desnudos machos de 4 a 6 semanas de edad de origen BALB/c. Se ha publicado que esta línea celular RC forma tumores s.c. no metastatizantes en ratones BALB/c desnudos (Ebert et al., 1990). Cinco semanas después de la inyección, los animales se sacrificaron y se determinó el peso de los tumores.

Análisis inmunohistoquímico

Cinco semanas después de la inyección s.c. de las células SK-RC-29 parentales o modificadas por gen en los ratones BALB/c desnudos, se extrajeron los tumores, se congelaron en nitrógeno líquido, se incluyeron en compuesto OCT (Miles Inc. Eklhart, IN) y se conservaron a -70ºC hasta su uso. Los cortes de tejido del criostato (6 \mum) se secaron al aire, se fijaron en acetona fría y se trataron con H_{2}O_{2} al 0,03% para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Para la detección de las células positivas para la preoxidasa endógena, el pretratamiento con H_{2}O_{2} y la tinción con el mAB primario se omitió y se añadió inmediatamente diaminobencidina a las secciones del tejido. En paralelo, los costes de tejido se tiñeron por el método de la inmunoperoxidasa indirecta descrito previamente (Finstad et al., 1985). Brevemente, los costes se incubaron durante 90 min con un mAB de ratón biotinilado específico de HLA-DR (Olympus), o con un mAB de rata biotinilado que detecta macrófagos tisulares murinos (clon AL-21; Pharmingen, San Diego, CA). Como control, el mAB primario se sustituyó por PBS. Después de lavar los cortes con PBS; se detectaron los anticuerpos biotinilados por incubación con avidina conjugada con peroxidasa (dilución 1:400; Dako Corp.) durante 45 minutos. Los complejos antígeno-anticuerpo se visualizaron usando diaminobencidina en presencia de H_{2}O_{2} como cromógeno y hematoxilina de Harris como contraste.

Resultados experimentales Análisis de la presencia de retrovirus murinos competentes de la replicación en células RC modificadas por gen

Los retrovirus murinos competentes para replicación pueden aparecer durante los procedimientos experimentales por recombinación en células humanas con partículas endógenas similares a retrovirus. Por tanto, la presencia de retrovirus murinos competentes de la replicación se valoró en los medios de cultivo consumidos de las líneas celulares RC SK-RC-9, -28, -29 y -39. que habían sido transducidas entre 21 y 28 días antes con DC/AD/R/IL2. No se detectaron retrovirus murinos competentes de replicación usando el ensayo de amplificación de NIH/3T3 (figura 8).

Expresión y liberación de IL-2 o IFN-\gamma a partir de células RC modificadas por gen

Dos construcciones de vector retroviral que contenía el ADNc de la IL-2 humana y dos construcciones que llevaban el ADNc del IFN-\gamma humano se usaron para transferir estos genes de linfocinas dentro de las células RC humanas (figura 7). Se eligieron para este estudio siete líneas celulares RC humanas que expresaban varios antígenos asociados a riñón (tabla 4).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

4

Los datos de las líneas celulares infectadas y de los vectores construidos usados se resumen en la tabla 5.

TABLA 5

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La secreción de IL-2 o de IFN-\gamma se determinó midiendo las concentraciones de linfocina en los sobrenadantes de los cultivos celulares usando un bioensayo apropiado. Entonces, los resultados se confirmaron con un ensayo de inmunoabsorción enzimática para la IL-2 o con un radioinmunoensayo para el IFN-\gamma. Se encontró que las líneas celulares RC infectadas con las construcciones retrovirales que portaban el ADNc de IL-2 liberaban cantidades variables de IL-2 bioactiva en consistencia con hallazgos previos (Gansbacher et al., 1990b). Las células SK-RC-29 modificadas con la construcción N2/CMVIFN\gamma liberaban cantidades moderadas de IFN-\gamma. Por tanto, de acuerdo con hallazgos previos (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 199b) el tipo de célula diana, así como el diseño de la construcción del vector son parámetros importantes cuando se determina la eficacia de la expresión de genes de linfocinas transferidos.

Efecto de las secreción de linfocinas por las células tumorales en su perfil antigénico

Los antígenos asociados a tumor, MHC y moléculas de adhesión son determinantes críticos de la inmunogenicidad de la célula tumoral. Para evaluar el efecto de la secreción de linfocina en tales marcadores expresados por células RC humanas, el perfil antigénico de las líneas celulares RC parentales y sus variantes secretoras de linfocinas se examinó por inmunofluorescencia indirecta y análisis por FACS. Como un ejemplo representativo, se describirán en detalle los hallazgos en las células de la línea celular SK-RC-29 (tabla 6).

TABLA 6

6

expresa constitutivamente varios antígenos asociados a riñón, antígenos MHC de clase I y moléculas de adhesión, pero no expresa determinantes MHC de clase II (tabla 4). La expresión de los antígenos asociados a riñón en células SK-RC-29 no se afectaba por la expresión de cualquier linfocina (datos no mostrados). De forma similar, las células SK-RC-29 que liberaban IL-2 y que portaban la construcción CD/TKIL2 no tenían efecto detectable sobre la expresión de los antígenos de MHC y de moléculas de adhesión (tabla 6). Sin embargo, la expresión eficaz de INF-\gamma por las células SK-RC-29 que portan la construcción N2/CMVIFN\gamma se asoció con el incremento de la expresión de HLA-ABC, \beta2-microglobulina e ICAM-1, así como la nueva expresión de las moléculas HLA-DR y -DP, la expresión de HLA-DR se detectó en el crecimiento in vitro e in vivo de células SK-RC-29 productoras de IFN-\gamma (véase la figura 13e). El perfil de marcadores de las células SK-RC-29 portadoras de la construcción DC/IKIFN\gamma y que liberaban sólo cantidades mínimas de IFN-\gamma fue indistinguible de aquel de las células parentales (tabla 3).

Supervivencia, secreción de linfocina e inmunogenicidad de las células RC tras altas dosis de irradiación \gamma

La futura vacunación de pacientes con células tumorales alogénicas o autólogas secretoras de linfocina requerirán de métodos para prevenir la formación del tumor por células tumorales modificadas por gen in vivo. Dichos procedimientos de salvaguarda, sin embargo, no disminuyen la capacidad de las células tumorales modificadas por gen para secretar linfocinas y podría no anular su inmunogenicidad. La irradiación \gamma a altas dosis ofrece una estrategia para alcanzar este objetivo. Sin embargo, se examinó el efecto de la irradiación \gamma en la supervivencia, producción de linfocina y la expresión de antígeno HLA-DR de células SK-RC-29 modificadas por gen. Las células SK-RC-29 parentales y liberadoras de linfocinas se pusieron en placas a alta densidad celular (0,25 x 10^{6} células/ml) en placas multipocillo y se irradiaron con 5.000 ó 10.000 rad. Las curvas de supervivencia de las células SK-RC-29 parentales y productoras de linfocina se ilustran en la figura 9. Veintidós días después de la irradiación, el 13% (intervalo de medias, 6-20%) de las células tumorales secretoras de linfocinas seguían siendo viables cuando se determinó por tinción con azul tripán, pero estas células supervivientes mantenían una parada del crecimiento y morían dentro de las 5 semanas después de la irradiación (datos no mostrados).

Para determinar el efecto de la irradiación \gamma de la liberación de linfocina, se midió la concentración de IFN-\gamma en los sobrenadantes celulares recogidos antes y 3, 12 y 22 días después de la irradiación. Como se muestra en la figura 10, la secreción de IFN-\gamma incluso aumentaba a los 3 y 12 días (después de la exposición a 5.000 rad) y descendió hasta el día 22, lo que sugería una biosíntesis en curso y liberación de esta citocina en las células tumorales con parada del crecimiento que sobrevivieron a la irradiación \gamma.

Para evaluar el efecto de la irradiación en la expresión de los antígenos de la superficie celular inducidos por linfocina, se examinó la expresión del antígeno HLA-DR en células SK-RC-29 parentales y productoras de IFN-\gamma antes de 1, 7 y 14 días después de la irradiación \gamma. En paralelo con la liberación ininterrumpida de IFN-\gamma por las células SK-RC-29 irradiadas que portaban la construcción N2/CMVIFN\gamma, se encontró una tinción más intenta para HLA-DR en estas células tras la irradiación (figura 11B). La irradiación \gamma, sin embargo, no inducía una nueva expresión de HLA-DR en las células parentales (figura 11A) o de las células secretoras de IL-2 (datos no mostrados).

Efecto de la transferencia génica con mediación retroviral en la tumorogenicidad de las células RC en ratones desnudos

Se ha demostrado que las células SK-RC-29 parentales forman tumores en ratones BALB/c desnudos (Ebert et al., 1990). Por tanto, se eligió esta línea celular para estudiar el efecto de la producción de linfocina por las células tumorales en la tumorogénesis de células SK-RC-29 parentales y modificadas con un vector. Ratones BALB/c nu/nu machos de cuatro a seis semanas de edad fueron inyectados vía s.c. con un número variado de células SK-RC-29 parentales y modificadas con el vector, y se evaluó la formación de tumor después de 5 semanas. Los resultados de un conjunto de experimentos se resumen en la figura 12. Las células SK-RC-29 parentales así como las productoras de citoquinas administradas en las dosis más bajas (0,005 x 10^{6} células /ratón) fallaron en la generación de tumores, y durante 12 semanas de observación estos ratones permanecieron sin tumores.

Sin embargo, la inyección de 0,05 x 10^{6} ó 0,5 x 10^{6} células tumorales/ratón conduce a una diferencia sorprendente en la formación de tumores en los animales que reciben células SK-RC-29 parentales o productoras de linfocinas. Mientras que las células SK-RC-29 parentales y secretoras de IFN-\gamma formaron tumores s.c grandes, los ratones inyectados con células SK-RC-29 que liberan IL-2 no mostraban tumores macroscópicamente visibles. Este hallazgo se reprodujo en muchos otros experimentos durante los cuales diferentes líneas celulares RC o de melanoma con vectores IL-2 fueron infectadas en ratones desnudos (Gansbacher et al., 1992). El examen microscópico de los sitios de inyección en los animales inoculados con las mayores dosis de células tumorales productoras de IL-2 reveló pequeños agregados de células tumorales, que por inmunohistología mostraron un fuerte infiltrado peritumoral de células mononucleares positivas para la peroxidasa (figura 13b). Usando un mAB de rata específico de macrófagos tisulares murinos, una proporción muy importante de estas células hospedadores infiltradas en el tumor se tiñeron positivamente (figura 7d). En contraste, tales acumulaciones peri o intratumorales de células que infiltran el tumor no se observaron en animales que desarrollaron nódulos tumorales derivados de células SK-RC-29 parentales o liberadoras de IFN-\gamma (figuras 13, a y c). Cuando los ratones inoculados con células SK-RC-29 que portaban la construcción DC/TKIL2 se observaron durante 12 semanas permanecían sin tumores macroscópicos.

Discusión experimental

Varias aproximaciones pueden utilizarse en un intento por estimular la inmunidad antitumor de un hospedador. Una posibilidad es usar la administración sistémica de citoquinas o la transferencia adaptativa de células LAK dentro del hospedador que soporta el tumor (Rosenberg et al., 1987). Alternativamente, las células tumorales por sí mismas y el sistema inmune del hospedador pueden manipularse in situ para provocar una respuesta antitumoral en el hospedador (Forni et al., 1988; Russel et al., 1990). Siguiendo la segunda estrategia, recientemente se ha publicado una estrategia para inducir inmunidad antitumoral mediada por células específicas en animales experimentales por terapia con citocina dirigida contra la célula tumoral. La secreción constitutiva de IL-2 (Gansbacher et al., 1990b; Fearson et al., 1990), IL-4 (Tepper et al., 1989), IL-7 (Hock et al., 1991) e IFN-\gamma (Gansbacher et al., 1990a; Myatake et al., 1990), a partir de células tumorales murinas modificadas genéticamente anula su tumorogenicidad en animales singénicos e induce una respuesta antitumoral in vivo específica y persistente mediada por células T. En estudios clínicos, las linfocinas IL-2 e IFN-\gamma se ha probado que inducen remisiones en un subgrupo de pacientes con RCC avanzado (Graham, 1989; Rosenbert et al., 1987; Aulitzky et al., 1989; Topalian et al., 1988). En la mayoría de los pacientes, sin embargo, la terapia de altas dosis de linfocina sistémica fue ineficaz y se asoció con toxicidad grave (Graham, 1989; Rosenberg et al., 1987; Topalian et al., 1988).

Puesto que la distribución local de linfocinas por células tumorales proporciona una estrategia alternativa atractiva de inmunoterapia tumoral, se eligió RCC como un modelo de enfermedad para determinar la viabilidad de introducir genes de linfocina en células RC humanas. En este informe, se demuestra que la transferencia mediada por vectores retrovirales de los ADNc de IL-2 o IFN-\gamma dentro de células RC humana es viable y tiene como resultado la elaboración de linfocinas biológicamente activas. Ambas linfocinas, IL-2 (Rees y Wiltrout, 1990) e IFN-\gamma (Trinchieri et al., 1985), son producidas fisiológicamente por linfocitos T cooperadores activados y tienen una función crítica en la provocación de respuestas inmunes mediadas por células. La IL-2 estimula la proliferación y capacidad lítica de NK (Trinchieri, 1989) y de los linfocitos T (Erard, 1985), e induce la diferenciación de células NK a células LAK (Grimm et al., 1982). Belldegrun et al. (Belldegrun et al., 1988) fueron capaces de demostrar una fuerte actividad tumoricida contra células RC autólogas en los linfocitos infiltrado en tumor activados con IL-2 in vitro. La IL-2, sin embargo, no tiene efecto directo citotóxico o citostático en las células neoplásicas. El IFN-\gamma es una linfocina pleiotrópica que promueve la activación y diferenciación de linfocitos T citotóxicos (Chen et al., 1986; Catalona et al., 1981) y amplia la actividad tumoricida de las células NK (Catalona et al., 1981) y de los macrófagos (Adams y Hamilton, 1987). Además, el IFN-\gamma induce o aumenta la expresión de antígenos MHC de clase I y clase II (Wallach et al., 1982) y de las moléculas de adhesión celular (Tomita et al., 1990; Mortarini et al., 1990). La regulación positiva de estas moléculas de la superficie celular puede aumentar la capacidad de presentación de antígeno de las células malignas (Ostrand-Rosenbert et al., 1990; Alexander et al., 1989) e incrementar su susceptibilidad para ser lisada por los linfocitos T citotóxicos (Hayashi et al., 1985; Vanky et al, 1988). Además, el IFN-\gamma media en un efecto directo antiproliferativo en algunos tipos de células tumorales (Wadler y Schwartz, 1990).

Dos aspectos importantes de la linfocina y la biología tumoral se consideran en este estudio: (a) la regulación de la expresión de moléculas inmunoreguladoras de la superficie celular en células tumorales; y (b) la modulación inducida por linfocina del crecimiento in vivo del tumor. Recientemente se publicó que la expresión de antígenos MHC de clase I en células CMS-5 murinas secretoras de IFN-\gamma se regulaba por incremento y posiblemente es responsable de su tumorogenicidad reducida en ratones singénicos, ya que el rechazo del tumor se asóció con una fuerte respuesta de células T citotóxicas específica de tumor (Gansbacher et al., 1990a). Como se muestra en este estudio, el IFN-\gamma secretado por células SK-RC-29 no sólo amplifica la expresión de antígeno MHC de clase I sino que también induce la expresión de moléculas MHC de clase II (HLA-DR y -DP) y regula por incremento la expresión de ICAM-1. La modulación de los antígenos MHC de clase II e ICAM-1 en las células tumorales parece ser particularmente importante puesto que: (a) las células tumorales humanas que expresan antígenos MHC de clase II pueden adquirir la capacidad para presentan antígenos solubles a los linfocitos T cooperadores (Vanky et al., 1989); y (b) se ha obtenido una presentación de antígeno más eficaz con células presentadoras de antígeno que coexpresan HLA-DR e ICAM-1 (Altmann et al., 1989). Estos estudios sugieren que, si los antígenos nuevos específicos de tumor son expresados por células tumorales humanas, la expresión conjunta de determinantes MHC de clase I y clase II, así como de ICAM-1 puede hacer a éstos accesibles para la cooperación restringida a MHC (Ostrand-Rosenberg et al., 1990; Alexander et al., 1989) y para los linfocitos citotóxicos (Hayashi et al,.1985; Vanky et al., 1988). Esto puede permitir al sistema inmune del hospedador generar una respuesta antitumoral mediada por células in vivo.

El efecto de la liberación local de linfocina en la formación del tumor por células RC humanas xenoinjertadas se examinó en un modelo de ratón desnudo. Estudios in vitro revelaron que bajo ninguna circunstancia la tasa de crecimiento de las células RC humanas se reducía por transferencia retroviral y por expresión de los genes del IFN-\gamma o la IL-2 humana (datos no mostrados). Sin embargo, la tumorogenicidad de las células SK-RC-29 humanas inyectadas vía s.c. en ratones BALB/c desnudos se suprimió por la liberación local de IL-2 humana (figura 12). Particularmente, la secreción incluso de cantidades pequeñas de IL-2 humana por las células SK-RC-29 inyectadas s.c. fue suficiente para atraer localmente a macrófagos y para suprimir la formación del tumor (figura 13, b y d). En este contexto, es notable que previamente se había mostrado cómo la IL-2 estimulaba la actividad citolítica de los macrófagos humanos (Malkovsky et al., 1987) y murinos (Verstovsek et al., 1992) in vitro, y aumentaba la proliferación y diferenciación de los precursores de macrófagos murinos in vivo (Baccharini et al., 1989).

En ratones desnudos inoculados con células SK-RC-29 parentales o que liberan IFN-\gamma, se desarrollaron tumores grandes desprovistos de células hospedadoras que infiltran el tumor (figura 13, a y c). Este hallazgo es coherente con la observación previa de que las células SK-RC-29 son tumorogénicas cuando se inyectan en ratones desnudos (Ebert et al., 190), y que el IFN-\gamma humano, al contrario que la IL-2, es específico de especie y no es capaz de ejercer funciones inmunoreguladoras en ratones (Langer y Pestka, 1988).

Para el estudio clínico inicial de las células RC humanas secretoras de linfocina como una vacuna celular viva, se requieren salvaguardia para eliminar cualquier capacidad tumorogénica. Una alta dosis de irradiación \gamma ofrece un método viable para eliminar el potencial de crecimiento de las células RC mientras que retienen su actividad metabólica y su antigenidad por un tiempo limitado. La irradiación \gamma in vitro con 5.000 ó 10.000 rad mata al 100% de las células SK-RC-29 en 5 semanas. Sin embargo, aunque se detiene el crecimiento, una porción significativa de las células tumorales que liberan linfocina sobreviven durante 3 semanas (figura 9). Como se publicó en un artículo independiente (Gansbacher et al., 1992), el patrón de secreción de IL-2 o de IFN-\gamma por parte de las células tumorales humanas modificadas con el gen de la linfocina después de la irradiación \gamma fue casi idéntico. La linfocina liberada por las células tumorales irradiadas dura aproximadamente de 3 a 4 semanas. Este tiempo puede ser suficiente para proporcionar la liberación local de linfocina y la inmunoestimulación in vivo.

Se llevaron a cabo pruebas para asegurarse de que las líneas celulares RC transducidas no liberaban los virus auxiliares competentes de replicación. Usando el ensayo de amplificación de NIH3T3, que es capaz de detectar una simple partícula viral competente de replicación por ml de medio problema, no se encontró ningún virus competente de replicación producidor por las líneas celulares RC humanas modificadas con el gen que han mostrado estar libres de virus de la inmunodeficiencia humana, citomegalovirus y virus de la hepatitis.

Estos datos demuestran que la transferencia de un gen mediada por vector retroviral representa una estrategia viable y segura de introducir genes de linfocinas en células RC humanas. Mientras que se preserve el fenotipo de la superficie celular y las características funcionales de las células tumorales modificadas por el gen de la linfocina, una alta dosis de irradiación \gamma ofrece una manera simple de genera una vacuna de células vivas para inmunización in vivo. El efecto de la liberación local de IL-2 o IFN-\gamma a partir de células RC en las células inmunes del hospedador y la regulación positiva de las moléculas inmunoreguladoras de la superficie celular de las células RC puede desencadenar una respuesta inmune antitumoral local así como sistémica in vivo. A la vista de datos recientes que muestran que pacientes con cáncer no tratados poseen ya células T tumor específicas (Coulie et al., 1992), la inmunización activa con tales células tumorales modificadas por gen de la linfocina puede incrementa el número de estas células efectoras. Esta suposición está firmemente apoyada por datos experimentales recientes obtenidos a partir de ratones con mastocitoma P815, donde la frecuencia de precursores tumor específicos circulantes y de linfocitos T citotóxicos maduros puede aumentarse significativamente por vacunación con células tumorales transfectadas con el ADNc de la IL-2 murina (Ley et al., 1991). Además, en animales inmunizados esta respuesta inmune celular se relacionó estrechamente con el rechazo del tumor y la inmunidad a largo plazo específica de tumor.

En resumen, se han hecho progresos en el desarrollo de vacunas tumorales. Las células tumorales secretoras de citoquinas ahora están disponibles para uso clínico en protocolos de vacunación.

De ese modo, están justificados los estudios en fase I para determinar la viabilidad y la seguridad de esta nueva estrategia terapéutica.

Cuarta serie de experimentos

Un estudio piloto de inmunización con células de carcinoma de célula renal HLA-A2 compatible alogénico que secreta interleucina-2 en pacientes con carcinoma de célula renal avanzado

Inmunizar pacientes con carcinoma de célula renal HLA-A2 positivo con células de carcinoma de célula renal alogénico compatible HLA-A2 que ha sido alterado para secretar interleucina-2. Se evaluarán la toxicidad de la inmunización, las pruebas de la inducción de inmunidad humoral y celular y los efectos anti-tumorales.

Antecedentes de la invención Carcinoma de célula renal

El carcinoma de célula renal (RCC) es el cuarto cáncer genitourinario más común en los Estados Unidos, con una incidencia anual de 20.000 casos y una tasa de muerte de 8.000 a 10.000. La historia natural y las manifestaciones clínicas de RCC son variables (Javadpour, 1982; Lang et al., 1982; Marshall y Powell, 1982; Robson et al., 1964; Van Der WefMessinge, 1973). Aproximadamente la mitad de los nuevos caso se localizan en el riñón, y un 30% de los pacientes presentan metástasis distantes. Una nefrectomía radial es una terapia curativa para RCC localizado, con una supervivencia a los cinco años del 66% para pacientes con la enfermedad en estadio I o II y del 35% para la enfermedad en estadio III (Robson, et al., 1964; Skinner et al., 1972; Boxer et al., 1979). Los pacientes seleccionados en el estadio IV de la enfermedad, aquellos con metástasis aislada, parecen mostrar una mejora de la supervivencia a partir de la intervención quirúrgica.

La terapia sistémica de RCC metastásico tiene una eficacia limitada. Se ha investigado la terapia hormonal con antiandrógenos, antiestrógenos, andrógenos y progestinas, con proporciones de respuesta publicadas de menos del 2% (Bloom, 1973; Hrushesly, et al., 1977; Yogada, et al., 1982). La quimioterapia generalmente no es efectiva, con más de 30 drogas investigadas, solas o en combinación, y ninguna alcanza una proporción de respuesta mayor del 15 ó 20% (Hrushesky, 1977; Yagoda, 1982). Digno de mención, es bien reconocida la aparición de regresiones espontáneas en hasta un 7% de los pacientes con RCC avanzado (Olivier, et al., 1988). Este fenómeno ha impulsado la investigación de inmunoterapia. Las intervenciones más prometedoras hasta el momento han sido inmunológicas, en particular las citoquinas. Se ha publicado que los interferones y la interleucina-2 provocan efectos antitumorales en el carcinoma de célula renal (Quesada, 1988). Sin embargo, la mayoría de los ensayos informaban de proporciones de respuesta menores de un 20% (Krown, 1987).

Estudios de vacunación

Durante muchos años se ha tenido la esperanza de que la vacunación contra el cáncer pudiera sensibilizar específicamente al sistema inmune del huéspedador e indujera una respuesta antitumoral. En el MSKCC, se han completado varios estudios de vacunación de tumores dirigido a introducir o aumentar una respuesta humoral o celular. La mayoría de estos estudios se han hecho en pacientes con melanoma. Puesto que hay más experiencia en el uso de vacunas para melanomas, este ensayo se basará en parte en las observaciones hechas para melanoma.

En los ensayos iniciales con vacunas de células de melanoma autólogas y alogénicas, Livingston et al. (1979) testaron el aumento de la citotoxicidad mediada por células contra las células de melanoma cultivadas. No se vio aumento y se encontró que era difícil el análisis de la especificidad de la citotoxicidad mediada por células preexistente. Por consiguiente, el énfasis se puso en los análisis serológicos. En el análisis de las reacciones de los sueros de los pacientes con células de melanoma cultivadas autólogas, se definieron tres clases de antígenos de superficie (Livingston, 1979). La clase I son antígenos únicos detectados sólo en células autólogas. La clase II esta restringida a antígenos de diferenciación compartidos por muchas líneas celulares de melanoma. La clase III son antígenos no específicos vistos en células normales y en otras células tumorales no melanomas.

Se ha encontrado que las células T citotóxicas que matan a células tumorales alogénicas están restringidas a la clase I. Estos linfocitos T citotóxicos pueden matar células de melanoma alogénicas HLA compatibles pero no a las HLA no compatibles (Hoon, et al., 1991; Hayashi, et al., 1991). Está creciendo la evidencia adicional para los antígenos tumorales compartidos. Houghton (datos no publicados) ha destacado que células las CD4+ pueden matar a células tumorales autólogas y alogénicas y estas reconocen antígenos compartidos restringidos al HLA-DR 15 (Crowley et al. 1990, 1991) lo que demostraba que los linfocitos T citotóxicos específicos de tumores autólogos (CTL), cuando se generaban por estimulación repetida con células de melanoma autólogo y se expandían en presencia de interleucina-2, estaban restringidos a la histocompatibilidad principal (Crowley et al., 1990; Crowley et al, 1991).

Experimentos adicionales sugerían que estos CTL reconocían un antígeno asociado al tumor en presencia de HLA-A2. Las células de melanoma alogénicas HLA-A2 compatibles se sustituyeron en la generación de CTL por células tumorales autólogas. Estos linfocitos lisaban las células tumorales autólogas en el mismo grado que los CTL generados por estimulación con células tumorales autólogas. Así, pueden generarse CTL específicos de tumor usando células de melanoma alogénicas HLA-A2 compatibles. Puesto que crecer células tumorales autólogas en cultivo es un procedimiento que requiere mucho tiempo, pueden usarse células HLA-A2 alogénicas para generar células T citotóxicas autólogas.

Efectos biológicos in vitro de la interleucina-2

La interleucina-2 es una linfocina producida por células T cooperadoras, por células T estimuladas y por células asesinas (NK). Se ha demostrado que la IL-2 in vitro causa la proliferación de células T específicas de antígeno. Las células T cooperadoras, citotóxicas y supresoras se han inmortalizado por cultivo repetitivo in vitro en presencia de IL-2 (Roehm et al., 1982). Las respuestas de las células B in vitro también estaban aumentadas por IL-2 (Basham et al., 1983). La interleucina-2 también puede estimular la secreción de otras linfocinas incluyendo el interferón gamma por los linfocitos T

Estudios de la interleucina-2 humana

Durante los últimos diez años, Rosenberg et al. han conducido varios estudios con IL-2 sistémica para aumentar la función de los linfocitos (Rosenberg, 1985; Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1989). De hecho, tumores tales como el carcinoma de célula renal y el melanoma han mostrado actividad a la IL-2 intravenosa con una tasa de respuesta del 20 al 30% (Rosenberg et al., 1987). El principal efecto de la IL-2 fue en la expansión de las poblaciones de células efectoras que tenían capacidad para matar a las células tumorales in vitro. Sin embargo, debido a la corta vida media de IL-2 en el suero, tuvieron que usarse altas dosis que eran muy tóxicas. La hipotensión y el síndrome de permeabilidad capilar con descenso de la resistencia vascular sistémica pueden llevar al edema pulmonar intersticial, azotemia prerrenal y arrítmias cardíacas e infarto de miocardio (Rosenberg 1985; Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1989).

Transferencia de genes en modelos animales

Varios laboratorios han mostrado que la introducción de genes de citoquinas, tales como IL-2, IL-4 (Tepper et al., 1989), IFN-gamma (Watanabe et al., 1989; Gansbacher et al., 1990), TNF (Asher et al., 1991) y G-CSF (Colombo et al., 1991) en células tumorales conduce a su rechazo en un hospedado inmunológicamente competente. La secreción de G-CSF o de IL-4 lleva a una respuesta inflamatoria localizada en el lugar del tumor sin inducción de memoria inmunológica (Tepper et al., 1989; Colombo et al., 1991). IL-2, interferón gamma y factor de necrosis tumoral por otro lado inducen una respuesta inmune a largo plazo que lleva al rechazo de reimunizaciones tumorales potencialmente letales en un punto posterior en el tiempo (Gansbacher et al., 1990; Watanabe et al., 1989; Asher et al., 1991). Estudios iniciales de Tepper et al. (1989) demostraron el potente efecto de la secreción localizada de IL-4 en el lugar del tumor caracterizado por un acúmulo de eosinófilos y macrófagos. Fearon et al. (1990) introdujeron el gen de IL-2 en un carcinoma de colon murino pobremente inmunogénico. Los tumores que secretaban IL-2 fueron rechazados e indujeron una respuesta de células T citolítica efectiva. La depleción de células CD8^{+} in vivo anulaba la respuesta antitumoral celular, lo que implica una función central de las células CD8 positivas restringidas a la clase I.

Para aproximarse más de cerca al modo fisiológico de la secreción de citocina durante una respuesta inmune, el gen de la IL-2 se introdujo directamente en una línea celular de fibrosarcoma murino (CMS5). De esta forma se alcanzó una secreción localizada de bajos niveles de citocina que llevaron a la regresión de tumor (Gansbacher et al., 1990; Gansbacher et al. 1990). Mientras que los ratones controles murieron por el tumor antes de 45 días, los ratones que portaban el tumor secretor de IL-2 no sólo rechazaron el tumor implanado y se curaron, sino que también desarrollaron memoria inmunológica. Dosis letales de células tumorales implantadas fueron rechazadas después de varios meses, mientras que tumores no relacionados crecieron y mataron a estos ratones, demostrando la especificidad de la respuesta. Además, los linfocitos tomados de los bazos fueron capaces de matar al tumor in vitro a través de extender la vida de los animales inmunizados. Digno de mención es que las células tumorales no modificadas generaron respuestas citolíticas débiles; estas fueron transitorias y desaparecieron tres semanas después de la implantación del tumor. Sin embargo, los ratones inyectados con las células secretoras de IL-2 generaron actividad citolítica específica del tumor que duró durante más de 75 días.

Algunos de estos hallazgos se han reproducido en el MSKCC en diferentes tipos de tumores, tales como el melanoma murino B16, el linfoma de células B murinas 38C13, y el carcinoma de vejiga murino MBT 2. Experimentos adicionales usando células CMS5 secretoras de IL-2 irradiadas demostraron que no había diferencia en su capacidad para inducir memoria inmunológica in vivo si se comparaba con las células tumorales secretoras de IL-2 no irradiadas. Rosenberg et al. (datos no publicados) reprodujeron estos resultados en el tumor pobremente inmunogénico MCA-102. A pesar de muchos intentos nunca fueron capaces de generan una respuesta celular antitumoral usando células tumorales no modificadas. La introducción del gen IL-2 en estas células incrementaba su inmunogenicidad hasta un nivel en el cual se generaba un rechazo del tumor y memoria. Además, la coinyección de las células tumorales productoras de IL-2 con células tumorales no modificadas producía una respuesta suficientemente fuerte como para rechazar no sólo las células tumorales secretoras de linfocina sino también las células tumorales no modificadas.

En resumen, la introducción y expresión constitutiva de IL-2 por células tumorales incrementa por si misma la inmunogenicidad de varias células cancerígenas histológicamente diferentes. A partir de estos estudios parece que la expresión persistente localizada y la secreción de bajos niveles de IL-2 puede tener un impacto en la respuesta antitumoral del hospedador con ausencia de cualquier toxicidad detectable.

Transferencia de genes en humanos

Más recientemente, Rosenberg et al. han tomado linfocitos que infiltran tumores autólogos alterados genéticamente y los han inyectado en pacientes con tumores metastásicos refractarios (Rosenberg et al., 1990). Se introdujo un vector retroviral que contenía el gen de la resistencia a la neomicina en linfocitos autólogos para poder monitorizar estos cuando se reinfundieron en los pacientes. Las células de cuatro pacientes de cinco crecieron con éxito en cultivos celulares con G418, un análogo de neomicina. Estas células que mostraban resistencia a la neomicina se inyectaron por vía intravenosa en los pacientes junto con IL-2 sistémica. Se recogió periódicamente sangre periférica y se encontraron células mononucleares circulantes con resistencia a neomicina. No se vieron toxicidades adicionales como resultado de la alteración genética. No se recuperaron virus intactos de ningún paciente. Rosenberg concluyó que este procedimiento era viable y seguro (Rosenberg et al., 1990).

Estudios previos de seguridad mostraron que la exposición de primates a infusiones grandes de virus anfotrópicos murinos infecciosos no producían efectos patológicos graves (Cornetta et al., 1990). Veintiún primates trasplantados con médula ósea modificada por gen retroviral no mostraron evidencias de toxicidad relacionada con la transferencia del gen durante cinco años después de la inyección (Kantoff, et al. 1987). El primer paciente deficiente en adenosina deaminasa con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) experimentó una transferencia eficas del gen de la adenosina deaminasa por mediación retroviral aproximadamente hace un año en el NCI. Hasta ahora, los investigadores observaron una reconstrucción parcial de la función inmune celular sin ningún efecto dañino en el paciente.

Para investigar si los hallazgos en el sistema murino puede hacerse extensivos, se infectaron líneas celulares tumorales humanas con vectores retrovirales que contenían citoquinas. Hasta la fecha, el gen de la IL-2 humana, el gen del IFN-gamma humano y el gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico se han transducido con eficacia a varias líneas celulares humanas. En colaboración con el Dr. Raymon Taetle (Universidad de Arizona), el gen del factor de crecimiento epidérmico se introdujo en la línea celular del linfoma de Burkitts, Namalwa; se mostró que el receptor se expresaba en la superficie de las células y completamente funcional. La estimulación de estas células transducidas con el factor del crecimiento epidérmico llevaba a la unión apropiada del ligando y a la transducción de la señal (Oval et al., 1991). Además, el gen de IL-2 o del IFN-gamma se introdujo y se expresó en líneas de carcinoma de célula renal primarias y establecidas. Estas células modificadas genéticamente secretaban al sobrenadante de forma constitutiva IL-2 recombinante hastas 20 U/ml. La expresión constitutiva de IFN-gamma llevaba a la regulación por incremento del HLA de clase I y clase II en la superficie de las células del carcinoma de célula renal (Gansbacher, datos no publicados). La inyección de las células tumorales secretoras de IL-2 en ratones desnudos lleva al rechazo del tumor en contraste con las células no modificadas. La irradiación de los carcinomas de célula renal alterados genéticamente no anula la secreción de IL-2. Tras la irradiación letal, la IL-2 se secretó de forma continua durante 2 ó 3 semanas en cantidades comparables a las células transducidas no irradiadas.

Fundamento

Se propusieron estudios sobre si la inmunización con células de carcinoma renal alogénico que expresan un gen de IL-2 humana recombinante puede ser bien tolerada sin evidencia de toxicidad. Hay experiencia sustancial en el MSKCC y en otras instituciones de que se ha establecido la seguridad general de la inmunización usando células tumorales alogénicas irradiadas (Livingston et al., 1985; Livingston et al., 1983). La elección de células tumorales HLA-A2 positivas alogénicas se basa en dos consideraciones. Primera, el uso de una única línea celular inmunizante establecida evita la necesidad de infectar células tumorales autólogas para cada paciente. Crecer células tumorales autólogas en cultivos tisulares es un procedimiento difícil y requiere mucho tiempo. La tasa de éxito en cultivos creciendo a largo plazo con células de carcinoma renal es de 10 a 20% (Ebert et al., 1990). Puesto que aproximadamente el 40% de los pacientes es HLA-A2 positivo, una vacuna tumoral producida a partir de líneas celulares de carcinoma de célula renal HLA compatible establecida previamente podría ser ampliamente utilizada. Adicionalmente, se amontonan las evidencias de que existen antígenos compartidos por tumores (Livingston et al., 1991; Ebert et al., 1990). Los antígenos HLA de clase I son los elementos restrictivos para una respuesta de célula T citotóxica. Las células tumorales HLA-A2 compatibles pueden inducir respuestas de célula T citotóxica. El protocolo estará restringido a pacientes que sean HLA-A2 positivos.

Línea celular de carcinoma renal

Se usaran dos líneas celulares en combinación, SK-RC-28 y SK-RC-39, para la expresión de IL-2. La combinación permitirá la presentación de más antígenos asociados a riñón y permitirá mayor estimulación alogénica. La línea celular SK-RC-28 está derivada de una muestra de nefrectomía primaria de 1979 de una mujer de 51 años con una metástasis humeral aislada. La línea celular parental es un carcinoma moderadamente bien diferenciado que crece en agar blando pero no en ratones desnudos. La célula SK-RC-39 se derivó en 1980 de la resección de una recurrencia local encontrada en una mujer de 55 años cinco años después de su primer nefrectomía. La línea parental crece en agar blando y en ratones desnudos; tiene un tiempo de duplicación in vitro de 42 horas. El fenotipo antigénico de cada línea celular se muestra debajo.

Línea celular	gp160	gp140	gp120	URO-8	G250	HLA-A2	ABH/Rh
SK-RC-28	+	-	+	-	+	+	A+
SK-RC-39	-	+	+	+	-	+	O+

Ambas líneas celulares se infectaron con el vector retroviral NAP-AD/IL-2 (DC/AD/R/IL2). Las líneas celulares transfectadas secretan constitutivamente IL-2: SK-RC-28 secreta 20 U/ml y SK-RC-39 secreta 40 U/ml. Estas células tumorales serán irradiadas con 10.000 rads antes de la inyección, para asegurar su incapacidad para proliferar. Se usarán para las vacunas dos niveles de dosis de células tumorales.

Protocolo clínico

Este será un estudio piloto de inmunización con células tumorales alogénicas SK-RC-28 y SK-RC-39 que han sido alteradas para secretar IL-2, dadas a pacientes con carcinoma de célula renal para probar la seguridad de este procedimiento. Los pacientes serán tipados para el HLA del tejido. Aquellos que sean HLA-A2 positivos recibirán vacunaciones de células de carcinoma renal HLA-A2 compatible alogénico que secretan IL-2. El número esperado para este estudio es de doce pacientes. La duración esperada del ensayo será de doce meses.

Los cultivos tisulares se crecerán en los laboratorios de los Dres. Bernd Gansbacher y Neil Bander. Las células tumorales han sido infectadas con el vector retroviral NAP-AD/IL2 (DC/AD/R/IL2). Las células que secretan IL-2 serán irradiadas (10.000 rads) y dadas en una serie de cuatro vacunaciones. Si el paciente tiene una respuesta clínica según se define en la sección criterios para una respuesta terapéutica, entonces se darán reinmunizaciones adicionales hasta el año o hasta el progreso de la enfermedad. Seis pacientes recibirán vacunas de dosis baja y los seis adicionales recibirán dosis alta (véase el plan de tratamiento).

Criterios de participación del paciente

1. Pacientes con confirmación histológica del carcinoma de célula renal metastásico en el MSKCC.

2. Estado funcional según Karnofsky mayor o igual al 70% y esperanza de vida superior a 4 meses.

3. Función hematológica adecuada con WBC \geq 3.000/mm^{3}, recuento absoluto de linfocitos > 1.000/mm^{3}, hemoglobina \geq 9 y plaquetas \geq 100.000/mm^{3}.

4. Función renal y hepática adecuada (creatinina en suero \leq 2,5 mg/dl y bilirrubina \leq 1,7 mg/dl).

5. Al menos 4 semanas desde cualquier radioterapia anterior, inmunoterapia o quimioterapia (6 semanas para nitrosureas) y recuperación completa de dicho tratamiento.

6. La capacidad para dar consentimiento informado escrito.

7. Edad \geq a 18 años.

8. No historia de otras enfermedades concurrentes excepto el carcinoma basal, carcinoma de células escamosas de la piel o carcinoma in situ de la cervix.

9. No esteroides sistémicos desde al menos una semana antes del tratamiento.

10. Se recomienda la selección de pacientes con la mínima carga tumoral. Por tanto, la masa tumoral ha de ser eliminada si es posible antes de entrar.

11. Los pacientes han de ser HLA-A2 positivos.

12. Los pacientes han de tener un enfermedad mensurable o evaluable.

Criterios de exclusión

Las siguientes condiciones y situaciones harán de los pacientes no participen en este estudio:

1. Enfermedades médicas intercurrentes serias, incluyendo enfermedad cardiaca significativa (New York Heart Association Class III or IV), angina de pecho o infarto de miocardio durante los 6 meses previos.

3. La presencia de metástasis activas en CNS.

4. Mujeres embarazadas o en lactancia.

5. Pacientes que ha recibido más de una forma de terapia inmunosupresora incluyendo radioterapia o quimioterapia.

6. Los pacientes que requieran de terapia continuada con corticoesteróides no serán elegibles.

Terapia concurrente

Las siguientes terapias están prohibidas mientras que los pacientes están siendo tratados con este protocolo: radioterapia, terapia con hormonas, quimioterapia, corticoesteroides (excepto los administrados por circunstancias en que peligre la vida del paciente) u otra inmunoterapia.

Evaluación pretratamiento

2. Altura, peso y estado general o funcional.

3. Perfil de selección, BUN y creatinina.

4. CDC, diferencial y recuento de plaquetas.

5. Radiografía de pecho.

6. EKG.

7. Pruebas adicionales, rayo x y barridos según esté indicado en los pacientes que presentan signos y síntomas y requeridos para definir la extensión de la enfermedad del paciente.

8. Se obtendrá sangre periférica para inmunoensayos. Seis tubos de tapa verde y dos tubos de tapa roja.

9. Biopsia de cualquier sitio clínicamente accesible para confirmar el diagnóstico. Por favor, nótese que este no es un requerimiento absoluto para entrar en este protocolo.

Plan de tratamiento

Los pacientes recibirán al menos cuatro vacunaciones. Los primeros seis pacientes recibirán vacunación de dosis baja (definido a continuación), los seis subsecuentes recibirán los niveles de dosis alta. La vacuna consistirá en células de tumor RC alogénico irradiadas que habrán sido organizadas para secretar IL-2.

Dosis baja: aproximadamente 10 millones de células tumorales.

Dosis alta: aproximadamente 50 millones de células tumorales.

Se dará una serie de cuatro vacunaciones de forma subcutánea en el muslo o en el brazo del paciente. Se rotarán los sitios con cada vacunación. Se dará una vacuna cada dos semanas durante cuatro semanas. Se dará una vacuna de reinunización dos meses después de la tercera. Si un paciente tiene respuesta clínica (CR o PR como se define en los criterios de respuesta terapéutica), se darán reinmunizaciones adicionales cada tres meses durante un año o hasta la progresión de la enfermedad. Los pacientes con respuesta menor o enfermedad estable recibirán reinmunizaciones a discreción de los investigadores principales. Se obtendrán muestras de sangre antes de cada vacunación (véase la sección evaluación durante el estudio)

Vacunación: Día 1, 15, 29, 85.

Si el paciente desarrolla una reacción grave a la vacuna definida como toxicidad de grado IV (véase los criterios de toxicidad) o se deteriora el estado funcional hospitalización, este paciente no recibirá vacunaciones posteriores.

Criterios para el abandono del estudio

A) Enfermedad progresiva.

B) Enfermedad intercurrente.

C) Toxicidad de grado 4+ inaceptable.

D) Alteración general o específica en la condición del paciente que puede convertir los tratamientos adicionales en inaceptables según la opinión de los investigadores.

Formulación de vacunas

Se ha demostrado que las líneas celulares de carcinoma de célula renal establecidas SK-RC-28 y SK-RC-39 HLA-A2 compatibles infectadas con el retrovirus NAP-AD/IL2 (DC/AD/R/IL2) secretan IL-2 por encima de 20 U/ml. El stock de líneas celulares infectadas IL-2 se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron en el laboratorio de los Drs. Bernd Gansbacher y Neil Bander. Aproximadamente una semana antes de la fecha de vacunación, los viales que contenían 10 millones de células tumorales (uno para la dosis baja y cinco para la dosis alta) serán descongelados, expandido en cultivo celular y se reanalizará la producción de IL-2. Estos cultivos se mostrarán libres de virus cooperadores, micoplasma, bacterias y hongos.

Evaluación durante el estudio

1. Examen físico durante la terapia antes de cada vacuna.

2. CDC, recuento de plaquetas, y se hará un diferencial antes de cada vacuna.

4. Se obtendrá sangre periférica para inmunoensayos (véase la sección 6.8). Se obtendrán dos tubos de tapa roja y seis tubos de tapa verde antes de empezar las vacunaciones y uno dos semanas después de la cuarta vacuna. Estos se almacenarán en el laboratorio del Dr. Gansbacher.

5. Se repetirá la radiografía del pecho cada 4 semanas durante dos meses y luego después de cada vacuna.

6. Si se observa toxicidad de moderada a grave, se llevarán a cabo las pruebas pertinentes más frecuentemente que lo indicado en la tabla.

Evaluación de la respuesta inmune

El método más directo para medir la respuesta inmune contra el carcinoma renal es la detección de anticuerpos. La detección de anticuerpos IgG inducidos por inmunización también es una posible medida de las respuestas de células T cooperadora, debido a que la inducción de respuestas IgG maduras de alta afinidad requieren de la ayuda de las células T CD-4 positivas. Se tendrá suero de sangre periférica de todos los pacientes para análisis serológico de anticuerpos dirigidos contra las líneas celulares SK-RC-28 y SK-RC-39 (incluyendo gp160, g120, gp140 y Uro-8) y células tumorales autólogas cuando están disponobles. Además, se hará un control de respuesta inmune positiva con anticuerpos contra antígenos MHC de clase I y clase II alogénicos expresados por SK-RC-28 y SK-RC-39. Se espera que la mayoría de los pacientes desarrollen fuertes respuestas IgG contra los aloantígenos de clase I y clase I expresados por las dos líneas celulares. Se detectarán los anticuerpos contra antígenos de la superficie celular e intracelulares por:

A. Inmunoprecipitación de lisados en NP40 al 1% de SK-RC-29 y SK-RC-39 metabólicamente marcadas con ^{35}metionina.

B. Ensayos de hemadsorción variada para anticuerpos IgG e IgM dirigidos contra antígenos de la superficie celular (como se ha señalado anteriormente).

En pacientes seleccionados, donde se dispone de células tumorales autólogas, se pueden evaluar las respuestas inmunes celulares restringidas a MHC. Aunque las respuestas inmunes celulares son una medida crítica de la respuesta inmune, tienen las siguientes limitaciones: a) son necesarias células tumorales autólogas para detectar las respuestas, b) son necesarias células normales autólogas y células alogénicas MHC compatibles para evaluar la especificidad de las respuestas, y c) las pruebas de respuestas citotóxicas o cooperadores no son evidentes sin una estimulación in vitro con células tumorales autólogas. Se purificarán células mononucleares de sangre periférica por centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque. Las células se cultivarán con células tumorales autólogas, interleucina-2 (20 a 100 U/ml) y células estimuladoras autólogas o alogénicas como se ha descrito durante 7 a 14 días (Wolfel et al., 1989). Se harán los ensayos siguientes para evaluar la respuesta inmune celular cuando se disponga de células tumorales autólogas:

A. Ensayos de células T cooperadoras

Se cultivarán linfocitos de sangre periférica con células tumorales autólogas, células normales autólogas y células tumorales alogénicas (por ejemplo SK-MEL-29) durante 48 horas. Se medirá la proliferación por captación de ^{3}H-timidina en un pulso de 4 horas al final del ensayo. Medidas adicionales son la secreción de citoquinas durante el cocultivo con las células diana. La producción de IL-2 se mide por ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y estimulación de la línea celular CTL de referencia. La producción de interferón-\gamma se mide por ELISA. La liberación de citoquinas adicionales puede medirse por ELISA, incluyendo interleucina-4, interleucina-6, factor de necrosis tumoral-\alpha y factor estimulantes de colonias monocito granulocito.

B. Ensayo de células T citotóxicas

La citotoxicidad se mide a las 4 horas ó 18 horas por el ensayo de liberación de ^{51}-cromo (como se describe en Wolfel et al., 1989).

Criterios de respuesta terapéutica

1. Respuesta completa (CR): Desaparición de todas las evidencias clínicas del tumor por examen físico, rayos-X y evaluación bioquímica durante un mínimo de 4 semanas.

2. Respuesta parcial (PR): Descenso mayor del 50% en el examen físico o radiográfico (incluyendo barrio CT y/o ultrasonidos) de los productos sumados de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones medidas mantenidos durante un mínimo de 4 semanas. No puede darse un incremento simultáneo en el tamaño de ninguna lesión o la aparición de cualquier nueva lesión.

3. Respuestas menor (MR): descenso entre 25 y 49% en los productos sumados de los diámetros de las lesiones medidas durante un mínimo de 4 semanas.

5. Progresión (PROG): Incremento mayor del 25% en la suma de todas las lesiones medidas o aparición de nuevas lesiones.

6. Duración de la respuesta: Medida desde el inicio de la terapia hasta un incremento del 25% o mayor de la suma menor de todas las medidas del tumor obtenidas durante la mejor respuesta (CR, PR, MR o STAB).

Criterios de toxicidad

0

\hskip0.15cm

No toxicidad.

2+ Toxicidad moderada mejorada por maniobras sencillas.

4+ Toxicidad que pone en peligro la vida del paciente que requiere hospitalización. Una toxicidad que causa una muerte relacionada con fármaco se llamará una 4F.

Experiencia adversa

Hasta la fecha ha habido efectos secundarios mínimos por vacunaciones con células tumorales alogénicas (Livingston, 1991). Los pacientes han tenido induración y eritema en el sitio de vacunación. No ha habido respuestas de anafilaxis contra las celulas tumorales alogénicas in vivo. En el estudio inicial de administración de células humanas genéticamente alteradas a pacientes, no se vieron efectos secundarios adicionales como resultado del procedimiento y no se transmitieron retrovirus viables (Rosenberg et al., 1990).

Se informará de los efectos adversos serios del tratamiento (definidos como toxicidad de grado III o IV) al Memorial Sloan-Kettering IRB así como a la Oficina del NIH para la Protección de los Riesgos de Investigación antes de las 24 horas y se seguirá de un informe escrito en 10 días a la Oficina de Actividades con ADN Recombinante, Edificio 31, Despacho 4B11, Bethesda, MD.

Consideraciones bioestadísticas

El punto final de este estudio se ha definido como citotoxicidad clínica. Como se indicó en el plan de tratamiento, se tratarán seis pacientes para cada nivel de dosis. Si tres pacientes desarrollan toxicidad de grado III o IV (como se ha definido en los criterios de toxicidad común), entonces una dosis tolerada máxima no será un punto final mensurable.

Diseño y tamaño de muestra

Aproximadamente doce pacientes se enrolarán en este estudio piloto de vacunación con células tumorales. Se usarán dos niveles de dosis de células tumorales.

dosis baja: 10 millones de células tumorales.

dosis alta: 50 millones de células tumorales.

La dosis máxima tolerada se definirá como la dosis de vacuna para la cual tres o más pacientes tengan grado IV de toxicidad. El ensayo se parará tras la determinación de la dosis máxima tolerada o la finalización de ambos niveles de dosis. Se anticipa que puede no establecerse una dosis máxima tolerada en este estudio.

Procedimientos consentidos

Se requerirá a todos los pacientes la firma de una declaración de informe consentido que ha de ajustarse a las directrices del IRB. Este estudio de investigación ha sido revisado por el IRB del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center así como del Comité del ADN recombinante del NIH. El investigador informará al IRB y al RAC de los cambios en el protocolo de investigación y de todos los problemas no anticipados que impliquen riesgos para sujetos humanos u otros, y no se harán cambios en la actividad sin aprobación del IRB.

Quinta serie de experimentos

Incremento de la eficacia de la vacuna alogénica cuando se expresa más de una citocina

La figura 14 muestra vectores de construcción retroviral, N/CIL2/TIFN\gamma y N/CIFN\gamma/TIL2, que contiene ambos genes, IL-2 e IFN-\gamma. Estas construcciones se usaron para hacer células productoras como se ha descrito anteriormente aquí. Entonces, el vector retroviral producido se usó para transducir células. La figura 15 ilustra la eficacia de las células tumorales que expresan IL-2 e IFN-\gamma. El cuadrado negro es un control que muestra que se formaron tumores cuando se inocularon 250 mil células tumorales CMS5 en ratones BALB/c. Los círculos negros indican que se formó un tumor pequeño cuando las células tumorales expresaban IL-2, DC/TKIL2/CMS5 y se inoculaban en cuatro veces, que es un millón de células. Los rombos negros indican que el tumor más pequeño se podría formar incluso si las células tumorales expresaban IFN-\gamma, SVIFN\gamma/CMS5, y cuando se usaron como mucho 4 inóculos, que es un millón de células. Cuando se usó un millón de células y las células expresaban IL-2 e IFN-\gamma, N/CIL2/TIFN\gamma/CMS5, el tumor no se pudo formar. Este experimento claramente indican que la eficacia de la vacuna alogénica podría incrementase por la expresión de más de una citocina.

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Sexta serie de experimentos

Los modelos terapéuticos que usan transferencia génica en células tumorales han perseguido tres objetivos: (1) inducir el rechazo del tumor transducido con genes terapéuticos, (2) inducir regresión de la enfermedad metastásica mediada por inmunidad, y (3) inducir inmunidad a largo plazo para proteger contra la reinmunización con células tumorales, o recrecimiento clínico de enfermedad micrometásica. Puesto que la terapia in vivo de pacientes con cáncer usando transferencia de genes sería como una primera etapa de intento de eliminar el tumor existente, el solicitante ha investigado si la inmunidad antitumoral inducida por las células tumorales secretoras de una citocina única podría incrementarse por la cotransfección de un segundo gen de citocina. Para probar esta estrategia, CMS-5, un fibrosarcoma murino, se transdujo con vectores retrovirales que portaban ADNc sólo de interleucina-2 (IL-2), interferón-\gamma (IFN-\gamma) o factor estimulante de colonias granulocito macrófago (GM-CSF) o ADNc de IL-2 en combinación con ADNc de IFN-\gamma o GM-CSF. Los clones que secretaban una sola citocina se seleccionaron para comparar los niveles de producción de citocina con los clones que secretan citocina doble, de esta forma se secretan cantidades similares de citoquinas. Las células CMS-5 que secretan IFN-\gamma e IL-2/ IFN-\gamma mostraron un incremento del nivel de expresión de MHC de clase I comparado con las células CMS-5 que secretan IL-2 y GM-CSF o parentales. Las células CMS-5 que secretan IL-2/IFN-\gamma fueron siempre rechazadas por ratones singénicos, mientras que el mismo número de células CMS-5 que secretan sólo una de estas citoquinas, o mezclas de células CMS-5 que secretan una sola citocina no eran rechazados. La depleción in vivo de subpoblaciones células efectoras CD4^{+}, CB8^{+} o subpoblaciones efectoras NK mostraban que las células T citotóxicas CD8^{+} fueron las principales responsables del rechazo de las células tumorales transducidas con IL-2/ IFN-\gamma. Los datos de la solicitud muestras el uso eficaz de un vector retroviral único para transducir de forma estable dos genes de citocina en la misma célula tumoral, llevando a un efecto incrementado en la inducción de inmunidad antitumoral in vivo.

Introducción

Las mejoras en la capacidad para dirigir la distribución y la expresión de transgenes in vivo eleva la posibilidad de la terapia génica explorada para el tratamiento de enfermedades humanas (1-6). Entre varias aproximaciones posibles a la terapia génica del cáncer, la introducción de genes de citoquinas en células tumorales como parte de una estrategia de vacuna se ha mostrado eficaz en modelos experimentales (7-24). Los resultados varían, sin embargo, dependiendo del gen de citocina y del sistema tumoral elegido. La expresión de ciertos genes de citocina por células tumorales se ha mostrado que incrementa la inmunogenicidad del tumor y lleva al rechazo primario de las células tumorales transfectadas en hospedadores singénicos, así como a la inducción de una respuesta inmune antitumoral celular sistémica (7-12, 15-17, 21, 23). Citoquinas como GM-CSF no muestran efecto en el crecimiento tumoral in vivo, pero pueden llevar a una inmunidad sistémica potente tras la reinmunización con células tumorales parentales cuando la vacuna que se aplica es células tumorales secretoras de citocina irradiadas (24, 25). Se podría probar que las células tumorales que expresan estas citoquinas son importantes en la terapia tumoral adyuvante, sin embargo, parece improbable que beneficie a pacientes con un tumor primario y enfermedad metastásica. Mientras que en algunos sistemas tumorales ha sido posible demostrar rechazo de enfermedades preestablecidas (16, 17, 26-28), en la mayoría de los modelos animales esto no ha sido posible. En etapas iniciales hacia la terapia genética in vivo para el cáncer, es necesario desarrollar estrategias para optimizar la estimulación de la inmunidad antitumoral primario a células tumorales transducidas con el gen de citocina. En el presente estudio, el solicitante investigó las respuestas inmunes antitumorales inducidas por células tumorales secretoras de una sola citocina y el efecto de tener la célula tumoral provista de dos señales estimuladoras de citocina. El solicitante y otros han demostrado que la transfección y expresión del ADNc de IFN-\gamma puede llevar al incremento de la expresión de las moléculas de la superficie celular, incluyendo moléculas de MHC y antígenos asociados a tumores (TAA), y rendir tumores no inmunogénicos susceptibles de ser destruidos por células T citotóxicas (9-14). La secreción local de IL-2 a partir de células tumorales transfectadas con ADNc de IL-2 puede activar y expandir células efectoras citotóxicas específicas que llevan al rechazo del tumor (7, 8, 29). Se ha mostrado la interacción sinérgica de citoquinas en varios sistemas biológicos. Transduciendo una célula tumoral con el ADNc de IL-2 y de IFN-\gamma, el solicitante ha intentado inducir una inmunidad antitumoral incrementada por activación de brazo aferente así como el eferente de la respuesta inmune: el IFN-\gamma debería actuar aumentando la inmunogenicidad de la célula diana y activando las células efectoras citotóxicas no específicas, mientras que IL-2 debería proporcionar la señal coestimuladora necesaria par activar y expandir las células T citotóxicas, presumiblemente presentes en estrecha proximidad a las células tumorales transducidas (30-34). Puesto que mezclando dos poblaciones de células tumorales, cada una secretando una citocina, podria llevar a la eliminación preferencial de una de las poblaciones (22) y de ese modo al cese prematuro de los efectos de una citocina, el solicitante ha decidido expresar ambas citoquinas en las misma célula tumoral para incrementar las respuesta antitumoral celular in vivo. Ya que sería deseable para uso in vivo una única etapa de transducción que proporcionara señales para un óptimo rechazo primario, el solicitante ha desarrollado vectores retrovirales para citoquinas dobles que portan los genes de IL-2 e IFN-\gamma, o IL-2 y GM-CSF y, como controles, vectores retrovirales con una única citocina que porten los genes de la IL-2, IFN-\gamma o GM-CSF. Estos vectores se usaron para transducir la línea celular de fibrosarcoma murino CMS-5. La capacidad de los clones CMS-5 secretores de una sola citocina para inducir rechazo primario de las células tumorales se comparó con la de células tumorales que secretan similares cantidades de las dos citoquinas. Los mecanismos inmunológicos implicados en el rechazo de células tumorales secretoras de citoquinas y el potencial para inducir inmunidad antitumoral sistémica a largo plazo también se han investigado.

Materiales y métodos Diseño de vectores retrovirales y conversión de los vectores en virus

El vector retroviral N2 deriva del genoma del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) y contiene el gen de la resistencia a la neomicina bacteriana (neo) como marcador seleccionable (35). Las fuentes y los enzimas de restricción usados para obtener los fragmentos de ADN que codifican para el ADNc de IL-2 humana, el ADNc del IFN-\gamma de ratón, el promotor de la timidina quinasa del virus del Herpes simples (TK), el promotor principal inmediato temprano del CMV humano, el promotor de la adenosina deaminasa (ADA) y la señal poli A, han sido descritos previamente (7, 9, 36). El ADNc de GM-CSF murino fue un regalo del Genetics Institute, Inc. Los promotores CMV, ADA y TK que codifican para fragmentos de ADN se fusionaron con el fragmento de ADNc de la IL-2 humana, el ADNc del GM-CSF murino o el ADNc del IFN-\gamma murino y se clonaron en diferentes sitios del vector N2. Los productos de fusión TK-IL2 o TK-IFN-\gamma se clonaron en el sitio SnaBiI presente en el polienlazador de la secuencia larga de repetición 3' (LTR) de un vector N2 modificado para generar las construcciones vectoriales DC/TKIL2, N/CIIFN\gamma/TIL2 o N/CIL2/TIFN\gamma. Para completar la clonación de las construcciones sectoriales N/CIL2/TIFN\gamma y N/CIFN\gamma/TIL2, los productos de fusión CMV-IL2 o CMV-IFN\gamma respectivamente, se clonaron en el sitio XhoI presente secuencia abajo del gen de resistencia a neomicina. Para generar los vectores retrovirales DC/AD/R/IFN\gamma, DC/AD/RGM-CSF y N/CGM-CSF/RIL2, se clonó el promotor ADA en orientación inversa en el sito M1uI tratado con Klenow, el ADNc del IFN-\gamma murino, la IL-2 humana o el GM-CFS murino en orientación inversa en el sito SnaBI y la señal poli A en el sitio ApaI tratado con Klenow del polienlazador de 3' LTR. Para completar la clonación de los productos de fusión N/CGM-CSF/RIL2 y CMV-GM-CSF se clonaron en el sito XhoI secuencia abajo del gen de la neomicina que codifica para las secuencias de DC/AD/R/IL2 (36). N2/CMV/GM/CSF se generó por clonación del producto de fusión CMV-GM-CSF en el mismo sitio XhoI en el vector N2. DCA es un vector descrito previamente en el que el minigen humano ADA se clonó en la 3' LTR de N2 (37). Las construcciones de vectores retrovirales se convirtieron el los correspondientes virus por electroporación del ADN del vector en una línea celular empaquetadora ecotrópica sin auxiliar (GP+E-86:DC/AD/R/IFN\gamma, DC/AD/R/GM-CSF, N2/CMVGM-CSF, N/CIL2/TIFN\gamma, N/CIFN\gamma/TIL2, N/CGM-CSF/RIL2) o anfotrópica (GP+envAM12: DC/TIL2, DCA) (38, 39). Las colonias se aislaron por selección con G418 (0,7 mg/ml de Genticina, Gibco® Laboratories, Grand Island, NY), se expandieron para producir líneas celulares y se testó el título de virus en el sobrenadante libre de células.

Línea celular tumoral e infección de células tumorales

CMS-5 y CMS-13 son líneas celulares de fibrosarcoma no metastásico inducidas por metilcolantreno de origen BALB/c (40, 41). Ambas líneas celulares forman tumores reproducibles en singénicos, así como en ratones desnudos inmunodeficientes después de la inyección intradérmica (i.d.). La dosis letal mínima en ratones BALB/c es de 2 x 10^{5} células (7). Las células tumorales se cultivaron en medio DMEM complementado con suero fetal bovino al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. Las líneas celulares productoras de virus que secretaban un alto título de virus se usaron para infectar células CMS-5. Los derivados clonales de las células CMS-5 se aislaron por selección con G418, se expandieron a líneas celulares y se usaron para análisis posteriores. La tasa de crecimiento in vitro de las células CMS-5 parentales y transfectadas se evaluó poniendo en la placa 0,25 x 10^{5} células/ml, por triplicado para cada día y se contaron las células viables a los 2, 3, 4, y 5 días tras la siembra.

Ensayos de citoquinas

La secreción de IL-2, GM-CSF y IFN-\gamma en los sobrenadantes de células tumorales infectadas se determinó usando el bioensayo apropiado y se confirmó por ELISA (Genzyme, Boston, MA; Endogen, Cambridge, MA). Los sobrenadantes de las células CMS-5 parentales o secretoras de citocina en semiconfluencia se recogieron después de 24 horas y se ensayó la IL-2 humana, el GM-CSF murino y el IFN-\gamma murino. La actividad biológica de IL-2 se midió testando la capacidad de las preparaciones que contenían IL-2 para inducir la incorporación de ^{3}H-timidina en el ADN de linfoblastos primarios humanos dependientes de IL-2 (42). La concentración de GM-CSF murino se determinó de forma similar en un bioensayo usando células 32DC13 murinas dependientes de GM-CSF. Después de la incubación durante toda la noche sin GM-CSF, se incubaron 10^{4} células con diluciones seriadas de las muestras problema y se cultivaron durante 6 horas a 37ºC, y CO_{2} al 6%. Después de pulsar los cultivos con 1 \muCi de ^{3}H- timidina, se continuó la incubación durante otras 15 horas a 37ºC y se contaron las células con líquido de centelleo. La actividad GM-CSF se expresó en cpm y se calculó en ng/24 h/10^{6} células en comparación con una curva estándar de GM- CSF murino recombinante. El bioensayo del IFN-\gamma murino se basó en la actividad antiviral de los sobrenadantes determinado como la reducción de los efectos citopáticos del virus de la estomatitis vesicular en células L.

Análisis de las células activadas por fluorescencia

Se llevó a cabo citometría de flujo para el análisis cuantitativo de la expresión de MHC de clase I y clase II en superficie. Se recogieron un millón de células de las placas de cultivo tisular. Para su tratamiento con EDTA 5 mM, se lavaron con tampón FACS (PBS con FCS al 2% y azida sódica al 0,025%), se incubaron durante 30 min a 4ºC con los sobrenadantes de los cultivos de las líneas celulares de hibridoma de rata M1/42.3.9.8.HLK (ATCC TIB 126) y B21-2 (ATCC TIB 229). Estas líneas celulares, obtenidas de la American Type Culture Collection (Rockville, MD), producen anticuerpos monoclonales reactivos con un determinante monomérico de la moléculas de MHC de clase I y un determinante polimórfico de las moléculas de MHC de clase II de haplotipos I-A^{b,d}, respectivamente. Después de lavar dos veces, las células se incubaron con una dilución 1:50 de anticuerpo de cabra anti-IgG de rata conjugado con isotiocianato de fluorescencia (Cappel Laboratories, Durham, NC), durante 30 min a 4ºC en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces y, entonces se analizaron. La fluorescencia originada por las células muertas se excluyó por tinción con ioduro de propidio y la selección de umbral de las señales de dispersión de luz frontal y a 90º. Los resultados se confirmaron por microscopia de fluorescencia.

Crecimiento tumoral in vivo

Los ratones BALB/c se obtuvieron a partir de una colonia criada en el Sloan Kettering Institute. Las inyecciones de células tumorales se llevó a cabo usando células tumorales recién preparada que se sacaron de las placas de cultivo por tripsinización y se lavaron dos veces con PBS. Las células se inyectaron vía i.d. en el dorso de animales hembras de 7 a 10 semanas de edad. El crecimiento del tumor se medió en mm usando un pie de rey y se registraba como media del diámetro (longitud mas anchura de la superficie más larga dividida por dos).

Depleción in vivo de subpoblaciones celulares efectoras

El mAB rata anti- ratón GK1.5 (IgG2b) y el mAB rata anti-ratón 2.43 (IgG2b) en líquido ascítico se usaron para eliminar las células CD4^{+} cooperadoras y las células CD8^{+} citotóxicas, respectivamente (43, 44). La cantidad necesaria para eliminar las células T se determinó por inyecciones semanales i.p. de diferentes diluciones de la ascitis en ratones BALB/c. Los esplenocitos se analizaron por citometría de flujo 1 semana después de la inyección. Para los estudios in vivo, se dieron inyecciones semanales i.p. de 0,5 ml de las ascitis diluidas 1:50 (2.43) ó 1:30 (G1.5), empezando 1 semana antes de la inyección de las células tumorales. Para la depleción de células NK, 30 \mul del suero de conejo anti-asialo GM1 (Wako Chemicals USA, Richmond, VG) se inyectaron i.p. cada 5 días, empezando 5 días antes de la inyección de las células tumorales. La depleción de las células NK se confirmó por análisis in vitro de las citotoxicidad de las células del bazo contra la línea celular YAC-1, diana de las células NK.

Resultados experimentales Infección de células tumorales y secreción de citoquinas

Las estructuras de los vectores retrovirales usados para transducir las células del fibrosarcoma murino CMS-5 se muestran en la figura 16. Los sobrenadantes libres de las células que contienen los virus de los clones de células empaquetadoras se usaron para infectar fibroblastos NIH 3T3 para determinar el título de virus. Los títulos de virus de las diferentes construcciones variaban y estaban inversamente correlacionados con la complejidad de la construcción retroviral usada (tabla 7). Los títulos de virus para las construcciones de citocina doble oscilaba desde 10^{3} a 10^{5} Neo CFU/ml, los de las construcciones de citocina única desde 10^{5} a 10^{6} Neo CFU/ml. Los clones de título alto se seleccionaron para infectar a células de fibrosarcoma CMS-5. Se analizó la expresión de genes de citocina transfectados en los clones CMS-5 resistentes a G418 midiendo IL-2, GM-CSF y IFN-\gamma liberado a sobrenadante del cultivo usando un bioensayo. Entonces, los resultados se confirmaron por ELISA. Las células CMS-5 parentales no secretaban ninguna de las citoquinas probadas en este estudio. Los clones aislados de las células CMS-5 transducidas con genes de citoquinas variaban en su capacidad para expresar y secretar citoquinas dependiendo del vector retroviral usado. El intervalo de citocina producida por los diferentes clones estaba entre 0 a 170 ng/24 h/10^{6} células para IL-2, 0 a 1.600 pg/24 h/10^{6} células para IFN-\gamma y 0 a 400 ng/24 h/10^{6} células para GM-CSF. Se seleccionaron los clones secretores de una sola citocina que después de la inoculación de un millón de células mostraban retraso en el crecimiento del tumor, pero no rechazo del tumor. Los clones de CMS-5 transducidos con IL-2 o IFN-\gamma DC/TKIL2/CMS5Nº6 y DC/AD/R/IFN\gamma/CMS5Nº13 secretores de 53 ng/24 h /10^{6} células (160 U/24 h/10^{6} células) de IL-2 y de 268 pg/24 h/10^{6} células (2 U/24h/10^{6} células) de IFN-\gamma, respectivamente. Para investigar si la secreción de una segunda citocina por la misma célula podría inducir el rechazo del tumor, el solicitante seleccionó el clon del tumor N/CIL2/TIFN\gamma/CMS5Nº3 que producía 58 ng/24 h/10^{6} células de IL2 (174 U/24 h/10^{6} células) y 159 pg/24 h/10^{6} células (0,72 U/24 h/10^{6} células ) de IFN-\gamma (tabla 8). Para analizar los efectos in vivo del GM-CSF en el rechazo de un tumor primario, se seleccionaron células CMS-5 transducidas en masa que secretaban cantidades altas (130 ng/24 h/10^{6} células), medias (80 ng/24 h/10^{6} células) o bajas (8ng/24 h/10^{6} células) de GM-CSF y el clon N2/CMV-GM-CSF/CMS5Nº6.1 que secretaba 65 ng/24 h/10^{6} células. El clon de célula tumoral N/CGM-CSF/RIL2Nº14.14 que secretaba 130 ng/24 h/10^{6} células de GM-CSF y 3,3 ng/24 h/10^{6} células (10 U/24 h/10^{6} células) de IL-2 se seleccionaron como control (tabla 2). La secreción de IL-2, IFN-\gamma o GM-CSF no tiene efecto discernible sobre la morfología celular. No se observaron cambios en la tasa de crecimiento in vitro de las células CMS-5 secretoras de GM-CSF o IL-2/GM-CSF en comparación con las células CMS-5 parentales. La tasa de crecimiento en cultivo estaba ligeramente reducida por la secreción de IFN-\gamma (figura 17).

TABLA 7

7

TABLA 8

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Expresión de MHC de las células tumorales transducidas con IFN-\gamma

Se ha mostrado la regulación por incremento de las moléculas MHC y otras moléculas implicadas en procesamiento y presentación de IFN-\gamma y se cree que contribuye a los efectos antitumorales de IFN-\gamma observados (12, 13, 45-49). Para determinar si la expresión constitutiva de IFN-\gamma coducía a efectos en la expresión de MHC de clase I y II, las células CMS-5 transducidas con IL-2, IFN-\gamma, GM-CSF e IL-2/ IFN-\gamma se valoraron por tinción de inmunofluorescencia indirecta y análisis de células activadas por fluorescencia (figura 18). Las células CMS-5 parentales expresaban moléculas de MHC de clase I, pero no se detectaban moléculas de MHC de clase II. El nivel de expresión de MHC I se elevó sustancialmente en las células que sólo secretaban IFN-\gamma y se elevó moderadamente en aquellas que secretaban IFN-\gamma más IL-2, en comparación con células de fibrosarcoma no transducidas. No se vió expresión de novo de moléculas de MHC de clase II en células transfectadas con IFN-\gamma. Como era de esperar, no se observaron efectos en la expresión de MHC con la secreción de IL-2 o GM-CSF (datos no mostrados, 9).

Aumento de una respuesta antitumoral específica por IL-2 e IFN-\gamma

Para estudiar los efectos in vivo de la secreción de IL-2, IFN-\gamma y GM-CSF en el rechazo de tumores primarios, se inyectaron vía i.d. células CMS-5 secretoras de citocina o parentales en el dorso de ratones BALB/c y se midió el crecimiento del tumor. El solicitante previamente demostró que la inyección de 2 x 10^{5} células CMS-5 no modificadas en ratones BALB/c tenía como resultado el crecimiento de tumor en el 100% de los ratones (7). Por tanto, el solicitante usó 2,5 x 10^{5} células CMS-5 parentales en los grupos de CMS-5 controles. Un trabajo previó mostró que la secreción sólo de IL-2 o IFN-\gamma por células CMS-5 lleva al rechazo del tumor primario (7, 9). El solicitante ahora ha elegido clones CMS-5 secretores de una sola citocina que no conducen al rechazo cuando se inyectaba un millón de células. Sin embargo, un millón de células CMS-5 que secretaban cantidades comparables de IL-2 más IFN-\gamma siempre eran rechazadas a las 3 ó 4 semanas. Un experimento representativo se muestra en la figura 19. La coinyección de 10^{6} ó 5 x 10^{5} células CMS-5 secretoras de IL-2 con el mismo número de células CMS-5 secretoras de IFN-\gamma tampoco tenía como resultado el rechazo del tumor (figura 20). Por tanto, la cosecreción de IL-2 e IFN-\gamma a partir de la misma célula tumoral parece aumentar las respuestas antitumorales primarias del hospedador comparado con la secreción de una sola citocina.

Como se ha probado que GM-CSF es un potente inductor de inmunidad contra una reinmunización de células tumorales parentales, el solicitante ha investigado los efectos directos in vivo de las células de fibrosarcoma secretoras de GM-CSF. Las células transducidas en masa que secretan cantidades altas, medias o bajas de GM-CSF no mostraban regresión a dosis de 2,5 x 10^{5} células (figura 21). Además, los resultados sugieren que la secreción de GM-CSF de las células de fibrosarcoma CMS-5 podría incluso haber promovido el crecimiento del tumor. Para demostrar la secreción continua de citocina in vivo, los tumores secretores de CM-CSF se eliminaron después de 3 ó 4 semanas, se reestablecieron en cultivo y se midió la producción de citocina antes y después de 10 días de cultivo con G418. Las secreción de GM-CSF antes de la inyección se correspondía en todos los casos con la cantidad secretada después de la selección del tumor y después de las selección con G418 (datos no mostrados). Estos datos sugieren que la producción de GM-CSF era responsable de los efectos observados in vivo. Experimentos in vivo en curso usando células CMS-5 transducidas con vectores que portan el ADNc de la IL-2 solo o los ADNc de GM-CSF más IL-2 muestran que la secreción de GM-CSF además de IL-2 no tenía efecto adicional en la inhibición de crecimiento del tumor comparada con la IL-2 sola (datos no mostrados).

Para investigar si la actividad antitumoral inducida en ratones inyectados con N/CIL2/TIFN\gammaCMS5 era una respuesta sistémica específica de tumor a largo plazo, los ratones que previamente habían rechazado las células CMS-5 secretoras de citocina fueron inoculados con una dosis letal de células tumorales parentales o con tumores inducidos con metilcolantreno que no presentaban reacción cruzada con el mismo fondo genético (CMS-13). Los tumores crecieron en los animales inoculados con células CMS-13, pero no con células CMS-15, conformando datos previos (datos no mostrados, 7, 9). Las células CMS-5 secretoras IL-2 e IFN-\gamma, por tanto, inducían respuestas antitumorales inmediatas así como inmunidad protectora a largo plazo contra el tumor parental.

Influencia de la eliminación in vivo de subpoblaciones de células efectoras en el crecimiento del tumor

Para determinar la contribución de las diferentes subpoblaciones celulares en el rechazo de las células tumorales secretoras de IL-2/IFN-\gamma, se monitorizó el crecimiento del tumor en ratones en los que se habían eliminado de forma selectiva las células CD4^{+}, CD8^{+} o NK. Un experimento representativo se muestra en la figura 7. Los ratones fueron inyectados con mAB contra células CD4^{+}, CD8^{+} o NK como se describe en Materiales y métodos. La ausencia de células CD8+ prevenía del rechazo de las células CMS-5 secretoras de IL-2/IFN-\gamma. Por el contrario, la eliminación de las células CD4^{+} no interfería con la capacidad del ratón para rechazar las células tumorales transducidas. La eliminación de las células NK retardaba el rechazo de los tumores secretores de IL-2/IFN-\gamma en comparación con los ratones no deplecionados. Estos resultados sugieren que en el rechazo primario de las células tumorales secretoras de IL-2/IFN-\gamma, las células T citotóxicas CD8^{+} eran lasa principales responsables pero que las células NK también se indujeron y que, mientras estas no fueron necesarias para la eliminación del tumor, también pueden influir en el rechazo del tumor (29). No parecía que las células CD4^{+} tuvieran una función en la actividad antitumoral mediada por las células CMS-5 secretoras de IL-2/IFN-\gamma.

Discusión experimental

En este trabajo el solicitante investiga los mecanismos del rechazo primario de células tumorales transducidas con genes de citoquinas presentados en construcciones retrovirales que contiene ADNc único o doble. Aunque actualmente no es posible dirigir genes terapéuticos contra células tumorales in situ, el progreso en la distribución específica de tejidos y en los sistemas de expresión hace de ésta una estrategia realista en el futuro (1-6). Puesto que el tratamiento in vivo de pacientes con cáncer usando transferencia génica intentarí alcanzar la máxima inducción de inmunidad antitumoral en una sola etapa de transducción, el solicitante ha investigado si la cotransducción de dos citoquinas en una célula tumoral por un único vector retroviral conduciría a un incremento de la respuesta antitumoral del hospedador.

El solicitante eligió IFN-\gamma e IL-2 en este estudio porque estas citoquinas previamente han mostrado su eficacia en la inducción del rechazo de tumores primarios (7-12) y porque ambos actúan a niveles diferentes de la respuesta inmune: IFN-\gamma es una citocina de la que se conoce que regula positivamente las moléculas que participan en el procesamiento y presentación del antígeno y así actúa a los niveles de las células diana (45, 47-52). IFN-\gamma también regula la inducción de células T citotóxicas y la activación de macrófagos, células NK y células LAK y puede inducir otros varios factores reguladores inmunes (29-33, 53, 54). IL-2, por otro lado, causa proliferación de las células T citotóxicas, células NK y LAK y así actúa principalmente a nivel de las células efectoras (55-57). La sinergia de IL-2 e IFN-\gamma también podría anticiparse ya que datos recientes muestran que la activación de células T se puede aumentar si una señal coestimuladora no específica de antígeno, como B7 o IL-2, es distribuida por las APC (26, 27, 58-60). La vacunación con células tumorales irradiadas secretoras de GM-CSF puede estimular una inmunidad potente a largo plazo contra una reinmunización con células tumorales parentales (24): El solicitante estudió los efectos de las células tumorales vivas secretoras de GM-CSF y GM-CSF/IL-2 en la inducción de rechazo del tumor primario.

Con este fin, el solicitante construyó vectores retrovirales para una única citocina que porta el ADNc del IFN-\gamma murino, del GM-CFS murino o de la IL-2 humana y un vector retroviral para citocina doble que contenía los ADNc de IL-2 e IFN-\gamma, o de IL-2 y GM-CSF y usó éstos para infectar CMS-5, un fibrosarcoma pobremente inmunogénico. Nuestros datos demuestran que los vectores retrovirales que portan dos genes de citoquinas pueden usarse para transfectar de forma estable células tumorales que llevan a la secreción de proteínas biológicamente activas durante períodos de tiempo prolongados. La secreción de bajas cantidades de IFN-\gamma por las células de fibrosarcoma tuvo como resultado la regulación por incremento de las moléculas de MHC de clase I en la superficie de la célula. Por tanto, la inmunogenicidad se podría aumentar ya que los antígenos asociados a tumores están presentes en las células citotóxicas en el contexto de las moléculas de MHC de clase I (61, 62). La secreción de IL-2 e IFN-\gamma por la misma célula tumoral condujo a la generación de células citotóxicas capaces de rechazar al menos un millón de células CMS-5, una dosis cuatro veces mayor que la dosis letal de CMS-5 en ratones BALB/c. La secreción de cantidades similares de IFN-\gamma o IL-2 solo no indujo una respuesta inmune lo suficientemente fuerte como para causar el rechazo de un millón de células tumorales. Mezclando el mismo número de células CMS-5 secretoras de IL-2 y de IFN-\gamma tampoco se consiguió el rechazo del tumor. Este fenómeno puede estar relacionado con la circunstancia de que con el vector de citocina doble ambas citoquinas se secretan a una concentración/célula constante hasta que todas las células del tumor han sido destruidas y que en las circunstancias de mezcla de células una población que secreta citocina se destruye preferentemente antes que la otra. Estos datos apoyan el concepto de que IL-2 e IFN-\gamma pueden cooperar activamente en las funciones citotóxicas del sistema inmune (46, 63-65) y sugiere una ventaja el tener ambas citoquinas secretadas por la misma célula. Es posible que la regulación por aumento inducida por IFN-\gamma in vivo de moléculas implicadas en el procesamiento y presentación de antígeno es más eficaz en situación autocrina y que en situación paracrina sería necesario más IFN-\gamma. Todavía, ha de considerarse que sobre una base celular sólo se produce la mitad de la citocina como máximo en una mezcla de clones. La cuestión de la ventaja de la cosecreción de ambas citoquinas por una célula tumoral no se contesta definitivamente con los experimentos realizados aquí. Sin embargo, la secreción de ambas citoquinas en una célula única debería conducir a la exposición simultánea de todos las células efectoras a ambas citoquinas. Por el contrario, la secreción de ambas citoquinas por diferentes células tumorales se esperaría que tuviera como resultado la exposición de las células efectoras a una concentración variable de las citoquinas. Además, el uso de un vector único que porta ambos genes de citocina simplificaría la transferencia génica del tratamiento de tumores in vivo requiriendo una sola etapa de transducción.

Las células CMS-5 transducidas en masa secretoras de GM-CSF no irradiadas y las células CMS-5 secretoras de GM-CSF y GM-CSF/IL-2 seleccionadas clonalmente no fueron rechazadas incluso con las cantidades de células más bajas. Por el contrario, cuanto más GM-CSF se secretaba, más rápido crecía el tumor, lo que sugiere un efecto promotor del crecimiento de GM-CSF en células CMS-5. La explantación del tumor y la reselección con G418 in vitro mostró que el sobrecrecimiento de las células CMS-5 no secretoras o secretoras de bajo GM-CSF podría no ser la razón para el crecimiento tumoral observado in vivo. En experimentos adicionales se usó le vector que contiene GM-CSF para transducir MBT-2, un carcinoma de vejiga, TS/A, un adenocarcinoma y B16, un melanoma. En ningún caso la secreción de GM-CSF indujo el rechazo de las células tumorales transducidas. Los datos del solicitante están de acuerdo con datos publicados que muestran que GM-CSF ejerce sus potentes efectos inmunoestimuladores mejor si lo secretan células tumorales irradiadas incapaces de proliferación. Dranoff et al. publicaron un síndrome sistémico de toxicidad mortal manifestada por leucocitosis, hepatoesplenomegalia y hemorragia pulmonar en ratones inyectados con células B16 secretoras de GM-CSF (24). Este fenómeno se atribuyó al número progresivamente creciente de células tumorales que expresaban GM-CSF in vivo. Los tumores humanas que secretan de forma natural GM-CSF no parece que nunca sean rechazados (66). Estos y nuestros datos subrayan la importancia de seleccionar cuidadosamente la citocina para cada tumor y cada gen elegido para estrategia terapéutica.

En ausencia de células CD8^{+} citotóxicas, los tumores CMS-5 secretores de IL-2/IFN-\gamma no fueron rechazados, confirmando la necesidad de las células CD8^{+}para la eliminación del tumor. Estos resultados sugieren que a pesar de la ligera inhibición del crecimiento de células secretoras de IFN-\gamma in vitro, los efectos inhibitorios directos de IFN-\gamma en el crecimiento tumoral no fueron responsables de la regresión del tumor. Aunque la secreción de IL-2/IFN-\gamma por células tumorales activaba la células NK, como se mostró por el rechazo retrasado de tumores en animales deplecionados de NK, su ausencia no fue necesaria para eliminar tumores. Las células T cooperadoras CD4^{+} parece que no contribuían al rechazo de las células CMS-5 secretoras de IL-2/ IFN-\gamma, ya que el rechazo del tumor no se vió afectado con ratones deplecionados de CD4, probablemente porque la secreción constitutiva de IL-2 e IFN-\gamma por las células diana evitaba el requerimiento de células T cooperadoras (8). De los experimentos presentados aquí, el solicitante no puede excluir que otras células efectoras no específicas del sistema inmune contribuyan al rechazo de las células neoplásicas. IFN-\gamma es un potente activador de macrófagos y por tanto, la actividad antitumoral de este sistema podría ser parcialmente atribuible a los efectos citostáticos o citotóxicos de macrófagos activados. Además, la secreción de IL-2/IFN-\gamma no sólo lleva al rechazo de las células tumorales transducidas sino también estimula una inmunidad antitumoral específica a largo plazo. Esto podría ser clínicamente importante si después de la terapia primaria no se eliminarán todas las células del tumor. Entonces, la inmunidad podría prevenir el recrecimiento de micrometástasis. Si la respuesta inmune inducida por las células tumorales transducidas con doble citocina podría ser suficiente para eliminar también la enfermedad preestablecida o, sino es así, cómo puede alcanzarse esto, necesita de investigaciones adicionales.

En resumen, los vectores retrovirales que portan genes de citoquinas dobles pueden usarse para transfectar de forma estable células tumorales transfectadas estables y aumentar la actividad antitumoral in vivo. También, la expresión de ambas citoquinas en una construcción vectorial puede ser beneficiosa para aplicaciones clínicas futuras para distribuir ambos genes al mismo tiempo dentro de una célula tumoral.

Referencias de la sexta serie de experimentos

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Claims

1. Una célula manipulada genéticamente que coexpresa interleucina-2 e interferón gamma y cuya célula es alogénica en relación con el paciente a quien se administra la célula.

2. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 1, la cual expresa otra inmunomolécula seleccionada del grupo formado por:

una citocina, una molécula de adhesión, un factor coestimulante, un antígeno asociado a tumor y un antígeno tumor específico.

3. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 1, en la que la célula es una célula presentadora de antígeno no profesional.

4. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 1, en la que la célula expresa un antígeno asociado a un tumor y un antígeno específico de tumor.

5. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 1, en la que la célula expresa un antígeno asociado a un tumor o un antígeno específico de tumor.

6. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 1, en la que la célula se selecciona de un grupo formado por una célula de melanoma, una célula de carcinoma renal, una célula de tumor de mama y una célula de tumor de cerebro.

7. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 1, en la que la célula comprende un vector retroviral que comprende:

(a) una secuencia larga de repetición (LTR) 3'; y

(b) una inserción que comprende:

: (i) un promotor,

: (ii) ADN que codifica para interleucina-2 e interferón-gamma, y

: (iii) una señal poli A

en el que el promotor, el ADN que codifica para interleucina-2 e interferón-gamma y la señal poli A están alineados en marco en orientación 5' a 3', y

en el que la inserción se sitúa dentro de 3' LTR en orientación opuesta a la orientación de 3' LTR.

8. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 7, en la que el promotor se selecciona del grupo formado por un promotor del gen de la timidina quinasa del virus del Herpes simples, un promotor del gen principal inmediato temprano del CMV humano y el promotor del gen de la adenisona deaminasa.

9. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 7, en la que el vector es N2.

10. La célula manipulada genéticamente de la reivindicación 7, en la que la células se selecciona del grupo consistente esencialmente en SK-MEL-29, SK-MEL-131, SK-RC-28 y SK-RC-39.

11. Una composición que comprende una pluralidad de células manipuladas genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. El uso de las células manipuladas genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto mamífero.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que la célula además expresa el antígeno asociado al tumor, antígeno asociado a melanoma E-1.

14. El uso de la reivindicación 12, en el que la célula manipulada genéticamente es una célula dendrítica.

\newpage

15. El uso de la reivindicación 12, en el que de aproximadamente diez a aproximadamente cincuenta millones de células manipuladas genéticamente han de ser administrada al sujeto mamífero.