ES2210832T3 - Secuencias de aminoacidos para uso terapeutico y profilactico contra enfermedades debidas a las toxinas de clostridium difficile. - Google Patents

Secuencias de aminoacidos para uso terapeutico y profilactico contra enfermedades debidas a las toxinas de clostridium difficile.

Info

Publication number
ES2210832T3
ES2210832T3 ES98951374T ES98951374T ES2210832T3 ES 2210832 T3 ES2210832 T3 ES 2210832T3 ES 98951374 T ES98951374 T ES 98951374T ES 98951374 T ES98951374 T ES 98951374T ES 2210832 T3 ES2210832 T3 ES 2210832T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
seq
sequence
antibody
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES98951374T
Other languages
English (en)
Inventor
Christoph Von Eichel-Streiber
Michael Moos
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Application granted granted Critical
Publication of ES2210832T3 publication Critical patent/ES2210832T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/13—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales capaces de reconocer y neutralizar epítopos del dominio de ligando, el dominio de translocación o el dominio catalítico de la enterotoxina (toxina A) y la citotoxina (toxina B) de Clostridium difficile, así como a su producción y aplicaciones terapéuticas y profilácticas en enfermedades debidas a las citadas toxinas.

Description

Secuencias de aminoácidos para uso terapéutico y profiláctico contra enfermedades debidas a las toxinas de Clostridium difficile.
El objeto de la invención son las secuencias de aminoácidos (péptidos) que neutralizan el efecto de la enterotoxina de Clostridium difficile. Además, hay una descripción de las regiones variables e hipervariables de estos anticuerpos.
Se sabe que la introducción de antibióticos macrólidos tales como clindamicina conduce a la enfermedad intestinal severa, la cual se manifiesta como diarrea, que se desarrolla más hasta la ocasionalmente fatal colitis pseudomenbranosa (PMC). Esta conexión proporcionó a la enfermedad el nombre "diarrea asociada a clindamicina". Ahora conocemos que casi todos los antibióticos y agentes citostáticos usados en medicina pueden provocar los síntomas clínicos de la PMC.
La PMC se caracteriza clínicamente por diarrea severa que puede conducir a la muerte debido a cuantiosas pérdidas de electrolitos y líquido. Tiene lugar, dependiendo de la severidad de los síntomas, dolor abdominal, diarrea sangrante, fiebre, y leucocitosis. El tratamiento ha consistido hasta ahora en cesar la administración del antibiótico que causa la enfermedad, mediante la administración de vancomicina, de la misma manera que compensando las pérdidas de líquido y electrolito.
El agente etiológico de la colitis pseudomembranosa fue durante largo tiempo desconocido. Sólo en 1977 se pudo demostrar la hasta entonces desconocida actividad tóxica en un espécimen de deposición, que indujo un efecto citotóxico en las células CHO (células de carcinoma de ovario de hámster chino). A través de investigaciones adicionales se pudo probar finalmente que la colitis pseudomembranosa era causada por Clostridium difficile y sus toxinas.
Clostridium difficile es una bacteria anaerobia obligada gram-positiva con forma de varilla que construye esporas ovales subterminales. Se caracteriza bioquímicamente por ser capaz de fermentar monosacáridos tales como glucosa, N-acetilglucosamina y ácido N-acetilneuramínico, pero no manosa, xilosa o arabinosa. Clostridium difficile también es incapaz de separar estos monosacáridos de las cadenas laterales de la mucina gastrointestinal, ya que enzimas tales como neuraminidasa, beta-galactosidasa o sialidasa faltan. Debido a estos defectos bioquímicos, Clostridium difficile no puede prosperar en el estómago de individuos sanos. Si se desequilibra la flora intestinal por la administración de antibióticos o agentes citostáticos, Clostridium difficile deja atrás la flora intestinal, lo que conduce a la PMC.
Clostridium difficile produce dos factores principales de patogenicidad, la enterotoxina (toxina A) y la citotoxina (toxina B). Su producción, purificación y propiedades, conjuntamente con su uso para producir anticuerpos monoclonales se describen en detalle en las patentes europeas153, 519 y 209.273, en las patentes de los Estados Unidos 4.879.218 y 5.098.826 igual que la solicitud de patente internacional WO 91/18.293.
Los anticuerpos juegan claramente una parte importante en proteger contra las consecuencias de la infección por Clostridium difficile. Las titulaciones de anticuerpos contra la toxina A y la toxina B se pueden establecer en pacientes que sufren de PMC. Después del tratamiento con antibióticos y la infección con las cepas generadoras de toxinas de Clostridium difficile, los hámsters desarrollan los síntomas de la PMC y mueren de ellos. La inmunización anterior de los animales con las enzimas mencionadas anteriormente en este documento protege después contra la enfermedad. Las toxinas se pueden neutralizar mediante anticuerpos, los cuales se dirigen contra los dominios ligandos C-terminales repetitivos, el dominio central de translocación o el dominio N-terminal catalítico (véase la referencia [1] de la bibliografía relativa a la estructura de los dominios). Los anticuerpos dirigidos dirigen contra los dominios ligandos C-terminales repetitivos impiden la unión de las toxinas a sus receptores celulares, los anticuerpos dirigidos contra el dominio N-terminal catalítico bloquean la reacción de glucoxilación transmitida por las toxinas, mientras que los anticuerpos dirigidos contra el dominio central de translocación del dominio catalítico N-terminal reprimen la translocación de las toxinas al interior de la célula.
Los anticuerpos que neutralizan la toxina A y/o la toxina B ofrecen así una posible terapia y/o profilaxis para las enfermedades causadas por Clostridium difficile en las cuales no eliminan a la bacteria pero bloquean la acción de las toxinas producidas. De esta manera el desarrollo de los síntomas de la enfermedad puede impedirse mediante la acción sobre las toxinas responsables.
Tomando como ejemplo la toxina A, la línea celular DSM ACC 2322 produce un anticuerpo TTC8, el cual no sólo se une a la toxina A, sino que es también capaz de neutralizar su acción biológica. El sitio de unión del TTC8 en la toxina A se identificó dentro del dominio ligando repetitivo. Mediante la unión de los anticuerpos a las toxinas, se impide su interacción con los receptores celulares. El sitio de unión de mAb TTC8 está entre los aminoácidos 2480-2539 de la toxina A con la (probable) secuencia de antígenos TINGKKYYF. Un mAb PCG-4 conocido a partir de la patente de los Estados Unidos 487918 se une a un fragmento de proteína de la toxina A, el cual está definido por los aminoácidos 2098 a 2141.
Tanto el anticuerpo monoclonal PCG-4 como el anticuerpo monoclonal TCC8 son anticuerpos de ratón, los cuales no se usan en terapia sobre los humanos pero podrían ser adecuados como una ayuda para el diagnóstico.
\newpage
Los anticuerpos monoclonales generados en el laboratorio del inventor y sus reactividades se indican a continuación:
Dirigido contra Toxina^{a)} Toxina^{a)}
Dominio catalítico^{b)} 1212 2612, 2688, 3110, 1502, 1115
Dominio de translocación^{b)} 2825, 2836, 5288 2703, 2740, 2747, 2754, 5288, 2784, 2788
Dominio ligando^{b)} 2620, TTC8 2912, 2914, 2916, 2926, 2562, 2CV
Notas
a)
Los anticuerpos reconocen proteínas recombinantes de las regiones enumeradas, en la prueba de bandas de Western.
b)
La posición de los aminoácidos de los dominios en las toxinas (A) y (B) son: dominio catalítico: 1-879 (1-877); dominio de translocación: 880-1848 (878-1850); dominio ligando: 1849-2681 (1851-2360).
Todos los anticuerpos monoclonales específicos de enzima generados y descritos hasta ahora se han obtenido de ratones. El uso terapéutico o profiláctico de esos anticuerpos en especies diferentes de ratones (humanos u otros animales) no es posible dado que los anticuerpos se reconocen como que son de otras especies, e inducen una respuesta inmune por la cual se inactivan. Su adaptación a otras especies, particularmente a humanos, no ha sido posible hasta ahora dado que sus regiones variables e hipervariables no se secuenciaron, es decir, que no fueron definidas.
El objetivo de la invención fue proporcionar péptidos los cuales poseen propiedades neutralizantes de toxinas pero no contienen más una parte fuertemente inmunogénica, de tal forma que los péptidos son adecuados para su uso en medicina humana y veterinaria. La neutralización del efecto de las toxinas se basa en la unión de los anticuerpos a través del anclaje de las regiones variables del anticuerpo a la toxina respectiva. Esta unión se determina principalmente a través de las regiones hipervariables (CDR: abreviatura en inglés de regiones determinantes complementarias). Él fue por tanto el problema para identificar las regiones (variables e hipervariables (CDR)) responsables de unir y neutralizar a las toxinas y de adaptarlas de tal forma que no induzcan más una reacción inmune. Tales péptidos se pueden usar tanto para la terapia de las enfermedades provocadas por Clostridium difficile ya existentes como para la protección contra tales enfermedades en medicina humana y veterinaria.
Los resultados científicos existentes hasta ahora se pueden resumir en que, por un lado, la toxina A de Clostridium difficile es capaz de inducir todos los síntomas de la colitis pseudomembranosa (PMC), y que, por otro lado, el anticuerpo monoclonal TTC8 dirigido contra esta toxina puede neutralizar el efecto de esta toxina durante los experimentos in vivo (en ratones). El mAb TTC8 es un anticuerpo de la clase IgG2b. El reconocimiento específico entre el mAb TTC8 y la toxina A de Clostridium difficile está mediado por las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera. Esto significa que las secciones del anticuerpo definidas exactamente (en otras palabras, los péptidos) son responsables del reconocimiento de antígeno. El reconocimiento de las regiones hipervariables hace posible transferir estos péptidos (estructuras) a las secuencias de anticuerpos de otras especies las cuales son después adecuadas para la terapia y profilaxis de las enfermedades provocadas por Clostridium difficile, por ejemplo en la forma de anticuerpos monoclonales humanizados en humanos, sin tener los indeseables efectos colaterales de los anticuerpos de especies extrañas obtenidos usualmente de ratones.
Por tanto, el problema fue determinar las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos deducidas hipervariables neutralizadoras de toxinas de los anticuerpos monoclonales, de tal modo que se pueden usar en forma de secciones peptídicas o anticuerpos humanizados (incorporados dentro del gen de los anticuerpos humanos) para terapia y profilaxis en humanos. Una tosca determinación de secuencia de este tipo fue llevada a cabo por ejemplo en la célula DSM 2322, la cual produce el anticuerpo monoclonal TTC8. Este anticuerpo neutraliza la acción biológica de la enterotoxina A mediante el bloqueo de sus dominios ligando.
Este problema se resolvió por el hecho de que las secuencias peptídicas variables e hipervariables las cuales ejercen el efecto neutralizante de mAb TTC8, se determinaron para la línea celular DSM ACC 2322 con secuencias SEQ ID Nº 1-12 y/o SEQ ID Nº 13-16. El conocimiento de las regiones variables de los anticuerpos neutralizantes permite que se produzcan péptidos los cuales bloquean la acción biológica de Clostridium difficile mediante unión a su enterotoxina y/o citotoxina. Estas secuencias peptídicas, tales como SEQ ID Nº 14 y SEQ ID Nº 16 del protocolo de secuencias, pueden usarse como tales o pueden incorporarse dentro de la inmunoglobulina para una terapia de las enfermedades causadas por Clostridium difficile. Para su uso terapéutico en humanos, se usa la inmunoglobulina humana; para su uso en medicina veterinaria, la incorporación de las secuencias debe de llevarse a cabo dentro del gen de inmunoglobulina de las especies que se trate.
Se pueden producir derivados de tales péptidos, los cuales aún preservan su actividad biológica, mediante deleción, inserción, adición o reemplazamiento de aminoácidos, es decir, por variación alélica. Estos derivados, de la misma manera que los péptidos originales, pueden inhibir la actividad biológica de Clostridium difficile a través de la unión a su enterotoxina y/o citotoxina, y pueden usarse así para la terapia y profilaxis de las enfermedades causadas por Clostridium difficile.
Las siguientes regiones llamadas hipervariables (CDR = regiones de complementariedad determinada) se determinaron en mAb TTC8 aislados de la línea celular de hibridoma DSM ACC 2322, depositada en la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ). Muestran las siguientes secuencias de aminoácidos:
CDR de la cadena pesada:
CDR-1: -Asn-Tyr-Trp-Met-Asn-
(SEQ ID Nº 2)
CDR-2: -Arg-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asp-Gly-Asp-Ala-His-Tyr-Asn-Gly-Lys-Phe-Lys-Gly-
(SEQ ID Nº 4)
CDR-3: -Gly-Gly-Asn-Tyr-Asp-Asp-Arg-Val-Phe-Asp-Tyr-
(SEQ ID Nº 6)
CDR de la cadena ligera:
CDR-4: -Lys-Ala-Ser-Gln-Asn-Val-Gly-Thr-Asn-Thr-Asn-Val-Ala-
(SEQ ID Nº 8)
CDR-5: -Ser-Pro-Ser-Tyr-Arg-Tyr-Ser-
(SEQ ID Nº 10)
CDR-6: -Gln-Gln-Tyr-Asn-Ser-Tyr-Pro-Leu-Thr-
(SEQ ID Nº 12)
El siguiente procedimiento se adoptó para la determinación de estas secuencias: primero, el RNA total de las células de hibridoma, el cual produce el mAbC8, se preparó de acuerdo con un procedimiento conocido. En una segunda etapa el mRNA se separó después del RNA total. Esto se llevó a cabo con la ayuda de perlas magnéticas de poliestireno a las cuales se unieron covalentemente las cadenas del oligo(dT)_{25}.
A partir del mRNA purificado, el cDNA se sintetizó después y con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (abreviadamente en inglés PCR), se amplificaron los genes VH y VL del mAB TTC8, los cuales codifican para la cadena ligera (VL) o pesada (VH) del anticuerpo TTC8. Aquí fue de importancia decisiva que se seleccionaran los cebadores que mostraron un adecuado sitio de restricción de tal forma que facilitara el subsiguiente clonaje.
Los genes VH y VL del mAB TTC8 así producidos fueron subsiguientemente clonados y después secuenciados en el vector pUC 19. De este modo se detectaron las secuencias de nucleótidos (SEQ ID Nº^{s} 13 y 15) y las secuencias de aminoácidos derivadas correspondientes a SEQ ID Nº 14 y SEQ ID Nº 16.
Las regiones hipervariables pueden identificarse por medio de una comparación con el gen de la línea germinal V 102. A partir del gen de la cadena pesada (SEQ ID Nº 13) puede verse que el CDR-1 de la cadena pesada contiene 5 aminoácidos y comienza en la posición 30 de la secuencia. El CDR-2 de la cadena pesada comienza en la posición 49 y contiene 17 aminoácidos. La región hipervariable CD-3 comienza en la posición 98 y contiene 11 aminoácidos.
En total el gen VH del mAb TTC8 muestra 36 mutaciones puntuales en comparación con la línea germinal V 102. Tres de las mutaciones se encuentran en la región de unión del cebador de PCR y pueden, por lo tanto, causarse mediante la secuencia del cebador. Casi todas las mutaciones en las regiones hipervariables conducen a un cambio en la secuencia de aminoácidos, mientras que casi la mitad de todas las mutaciones en la región estructural son inactivas.
En el gen para la cadena ligera (SEQ ID Nº 15), las regiones hipervariables se pudieron establecer como sigue: la CDR-4 comienza en la posición 22 y contiene 11 aminoácidos. La CDR-5 contiene 7 aminoácidos y comienza en la posición 48. La CDR-6 empieza en la posición 87 y contiene 9 aminoácidos. El gen VL de mAb TTC8 comparado con el mAb A23 muestra sólo 9 mutaciones. De estas, 4 se encuentran en la región de unión del cebador de PCR. De las cinco diferencias restantes en la secuencia de nucleótidos, dos mutaciones están inactivas a nivel de proteína. De las mutaciones que conducen a un cambio en la secuencia de aminoácidos, una se encuentra en la CDR-4, las otras dos están ambas en las regiones estructurales 2 y 3.
El uso terapéutico de un anticuerpo monoclonal derivado de ratones causa una reacción inmune en humanos. Con el fin de superar este problema, un anticuerpo se puede adaptar a la especie a tratar (aquí humanos), es decir, se puede humanizar. Hay varios procedimientos para esto, los cuales equivalen a reemplazar la parte inmunogénica del anticuerpo monoclonal murino con una parte correspondiente de un anticuerpo humano. Se conocen a partir de, por ejemplo, las solicitudes de patentes europeas 184.187, 171.496 y 173.494.
Los anticuerpos monoclonales humanizados producidos por un procedimiento de este tipo son considerablemente más adecuados para uso terapéutico en humanos que los anticuerpos producidos por ratones.
Estos procedimientos para humanizar los anticuerpos pueden usarse también para el mAb TTC8 y otros anticuerpos monoclonales neutralizadores de la toxina A. Producen un anticuerpo monoclonal humanizado el cual forma una quimera de las regiones hipervariables (por ejemplo para TTC8: SEQ ID Nº 1-12) del mAb TTC8 neutralizante insertado en la región estructural de una inmunoglobulina humana. La última puede ser de subtipo IgG (preferida para la aplicación parenteral) o de subtipo IgA (preferida para aplicación peroral). Como describimos para los anticuerpos TTC8 (de la línea celular DSM ACC 2322), las regiones hipervariables de otros anticuerpos monoclonales dirigidas contra Clostridium difficile pueden clonarse de una forma correspondiente, secuenciarse y usarse para la producción de anticuerpos humanizados.
Un objeto adicional de la invención es humanizar los anticuerpos monoclonales en los cuales la secuencia de aminoácidos se modifica a través de variaciones alélicas dentro de las regiones variables o constantes de las cadenas ligeras o pesadas de la inmunoglobulina humana, tanto como se mantenga la capacidad de unión a la toxina A y/o toxina B de Clostridium difficile.
Todos los "bloques de construcción" biológicos necesarios para la producción de anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención, tales como líneas celulares, plásmidos, promotores, marcadores de resistencia, orígenes de replicación, y otros fragmentos de vectores, en la medida en que no se depositan como se describe en el presente documento, son obtenibles en el mercado o están generalmente disponibles. Si no se indica lo contrario, sólo se usan como ejemplos y no son cruciales para llevara cabo la invención, pero pueden reemplazarse mediante otros "bloques de construcción" biológicos disponibles. Las células bacterianas se usan preferiblemente como hospedadores para la amplificación de las secuencias de DNA mencionadas de acuerdo con la invención. Ejemplos de esto son E. coli o especies del género Bacillus.
La producción de anticuerpos humanizados puede llevarse a cabo en células eucariotas tales como células de levaduras, hongos o, por ejemplo, CHO (células de ovario de hámster chino). La producción en plantas puede llevarse a cabo en monocotiledóneas o dicotiledóneas.
Como un ejemplo, la producción de anticuerpos en las plantas se describe más adelante en este documento. La producción en otros organismos se lleva a cabo de forma análoga.
La producción de anticuerpos específicos en plantas ya se conoce de [2] y de la solicitud de patente internacional WO 91/06320. Para la producción de los anticuerpos monoclonales en las plantas transgénicas, los genes para el anticuerpo monoclonal completo o para sus derivados recombinantes se clona, o el gen para una única cadena de anticuerpo bajo el control de uno o dos promotores vegetales activos se clona en un vector de transformación de plantas.
El vector de transformación final contiene todas las secuencias de DNA a transferirse en la planta. Éstas se transfieren del vector en las células de la planta. Alternativamente, los genes para las cadenas pesada y ligera pueden incorporarse separadamente también en dos vectores de transformación de plantas, de tal forma que sólo más tarde se unen juntos en la construcción final de anticuerpo. La transformación de las plantas se puede llevar a cabo con cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo con la ayuda de Agrobacterium tumefasciens o directamente a través de transferencia génica directa o con la ayuda de un cañón de partículas.
La producción de anticuerpos puede dirigirse dentro de compartimentos predeterminados de la célula. Mediante la eliminación de la secuencia codificante para el péptido señal, los anticuerpos se expresan citoplásmicamente. Para la alta expresión de los anticuerpos, una secuencia de DNA se conecta al extremo 5' del gen o se retiene el que se da en la naturaleza, el cual codifica para un péptido señal para transporte dentro del retículo endoplásmico. Con el fin de obtener una localización específica en compartimentos celulares definidos, es posible fusionar, sobre o dentro del gen, las secuencias de DNA que codifican para las secuencias peptídicas responsables de ello. A través de la integración de una secuencia KDEL es posible, por ejemplo, conseguir la retención en el retículo endoplásmico.
La incorporación del gen del anticuerpo en el gen transgénico se analiza y confirma a través de la adecuada restricción de la digestión del DNA vegetal genómico aislado y la subsiguiente hibridación por Southern. La transcripción del gen se puede demostrar usando el procedimiento de la prueba de bandas de Northern. El anticuerpo biosintetizado se detecta en extractos vegetales usando, por ejemplo un anticuerpo secundario específico policlonal o monoclonal o un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la región constante o contra una secuencia señal introducida especialmente para ese propósito.
Tanto las monocotiledóneas, tales como cebada y trigo, como las dicotiledóneas, tales como patatas, colza, zanahorias o guisantes, son adecuadas para plantas de producción. La expresión del anticuerpo puede ocurrir en varios órganos de la planta, por ejemplo en hojas, semillas, tubérculos u otro tejido.
La purificación del anticuerpo expresado en la planta se lleva a cabo usando, por ejemplo, procedimientos cromatográficos que normalmente también se usan para purificar anticuerpos a partir de líneas celulares de hibridoma. Además, los anticuerpos recombinantes que contienen una secuencia señal se pueden purificar también por medio de procedimientos cromatográficos de afinidad establecidos especialmente tales como cromatografía de quelación de metales.
Los anticuerpos monoclonales humanizados se pueden administrar a los pacientes humanos para la terapia y profilaxis de las enfermedades causadas por Clostridium difficile siguiendo estos procedimientos. En general, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se administran parenteralmente, o, preferiblemente peroralmente. La directa toma peroral de las plantas que contienen los anticuerpos como una comida cruda puede ser considerada una "preparación galénica" especial. La dosis apropiada de los anticuerpos se ajusta a al paciente pertinente y depende, por ejemplo del peso corporal, la edad, y el estado morboso del paciente. La dosis está establecida mediante un doctor en medicina experto y usualmente está entre 0,1 mg/kg y 70 mg/kg, administrada una vez o varias veces por día durante un periodo de varios días.
Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento del RNA total de las células de hibridoma las cuales producen mAB TTC8 (DSM ACC 2322)
Para la producción de RNA mediante gradientes de CsCl, las células inicialmente se descompone mediante tampón guanidina tiocianato y después se alteran totalmente mecánicamente, con la ayuda de un Ultrathorax. Los restos celulares se centrifugan y la disolución se añade en la parte superior de un amortiguados de CsCl (5,7 M) ya preparado. Durante la siguiente centrifugación el RNA forma un sedimento en el fondo del tubo prueba. Esta capa del fondo se separa usando un escalpelo caliente y el sedimento se disuelve por adición de H_{2}O. El RNA se purifica más después mediante precipitación a partir de la disolución. Se disuelve finalmente en 100 \mul de agua. La concentración de RNA así preparado usualmente se encuentra en el intervalo 1,5-3 \mug/\mul.
Ejemplo 2 Aislamiento del mRNA
Para la purificación del mRNA de las otras especies de RNA, se hibridó a las perlas de oligo(dT)_{25} de acuerdo con el procedimiento descrito por Dynal. La capacidad de unión de las perlas es 2 \mug de RNA por mg de perlas. La proporción de mRNA frente al RNA total es aproximadamente 1-5%, de forma que 1 mg de perlas se añadió a 80 \mug de mRNA. La purificación se desarrolló de acuerdo con el procedimiento de Dynal Company con la siguiente alteración. El RNA unido se lavó dos veces con un tampón que contiene 10 mM de Tris/HCl (pH 7,5), 0,15 mM de LiCl, 1 mM de EDTA, 1% SDS y entonces se lavó dos veces con un tampón alterado que tiene una concentración de sal más baja [5 mM de Tris/HCl (pH 7,5), 75 mM de LiCl, 0,5 mM de EDTA]. Todos los pasos adicionales se ajusta a las especificaciones de Dynal. La adición de SDS y la etapa adicional de lavado a concentración de sal más baja (más restrictiva) incrementa considerablemente la pureza del mRNA.
Ejemplo 3 Síntesis de cDNA
A partir de la purificación del mRNA, el cDNA se sintetizó usando transcriptasa inversa de MMLV (abreviatura en inglés de virus de la leucemia murina de Moloney). En el experimento el cebador oligo(dT)_{12-18} se usó 2 veces en exceso para mantener alta la proporción de moléculas de mRNA-oligo(dT) hibridadas. La concentración de nucleótido trifosfatos fue más alta que 1 mM durante la reacción. El incremento prematuro de la rotura del RNA en la disolución se contrarrestó por la adición del inhibidos de ribonucleasa humano y de placenta. El ssDNA así producido se usó en las reacciones de PCR para la amplificación de las regiones variables en el mAb TTC8.
Ejemplo 4 Reacción en cadena de la polimerasa para la amplificación del cDNA
La amplificación del cDNA se llevó a cabo de acuerdo al procedimiento conocido de la patente europea 0 338 914.
Por medio de un intervalo de publicaciones, los cebadores particulares para la amplificación por PCR de las regiones variables de los anticuerpos monoclonales de ratones se dedujeron. Éstos son:
Cadena pesada: (un sitio de restricción Sal1 introducido está subrayado)
VH5Prim: 5'-AGGTCGACCTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG-3'
VH3Prim: 5'-ACGGTGACAGTCGACCCTTGGCCCC-3'
Cadena ligera: (un sitio de restricción SacI está subrayado)
VL5Prim: 5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3'
VL3Prim: 5'-GTTTGAGCTCCAGCTTGGTCCC-3'
La concentración óptima de cebador para la producción de las regiones variables fue de 0,5 \muM, los dNTP se usaron a una concentración final de 400 \muM.
Las temperaturas de PCR se establecieron como un segundo parámetro significativo. Para la amplificación de la región VH la secuencia de reacción fue como sigue: desnaturalización 1 min. a 92º; atemperamiento 1,5 minutos a 50ºC, elongación 2 minutos a 72º durante 30 ciclos. Para la amplificación de VL la secuencia de reacción fue como sigue: desnaturalización 1 min. a 92º; atemperamiento 1,5 minutos a 60ºC, elongación 3 minutos a 72º durante 30 ciclos.
Ejemplo 5 Clonación de los genes VH y VL del mAb TTC8
Para su clonación, los productos de PCR se cortaron con Sal1 (VH) o Sac1 (VL) y se purificaron en geles de agarosa. La clonación dentro de pUC19 se llevó a cabo dentro de los sitios de restricción homólogos.
Como los clones deseados, las construcciones pVHT8 y pVHT9 se identificaron por control de digestión. Contienen los segmentos VH o VL con orientación positiva relativa la promotor pLac de pUC19.
Ejemplo 6 Secuenciación de los dominios variables del mAb TTC8
El inserto de pVHT8 tiene un tamaño de 341 pares de bases, el inserto del clon pVLT8.10 es de 312 pares de bases. Ambos clones poseen un marco abierto de lectura el cual se extiende sobre todo el inserto. La secuencias de los cebadores de PCR y los sitios de corte pueden identificarse bien.
Mediante comparación de secuencias, se puede hallar la relación de los segmentos VH con la familia multigénica 1558. El grado más alto de homología fue con la secuencia de la línea germinal V102.
El gen para la región VL de mAb TTC8 tiene una homología del 94% con una secuencia de un anticuerpo el cual se atribuye al gen de la línea germinal Vk19d. Por lo tanto, la región VL de TTC8 también está relacionada con esta familia génica.
Ejemplo 7 Producción de un anticuerpo monoclonal humanizado
Con el fin de prevenir una reacción del sistema inmune humano cuando se le aplican anticuerpos de otras especies (en lo sucesivo citados como no humanos), las regiones inmunogénicas del mAB deben reemplazarse mediante secuencias humanas homólogas. Hay básicamente dos posibilidades para esto:
a)
la creación de anticuerpos quiméricos ratón/humano, en los cuales la región variable determinante de antígeno del anticuerpo quimérico se origina a partir del anticuerpo no humano y la región constante se origina a partir de un anticuerpo humano.
b)
La humanización completa del mAb. De acuerdo con esta aproximación, también las regiones estructurales en la región variable del mAb se reemplazan por las secuencias humanas correspondientes y sólo las regiones de CDR se mantienen en la forma original o sus variantes alélicas.
Para llevar a cabo el trabajo en la práctica se puede adoptar un rango de procedimientos, los cuales están bien documentados y son bien conocidos por expertos en el campo:
para a) los anticuerpos quiméricos se producen mediante acoplamiento de las secuencias de las regiones constantes de un anticuerpo humano con las secuencias de la región variable del mAb no humano, en un sistema vector adecuado. Se puede producir un anticuerpo quimérico completo, o sólo una parte del anticuerpo quimérico, una que se llama fragmento Fab [3]. La producción de anticuerpos quiméricos tiene la ventaja de que el procedimiento está relativamente libre de problemas. Los anticuerpos producidos muestran una inmunogenicidad ligeramente incrementada debido a las partes de ratón que permanecen en la proteína, pero estas son de menor importancia si se sigue una administración oral.
para b) para la completa humanización del mAb no humano, un anticuerpo humano cuya estructura corresponde aproximadamente a aquella del anticuerpo original se identifica primero a través de comparación de secuencias y modelado 3D. Entonces, mediante rondas subsiguientes de amplificaciones por PCR, se genera un gen completamente humanizado para la parte variable del anticuerpo [4], usando cinco cebadores de oligonucleótido que se unen a la secuencia de la región variable en el anticuerpo humano (VL o VH) y tres oligonucleótidos que comprenden las secuencias de las regiones CDR del anticuerpo de ratón. Una segunda aproximación modificada es ensamblar el gen a partir de varios oligonucleótidos sintéticos solapantes que codifican para la secuencia diana (para la estrategia y el procedimiento cf. [41]). Alternativamente, es posible, después de la identificación de un anticuerpo homólogo humano, ajustar justamente los aminoácidos en las regiones de la estructura en las cuales ambos anticuerpos difieren, mediante mutagénesis dirigida a sitio [5]. Los anticuerpos modificados de este modo pueden sucumbir a una alteración en su especificidad a ajustarse mediante mutación inversa [5]. La humanización completa de los anticuerpos mediante los procedimientos citados en último lugar requieren esfuerzos metódicos relativamente altos, pero estos anticuerpos no producen prácticamente ninguna respuesta inmune en humanos [6].
Bibliografía
[1] Eichel-Streiber, C.V., P. Boquet, M. Sauerborn y M. Thalestam. 1996. Citotoxinas grandes de Clostridium - una familia de glicosiltransferasas que modifican pequeñas proteínas de unión a GTP' (Large clostridial cytotoxins - a family of glycosyltransferases modifying small GTP' binding proteins). Trends in Microbiology, 14: 375-382.
[2] During, K. (1988) "Expresión inducida y secreción de lisozima T4 y anticuerpo monoclonal rpern en Nicotiana tabacum" ("Wundinduzierte Expression und Sekretion von T4 Lysozym und Monoklonalen ntik rpern in Nicotiana tabacum"). Tesis Postdoctoral, Universitdt Kbln.
[3] Skerra, A. (1994). Un vector general, pASK 84 para clonación, producción bacteriana y purificación de una sola etapa de fragmentos Fab de anticuerpos (A general vector, pASK 84 for cloning, bacterial production y single step purification of antibody Fab fragments). Gene 141: 79-84.
[4] Sato, K., M. Tsuchiya, J. Saldanha, Y. Koishihara, Y. Ohsugi, T. Kishimoto y M.M. Bending (1994). Humanización de un anticuerpo de ratón anti receptor de interleucina-6 comparando dos procedimientos para seleccionar las regiones estructurales de humanos (Humanization of a mouse anti-human Interleukin-6 receptor antibody comparing two methods for selecting humanframework regions). Mol. Immun. 31: 371-381.
[5] Benhar, I., E.A., Padlan, S.H., Lee, B., Lee e I., Pastan (1994). Humanización rápida del Fv del anticuerpo monoclonal B3 usando intercambio de estructuras de la inmunotoxina recombinante B3(Fv)-PE38 (Rapid humanization of the Fv of monoclonal antibody B3 by using framework exchange of the recombinant inmunotoxin B3(Fv)-PE38). Proc. Natl. Sci. USA 91:12051-12055.
[6] Stephens, S., S., Emtage, O., Vetterlein, L., Chaplin, C., Bebbington, A, Nesbitt, M., Sopwith, D., Athwal, C., Nowak y M., Bodmer (1995). Farmacocinéticas comprensivas de un anticuerpo humanizado y análisis de respuestas residuales anti-idiotípicas. Inmunología 85: 668-674, reacción para generar anticuerpos monoclonales humanizados (Comprehensive pharmacokinetics of a humanized antibody and analisis of residual anti-idiotipic responses. Immunology 85: 668-674, reaction to generate humanised monoclonal antibodies). GENE, vol. 101, Nº,1.Enero 1991, pp.297-302.
[8] Lilerly et al. "Vacunación contra la enterocolitis letal provocada por Clostridium difficile con un péptido recombinante no tóxico de toxina A" ("Vaccination against letal Clostridium difficile enterocolitis with a non-toxic recombinant peptide of toxin A"). CURRENT MICROBIOLOGY, vol. 21, Julio 1990, pp. 29-32.
[9] Corthier, G. et al. "Protección contra colitis pseudomembranosa experimental en ratones gnotobióticos mediante el uso de anticuerpos monoclonales contra la toxina A de Clostridium difficile" ("Protection against experimental pseudomembranous colitis in gnotobiotic mice by use of monoclonal antibodies against Clostridium difficile toxin A"). INFECTION AND INMUNITY, vol. 59, Nº. 3, March 1991, pp. 1192-1195.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Dr. Christoph von Eichel-Streiber
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Bingerweg 15
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
POBLACIÓN: Schweppenhausen
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
REGIÓN: Rheinland-Pfalz
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 55444
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 06724/3398
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
FAX:
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN: Secuencias de aminoácidos para uso terapéutico y profilácticocontra enfermedades debidas a toxinas de Clostridium difficile 
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
VEHÍCULO DE DATOS: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC DOS/MS DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPA)
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FECHA DE LA SOLICITUD ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: DE 19739685.2
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE SOLICITUD: 10-SEPTIEMBRE-1997
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 1
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: CDR1 de la cadena pesada
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Anticuerpo monoclonal TTC8
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
LÍNEA CELULAR: Hibridoma
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: DSM ACC 2322
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..15
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACC TAC TGG ATG AAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Tyr Trp Met Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia proteica CDR1 de la cadena pesada
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Tyr Trp Met Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: CDR2 de la cadena pesada
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Anticuerpo monoclonal TTC8
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
LÍNEA CELULAR: Hibridoma
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: DSM ACC 2322
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..51
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGG ATT TAT CCT GGA GAT GGA GAT GCT CAC TAC AAT GGG AAG TTC AAG GGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia proteica CDR2 de la cadena pesada
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 5
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: CDR3 de la cadena pesada
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Anticuerpo monoclonal TTC8
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
LÍNEA CELULAR: Hibridoma
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: DSM ACC 2322
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..33
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGG GGG AAT TAC GAC GAC AGG GTC TTT GAC TCA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Asn Tyr Asp Arg Val Phe Phe Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia proteica CDR3 de la cadena pesada
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Asn Tyr Asp Arg Val Phe Phe Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 7
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: región hipervariable (CDR) de la cadena ligera
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Anticuerpo monoclonal TTC8
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
LÍNEA CELULAR: Hibridoma
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: DSM ACC 2322
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..33
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia proteica CDR1 de la cadena ligera
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 9
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: CDR2 de la cadena ligera
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Anticuerpo monoclonal TTC8
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
LÍNEA CELULAR: Hibridoma
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: DSM ACC 2322
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..21
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCG CCA TCC TAC CGG TAC AGT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia proteica CDR1 de la cadena ligera
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 11
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: CDR3 de la cadena ligera
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Anticuerpo monoclonal TTC8
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
LÍNEA CELULAR: Hibridoma
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: DSM ACC 2322
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..27
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAG CAA TAT AAT AGC TAT CCT CTT ACG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia proteica CDR3 de la cadena ligera
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 341 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: región variable VH de la cadena pesada
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Anticuerpo monoclonal TTC8
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
LÍNEA CELULAR: Hibridoma
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: DSM ACC 2322
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..341
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: cebador unido
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..21
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta=VHSPRIM
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: cebador unido
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 325..341
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta=VH3PRIM
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
1
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia proteica de la región variable de la cadena pesada
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
2 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 312 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: cadena simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: región variable de la cadena ligera
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Anticuerpo monoclonal TTC8
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
LÍNEA CELULAR: Hibridoma
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: DSM ACC 2322
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: cebador unido
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..18
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta=VL5Prim
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: cebador unido
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 289..312
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta=VH3PRIM
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARATERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..312
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
3
2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 104 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia proteica de la región variable VL de la cadena ligera
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
4

Claims (8)

1. Secuencia de aminoácidos, caracterizada porque contiene completamente o parcialmente secuencias de aminoácidos, seleccionadas a partir de SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10 o SEQ ID Nº 12 del protocolo de secuencia, y que une la Toxina A de Clostridium difficile.
2. Secuencia de DNA, caracterizada porque codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de la reivindicación 1.
3. Secuencia de DNA, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque contiene una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 7, SEQ ID Nº 9 o SEQ ID Nº 11 del protocolo de secuencia.
4. Secuencia de aminoácidos, caracterizada porque contiene o porque está constituida por una secuencia seleccionada a partir de SEQ ID Nº 14 o SEQ ID Nº 16 del protocolo de secuencia.
5. Secuencia de DNA, caracterizada porque contiene o porque está constituida por una secuencia seleccionada de SEQ ID Nº 13 o SEQ ID Nº 15 del protocolo de secuencia.
6. Secuencia de aminoácidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 4, caracterizada porque contiene uno o más derivados modificados de los aminoácidos que se han obtenido mediante variación alélica, dichos derivados tienen un efecto biológico comparable al de las secuencias de aminoácidos de la reivindicación 1.
7. Secuencia de DNA, caracterizada porque codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de la reivindicación 6.
8. Línea celular hibridoma DSM ACC 2322.
ES98951374T 1997-09-10 1998-09-10 Secuencias de aminoacidos para uso terapeutico y profilactico contra enfermedades debidas a las toxinas de clostridium difficile. Expired - Lifetime ES2210832T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19739685A DE19739685A1 (de) 1997-09-10 1997-09-10 Monoklonale Antikörper zur Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen durch Clostridium difficile
DE19739685 1997-09-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2210832T3 true ES2210832T3 (es) 2004-07-01

Family

ID=7841840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES98951374T Expired - Lifetime ES2210832T3 (es) 1997-09-10 1998-09-10 Secuencias de aminoacidos para uso terapeutico y profilactico contra enfermedades debidas a las toxinas de clostridium difficile.

Country Status (11)

Country Link
US (2) US6667035B1 (es)
EP (1) EP0994904B1 (es)
JP (1) JP4318398B2 (es)
CN (1) CN1273588A (es)
AT (1) ATE254139T1 (es)
AU (1) AU9742698A (es)
BR (1) BR9815367A (es)
CA (1) CA2303202C (es)
DE (2) DE19739685A1 (es)
ES (1) ES2210832T3 (es)
WO (1) WO1999012971A2 (es)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19739685A1 (de) * 1997-09-10 1999-03-11 Eichel Streiber Christoph Von Monoklonale Antikörper zur Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen durch Clostridium difficile
US20030054009A1 (en) * 2001-02-09 2003-03-20 Windle Henry J. Clostridium difficile vaccine
GB0130267D0 (en) * 2001-12-19 2002-02-06 Neutec Pharma Plc Focussed antibody technology
GB0205206D0 (en) * 2002-03-06 2002-04-17 Oxoid Ltd Synthetic peptides
GB0309126D0 (en) * 2003-04-17 2003-05-28 Neutec Pharma Plc Clostridium difficile focussed antibodies
EP2857418B1 (en) * 2004-02-06 2017-07-26 University of Massachusetts Antibodies against Clostridium difficile toxins and uses thereof
ATE385423T1 (de) * 2004-06-16 2008-02-15 Straumann Holding Ag Abdeckmembran
GB0414886D0 (en) 2004-07-02 2004-08-04 Neutec Pharma Plc Treatment of bacterial infections
EP1833510A4 (en) * 2004-12-27 2010-02-10 Progenics Pharmaceuticals Neva ORAL ADMINISTRATION ANTITOXIN ANTIBODIES AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME
GB2429013C (en) 2005-08-11 2012-11-28 Arpi Matossian-Rogers Peptides for treatment and diagnosis of autoimmunedisease
AU2012241141B2 (en) * 2005-08-11 2015-08-20 Arpi Matossian-Rogers TCR-V-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease
WO2009008916A2 (en) 2007-03-22 2009-01-15 The Regents Of The University Of Californina Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
WO2009136297A2 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Recopharma Ab Compositions and methods for inhibiting toxin a from clostridium difficile
DE102008029688B4 (de) * 2008-06-24 2016-06-23 Biodics Gmbh Verfahren zum Nachweis und zur Identifikation eines varianten C. difficile Stammes in einer Probe
CA2732003A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 James D. Marks Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
AU2009350614B2 (en) * 2009-07-27 2013-04-04 Biodics Gmbh Method for detecting and identifying a variant C. difficile strain in a sample
US8889363B2 (en) 2009-07-27 2014-11-18 Biodics Method for the detection and identification of a variant C. difficile strain in a sample
WO2011060076A1 (en) * 2009-11-10 2011-05-19 Amgen Inc. Anti-c-mpl antibodies
US9243057B2 (en) 2010-08-31 2016-01-26 The Regents Of The University Of California Antibodies for botulinum neurotoxins
WO2012118693A1 (en) * 2011-02-28 2012-09-07 Northshore University Healthsystem Methods of diagnosing clostridium difficile infection
ES2969952T3 (es) 2011-04-22 2024-05-23 Wyeth Llc Composiciones relacionadas con una toxina mutante de Clostridium difficile y sus procedimientos
BR112014004162A2 (pt) 2011-08-22 2018-04-24 Cangene Corp anticorpos contra clostridium difficile
US10364298B2 (en) 2011-11-18 2019-07-30 National Research Council Of Canada Clostridium difficile lipoteichoic acid and uses thereof
NZ714516A (en) 2012-03-02 2017-06-30 Regeneron Pharma Human antibodies to clostridium difficile toxins
BR122016023101B1 (pt) 2012-10-21 2022-03-22 Pfizer Inc Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile
US10117933B2 (en) * 2012-11-28 2018-11-06 Emergent Biosolutions Canada Inc. Antibodies against Clostridium difficile
US10160797B2 (en) 2013-03-15 2018-12-25 Sanofi Pasteur Biologics, Llc Antibodies against Clostridium difficile toxins and methods of using the same
WO2021255690A2 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Pfizer Inc. Immunogenic compositions against clostridioides (clostridium) difficile and methods thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4879218A (en) * 1982-09-13 1989-11-07 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Antibody for C.difficile
DE3471661D1 (en) 1984-03-02 1988-07-07 Tracy Dale Wilkins Toxins and antibodies of c. difficile
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4863852A (en) 1985-07-03 1989-09-05 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Method of detecting, isolating and purifying clostridium difficile toxin A and its receptors
US5071759A (en) 1986-05-30 1991-12-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies to clostridum difficile toxins A and B
US5580774A (en) * 1989-07-31 1996-12-03 Eli Lilly And Company Chimeric antibodies directed against a human glycoprotein antigen
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5098826A (en) 1990-03-09 1992-03-24 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Detection, isolation and purification of Clostridium difficile toxin A with toxin receptors
US5231003A (en) 1990-05-11 1993-07-27 Cambridge Bioscience Corporation Monoclonal antibodies specific for toxin b of clostridium difficile
US5858725A (en) 1990-10-10 1999-01-12 Glaxo Wellcome Inc. Preparation of chimaeric antibodies using the recombinant PCR strategy
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
GB9317423D0 (en) * 1993-08-21 1993-10-06 Imp Cancer Res Tech Monoclonal antibodies
CN1176658A (zh) * 1994-10-24 1998-03-18 蛇药制品有限公司 治疗和预防艰难梭菌疾病的疫苗和抗毒素
DE19739685A1 (de) * 1997-09-10 1999-03-11 Eichel Streiber Christoph Von Monoklonale Antikörper zur Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen durch Clostridium difficile

Also Published As

Publication number Publication date
US20040137601A1 (en) 2004-07-15
US6667035B1 (en) 2003-12-23
WO1999012971A3 (de) 1999-07-22
JP2001515920A (ja) 2001-09-25
EP0994904B1 (de) 2003-11-12
AU9742698A (en) 1999-03-29
ATE254139T1 (de) 2003-11-15
BR9815367A (pt) 2001-11-06
CA2303202A1 (en) 1999-03-18
US7151159B2 (en) 2006-12-19
EP0994904A2 (de) 2000-04-26
CA2303202C (en) 2010-04-27
DE19739685A1 (de) 1999-03-11
WO1999012971A2 (de) 1999-03-18
CN1273588A (zh) 2000-11-15
JP4318398B2 (ja) 2009-08-19
DE59810172D1 (de) 2003-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2303202C (en) Amino acid sequences for therapeutical and prophylactic applications to diseases due to clostridium difficile toxins
RU2757813C2 (ru) Антитело против lag-3, его антигенсвязывающий фрагмент и их фармацевтическое применение
FI115462B (fi) Menetelmä immunoglobuliinin valmistamiseksi
AU2018243123B2 (en) B7-H3 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
EP3689909A1 (en) Tigit antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
ES2052027T5 (es) Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
EP0937140B1 (en) Antibody molecules which interact specifically with the active site or cleft of a target molecule
ES2533492T3 (es) Anticuerpos contra toxinas de Clostridium difficile y usos de los mismos
JP4954104B2 (ja) Ｉｌ−５介在障害を治療および診断するための改良方法
HK1247214B (zh) 一种pdl-1抗体、其药物组合物及其用途
JP2012515746A (ja) 抗ｃｄ１６０モノクローナル抗体及びその使用
WO2019091449A1 (zh) Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途
CN112513088B (zh) 抗ox40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
TW526206B (en) Reshaped human antibody to human medulloblastoma cells
CN102906111A (zh) 特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原的人抗体
CN101580546B (zh) 人源抗人干扰素α抗体及其应用
KR101613347B1 (ko) 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
EP1079856B1 (en) Humanized antibodies that recognize verotoxin ii and cell line producing same
CN100441689C (zh) 抗ehec o157志贺样毒素ⅱa亚单位单克隆抗体5f3轻、重链可变区基因及应用
KR100506118B1 (ko) 수막염균증 백신 조성물
KR100509993B1 (ko) Il-5 매개된 질환의 치료에 유용한 재조합 il-5 길항제
MXPA00002491A (es) Secuencias aminoacidas para la terapia y profilaxis de enfermedades provocadas por las toxinas de clostridium difficile
KR20040084875A (ko) Ｂ형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체의가변영역을 삽입할 수 있는 항체발현 플라스미드
WO2022063100A1 (zh) 抗tigit抗体及双抗体和它们的应用
KR101553845B1 (ko) 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도