ES2210356T3 - Conjugados de haptano-transportador para empleo en terapia contra el uso de drogas. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN CONJUGADOS VEHICULOS DE HAPTENO CAPACES DE OBTENER ANTICUERPOS ANTI-HAPTENO IN VIVO MEDIANTE SU ADMINISTRACION EN UNA COMPOSICION TERAPEUTICA. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA PREPARAR DICHOS CONJUGADOS Y COMPOSICIONES TERAPEUTICAS. CUANDO EL HAPTENO ES EL FARMACO DEL QUE SE ESTA ABUSANDO, RESULTA PARTICULARMENTE UTIL UNA COMPOSICION TERAPEUTICA QUE CONTIENE EL CONJUGADO HAPTENO-VEHICULO EN EL TRATAMIENTO DE LA ADICCION AL FARMACO, MAS EN CONCRETO LA ADICCION A LA COCAINA. TAMBIEN SE DESCRIBE LA INMUNIZACION PASIVA UTILIZANDO ANTICUERPOS PRODUCIDOS CONTRA LOS CONJUGADOS DE LA PRESENTE INVENCION. LA COMPOSICION TERAPEUTICA RESULTA ADECUADA PARA LA CO-TERAPIA CON OTROS FARMACOS CONVENCIONALES.

Description

Conjugados de haptano-transportador para empleo en terapia contra el uso de drogas.

Área de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento del abuso de drogas. Más específicamente, la presente invención puede ser utilizada para el tratamiento del abuso de drogas utilizando conjugados droga-hapteno transportadores que inducen respuestas de anticuerpos y/o utilizando los anticuerpos contra los conjugados droga-hapteno transportadores.

Antecedentes de la invención

La frecuencia del uso y abuso de drogas en el mundo, especialmente en los Estados Unidos, ha alcanzado niveles epidémicos. Existen multitud de drogas, tanto legales como ilegales, cuyo abuso se ha convertido en un problema público serio que afecta a todos los estratos de la sociedad con unas consecuencias médicas y sociales obvias. Algunos usuarios viven en una población con un riesgo extremadamente alto asociado a la pobreza y a las actividades ilegales. Otros usuarios, que pueden definirse a sí mismos como usuarios recreacionales, también se encuentran en riesgo debido a (a) propiedades de la(s) droga(s) que las hacen adictivas, (b) la predisposición del usuario a convertirse en usuario de gran cantidad o (c) una combinación de factores que incluyen circunstancias personales, apuros económicos, entorno y accesibilidad. El tratamiento adecuado del abuso de drogas, incluyendo el abuso de varias drogas, requiere de programas de intervención innovativos y creativos.

Una droga especialmente problemática es la cocaína, un alcaloide derivado de las hojas de la planta de coca (Erythroxylon coca). Únicamente en los Estados Unidos, existen actualmente más de 5 millones de usuarios regulares de cocaína de los cuales al menos 600.000 están clasificados como adictos severos (Miller et al. (1989) N.Y. State J. Med. pp. 390-395; y Carroll et al. (1994) Pharm. News. 1:11-16). Dentro de esta población, un número significativo de adictos está buscando terapia activamente. Por ejemplo, en 1990, 380.000 personas buscaron tratamiento médico para la adicción a la cocaína y este número se encuentra en aumento. En ese momento, se estimó que 100.000 admisiones por año en urgencias implicaban la utilización de cocaína. Los efectos cumulativos del crimen violento asociado a la cocaína, la pérdida de productividad individual, y la muerte, constituyen un problema internacional.

La ausencia de terapias eficaces para el tratamiento de la adicción a la cocaína, sugiere de manera firme que se deben desarrollar nuevas aproximaciones. Otros factores adicionales que contribuyen a la falta de éxito de los programas de tratamiento es la variación con el tiempo de los patrones del abuso de la cocaína. En un artículo titulado "1994 Chemical Approaches to the Treatment of Cocaine Abuse" (Carroll et al. (1994) Pharm. News, Vol. 1,No.2), Carroll et al. describe que desde mediados de los años 80, la administración por vía intravenosa y nasal de la sal clorhidrato (coke, snow, blow) y el fumar base libre de cocaína (crack) se han convertido en rutas comunes de administración, produciendo euforia y estimulación psicómotora que dura 30-60 minutos. Al contrario que otras drogas de abuso, la cocaína puede ser tomada en excesos que duren varias horas. Este comportamiento lleva a la adicción, y en algunos casos, a consecuencias tóxicas (Carroll et al., Pharma News, supra).

Solamente existen tratamientos muy limitados para las drogas de abuso y no existe ningún tratamiento eficaz a largo plazo para la adicción a la cocaína. Los tratamientos incluyen, pero no están limitados a, asesoramiento asociado con la administración de drogas que actúan como antagonistas de los receptores de opiáceos o drogas que tratan de reducir el ansia asociada con la drogadicción. Una aproximación al tratamiento es la desintoxicación. Incluso remisiones temporales con mejoras físicas, sociales y psicológicas concomitantes son preferibles a la continuación de la aceleración progresiva del abuso y sus consecuencias médicas e interpersonales adversas (Wilson et al. en Harrison´s Principle of Internal Medicine Vol. 2. 12ª Ed., McGraw-Hill (1991) pp. 2157-8). Más específicamente, las aproximaciones farmacológicas al tratamiento del abuso de cocaína implican generalmente la utilización de drogas antidepresivas, como la desipramina o fluoxetina, que pueden ayudar en el manejo de los aspectos psicológicos del abandono pero que, en general, no afectan directamente a la fisiología de la cocaína. Aún más, su efectividad varía mucho (Brooke et al. (1992) Drug Alcohol Depend. 31:37-43). En algunos estudios, la desipramina reduce la administración propia (Tella (1994) College on Problems of Drug Dependence Meeting Abstracts; Mello et al. (1990) J. Pharmacol. Exp. Ther. 254:926-939; y Kleven et al. (1990) Behavl. Pharmacol. 1:365-373), pero la proporción de abstinencia después del tratamiento no supera el 70% (Kosten (1993) Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr. 85). También se han utilizado drogas que potencian la transmisión dopaminérgica, como la bromocriptina, pero los beneficios de estas drogas están limitados en parte por su toxicidad (Taylor et al. (1990) West. J. Med. 152:573-577).

Se han utilizado también drogas nuevas con el fin de reemplazar a la metadona en la adicción opiácea, como la buprenorfina, basadas en la interferencia cruzada con el sistema dopaminérgico, sin embargo sólo se encuentra disponible una información limitada de estudios clínicos (Fudula et al. (1991) NIDA Research Monograph, 105:587-588). Se ha descrito que la buprenorfina disminuye la administración propia de cocaína (Carrol et al. (1991) Psycopharmacology 106:439-446; Mello et al. (1989) Science 245:859-862; y Mello et al. (1990) J. Pharmacol. Exp. Ther. 254:926-939); sin embargo, la proporción de abstinencia a la cocaína después del tratamiento no supera generalmente el 50% (Gastfried et al. (1994) College on Problems of Drug Dependence Meeting Abstracts; y Schottenfeld et al. (1993) Problems on Drug Dependence, NIDA Res. Monogr. 311).

Las terapias utilizadas actualmente para tratar a los adictos a la cocaína presentan al menos cuatro limitaciones principales que dan lugar a una alta proporción de recidivismo. Primera, y quizá la más importante, los eventos neuroquímicos que contribuyen al abuso y adicción a la cocaína son complejos (Carroll et al. (1994) supra.). Como resultado, las aproximaciones que actúan solamente a nivel neurofarmacológico, como la inhibición del transporte de dopamina, no parecen suficientes para superar la adicción. Segunda, las drogas que se utilizan actualmente en los tratamientos de adicción a la cocaína tienen efectos secundarios significativos en ellas mismas, lo que limita su utilidad. Tercera, el seguimiento de las terapias de drogas entre la población de estos pacientes es problemático. Las terapias actuales pueden requerir de visitas frecuentes al médico y/o administración propia de drogas que curan la adicción de su hábito. Al prevenir muchas de estas drogas la euforia asociada a la cocaína, existe una falta de incentivo importante para tomarlas. (Carroll, et al. (1994) supra.; Kosten et al. (1993) Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr. 132:85; Schottenfeld et al. (1993) Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr. 132:311). Cuarta, debido a las químicas complejas implicadas en las terapias farmacológicas, muchas de ellas pueden no ser compatibles con otras terapias actualmente en uso en los ensayos clínicos.

Se han sugerido en la literatura aproximaciones y terapias de diagnóstico experimentales aunque todavía no se han llevado a la práctica. Por ejemplo, se ha descrito la vacunación como una aproximación terapéutica para la drogadicción. Bonese et al. han investigado cambios en la administración propia de heroína por un mono rhesus después de ser inmunizado contra la morfina (Bonese et al. (1974) Nature 252:708-710). Bagasra et al. han investigado la vacunación utilizando cocaína-KLH para prevenir la adicción (Immunopharmacol. (1992) 23:173-179). Se inmunizaron ratas con un conjugado cocaína-KLH lo que indujo algunos anticuerpos anticocaína. Sin embargo, estos resultados están en disputa (Gallacher (1994) Immunopharm. 27: 79-81). Obviamente, si un conjugado tiene que ser eficaz en un régimen terapéutico, debe ser capaz de incitar los anticuerpos que puedan reconocer a la cocaína libre circulante in vivo. Cerny (WO 92/03.163) describe una vacuna y un inmunosuero contra las drogas. La vacuna comprende un hapteno unido a una proteína transportadora con el fin de producir anticuerpos. También se describe la producción de anticuerpos contra las drogas, y la utilización de estos anticuerpos en la desintoxicación de una persona que había tomado la droga.

Se ha descrito previamente la administración pasiva de anticuerpos monoclonales para el tratamiento del abuso de drogas (véase, Killian et al. (1978) Pharmacol. Biochem. Behavior 9:347-352; Pentel et al. (1991) Drug Met. Dispositions 19:24-28). En esta aproximación, se administran pasivamente a animales anticuerpos preformados contra drogas seleccionadas. Aunque estos datos demuestran la viabilidad de las aproximaciones inmunológicas en la terapia de adicción, la inmunización pasiva como estrategia terapéutica en los seres humanos a largo plazo presenta numerosos inconvenientes. Primero, si los anticuerpos que van a ser utilizados en la terapia pasiva proceden de fuentes no humanas o son anticuerpos monoclonales, estas preparaciones van a ser reconocidas como proteínas extrañas por el paciente, y puede existir una rápida respuesta inmune contra los anticuerpos extraños. Esta respuesta inmune puede neutralizar el anticuerpo administrado pasivamente, bloqueando su eficacia y reduciendo drásticamente el tiempo de la protección posterior. Además, la readministración del mismo anticuerpo puede resultar problemática, debido a una potencial inducción de una respuesta de hipersensibilidad. Estos problemas pueden solucionarse por la producción de inmunoglobulinas en donantes humanos inmunizados con la vacuna. Esta aproximación se discute con más detalle en los Ejemplos. Segundo, los anticuerpos administrados pasivamente son eliminados rápidamente de la circulación. La vida media de un determinado anticuerpo in vivo se encuentra entre 2,5 y 23 días, dependiendo del isótopo. De esta manera, cuando los anticuerpos se administran pasivamente, en lugar de incitar inmunización, presentan únicamente eficacia a corto plazo.

Otra aproximación inmunológica a la drogadicción ha sido la utilización de un anticuerpo catalítico que es capaz de ayudar en la hidrólisis de la cocaína en el paciente (Landry et al. (1993) Science 259:1899-1901). El anticuerpo catalítico se genera por inmunización de un animal experimental con un análogo de estado de transición de la cocaína unido a una proteína transportadora; se selecciona entonces un anticuerpo monoclonal que presenta la actividad catalítica deseada. Aunque esta aproximación es atractiva en teoría, también presenta serios problemas. Los anticuerpos catalíticos deben ser administrados pasivamente por lo que presentan todos los inconvenientes de la terapia pasiva con anticuerpos. La inmunización activa para generar un anticuerpo catalítico no es viable, porque la actividad enzimática no es común entre anticuerpos producidos frente a análogos de estados de transición, y la actividad no parece ser detectable en preparaciones policlonales. Además, la actividad semejante a la esterasa de estos anticuerpos catalíticos y la naturaleza no controlada de la respuesta inmune activa en individuos genéticamente diversos, hacen de ellos moléculas potencialmente tóxicas, particularmente cuando son producidos en un paciente humano.

Yugawa et al. (EP 0613.899 A2) sugiere la utilización de un conjugado cocaína-proteína que contenga un derivado de la cocaína para la producción de anticuerpos para la detección de la cocaína o derivados de la cocaína en una muestra de sangre. Las patentes Syva (Patentes de EEUU No. 3.888.866, No. 4.123.431 y No. 4.197.237) describen conjugados para producir anticuerpos contra la cocaína para inmunoensayos. Se describen conjugados con BSA utilizando sales de diazonio derivadas de benzoilecgonina y de cocaína. Los conjugados se preparan utilizando derivados ésteres para-imino de la cocaína y de la norcocaína para conjugar un transportador. Biosite (WO 93/12.111) describe conjugados de cocaína utilizando la posición para de un anillo de fenilo de varios derivados de la cocaína que incrementan la estabilidad frente a hidrólisis al introducir un enlace amida. Las patentes Strahilevitz (Patente de EEUU No. 4.620.977; Patente de EEUU No. 4.813.924; Patente de EEUU No. 4.834.973: y Patente de EEUU No. 5.037.645) describen la utilización de conjugados de proteínas con sustancias endógenas y drogas para el tratamiento de enfermedades, para prevenir la dependencia de haptenos psicoáctivos, así como para su uso en inmunoensayos, inmunodiálisis e inmunoadsorción.

Sin embargo, no se ha desarrollado ninguna terapia eficaz para la drogadicción,especialmente, para la adicción a la cocaína. Existe, por lo tanto, una necesidad de desarrollar una aproximación a largo plazo para el tratamiento de la drogadicción, en particular para la adicción a la cocaína, que no dependa totalmente del seguimiento y administración propia del individuo adicto.

Compendio de la invención

El objeto de la invención aparece definido en las reivindicaciones. La presente invención supera los inconvenientes descritos anteriormente y proporciona métodos para el tratamiento del abuso de drogas. Utilizando composiciones terapéuticas, en particular conjugados hapteno-transportadores, la presente invención induce una respuesta inmune contra las drogas en el adicto en la forma de anticuerpos, que en una exposición posterior a la droga en un individuo vacunado neutraliza la droga por lo que los efectos farmacológicos esperados disminuyen, si no se eliminan. La presente invención proporciona una terapia para la drogadicción, particularmente para la adicción a la cocaína, basada en la vacunación de sujetos con un conjugado droga/hapteno-transportador, y más particularmente, un conjugado cocaína-proteína. Las composiciones terapéuticas de la invención constan al menos de un hapteno y al menos de un transportador que contenga un epítopo de célula T que cuando se conjuga para formar el conjugado hapteno-transportador es capaz de estimular la producción de anticuerpos antihapteno. El hapteno puede ser una droga o un derivado de una droga, particularmente cocaína. Cuando la composición terapéutica que contiene el conjugado droga/hapteno transportador se administra a un individuo adicto, se inducen anticuerpos específicos antidroga contra la droga. Un régimen de inmunización terapéutica induce y mantiene una titulación de anticuerpos antidroga lo suficientemente alta como para que en cada exposición posterior a la droga durante el periodo de protección que proporciona la terapia, los anticuerpos antidroga neutralicen una cantidad suficiente de droga con el fin de disminuir, si no eliminar, el efecto farmacológico de la droga. También se proporcionan nuevos métodos para la preparación de estos conjugados. También se proporciona un método de inmunización pasiva, donde un sujeto se trata con anticuerpos generados en un donante por vacunación con el conjugado hapteno-transportador de la invención.

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención aparecerán más aparentes y mejor explicados en relación con los dibujos siguientes, descripción, y reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1a es una representación esquemática de la fórmula estructural de la cocaína.

La Figura 1b es un diagrama que representa sitios de variabilidad cuando se prepara un conjugado de cocaína de la presente invención. Los sitios de variabilidad se asignan arbitrariamente para designar fácilmente el compuesto y los conjugados de la presente invención y no son necesariamente sitios de reacción.

La Figura 2a es una representación de un número de posibles "ramificaciones", marcadas arbitrariamente, de un conjugado hapteno-transportador identificadas para facilitar la comprensión de compuestos apropiados y conjugados utilizados en la práctica de la presente invención.

La Figura 2b es una representación de un número de posibles "ramificaciones", marcadas arbitrariamente, de un conjugado hapteno-transportador identificadas para facilitar la comprensión de compuestos apropiados y conjugados utilizados en la práctica de la presente invención, donde Q' es un transportador modificado que contiene un epítopo de célula T, como por ejemplo un transportador de proteína modificado.

La Figura 3a es una representación de 6 conjugados de cocaína (PS-2, PS-3, PS-4, PS-5, PS-6, y PS-9) de la presente invención, donde Q es un transportador que contiene un epítopo de célula T, como por ejemplo un transportador de proteína o un transportador modificado que contiene un epítopo de célula T, como por ejemplo un transportador de proteína modificado.

La Figura 3b es una representación de "ramificaciones" en los sitios de variabilidad fuera del anillo de tropano de la cocaína de los conjugados de cocaína e intermediarios de la presente invención.

La Figura 4 es una representación de las "ramificaciones " en los sitios de variabilidad fuera del anillo de tropano en la Figura 1b de cuatro compuestos útiles en la preparación de conjugados de la presente invención.

La Figura 5 es una representación de las estructuras de cinco reactivos útiles en la práctica de la presente invención.

La Figura 6 es una representación de las estructuras de cuatro drogas de abuso alternativas apropiadas para conjugación y administración de acuerdo con lo descrito en la presente invención.

La Figura 7 es un diagrama esquemático que representa dos posibles reacciones de conjugación para la preparación de un único conjugado de cocaína (PS-5) de acuerdo con los métodos de la presente invención.

La Figura 8 es una representación de las estructuras de "norcocaína succinilada" y "norcocaína succinilada pre-activada" útiles en la preparación de algunos de los conjugados de la presente invención.

La Figura 9a es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado de cocaína (PS-5,1/,6 + CFA i.p.) de la presente invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante unión in vivo del conjugado HEL apropiado, preparado utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones recibieron 2 inyecciones de 50 g por inyección. Las curvas representan la respuesta de 5 ratones individuales por grupo.

La Figura 9b es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado de cocaína (PS-5,5 Alumbre i.p.) de la presente invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante unión in vivo del conjugado HEL apropiado,4 preparado utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones recibieron 2 inyecciones de 50 g por inyección. Las curvas representan la respuesta de 5 ratones individuales por grupo.

La Figura 9c es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado de cocaína (PS-9,2 + CFA i.p.) de la presente invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante unión in vivo del conjugado HEL apropiado preparado utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones recibieron 2 inyecciones de 50 g por inyección. Las curvas representan la respuesta de 5 ratones individuales por grupo.

La Figura 10a es un gráfico que demuestra que la unión del antisuero al conjugado cocaína-proteína puede equilibrarse utilizando cocaína libre.

La Figura 10b es un gráfico de barras que muestra que el antisuero inmune puede unir ^{3}H-cocaína.

La Figura 11a es un gráfico de barras que muestra que un conjugado cocaína-BSA preparado de acuerdo con el método de la presente invención proporciona una protección de dos veces utlizando una dosis alta de cocaína DL50.

La Figura 11b es otro gráfico de barras que muestra que un conjugado cocaína-BSA preparado de acuerdo con el método de la presente invención proporciona una protección de dos veces utlizando una dosis alta de cocaína DL50.

La Figura 12a es un gel que muestra los pesos moleculares relativos de la tóxina B del cólera (CTB) nativa (monómero y pentámero) y recombinante (monómero).

La Figura 12b es un gel que muestra la estabilidad de los pentámeros CTB en un intervalo de pH de 3-9.

La Figura 12c es un dibujo de un gel de Western Blot que muestra las fracciones de los picos CTBr#32 y CTBr#53 que se obtuvieron por expresión periplasmática que dio lugar a CTB pentámerica.

La Figura 13a es un gráfico que representa un ELISA donde el anticuerpo antiCTB detecta la capacidad de CTBr de unirse al gangliósido G_{M1} en la placa ELISA.

La Figura 13b es un escaneo que representa un ensayo de unión de citometría de flujo en el que CTBr se une a células eucariotas que expresan el gangliósido G_{M1}.

La Figura 14a es un gráfico que representa un ELISA en el que se muestra que la CTB nativa y el conjugado cocaína-CTB CTB-5,8 (PS-5,8 conjugado con CTB) son pentaméricos, en base a su capacidad para unirse al gangliósido G_{M1}.

La Figura 14b es un gráfico que representa un ELISA en el que CTB-5,8 (PS-5,8 conjugado con CTB) se une al gangliósido G_{M1} y el conjugado se detecta con un anticuerpo monoclonal anticocaína (antibenzoilecgonina).

La Figura 15 es una representación esquemática de otra reacción útil en la preparación de conjugados de la presente invención, en particular, del éster 3 benzoato aducto 4.

La Figura 16 es una representación esquemática de la síntesis de un conjugado marcado con carbono 13.

Descripción detallada de la invención

La literatura de patentes y científica a la que se refiere la presente memoria contienen la información que se encuentra disponible para aquellas personas especializadas en el tema.

La presente invención proporciona una terapia para la drogadicción, basada en la vacunación de un individuo adicto con un conjugado droga hapteno-transportador, y más particularmente, con un conjugado cocaína-proteína como se define en las reivindicaciones. Las composiciones terapéuticas de la invención comprenden al menos un hapteno y al menos un transportador que contenga un epítopo de célula T que cuando se conjuga para formar el conjugado hapteno-transportador es capaz de estimular la producción de anticuerpos antihapteno. Cuando se utilice en la presente memoria, el término "epítopo de célula T" se refiere a el elemento básico o a la unidad más pequeña de reconocimiento por parte de un receptor de la célula T, donde el epítopo comprende aminoácidos esenciales para el reconocimiento por el receptor. Las secuencias de aminoácidos que mimetizan las de los epítopos de la célula T y que modifican la respuesta alérgica a alergenos proteícos, se encuentran en el ámbito de esta invención. Un "peptido mimético" se puede definir como una estructura química derivada de peptidos bioactivos que mimetiza las moléculas naturales. El hapteno puede ser una droga como la cocaína o un derivado de droga. Cuando se administra la composición terapéutica que contiene el hapteno/droga (o derivado) a un individuo adicto, se producen anticuerpos antidroga específicos contra la droga. Un régimen de inmunización terapéutica produce y mantiene titulaciones de anticuerpos antidroga lo suficientemente altas, de manera que en exposiciones posteriores a la droga los anticuerpos neutralizantes se unen a una cantidad suficiente de la droga como para disminuir, si no eliminar, los efectos farmacológicos de la droga. Por ejemplo, cuando la composición terapéutica es un conjugado cocaína-transportador, el tratamiento induce una respuesta de anticuerpos anticocaína que es capaz de reducir o neutralizar a la cocaína en el torrente sanguíneo o en el tejido mucoso de un sujeto, bloqueando así las propiedades fisiológicamente adictivas de la droga. Como, de acuerdo con la presente invención, niveles reducidos de la droga de abuso alcanzan el sistema nervioso central, el adicto o no recibe o recibe una gratificación disminuida al utilizar la cocaína. No se esperan efectos secundarios por la administración terapéutica de la presente invención. Por ejemplo, la droga de abuso es pequeña y monovalente y por tanto no es capaz de entrecruzar el anticuerpo. Por lo tanto, no se espera que se produzca la formación de complejos inmunes y las patologías asociadas, después de la exposición a la droga de abuso. Es, y se espera que sea, compatible con terapias farmacológicas actuales y futuras. Es más, la neutralización efectiva es de larga duración. Por ejemplo, se sabe que las respuestas de neutralización de los anticuerpos contra patógenos duran años. De acuerdo con esto, se espera que los anticuerpos antidroga producidos en alta titulación utilizando la composición terapéutica de la presente invención puedan ser mantenidos durante largos periodos de tiempo y posiblemente, al menos durante un año. Este efecto a largo plazo de la composición terapéutica, que reduce los problemas del seguimiento, reduce el recidivismo que es un problema de las terapias actuales.

Además, la aproximación de la vacunación terapéutica de la presente invención para la adicción a la cocaína es compatible con otras terapias actualmente utilizadas o en ensayos clínicos. De hecho, la coterapia en fase temprana es muy deseable debido al tiempo necesario para alcanzar titulaciones óptimas de anticuerpo. Diversos agentes farmacológicos, como desipramina, buprenorfina, naloxona, halperidol, clorproazina, bromocriptina, ibogaína, así como otros que puedan ser relevantes, serían apropiados como coterapias con el fin de prevenir la recaída en la cocaína.

Lo que sigue son términos que se utilizan en la presente memoria, cuyas definiciones se proporcionan como orientación. Cuando se utilice en la presente memoria "hapteno", es un compuesto orgánico de bajo peso molecular que reacciona específicamente con un anticuerpo y que no es capaz de producir una respuesta inmune por sí mismo pero que es inmunogénico cuando forma un complejo con un transportador que contenga un epítopo de célula T formando un conjugado hapteno-transportador. Es más, el hapteno se caracteriza por ser la porción que determina la especificidad del conjugado hapteno-transportador, esto es, es capaz de reaccionar con un anticuerpo específico del hapteno en su estado libre. En un sujeto adicto no inmunizado, no se produce la formación de anticuerpos frente al hapteno. La composición terapéutica se utiliza para vacunar individuos que buscan tratamiento para su adicción a las drogas. En la presente invención, el término hapteno puede incluir el concepto de droga/hapteno más específico, como una droga, un análogo de una parte de la droga, o un derivado de la droga. La composición terapéutica, o vacuna antidroga terapéutica, cuando se administra inicialmente da lugar a un "resultado deseado perceptible". Inicialmente, el resultado deseado perceptible es la producción de una alta titulación de anticuerpos antidroga (aproximadamente 0,1 mg/ml a 1 mg/ml del anticuerpo específico en suero). Sin embargo, la manipulación del régimen de dosis adecuado para cada individuo da lugar y mantiene un efecto terapéutico deseado y mantenido. El "efecto terapéutico deseado" es la neutralización de una fracción suficiente de la droga de abuso libre con anticuerpos específicos contra la droga después de una posterior exposición a la droga, con el fin de reducir o eliminar los efectos farmacológicos de la droga dentro de un tiempo de terapia aceptable. La determinación del tiempo de terapia aceptable en base al tiempo que se tarda en obtener una respuesta de anticuerpo suficiente y al tiempo que se mantiene esta respuesta de anticuerpo y la fracción suficiente de droga libre, puede hacerse por una persona especializada en el tema, mediante el estudio de las características del sujeto que va a ser inmunizado, la droga de abuso que se va a neutralizar, así como la ruta de administración. Utilizando este y otros protocolos de vacunación como modelos, una persona especializada en el tema esperaría que la inmunidad o el periodo de protección durase varios meses, hasta más de un año.

"La inmunización pasiva" se describe como la administración de o la exposición a un anticuerpo anti droga o a un anticuerpo policlonal o a un fragmento de anticuerpo monoclonal (como Fab, Fv, (Fab')_{2} o Fab') preparados utilizando conjugados nuevos de la presente invención. Como se ha descrito arriba, la inmunización pasiva de seres humanos con anticuerpos anticocaína de la presente invención puede resultar, como tratamiento único, menos eficaz que la inmunización activa. La inmunización pasiva sería particularmente útil como cotratamiento inicial y/o como tratamiento complementario suplementario (por ejemplo, durante el periodo de tiempo posterior a la administración inicial de vacuna pero anterior a la producción de anticuerpos propios por el cuerpo) o en situaciones graves para evitar la muerte (por ejemplo, cuando se presente una persona con sobredosis de drogas). En algunas situaciones, la terapia pasiva sola puede ser preferible, como cuando el paciente está comprometido inmunológicamente o necesita de un tratamiento rápido.

La composición terapéutica de la presente invención, y más específicamente, la vacuna antidroga terapéutica, es una composición que contiene al menos un conjugado droga/hapteno-transportador capaz de incitar la producción de una titulación suficientemente alta de anticuerpos específicos contra la droga/hapteno como para que una posterior exposición a la droga de los mencionados anticuerpos contra la droga/hapteno sean capaces de reducir las propiedades adictivas de la droga. La respuesta inmune esperada contra un conjugado hapteno-transportador es la formación de anticuerpos tanto antihapteno como antitransportador. El nivel terapéutico se alcanza cuando se induce y se mantiene una cantidad suficiente de anticuerpos específicos antidroga capaces de organizar un ataque de neutralización de la droga introducida después de la vacunación. Los regímenes terapéuticos de la presente invención proporcionan el tiempo suficiente para la producción de anticuerpos después de la vacunación inicial y de cualquier refuerzo. Es más, la vacuna antidroga óptima contiene al menos un conjugado droga/hapteno transportador que comprende una combinación óptima de la droga como hapteno y de un transportador, de manera que la producción de anticuerpos antidroga es capaz de alcanzar un nivel terapéutico óptimo, esto es, permanecer a una titulación lo suficientemente alta in vivo como para resistir una exposición a la droga seleccionada en los meses posteriores. Más particularmente, la titulación de anticuerpos permanece lo suficientemente alta como para proporcionar una respuesta eficaz después de una exposición posterior a la droga, durante aproximadamente dos meses hasta aproximadamente un año o más dependiendo del individuo, más habitualmente al menos tres meses. Esta composición óptima consiste en un conjugado hapteno-transportador, excipientes y, opcionalmente, adyuvantes.

Cuando se utiliza en el tratamiento de la cocaína, la presente invención define un conjugado hapteno-transportador, donde el hapteno es cocaína o un derivado de la cocaína, que puede ser utilizado para inmunizar animales, particularmente seres humanos, para producir anticuerpos anticocaína capaces de unirse a la droga libre e impedir el tránsito de la droga al sistema de recompensa del cerebro, abrogando el comportamiento adictivo del consumo de drogas. Se piensa que la cocaína afecta la captación neuronal de la dopamina, la norepinefrina y la serotonina. Aunque no se pretenden excluir otros mecanismos de acción, se cree que una vez que la cocaína entra en el torrente sanguíneo después de ser inhalada (esnifada o fumada) o por administración intravenosa, cruza rápidamente la barrea hematoencefálica donde la cocaína intacta se une a sitios de reconocimiento específicos localizados en el transportador de dopamina de las neuronas mesolimbocorticales, inhibiendo por lo tanto la recaptación de dopamina en las neuronas presinápticas. La euforia se debe a un aumento rápido de dopamina en la sinapsis. La acción rápida de la cocaína presenta problemas exclusivos de la terapia de cocaína. Por este motivo, la cocaína permanece como la droga más compleja y sugestiva, y antes de la presente invención, esquiva en cuanto a su terapia. Aunque las estimaciones varían, se piensa que tras la administración intranasal se perciben cambios de humor y de estados emocionales en aproximadamente 2 a 5 minutos, y que los efectos más elevados ocurren en 10 a 20 minutos. De esta manera, el ingrediente activo, el conjugado hapteno-transportador, debe ser capaz de incitar anticuerpos de acción rápida. La base libre de la cocaína, incluyendo la base libre preparada con bicarbonato de sodio (crack), tiene una potencia relativamente alta y un comienzo de acción rápido, aproximadamente 8 a 10 segundos después de fumar. Una realización de la presente invención induce anticuerpos capaces de neutralizar la cocaína de una manera rápida y específica dentro de este periodo de tiempo. Debido a la ruta de circulación, el tiempo de comienzo de la euforia de la cocaína intravenosa es intermedio tardando de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 minuto. De esta manera, cuando se utiliza en el tratamiento del abuso de la cocaína, la composición del conjugado terapéutico hapteno-transportador de la presente invención induce anticuerpos anticocaína que alteran la respuesta fisiológica a la cocaína en los seres humanos. Estos anticuerpos presentan la biodisponibilidad apropiada y la velocidad de unión requerida para neutralizar la cocaína in vivo. Los Ejemplos descritos en la presente memoria describen experimentos realizados en ratones para simular la alteración de la respuesta en mamíferos.

La vacunación inicial con la composición del conjugado terapéutico hapteno-transportador de la presente invención crea un alta titulación de los anticuerpos específicos contra el hapteno in vivo. Resulta útil la realización de ensayos periódicos del plasma de los sujetos vacunados para determinar las dosis individuales eficaces. Los niveles de titulación se elevan y se mantienen durante las dosis de refuerzo periódicas. Se anticipa que esta terapia se utilizará en combinación con programas de rehabilitación utilizados actualmente, incluido el asesoramiento. Es más, las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden estar dirigidas a una sola droga, a varias drogas simultáneamente o en sucesión y puede ser utilizada en combinación con otras terapias. Por ejemplo, las composiciones del conjugado terapéutico hapteno-transportador y los métodos de la presente invención son utilizados sin interacciones adversas en combinación con aproximaciones farmacológicas convencionales y con la anteriormente descrita inmunización pasiva "a corto plazo" e inmunización activa frente a estados de transición para aumentar el efecto global de la terapia.

La composición del conjugado terapéutico hapteno-transportador de la presente invención se prepara por acoplamiento de una o más moléculas de hapteno a un transportador que contiene un epítopo de célula T para obtener un conjugado hapteno-transportador capaz de estimular a las células T (inmunogénico) lo que da lugar a la proliferación de células T y a una liberación característica de mediadores que activan a las células B relevantes y que estimulan la producción de anticuerpos específicos. Los anticuerpos de interés son aquellos específicos para la porción de hapteno del conjugado hapteno-transportador (también llamado complejo hapteno- transportador). Se describen las composiciones terapéuticas que contienen una combinación de conjugados bien de la misma droga (inmunización cruzada) o de múltiples drogas (coinmunización). Estas comezclas de conjugados de múltiples drogas resultan particularmente útiles en el tratamiento del abuso de varias drogas.

En la selección de una droga adecuada para conjugación de acuerdo con la presente invención, una persona especializada en el tema seleccionará una droga que sea capaz de producir una alta titulación de anticuerpos. Sin embargo, si la molécula elegida es similar a las moléculas endógenas del individuo, los anticuerpos producidos frente a esta molécula reaccionarán de manera cruzada con varias moléculas diferentes en el cuerpo dando lugar a un efecto no deseado. De esta manera, la droga seleccionada como hapteno (droga/hapteno) debe ser lo suficientemente extraña y de un tamaño suficiente como para evitar la producción de anticuerpos frente a moléculas encontradas habitualmente en el cuerpo humano. Por estos motivos, el alcohol, por ejemplo, no sería adecuado para la terapia de la presente invención. Los anticuerpos creados frente a la composición terapéutica son muy específicos y son inducidos en una cantidad suficiente como para neutralizar la droga tanto en el torrente sanguíneo como en la mucosa o en ambos. Sin limitar la invención, las drogas apropiadas para la composición terapéutica (no presentadas en orden de

\hbox{importancia) son:}

Alucinógenos, por ejemplo mescalina y LSD;

Cannabinoides, por ejemplo THC;

Estimulantes, por ejemplo anfetaminas, cocaína, fenmetrazina, metilfenidato;

Nicotina;

Depresivos, por ejemplo, no barbitúricos (por ejemplo, bromuros, hidrato de cloral etc.), metacualona, barbitúricos, diazepam, flurazepam, fenciclidina, y fluoxetina;

Opio y sus derivados, por ejemplo, heroína, metadona, morfina, meperidina, codeína, pentazocina, y propoxifeno; y

"Drogas de diseño" como el "éxtasis".

La Figura 6 muestra la estructura de 6 drogas apropiadas para la conjugación de acuerdo con la presente invención.

El transportador de la presente invención, es una molécula que contiene al menos un epítopo de célula T que es capaz de estimular las células T del sujeto, que a su vez ayudan a las células B a iniciar y mantener la producción de anticuerpos contra fracciones del conjugado entero, incluyendo la porción hapteno. De esta manera, como el transportador se selecciona porque es inmunogénico, es de esperar una potente respuesta inmune a la vacuna en una población diversa de pacientes. El transportador, como el hapteno, debe ser lo suficientemente extraño como para producir una respuesta inmune potente a la vacuna y para evitar el fenómeno de supresión de la inducción del epítopo por el transportador. Una aproximación conservadora, pero no imprescindible, es la utilización de un transportador al que la mayoría de los pacientes no hayan sido expuestos. Sin embargo, aunque se produzca la supresión de la inducción del epítopo por el transportador, la situación es manejable al haber sido superada por cambios en la dosis (DiJohn et al. (1989) Lancet 1415-1418) y por otros cambios en el protocolo (Etlinger et al. (1990) Science 249:423-425), incluyendo la utilización de CTB (Stok et al. (1994) Vaccine 12:521-526). Aún más, los transportadores que contienen un alto número de lisinas son particularmente apropiados para la conjugación de acuerdo con los métodos de la presente invención. Son numerosas las moléculas transportadoras apropiadas e incluyen, pero no están limitadas a:

Toxinas bacterianas o productos, por ejemplo, toxina B del cólera-(CTB), toxina de la difteria, toxoide del tétanos, y toxina pertussis y hemaglutinina filamentosa, toxina shiga, exotoxina de pseudomonas;

Lectinas, por ejemplo, subunidad B de la ricina, abrina y lectina de guisante dulce;

Fracciones subvirales, por ejemplo, nucleoproteína de retrovirus (retro NP), ribonucleoproteína de la rabia (rabia RNP), virus de plantas (por ejemplo, TMV, virus de mosaico de fréjol de vaca y coliflor), proteína de la nucleocápside del virus de la estomatítis vesicular (VSV-N), vectores del virus de la sífilis y vectores del virus del bosque Semliki; Vehículos sintéticos, por ejemplo, péptidos multi-antigénicos (MAP), microesferas;

Partículas semejantes a virus de levaduras (VLPs);

Antígeno de la proteína de la malaria;

y otros como proteínas y péptidos y cualquier modificación, derivados o análogos de las moléculas listadas arriba.

Para determinar las características de los transportadores apropiados, se llevaron a cabo experimentos iniciales utilizando albúmina de suero bovino como proteína transportadora. La proteína resultó perfecta en experimentos con animales, al ser barata y contener un alto número de lisinas para la conjugación. Sin embargo, resulta menos apropiada para la vacunación en los seres humanos porque la producción de anticuerpos antiBSA tiene el potencial de producir respuestas adversas. Así, utilizando los resultados de estos experimentos, los criterios descritos más arriba se aplicaron a un gran número de transportadores potenciales. El resultado es la lista de transportadores apropiados para la práctica de la presente invención descrita arriba.

El transportador de una realización preferida es una proteína o un péptido ramificado (por ejemplo, péptidos multi-antigénicos (MAP)) o un péptido de una cadena única. Un transportador perfecto es una proteína o péptido que no se utiliza habitualmente en los procesos de vacunación del país en el que se vaya a utilizar la terapia, evitando de esta manera el potencial de "supresión de la inducción del epítopo por el transportador". Por ejemplo, en los EEUU, donde la inmunización estándar de los niños incluye difteria y tétanos, las proteínas como el toxoide del tétanos y el toxoide la difteria, si no se modifican, resultan poco deseables como transportadores apropiados. Además, la proteína transportadora no debe ser una proteína a la que uno es tolerante. En los seres humanos, esto excluiría a la albúmina de suero humano sin modificar. Además, muchas proteínas alimenticias deben ser examinadas cuidadosamente antes de ser utilizadas como transportadores. También en los seres humanos, la albúmina de suero bovino sería poco deseable como transportador debido a la presencia de bovino en la dieta de la mayoría de las personas. Aún más, resulta altamente ventajoso que el transportador tenga una inmunogenicidad/adyuvanticidad inherente. Se debe conseguir un equilibrio entre el deseo de inmunogenicidad del transportador y el deseo de maximizar el anticuerpo antihapteno. Aún más, el transportador preferido debería ser capaz de producir tanto una respuesta sistémica como una respuesta en el lugar de la exposición. Esto resulta particularmente aplicable a la cocaína que es administrada frecuentemente a través de las membranas mucosas. La velocidad de la respuesta es especialmente crítica cuando la cocaína se fuma. De acuerdo con esto, en el caso de la cocaína, un transportador preferido produciría no solo una respuesta sistémica sino también una respuesta de anticuerpo preexistente en la mucosa. En dicha respuesta mucosal la reacción de los anticuerpos con la cocaína ocurriría lo suficientemente rápida como para contrarrestar a la droga antes de que ésta empiece a circular en el torrente sanguíneo.

Un transportador perfecto, la toxina B del cólera (CTB), es una subunidad proteica altamente inmunogénica capaz de estimular respuestas de anticuerpos sistémicas y mucosales (Lycke (1992) J.Immunol. 150:4810-4821; Holmgren et al. (1994) Am. J. Trop. Med. Hyg. 50:42-54; Silbart et al. (1988) J. Immun. Meth. 109:103-112; Katz et al. (1993) Infection Immun. 61:1964-1971). Esta respuesta combinada antihapteno IgA e IgG es altamente deseable para bloquear a la cocaína que es administrada nasalmente o por inhalación. Además, mediante ensayos clínicos con vacunas del cólera, se ha demostrado que CTB es segura para ser utilizada en los seres humanos (Holmgren et al., supra; Jertborn et al. (1994) Vaccine 12:1078-1082: "The Jordan Report, Accelerated Development of Vaccines" 1993., NIAID, 1993). Más aún, la mayoría de los adictos a la cocaína en los EEUU, no se han expuesto al cólera y por lo tanto no son inmunes a CTB.

Otros transportadores útiles incluyen aquellos con capacidad para aumentar una respuesta mucosal, más particularmente, la familia LTB de toxinas bacterianas, nucleoproteína de retrovirus (retro NP), ribonucleoproteína de la rabia (rabia RNP), proteína de la nucleocápside del virus de la estomatitis vesicular (VSV-N), subunidades recombinantes del virus de la sífilis, y péptidos multi-antigénicos (MAP).

En otra realización, se utilizan como transportadores varios fragmentos de péptidos derivados de proteínas o análogos, de alergenos. Estos transportadores son elegidos porque inducen una respuesta de célula T capaz de proporcionar ayuda a la iniciación de la producción de anticuerpos antihapteno por las células B. Ejemplos y métodos para producir proteínas y péptidos alergénicos así como sus secuencias aparecen descritos en WO 95/27.786 publicado el 19 de Octubre de 1995.

Utilizando los métodos y las composiciones de la presente invención, y más particularmente, las técnicas listadas en los Ejemplos que aparecen más abajo, una persona especializada en el tema puede unir la droga/hapteno seleccionado con el transportador seleccionado para producir el conjugado hapteno-transportador de la presente invención. Un alergeno particularmente apropiado como transportador es Cryptomeria japonica, más particularmente, Cry j 1 recombinante, cuya secuencia ha sido publicada con una pequeña variación. Por lo tanto, el alergeno Cry j 1 cumple de manera general uno de los criterios de un transportador apropiado, esto es, un transportador al cual el sujeto no ha sido previamente expuesto.

En una realización de la presente invención, los anticuerpos inducidos por la composición terapéutica actúan en el tiempo que tarda la droga en viajar desde los pulmones a través del corazón hasta el cerebro. La capacidad de producir esta respuesta de anticuerpos requiere de la selección cuidadosa de la molécula transportadora.

Producción de la subunidad B recombinante de la toxina del cólera

La toxina del cólera es una enterotoxina producida por Vibrio cholerae y consta de cinco subunidades B idénticas teniendo cada subunidad un peso molecular de 11,6 KDa (103 aminoácidos) y una subunidad A de 27,2 KDa (230 aminoácidos) (Finkelstein (1988) Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path. 85-102). La subunidad de unión, CTB, se une al gangliósido GM_{1} en la superficie celular (Sixma et al. (1991) Nature 351:371-375; Orlandi et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:17038-17044). CTA es la subunidad enzimática que entra en la célula y cataliza la ADP-ribosilación de una proteína G, activando de manera constitutiva la adenilato ciclasa (Finkelstein (1988) Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path. pp. 85-102). En ausencia de la subunidad A, la toxina del cólera no es tóxica.

Otros autores han descrito la producción de altos niveles de la expresión recombinante de pentámeros CTB (L'hoir et al. (1990) Gene 89:47-52; Slos et al. (1994) Protein Exp. Purif. 5:518-526). Aunque la CTB nativa se encuentra disponible comercialmente, aparece contaminada frecuentemente con CTA (aproximadamente un 0,1%). Por este motivo, la CTB recombinante ha sido expresada en E. Coli y se han desarrollado ensayos para su caracterización. La construcción coleragenoide se adquirió de la American Type Culture Collection (conforme a la Patente de EEUU 4.666.837). La CTB recombinante se clonó del vector original (pRIT10810) en un plásmido de expresión (pET11d, Novagen) con una secuencia N- terminal extra que contenía un marcador His6 y fue expresada en E. Coli en una cantidad de hasta 25 mg/litro de cultivo. La proteína se purificó a través de una columna de Ni^{2+} utilizando técnicas estándar y se analizó mediante SDS-PAGE (véanse las Figuras 12a, b y c). La CTB recombinante es monomérica en este ensayo y es mayor que el monómero CTB nativo debido a la extensión N-terminal.

La CTB pentamérica recombinante fue producida tanto en ausencia como en presencia del marcador His utilizando el ADNc modificado por PCR para incluir la secuencia líder Pel b. Se insertó un codon de parada en el C-terminal para eliminar el marcador His. Ambas construcciones se expresaron en E. coli del vector pET22b (Novagen). La proteína marcada en His se purificó mediante cromatografía de afinidad Ni^{2+}, como se ha descrito más arriba (13 mg/L). La CTB recombinante sin marcar se purificó por cromatografía de afinidad con el gangliósido G_{M1} como se ha descrito (Tayot et al. (1981) Eur. J. Biochem. 113:249-258). Se demostró que el pentámero recombinante de la CTB se unía al gangliósido G_{M1} en un ELISA y que reaccionaba con anticuerpos específicos de pentámero en Western blots y en ELISA. La CTB recombinante puede ser obtenida también de otras fuentes.

La estructura pentamérica de la CTB puede ser preferida para la unión al gangliósido G_{M1}. El pentámero es estable frente al SDS si las muestras no son hervidas, permitiendo que la pentamerización sea evaluada por SDS-PAGE. El gel de la Figura 12b demuestra que la CTB nativa es un pentámero y que es fácilmente distinguible de la CTB monómerica desnaturalizada. La estructura pentamérica se mantiene en un intervalo de pH de 4 a 9 (véase la Figura 12b), lo que facilita una gran variación de químicas conjugacionales. La CTB recombinante expresada inicialmente es monomérica. Una manera de obtener CTB pentamérica es haciendo ajustes para expresar la CTB pentamérica apropiadamente plegada. Se ha visto que la expresión citoplasmática proporciona unos niveles de CTB monomérica mucho mayores. Una persona especializada en el tema conoce métodos para el plegamiento de la CTB monomérica en CTB pentamérica (véase, por ejemplo L'hoir et al. (1990) Gene 89:47-52). Una alternativa al replegamiento de la CTB monomérica para obtener la CTB pentamérica es la expresión periplasmática que resulta en una CTB pentamérica recombinante capaz de unir gangliósido G_{M1} por ELISA, las Figuras 13a y 13b muestran los datos que apoyan esta afirmación. Una persona especializada en el tema descubrirá que se han descrito numerosas aproximaciones para la obtención de CTB pentamérica recombinante, incluyendo la expresión periplásmatica con un líder (Slos et al., supra; Sandez et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:481-485; Lebens et al. (1993) BioTechnol. 11:1574-1578) o con replegamiento post-translacional (L'hoir et al., supra; Jobling et al. (1991) Mol. Microbiol. 5:1755-1767).

Otro transportador útil es la toxina del cólera que proporciona una respuesta mucosal mayor que la de CTB. Se ha descrito que la subunidad A activa desde un punto de vista enzimático utilizada como adyuvante aumenta la actividad (Liang et al. (1988) J. Immunol. 141:1495-1501; Wilson et al. (1993) Vaccine 11:113-118; Snider et al. (1994) J. Immunol. 153:647).

Un aspecto de conseguir el conjugado de la presente invención implica modificar el hapteno lo suficiente como para convertirlo en capaz de ser conjugado o unido a un transportador manteniendo su estructura lo suficiente como para que sea reconocido como el hapteno en estado libre (por ejemplo, como cocaína libre). Resulta esencial que los individuos vacunados tengan anticuerpos que reconozcan al hapteno libre (cocaína). Experimentos de radioinmunoensayo y ensayos de ELISA de competición (Figuras 10a y 10b), explicados con más detalle en los Ejemplos, pueden medir las titulaciones del anticuerpo contra el hapteno libre. Los anticuerpos de interés son anticuerpos específicos contra el hapteno que, en algunas realizaciones, son anticuerpos específicos contra la cocaína. Debe ser entendido que los principios y métodos utilizados para describir las realizaciones preferidas pueden aplicarse, partiendo de esta descripción, a un amplio rango de conjugados hapteno-transportador útiles en el tratamiento de numerosas adicciones a drogas y de respuestas tóxicas.

Conjugados

Los conjugados nuevos cocaína-transportador de la presente invención se derivan de la cocaína y de los metabolitos de la cocaína, sobre todo derivados de la norcocaína, benzoilecgonina y éster metílico de ecgonina. La Figura 4 muestra una representación de la molécula de cocaína comparándola con estas otras moléculas. En el caso de la norcocaína y del éster metílico de ecgonina, los grupos funcionales amina secundaria y alcohol secundario presentes en los dos compuestos respectivamente, son modificados con el fin de proporcionar un anclaje químico que permita la unión a una proteína transportadora. En el caso de la benzoilecgonina, el ácido libre se utiliza directamente para la unión a la proteína transportadora o se modifica con un anclaje para permitir esta unión. La longitud y naturaleza del anclaje debe ser tal que el hapteno sea desplazado a una distancia suficiente del dominio del transportador como para permitir un reconocimiento óptimo por los anticuerpos producidos contra él. La longitud del anclaje se optimiza variando el número de grupos -CH_{2}- que se encuentran estratégicamente situados en la "ramificación" seleccionada del grupo que consiste en:

1

2

y que se muestran en las Figuras 2a y 2b de la presente memoria. Respecto a las ramificaciones anteriores, n es un número entero seleccionado entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20, más particularmente de aproximadamente 3 a aproximadamente 6; Y se selecciona preferentemente de un grupo que consiste en S, O, y NH; y Q se selecciona preferentemente de un grupo que consiste en:

(1) -H

(2) -OH

(3) -CH_{2}

(4) -CH_{3}

(4a) -OCH_{3}

(5) -COOH

(6) halógeno

(7) proteína o péptido transportador

(8) proteína o péptido transportador modificados

(9) ésteres activados, como éster 2-nitro-4-sulfofenilo y éster N-oxisuccinimidilo

(10) grupos reactivos frente a transportadores o transportadores modificados, como anhídridos mixtos, halogenuros de acilo, acilazidas, halogenuros de alquilo, N-maleimidas, iminoésteres, isocianato, isotiocianato; u

(11) otra ramificación identificada por su número de referencia ''CJ''.

El transportador que contiene el epítopo de célula T (por ejemplo, una proteína o péptido transportador de la presente invención) puede ser modificado para facilitar su conjugación con el hapteno (por ejemplo, por tiolación) mediante métodos conocidos por una persona especializada en el tema. Por ejemplo, con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) o por succinilación, etc. Para simplificar, (CH_{2})_{n}Q, donde Q=H, puede ser referido como (CH_{3}), metilo o Me, sin embargo, se entiende que se corresponde con el grupo según se identifica en las "ramificaciones" que se muestran en las Figuras 2a y b.

En las abreviaturas de compuestos utilizados en la presente memoria que se obtienen comercialmente se incluyen:

BSA= Albúmina de suero bovino

DCC= Diciclohexilcarbodiimida

DMF= N,N-Dimetilformamida

EDC (o EDAC)= Clorhidrato de N-Etil-N'-(3-(dimetilamino)propil)carbodiimida

EDTA= Ácido etilendiamínico tetraacético, sal disódica

HATU= Hexafluorfosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

NMM= N-Metilmorfolina

HBTU= Hexafluorfosfato de 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

TNTU= Tetrafluorborato de 2-(5-Norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio

PyBroP®= Hexafluorfosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio

HOBt= N-Hidroxibenzotriazol

La moneclatura IUPAC para muchos de los compuestos que se mencionan es:

Norcocaína

Éster metílico del ácido 3-(Benzoiloxi)-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico

Benzoil ecgonina

Ácido 3-(Benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico

Cocaína

Éster metílico del ácido 3-(Benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico

Éster metílico de la ecgonina

Éster metílico del ácido 3-(Hidroxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico

Reacciones

En una realización, los precursores de los conjugados de la presente invención, son sintetizados por acilación del éster metílico de la ecgonina con bromuro de bromoacetilo en DMF en presencia de dos equivalentes de diisopropiletilamina. El producto se acopla entonces al grupo tiol de una proteína transportadora tiolada para obtener el conjugado con la estructura general de PS-2 (véanse la Figura 3a y el Ejemplo 1).

En otra realización, los precursores de los conjugados de la presente invención se sintetizan por succinilación del éster metílico de la ecgonina con anhídrido succínico en DMF en presencia de un equivalente de trietilamina. El producto se acopla entonces al grupo amino de un residuo de lisina de una proteína transportadora para obtener un conjugado con la estructura general de PS-4 (véanse la Figura 3a y el Ejemplo 2).

En otra realización, los precursores de los conjugados de la presente invención se sintetizan al hacer reaccionar norcocaína con anhídrido succínico en DMF en presencia de dos equivalentes de trietilamina. El producto se acopla entonces al grupo amino de un residuo de lisina de una proteína transportadora utilizando EDC para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y el Método A del Ejemplo 3).

Los conjugados con la estructura general de PS-5 pueden ser obtenidos a través de un conjunto alternativo de reacciones. En esta alternativa, la conjugación proteica se puede llevar a cabo utilizando un derivado succinilado pre-activado de la norcocaína. Es decir, el intermediario puede ser aislado y caracterizado. El derivado succinilado pre-activado de la norcocaína se sintetiza al hacer reaccionar la sal sódica del ácido 4-hidroxi-3-nitrobenceno sulfónico con norcocaína succinilada en presencia de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y DMF. El producto se acopla al grupo amino de un residuo de lisina de una proteína transportadora para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y el Ejemplo 7, Método B).

En otra realización, los compuestos de la presente invención se sintetizan al hacer reaccionar norcocaína succinilada con N-hidroxisuccimida en presencia de cloroformato de etilo, N-metilmorfolina (NMM) y DMF. El producto se acopla entonces al grupo amino de un residuo de lisina de una proteína transportadora para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y el Ejemplo 7, Método C).

En otra realización, los compuestos de la presente invención se sintetizan al hacer reaccionar cloruro de tionilo con norcocaína succinilada. El producto se conjuga entonces con una proteína transportadora para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y el Ejemplo 7, Método A).

En otra realización, los compuestos de la presente invención se sintetizan al hacer reaccionar norcocaína succinilada con HATU en DMF y diisopropiletilamina (Carpino (1993) J. Am. Soc. 115:4397-4398). El producto se añade a una disolución acuosa que contiene la proteína transportadora para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y el Método A del Ejemplo 7).

En otra realización, los compuestos de la presente invención se sintetizan al hacer reaccionar norcocaína succinilada con HBTU en DMF y diisopropiletilamina. El producto se añade a una disolución acuosa que contiene la proteína transportadora para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y el Método B del Ejemplo 7).

En otra realización, los compuestos de la presente invención se sintetizan al hacer reaccionar norcocaína succinilada con TNTU en DMF y diisopropiletilamina. El producto se añade a una disolución acuosa que contiene la proteína transportadora para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y los Métodos C y D del Ejemplo 7).

En otra realización, los compuestos de la presente invención se sintetizan al hacer reaccionar norcocaína succinilada con PyBroP en DMF y diisopropiletilamina. El producto se añade a una disolución acuosa que contiene la proteína transportadora para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y los Métodos E y F del Ejemplo 7).

Alternativamente, los compuestos de la presente invención se sintetizan por succinilación de la proteína transportadora con anhídrido succínico en tampón borato. El producto se acopla entonces a la norcocaína en presencia de EDC para obtener un conjugado con la estructura general de PS-5 (véanse la Figura 3a y el Método B del Ejemplo 3).

En otra realización, los compuestos de la presente invención se sintetizan por reducción del ácido libre de la benzoil ecgonina a su correspondiente alcohol primario, utilizando el complejo borano-sulfuro de dimetilo. El alcohol se hace reaccionar con anhídrido succínico en DMF, y el producto se conjuga entonces con el grupo amino libre de una proteína transportadora en presencia de EDC para obtener un conjugado con la estructura general de PS-6 (véanse la Figura 3a y el Ejemplo 4).

En otra realización, los compuestos de la presente invención se sintetizan por conjugación de la benzoil ecgonina con el grupo amino de un residuo de lisina de una proteína transportadora en presencia de EDC para obtener un conjugado con la estructura general de PS-9 (véanse la Figura 3a y el Ejemplo 5).

Los análogos PS-5 de CTB se sintetizan utilizando los protocolos descritos en el Ejemplo 5. Los numerosos métodos descritos en el Ejemplo 5 para la síntesis de análogos PS-5 de CTB dan lugar a análogos PS-5 con diferentes grados de haptenación. El grado de haptenación puede ser determinado por absorción UV o análisis espectral de masas de tiempo de vuelo (TOF). La Tabla 2 muestra que la haptenación se logró utilizando numerosos conjugados (algunos con CTB como transportador) producidos siguiendo los métodos descritos en la presente invención. Los diferentes lotes se indican por la adición de un decimal a un número, por ejemplo, el lote 6 de PS-5 es PS-5,6. Los conjugados hapteno-transportador de la invención pueden ser haptenados a diferentes grados utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 5, así como utilizando métodos de conjugación conocidos por las personas especializadas en el tema, por ejemplo, diferentes posibilidades de agentes activadores, diferentes tampones, diferentes tiempos de reacción, etc. La cantidad de haptenación del conjugado está sin embargo limitada por el número de grupos nucleófilos que contenga

\hbox{el transportador.}

TABLA 2

3

4

ND- no disponible

Esta lista de conjugados no es limitante. Se han producido otros conjugados con más de un hapteno acoplado al transportador que contiene el epítopo de célula T. Preferentemente, se acoplan de 1 a 100 haptenos al transportador que contiene el epítopo de célula T. Más preferentemente, se acoplan de 1 a 70 haptenos al transportador que contiene el epítopo de célula T.

Los métodos para sintetizar los compuestos PS-2, PS-3, PS-4, PS-5 y PS-6 aparecen descritos en los Ejemplos. Siguiendo los métodos descritos, por ejemplo utilizando agentes activadores en condiciones acuosas, una persona especializada en el tema puede sintetizar los compuestos PS-10 a PS-26 (véase la Figura 3b(1) y (2)).

La hidrólisis del éster metílico de los conjugados PS-2, PS-4 y PS-5 da lugar a la producción de anticuerpos específicos contra la benzoil ecgonina, convirtiendo de esta manera el conjugado en esencialmente inactivo como vacuna terapéutica. Para una conjugación óptima y para prevenir una hidrólisis extensiva del éster metílico de la norcocaína succinilada y de los conjugados PS-5, durante la conjugación el pH del tampón se mantiene entre pH 7,6 y 7,8, con unos tiempos de reacción limitados a 1,5 horas. Además, la purificación después de la conjugación del conjugado PS-5 se lleva a cabo idealmente a pH 6,5 utilizando tampón succinato de sodio 20mM.

Con el fin de evaluar la estabilidad del éster metílico, se pueden utilizar técnicas tanto inmunológicas como físicoquímicas. Se ha generado un anticuerpo monoclonal específico de la cocaína que puede discriminar entre cocaína y sus metabolitos cuando se une a una proteína transportadora. La reactividad frente a los metabolitos inactivos fue 2.000 veces menor que frente a la cocaína. Se pueden generar anticuerpos monoclonales específicos contra la benzoilecgonina utilizando una tecnología similar. Cualquiera de los dos anticuerpos monoclonales o preferiblemente los dos pueden utilizarse para determinar los niveles de conjugados intactos e hidrolizados comparados con mezclas estándar. Esta diferenciación depende de la reactividad relativa de cada anticuerpo monoclonal frente al conjugado hidrolizado e intacto. En otra realización, se puede sintetizar un análogo éster metílico de la norcocaína succinilada enriquecido en carbono-13 (Figura 16). Cuando se conjuga con una proteína transportadora para formar PS-5, se puede utilizar la espectroscopía de resonancia magnética nuclear de carbono-13 (^{13}C NMR) para evaluar la presencia del éster metílico y como el grupo metilo está enriquecido con el isótopo, la señal que corresponde al éster metílico se distinguirá por encima de las señales de proteína.

En otra realización, se puede sintetizar un conjugado que contiene un éster metílico marcado radiactivamente. Esto podría incluir un análogo éster metílico de la norcocaína succinilada que contenga carbono-14 o tritio. Cuando se conjuga con una proteína transportadora para formar PS-5, la pérdida de radiactividad con el tiempo de cualquiera de los dos análogos se puede evaluar utilizando técnicas conocidas para una persona especializada en el tema. La evaluación de la pérdida de radiactividad indicará los niveles residuales del éster metílico intacto.

El grupo éster benzoato de los conjugados PS-5 es estable esencialmente en las condiciones de conjugación y purificación, y por lo tanto no requiere de una evaluación de la retención de su integridad estructural. Si, sin embargo, se desea una biodisponibilidad incrementada se puede incorporar en el conjugado un enlace amida u otro grupo estable metabólicamente, conocidos para una persona especializada en el tema. De manera similar, el éster metílico de los conjugados PS-5 se puede estabilizar utilizando la ramificación CJ6 donde Q=H, es decir, un enlace amida. Esta incorporación incrementaría la estabilidad de los conjugados tanto in vitro como in vivo.

En otra realización, los compuestos PS-27 a PS-50 se sintetizan a través de una serie de reacciones que permiten una entrada nueva en la clase tropano de alcaloides. Esta nueva ruta, implica una ciclización intermolecular mediada por radicales libres tipo 1,6 dieno (March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, (1992) 4^{a} ed., Wiley-Interscience, p. 744, y las referencias citadas en ese trabajo). Los alcaloides tropano, en particular la cocaína y sus análogos, han sido previamente sintetizados; sin embargo, estas rutas están compuestas de múltiples etapas y normalmente con la producción de un intermediario (Wilstatter et al. (1923) Ann. Chem. 434:111-139; Tufariello et al. (1979) J. Am. Chem. 101:2435-2442; Lewin et al. (1987) J. Heterocyclic Chem. 24:19-21; y Simoni et al. (1993) J. Med. Chem. 36:3975-3977). Aunque limitados a la síntesis de derivados 3-ariltropano Davies et al. (Patente de EEUU 5.262.428), sintetizaron análogos de la cocaína por descomposición de vinildiazotanos en presencia de pirroles para formar un anillo tropano que es seguido de una adición Grignard para producir los análogos de la cocaína. En esta realización alternativa, se sintetizan nuevos conjugados cocaína-transportador con ramificaciones en "sitios remotos". Cuando se utilice en la presente memoria los "sitios remotos" se marcarán con C, D y E en la Figura 1. Estos sitios presentan un especial reto para el químico debido a la naturaleza del anillo de tropano y son posiciones especialmente difíciles para "ramificaciones" necesarias para los conjugados de la presente invención. Una realización, añade las "ramificaciones" y por último construye el anillo de tropano. Como aparece representado en la Figura 15, existe una adición nueva en una sola etapa del radical 2 y la ciclización, a baja temperatura, del compuesto general 1. El resultado estereoquímico se define por la forma semejante a nave del intermediario 3 en el que la adición del radical 2 se produce de manera ecuatorial a la posición 3 seguida del cierre del anillo mediante el mecanismo pronosticado lo que da lugar al aducto 4 del éster 3-benzoato (análogo de la cocaína). La orientación de C, D, E y CO_{2}R vendrán predefinidas en 1.

Se ha desarrollado un amplio rango de compuestos para facilitar el entrecruzamiento de proteínas/péptidos o la conjugación de proteínas con moléculas derivatizadas, por ejemplo, haptenos. Estos incluyen, pero no están limitados a, ésteres activos derivados de ácidos carboxílicos (compuestos activados), anhídridos mixtos, halogenuros de acilo, acilazidas, halogenuros de alquilo, N-maleimidas, iminoésteres, isocianatos e isotiocianatos,que resultan conocidos para las personas especializadas en el tema. Estos compuestos son capaces de formar un enlace covalente con un grupo reactivo de una molécula de proteína. Dependiendo del grupo activador, el grupo reactivo será el grupo amino de un residuo de lisina en una molécula de proteína o el grupo tiol en una proteína transportadora o una proteína transportadora modificada que, cuando reacciona, resulta en la formación de una enlace amida, amina, tioéter, amidina, urea o tiourea. Una persona especializada en el tema, puede identificar otros grupos activadores apropiados, por ejemplo, en textos de referencia como Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (Wong (1991) CRC Press, Inc., Boca Raton, FL). Idealmente, la conjugación se realiza a través de un grupo amino de una lisina en la cadena lateral. La mayoría de los reactivos reaccionan preferentemente con lisina. Un transportador especialmente apropiado es CTB por tener 9 residuos de lisina por monómero en su forma nativa. Para determinar si la CTB conjugada retiene su estructura y actividad, se puede evaluar su unión al gangliósido G_{M1}.

Distintos investigadores han expresado y purificado cantidades de CTB recombinante que, una vez optimizado, son producidas en grandes lotes de fermentación. Los procesos para expresar y purificar proteínas recombinantes son conocidos en éste ámbito, por ejemplo, USSN 07/807.529. CTB puede ser purificada, por ejemplo, por cromatografía de afinidad (Tayor et al. (1981) Eur. J. Biochem. 113:249-258), puede ser conjugada con derivados de la cocaína, y el conjugado puede ser entonces purificado adicionalmente. Se analiza la pureza de CTB purificada y del conjugado resultante y el mantenimiento de la estructura pentamérica de CTB. Las técnicas incluyen SDS-PAGE, cromatografía de filtración en gel, Western blotting, ELISA directo y de captura de G_{M1}, y ELISA de competición con CTB biotinilada. El grado de haptenación se determina por espectrometría de masas y por análisis del incremento de la absorción UV que resulta de la presencia del hapteno. Tanto la solubilidad como la estabilidad del conjugado se optimizan en preparación para la formulación a gran escala. Los detalles de algunos de estos análisis aparecen en los Ejemplos.

Numerosos conjugados producidos de acuerdo con la presente invención incluyen conjugados con análogos de la cocaína y con BSA, HEL o CTB como proteína transportadora. En la Figura 3a se muestran seis análogos representativos de la cocaína. De estos seis, PS-2, PS-4, PS-5, PS-6 y PS-9 se conjugaron con BSA o HEL, mientras que PS-5 se conjugó también con CTB (véase la Tabla 2 más arriba).

Con el fin de variar el grado de haptenación, se pueden adoptar aproximaciones alternativas. En una realización, el transportador es haptenado con una construcción de cocaína multivalente. Esta idea está basada en el concepto de péptidos multi-antigénicos (MAP) (Lu et al. Mol. Immunol. 28:623-630 (1991)). En este sistema, los residuos de lisina muy ramificados son utilizados para maximizar la densidad y valencia del hapteno. La premisa de esta aproximación es que la respuesta inmune se incrementa si existen múltiples copias del hapteno unido a la misma molécula de péptido o proteína. Por lo tanto, se prepara un hapteno multivalente que necesita unirse únicamente a uno o dos sitios del transportador CTB pentamérico como se describe en la presente memoria. El núcleo de este hapteno antigénico múltiple es un núcleo de polilisina ramificado como sugiere Tam (Lu et al., supra). Se conserva un anclaje químicamente reactivo por la inclusión de un residuo de Cys protegido. Después de la haptenación de la cocaína de todos los grupos amino disponibles, el grupo sulfhidrilo de Cys se desprotege y aparece disponible para el acoplamiento con la proteína que presente alguno o numerosos grupos de entrecruzamiento específicos bifuncionales sulfhidril/amino (Yoshitake et al. (1979) Eur. J. Biochem. 101:395-399. Como núcleo se utiliza un número de estructuras dendriméricas.

Adyuvante

Cualquier adyuvante que no enmascare el efecto del transportador se considera útil en la vacuna terapéutica de la cocaína de la presente invención (véase, Edelman (1980) Rev. Infect. Dis. 2:370-373). En experimentos iniciales con el objetivo de demostrar la viabilidad de una vacuna terapéutica frente a la adicción a la cocaína se utilizó el potente adyuvante CFA (Figuras 9a y c). Sin embargo, CFA no es preferido en los seres humanos. Un adyuvante útil que está actualmente permitido para su uso en los seres humanos es el alumbre, incluyendo hidróxido de aluminio (Spectrum Chem. Mtg. Corp., New Brunswick, NJ) o fosfato de aluminio (Spectrum). Típicamente, la vacuna se adsorbe en el alumbre, que presenta una solubilidad muy limitada. Los datos preliminares en el modelo murino sugieren que el alumbre es capaz de incitar una respuesta potente de anticuerpo anticocaína (Figura 9b), y el adyuvante RBI también resulta apropiado.

La inmunización eficaz utilizando CTB como proteína transportadora no requiere de un adyuvante potente. Como se muestra en los Ejemplos, se indujeron respuestas con alta titulación de anticuerpos anticocaína por inmunización con el conjugado CTB-cocaína utilizando alumbre como adyuvante o en ausencia de adyuvante añadido.

Excipientes y agentes auxiliares

Las composiciones terapéuticas pueden contener opcionalmente uno o más excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico que incluyen, pero no están limitados a, agua estéril, disoluciones de sales como, disolución salina, fosfato sódico, cloruro sódico, alcohol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes benzílicos, polietilenglicol, gelatina, manitol, carbohidratos, estearato de magnesio, parafina viscosa, ésteres de ácidos grasos, hidroximetil celulosa y tampón. Las personas especializadas en el tema pueden utilizar otros excipientes apropiados. La composición terapéutica puede contener opcionalmente al menos un agente auxiliar, por ejemplo, medio de dispersión, envolturas, como lípidos y liposomas, surfactantes como agentes humidificantes y emulsionantes, lubricantes, conservantes como agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, estabilizantes y otros agentes conocidos para personas especializadas en el tema. La composición de la presente invención puede contener adyuvantes adicionales, agentes y/o excipientes inertes aceptables desde un punto de vista farmaceútico que pueden ser añadidos para incrementar las propiedades terapéuticas del medicamento o para permitir medios de administración alternativos.

Los conjugados hapteno-transportador altamente purificados producidos tal y como se discute arriba, pueden ser formulados en composiciones terapéuticas de la invención adecuadas para terapia en los seres humanos. Si una composición terapéutica de la invención va a ser administrada por inyección (es decir, inyección subcutánea), es preferible que el conjugado hapteno-transportador altamente purificado sea soluble en una solución acuosa a un pH aceptable desde un punto de vista farmaceútico (es decir, en un intervalo de aproximadamente 4-9) de manera que la composición sea líquida y permita una administración fácil. La composición también incluye opcionalmente excipientes aceptables desde un punto de vista farmaceútico, adyuvantes y agentes auxiliares o compuestos suplementarios activos. Dependiendo del modo de administración, la inclusión de ingredientes opcionales asegurará las propiedades deseadas de la composición terapéutica, por ejemplo, fluidez adecuada, prevención de la acción de microorganismos no deseados, incremento de la biodisponibilidad o absorción prolongada.

Una composición terapéutica de la invención debe ser estéril, estable en las condiciones de fabricación, almacenamiento, distribución y uso, y debe ser preservada de la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. Con el fin de mantener la integridad de la composición, una forma preferida de fabricación de la composición terapéutica de la invención es preparar la formulación del conjugado y del excipiente farmacéutico de manera que la composición esté en la forma de un polvo liofilizado que se reconstituya en excipientes o agentes auxiliares, por ejemplo, agua estéril, justo antes de su utilización. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado en vacío, secado por liofilización o secado por centrifugación que dan lugar a un polvo del ingrediente activo además de cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución estéril previamente filtrada.

Los compuestos activos de la invención pueden ser procesados de acuerdo con métodos convencionales de farmacia galénica para la producción de composiciones terapéuticas que van a ser administradas a pacientes, por ejemplo, mamíferos incluyendo los seres humanos. Los medios preferidos de administración son intranasal, intratraqueal, oral, dérmico, y/o inyección. Una combinación particularmente apropiada de medios de administración comprende una inyección inicial con dosis de refuerzo intranasales.

Para aplicaciones parenterales, resultan particularmente apropiadas las disoluciones estériles, inyectables, preferentemente disoluciones aceitosas o disoluciones acuosas, así como suspensiones, emulsiones, o implantes, incluyendo supositorios. Las ampollas son convenientes para dosificaciones unitarias. Para aplicaciones enterales, resultan particularmente apropiadas las pastillas, grageas, líquidos, gotas, supositorios, o cápsulas. Se puede utilizar un jarabe, elixir o semejante cuando se utilice un vehículo endulzado.

Se pueden formular composiciones de liberación dirigida o sostenida, por ejemplo, liposomas o aquellas donde el compuesto activo (conjugado) se protege con diferentes envolturas degradables, por ejemplo, mediante microencapsulación, múltiples envolturas, etc. También es posible liofilizar los nuevos compuestos y utilizar los liofilizados obtenidos, por ejemplo, para la preparación de productos para inyección.

Para una aplicación tópica, se utilizan en forma no pulverizable, en forma viscosa a semisólida o sólida que contenga un transportador compatible con la aplicación tópica y que tenga una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que la del agua. Las formulaciones apropiadas incluyen, pero no están limitadas a, disoluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, etc., que son, si se desea, esterilizadas o mezcladas con el agente auxiliar. Para una aplicación tópica son apropiadas las preparaciones en aerosol pulverizables en las que el compuesto activo, preferiblemente en combinación con un excipiente o agente auxiliar apropiados, se empaqueta en una botella comprimida o se mezcla con un propelente presurizado, volátil, normalmente gaseoso.

Un anticuerpo producido mediante las composiciones y métodos de la presente invención puede tener un peso molecular que varía entre 150 KDa y 1.000 KDa. Cuando el sujeto se expone a la cocaína libre después de la vacunación con el conjugado optimizado en la composición terapéutica, la cocaína libre es detectada por el o los anticuerpos específicos de la cocaína. No se necesitan cambios en la forma o estructura de la droga para que el anticuerpo reconozca a la droga in vivo. Aunque sin pretender limitar la presente invención, se piensa que después de la exposición de un individuo vacunado a la cocaína, los anticuerpos antidroga bloquearán los efectos de la cocaína. Primero, los anticuerpos no son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, se cree que la cocaína, cuando se una al anticuerpo anticocaína, no cruzará la barrera hematoencefálica y no será capaz de ejercer su efecto en los transportadores de dopamina. Segundo, el anticuerpo impide que la droga se una a su receptor por un simple bloqueo estérico. Se espera que este mecanismo sea operativo en el bloqueo de algunos de los efectos de la cocaína no localizados en el SNC (por ejemplo toxicidad cardiaca) y en la actividad de los anticuerpos contra otras drogas que no tengan como blanco el SNC. Tercero, la cocaína tiene una vida media relativamente corta in vivo debido a hidrólisis enzimática y no enzimática, que dan lugar a metabolitos inactivos. En particular, la cocaína es una droga lo suficientemente pequeña como para no ser capaz de entrecruzar anticuerpos, por lo que no se producirá la formación de complejos inmunes.

En la práctica de la presente invención se utilizan realizaciones de aplicaciones mucosales. Por ejemplo, se utilizan microesferas de copolímero para incitar o incrementar una respuesta inmune mucosal. Estas microesferas pequeñas y biodegradables encapsulan y protegen al conjugado y facilitan su captación por el sistema inmune mucosal. Aunque se utilizan preferentemente para inmunización oral, también se ha descrito su eficacia en la inmunización intranasal (Walker (1994) Vaccine 12:387-399). Resultan particularmente útiles para esta aplicación los polímeros inertes como el poli(láctido-coglicolido) (PLG) de diámetro 1-10 \muM (Holmgren et al. (1994) Am. J. Trop. Med. Hyg. 50:42-54; Serva (1994) Science 265:1522-1524).

Además de los conjugados preferidos, se lleva a cabo una inmunización cruzada con diferentes conjugados con el fin de minimizar la reactividad cruzada del anticuerpo. Se administran conjugados a ratones, más particularmente los conjugados PS-5 o PS-9, y se administran dosis de refuerzo en el día 14 de los conjugados recíprocos PS-9 o PS-5 acoplados al mismo transportador, BSA. Únicamente se estimulará y expandirá el subconjunto de células B secretoras de anticuerpos que reconozca a los dos conjugados de cocaína. Se piensa que al diferenciarse los dos conjugados en el punto de unión a la molécula de cocaína, la especificidad del reconocimiento se ve incrementada. La especificidad del antisuero inducido se confirma entonces por ELISA de competición.

Aún más, las composiciones terapéuticas que contienen más de un conjugado estimulan la producción de anticuerpos policlonales aumentando de esta manera la respuesta de anticuerpo en una exposición posterior.

Dosis

Se sabe que las respuestas de neutralización de los anticuerpos frente a patógenos duran años, y debería ser posible alcanzar una respuesta de anticuerpo anticocaína con una alta titulación que se mantenga durante al menos un año. Sería posible, en base a los valores obtenidos con vacunas convencionales, alcanzar las concentraciones de anticuerpo específico requeridas para neutralizar las concentraciones de cocaína en plasma (1-10 \muM); los datos farmacocinéticos en ratón, descritos en los Ejemplos, demuestran claramente que se pueden alcanzar concentraciones del anticuerpo neutralizante relevantes desde un punto de vista fisiológico. Finalmente, la capacidad de los anticuerpos maternales de cruzar la placenta en mujeres adictas a la cocaína, protegiendo de esta manera al feto, representa un efecto deseado adicional de la vacunación terapéutica de la cocaína. La optimización de la terapia para que sea eficaz en una población amplia supone un reto, por lo que las personas especializadas en el tema valoran cuidadosamente varios factores con el fin de determinar la dosis terapéutica apropiada. Aún más, las respuestas de anticuerpo pueden ser evaluadas utilizando ELISAs específicos como se describe en los Ejemplos, y otros ensayos basados en anticuerpos.

La variación genética en las tasas de eliminación, las interacciones con otras drogas, las alteraciones en la eliminación y la distribución inducidas por enfermedades, y otros factores combinados, dan lugar a un amplio espectro de respuesta a los niveles de vacunación en pacientes a los que se administra la misma dosis. Los indicadores clínicos ayudan en la titulación de algunas drogas en el intervalo deseado, y ninguna determinación química puede sustituir una observación cuidadosa de la respuesta al tratamiento. Debido a la eliminación, la vida media de la acumulación y los niveles en plasma permanentes resultan difíciles de predecir, la valoración de la producción del anticuerpo antidroga de abuso resulta útil como guía para obtener la dosis óptima. Cada uno de los conjugados/transportadores/adyuvantes de la presente invención se evalúa para determinar su capacidad para incitar una respuesta de anticuerpo que resulta la mejor en su capacidad para unir cocaína libre en la circulación.

En los Ejemplos aparecen más detalles acerca de los efectos de los transportadores y adyuvantes en la inducción de una respuesta de anticuerpo.

Así, se aprecia que las cantidades realmente preferidas del compuesto activo para un caso específico variarán de acuerdo con el conjugado específico que vaya a ser utilizado, las composiciones formuladas, el modo de aplicación, y el organismo tratado. Por ejemplo, en una realización, la composición terapéutica que contiene un transportador apropiado, se administra en primer lugar por vía parenteral y se administra una dosis de refuerzo por vía mucosal. Como se discute con más detalle en la presente memoria, este tipo de inmunización con la combinación óptima hapteno-transportador resulta muy eficaz para generar en primer término IgG de manera sistémica y en primer término IgA de manera local.

Titulación de anticuerpo

La primera valoración de una vacunación consiste en evaluar si el conjugado de interés induce una alta titulación de la respuesta de anticuerpo. Las titulaciones de anticuerpo se determinan utilizando un ensayo ELISA como se describe en los Ejemplos más adelante. Las placas se recubren con el conjugado cocaína-HEL, se lavan, y se incuban con diferentes diluciones del suero que se quiere valorar. Las placas se lavan de nuevo y se revelan con un segundo anticuerpo contra IgG de ratón marcado enzimáticamente. Las titulaciones se definen como el inverso de la dilución de suero que produce un 50% de la respuesta máxima.

La titulación de anticuerpo depende de la concentración del anticuerpo y de la afinidad del anticuerpo. Como se detalla en los Ejemplos, antisueros con aproximadamente 0,7 mg/ml de anticuerpo específico contra la cocaína de afinidad media de aproximadamente 2 x 10^{-8}M (ó 5 x 10^{7} M^{-1}) tienen una titulación en ELISA de 80.000. En la estimación de la titulación de anticuerpo requerida, una persona especializada en el tema considera tanto la concentración como la afinidad de los anticuerpos.

Aunque las personas especializadas en el tema conocen otros métodos para calcular la concentración apropiada de anticuerpo, sin intención de limitar la invención, se describe un método para predecir los requerimientos de la concentración del anticuerpo anticocaína. El pico de los niveles de cocaína en plasma en adictos se encuentra en el intervalo 0,3-1,5 g/ml (Ambre et al. (1991) J. Anal. Tox. 15:17-20; Cone (1995) J. Anal. Tox. 19:159-478; y Cone et al. (1989) J. Anal. Tox. 13:65-68). Por lo tanto, 0,075-0,375 mg/ml de anticuerpo se corresponde aproximadamente con la equivalencia molar (La proporción en peso anticuerpo monoclonal/cocaína = aproximadamente 160.000/303= aproximadamente 500 pero al existir dos sitios de unión en cada anticuerpo, la proporción molar por cada sitio de unión a la cocaína es aproximadamente 250). Es posible alcanzar este nivel en la respuesta de anticuerpo con un transportador haptenado, como se demuestra en los Ejemplos. Sin embargo, si se induce en la mucosa una respuesta específica de IgA dimérica secretada contra una droga de abuso, como se describe en al menos una de las realizaciones de la presente memoria, el requerimiento de la concentración de anticuerpo es dos veces menor en comparación con la droga de abuso. No se quiere indicar con esto que se necesite un exceso molar de anticuerpo respecto a la droga de abuso para conseguir una terapia con éxito.

En una composición terapéutica de la presente invención, el anticuerpo específico contra la cocaína (anticuerpo monoclonal) bloquea los efectos de un exceso molar de cocaína en un modelo de adicción en ratas. Se inyectaron a las ratas 4 mg de anticuerpo monoclonal antes de la infusión de la cocaína (1 mg/kg; 300 g/rata). La concentración de anticuerpo monoclonal determinada en las ratas fue de aproximadamente 50 g/ml. El anticuerpo se encontraba por debajo de la equivalencia molar a la cocaína cuando se comparó en el animal completo o en el plasma.

La afinidad del anticuerpo refleja la cantidad del complejo anticuerpo-droga en equilibrio con anticuerpo no unido y droga de abuso no unida, de esta manera:

K_{eq} = [complejo Ab+droga]/[Ab] x [droga]

donde [Ab] = concentración molar de los sitios de unión del anticuerpo no unidos;

[droga] = concentración molar de droga no unida; [Ab+droga] = concentración molar del complejo anticuerpo-droga.

Por ejemplo, en base a diferentes cálculos, los anticuerpos con afinidad por la cocaína por encima de 10^{-6} M se encuentran en su mayoría unidos a la cocaína y los anticuerpos con afinidades de aproximadamente 10^{-7} M están prácticamente todos unidos a la cocaína a las concentraciones plasmáticas esperadas de anticuerpo y cocaína.

Capacidad para reconocer a la cocaína libre

Una vez que un conjugado es capaz de incitar una alta titulación de respuesta de anticuerpo en suero, el suero también se chequea mediante un ELISA de competición para valorar su capacidad de reconocer a la cocaína libre como se describe en los Ejemplos. Se pone a punto un ensayo ELISA utilizando una dilución subóptima de suero. Se añaden diferentes concentraciones de cocaína libre junto con el antisuero, y el ELISA se revela como se ha descrito más arriba. Los datos se expresan como la concentración de cocaína libre requerida para competir al 50% en la unión al anticuerpo, una medida aproximada de afinidad. La lidocaína, entre otras, se utiliza como control negativo en los experimentos de competición, y el conjugado cocaína-transportador utilizado en la inmunización se utiliza como control positivo.

Además del ensayo ELISA de competición la unión se evalúa utilizando cocaína marcada radiactivamente. Los datos que resultan de estos ensayos indican si el suero inmune se está uniendo a la cocaína libre. Este punto se discute con más detalle en los Ejemplos.

Especificidad de la respuesta de anticuerpo

Con el fin de tener la máxima eficacia en bloquear la actividad de la cocaína, los anticuerpos inducidos deben tener una afinidad mínima por los metabolitos de la cocaína inactivos desde un punto de vista farmacológico. La unión de los anticuerpos a los metabolitos de la cocaína inactivos desde un punto de vista farmacológico reduciría la potencia de la vacuna. Los metabolitos inactivos principales son el éster metílico de ecgonina, norcocaína y benzoilecgonina, estando todos disponibles comercialmente. La especificidad de los antisueros para cada uno de estos metabolitos se determina en un ELISA de competición y por inmunoensayo con marcaje radiactivo. Estos puntos se discuten con más detalle en los Ejemplos, más adelante.

Adicionalmente, debe ser minimizada la interacción de los anticuerpos producidos por otras drogas utilizadas en la terapia de adicción y en otros procedimientos médicos. En particular, se evita la reacción cruzada con drogas prescritas habitualmente para los adictos a la cocaína y a varias drogas. Aunque la naturaleza única de la estructura del anillo de tropano de la cocaína minimiza las reacciones cruzadas, éstas pueden ser valoradas en un ELISA de competición. Así, la lidocaína se utiliza como control negativo en nuestro ELISA de competición. Las siguientes moléculas resultan útiles como cotratamiento, buprenorfina, desipramina, naloxón, haloperidol, clorproazina, y bromocriptina, así como otras que pudieran resultar relevantes.

Efecto en la DL_{50} de la cocaína

Los conjugados y los protocolos de inmunización que resultan más eficaces para incitar respuestas de anticuerpo específicas con alta titulación se evalúan adicionalmente para valorar su capacidad de desviar la DL_{50} de la cocaína. En estos experimentos, a los ratones inmunizados con la cocaína e inmunizados con el transportador (control) se les inyecta por vía intravenosa dosis de cocaína cercanas a la DL_{50} definida previamente. Se utilizan diez ratones para cada punto, y los datos se analizan utilizando un test de chi-cuadrado de Cochran-Mantel-Haenzel.

Además, se utiliza un modelo del tiempo de fallo para analizar el tiempo hasta la muerte inducido por la cocaína. La magnitud en la que los anticuerpos anticocaína incrementan tanto (a) la dosis de cocaína requerida para producir letalidad como (b) el tiempo hasta la muerte, son medidas de la eficacia en este modelo. Estos datos resultan en una evaluación rápida y rigurosa de la eficacia de los anticuerpos in vivo.

Observando el efecto fisiológico en seres humanos

Una persona que busca atención médica durante un episodio de abuso puede presentarse con un pulso rápido, una tasa respiratoria aumentada y una temperatura corporal elevada. A altos niveles de sobredosis, se pasa a convulsiones, presión sanguínea marcadamente elevada, y una temperatura corporal muy alta, todos estos factores pueden resultar en shock cardiovascular. Además de los niveles en sangre, todos estos factores serán evaluados y se establecerán criterios específicos cuando se contemple la administración de inmunización activa por medio de una vacuna o la administración pasiva por medio de anticuerpos.

Cuando se ensayaron realizaciones de la invención en ratones, la inmunización con un conjugado proteína-cocaína indujo una respuesta de anticuerpo que varió la DL_{50} de la cocaína (Figuras 11a y b). Se establece la hipótesis de que la relativamente pequeña desviación observada con dosis muy altas de cocaína se traduce en una desviación mayor a concentraciones de cocaína más bajas; el dramático efecto del anticuerpo monoclonal anticocaína en la administración propia de cocaína es consistente con esta hipótesis.

Sin intentar limitar el alcance de la invención, se describirán ahora con más detalle la composición y los métodos de esta invención en referencia a una droga de abuso preferida, la cocaína, y en referencia a realizaciones específicas.

A no ser que se indique otra cosa en los Ejemplos, en estos estudios se utilizaron ratas hembra BALB/c de 2-3 meses de edad. Estos animales presentan una respuesta reproducible a los antígenos utilizados en esta investigación. Los animales se inmunizaron bien por vía intramuscular, subcutánea, intratraqueal, o intranasal con un conjugado proteína-cocaína bien en disolución salina, o en alumbre, o en CFA. A no ser que se indique otra cosa, los ratones BALB/c se inmunizaron por vía subcutánea con 50 \mug del conjugado a ensayar. Después de 14 días, se administró a los ratones la misma dosis de refuerzo. En los ratones inmunizados utilizando CFA, se utilizó IFA para las inmunizaciones posteriores. Las respuestas de anticuerpo en el suero se determinaron después de 14 días adicionales. Se utilizaron cinco ratones por grupo y todos los sueros fueron ensayados de manera individual. La CTB utilizada en los siguientes ejemplos se encuentra disponible comercialmente, por ejemplo, de List o Sigma.

Se sobreentiende que el ejemplo y las realizaciones descritas en la presente memoria tienen un propósito únicamente ilustrativo, y que las personas especializadas en el tema podrán sugerir varias modificaciones. De acuerdo con esto, los siguientes Ejemplos, no limitantes, se ofrecen como guía en la práctica de la presente invención.

Ejemplo 1 Síntesis de PS-2

Se trata una disolución de clorhidrato del éster metílico de ecgonina (50 mg, 0,21 mmol), diisopropiletilamina (80 l, 0,46 mmol) en DMF (3 ml) con bromuro de bromoacetilo (22 l, 0,25 mmol) y se calienta a 40ºC durante toda la noche. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (con 9:1 cloroformo:metanol como eluyente), dando lugar al compuesto bromado (67 mg, 96%) como un polvo amarillo claro (éster metílico de ácido 3-(Bromoacetiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico).

A una disolución del compuesto bromado (17 mg, 0,053 mmol) en PBS (0,5 ml), se añade BSA tiolada (15 mg) en PBS (0,5 ml) y se agita de manera continua a temperatura ambiente durante 3 días. El conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se analiza entonces por análisis espectral de masas.

Ejemplo 2 Síntesis de PS-4

A una disolución del éster metílico de ecgonina (32 mg, 0,16 mmol) en DMF (2 ml), se añade trietilamina (22 l, 0,16 mmol) seguida de anhídrido succínico (16 mg, 0,16 mmol) y la disolución se calienta a 35ºC durante 2 horas. El disolvente se elimina bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (con 9:1 cloroformo:metanol como eluyente). Mediante este proceso se obtiene el deseado hemisuccinato (21 mg, 44%) como un polvo blanco (éster metílico de ácido 3-(Succinoloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico).

A una disolución del hemisuccinato (2,4 mg, 7,69 mol) en agua destilada (0,5 ml) a 0ºC, se le añade EDC (1,5 mg, 7,69 mol). Después de 10 minutos, se añade BSA (2 mg en 0,5 ml de PBS) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. El conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de masas.

Ejemplo 3 Síntesis de PS-5

Método A

Se trata una disolución de clorhidrato de norcocaína (1 g, 3,07 mmol), trietilamina (0,86 ml, 6,14 mmol) en DMF (20 ml) con anhídrido succínico (614 mg, 6,14 mmol) y la mezcla se calienta a 45ºC durante toda la noche. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (con 2:1 cloroformo: metanol como eluyente). Esto da lugar a la norcocaína succinilada (1,0 g, 84%) en forma de un jarabe espeso (éster metílico de ácido 3-(Benzoiloxi)-8-succinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico).

A una disolución del ácido (14 mg, 0,036 mmol) en agua destilada (1 ml) a 0ºC, se añade EDC (10,4 mg, 0,055 mmol). Después de 5 minutos se añade gota a gota una disolución de BSA (14 mg) en PBS (1 ml) y la mezcla se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. El conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de conjugación por análisis espectral de masas.

Método B

A una disolución de BSA (500 mg) en tampón borato 0,2 M (80 ml), se añade anhídrido succínico (270 mg, 2,70 mmol) en 1,4-dioxano (10 ml) en alicuotas de 200 l durante 30 minutos. Se mantiene el pH en 9,3 por adición de una disolución se hidróxido sódico 3 N. La disolución se guarda a temperatura ambiente durante 18 horas, se dializa frente a trietilamina 0,01 M y se liofiliza para obtener un polvo blanco. El análisis espectral de masas del producto indica 55 grupos succinoilo por cada molécula de BSA.

Se trata una disolución de BSA succinilada (72 mg) en tampón bicarbonato sódico 0,1 M, pH 8,8 (15 ml) a 0ºC con EDC (88 mg, 0,46 mmol). Después de 5 minutos, se añade clorhidrato de norcocaína (100 mg, 0,31 mmol) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de masas.

Ejemplo 4 Síntesis de PS-6

A una disolución de benzoilecgonina (276 mg, 0,96 mmol) en DMF (5 ml) a -10ºC, se añade gota a gota complejo borano-sulfuro de dimetilo (disolución 1,0 M en cloruro de metileno; 1,0 ml, 1,01 mmol). La mezcla se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche, después de lo cual la reacción se para por la adición de THF:agua (proporción 1:1 v/v) seguido de agitación durante 10 minutos adicionales. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (cloroformo seguido de metanol como eluyentes). Esto da lugar al alcohol deseado (246 mg, 93%) como un polvo blanco (3-(Benzoiloxi)-2-(hidroximetil)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano).

A una disolución del alcohol (190 mg, 0,69 mmol) en DMF (5 ml) se añade trietilamina (0,19 ml, 1,38 mmol), seguida de anhídrido succínico (138 mg, 1,38 mmol) y se calienta a 40ºC durante toda la noche. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (1:1 cloroformo:metanol como eluyente). Esto da lugar al hemisuccinato (123 mg, 48%) como un polvo blanco (3-(Benzoiloxi)-2-(hidroximetil succinoil)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano).

A una disolución del hemisuccinato (16 mg, 0,043 mmol) en agua destilada (0,5 ml) a 0ºC se añade EDC (12 mg, 0,064 mmol). Después de 5 minutos, se añade gota a gota BSA (16 mg) en PBS (0,5 ml) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de masas.

Ejemplo 5 Síntesis de PS-9

A una disolución de benzoilecgonina (10 mg, 0,035 mmol) en agua destilada (1,0 ml) a 0ºC, se añade EDC (10 mg, 0,052 mmol). Después de 5 minutos, se añade gota a gota BSA (10 mg) en PBS (0,5 ml) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. El conjugado de proteína se purifica por diálisis frente a PBS. El grado de haptenación determina por análisis espectral de masas.

Ejemplo 6 Síntesis de CTB-PS-5

Método A

A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l, 10,3 mol) seguida de HATU (2 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón borato 10 mM, pH 7,8) y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV.

Método B

A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l, 10,3 mol) seguida de HBTU (1,9 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón PBS, pH 7,6) y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV.

Método C

A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l, 10,3 mol) seguida de TNTU (1,9 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón PBS, pH 7,6) y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV.

Método D

A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l, 10,3 mol) seguida de TNTU (1,9 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón borato 10 mM, pH 7,8) y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV.

Método E

A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l, 10,3 mol) seguida de PyBroP (2,4 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón PBS, pH 7,6) y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV.

Método F

A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg, 5,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l, 10,3 mol) seguida de PyBrop (2,4 mg, 5,40 mol). Después de 10 minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0,5 mg en 0,9 ml de tampón borato 10 mM, pH 7,8) y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El pH de la disolución del conjugado se ajusta a pH 6,5 añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico 20 mM, pH 6,5. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV.

Ejemplo 7 Síntesis Alternativa de CTB-PS-5

Método A

Se agita una disolución de norcocaína succinilada (15 mg, 0,39 mol), cloruro de tionilo (28 l, 0,39 mmol) en DMF (250 l) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de que la reacción se estime terminada (por análisis por CCF), los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el derivado clorado resultante (éster metílico de ácido 3-(Benzoiloxi)-8-clorosuccinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico) se pasa a la siguiente etapa sin purificación adicional.

El derivado clorado (16 mg, 0,04 mmol) se disuelve en DMF (100 l) y se añade gota a gota a una disolución de CTB (0,38 mg/ml en 3 ml de PBS). La mezcla resultante se mantiene a temperatura ambiente durante toda la noche, se dializa frente a PBS y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de masas.

Método B

A una disolución de norcocaína succinilada (100 mg, 0,26 mmol) en DMF (5 ml), se añade DCC (64 mg, 0,31 mmol). Después de 10 minutos, se añade sal sódica de ácido 4-hidroxi-3-nitrobencenosulfónico (74 mg, 0,31 mmol) y la disolución amarilla resultante se mantiene a temperatura ambiente durante 4 días. La suspensión resultante se filtra bajo presión reducida y el filtrado se añade a éter dietílico frío (10 ml) con agitación vigorosa. Se añade hexano (5 ml) y después de una precipitación completa de un aceite amarillo, se decanta el sobrenadante incoloro. El proceso se repite y el aceite se seca durante toda la noche bajo presión reducida, dando lugar al éster deseado (157 mg) (éster metílico de ácido 3-(Benzoiloxi)-8-(2-nitro-4 éster sulfofenilo)succinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico) que se pasa a la siguiente etapa sin purificación adicional.

El éster (5 mg, 8,16 mol) se disuelve en DMF (100 l) y se añade gota a gota a CTB (1 mg en 2 ml de PBS) a 4ºC y se templa entonces a temperatura ambiente. Después de 3 horas la disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de masas.

Método C

A una disolución de norcocaína succinilada (108 mg, 0,28 mmol) en DMF (5 ml) a 0ºC, se añade NMM (37 l, 0,33 mmol) seguido de cloroformato de etilo (32 l, 0,33 mmol). Después de 10 minutos, se añade N-hidroxisuccinimida (38 mg, 0,33 mol) y la disolución se templa a temperatura ambiente durante 18 horas. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se recristaliza con isopropanol/éter dietílico para dar lugar al éster N-oxisuccinimidilo (113 mg, 84%) en forma de un polvo blanco (éster metílico de ácido 3-(Benzoiloxi)-8-(N-oxisuccinimidoil)succinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico).

Una disolución del éster (2 mg, 4,11 mol) en DMF (100 l) se añade gota a gota a una disolución de CTB (1 mg en 2 ml de PBS). Después de 3 días la disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas.

Ejemplo 8 Síntesis de un conjugado con un espaciador ampliado

A una disolución de clorhidrato de norcocaína (50 mg, 0,15 mmol) en DMF (1 ml) se añade diisopropiletilamina (27 l, 0,31 mmol). Después de 5 minutos la disolución se enfría hasta 0ºC y se añade gota a gota a una disolución de cloruro de adipoilo (44 l, 0,080 mmol) en DMF (100 l) a 0ºC. Después de 2 horas, la disolución se añade gota a gota a una disolución de CTB (1 mg en 2 ml de PBS) a 0ºC y se templa a temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas.

Ejemplo 9 Conjugación de norcocaína succinilada con MAP

La resina MAP (Novabiochem EEUU, La Jolla, CA) (grado de sustitución: 0,48 mmol/g; 50 mg, 0,023 mmol) se esponja previamente en DMF (5 ml). El disolvente se decanta y la resina se trata con una disolución de piperidina 20% en DMF (5 ml), se agita durante 15 minutos y los disolventes se eliminan por decantación. La resina se lava de manera secuencial con DMF (5 ml), metanol (5 ml) y DMF (5 ml). Una disolución de norcocaína succinilada (18 mg, 0,046 mmol) en DMF (1 ml) se trata con un mezcla de HOBt/DMF/HATU (disolución 0,5 M recién preparada en DMF; 92 l, 0,046 mmol) y después de 5 minutos, se agita durante toda la noche después de lo cual se estima que la reacción se ha completado en >90% mediante el test Kaiser-Ninhydrin. Los disolventes se decantan y los lechos de resina se lavan de manera exhaustiva con metanol, seguido de secado bajo una corriente de argón. El MAP derivatizado se disocia al resúspender la resina en fenol/TFA/EDT 2,5% (5 ml), agitar durante 1 hora, filtrar, lavar con TFA (4 x 4 ml) y los disolventes se eliminan bajo presión reducida. El péptido crudo se tritura con éter dietílico frío, se centrifuga durante 5 minutos a 5.000 rpm y se repite el proceso. El sedimento se disuelve en agua y se liofiliza para obtener 1 mg del péptido crudo.

Ejemplo 10 Síntesis del conjugado (n-succinamidil-cocaína)8-MAP proteína

La síntesis de la porción que no incluye al hapteno (núcleo MAP) del MAP polihaptenado se lleva a cabo por síntesis manual de péptidos como describe Tam et al (Patente de EEUU 5.229.490). Los grupos amino se protegen por la función Boc (t-butiloxicarbonilo) y el grupo sulfhidrilo de Cys se protege como su derivado 3-nitro-2-piridilsulfenilo (Npys). Después de la unión a la resina y la eliminación de los grupos protectores Boc con TFA como describe Tam (supra), el núcleo MAP se disocia de la resina por disociación HF dejando los grupos Npys intactos. El núcleo MAP crudo se recoge en clorhidrato de guanidina 7 M que contiene HOAc 0,2 M y se somete a cromatografía de permeación en gel en HOAc 0,2 M en Sephadex G-10 para eliminar cualquier subproducto de bajo peso molecular generado por la disociación HF. El núcleo MAP se liofiliza de HOAc 0,2 M. Se prepara (N-succinamidil-cocaína)8-MAP de acuerdo con lo descrito en el Ejemplo 9.

Antes del acoplamiento con la proteína activada el grupo tiol se expone por tratamiento con un equivalente molar de clorhidrato de tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP). La proteína transportadora activada se disuelve en tampón bicarbonato 0,2 M a temperatura ambiente hasta alcanzar una concentración de 5 mg/ml. A esta disolución se añade un exceso molar de 2 veces de (N-succinamidil-cocaína)8-MAP a 5 mg/ml. Se deja que la reacción se lleve a cabo durante 20 horas a temperatura ambiente y se dializa entonces durante toda la noche frente a HOAc y se liofiliza.

Ejemplo 11 Valoración de la inducción de una respuesta de anticuerpo específica contra la cocaína

Con el fin de incitar una respuesta de anticuerpo contra una molécula pequeña o hapteno, como la cocaína, es necesario unirla a un transportador que contenga un epítopo de célula T, por ejemplo, una proteína transportadora. El transportador es reconocido por las células T que proporcionan ayuda a las células B específicas de cocaína para la iniciación y el mantenimiento de una producción de anticuerpos sostenida. En este ejemplo, el transportador utilizado es BSA, una proteína con 36 residuos de lisina que se encuentran expuestos y disponibles para la conjugación. Se produjo un panel de conjugados cocaína-proteína estructuralmente diferentes que se unieron a través de diferentes regiones de la molécula de cocaína (Figuras 1a, 1b, 2a, 2b). Se sintetizó un conjunto de conjugados porque la molécula de cocaína se altera físicamente y se orienta de manera distinta durante el proceso de conjugación con el transportador. Como cualquier conjugado de la cocaína puede incitar anticuerpos que reconozcan sólo al conjugado, y no al hapteno libre (cocaína), se llevó a cabo un cribado. Los ratones se inmunizaron con 50 g del conjugado cocaína-BSA PS-5,1 y PS-5,6 (Figuras 9a y b) o con PS-9,1 (Figura 9c) por vía intraperitoneal bien con CFA (Figuras 9a y 9c) o con alumbre (Figura 9b). Se administró a los ratones una dosis de refuerzo y luego se sangraron. Los ratones inmunizados con el conjugado cocaína-BSA PS-5,1 se refuerzan con el conjugado cocaína-BSA PS-5,6. Los sueros se ensayaron en un ensayo ELISA utilizando placas recubiertas con PS-5 (conjugado con HEL) o PS-9 (conjugado con HEL). Se muestran las respuestas de 5 ratones individuales por grupo. Estos datos demuestran que los conjugados cocaína-BSA son capaces de incitar respuestas de anticuerpo con una alta titulación.

Ejemplo 12 Reconocimiento de la cocaína libre

Para determinar directamente si los anticuerpos inducidos eran capaces de reconocer a la molécula de cocaína libre, se realizó un ELISA de competición. Las placas se recubrieron con el conjugado cocaína libre-HEL apropiado y se incubaron con el antisuero en una dilución 1:2.000 en presencia de distintas concentraciones de cocaína libre como competición. Cuando se utiliza PS-5,6-BSA como inmunógeno, la mayoría de la respuesta del anticuerpo es efectivamente competida por la cocaína libre (Figuras 10a y b). En este lote de sueros procedentes de diez ratones (cada línea en el gráfico de la Figura 10a representa un ratón diferente), uno es menos efectivo en el ensayo de competición (cuadrados abiertos y línea de puntos) y este ratón no se utilizó en los experimentos de DL_{50} descritos en la presente memoria. El conjugado PS-9,2-BSA también induce anticuerpos específicos contra la cocaína. Estos datos demuestran que los conjugados cocaína-transportador pueden ser sintetizados y que inducen respuestas de anticuerpo específicas contra la cocaína con una titulación alta que deberían ser capaces de neutralizar a la cocaína in vivo.

Ejemplo 13 Capacidad de la vacunación para proteger contra la toxicidad de la cocaína

La presente invención describe un conjugado cocaína-proteína que induce una respuesta de anticuerpo anticocaína en un modelo de ratón. Estos anticuerpos anticocaína neutralizan a la cocaína in vivo, desviando significativamente la dosis de cocaína requerida para incitar una respuesta letal en ratones.

La eficacia de la vacunación terapéutica contra la cocaína se evaluó determinando la dosis letal de cocaína (DL_{50}) en animales inmunizados. La predicción fue que una gran respuesta de anticuerpo específica contra la cocaína debería unir suficientes cantidades de cocaína como para evitar los rápidos efectos cardíacos, respiratorios y neurológicos de la cocaína, incrementando de esta manera la DL_{50} de la cocaína en los ratones inmunizados. Se inmunizaron sesenta ratones BALB/c con 50 \mug de PS-5,4-BSA en CFA y se les administró una dosis de refuerzo con el mismo conjugado en IFA. Cada ratón se sangró en el día 34 y se valoraron las titulaciones y la competición con la cocaína de los anticuerpos en el suero. Se eligieron cuarenta y ocho ratones para el experimento, con unas titulaciones medias de 18.700, y todos mostraron competición con la cocaína libre. Para los experimentos de DL_{50}, se utilizaron 4-6 ratones por grupo y cada grupo fue cuidadosamente formado de acuerdo con la titulación de anticuerpo y la afinidad aparente por la cocaína libre.

Como se muestra en la Figura 11, la DL_{50} en ratones BALB/c no inmunizados fue 3 mg/kg cuando la droga se administró por vía intravenosa (i.v., Figura 11b) y 20 mg/kg cuando se administró por vía intraperitoneal (i.p., Figura 11a). La inmunización de los ratones con el conjugado cocaína-proteína cambió la DL_{50} de manera significativa. Las dosis requeridas para una toxicidad mitad de la máxima fue 4,5 mg/kg y 35 mg/kg para las dosis i.v. e i.p., respectivamente. Estas dosis fueron significativamente diferentes de los valores obtenidos en los ratones no inmunizados (p = 0,048 para i.v. y p = 0,014 para i.p., test chi-cuadrado de Cochran-Mantel-Haenszel). La protección de la vacunación contra la cocaína de casi dos veces frente a la toxicidad aguda a altas dosis se compara favorablemente con algunas drogas que afectan la farmacología de la cocaína. Por ejemplo, el antagonista de NMDA, MK-801 incrementa la DL_{50} 1,3 veces y 1,4 veces cuando se combina con propanolol (Itzhak et al. (1992) J. Pharmacol. Exp. Therap. 262:464-467). Además, la vacunación prolonga significativamente el tiempo hasta la muerte de una media de 3,2 min a 5,4 min. para la administración i.v. (p = 0,007, test de Wilcoxon 2 muestras) y de 4,0 min a 8,5 min. para la administración i.p. (p = 0,0003). Este estudio demuestra que el anticuerpo afecta la respuesta fisiológica a altas dosis de cocaína.

Ejemplo 14 Discriminación de la cocaína de la disolución salina en el modelo de rata

Con el fin demostrar la estabilidad y reproducibilidad de este sistema, se adiestraron 8 ratas para discriminar inyecciones i.p. de 10 mg/kg de cocaína de las de disolución salina utilizando un procedimiento de 2 palancas (Kantak et al. (1995) J. Pharmacol. Exp. Therap. 274:657-665). Después de la administración de las inyecciones de cocaína, se hace a los animales presionar una de las palancas (la palanca correspondiente a la droga) 10 veces (FR 10) para obtener una bola de comida; después de las inyecciones de disolución salina, se les hace presionar la otra palanca (la palanca correspondiente a la disolución salina) 10 veces para obtener una bola de comida. Cuando los animales han aprendido a discriminar la cocaína de la disolución salina, al menos un 90% del total de respuestas se realizan en la palanca apropiada durante varios días consecutivos. Con el fin de incorporar un procedimiento de dosificación cumulativo durante las sesiones posteriores de sustitución, las sesiones de adiestramiento se componen de múltiples componentes, cada uno de ellos de 10 minutos de duración o hasta que se completen 10 FRs, lo que ocurra antes.

Después del adiestramiento, se llevaron a cabo sesiones de sustitución con diferentes dosis de cocaína (0,3-17,8 mg/kg) dos veces por semana, con sesiones de entrenamiento en días intermedios. Las sesiones de sustitución de la droga consistieron en cuatro componentes de 10 minutos, cada uno de ellos precedido de un período de 15 min de tiempo de descanso. Durante los ensayos de sustitución, la realización de 10 respuestas en cualquiera de las palancas produce una bola de comida. Se inyectaron dosis cada vez mayores de cocaína al inicio de cada uno de los 4 períodos de tiempo de descanso. Se estudiaron los intervalos superpuestos de dosis cumulativas en diferentes días de ensayo, lo que permitió determinar una curva de dosis respuesta de siete puntos en una única semana.

En los ensayos de sustitución, la cocaína produjo incrementos en el porcentaje de respuestas correspondientes a la cocaína relacionados con la dosis, lo que resultó en una sustitución total (>90% de respuestas correspondientes a la cocaína) en todos los sujetos después de la administración de dosis al menos iguales a la dosis utilizada en el adiestramiento. Cada punto de datos se basa en 2-3 determinaciones en sujetos individuales. La ED_{50} \pm 95% C.I. para las respuestas correspondientes a la cocaína es 2,14 \pm 0,20 mg/kg, lo que se compara favorablemente con el valor obtenido en ratas adiestradas para discriminar inyecciones de 10 mg/kg de cocaína utilizando procedimientos de un único componente y una única dosificación (2,6 \pm 0,29 mg/kg; (Kantak et al. (1994) J. Pharmacol. Exp. Ther. (en revisión)).

Ejemplo 15 Ensayos para detectar la actividad funcional de ctb

Para ensayar la actividad funcional de CTB, se desarrollaron dos ensayos. Primero, se determinó la unión de CTB a células mediante citometría de flujo. Las células se incubaron con CTB, seguido de antisuero antiCTB comercial de cabra y de un segundo anticuerpo anticabra marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 13). La CTB petamérica nativa se unió a las células produciendo una dramática desviación de la intensidad de la fluorescencia. La CTB monomérica resultó incapaz de unirse a las células en este ensayo. Segundo, se puso a punto un ELISA para determinar la capacidad de CTB para unirse al gangliósido G_{M1}. Las placas de ELISA se recubrieron con gangliósido G_{M1} y se incubaron con diferentes concentraciones de CTB. La unión se detectó utilizando un anticuerpo antiCTB (o disolución salina como control) seguido de un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente y de revelado con el sustrato. Este ensayo proporcionó una determinación cuantitativa y muy sensible de la capacidad de CTB pentámerica para unirse a los gangliósidos G_{M1}. Estos ensayos se utilizaron para evaluar la actividad funcional de los conjugados CTB haptenados y recombinantes antes de llevar a cabo los experimentos in vivo. De manera similar, la Figura 14a muestra que la conjugación no afecta la capacidad de los anticuerpos específicos contra CTB para reconocer al conjugado. La Figura 14b, muestra que las moléculas CTB conjugadas que son capaces de unir G_{M1}, también pueden ser unidas por anticuerpos específicos contra la cocaína, lo que demuestra la retención de la actividad CTB de la CTB haptenada.

Ejemplo 16 Modelo de adicción de administración propia y efecto de la vacuna

En ratas, las propiedades de refuerzo de estímulos de la cocaína pueden ser estudiadas de manera fiable utilizando procedimientos de administración propia intravenosa. Este es un modelo directo de adicción y del comportamiento de la administración propia en sujetos animales que se correlaciona positivamente con el abuso de esa droga por sujetos humanos. Para examinar el efecto de la vacuna terapéutica, se implanta a ratas macho adultas (Wistar, 300 g aproximadamente) un catéter en la vena yugular utilizando los procedimientos generales descritos por Weeks (Meth. Psychobiol. (1972) 2:115-168) y adaptados por Kantak et al. (Kantak et al. (1990) Pharm. Biochem. Behavior 36:9-12; Kantak et al. (1991) Psycopharm. 104:527-535; y Kantak et al. (1992) Pharmacol. Biochem. Behav. 41:415-423). Todos los animales se guardan individualmente y se mantienen a un 80%-85% de sus pesos corporales sin comida para facilitar la comparación con los experimentos de discriminación de droga. Una semana después de la cirugía, 1,0 mg/kg/infusión de cocaína resulta válida como dosis de adiestramiento en sesiones diarias de 2 horas. La infusión propia de las ratas es de una dosis cumulativa de 10 mg/kg cada hora. Durante la fase inicial de adiestramiento, cada presión en la palanca resulta en la liberación de droga. El número requerido de respuestas para la infusión propia de cocaína se aumenta gradualmente hasta 5 (FR5) y se introduce entonces el programa de liberación de droga FR 5:F15 min. Después de una respuesta estable durante al menos 5 días, se determina una línea base en la curva de dosis respuesta a la cocaína (0,1, 0,3, 0,56, 1,0 y 3,0 mg/kg/infusión). Cada dosis de cocaína, así como de disolución salina, se examina en un bloque de al menos 5 sesiones y hasta que no se observen tendencias sistemáticas al alza o a la baja. Los datos se expresan como velocidades de respuesta medias durante los últimos dos días de cada bloque de sesiones.

Después de la determinación de la línea base en la curva de dosis respuesta a la cocaína en ratas, se inmuniza a la mitad de las ratas con el conjugado cocaína-transportador óptimo y se inmuniza a la otra mitad únicamente con el transportador. Las sesiones de administración propia se interrumpen hasta que se alcanzan titulaciones significativas de anticuerpo anticocaína, lo que suele tardar 4-6 semanas. Las ratas se sangran de la vena del rabo para asegurar que todas las ratas presentan titulaciones comparables de anticuerpos específicos contra la cocaína. Después de la inmunización, se ensaya la capacidad de las ratas para responder a la cocaína. Se permite el acceso de las ratas a diferentes dosis de cocaína (0,3-3,0 mg/kg/infusión), o a disolución salina, en bloques de 5 días. Las ratas control inmunizadas únicamente con el transportador vuelven rápidamente al patrón de la línea base de la administración propia de cocaína.

El anticuerpo anticocaína bloquea los efectos de refuerzo de la cocaína. Si es necesario, se estudian dosis de cocaína de hasta 30 mg/kg/infusión para determinar la magnitud de la protección que proporciona el anticuerpo. Si el anticuerpo anticocaína bloquea parcialmente la cocaína, las ratas requieren dosis mucho mayores de cocaína para alcanzar el efecto fisiológico deseado y las respuestas mantenidas por la cocaína se restituyen mediante una desviación a la derecha en la curva de dosis respuesta de la cocaína. Si el anticuerpo policlonal frente a la cocaína bloquea completamente dosis de cocaína de hasta 30 mg/kg/infusión, entonces la respuesta que es mantenida por la cocaína no se restituye y se acaba la administración propia de cocaína, permaneciendo la curva de dosis respuesta de la cocaína plana, cerca del cero semejante a los niveles que corresponden a la disolución salina.

La administración propia de cocaína, puede inhibirse también por administración pasiva del anticuerpo anticocaína. Se administró a grupos separados de ratas anticuerpo monoclonal anticocaína o anticuerpo control. Los animales que habían sido previamente estabilizados en un programa FR5:F15 de administración de cocaína acabaron su administración propia de cocaína cuando se les trató de manera pasiva con anticuerpos anticocaína. Las ratas tratadas con el anticuerpo control mantuvieron sus respuestas de administración propia de cocaína.

Ejemplo 17 Cotratamiento con otras drogas

Se realizó un cribado para determinar si la terapia farmacológica con buprenorfina y/o desipramina aumentaba la actividad de la vacuna terapéutica. Es de esperar que los tratamientos con buprenorfina y/o desipramina sean compatibles. Resulta posible que los agentes terapéuticos puedan ser inmunosupresores, inhibiendo la inducción de una respuesta de alta titulación de anticuerpos anticocaína. Para estudiar esta posibilidad, se inmunizaron ratas con el conjugado cocaína-transportador en presencia o ausencia de buprenorfina o desipramina y se determinó la titulación de anticuerpo a diferentes tiempos. Una droga que resulte significativamente inmunosupresora se eliminará por ser una terapia incompatible. Este ensayo de cribado se utiliza para cualquier droga para la que se considere cotratamiento.

Si no se observa inmunosupresión, se lleva a cabo un cribado adicional para determinar si las dos aproximaciones son sinérgicas. Después del adiestramiento, de la inmunización y del ensayo, se evalúa adicionalmente a las ratas en los dos modelos en presencia de las drogas. Las ratas reciben drogas antes de las sesiones con diferentes dosis de cocaína. Se llevan a cabo experimentos iniciales con ratas control inmunizadas con el transportador para seleccionar una dosis de droga que no acabe completamente con el comportamiento en la administración propia o en los sistemas de discriminación de droga; se estima que esta dosis es de aproximadamente 5,6 mg/kg (-)-buprenorfina o de 10 mg/kg desipramina. Los datos se evalúan para determinar si la acción de la vacuna terapéutica es aditiva con el tratamiento con buprenorfina o desipramina.

Ejemplo 18 Inducción de respuesta mucosal

Se ha demostrado en muchos sistemas que la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) retiene la actividad de la toxina del cólera intacta, incluyendo la inducción de una respuesta de anticuerpo mucosal. Por lo tanto, este transportador debería incitar una fuerte respuesta de anticuerpo IgA anticocaína.

Un medio efectivo de producir una respuesta inmune en el tracto respiratorio es llevar el antígeno directamente a esa zona. El antígeno se administra en disolución salina, con CTB actuando como su propio adyuvante. Para confirmar la capacidad de CTB para incitar una respuesta de IgA mucosal, se llevaron a cabo experimentos iniciales únicamente con el transportador. Los ratones se indujeron con 50 \mug de CTB o con el conjugado cocaína-CTB por dos vías: nasal e intratraqueal. La administración nasal es una vía de inducción simple y común. El antígeno se aplica a cada ventana de la nariz de un ratón ligeramente anestesiado, en un volumen total de 50 \mul por ratón. Catorce días después de la inducción, se administró a los ratones dosis de refuerzo utilizando el mismo protocolo. La administración nasal se adapta fácilmente a la aplicación en seres humanos como un pulverizador nasal. La vacunación nasal se ha utilizado con éxito con vacunas de influenza vivos (Walker et al. (1994) Vaccine 12:387-399).

En la inmunización intratraqueal el antígeno se aplica directamente al tracto respiratorio bajo, aumentando de esta manera la inmunidad en los pulmones. Los ratones se anestesian con una mezcla de ketamina y xilazina. Los animales se ponen en un aparato que mantiene su boca abierta y expone la tráquea; la tráquea se visualiza con una sonda de luz de fibra óptica. Se utiliza una aguja sin filo de calibre 23 para administrar 50 \mul de disolución en los pulmones. Catorce días después de la inducción, se administró a los ratones dosis de refuerzo utilizando el mismo protocolo.

Los animales se sacrifican por asfixia con CO_{2} a diferentes tiempos después de las dosis de refuerzo (14, 21, ó 28 días) y se recogen los fluidos de lavado nasales y broncoalveolares y se ensaya la presencia de IgA específica para el conjugado administrado. El fluido de lavado nasal se obtiene por lavado (cuatro veces) de la cavidad nasal con un total de 1 ml de PBS como se ha descrito (Tamura et al. (1989) Vaccine 7:257-262). El fluido de lavado broncoalveolar se obtiene por exposición quirúrgica de la traquea, inyección de 0,5 ml de PBS en los pulmones y lavado (tres veces) como se ha descrito (Nedrud et al. (1987) J. Immunol. 139:3484-3492). Después de centrifugar para eliminar las células, las muestras se ensayaron para detectar IgA específica del antígeno mediante ELISA utilizando un segundo anticuerpo específico de IgA. La IgG específica de la cocaína se determina en los lavados nasales y de pulmón, porque se ha descrito que la IgG se detecta y resulta importante en el pulmón (Cahill et al. (1993) FEMS Microbiol. Lett. 107:211-216).

Se comparan directamente las dos vías de administración para estudiar su capacidad de incitar una respuesta IgA, tanto en el fluido de lavado nasal como en el de los pulmones. La ruta que sea más potente será la preferida y la utilizada en el resto de experimentos. Si la eficacia de las dos rutas resulta comparable, se prefiere la inmunización nasal por su simplicidad.

Para conseguir una protección máxima contra la cocaína, tanto la respuesta IgG sistémica como la IgA mucosal pueden ser máximizadas. Por lo tanto, se prefiere una inyección sistémica con el conjugado cocaína-CTB en alumbre (u otro adyuvante) y un pulso mucosal con el conjugado, a la inducción efectiva de los dos compartimentos. Se comparan tres grupos. Primero, los ratones se inducen sistémicamente, seguido de un pulso mucosal después de 14 días. Segundo, los ratones se inducen por vía mucosal, seguido de un pulso sistémico después de 14 días. Tercero, son inducidos al mismo tiempo tanto por vía sistémica como por vía mucosal seguido de la administración de dosis de refuerzo iguales después de 14 días. Los ratones control se inducen sólo por vía mucosal o sólo por vía sistémica. Se valora, en cada caso, la eficacia del pulso mediante la determinación de la titulación de los anticuerpos anticocaína IgG e IgA.

Como medida inicial de la eficacia de los anticuerpos anticocaína mucosales in vivo, se determina la DL_{50} para la cocaína administrada por vía mucosal. Se administran diferentes dosis de cocaína bien por vía intratraqueal o por vía intranasal a ratones anestesiados. Se comparan tres grupos de ratones en el experimento de DL_{50}: ratones sin inmunizar, ratones inmunizados sólo por vía sistémica y ratones inmunizados tanto por vía sistémica como por vía mucosal. La DL_{50} real de todos los grupos puede verse desviada por la anestesia (Tella et al. (1992) J. Pharm. Exper. Therap. 262:936-946). Esta aproximación también se puede proseguir en un modelo de primate no humano utilizando cocaína base fumada (Carrol et al. (1992) J. Pharm. Exper. Therap. 261:26-37).

Ejemplo 19 Inmunogenicidad de los conjugados cocaína-CTB A. Definición de la dosis requerida para la inmunogenicidad

La inmunogenicidad de los conjugados cocaína-CTB se determinó por inmunización de roedores con cocaína-CTB, dosis de refuerzo cuando resultara apropiado, y valoración de los niveles de anticuerpo a diferentes tiempos. Los niveles de anticuerpo se determinaron en un ELISA específico de antígeno. Las titulaciones de anticuerpo se determinaron como los valores inversos de la dilución de suero que produce un 50% de la respuesta máxima en el ELISA y se expresan como las medias geométricas de los resultados en 5 o más ratones.

Para determinar el intervalo de la dosis de antígeno requerido para incitar una respuesta de anticuerpo anticocaína, los ratones se inmunizaron bien subcutáneamente o intramuscularmente con diferentes dosis de cocaína-CTB PS-5,53. Se administraron dosis de refuerzo a los animales en los días 23 y 59 y se sangraron en el día 71. Las dosis de 3, 10, y 30 g administradas intramuscularmente indujeron titulaciones de IgG específicas de cocaína de 18.429, 29.013, y 22.957, respectivamente. Utilizando inmunización subcutánea, las mismas dosis indujeron titulaciones de anticuerpo específico de 10.097, 15.136, y 21.169. Estos datos demuestran que el conjugado cocaína-CTB puede ser utilizado de manera eficaz en el intervalo 3-30 g y que se espera que dosis más altas y más bajas sean eficaces. Dosis similares resultan también eficaces para ser utilizadas en ratas. Las personas especializadas en el tema utilizan estos datos para identificar las dosis óptimas en seres humanos, que normalmente son comparables.

B. Inmunización de superficies mucosas

Para generar respuestas óptimas de anticuerpo en las secreciones mucosas, es normalmente necesaria la inducción en una superficie mucosa. Para determinar si CTB es una proteína transportadora útil para la inducción de una respuesta de anticuerpo mucosal, se inmunizaron ratones intranasalmente o intratraquealmente. Los métodos para la inmunización intranasal e intratraqueal se describen en el Ejemplo 18. La inmunización intranasal con el conjugado cocaína-CTB indujo unos niveles significativos de IgG circulante específica de la cocaína, aunque las titulaciones fueron más bajas que las observadas después de la inmunización subcutánea o intramuscular. Como ocurre con las vías de administración descritas en la Parte A de este ejemplo, las dosis del conjugado cocaína-CTB de 3-30 g indujeron niveles significativos de anticuerpo específico de la cocaína. La inmunización simultánea por vía subcutánea e intranasal indujo unas titulaciones de anticuerpo iguales a las inducidas por vía subcutánea exclusivamente. Se valoró la viabilidad de la vía de inmunización intratraqueal mediante la inmunización con CTB exclusivamente. Se encontró que esta vía también inducía IgG específica del antígeno en el suero (en este caso específica de CTB). Estos datos demuestran que CTB es capaz de incitar una respuesta IgG sistémica específica del antígeno después de una inmunización en una superficie mucosa en ausencia de un adyuvante añadido.

C. Inducción de anticuerpos específicos de la cocaína en secreciones mucosas

Para maximizar la protección frente a las propiedades adictivas de la cocaína, es deseable optimizar los niveles del anticuerpo específico de la cocaína en los lugares de aplicación de la cocaína (por ejemplo, mucosa nasal y pulmonar) así como en la sangre. Se inmunizaron ratones intranasalmente o subcutáneamente con 10 g del conjugado cocaína-CTB y se les administraron dosis de refuerzo en los días 27 y 61 utilizando el mismo protocolo. Después de ser sacrificados el día 78, se recogieron los lavados bronquial y nasal como se describe en los Ejemplos y se ensayaron para determinar IgA e IgG específicas de la cocaína. Se detectaron anticuerpos anticocaína tanto en el lavado nasal como bronquial utilizando los dos regímenes de inmunización. La inmunización intranasal indujo unos niveles de IgA específica del antígeno mayores, mientras que las dos vías fueron comparables en su inducción de respuestas IgG anticocaína en las secreciones mucosas. La vía de administración intranasal también resultó la más efectiva en la inducción de IgA específica del antígeno en el suero. La inmunización intratraqueal con CTB también indujo IgA e IgG específicas de CTB en las secreciones respiratorias. Estos datos demuestran que CTB es una proteína transportadora eficaz para la inducción de una respuesta de anticuerpo específica del antígeno en el tracto respiratorio.

D. Utilización de alumbre como adyuvante para la inmunización

Normalmente la utilización de un adyuvante resulta beneficiosa en los protocolos de inmunización. Para valorar la contribución del alumbre en la respuesta inmune, se inmunizaron ratones intraperitonealmente con 10 g del conjugado cocaína-CTB PS-5,53 en disolución salina o adsorbido en alumbre. Se administró a los ratones dosis de refuerzo en el día 27 utilizando el mismo protocolo. En ambos grupos de animales se detectaron altos niveles de anticuerpos específicos de la cocaína en el día 43 (titulación de 14.687 en ausencia de alumbre y 16.775 en presencia de alumbre). También se ha demostrado que la inmunización con el conjugado cocaína-CTB adsorbido en alumbre es eficaz si es administrado por vía subcutánea o intramuscular. Por lo tanto, la utilización de alumbre con este antígeno resulta aceptable.

E. Duración de las respuestas de anticuerpo

Para determinar si las respuestas de anticuerpo inducidas con el conjugado cocaína-CTB PS-5,8 resultan duraderas, se evaluaron los niveles de anticuerpo en suero en función del tiempo. Los animales descritos en la sección D de este Ejemplo se estudiaron hasta el día 128 después de la inmunización. En este punto en el tiempo, las titulaciones de anticuerpo permanecían altas, siendo aproximadamente 2 veces más bajas que el pico del día 43. Estos datos demuestran que las respuestas de anticuerpo anticocaína contra el conjugado cocaína-CTB son duraderas.

F. Niveles relativos de la respuesta de anticuerpo antihapteno y antitransportador

La inmunización con el conjugado cocaína-CTB induce una respuesta de anticuerpo tanto contra el hapteno (cocaína) como contra el transportador (CTB). La CTB es un inmunógeno muy potente y es posible que la respuesta antiCTB pueda dominar, evitando que la respuesta anticocaína alcance unas titulaciones muy altas. Para determinar si es posible regular de manera diferencial las respuestas de anticuerpo anticocaína y antiCTB mediante un cambio en el régimen de inmunización, se llevó a cabo el ensayo no limitante siguiente. Se inmunizaron los ratones intramuscularmente con 30 g del conjugado cocaína-CTB y se evaluó la respuesta de anticuerpo. La inmunización indujo anticuerpos tanto anticocaína como antiCTB con una relación relativa de titulaciones de IgG en suero de 0,04. En contraste, se observó una relación de 0,2 cuando los ratones se inmunizaron con 3 g del conjugado cocaína-CTB. Las dosis de 3 g y 30 g produjeron titulaciones similares, 18.429 y 22.957, respectivamente. Resulta posible que la relación de anticuerpos anticocaína frente a anticuerpos antiCTB se vea también afectada por otros parámetros del régimen de inmunización así como por las propiedades inherentes al conjugado, como el grado de haptenación.

Ejemplo 20 Unión directa de la cocaína por anticuerpos de ratones inmunizados

Se puede valorar la capacidad de los anticuerpos para unir cocaína libre utilizando cocaína marcada radiactivamente. Se incubó ^{3}H-Cocaína (1 Ci) con suero de ratones normales (0,05 ml), con suero de ratones inmunizados con un conjugado PS-5,4 (conjugado con BSA) (0,05 ml, combinación del suero de 10 ratones) o con anticuerpos monoclonales anticocaína comerciales (mezcla de dos anticuerpos diferentes, 2 g de cada uno) (véase la Figura 10b). Se incluyeron en la incubación lechos recubiertos con proteína G que se une a la porción Fc de las moléculas de anticuerpo. Después de 2 horas, los lechos se sedimentaron por centrifugación, se lavaron tres veces con PBS frío y se contaron en un contador de centelleo. Los datos de la Figura 10b representan las medias y las desviaciones estándar de muestras en duplicado. Estos datos demuestran claramente que el suero inmune es capaz de unir cocaína libre con una afinidad lo suficientemente alta como para permitir que la cocaína unida sea precipitada y lavada. Esto es una evidencia de que estos anticuerpos serán capaces de unir y neutralizar a la cocaína en la circulación de los adictos a la cocaína.

Ejemplo 21 Especificidad de los anticuerpos específicos de la cocaína

Para analizar la especificidad de los anticuerpos anticocaína inducidos por la vacuna de la cocaína, se ensayaron los sueros de ratones inmunizados con el conjugado cocaína-CTB en un ELISA de competición. Se ensayó un conjunto de metabolitos de la cocaína y moléculas relacionadas a diferentes concentraciones. Si los anticuerpos tuvieran una alta afinidad por el metabolito, entonces concentraciones bajas serían capaces de competir de manera eficaz en este ensayo. La reactividad relativa se expresa como CI_{50}, la concentración del inhibidor que disminuye un 50% la señal en el ELISA. Utilizando este método se determinó que los anticuerpos producidos por la inmunización con el conjugado cocaína-BSA PS-5,6 reconocen tanto la norcocaína, el metabolito farmacológicamente activo de la cocaína, como el cocaetileno, el derivado activo de la cocaína producido por transesterificación después del consumo de alcohol. Por el contrario, los anticuerpos reconocían en baja medida los metabolitos farmacológicamente inactivos benzoilecgonina y éster metílico de ecgonina. Los anticuerpos inducidos por los conjugados cocaína-BSA PS-5,6 y cocaína-CTB PS-5,53 mostraron una especificidad similar, demostrando que la proteína transportadora no afecta la especificidad de los anticuerpos anticocaína. Se indujo un anticuerpo monoclonal altamente específico en un animal inmunizado con el conjugado cocaína-BSA que también mostraba una especificidad muy similar frente a la cocaína y sus metabolitos activos. La reactividad de este anticuerpo monoclonal fue 2.000 veces mayor hacia la cocaína que hacia la benzoilecgonina.

Ejemplo 22 Cuantificación del anticuerpo específico de la cocaína

Sin intención de limitar la invención, se describe un método para cuantificar directamente la capacidad de unión al antígeno y la afinidad de los anticuerpos específicos de antígeno obtenidos utilizando la vacuna de conjugado de cocaína. Se utiliza la técnica inmunológica clásica de diálisis de equilibrio. Los sueros inmunes inducidos por inmunización con el conjugado cocaína-BSA PS-5,6 y los antisueros control se colocaron en bolsas de diálisis (éster de celulosa, 25.000 MWCO, Spectrum, Los Angeles, CA) y se dializaron hasta el equilibrio frente a un gran volumen que contenía diferentes concentraciones de ^{3}H-cocaína en PBS. Esto permitió la determinación de la cantidad de cocaína unida al anticuerpo y la cantidad no unida. Los datos se analizaron representando la cantidad de cocaína unida en función de la cantidad de cocaína total y por representación de Scatchard (antígeno unido frente a antígeno unido/libre). Como era de esperar, los antisueros contenían una mezcla heterogénea de anticuerpos con afinidades que variaban desde 1 x 10^{7} hasta -1 x 10^{-10} M. La capacidad de unión a la cocaína fue de hasta aproximadamente 10 M, lo que indica una concentración de anticuerpo específico de antígeno de aproximadamente 0,7 mg/ml. Por lo tanto, la inmunización con la vacuna del conjugado de cocaína puede producir anticuerpos con un intervalo de afinidades de utilidad y con alta capacidad de unión a la cocaína, de manera que una proporción sustancial del anticuerpo total en circulación puede reaccionar con y neutralizar la cocaína.

Ejemplo 23 Eficacia del anticuerpo específico de la cocaína para inhibir la distribución de cocaína in vivo A. Inhibición de la distribución de cocaína al cerebro

Para evaluar los cambios producidos por el anticuerpo específico de la cocaína en la distribución de cocaína en los tejidos, se siguió la distribución de ^{3}H-cocaína en ratones inmunizados con el conjugado PS-5,7 cocaína-BSA y se comparó con ratones control inmunizados con BSA. Se inyectaron por vía intravenosa 0,5 mg/kg de ^{3}H-cocaína a los ratones inmunizados con el conjugado y a los ratones control y se les decapitó 0,5 minutos después de la inyección. Se extrajeron los cerebros, corazones y sangre (plasma) para análisis posteriores de la concentración de cocaína en tejidos y en plasma. La sangre se recogió en tubos que contenían una disolución de fluoruro sódico para inhibir esterasas y EDTA para evitar la coagulación. Las muestras de cerebro, corazón y plasma se pusieron en viales de centelleo que contenían un solubilizador de tejido; la digestión de las muestras se produce durante 3 días a temperatura ambiente. Las muestras se descoloraron y se añadió a cada muestra líquido de centelleo. Se añadió ácido acético glacial para clarificar las muestras. Después de contar las muestras en un contador de centelleo, los datos se convirtieron en ng/g o ng/ml de tejido. La concentración de cocaína en el tejido cerebral fue significativamente más baja (n = 10, p<,05) a 0,5 minutos después de la inyección (636,1 \pm 57,5 ng/g (media \pm ES) para los ratones inmunizados con el conjugado cocaína-BSA que para los ratones inmunizados con BSA (1.052,2 \pm 93,85 ng/g).

Se inyectaron a varios grupos de ratones 0,5 mg/kg de cocaína por vía intravenosa dos veces para determinar la capacidad del anticuerpo específico de la cocaína de inhibir la distribución de dosis repetidas de cocaína. Solamente la segunda dosis de cocaína, administrada 10 minutos después de la dosis inicial, incluía ^{3}H-cocaína. El anticuerpo inhibió la distribución de la redosis de cocaína al tejido cerebral en los ratones inmunizados con el conjugado cocaína-BSA (443,6 \pm 48,5 ng/g) comparado con los ratones inmunizados con BSA (948,9 \pm 43,3 ng/g (n = 10, p<,001)). De esta manera, la inhibición de la distribución de cocaína después de la segunda dosis de cocaína fue similar a la inhibición de la distribución después de una dosis.

B. Inhibición de la distribución al tejido cardíaco

Se anestesiaron ratones inmunes y ratones control y se les inyectaron por vía intravenosa 0,015 mg/kg de ^{3}H-cocaína y se decapitaron 0,5 minutos después de la inyección. Se extrajeron los cerebros, corazones y sangre (plasma) para análisis posteriores de la concentración de cocaína. La concentración de cocaína en el tejido cardíaco en ratones inmunizados con el conjugado cocaína-BSA (5,7 \pm 0,78 ng/g) fue significativamente más baja que la de los ratones inmunizados con BSA (23,4 \pm 4,6 ng/g (n = 5, p<,001)). La inhibición de la distribución de cocaína al tejido cardíaco en ratones inmunizados con cocaína fue igual o mayor que la inhibición de la distribución de cocaína al tejido cerebral.

C. Inhibición de la distribución tisular de cocaína después de administración intranasal

Se compararon los efectos del anticuerpo específico de la cocaína después de la administración intranasal de cocaína con los efectos después de la administración intravenosa de cocaína. En la administración intranasal la cinética de distribución es diferente que en la administración intravenosa. Se anestesiaron ratones inmunizados y control y se les administró intranasalmente 1 mg/kg de ^{3}H-cocaína en 50 l de PBS. Los niveles de cocaína no alcanzaron el máximo hasta 2-5 minutos después de la administración intranasal comparado con el máximo a los 15 segundos de la inyección intravenosa. Por lo tanto, los ratones se decapitaron dos minutos después de la inyección de cocaína y se extrajeron los cerebros y sangre (plasma) para análisis posteriores de la concentración de cocaína. Comparando la administración intranasal de cocaína con la administración intravenosa, los niveles totales de cocaína en los cerebros de los ratones control son prácticamente iguales (1.538 ng/g intranasal frente a 2.260 ng/g intravenoso).

La distribución de cocaína al cerebro después de la administración intranasal de cocaína resultó inhibida por la presencia de anticuerpo anticocaína. Se determinó una inhibición significativa de la distribución de cocaína al cerebro después de la administración intranasal de cocaína a ratones inmunizados con el conjugado cocaína-BSA (708,3 \pm 82,8 ng/g) comparado con los ratones control (1538,1 \pm 49,5 ng/g (n = 5, p<,0001)).

D. Titulación de anticuerpo

Se compararon ratones con diferentes niveles de anticuerpo específico de cocaína para determinar como afecta la titulación de anticuerpo al grado de inhibición de la distribución de cocaína. Los grupos de ratones inmunizados en este estudio alcanzaron niveles de titulación que variaban entre 6.000 y 256.000. Se administraron 0,015 mg/kg de ^{3}H-cocaína a los ratones que presentaban una titulación baja (de aproximadamente 6.000 a 18.000) o una titulación alta (de aproximadamente 54.000 a 256.000) del anticuerpo anticocaína. Treinta segundos después de la inyección intravenosa, los ratones se decapitaron y se extrajeron muestras de los cerebros y de la sangre (plasma) para análisis de la distribución de cocaína.

Los ratones con titulaciones altas de anticuerpo inhibieron la distribución de cocaína al cerebro significativamente (ratones control: 26,1 \pm 2,0 ng/g, ratones inmunizados con cocaína: 8,9 \pm 1,2 ng/g; n = 10, p<,0001). Por el contrario, los ratones con titulaciones bajas mostraron una capacidad reducida de inhibir la distribución al cerebro (ratones control: 24,4 \pm 2,98 ng/g, ratones inmunizados con cocaína: 15,7 \pm 3,4 ng/g).

E. Metabolismo de la cocaína

Para determinar si el anticuerpo específico de la cocaína modifica el metabolismo de la cocaína in vivo, se analizaron en el tiempo los metabolitos de la cocaína en ratones inmunizados con cocaína y en ratones control. Las muestras de plasma ensayadas se obtuvieron como en los experimentos con animales descritos y realizados en la Parte A de este Ejemplo. El tiempo en el que se determinó la composición de metabolitos fue 30 minutos. El método de preparación del plasma para el análisis es el descrito en la Parte A anterior.

Las muestras de plasma se alicuotaron y se añadió cocaína no radiactiva, benzoilecgonina y norcocaína con el fin de ayudar en la visualización UV de los compuestos. Las muestras se aplicaron entonces a placas CCF de sílice que se revelaron en dos sistemas de disolventes: metanol, cloroformo, y trietilamina (3:1:0,1); y etilacetato, metanol, agua, y amoniaco concentrado (85:10:3:1). Los metabolitos se identificaron por referencia con compuestos control aplicados en las mismas placas. Las bandas se rasparon de las placas y los compuestos que contenían ^{3}H se detectaron por contaje de centelleo. De las cuentas obtenidas se determinó la cantidad de cocaína, benzoilecgonina, ácido benzoico y norcocaína como tanto por ciento del total de cuentas. La radiactividad total en el plasma se determinó por contaje de centelleo del plasma total. El ácido benzoico se detecta como un metabolito cuando la cocaína se degrada a éster metílico de ecgonina y ácido benzoico, por lo que es equimolar con el metabolito éster metílico de ecgonina.

Los anticuerpos anticocaína parecen no tener un efecto detectable en el metabolismo de la cocaína in vivo. Después de 30 minutos los metabolitos encontrados son los siguientes, expresados como tanto por ciento del total:

Metabolito	Inmunes Coc-BSA	Control BSA
Cocaína	19,66 \pm 7,5	17,31 \pm 3,7
Norcocaína	5,5 \pm 0,93	3,6 \pm 0,93
Ácido Benzoico	47,51 \pm 8,5	50,28 \pm 4,4
Benzoilecgonina	27,3 \pm 0,6	29 \pm 7,2

F. Desaparición de la cocaína del plasma

Para determinar si el anticuerpo específico de cocaína cambia la velocidad de desaparición de la cocaína del plasma, se analizaron muestras de plasma recogidas a diferentes tiempos después de inyectar cocaína a animales inmunizados con el conjugado cocaína-BSA y a animales inmunizados con BSA. Se inyectó a los ratones inmunizados y control 1 mg/kg de ^{3}H-cocaína por vía intravenosa y se decapitaron a los 0,5, 5 ó 30 minutos después de la inyección. Se extrajeron los cerebros y la sangre (plasma) para análisis posterior de la concentración de cocaína en cerebro y en plasma, del tanto por ciento de cocaína unida al anticuerpo y para cuantificar por CCF la concentración de cocaína y los metabolitos de la cocaína en plasma.

El plasma se analizó, como se describe en la Parte E más arriba, para determinar el porcentaje de la radiactividad total en la forma de cocaína y cualquiera de sus metabolitos. Las muestras de plasma también se analizaron para determinar el total de radiactividad. La velocidad de desaparición de la cocaína del plasma de los ratones inmunizados con el conjugado cocaína-BSA se comparó con la velocidad de desaparición de la cocaína del plasma de los ratones inmunizados con BSA. En este análisis, se consideró la pequeña fracción de norcocaína (menor del 5%) con la cocaína al presentar la norcocaína actividad en el SNC y unirse al anticuerpo. Este hecho no modifica los resultados descritos más adelante.

La cocaína desaparece del plasma de ambos grupos de animales a velocidades similares. Entre 30 segundos y 30 minutos, alrededor del 80% de la cocaína ha desaparecido del plasma de ambos grupos de animales. La desaparición de la cocaína del plasma a esos tiempos después de la inyección se debe tanto a la redistribución como al metabolismo. Aunque la cocaína desaparece a la misma velocidad en los dos grupos de animales, hay más cocaína en el plasma de los ratones inmunizados con el conjugado cocaína-BSA que en el plasma de los ratones inmunizados con BSA a todos los tiempos. La presencia del anticuerpo específco de la cocaína no modifica de manera detectable la duración de la cocaína.

G. Porcentaje de cocaína unida al anticuerpo

La inhibición de la distribución mostrada más arriba es posible si la cocaína se encuentra unida al anticuerpo en el mismo animal. Para determinar el grado de unión de la cocaína al anticuerpo en plasma, se inyectó a ratones inmunizados y control 1 mg/kg de ^{3}H-cocaína por vía intravenosa y se decapitaron a los 0,5 minutos después de la inyección. Se extrajo la sangre (plasma) y se utilizaron lechos de proteína G para capturar los complejos anticuerpo-cocaína. Los lechos de proteína G se añadieron al plasma de un animal inyectado con ^{3}H- cocaína (con NaF para inhibir la degradación de la cocaína) y se incubaron. Después de aclarar, cada volumen de aclarado y los lechos se añadieron a líquido de centelleo. La ^{3}H-cocaína se detectó por contaje de centelleo. Se analizó el mismo plasma para determinar la degradación de la cocaína como en el ensayo de metabolismo (Parte E) más arriba. Como los anticuerpos producidos después de la inmunización con el conjugado cocaína-BSA se unen a la cocaína y a la norcocaína, pero no a los otros metabolitos principales, como se demuestra en los Ejemplos, se calculó el porcentaje de unión en base a la cantidad de cocaína y norcocaína hallada en la muestra de plasma.

En los animales inmunizados con el conjugado cocaína-BSA, una media de aproximadamente 50% de cocaína en la muestra de plasma estaba unida al anticuerpo. Esto se compara con los animales inmunizados con BSA en los que el 3% de la cocaína estaba unida al anticuerpo. Este 3% representa la línea base en el ensayo.

H. Cocaína-CTB hapteno transportador induce un anticuerpo eficaz

Se inyectó el conjugado cocaína-CTB PS-5,53 a ratones para determinar su capacidad de incitar anticuerpos que alteren la distribución de cocaína. Se inyectó CTB a grupos de ratones control. Se administraron a los ratones dosis de refuerzo de los conjugados cocaína-CTB PS-5,53 y PS-5,70 según lo que se necesite, hasta que las titulaciones de anticuerpo sean alrededor de 54.000 o mayores. Los métodos utilizados para la inmunización y el ensayo de las titulaciones de anticuerpo específico de la cocaína se describen en los Ejemplos. Se inyectaron con 0,5 mg/kg de ^{3}H-cocaína ratones con titulaciones de anticuerpo específico de la cocaína y ratones control y se decapitaron 30 segundos después de la inyección. Se aisló tejido cerebral y plasma y se analizaron para determinar el contenido de ^{3}H-cocaína como se dsecribe en la parte A de este Ejemplo.

El anticuerpo producido después de la inmunización con el conjugado cocaína-CTB inhibía la distribución de cocaína al cerebro de manera significativa. Se encontró una cantidad significativamente menor de cocaína en el tejido cerebral de ratones inmunizados con el conjugado CTB-cocaína que en el de ratones inmunizados con CTB (678,8 ng/g comparado con 885,4 ng/g, n = 6, p = 0,0004 test de Student para dos colas). De la misma manera, la cocaína se retuvo en mayor cantidad en el plasma de ratones inmunizados con el conjugado cocaína-CTB que en el de ratones inmunizados con CTB. Por lo tanto, el conjugado cocaína-CTB resulta eficaz para generar anticuerpo que inhibirá la distribución de cocaína al cerebro.

Ejemplo 24 Transferencia pasiva de inmunoglobulina inmune a ratones

Los ratones se inmunizan con el conjugado PS-5-CTB utilizando regímenes de inmunización óptimos como se describe en los Ejemplos. A diferentes tiempos, los animales se sangran y se evalúan las titulaciones de anticuerpo anticocaína por ELISA. Los animales con titulaciones de anticuerpo de aproximadamente 54.000 o mayores se sacrifican y se sangran por punción cardíaca. Los ratones control se inmunizan únicamente con la proteína transportadora. Los sueros de varios ratones (al menos 20) se juntan y se aisla la fracción IgG por precipitación con sulfato amónico. Después de diálisis para eliminar el sulfato amónico, se cuantifica por ELISA el nivel del anticuerpo específico de la cocaína en la fracción de inmunoglobulina. Se administran i.p. o i.v. diferentes cantidades de inmunoglobulina a ratones sin inmunizar. Después de 24 horas, los ratones se sangran y se ensaya el suero para determinar el nivel del anticuerpo específico de la cocaína. Utilizando este método, se determina la cantidad de anticuerpo que debe ser transferida para alcanzar una determinada titulación. Se administra a grupos de ratones inmunoglobulina inmune y se sangran en diferentes períodos de tiempo para determinar la velocidad de desaparición del anticuerpo específico del antígeno. A otros grupos de ratones se les administra cocaína radiactiva, como se describe en los Ejemplos, y se determina la distribución de cocaína al cerebro. Los ratones control reciben IgG de los ratones inmunizados con el transportador. Estos experimentos demuestran la capacidad de la inmunoglobulina inmune transferida pasivamente de inhibir la entrada de cocaína en el cerebro.

Ejemplo 25 Transferencia pasiva de inmunoglobulina inmune a seres humanos

Se inmuniza un conjunto de donantes humanos con el conjugado PS-5-CTB o con otros conjugados de la invención utilizando regímenes de inmunización óptimos como se describe en los Ejemplos. A diferentes tiempos, los donantes se sangran por punción venosa y se ensayan las titulaciones del anticuerpo anticocaína por ELISA. Se junta el plasma hiperinmune de varios donantes y se aisla la fracción IgG por fraccionamiento con alcohol frío. La preparación de anticuerpo se tampona, se estabiliza, se conserva y se estandariza según lo requerido para preparaciones de anticuerpo hiperinmunes para uso en seres humanos. Se estandariza la cantidad de anticuerpo anticocaína por ELISA o por otros ensayos basados en anticuerpos.

Se administra intramuscular o intravenosamente una dosis apropiada del anticuerpo purificado a pacientes con o sin la vacuna cocaína-CTB, que se administra en otro sitio anatómico distinto al de la administración de la vacuna. La dosis apropiada se determina ensayando los niveles séricos de los receptores en una población de pacientes experimental por ELISA o por otro ensayo basado en anticuerpos a las 24 horas o a otro tiempo apropiado después de la inyección de la preparación hiperinmune de anticuerpo y/o ensayando la eficacia de diferentes dosis para inhibir los efectos de la cocaína.

La globulina inmune transferida pasivamente inhibe los efectos de la cocaína en los pacientes. La utilización de donantes humanos, de anticuerpo policlonal, y de un gran número de donantes limita la posibilidad de una respuesta inmune de los pacientes al anticuerpo transferido. Esto demuestra que el conjugado cocaína-CTB induce anticuerpos en un conjunto de donantes que pueden ser utilizados para inmunizar pasivamente a pacientes contra los efectos de la cocaína.

Equivalentes

Las personas especializadas en el tema, podrán identificar, o ser capaces de descubrir, únicamente a través de la experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a las sustancias específicas y a los procedimientos descritos en la presente memoria. Estos equivalentes se consideran dentro del ámbito de esta invención, y son abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (10)

1. Utilización de: un conjugado terapéutico hapteno-transportador que comprende (a) al menos un hapteno derivado de la cocaína y (b) un transportador que contiene una proteína, cuyo transportador contiene al menos un epítopo de célula T y es seleccionado de:

productos bacterianos, subunidades víricas, lectinas, antígeno de la proteína de la malaria, péptidos multi-antigénicos sintéticos y modificaciones, análogos y derivados de éstos, y alergenos proteicos y derivados, fragmentos y análogos de alergenos;

siendo dicho conjugado terapéutico hapteno-transportador capaz de incitar anticuerpos anticocaína cuando se utiliza para la vacunación de sujetos; en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de drogadicción en un ser humano.

2. Utilización de un conjugado hapteno-transportador de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el transportador es un derivado de una toxina bacteriana.

3. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la mencionada preparación farmacéutica comprende un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico.

4. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la mencionada preparación farmacéutica puede ser administrada por vía mucosal y comprende microesferas de copolímero, opcionalmente de copolímero poli(láctido-coglicólido).

5. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la mencionada preparación farmacéutica es una preparación de liberación sostenida o dirigida.

6. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la mencionada preparación farmacéutica está liofilizada.

7. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la mencionada preparación farmacéutica puede ser administrada tópicamente y cuya preparación tiene opcionalmente una viscosidad dinámica mayor que la del agua.

8. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la mencionada preparación farmacéutica es una preparación en aerosol pulverizable y que comprende, opcionalmente, un propelente gaseoso volátil.

9. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la mencionada preparación farmacéutica consta de un adyuvante, opcionalmente hidróxido de aluminio.

10. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que se acoplan al menos dos haptenos y hasta 70 haptenos a la proteína transportadora.