ES2210528T3 - Plantas de la familia compositae resistentes a los afidos. - Google Patents
Plantas de la familia compositae resistentes a los afidos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A PLANTAS DE LA FAMILIA COMPOSITAE, QUE SON RESISTENTES A LOS AFIDOS NASONOVIA RIBISNIGRI, GRACIAS A LA PRESENCIA, EN EL GENOMA, DEL GEN DE RESISTENCIA NR, CARACTERIZADO PORQUE LA INFORMACION GENETICA RESPONSABLE DEL FENOTIPO CRA SE ENCUENTRA AUSENTE DEL GENOMA DE LA PLANTA AL MENOS HASTA EL PUNTO DE QUE EL FENOTIPO DEL CRA NO SE EXPRESA. LAS PLANTAS SON, POR EJEMPLO, LECHUGAS DEL GENERO LACTUCA, EN PARTICULAR LA L. SATIVA L., Y PUEDE OBTENERSE POR SELECCION DE UNA PLANTA MADRE QUE ES HETEROCIGOTA PARA LA RESISTENCIA NR, FABRICACION DE UNA POBLACION SEPARADA, PRODUCCION DE UNA PROGENIE DE PRACTICAMENTE CADA PLANTA DE LA POBLACION SEGREGADA, PRUEBA DE LA PROGENIE PARA RESISTENCIA Y FENOTIPO CRA, SELECCION DE UNA ADECUADA PROGENIE DE PLANTAS QUE O SON RESISTENTES O NO TIENEN EL FENOTIPO CRA, PRODUCIENDOSE SEMILLAS DE ESTAS PLANTAS A TRAVES DE AUTO - POLINACION Y CULTIVANDO LA PROGENIE DE ESTA SEMILLA A FIN DE OBTENER UNA LINEA, PROBANDOSE LA LINEA PARA DETERMINAR SU RESISTENCIA Y FENOTIPO CRA Y ELIGIENDOSE LAS QUE SON UNIFORMEMENTE RESISTENTES Y TIENEN UNIFORMEMENTE UN FENOTIPO NO - CRA.
Description
Plantas de la familia compositae resistentes a
los áfidos.
La presente invención se refiere a nuevas plantas
de la familia Compositae, en particular a plantas de lechuga
del género Lactuca que son resistentes al áfido Nasonovia
ribisnigri y que muestran en la presente invención caracteres
agronómicamente deseables.
Los áfidos causan mucho daño a los cultivos de
vegetales. Se alimentan de los floemas de las plantas y por lo tanto
causan un crecimiento reducido o anormal. Los áfidos vivos o los
restos de áfidos hacen que el producto recolectado sea invendible.
Además, la melaza, un líquido azucarado secretado por los áfidos,
forma una capa pegajosa sobre las hojas. Se teme grandemente a los
áfidos, no sólo por su daño directo, sino también porque propagan
enfermedades víricas.
Nasonovia ribisnigri es la especie de
áfido que en Europa se encuentra más frecuentemente en las lechugas
cultivadas en el campo. N. ribisnigri es particularmente
dañino porque prefiere alimentarse de las hojas jóvenes de la
planta. Los áfidos por lo tanto quedan atrapados fácilmente en las
cabezas que se cierran de las lechugas, haciendo difícil que sean
alcanzados por los pesticidas. Especialmente en las lechugas de tipo
cabeza crujiente (crisphead), que forman una cabeza compacta,
esto causa grandes problemas. Los agricultores limitan el daño
causado por los áfidos pulverizando pesticidas repetidamente sobre
los cultivos en crecimiento, en particular cuando las condiciones
meteorológicas son favorables para la reproducción de los áfidos. El
uso de cantidades excesivas de pesticida es indeseable desde un
punto de vista medioambiental. Además, los pesticidas yerran su
objetivo en casos particulares, como se ha descrito anteriormente,
por ejemplo, en el caso de las cabezas que se cierran de las
lechugas.
La resistencia de las plantas sobre las que
actúan los áfidos (resistencia de la planta anfitriona) es una
alternativa respetuosa para el medio ambiente al uso de pesticidas
para controlar el desarrollo de áfidos en, por ejemplo, lechugas.
Por lo tanto, se ha realizado ya una extensa investigación sobre la
resistencia a N. ribisnigri y sobre la herencia de este tipo
de resistencia. Se describió una resistencia parcial a N.
ribisnigri para algunas variedades cultivadas de lechuga (Dunn,
J.A. y Kempton, D.P.H. (1980) Tests of Agrochemical and Cultivars,
Nº 1, (Ann, appl. Biol. 94, Supplement): 58-59). Se
encontró un resistencia casi completa a N. ribisnigri en la
variedad de Lactuca silvestre L. virosa L. (Eenink
A.H. y F.L. Dieleman (1983) Euphytica 32:691-695).
Se encontró que esta resistencia a Nasonovia en L.
virosa era causada por un único gen dominante, denominado gen
Nr.
En 1981, el antiguo Institute for
Horticultural Plant Breeding (IVT, ahora parte del
CPRO-DLO) de Wageningen liberó plantas de L.
sativa que contenían en su genoma un fragmento de cromosoma de
L. virosa que tenía el gen Nr para resistencia a N.
ribisnigri. Estas plantas resultaron de un programa de
hibridación con L. virosa y L. sativa, en el que se
usó L. serriola como especie puente. Se usa una especie
puente cuando dos especies pueden cruzarse la una con la otra
solamente en un grado limitado, como fue el caso de L. virosa
y L. sativa.
Las plantas liberadas eran de un tipo indeseable
con respecto al fenotipo y los caracteres agronómicos (de hojas
sueltas, malas características de cultivo).
Debido a los caracteres agronómicos indeseables,
estas plantas se usaron por compañías de reproducción como
parentales de hibridación con el propósito de obtener plantas
mediante recombinación y selección genéticas, que combinaran
resistencia a N. ribisnigri con buenos caracteres
agronómicos.
L. sativa es una especie anual pero,
cuando se cultiva bajo luz artificial a una temperatura aumentada,
pueden producirse 2-5 generaciones sucesivas en un
año. Los procedimientos de retrocruzamiento son métodos conocidos y
adecuados para cruzar genes a partir de un "parental donante"
en una base genética con un alto valor agronómico. En general, la
introgresión de un gen dominante en un fenotipo agronómicamente
aceptable puede lograrse mediante 3-5
retrocruzamientos, seguido de 2-3
autopolinizaciones. Por lo tanto, se requieren 5-8
generaciones en 3-5 años para obtener plantas
agronómicamente aceptables que tengan en su genoma el gen deseado.
Sin embargo, aunque en 1981 ya se liberaron para compañías de
semillas plantas que tenían en gen Nr en 1981, no se ha
informado hasta ahora todavía de la transferencia exitosa del gen
Nr a plantas de lechuga agronómicamente aceptables.
Es ahora el objeto de la presente invención
proporcionar plantas de la familia Compositae, y en
particular nuevas plantas de lechuga, que combinan resistencia a los
áfidos de la especie Nasonovia ribisnigri con buenos
caracteres agronómicos.
Este objeto se logra conforme a la invención, por
cuanto se encontró en el curso de un programa de selección que la
aplicación de esta resistencia en plantas de lechuga que tenían
buenas características agronómicas fue impedida por los efectos
secundarios negativos causados por el fragmento de cromosoma de
L. virosa, en el que estaba situado el gen Nr, cuando
se insertó en un genoma de L. sativa. Comparadas con plantas
cultivadas de lechuga sin la resistencia a N. ribisnigri, las
plantas que eran homocigóticas respecto al gen Nr mostraron
de hecho un crecimiento reducido, un color verde más claro y una
degradación acelerada de la clorofila en las hojas más antiguas de
la planta generativa (cuando la planta está floreciendo). Esto dio
como resultado plantas generativas que tenían completa o
parcialmente blancas las hojas más antiguas y/o una altura de la
planta reducida. Este fenotipo agronómicamente no deseado se
designará adicionalmente en esta solicitud como "fenotipo CER",
que significa "crecimiento Compacto y Envejecimiento
Rápido". La figura 1 proporciona un ejemplo de la
diferencia entre plantas normales de lechuga y plantas con CER. En
la etapa vegetativa los síntomas de CER son particularmente
evidentes cuando las plantas crecen bajo tensión (por ejemplo, a
baja temperatura).
La invención proporciona por lo tanto plantas que
tienen el gen de resistencia Nr en el genoma, en las que la
información genética responsable del fenotipo CER está ausente del
genoma de la planta al menos hasta tal grado que no se expresa el
fenotipo CER.
La presente invención está basada en la
revelación que el fenotipo CER no es un resultado del propio gen
Nr, sino más bien de la información genética de la proximidad
del gen de resistencia. Conforme a la invención, se ha encontrado
por lo tanto que hay una conexión entre la resistencia y el fenotipo
CER. Rompiendo esta conexión, es posible cultivar plantas
resistentes y agronómicamente aceptables. Se ha encontrado por otra
parte en la bibliografía y en la propia investigación que otros
caracteres de L. virosa están a menudo asociados con el
fenotipo CER cuando están cruzados en otras plantas. Maxon Smith y
Langton (The Grower, 21/9/1989 p 54-55) describen
una conexión entre el crecimiento compacto y resistencia a Bremia
lactucae, introgresada a partir de L.virosa en lechugas
cultivadas. La presente invención proporciona también una solución
para esto, ahora que se ha encontrado que el fenotipo CER está
ligado genéticamente al carácter deseado. El fenotipo CER es un
carácter recesivo que se expresa solamente en plantas con
resistencia homocigótica.
Una vez que se hubo obtenido esta revelación, fue
posible seleccionar plantas en las que la información genética para
el fenotipo CER estaba retirada de la proximidad del gen Nr o
cambiada hasta un grado tal que la resistencia ya no estaba
expresada en combinación con el fenotipo CER. El gen de resistencia
Nr está descrito en esta solicitud a modo de ejemplo, pero el
principio de la invención también se aplica, desde luego, a otros
caracteres ligados a CER que se tienen su origen en L.
virosa.
La retirada o cambio de la información genética
que da como resultado el fenotipo CER es causada mediante
evento(s) de recombinación en la proximidad del gen. En este
momento no está completamente claro si la información del CER está
situada hacia la izquierda o hacia la derecha del gen, o alrededor
de él. Cuando la información genética para el fenotipo CER está
situada en ambos lados del gen de resistencia, se cambian o retiran
preferiblemente ambas partes de esta información genética. Conforme
a esta invención, preferiblemente al final se seleccionarán plantas
en las que se han verificado dos o más eventos de recombinación. Tal
doble evento de recombinación no necesita desde luego haberse
verificado en una generación, sino que los eventos de recombinación
de generaciones sucesivas pueden dar también como resultado la
retirada o cambio final de la información genética en ambos lados
del gen de resistencia. Si la información de CER está situada
solamente en un lado del gen, es desde luego suficiente un único
evento de recombinación.
En esta solicitud, se entiende que un "evento
de recombinación" significa un entrecruzamiento meiótico.
Las plantas sin fenotipo CER pueden obtenerse por
medio de técnicas convencionales de hibridación. Una condición es,
sin embargo, que se use el criterio correcto de selección. Conforme
a la invención, se ha definido ahora un criterio adecuado de
selección, es decir, la completa o parcial ausencia o inactividad de
un fragmento de información genética de la proximidad del gen de
resistencia. Conforme a la invención, no es relevante qué cantidad
de la información genética que rodea al gen de resistencia está
ausente de un producto recombinante o de qué manera el gen CER o los
genes CER esté o estén desactivados, con tal que el fenotipo CER
esté ausente de la planta y su progenie.
Para encontrar plantas en las que se haya
verificado la recombinación entre el gen Nr y genes que
causan el fenotipo CER, en la práctica se escrutan poblaciones
segregantes, o progenies de tales poblaciones, en busca de plantas
que tengan un fenotipo recombinante, es decir, resistencia
homocigótica a N. ribisnigri en combinación con un fenotipo
no CER. Aunque es posible encontrar de esta manera productos
recombinantes adecuados, como puede verse en los ejemplos, hay sin
embargo varias razones por las que puede complicarse encontrar
productos recombinantes agronómicamente valiosos.
En el programa de selección para combinar
resistencia con buenas características agronómicas, se ha encontrado
que las plantas que combinan resistencia a N. ribisnigri con
un fenotipo agronómicamente valioso son casi siempre no el resultado
de recombinación en un cromosoma, sino que son heterocigóticas
respecto al fragmento de cromosoma de L. virosa introgresado.
Conforme a la invención, se ha encontrado que el fenotipo CER se
hereda recesivamente. Debido a que el gen Nr es dominante,
una planta con una única copia del fragmento de cromosoma de L.
virosa combinará resistencia con un fenotipo normal (no CER). La
progenie de tales plantas segregará sin embargo para el fenotipo CER
y no pueden usarse comercialmente, porque las variedades de lechuga
comerciales son líneas puras que deben ajustarse a requisitos
estrictos de uniformidad genética para ponerse en circulación. Se ha
encontrado además que, debido a que la expresión de la resistencia
es una característica biológica que depende de diferentes
condiciones ambientales y experimentales, una cierta fracción de las
plantas, en un ensayo de resistencia a N. ribisnigri, es a
menudo clasificada incorrectamente. Plantas con el gen Nr se
consideran sensibles y plantas sin el gen Nr se puntúan como
resistentes. Lo mismo se aplica cuando se puntúa el fenotipo CER de
plantas individuales en el campo o en el invernadero. Dependiendo de
las condiciones experimentales y ambientales, una cierta fracción de
las plantas con el fragmento de cromosoma de L. virosa
insertado se considerarán normales en estado homocigótico, mientras
que varias plantas en las que el fragmento de cromosoma insertado
está presente en estado heterocigótico o está totalmente ausente,
podrían mostrar síntomas que den como resultado una clasificación
errónea del fenotipo CER.
A pesar de las dificultades que pueden ocurrir
descritas anteriormente, será evidente en los ejemplos que la
selección de las plantas deseadas en las que la información genética
para el fenotipo CER esté ausente es mucho más posible de la manera
convencional. Esta manera de selección requiere sin embargo una
población segregante relativamente grande o un gran número de
hibridaciones.
Por lo tanto, puede ser más eficaz usar
herramientas de biología molecular en la selección de plantas
adecuadas. Una técnica excepcionalmente útil es la técnica AFLP
(polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados), como
se describe por Vos, P. et al., en Nucleic Acids Research,
1995, Vol. 23, Nº 21: 4407-4414. Cuando se aplica a
la presente invención, esta técnica está basada en cartografiar
marcadores de ADN que están ligados genéticamente al gen
Nr,después de lo cual se puede determinar de una manera
relativamente sencilla si se ha producido un evento de recombinación
en la proximidad del gen Nr, en una progenie de un
experimento de hibridación. Cuando un marcador ligado se pierde, se
ha verificado (por lo tanto) un entrecruzamiento entre el gen
Nr y ese marcador. Eligiendo marcadores a diversas distancias
del gen puede determinarse también si ha desaparecido mucho o poco
de la proximidad del gen. La progenie en la que están ausentes uno o
más de los marcadores ligados carece por lo tanto de al menos un
fragmento de la proximidad no deseada del gen, y tiene por lo tanto
una probabilidad superior al promedio de que un cromosoma con el gen
Nr esté presente, en el que la información genética que
produce el fenotipo CER esté ausente. La eficacia de la selección de
plantas que combinan que sean homocigóticas respecto al gen
Nr con ausencia del fenotipo CER puede aumentarse
significativamente con marcadores moleculares.
La cartografía de marcadores genéticos en la
proximidad de un gen es un procedimiento que puede llevarse a cabo
bastante fácilmente por los biólogos moleculares de habilidad media,
y que está descrito, por ejemplo, por Lefebvre, V. y A.M. Chevre, en
Tools for marking plant disease and pest resistance genes: a
rewiew. Agronomie 15, 1995 (1): 3-19; por
Michelmore, R.W. en Molecular approaches to manipulation of
disease resistance genes. Annual Review of Phytopathology 33
(1995): 393-427; por Michelmore, R.W., R.V. Kesseli
y E.J. Ryder, Genetic mapping in lettuce. En: R.L. Phillips
& I.K. Vasil (eds.) DNA-based markers in
plants, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 1994, pp.
223-239; por Winter, P. y G. Kahl en Molecular
marker technologies for plant improvement. World Journal of
Microbiology & Biotechnology, 1995, 11 (4):
438-448. Se puede encontrar información general
sobre la tecnología AFLP en Vos, P. et al. (supra). En el
ejemplo 2, se elucidará con más detalle el uso de la tecnología AFLP
para seleccionar plantas conforme a la invención.
La presente invención se ilustra en esta
solicitud con referencia a la lechuga cultivada Lactuca
sativa. Será evidente para las personas expertas que los
principios de la invención son aplicables igualmente a otras
especies del género Lactuca, y más generalmente a plantas de
la familia Compositae. La referencia a L. sativa no
debe, por lo tanto, interpretarse como una limitación de la
invención.
Conforme a la presente invención, el gen de
resistencia tiene su origen preferiblemente en L. virosa. Las
plantas conforme a la invención son, desde luego, de manera
sustancial completamente fértiles y homocigóticas respecto al gen de
resistencia. Debido a la ausencia de la base genética que produce el
fenotipo CER, muestran sustancialmente un crecimiento no reducido,
coloración verde de las hojas no reducida y una degradación de la
clorofila no prematura cuando las plantas están en la fase
generativa.
Se entiende que las expresiones "lechuga
cultivada" o "plantas de lechuga cultivadas" significan
lechuga que es adecuada para el consumo y cumple con los requisitos
para el cultivo comercial. Además de las propias plantas de lechuga,
y sus partes adecuadas para el consumo, tales como las cabezas u
hojas, la invención comprende partes o derivados de la planta
adecuados para propagación. Ejemplos de partes adecuadas para
propagación son tejidos orgánicos, tales como hojas, tallos, raíces,
vástagos y similares, protoplastos, embriones somáticos, anteras,
pecíolos, células en cultivo y similares. Los derivados adecuados
para propagación son, por ejemplo, las semillas. Las plantas
conforme a la invención pueden cultivarse o propagarse de la manera
convencional, pero también por medio de técnicas de cultivo de
tejidos de partes de la planta.
Las plantas conforme a la invención, que se
caracterizan por la ausencia de un fenotipo CER en presencia del gen
Nr en estado homocigótico, pueden usarse para transferir la
resistencia a N. ribisnigri a otros tipos de lechuga
agronómicamente valiosos. Esto se verifica, por ejemplo, por medio
de procedimientos normales de retrocruzamiento en busca de un gen
dominante (véase Briggs, F.N. y P.F. Knowles (1967) en:
Principles of plant breeding, pp. 162-167),
seguido de autopolinización de las plantas durante al menos dos
generaciones y la selección de líneas que sean homocigóticas
respecto al gen de resistencia.
En etapas particulares del programa de selección,
se usan polinizaciones cruzadas. Sin embargo, la polinización
cruzada de plantas autopolinizantes requiere que se impida la
autofertilización en la planta que se usa como el parental femenino.
Esto puede lograrse retirando manualmente las partes masculinas de
los órganos reproductores. Esto puede llevarse a cabo mediante su
retirada física o por medio de agentes químicos y/o el uso de agua
sobre las flores. Todos estos métodos de retirar o convertir en
disfuncionales las partes masculinas de los órganos reproductores
son bien conocidos en la técnica. La progenie de una hibridación
puede conseguirse provocando que el parental femenino de la
hibridación produzca semillas, recogiendo la semilla F1 o de
retrocruzamiento y sembrándola para obtener nuevas plantas. Las
plantas F1 pueden autopolinizarse para producir la generación F2 o
retrocruzarse con el parental recurrente de un esquema de
retrocruzamiento. Las plantas retrocruzadas pueden retrocruzarse
adicionalmente con el parental recurrente para mejorar el valor
agronómico de las plantas en una generación posterior o pueden
autopolinizarse para producir plantas que sean homocigóticas
respecto al gen Nr.
En una primera realización específica, la
invención proporciona plantas de L. sativa L. de la línea RZ
96.85123, cuya obtención se explica con más detalle en el ejemplo 2.
Las plantas de esta línea son homocigóticas respecto al gen
Nr y carecen de la información genética que causa el fenotipo
CER. Tales plantas no son pequeñas y/o no son amarillas, como las
plantas con CER. Cuando las plantas no son pequeñas y/o no son
amarillas, se ha perdido bastante de la información genética que
causa el fenotipo CER, o esta información genética está
suficientemente desactivada. Para ilustrar la invención, se
depositaron semillas de las plantas RZ 96.85123 en las National
Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB) con
el número 40804, el 16 de mayo de 1996. Se impuso la condición que
hasta la fecha de concesión de una patente, solamente se pudieran
expedir muestras de las semillas depositadas a una persona
experta.
En otra realización específica, la invención
proporciona el resultado del método de hibridación convencional, y
el esquema específico de selección como se describe en el ejemplo 1,
en forma de plantas de la línea RZ 96.75906. Estas plantas son
igualmente homocigóticas respecto al gen Nr y carecen de la
información genética que causa el fenotipo CER. Para ilustrar la
invención, se depositaron semillas de las plantas RZ 96.75906 en las
NCIMB con el número 40803, el 16 de mayo de 1996.
La invención se refiere además a un método para
obtener plantas conforme a la invención, que comprende seleccionar
una planta parental que sea heterocigótica respecto a la resistencia
Nr, fabricar un población segregante, producir una progenie
de sustancialmente cada planta de la población segregante, y
examinar la progenie en busca de resistencia y del fenotipo CER. Una
población segregante puede ser producida de diferentes maneras,
tales como mediante autopolinización de la planta parental
heterocigótica, mediante cruzamiento de la planta parental
heterocigótica con una planta resistente y mediante la aplicación de
una técnica de dobles haploides a la planta parental heterocigótica.
En la técnica de dobles haploides, se cultivan nuevas plantas a
partir de gametos dobles de una planta. Los gametos pueden tener su
origen en los órganos reproductores masculinos (androgénesis) o en
los órganos reproductores femeninos (ginogénesis). El cultivo de
dobles haploides requiere usualmente una etapa in vitro. La
ventaja de los dobles haploides en la búsqueda de productos
recombinantes es que los gametos a partir de los que tienen su
origen las plantas resultan de una recombinación meiótica en la
planta parental heterocigótica, mientras que los dobles haploides
resultantes son completamente homocigóticos, de modo que se evitan
los efectos enmascaradores de la heterocigosis.
En plantas obtenidas por medio de la técnica de
dobles haploides, puede reconocerse inmediatamente el producto
recombinante deseado: una planta con resistencia y sin CER. En las
líneas obtenidas mediante autopolinización de plantas de una
población segregante, pueden reconocerse las líneas que tienen las
plantas recombinantes deseadas por cuanto la línea es uniformemente
resistente pero todavía segrega para CER, o por cuanto la línea
todavía segrega para la resistencia pero tiene uniformemente un
fenotipo normal, o por cuanto la línea es uniformemente resistente y
tiene uniformemente un fenotipo normal.
La eficacia de dicho método puede aumentarse
significativamente cuando, antes de producir una progenie de
sustancialmente cada planta, se verifica un preensayo sobre plantas
en las que se ha producido un evento deseado de recombinación. Tal
preensayo puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando métodos de
biología molecular, tales como la técnica AFLP. La selección
conforme a la técnica AFLP está basada en detectar eventos de
recombinación en la proximidad del locus del gen Nr en el
genoma de plantas de la población segregante.
La presente invención se elucidará con más
detalle con referencia a los ejemplos adjuntos, que se dan solamente
a modo de ilustración, y no se pretende que limiten la invención de
ningún modo.
Las técnicas usadas para obtener las plantas
conforme a la invención están descritas muy generalmente a
continuación. Los detalles específicos de los experimentos llevados
a cabo se examinarán con más detalle en los ejemplos.
La resistencia a N. ribisnigri puede
demostrarse cultivando una población de plantas e inoculando cada
planta con un cierto número de áfidos N. ribisnigri (por
ejemplo, 15). La resistencia se demuestra cuando después de un
cierto periodo de ensayo (por ejemplo, 7 días) el número de áfidos
sobre la planta es 0 o inferior al número original, mientras que
sobre las plantas sensibles el número de áfidos por planta ha
aumentado después del periodo de ensayo.
Las plantas de una variedad sensible se incluyen
en el ensayo como testigos. Los áfidos deben multiplicarse
claramente sobre estas plantas testigo para que el ensayo sea
aceptado como fiable. El ensayo se lleva preferiblemente a cabo a
una temperatura entre 18 y 24ºC, y a una duración mínima del día de
14 horas. Se usan preferiblemente plantas pequeñas en la fase
vegetativa con aproximadamente de 1 a 3 hojas verdaderas, para
inoculación con individuos de N. ribisnigri, aunque también
pueden usarse plantas más viejas en el ensayo de resistencia. La
resistencia a N. ribisnigri no se observa solamente bajo las
condiciones de ensayo, sino que puede verse igualmente en el campo o
en el invernadero.
Los áfidos usados en el ensayo de resistencia
fueron de un biotipo rojo designado como WN1 y pueden obtenerse en
el departamento de entomología de la Agricultural University de
Wageningen. Antes del ensayo, se hicieron crecer sobre plantas de
lechuga. También pueden usarse, desde luego, áfidos de color verde.
Los ensayos de resistencia se llevaron a cabo con semillas que se
sembraron en bloques de abono puestos en tiestos. Los áfidos se
transfirieron a las plantas jóvenes de lechuga cuatro semanas
después de la siembra.
Para la primera hibridación, se usa un parental
que es homocigótico respecto a la resistencia a N. ribisnigri
y que muestra los caracteres agronómicamente indeseables de un
crecimiento reducido, una coloración verde reducida y/o una
degradación temprana de la clorofila en la fase generativa. La otra
planta es una planta que no es resistente a N. ribisnigri y
que no muestra los caracteres agronómicamente indeseables indicados
anteriormente.
Las plantas F1 obtenidas mediante hibridación
pueden retrocruzarse con el parental recurrente (sensible a N.
ribisnigri) (u otra planta sensible a N. ribisnigri), y/o
pueden cultivarse hasta la generación F2 mediante autopolinización.
Las plantas así resultantes BC1 (retrocruzadas) o F2 pueden
igualmente cultivarse hasta la siguiente generación por medio de
autopolinización o pueden usarse de nuevo como parental de
hibridación. Detectar plantas con un evento de recombinación cercano
al locus del gen Nr que proporciona resistencia, usando la
técnica AFLP u otra técnica de marcadores moleculares, puede
verificarse eficazmente en una población que segrega para el gen
Nr. Ésta puede ser una población obtenida mediante
autopolinización de una planta heterocigótica (véase el ejemplo 2),
o una población obtenida mediante retrocruzamiento de una planta
heterocigótica, preferiblemente con una planta de la línea parental
resistente. La selección fenotípica para recombinación entre
resistencia a N. ribisnigri y fenotipo CER puede verificarse
eficazmente con una población de líneas consanguíneas de plantas de
una población que segrega para el gen Nr.
Se entiende en la presente invención que una
línea significa un grupo de semillas o plantas obtenidas mediante
autopolinización de una única planta.
El aumento de la eficacia de la selección a
través del uso de marcadores moleculares se logra por cuanto puede
llevarse a cabo una preselección con marcadores. Solamente la
progenie de plantas en la que se ha demostrado, usando marcadores,
que se ha verificado un evento de recombinación en la proximidad del
locus Nr se ensayan posteriormente más a fondo en busca de
resistencia y de la presencia del fenotipo CER.
Puede encontrarse rotura de la conexión entre
resistencia y el fenotipo CER en una población de líneas (estén o no
preseleccionadas con marcadores) ensayando varias plantas por línea
(por ejemplo, 25) en busca de resistencia a N. ribisnigri, y
ensayando la misma planta o plantas diferentes (por ejemplo, 25), en
busca del fenotipo CER. Sobre la base de estos dos ensayos, puede
clasificarse cada línea por carácter, dentro de las siguientes
categorías:
Resistencia:
- a)
- uniformemente resistente
- b)
- que segrega en plantas resistentes y sensibles
- c)
- uniformemente sensible
Fenotipo CER:
- a)
- fenotipo uniformemente CER
- b)
- que segrega en plantas con fenotipo CER y plantas con fenotipo normal
- c)
- fenotipo uniformemente normal
Las plantas recombinantes, que son homocigóticas
respecto al gen Nr sin tener el fenotipo CER, pueden
encontrarse:
1) En líneas que son uniformemente resistentes a
N. ribisnigri y de las que no todas las plantas tienen el
fenotipo CER, y
2) En líneas que tienen uniformemente un fenotipo
normal y de las que no todas la plantas son sensibles a N.
ribisnigri.
En el primer caso, las plantas sin el tipo CER se
seleccionan para producción de semillas. La progenie de
autopolinización de estas plantas seleccionadas se ensaya de nuevo
en busca de resistencia y de fenotipo CER, y se conservan las líneas
que son uniformemente resistentes y que tienen uniformemente un
fenotipo normal (no CER).
En el segundo caso, las plantas resistentes se
seleccionan para producción de semillas. La progenie de
autopolinización de estas plantas seleccionadas se ensaya de nuevo
en busca de resistencia y de fenotipo CER, y se conservan las líneas
que son uniformemente resistentes y que tienen uniformemente un
fenotipo normal (no CER).
Se recoge para ensayar un pequeño fragmento de
hoja (por ejemplo, 50 mg) de cada planta, y se extrae ADN. Para
llevar a cabo un estudio de la conexión entre marcadores AFLP y el
gen Nr, también debe ensayarse cada planta de la que se toma
una muestra en busca de resistencia a N. ribisnigri, lo que
puede verificarse conforme al procedimiento anterior. La detección
de AFLP u otros marcadores moleculares ligados al gen Nr,
puede verificarse comparando el patrón de los marcadores de plantas
individuales resistentes o sensibles o mezclando ADN de grupos de
plantas sensibles o resistentes (denominados "agrupamientos") y
comparando los patrones de los marcadores de estos agrupamientos.
Sobre la base de los patrones de los marcadores de plantas
individuales de una población segregante, los marcadores ligados al
gen Nr pueden ordenarse posteriormente en un mapa de
marcadores, indicando la distancia genética mutuamente entre los
marcadores, y entre los marcadores y el gen Nr. Los métodos
para detectar el grado de conexión genética mutuamente entre los
marcadores, y entre los marcadores y un carácter monogénico son
métodos normales en la técnica y se describen en muchos manuales. El
software para ordenadores para llevar a cabo estos estudios
de conexión está disponible generalmente (por ejemplo, el programa
"Joinmap", distribuido por el CPRO-DLO
en Wageningen).
Con un grupo de marcadores ligados estrechamente
al locus Nr, las plantas pueden detectarse con uno o más
eventos de recombinación en la proximidad del locus Nr. Las
plantas con un evento de recombinación se caracterizan en que una
proporción de los marcadores ligados al gen Nr están
reemplazados por marcadores del parental sensible con fenotipo
normal (no CER).
El desarrollo de marcadores y las determinaciones
de marcadores para este proyecto se llevaron a cabo por Keygene NV,
Agro Business Park 90, Post box 216, 6700 AE, Wageningen. Solamente
se usó la técnica AFLP desarrollada y patentada por Keygene. Para
los detalles de la técnica AFLP, se hace referencia en AFLP: a
new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research,
1995, 23 (21): 4407-4414, por P. Vos et
al.
La técnica AFLP es ahora suministrada por varios
suministradores, y está disponible para la persona de habilidad
media. Para la persona de habilidad media, la detección de
marcadores ligados estrechamente a un gen se ha convertido por esa
razón en un asunto de rutina, en la medida en que están disponibles
poblaciones adecuadas de plantas. Será evidente para la persona de
habilidad media que eligiendo enzimas de restricción y cebadores
pueden ser generados muchos marcadores AFLP diferentes que estén
ligados a un cierto gen, y que para generar un grupo de marcadores
ligados estrechamente con el objeto de detectar una recombinación
meiótica en la proximidad de un locus, no es de una importancia
esencial qué marcadores ligados estrechamente se usen para este
propósito. Solamente es decisivo el número de marcadores usados, más
la distribución sobre el fragmento de cromosoma en el que se desea
detectar la recombinación.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo 1 pasa a página
siguiente)
\newpage
Se obtuvieron plantas de L. sativa L.
conforme a la invención, conforme al esquema siguiente:
Se cruzó una planta de la línea IVT 793202, una
de las líneas con el gen Nr, liberada en 1981 por el antiguo
Institute for Horticultural Plant Breeding (IVT) de
Wageningen, con una planta de la propia selección de los inventores,
de tipo lechuga de cabeza crujiente (crisphead), con
resistencia completa a la enfermedad del mildiu causada por
Bremia lactucae (BC2 (Calona x donante R18)). La semilla F1
de este cruzamiento se sembró y se propagó hasta F2. Se ensayaron
las plantas F2 en busca de resistencia a N. ribisnigri y en
cuanto a su morfología, y se cruzó una planta F2 resistente
seleccionada con una planta de tipo Saladin con resistencia completa
a B. lactucae (BC2 ("Saladin RZ" x donante R18)). Se
examinaron las plantas F1 de este cruzamiento en busca de
resistencia a N. ribisnigri, y se retrocruzaron con una
planta de tipo "Saladin RZ". Las plantas F1 de este cruzamiento
se examinaron en busca de resistencia a N. ribisnigri y se
cruzaron de nuevo con una planta de tipo "Saladin RZ". La
semilla F1 de este cruzamiento se sembró y se propagó hasta F2. Las
plantas F2 se examinaron en busca de resistencia a N.
ribisnigri y en cuanto a su morfología, y una planta F2
resistente seleccionada del tipo lechuga de cabeza crujiente
(crisphead) se propagó hasta la línea F3. Las líneas F3 se
ensayaron una vez más en busca de resistencia y de fenotipo, y una
planta F3 seleccionada del tipo lechuga de cabeza crujiente
(crisphead) se cruzó con una planta del tipo "Saladin Quick
RZ". La generación F1 de este cruzamiento se examinó en busca de
resistencia a N. ribisnigri y se propagó hasta F2. Se
ensayaron plantas de las generaciones F2, F3 y F4 que tenían su
origen en una planta F1 de esta hibridación, en busca de resistencia
a N. ribisnigri y de fenotipo. Se encontró que plantas F2 y
F3 seleccionadas que combinaban resistencia con un fenotipo no CER
deseado, fueron siempre heterocigóticas respecto al gen Nr.
Sin embargo, en la generación F4 de este cruzamiento, se encontró
finalmente una línea que era uniforme respecto al fenotipo normal
(lechuga de cabeza crujiente (crisphead)), es decir, no
mostraba síntomas de CER y además todavía segregaba para resistencia
a N. ribisnigri. Se produjeron semillas de varias plantas de
esta línea F4. Se encontró que la progenie de unas cuantas de estas
plantas F4 (entre otras, la línea RZ 96.75906) ya no segregaba para
resistencia a N. ribisnigri, y por lo tanto, combinaba que
era homocigótica respecto al gen Nr con un fenotipo
agronómicamente valioso, debido a la ausencia de síntomas de
CER.
Debe observarse aquí que el ejemplo descrito en
la presente invención proporciona la historia del desarrollo y
genealogía de plantas conforme a la invención. De ningún modo
muestra todas las generaciones producidas que tienen su origen en
esta serie de hibridaciones, sino solamente las generaciones de las
que las plantas de la invención son progenie en línea directa. Se
han examinado más ramas del esquema de hibridación y selección
anterior, todas sin embargo sin el resultado final deseado, es
decir, plantas homocigóticas y resistentes a N. ribisnigri
sin síntomas de CER.
Se obtuvieron plantas de L. sativa L.
conforme a la invención, partiendo de un único cruzamiento para
obtener un híbrido entre una planta de la línea resistente a N.
ribisnigri IVT 793202 expedida por el antiguo Institute for
Horticultural Plant Breeding y una planta de la variedad de
lechuga de cabeza mantecosa (butterhead) "Ultra RZ". Se
produjeron semillas de una planta F1 de este cruzamiento. Las
semillas F2 de este cruzamiento se sembraron y se produjeron
semillas F3 de varias plantas.
Se ensayaron luego 140 plantas de este
cruzamiento en busca de resistencia, de una línea F3 que segregaba
para resistencia (que tenía su origen en una planta F2
heterocigótica respecto al gen Nr). De las plantas ensayadas,
95 fueron resistentes y 32 sensibles, mientras que en 3 plantas no
se obtuvo una puntuación clara de resistencia. De las plantas F3 sin
una puntuación clara de resistencia, se recogió material de las
hojas para un análisis de ADN. El punto de partida para la detección
de los marcadores AFLP ligados al gen Nr fue en primer lugar
un grupo de ensayos de ADN de 5 líneas de lechugas resistentes (que
incluían la línea donante resistente IVT 793202), 3 líneas sensibles
(que incluían Ultra RZ), 2 mezclas ("agrupamientos") de ADN de
variedades sensibles a N. ribisnigri y 44 individuos de la
línea F3 mencionada anteriormente de la hibridación entre IVT 793202
y Ultra RZ. En este estudio preliminar, se identificó un marcador
AFLP co-dominante que estaba ligado completamente al
gen de resistencia en el grupo de 44 plantas. Con este marcador
co-dominante pueden distinguirse las plantas con
resistencia homocigótica y heterocigótica.
Con el marcador AFLP co-dominante
mencionado anteriormente, se examinaron posteriormente un total de
121 plantas F3 de la hibridación entre IVT 793202 y Ultra RZ. De
este modo fue posible diferenciar las plantas F3 en 35 con
resistencia homocigótica, 60 con resistencia heterocigótica y 26
sensibles. Los ADN de las plantas con resistencia homocigótica y de
las plantas con sensibilidad homocigótica se agruparon
separadamente. De estos agrupamientos "resistentes" y
"sensibles" se prepararon 96 patrones de AFLP. Esto produjo
aproximadamente 4300 bandas AFLP, de las cuales 110 estaban ligadas
al gen Nr y 25 al alelo sensible en este locus. Se eligieron
de aquí 19 marcadores AFLP para usar para el escrutinio de la
recombinación en la proximidad del gen Nr. De estos 19
marcadores, 14 estaban ligados al gen Nr que produce la
resistencia y 5 al alelo "sensible".
Sobre la base del ensayo con el marcador AFLP
co-dominante indicado anteriormente, se
identificaron dos plantas F3 que eran heterocigóticas respecto al
gen Nr. De las semillas F4 que produjeron esas plantas, se
sembraron 800 plantas por línea F4. Se tomaron muestras de material
de las hojas de estas plantas y se aisló el ADN. Se usó ADN de un
total final de 1575 plantas F4 para escrutar la recombinación para
los marcadores, con los 19 marcadores AFLP elegidos. El resultado de
la primera determinación fue que se obtuvo un indicio de
recombinación para los marcadores para 206 plantas. Estas 206
plantas se ensayaron una vez más para los 19 marcadores APLF. Esto
dio finalmente como resultado una confirmación de un evento de
recombinación en la proximidad del locus Nr para 162
plantas.
Se cultivaron semillas F5 de las 1575 plantas de
las que se tomaron muestras. Se obtuvieron semillas F5 de 89 de las
162 plantas identificadas como recombinantes para los marcadores
sobre la base del análisis AFLP. Las 89 líneas F5 que resultaron de
aquí se ensayaron en busca de resistencia a N. ribisnigri y
de fenotipo. En estos ensayos, se encontró una línea (94.85338) que
ya no segregaba para resistencia (y tenía por lo tanto resistencia
homocigótica respecto al gen Nr), pero que todavía segregaba
para el fenotipo CER. Se analizaron de nuevo 50 plantas de la
semilla número 94.85338 con varios marcadores AFLP. Después de un
análisis con 22 marcadores AFLP ligados al gen Nr, se
encontró que una de estas plantas era recombinante de manera
homocigótica para 12 de los 22 marcadores. Se recuperaron semillas
F6 (línea 95.85051) de esta planta. Se ensayó una vez más esta línea
en busca de fenotipo y de resistencia, y de nuevo se encontró que
todas las plantas de esta línea eran resistentes a N.
ribisnigri y todas las plantas de esta línea tenían un fenotipo
normal, es decir, no CER.
Se cultivaron semillas F7 de 11 plantas de la
línea 95.85051. Esto dio como resultado, entre otras, la semilla
número 96.85123, que fue depositada.
Las dos líneas recombinantes RZ 96.85123 y RZ
96.75906, y algunas líneas testigo, se ensayaron para 21 marcadores
AFLP, los cuales, conforme a estudios previos de AFLP, se acoplaban
al alelo de resistencia (marcadores cis). Los marcadores se
desarrollaron sobre el cruzamiento IVT 793202 x Ultra. La secuencia
más probable de los diversos marcadores en el genoma de la lechuga
era también conocida de una investigación previa. Los genotipos
ensayados fueron:
1. IVT 793202 (línea liberada, resistencia a
Nasonovia + CSV)
2. Ultra (BOTERSLARAS sensible a
Nasonovia, no CSV)
3. Saladin (variedad de lechuga iceberg
sensible a Nasonovia, no CSV)
4. RZ 96.85123 (línea recombinante resistente a
Nasonovia del ejemplo 2, no CSV)
5. RZ 96.75906 (línea recombinante resistente a
Nasonovia del ejemplo 1, no CSV)
Los resultados con los marcadores están listados
en la tabla siguiente:
Resultados con marcadores AFLP de 5 líneas de
lechuga ensayadas para 21 marcadores AFLP acoplados al alelo de
resistencia (marcadores cis), presentados en la secuencia intermedia
más probable del genoma.
De la tabla 1, se sigue que tres marcadores cis
(N^{os} 3, 7 y 15) son también positivos en la variedad de lechuga
iceberg "Saladin" y de este modo no son polimórficos
entre esta variedad sensible a Nasonovia y el área de
introgresión de L. virosa en IVT 793202. De las puntuaciones
de los restantes marcadores, se sigue que las líneas recombinantes
96.85123 y 96.75906 corresponden a la parte izquierda del área de
introgresión. En ambas líneas ha habido una recombinación entre los
marcadores 12 y 13: a la izquierda del marcador 13 ambas líneas
carecen de los marcadores cis. Por lo tanto es muy probable que el
gen o genes que codifican CSV estén situados a la izquierda del
marcador 13 en el fragmento de introgresión de L. virosa. La
línea 96.75096 se diferencia de la otra línea recombinante en que la
línea 96.75906 está también separada en el lado derecho: entre los
marcadores N^{os} 15 y 16 ha habido una recombinación, la línea
96.750906 carece de los marcadores cis a la derecha del marcador 15.
De esto puede concluirse que el gen de resistencia a
Nasonovia está situado en alguna parte entre los marcadores
N^{os} 12 y 16.
Claims (14)
1. Plantas de la familia Compositae que
son resistentes al áfido Nasonovia ribisnigri debido a la
presencia en el genoma del gen de resistencia Nr,
caracterizadas porque la información genética responsable del
fenotipo CER está ausente del genoma de la planta, al menos hasta
tal grado que no se expresa el fenotipo CER.
2. Plantas conforme a la reivindicación 1,
caracterizadas porque el gen de resistencia Nr está
presente de manera homocigótica.
3. Plantas conforme a la reivindicación 1 ó 2,
caracterizadas porque las plantas son plantas de lechuga del
género Lactuca, en particular L. sativa L.
4. Plantas conforme a la reivindicación 1, 2 ó 3,
obtenibles mediante las siguientes etapas de:
a) seleccionar una planta parental que sea
heterocigótica respecto a la resistencia Nr.
b) fabricar una población segregante,
c) producir una progenie de sustancialmente cada
planta de la población segregante,
d) ensayar la progenie en busca de resistencia y
de fenotipo CER,
e) seleccionar, a partir de una progenie
adecuada, plantas que sean o resistentes o que no tengan el fenotipo
CER,
f) producir semillas de estas plantas mediante
autopolinización, y cultivar la progenie de estas semillas para
obtener una línea, y
g) ensayar la línea en busca de resistencia y de
fenotipo CER, y seleccionar líneas que sean uniformemente
resistentes y que tengan uniformemente un fenotipo no CER.
5. Plantas conforme a la reivindicación 4,
caracterizadas porque la población segregante está producida
mediante autopolinización de la planta parental, mediante
cruzamiento de la planta parental con una planta resistente o
mediante una técnica de dobles haploides.
6. Plantas conforme a la reivindicación 4 ó 5,
caracterizadas porque la progenie adecuada de la etapa e) es
una de la que las plantas o son uniformemente resistentes a N.
ribisnigri y no todas tienen el fenotipo CER o no tienen
uniformemente el fenotipo CER y no son todas sensibles a N.
ribisnigri.
7. Plantas conforme a la reivindicación 4 ó 5,
caracterizadas porque la progenie adecuada de la etapa e) es
una de la que las plantas son tanto uniformemente resistentes a
N. ribisnigri como no poseedoras uniformemente del fenotipo
CER, en cuyo caso se omiten las etapas f) y g).
8. Plantas conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 4-7, caracterizadas porque
el ensayo en la etapa d) está basado en la ausencia de un fenotipo
CER visible para el ojo.
9. Plantas conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 4-8, caracterizadas porque
antes de la etapa c), por medio de técnicas de biología molecular,
se hace una preselección de plantas en las que se ha verificado un
evento de recombinación entre la información genética de la
resistencia y la información genética del fenotipo CER.
10. Plantas conforme a la reivindicación 9,
caracterizadas porque las técnicas de biología molecular
están formadas por la técnica AFLP.
11. Una progenie de plantas conforme a cualquiera
de las reivindicaciones 1-10, obtenida de manera
generativa o vegetativa.
12. Partes o derivados de plantas conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que son
adecuadas para propagación, tales como tejidos orgánicos, tales como
hojas, tallos, raíces, vástagos y similares, protoplastos, embriones
somáticos, anteras, pecíolos, células en cultivo, semillas y
similares.
13. Partes o derivados de plantas conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que son
adecuadas para el consumo, tales como cabezas u hojas.
\newpage
14. Un método para obtener plantas conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que
comprende las etapas especificadas en las reivindicaciones
4-10.
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