ES2211568T3 - Prueba genetica para determinar la falta de respuesta al tratamiento farmacologico con estatina. - Google Patents
Prueba genetica para determinar la falta de respuesta al tratamiento farmacologico con estatina.Info
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Abstract
Método de detección de la predisposición genética en un sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la prevención de la estenosis aterosclerótica, que comprende: a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a partir de una muestra de tejido recogida de un sujeto humano para obtener los productos de amplificación, y b) analizar los productos de amplificación para determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa humano, en el que la homocigosidad para la ausencia de dicho sitio de reconocimiento para HindIII indica una predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la prevención de la estenosis aterosclerótica.
Description
Prueba genética para determinar la falta de
respuesta al tratamiento farmacológico con estatina.
En toda esta solicitud se hace referencia a
diversas publicaciones entre paréntesis con el fin de describir más
detalladamente el estado de la técnica al que concierne la
invención.
Esta invención se refiere a las técnicas médicas.
En particular, se refiere al campo de los métodos de pruebas
genéticas y equipos de diagnóstico.
Los fármacos de estatina, los agentes
hipolipemiantes más potentes actualmente disponibles, son
inhibidores de la
3-hidroxi-3-metilglutaril
coenzima A (HMG-CoA) reductasa. Incluyen
lovastatina, pravastatina, simvastatina, atorvastatina, fluvastatina
y cerivastatina. Todos estos fármacos de estatina comparten un
mecanismo de acción común y tienen similares perfiles de toxicidad
(E. Von Kreutz y G. Schluter, Preclinical safety evaluation of
cerivastatin, a novel HMG-CoA reductase
inhibitor, Am. J. Cardiol. 82(B):11J-17J
[1998]; A.G. Ollson [1998]).
Los fármacos de estatina son eficaces en la
reducción del riesgo primario y secundario de enfermedad de la
arteria coronaria y acontecimientos coronarios, tales como ataque al
corazón, en hombres y mujeres de mediana edad y mayores (por debajo
de los 76 años) tanto en pacientes diabéticos como no diabéticos, y
a menudo se prescriben para pacientes con hiperlipidemia. (A.G.
Ollson, Addressing the challenge, Eur. Heart J. Suppl.
M:M29-35 [1998]; M. Kornitzer, Primary and
secondary prevention of coronary artery disease: a
follow-up on crinical controlled trials, Curr.
Opin. Lipidol. 9(6):557-64 [1998]; M. Farnier
y J. Davignon, Current and future treatment of hyperlipidemia:
the role of statins, Am. J. Cardiol.
82(4B):3J-10J [1998]). Las estatinas
utilizadas en la prevención secundaria de la enfermedad coronaria o
cardiaca reducen significativamente el riesgo de accidente
cerebrovascular, la morbimortalidad total y los ataques de isquemia
miocárdica; el uso de las estatinas también se asocia con las
mejoras en las funciones endotelial y fibrinolítica y la disminución
de la formación de trombos plaquetarios. (M. Kornitzer [1998]; M.
Farnier y J. Davignon, Current and future treatment of
hyperlipidemia: the role of statins, Am. J. cardiol.
82(4B):3J-10J [1998]).
El uso de fármacos de estatina ha disminuido
recientemente la necesidad de revascularización coronaria
quirúrgica, conocida como injerto de derivación de arteria coronaria
(CABG). (B.M. Rifkind, Clinical trials of reducing
low-density lipoprotein concentrations,
Endocrinol. Metab. Clin. North. Am.
27(3):585-95, viii-ix
[1998]). Pero la CABG es todavía una intervención quirúrgica común
para pacientes que desarrollan oclusión aterosclerótica en las
arterias coronarias. Se realizan al año aproximadamente
12.000-14.000 procedimientos de CABG. (G.F. Neitzel
et al., Atherosclerosis in Aortocoronary Bypass Grafts,
Atherosclerosis 6(6):594-600 [1998]). Se
utiliza la propia vena safena de los pacientes o la arteria humeral
o mamaria para derivar la arteria coronaria afectada. La mayoría de
los pacientes de CABG experimentan buenos resultados a largo plazo,
pero el 30-40% requieren una segunda CABG en el
plazo de 10-12 años tras la cirugía, y la
aterosclerosis continuada en el injerto es un factor importante en
el rechazo del injerto tardío. (L. Campeau et al., The effect of
aggresive lowering of low-density lipoprotein
cholesterol levels and low-dose anticoagulation on
obstructive changes in saphenous-vein
coronary-artery bypass grafts, N. Eng. J. Med.
336(3):153-62 [1997]).
La aterosclerosis en injertos de derivación se
asocia con niveles séricos elevados de lipoproteínas de muy baja
densidad (VLDL), colesterol de la lipoproteína de baja densidad
(LDL-C) y triglicéridos, y niveles bajos del
colesterol de la lipoproteína de alta densidad
(HDL-C). (J.T. Lie et al., Aortocoronary bypass
saphenous vein atherosclerosis: Anatomic study of 99 vein grafts
from normal and hyperlipoproteinemic patients up to 75 months
postoperatively, Am. J. cardiol. 40:906 [1977]; L. Campeau et
al., The relation of risk factors to the development of
atherosclerosis in saphenous vein bypass grafts and the progression
of disease in the native circulation, N. Engl. J. Med.
311(21):1329-32 [1984]). Es normal que se
prescriban fármacos de estatina a los pacientes de CABG para
disminuir sus niveles séricos de LDL-C.
Se ha demostrado que el tratamiento con
hipolipemiantes retrasa la progresión de la aterosclerosis en las
arterias coronarias. (Por ejemplo, G. Brown et al., Regression of
coronary artery diseases as a result of intensive lipid lowering
therapy in men with high levels of apolipoprotein B, N. Engl. J.
Med. 323:1289-98 [1990]; J.P. Kane et al.,
Regression of coronary atherosclerosis during trestment of familial
hypercholesterolemia with combined drug regimens, JAMA
264:3007-12 [1990]; Jukema et al., 1995).
Antes del ensayo Post-CABG, había pocos datos
disponibles para determinar la eficacia de el tratamiento de
disminución de las LDL en el retraso de la obstrucción de los
injertos de vena safena. (D.H. Blankenhorn et al., Beneficial
effects of combined colestipol-niacin therapy on
coronary atherosclerosis and coronary venous bypass grafts, JAMA
257:3233-40 [1987]). Además, también se había
observado que la trombosis contribuye a la obstrucción del injerto
(G.F. Neitzel et al., Atherosclerosis in aortocoronary bypass
grafts: morphologic study and risk factor analysis 6 to 12 years
after surgery, Arteriosclerosis 6:594-600
[1986]). El tratamiento anticoagulación a dosis bajas evitó la
embolia tras la cirugía mayor (A.G.G. Turpie et al., Randomised
comparison of two intensities of oral anticoagulant therapy after
tissue heart valve replacement, Lancet 1:1242-45
[1998]; L. Poller et al., Fixed minidose warfarin: a new approach
to prophylaxis against venous thrombosis after major surgery,
Br. Med. J. 295:1309-12 [1987]), y esto implicaba
que el tratamiento anticoagulante a dosis bajas también debería
poder retrasar la obstrucción del injerto.
El tratamiento con fármaco de estatina afecta
beneficiosamente al resultado a largo plazo para la mayoría de
pacientes de CABG. En un gran estudio clínico, el ensayo
Post-CABG, los pacientes de CABG recibieron
tratamiento farmacológico de estatina para disminuir los niveles
séricos de LDL-C; comparando los pacientes que
habían recibido un tratamiento intensivo con lovastatina
(LDL-C disminuyó hasta 93-97 mg/dl)
con los que sólo habían recibido un tratamiento moderado con
lovastatina (LDL-C disminuyó hasta
132-136 mg/dl), los porcentajes de pacientes con
empeoramiento aterosclerótico de los injertos en un plazo de 4 años
fueron del 39% y el 51%, respectivamente. (L. Campeau et al.
[1997]). El número de pacientes del grupo de tratamiento intensivo
con lovastatina que requirieron un segundo procedimiento de CABG fue
un 29% inferior que el número en el grupo de tratamiento
moderado.
Además de las concentraciones lipídicas en suero,
existen otros factores de riesgo, que pueden tener una base
genética, y que pueden afectar independientemente a la enfermedad de
la arteria coronaria aterosclerótica y a la oclusión de los injertos
de derivación o que pueden interaccionar con el tratamiento de
estatina para disminuir los lípidos séricos, que puede afectar a la
estenosis aterosclerótica. Varios laboratorios han observado una
relación entre alelos variantes del gen de la lipoproteína lipasa
(LPL) y la aparición / progresión de la aterosclerosis. La
implicación de la LPL en la enfermedad de la arteria
coronaria se sospechaba, puesto que los raros homocigotos con
defectos en este gen tienen hiperlipoproteinemina de tipo I (OMIM
238600) y enfermedad prematura de la arteria coronaria (P. Benlian
et al., Premature atherosclerosis in patients with familial
chylomicronemia caused by mutations in the lipoprotein lipase
gene, N. Engl. J. Med. 335:848-54 [1996]).
La lipoproteína lipasa (LPL; E.C.
3.1.1.34), también conocida como triacilglicerol acilhidrolasa, es
una enzima de glucoproteína que se puede liberar de heparina, unida
a los componentes glucosaminoglicanos de los macrófagos y a la
supericie luminal de las células epiteliales capilares en una
variedad de tejidos humanos, incluyendo corazón, músculo
esquelético, adiposo, pulmón y cerebro. (K.L. Wion et al., Human
lipoprotein lipase complementary DNA sequence, Science 235:1638
[1987]; C. Heizmann et al., DNA polymorphism haplotypes of the
human lipoprotein lipase gene: possible asociation with high
density lipoprotein levels. Hum. Genet.
86:578-84 [1991]). La lipoproteína lipasa es activa
como un dímero de subunidades idénticas, cada una de aproximadamente
62,500 D en forma no glicosilada. (M.R. Taskinen et al., Enzymes
involved in triglyceride hydrolysis. En: James Shepard (Ed.),
Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 1, Nº
3, Bailliere Tindall, Londres, págs. 639-66
[1987]).
La lipoproteína lipasa es una enzima limitante de
la velocidad para la hidrólisis y eliminación de lipoproteínas ricas
en triglicéridos, tales como los quilomicrones, VLDL y
LDL-C procedentes del torrente sanguíneo. (Jukema
et al., The Asp_{9}Asn Mutation in the lipoprotein Lipase Gene
Is Associated With Increased Progression of Coronary
Atherosclerosis, Circulation
94(8):1913-18 [1996]). La acción enzimática
de la LPL da como resultado la generación de mono y
diglicéridos y ácidos grasos libres que se pueden utilizar como
combustible para obtener energía o volverse a esterificar para su
almacenamiento en el tejido adiposo periférico.
La secuencia génica de la LPL humana es
conocida, incluyendo la región 3' a través del exón 10 y la región
3' sin traducir (3'-UTR). K.L. Wion et al.,
Human lipoprotein lipase complementary DNA sequence, Science
235:1638-41 [1987]; T.G. Kirchgessner et al., The
sequence of cDNA encoding lipoprotein lipase, J. Biol. Chem.
262(18):8463-66 [1987]; K. Oka et al.,
Structure and polymorphic map of human lipoprotein lipase gene,
Biochim. Biophys. Acta 1049:21-26 [1990]; D.A.
Nickerson et al., DNA sequence diversity in a
9.7-kb region of the human lipoprotein lipase
gene, Nat. Genet. 19:233-40 [1998]). Nickerson
et al. secuenciaron la región del gen de la LPL que
abarca los exones 4-9 (que contienen la principal
porción catalítica de la enzima) de 71 individuos tomados de 3
poblaciones diferentes y se observaron 88 variantes diferentes de
ADN o polimorfismos, con 78 de éstos presentes en una frecuencia
alélica superior al 1% (D.A. Nickerson et al., [1998]).
Dos polimorfismos de la LPL se sabe que
afectan a la actividad de la LPL. La mutación D9N en el exón
2 se ha asociado con el aumento de los niveles de triglicéridos y
con la aparición de aterosclerosis coronaria, atenuando la capacidad
de la pravastatina para disminuir el LDL-C. (J.
Jukema et al., [1996]). La mutación N291S en el exón 6 se ha
asociado con niveles reducidos de HDL-C. (P. Reymer
et al., A lipoprotein lipase mutation [asn291ser] is associated
with reduced HDl cholesterol levels in premature
atherosclerosis, Nat. Gen. 10:28-34 [1995]; H.H.
Wittrup et al., A common substitution [asn291ser] in lipoprotein
lipase is associated with increased risk of ischemic heart disease,
J. Clin. Inves. 99:1606-13 [1997]). La mutación
N291S también está relacionada con el aumento de la estenosis
coronaria (estrechamiento del lumen arterial) observada mediante
angiografía en mujeres con enfermedad cardiaca isquémica confirmada
comparada con los controles. (H.H. Wittrup et al.,
[1997]).
Los otros dos polimorfismos de la LPL han
demostrado asociación con el desarrollo de aterosclerosis, aunque su
importancia funcional es desconocida. El primero es el polimorfismo
PvuII en el intrón 6, que está relacionado con los varios
vasos sanguíneos coronarios con más del 50% de obstrucción (X. Wang
et al., Common DNA polymorphisms at the lipoprotein lipase gene:
association with severity of coronary artery disease and
diabetes, Circulation 93:1339-45 [1996]). El
segundo es el polimorfismo HindIII en el intrón 8, asociado
con la gravedad angiográfica de la enfermedad de la arteria
coronaria. (R. Mattu et al., DNA variants at the LPL gene locus
associate with angiographically defined severity of atherosclerosis
and serum lipoprotein levels in a Welsh population, Arterio.
Thromb. 14:1090-97 [1994]; R. Peacock et al.,
Associations between lipoprotein lipase, lipoproteins and lipase
activities in young myocardial infarction survivors and
age-matched healthy individuals from Sweden,
Atherosclerosis 97:171-85 [1992]).
El avance de la farmacogenética ha demostrado que
bajo una variación genética humana subyacen diferentes respuestas
individuales al tratamiento farmacológico dentro de una población.
(Revisado en G. Alvan, Genetic polymorphisms in drug
metabolism, J. Int. Med. 231:571-73 [1992]; P.W.
Kleyn and E.S. Vesell, Genetic variation as a guide to drug
development, Science 281:1820-22 [1998]). Por
ejemplo los alelos de los genes NAT1 y NAT2
(N-acetiltransferasas) producen un fenotipo
"acetilador lento" en el 40-60% de la raza
blanca, dando como resultado un aclaramiento lento y la toxicidad
asociada de muchos fármacos, incluyendo isoniazida y procainamida
(K.P. Vatsis et al., Diverse point mutations in the human gene
for polymorphic N-acetyltransferase, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88(14):6333-37 [1991]). Un
defecto en CYP2D6 un elemento de la familia del citocromo
P450) conduce al fenotipo del "metabolizador lento" en el
5-10% de la raza blanca, afectando al metabolismo de
muchos fármacos, incluyendo algunos beta-bloqueantes
y antiarrítmicos. (Revisado en A.K. Daly et al., Metabolic
polymorphisms, Pharmac. Ther. 57:129-60 [1993]).
Algunas variaciones genéticas se pueden asociar con la acumulación
de productos tóxicos, por ejemplo, el tratamiento de pacientes
deficientes en TPMT (tiopurina metiltransferasa) con
6-mercaptopurina o azatioprina puede conducir a
toxicidad hematopoyética potencialmente fatal debida a niveles
superiores a los normales de nucleótidos de tioguanina. (R.
Weinshilboum, Methyltransferase pharmacogenetics, Pharmac.
Ther. 43:77-90 [1989]; E.S. Vesell, Therapeutic
lessons from pharmacogenetics, Ann. Intern. Med.
126:653-55 [1997]).
La presencia de múltiples factores genéticos y
ambientales que pueden producir tales grandes variaciones en cómo
funcionan los fármacos en los pacientes aboga porque se requiere la
individualización de la elección del fármaco y la dosis para el
tratamiento óptimo de la enfermedad, incluyendo enfermedad
aterosclerótica de la arteria coronaria. Jukema et al. (1996)
notificaron que el inhibidor de la HMG_CoA reductasa, pravastatina,
no disminuía el nivel de LDL-colesterol en sujetos
con el polimorfismo N9 de la LPL en el mismo grado que en
aquellos con polimorfismo D9 de la LPL. Además, J.A.
Kuivenhoven et al. (1998) observaron que la pravastatina
ralentizaba la progresión de la aterosclerosis en sujetos con el
genotipo B1B1 de la CETP, pero no en aquellos con el genotipo
B2B2 de la CETP. (J.A. Kuivenhoven et al., The role of a
common variant of the cholesterol ester transfer protein gene in the
progresión of coronary atherosclerosis, N. Engl. J. Med.
338:86-93 [1998]). Este informe sugiere que existen
interacciones entre los fármacos de estatina y algunos determinantes
genéticos de la aterosclerosis.
Ha existido una necesidad definitiva de una
prueba predictiva fiable para determinar qué pacientes padecen la
enfermedad de la arteria coronaria, o qué pacientes de CABG,
probablemente no responderán positivamente al tratamiento
farmacológico con estatina con respecto a la estenosis de una
arteria coronaria o un injerto de derivación. Tal método de pruebas
genéticas puede proporcionar información útil de modo que se pueda
administrar a los pacientes tratamientos alternativos más adecuados
individualmente para evitar el daño adicional.
Este y otros beneficios de la presente invención
se describen en el presente documento.
La presente invención se refiere a un método de
detección de la predisposición genética en un sujeto humano a la
falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina, tal
como se define en las reivindicaciones. Este método de pruebas
genéticas implica analizar los productos de amplificación de los
ácidos nucleicos en una muestra de tejido humano que incluye una
región no codificante o no traducida dentro del extremo 3' del gen
de la LPL humano. La homocigosidad de la ausencia del sitio
de restricción para HindIII en el intrón 8 del gen de la
LPL humano indica una predisposición genética a la falta de
respuesta al tratamiento con fármacos de la clase de la estatina,
tales como lovastatina, pravastatina, simvastatina, atorvastatina,
fluvastatina y cerivastatina, que se prescriben normalmente para
tratar la aterosclerosis en sujetos con enfermedad de la arteria
coronaria, o para evitar el empeoramiento del injerto (estenosis) en
pacientes de CABG.
La figura 1 muestra el empeoramiento del injerto
en sujetos relacionados con diferentes alelos variantes de la
LPL en el gen de la LPL.
La figura 1(a) muestra la localización de
algunos alelos variantes en el gen de la LPL. Las barras
verticales representan exones. La figura 1(b) muestra el
porcentaje de sujetos con empeoramiento del injerto. Cada pareja de
barras verticales representa dos grupos de genotipo para cada
marcador, tal como se define en la casilla de la base de la barra.
El número de sujetos en cada grupo de genotipo (N) se facilita
debajo de cada barra. La figura 1(c) representa las razones
de probabilidades y los límites de confianza al 95% para el
empeoramiento del injerto para cada polimorfismo.
La figura 2 muestra el empeoramiento del injerto
en sujetos por el genotipo HindIII y los grupos de
tratamiento farmacológico. El número total de sujetos en cada grupo
se facilita sobre cada barra vertical.
La presente invención se refiere a un método de
detección de la predisposición genética en un sujeto humano a la
falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la
enfermedad de la arteria coronaria o la tensión arterial elevada.
Este método de pruebas genéticas implica analizar los productos de
amplificación de los ácidos nucleicos en una muestra de tejido
humano para determinar la homocigosidad con respecto a un alelo
variante en una región no codificante o no traducida del extremo 3'
del gen de la LPL humano. La presente invención no se basa en
y no se compromete con ningún mecanismo particular mediante el cual
un alelo variante o polimorfismo de la LPL en una región no
codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL
humano produce un fenotipo de falta de respuesta al tratamiento
farmacológico con estatina.
El gen de la LPL se localiza en el brazo
corto del cromosoma 8 humano, en 8p22. (R.S. Sparkes et al.,
Human genes involved lipolysis of plasma lipoproteins: Mapping of
loci for lipoprotein lipase to 8p22 and hepatic lipase to 15q21,
Genomics 1:138-44 [1987]). El gen está próximo al
marcador microsatélite D8S1715 y flanqueado por los microsatélites
D8S261 y D8S280. Las secuencias de flanqueo más próximas de la
LPL humana se definen por los números de acceso de GenBank
M94221 y M94222 (S. Wood et al., Support for founder effect for
two lipoprotein lipase [LPL] gene mutations in French Canadians by
analysis of GT microsatellites flanking the LPL gene, sin
publicar [1992]). El gen abarca aproximadamente 30 kb y contiene 10
exones que codifican para una proteína de 475 aminoácidos que
incluye un péptido señal secretor de 27 aminoácidos. (S. Deeb y R.
Peng, Structure of the human lipoprotein lipase gene,
Biochemistry 28(10):4131-35 [1989]; T.G.
Kirchgessner et al., Organization of the human lipoprotein lipase
gene and evolution of the lipase gene family, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86:9647-51 [1989]).
El extremo 3' del gen de la lipoproteína lipasa
humano, para los fines de la presente invención, incluye las
posiciones nucleotídicas 4801 a 9734 de la secuencia de referencia
de Nickerson que se extiende desde el intrón 6 hasta el intrón 9 (Nº
de acceso de GenBank AF050163). (D.A. Nickerson et al., DNA
sequence diversity in a 9.7-kb region of the human
lipoprotein lipase gene, Nat. Genet. 19:233-40
[1998]). La secuencia completa de referencia de Nickerson es la
siguiente:
El extremo 3' del gen de la lipoproteína lipasa
humano incluye el exón 10 y la región 3' no traducida (3'UTR), al
menos parcialmente definida por las posiciones nucleotídicas 1 a
3240 de la secuencia de referencia de Oka et al., (Nº de
acceso de GenBank X52978 y X53518; Oka et al., Structure and
polymorphic map of human lipoprotein lipase gene, Biochim.
Biophys. Acta 1049(1):21-26 [1990], errata:
[Biochim. Biophys. Acta 11 de noviembre de 1991;
1090(3):357]. En la secuencia de referencia de Oka et
al., la primera y segunda señales de poliadenilación están en
los nt 15-20 y 411-416,
respectivamente (en negrita), y dos secuencias AGTAAA análogas están
en los nt 469-473 y 529-534 (en
negrita). El sitio de poli(A)adición está en el nt
439. La siguiente es la secuencia de referencia de Oka et
al.:
El extremo 3' del gen de la lipoproteína lipasa
humano incluye la secuencia de nucleótidos intermedios entre el
extremo de la secuencia de referencia de Nickerson en el intrón 9 y
el principio de la secuencia de referencia de Oka et al.
Una región no codificante o no traducida del
extremo 3' del gen de la LPL humano incluye cualquier
secuencia nucleotídica no transcrita o no traducida dentro del
extremo 3', incluyendo todas las secuencias intrónicas. Están
incluidas la parte del intrón 6 que se extiende desde la posición
del nt 4801 de la secuencia de referencia de Nickerson hasta el nt
6086; el intrón 7 desde el nt 6208 hasta el nt 7729; el intrón 8
desde el nt 7913 hasta el nt 8941; y el intrón 9 desde el nt 9047
hasta el nt 9734. También está incluido el exón 10 y el 3'UTR.
Un alelo variante en una región no codificante o
no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano es una
mutación o polimorfismo con respecto a las secuencias de referencia
de Nickerson o de Oka et al., de cualquier clase, tal como,
pero sin limitarse a, un polimorfismo de un único nucleótido (SPN).
Incluidas entre las fuentes de alelos variantes en una región no
codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL
humano se encuentran las mutaciones de deleción, mutaciones de
inserción, inversiones, translocaciones, transiciones,
transversiones o repeticiones.
Ejemplos de genotipos homocigóticos que indican
una predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento
farmacológico con estatina incluyen, pero no se limitan a, los
genotipos HindIII 2/2 y (TTTA)_{n} 4/4.
El alelo variante HindIII 2 es producido
por una transición de T a G en el sitio de reconocimiento para
HindIII único mapeado en el intrón 8, es decir, de
AAGCTT a AAGCGT, en la posición 8393 de la secuencia
de referencia de Nickerson. (K. Oka et al. [1990]; C.
Heinzmann et al., RFLP for the human lipoprotein lipase [LPL]
gene: HindIII, Nuc. Acids Res. 15:6763 [1987]; D.A. Nickerson
et al. [1998]). Para los fines de la presente invención, los
ácidos nucleicos que comprenden el locus normal del sitio de
reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la
LPL humana, son secuencias de ácidos nucleicos que solapan
con la región de seis pares de bases completa en las posiciones
8389-8394 de la secuencia de referencia de
Nickerson, sea o no AAGCTT la secuencia de ácidos nucleicos de un
sujeto humano particular en ese locus.
La secuencia de repetición del tetranucleótido
(TTTA)_{n} en el intrón 6 del gen de la LPL empieza
en la posición 4819 de la secuencia de referencia de Nickerson y se
extiende hasta la posición 4864. Existen cinco alelos o
polimorfismos de (TTTA)_{n} conocidos. El alelo 4
proporciona un fragmento nucleotídico de 131 pb cuando se realiza la
amplificación mediante PCR utilizando un conjunto de cebadores que
comprende un cebador inverso GZ-15
5'-CCT GGG TAA CTG AGC GAG ACT GTG
TC-3': SEQ. ID. NO.:33) y el cebador directo
GZ-14 (5'-ATC TGA CCA AGG ATA GTG
GGA TAT A-3'; SEQ. ID. NO.:34).
En los 4 alelos variantes de (TTTA)_{n},
se añaden dos repeticiones TTTA adicionales (mostradas a
continuación en el tipo de negrita subrayado) para dar una longitud
de los 4 alelos de (TTTA)_{n} de 131 pb. Los números de
posición nucleotídica con respecto a la secuencia de referencia de
Nickerson estarán fuera de este punto en:
Un fármaco de estatina es cualquier inhibidor de
la
3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima
A (HMG-CoA) reductasa, incluyendo, pero sin
limitarse a, lovastatina, pravastatina, simvastatina, atorvastatina,
fluvastatina y cerivastatina.
Un sujeto humano, particularmente un paciente de
CABG, que tenga una predisposición genética a la falta de respuesta
al tratamiento farmacológico con estatina, posee una inclinación,
susceptibilidad o tendencia hereditaria a desarrollar estenosis
aterosclerótica de los vasos sanguíneos coronarios, incluyendo de
una arteria coronaria nativa o de cualquier injerto de derivación de
arteria coronaria que utilice la vena safena o cualquier otra vena o
arteria, de manera que no responda al tratamiento farmacológico con
estatina. Esto no significa que en algún momento tal persona
desarrollará estenosis de un vaso sanguíneo coronario, o
empeoramiento del injerto (estrechamiento del lumen del injerto).
Simplemente significa que tiene una probabilidad mayor de
desarrollar estenosis, cuando se administra el tratamiento con
estatina, esto es en comparación con la población general de
individuos que no son homocigóticos para una mutación en el extremo
3' del gen de la LPL, por ejemplo, para los 2 alelos de
HindIII o los 4 alelos de (TTTA)_{n}, incluyendo
aquellos que tienen enfermedad aterosclerótica de la arteria
coronaria, que son pacientes con injerto de derivación de la arteria
coronaria.
Un paciente de CABG es un sujeto humano que es
candidato a la cirugía de injerto de derivación de la arteria
coronaria o uno que se ha sometido al procedimiento de injerto de
derivación de la arteria coronaria.
Se pueden tomar y recoger muestras de cualquier
tejido humano que contenga ácidos nucleicos con el fin de poner en
práctica los métodos de la presente invención. Un tejido más
preferido y conveniente del que recoger muestras es la sangre.
Recoger una muestra de tejido incluye la recogida in vitro de
células humanas cultivadas obtenidas a partir de un tejido del
sujeto o cualquier medio de toma de muestras in vivo
directamente de un sujeto, por ejemplo, mediante extracción de
sangre, punción lumbar, frotis de tejido o biopsia de tejido.
Opcionalmente, las muestras de tejido se almacenan antes del
análisis mediante medios de almacenamiento bien conocidos que
conservarán los ácidos nucleicos de las muestras en un estado
analizable, tal como un régimen de congelación rápida o de
congelación controlada, en presencia de un crioprotector, por
ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol o
propanodiol-sacarosa. Las muestras de tejido también
se pueden reunir antes o después del almacenamiento para fines de
amplificarlas para el análisis.
La amplificación de los ácidos nucleicos de una
muestra de tejido de un sujeto para obtener productos de
amplificación incluye cualquier medio convencional de acumulación
de suficiente material de ácido nucleico para el análisis. Más
preferiblemente, la amplificación se realiza mediante métodos
convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Alternativamente, la amplificación de ácidos nucleicos se realiza
con cultivo celular in vitro y recogida de las células
cultivadas del sujeto, o mediante la múltiple toma de muestras de
los tejidos del sujeto in vivo y reunión de las múltiples
muestras de tejido procedentes de un sujeto. Los ácidos nucleicos
así amplificados son productos de amplificación si incluyen una
secuencia nucleotídica no codificante o no traducida desde el
extremo 3' del gen de la LPL, por ejemplo, el locus normal
del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8, o la
región de repetición del tetranucleótido (TTTA)_{n} del
intrón 6, del gen de la LPL humano.
En una realización preferida del presente método,
se utiliza la secuenciación nucleotídica para analizar los productos
de amplificación de los ácidos nucleicos de una muestra de tejido,
para detectar la homocigosidad para una mutación en el extremo 3' de
la LPL humana. Los expertos pueden detectar la mutación
mediante cualquier medio de secuenciación nucleotídica, por ejemplo
la secuenciación didesoxi convencional o, preferiblemente,
utilizando un secuenciador automático disponible comercialmente,
comparando luego las secuencias nucleotídicas del sujeto con otras
secuencias conocidas de la LPL humana disponibles en las
bases de datos de secuencias genómicas, tales como la GenBank.
En una realización más preferida que emplea la
secuenciación nucleotídica, la secuenciación de las secuencias del
extremo 3' de la LPL se consigue mediante el uso de análisis
de polimorfismo conformacional de la cadena sencilla (SSCP) basado
en la fluorescencia, un medio fiable y de rutina de identificación
de mutaciones puntuales, pequeñas inserciones o deleciones. (J.S.
Ellison, Fluorescence-based mutation detection.
Single-strand conformation polymorphism analysis
[F-SSCP], Mol. Biotechnol.
5(1):17-31 [1996]; H. Iwahana et al.,
Multiple fluorescence-based PCR-SSCP
analysis using internal fuorescent labeling of PCR products,
Biotechniques 21(3):510-14,
516-19 [1996]; R. Makino et al.,
F-SSCP: fluorescence-based
polymerase chain
reaction-single-strand conformation
polymorphism [PCR-SSCP], PCR Methods Appl.
2(1):10-13 [1992]). Se puede utilizar un
sistema automático, tal como un secuenciador de ADN de Applied
Biosystems, equipado con GENESCAN 672^{MR}, Genotyper^{MR}, u
otro paquete de software analítico apropiado.
Opcionalmente, se puede conseguir el análisis de
alto rendimiento mediante técnicas de multiplicación por PCR bien
conocidas en la técnica. (Por ejemplo, Z. Lin et al., Multiplex
genotype determination at a large number of gene loci, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93(6):2582-87
[1996]).
En una realización más preferida, la
secuenciación nucloetídica no es necesaria para analizar los
productos de amplificación. Por ejemplo, el análisis de heterodúplex
en matrices de gel de alta resolución se emplea para detectar
incluso polimorfismos de un único nucleótido. (M.T. Hauser et
al., Generation of codominant PCR-based markers by
duplex analysis on high resolution gels, Plant. J.
16(1):117-25 [1998]). El procedimiento de
PCR/OLA se puede utilizar para analizar los productos de
amplificación para detectar SNP en el extremo 3' del gen de la
LPL humano. (B.R. Glick y J.J. Pasternak, Molecular
Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,
ASM Press, Washington, D.C., págs. 197-200 [1994]).
También se puede emplear la electroforesis en gel sensible a la
conformación de los productos de amplificación como un medio de
análisis por el experto en la práctica de los métodos de la presente
invención. (A. Markoff et al., Comparison of
conformation-sensitive gel electrophoresis and
single strand conformation polymorphism analysis for detection of
mutations in the BRCA1 gene using optimized conformation analysis
protocols, Eur. J. Genet. 6(2):145-50
[1998]).
La electroforesis para el análisis de los
productos de amplificación se realiza rápidamente y con sensibilidad
elevada utilizando cualquiera de diversos métodos de electroforesis
en placa o capilar convencional, con la que el profesional puede
elegir opcionalmente el empleo de cualquier medio que facilite la
detección de los fragmentos de ácidos nucleicos, incluyendo, pero
sin limitarse a, radionucleidos, absorbancia UV o fluorescencia
inducida por láser. (K. Keparnik et al., Fast detection of a
(CA)18 microsatellite repeat in the IgE receptor gene by
capillary electrophoresis with laser-induced
fluorescence detection, Electrophoresis
19(2);249-55 [1998]; H. Inoue et al.,
Enhanced separation of DNA sequencing products by capillary
electrophoresis using a stepwise gradient of electric field
stength, J. Chromatogr. A. 802(1):179-84
[1998]; N.J. Dovichi, DNA sequencing by capillary
electrophoresis, Electrophoresis
18(12-13);2393-99 [1997]; H.
Arakawa et al., Analysis of single-strand
conformation polymorphisms by capillary electrophoresis with laser
induced fluorescence detection, J. Pharm. Biomed. Anal.
15(9-10):1537-44 [1997]; Y.
Baba, Analysis of diseases-causing genes and
DNA-based drugs by capillary
electrophoresis. Towards DNA diagnosis and gene therapy for
human diseases, J. Chromatogr B. Biomed. Appl.
687(2):271-302 [1996]; K.C. Chan et al.,
High-speed electrophoretic separation of DNA
fragments using a short capillary, J. Chromatogr B. Biomed. Sci.
Appl. 695(1):13-15 [1997]). Cualquiera de los
tintes fluorescentes diversos pueden utilizarse opcionalmente para
marcar cebadores de la presente invención o productos de
amplificación para la facilidad del análisis, incluyendo pero sin
limitarse a, SYBR Green I,
Y1O-PRO-1, naranja de tiazol, Hex
(es decir,
6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína),
pico green, edans, fluoresceína, FAM (es decir,
6-carboxifluoresceína) o TET (es decir,
4,7,2',7'-tetracloro-6-carboxifluoresceína).
Por ejemplo, J. Skeidsvoll y P.M. Ueland, Analysis of
double-stranded DNA by capillary
electrophoresis with laser-induced fluorescence
detection using the monomeric dye SYBR green I, Anal. Biochem.
231(20):359-65 [1995]; H. Iwahana et al.,
Multiple fluorescence-based PCR-SSCP
analysis using internal fuorescent labeling of PCR products,
Biotechniques 21(30:510-14,
516-19 [1996]).
El análisis de los productos de amplificación
también se puede realizar por medio de la restricción de los
productos de amplificación con una o más enzimas de restricción.
Cuando los productos de amplificación comprenden el locus normal del
sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen
de la LPL humano, la enzima de restricción empleada es
preferiblemente HindIII. La restricción de los ácidos
nucleicos se sigue mediante la separación de los fragmentos
resultantes y el análisis de la longitud de los fragmentos o la
migración diferencial de los fragmentos en cromatografía líquida de
alta resolución desnaturalizante (DHPLC) o electroforesis en gel,
como anteriormente, incluyendo la electroforesis
capilar-restricción. Por ejemplo, esto se puede
lograr mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como
PCR-fragmentos de restricción-SSCP,
que puede detectar sustituciones, eliminaciones o inserciones de una
única base. (M. Tawata et al., A mass screening device of genome
by polymerase chain reaction-restriction
fragment-single strand conformation polymorphism
analysis, Genet. Anal.
12(3-4):125-27 [1996]; Lee
et al., Mutational analysis by a combined application of the
multiple restriction fragment-single strand
conformation polymorphism and the direct linear amplification DNA
sequencing protocols, Anal. Biochem.
205(2);289-93 [1992]).
Los cebadores nucleotídicos útiles para
amplificar los ácidos nucleicos incluyen cualquiera de una secuencia
de 15 a 18 unidades de nucleótidos que se hibridan con un fragmento
de ácido nucleico de las secuencias de referencia de Nickerson o de
Oka, en condiciones convencionales de astringencia utilizadas para
la hibridación en PCR, y en conjunto con otra secuencia cebadora que
amplifica una región no codificante o no traducida dentro del
extremo 3' del gen de la LPL humano. Un cebador preferido es
uno de 20 a 24 unidades.
Es útil para amplificar secuencias no
codificantes o no traducidas de ácidos nucleicos desde el intrón 6
(comenzando en la posición 5988 de la secuencia de referencia de
Nickerson) al intrón 9, un conjunto de cebadores oligonucleotídicos
que tienen secuencias nucleotídicas que son fragmentos de las
secuencias nucleotídicas con los números de acceso de GenBank M76722
(a continuación) y M76723 (hebra opuesta). La secuencia nucleotídica
de M76722 es la siguiente:
Por ejemplo, las secuencias de cebadores
oligonucleotídicos que son útiles para amplificar ácidos nucleicos
que comprenden el locus normal del sitio de reconocimiento para
HindIII en el intrón 8 de la LPL, incluyen pero no se
limitan a, las siguientes secuencias (la designación tras el
SEQ.ID.NO. incluye la posición nucleotídica dentro de M76222, por
ejemplo, 2701 ó 2397, en el que el 5'-terminal de la
primera secuencia empieza si hay un cebador superior ["U", es
decir, directo], en cuya posición complementaria a una posición
dentro de M76222 termina su extremo 3'-terminal si
hay un cebador inferior ["L", es decir inverso]; y la longitud
del cebador, por ejemplo, 24 bases):
Cualquier secuencia de cebador de 15 a 28
unidades que se solape con cualquiera de los SEQ.ID.NO:
1-32 ó 35-79 puede utilizarse
también para amplificar ácidos nucleicos que comprenden el locus
normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón
8 del gen de la LPL. La secuencia del cebador puede solapar
con la secuencia completa de cualquiera de los SEQ.ID.NO:
1-32 y 35-79 o puede solapar con una
o más posiciones nucleotídicas contiguas de cualquiera de los
SEQ.ID.NO: 1-32 y 35-79 y
nucleótidos adicionales adyacentes a la posición basándose en la
secuencia de referencia de Nickerson.
Otras secuencias de cebadores son útiles para
amplificar secuencias de ácidos nucleicos que incluyen la región de
repetición del tetranucleótido (TTTA)_{n} en el intrón 6.
Estos incluyen los SEQ.ID.NOS: 33 y 34, descritos anteriormente y
las siguientes secuencias de cebadores (la designación incluye la
posición nucleotídica dentro de la secuencia de referencia de
Nickerson en el acceso de GenBank AF050163, por ejemplo, 4644 ó
4934, en el que el 5'-terminal de la primera
secuencia empieza si hay un cebador superior ["U", es decir,
directo]; o la posición complementaria a una posición en AF050163 en
la que termina su extremo 3'-terminal si hay un
cebador inferior ["L", es decir inverso]; y la longitud del
cebador, por ejemplo, 24 bases):
Cualquier secuencia de cebador de 15 a 28
unidades que solape con cualquiera de los SEQ.ID.NOS: 33 y 34 ó
82-92 puede utilizarse también para amplificar
ácidos nucleicos que comprenden la región de repetición del
tetranucleótido (TTTA)_{n} en el intrón 6 de la LPL.
La secuencia del cebador puede solapar con la secuencia completa de
cualquiera de los SEQ.ID.NOS: 33-34 y
82-92 o puede solapar con una o más posiciones
nucleotídicas contiguas de cualquiera de los SEQ.ID.NO:
33-34 y 82-92 y nucleótidos
adicionales adyacentes a la posición basándose en la secuencia de
referencia de Nickerson.
Otras secuencias de cebadores son útiles para
amplificar secuencias de ácidos nucleicos en el exón 10 y el
3'-UTR. Éstas incluyen las siguientes secuencias de
cebadores (SEQ.ID.NO.:95-106) (la designación
incluye la posición nucleotídica dentro de la secuencia de
referencia de Oka en el acceso de GenBank X52978 X53518, por
ejemplo, 2564, en el que el 5'-terminal de la
primera secuencia empieza si hay un cebador superior ["U", es
decir, directo]; o la posición complementaria a una posición dentro
de X52978 X53518 en la que termina su extremo
3'-terminal si hay un cebador inferior ["L", es
decir inverso]; y la longitud del cebador, por ejemplo, 22
bases):
Cualquier secuencia de cebador de 15 a 28
unidades que solape con cualquiera de las SEQ.ID.NO.:
95-106 con respecto a su posición en la secuencia de
referencia de Oka puede utilizarse también para amplificar ácidos
nucleicos que comprenden el exón 10 y el 3'-UTR de
la LPL. La secuencia del cebador puede solapar con la
secuencia completa de cualquiera de las SEQ.ID.NO.:
95-106 o puede solapar con una o más posiciones
nucleotídicas contiguas de cualquiera de las SEQ.ID.NO.:
95-106 y nucleótidos adicionales adyacentes a la
posición basándose en la secuencia de referencia de Oka.
Las funciones de conjuntos de cebadores útiles
pata iniciar la síntesis de los ácidos nucleicos en PCR desde ambos
extremos 5' y 3' de una plantilla de ácido nucleico que comprende
una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de
la LPL humano. El conjunto de cebadores comprende dos
cebadores oligonucleotídicos cualesquiera adecuados de la presente
invención, tal como se describe en el presente documento, siempre
que el conjunto de cebadores incluya tanto un cebador directo
(superior o "U") y uno inverso (inferior o "L").
Por ejemplo, un conjunto de cebadores preferido
para amplificar ácidos nucleicos que comprenden el locus normal del
sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 de la
LPL incluye cualquier par de cebadores inferior y superior de
entre las SEQ.ID.NO.: 1-32 ó 35-79
(descritas anteriormente), o secuencias de cebadores que solapan con
cualquiera de ellas con respecto a la secuencia de referencia de
Nickerson. Un conjunto de cebadores más preferido es el cebador
inverso (inferior) SEQ.ID.NO.: 1 y el cebador directo (superior)
SEQ.ID.NO.: 2.
Conjuntos adicionales de cebadores que son útiles
para amplificar la región de la repetición del tetranucleótido
(TTTA)_{n} incluyen cualquier par de cebadores inferior y
superior de entre las SEQ.ID.NO.: 33-34 y
82-92 (descritas anteriormente), o secuencias de
cebadores que solapan con cualquiera de ellas con respecto a la
secuencia de referencia de Nickerson. Una realización más preferida
de un conjunto de cebadores para la detección de la presencia de los
4 alelos de (TTTA)_{n} incluye cebadores que comprenden las
SEQ.ID.NO.: 33 y 34.
Conjuntos adicionales de cebadores que son útiles
para amplificar el exón 10 y el 3'UTR incluyen cualquier par de
cebadores inferior y superior de entre las SEQ.ID.NO.:
95-106 (descritas anteriormente), o secuencias de
cebadores que solapan con cualquiera de ellas con respecto a la
secuencia de referencia de Oka.
El equipo de pruebas genéticas útiles es un
conjunto preparado de materiales para facilitar la amplificación de
los ácidos nucleicos de un sujeto humano que comprende una secuencia
nucleotídica de una región no codificante o no traducida del extremo
3' del gen de la LPL humano y/o analizar los productos de
amplificación de los mismos. Un equipo de pruebas genéticas de la
presente invención contiene al menos un cebador oligonucleotídico de
la presente invención y, preferiblemente comprende un conjunto de
cebadores de la presente invención, tal como se definió
anteriormente, junto con instrucciones para la puesta en práctica
del presente método. Los materiales o componentes reunidos en el
equipo de pruebas genéticas, se facilitan al profesional almacenados
de cualquier manera conveniente y adecuada que conserve su
operabilidad y utilidad. Por ejemplo, los componentes pueden estar
en forma disuelta, deshidratada o liofilizada; pueden facilitarse a
temperaturas ambiente, de refrigeración o de congelación.
El equipo de pruebas genéticas puede incorporar
una serie de cebadores oligonucleotídicos específicos para los
polimorfismos de un único nucleótido en la secuencia nucleotídica
humana del extremo 3' de la LPL, particularmente de regiones
no codificantes o no traducidas, recopilados previamente en una
configuración de "chip de ADN" (o "chip génico") para
facilitar la amplificación de los ácidos nucleicos y el análisis de
los productos de amplificación. (Por ejemplo, J.G. Hacia et al.,
Enhanced high density oligonucleotide array-based
sequence analysis using modified nucleoside triphosphates,
Nucleic Acids Res. 26(2):4975-82 [1998];
R.W. Wallace, DNA on a chip: serving up the genome for
diagnostics and research, Mol. Med. Today
3(9):384-89 [1997]; T. Pastinen et al.,
Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and diagnostics on
oligonucleotide arrays, Genome Res.
7(6):606-14 [1997]; M.T. Cronin et al.,
Cystic fibrosis mutation detection by hybridization to
light-generated DNA probes arrays, Hum. Mutat.
7(3):244-55 [1996]; A.C. Pease et al.,
Light-generated oligonucleotide arrays for rapid
DNA sequence analysis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91(11):5022-26 [1994]; E.M. Southern et
al., Arrays of complementary oligonucleotides for analyzing the
hibridisation behaviour of nucleic acids, Nucleic Acids Res.
22(8):1368-73 [1994]).
El profesional experto apreciará que la
homocigosidad para una mutación en una región no codificante o no
traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano, tal como
los genotipos HindIII 2/2 o (TTTA)_{n} 4/4, es un
factor de riesgo para la estenosis aterosclerótica en la enfermedad
de la arteria coronaria, independiente y aditivo al uso de fármacos
de estatina para reducir las LDL. Por ejemplo, el efecto del
genotipo HindIII 2/2 de la LPL en el empeoramiento
aterosclerótico del injerto es de la misma magnitud que con el uso
de un tratamiento farmacológico moderado en lugar de intensivo para
disminuir las LDL. Tal genotipo aparentemente no actúa a través de
un efecto sobre los niveles lipídicos, ni sobre la cantidad de
fármaco que se necesita para conseguir niveles más bajos. Sin
embargo, se asocia con un efecto moderado sobre la tensión
arterial.
Utilizando los métodos de la presente invención
para la detección de una predisposición genética en un ser humano a
la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para
la enfermedad de la arteria coronaria, el profesional puede
identificar pacientes homocigóticos para el alelo variante, el
genotipo HindIII 2/2. Estos pacientes están predispuestos a
desarrollar la progresión aterosclerótica, a pesar de su
cumplimiento del tratamiento intensivo hipolipemiante con
lovastatina u otros fármacos de la clase de la estatina.
Un nivel elevado de LDL-C es un
factor de riesgo importante en la enfermedad cardiaca y la
aterosclerosis, pero no es el único factor de riesgo. La presente
invención facilita al profesional una herramienta valiosa para
caracterizar mejor los pacientes individuales e identificar aquellos
pacientes que es probable que necesiten intervenciones alternativas
individualizadas distintas al tratamiento para disminuir el
LDL-C con fármacos de la clase de la estatina. Por
ejemplo, puede estar indicado el tratamiento directo para disminuir
la tensión arterial en pacientes identificados como homocigóticos
para un genotipo variante según la presente invención, debido a que
tienden a tener tensiones arteriales en el extremo superior del
intervalo normal. Tal tratamiento puede incluir, por ejemplo,
inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE) o
bloqueantes del canal del Ca^{2+}. Alternativamente, los
beta-bloqueantes, diuréticos o una combinación de
modalidades pueden ser un tratamiento más adecuado de disminución de
la tensión arterial para un paciente dado. La disminución de la
tensión arterial en combinación con el tratamiento con aspirina
puede evitar la enfermedad cardiaca en algunos pacientes. (Véase, L.
Hansson et al., Effects of intensive
blood-pressure lowering and low-dose
aspirin in patients with hypertension: principle results of the
hypertension Optimal Treatment [HOT] randomised trial, Lancet
351(9118):1755-62 [1998]; Thrombosis
prevention trial: randomised trial of low-intensity
oral anticoagulation with warfarin and low-dose
aspirin in the primary prevention of ischemic heart disease in men
at increased risk, Lancet
351(9098):233-41 [1998]).
Para los pacientes identificados como
homocigóticos para un alelo variante según la presente invención, el
profesional puede considerar una variedad de otros factores de
riesgo aterogénicos conocidos o sospechados, además de los niveles
de LDL-C, que pueden tratarse en un paciente
individual. Por ejemplo, pequeños tamaños de partícula de las LDL
pueden tratarse con fármacos derivados del ácido fíbrico, por
ejemplo, lopid, o niacina a dosis elevadas. (Véase J.R. Guyton et
al., Effectiveness of once-nightly dosing of
extended-release niacin alone and in combination for
hypercholesterolemia, Am. J. Cardiol.
82(6):737-43 [1998]). Los niveles elevados de
Lp(a) pueden tratarse con niacina, o estrogenoterapia
restitutiva en mujeres o restitución de testosterona en hombres.
Para algunos pacientes identificados como
homocigóticos para un alelo variante según la presente invención, el
profesional puede centrarse apropiadamente en alterar los factores
aterogénicos del estilo de vida tales como la dieta, fumar y el
ejercicio. (Por ejemplo, véase J.C. LaRosa, The role of diet and
exercise in the statin era, Prog. Cardiovasc. Dis.
41(2):137-50 [1998]).
En vista del coste sustancial de los fármacos de
estatina, un segundo beneficio que ha de derivarse de los pacientes
que se ha identificado que tienen una predisposición genética a la
falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina, para
la enfermedad de la arteria coronaria o la tensión arterial elevada,
es el ahorro de costes para los pacientes y los sistemas de
asistencia sanitaria, que se puede obtener basándose en tratamientos
alternativos más adecuados individualmente en lugar de regímenes de
tratamiento con estatina, para aquellos individuos para los que es
probable que la estatina sea ineficaz. (Véase D.M. Huse et al.,
Cost-effectiveness of statins, Am. J. Cardiol.
82(11):1357-63 [1998]; P.N. Durrington,
Can we afford to treat hyperlipidaemia as we should? Strategies
for rational treatment, Atherosclerosis 139 (Apéndice
1):S1-5[1998]; J.A. Farmer, Economic
implications of lipid-lowering trails: current
considerations in selecting a statin, Am. J. Cardiol.
82(6A):26M-31M [1998]).
Utilizando los métodos de la presente invención,
el profesional puede individualizar mejor el tratamiento y mejorar
la atención de los pacientes con enfermedad de la arteria
coronaria.
Los ejemplos detallados que siguen describen la
asociación genética entre los alelos variantes en regiones no
codificantes o no traducidas del extremo 3' del gen de la LPL
humano y la estenosis aterosclerótica en la enfermedad de la arteria
coronaria que no responde al tratamiento farmacológico con estatina.
Se pretende que estos ejemplos sean simplemente para ilustrar y de
ninguna manera limitan la presente invención.
Los siguientes ejemplos describirán
adicionalmente datos y análisis que apoyan una asociación genética
entre los genotipos HindIII 2/2 o (TTTA)_{n} 4/4 de
la LPL y un fenotipo de estenosis aterosclerótica en la
enfermedad de la arteria coronaria que no responde al tratamiento
farmacológico con estatina. Sólo las realizaciones referidas al
alelo HindIII 2/2 de la LPL ilustran la invención.
Se llevó a cabo un estudio de la asociación
genética mediante una comparación dentro del caso auxiliar al Ensayo
Tras el Injerto de Derivación de Arteria Coronaria (Post Coronary
Artery Bypass Graft Trial. (Investigadores del Ensayo Tras el
Injerto de Derivación de Arteria Coronaria). The effect of
aggressive lowering of low-density lipoprotein
cholesterol levels and low-dose anticoagulation on
obstructive changes in saphenus-vein
coronary-artery bypass grafts, N. Engl. J. Med.
336:153-62 [1997]). Se siguió un diseño de dos
fases. En primer lugar, se establecieron líneas celulares
linfoblastoides transformadas mediante EBV (virus de
Epstein-Barr) para sujetos de la cohorte de Los
Ángeles (L.A.), que proporcionaban una fuente permanente de ADN para
probar las hipótesis relacionadas con los genes candidatos a estar
relacionados con la aterosclerosis. Entonces, los resultados
significativos se probaron en una segunda fase mediante la obtención
de los genotipos de todos los sujetos disponibles en el ensayo
Post-CABG utilizando ADN aislado de la sangre total
enviada a Cedars-Sinai Medical Center desde los
demás centros participantes.
Los participantes se asignaron aleatoriamente,
siguiendo un diseño de dos por dos, para recibir 1) tratamiento con
lovastatina para disminuir el nivel de
LDL-colesterol hasta dentro del intervalo de
93-97 mg/dl (grupo de tratamiento intensivo) o
132-136 mg/dl (grupo de tratamiento moderado), y 2)
placebo o warfarina a dosis bajas (Post-CABG, 1997).
Se compararon los angiogramas coronarios de 1351 sujetos en su
inscripción y una media de 4,3 años después utilizando una
evaluación cuantitativa de la gravedad de la estenosis del injerto.
El empeoramiento del injerto se definió como una disminución del
diámetro del lumen de 0,6 mm o más. El porcentaje de sujetos con
empeoramiento de uno o más injertos fue del 39% en el grupo de
tratamiento intensivo comparado con el 51% en el grupo de
tratamiento moderado (p<0,001) y el porcentaje medio de injertos
por paciente que mostraban un empeoramiento fue del 27% en el grupo
de tratamiento intensivo comparado con el 39% en el grupo de
tratamiento moderado (p<0,001).
Estos resultados demuestran la eficacia de la
disminución de los niveles de LDL-colesterol con
tratamiento farmacológico con estatina en reducir el riesgo de
empeoramiento del injerto en la mayoría de los pacientes de CABG. No
se observó ningún efecto del tratamiento con warfarina en el
empeoramiento del injerto.
Se incluyeron un total de 1351 sujetos
procedentes de siete centros clínicos de toda Norteamérica en el
ensayo clínico y todos se pudieron elegir como participantes. Se
recibió el material genético de 891 sujetos que se incluyeron en el
estudio auxiliar. Los criterios de inclusión para el ensayo clínico
fueron: cirugía de derivación 1-11 años antes del
estudio; un nivel de LDL-colesterol de
130-175 mg/dl; y al menos un injerto de vena del
paciente tal como se determinó mediante angiografía. Se excluyeron
los sujetos si hubo: (a) la posibilidad de revascularización o
muerte dentro del periodo del estudio de 5 años; (b) angina
inestable o infarto de miocardio en un plazo de seis meses antes del
inicio del ensayo; (c) angina grave; (d) insuficiencia cardiaca; o
(e) contraindicaciones a las medicaciones del estudio. Id.
Los participantes se asignaron aleatoriamente en un diseño de dos
por dos al tratamiento para disminuir el nivel de
LDL-colesterol de forma intensiva (LDL objetivo de
93-97 mg/dl) o moderada (LDl objetivo de
132-136 mg/dl) con lovastatina y colestiramina si
fuese necesario, y para el tratamiento con placebo o warfarina
suficiente para mantener una razón normalizada internacional
inferior a 2. Id. El empeoramiento del injerto se determinó
comparando el angiograma inicial en la inscripción con un angiograma
de seguimiento repetido una media de 4,3 años después. "El
empeoramiento" se definió como una reducción del diámetro \geq
0,6 mm de diámetro. "Los sujetos con empeoramiento" se
definieron como aquellos sujetos con uno o más injertos que
mostraban empeoramiento.
Se recogieron los datos de cuestionarios
concernientes a datos demográficos, de historia médica y familiar y
datos angiográficos y clínicos, como parte del ensayo
Post-CABG. Se recogieron datos adicionales de
historial familiar en 891 sujetos en el estudio genético
auxiliar.
Durante los años 2-3 del ensayo
clínico, se establecieron las líneas celulares de 224 de la cohorte
de L.A. mediante la transformación de los linfocitos de la sangre
periférica con el virus de Epstein-Barr (EBV). (M.A.
Anderson y J.F. Gusella, Use of cyclosporin-A in
establishing Epstein-Barr virus transformed human
lymphoblastoid cell lines. In Vitro 21:856-58
[1984]; S. Pressman y J.I. Rotter, Epstein-Barr
virus transformation of cryopreserved lymphocytes, prolonged
experience with technique, letter to the editor, Am. J. Hum.
Genet. 49:467 [1991]). Durante los años 4-5, se
recogió la sangre total de 667 sujetos adicionales de los demás
centros. Por tanto, el ADN estaba disponible a partir de 891
sujetos. Se aisló el ADN siguiendo protocolos estándar (B.G. Herrman
y A. Frischauf, Isolation of Genomic DNA, Methods in
Enzymology 152:180-183 [1987]).
Se utilizaron técnicas convencionales sobre gel
de agarosa para obtener el genotipo de la cohorte de LA para el
polimorfismo HindIII de la LPL bialélica siguiendo a
Heizmann et al. (C.Heizmann et al., RFLP for the human
lipoprotein lipase (LPL) gene: HindIII, Nucleic Acids Res.
15:6373 [1987]). Se obtuvo el genotipo de las muestras de ADN de los
sujetos restantes para este polimorfismo así como cuatro
polimorfismos adicionales de la LPL utilizando la tecnología
fluorescente semiautomática. En la figura 1(a), se recopiló
la localización de los polimorfismos en el gen de la LPL a
partir de la información en GenBank, números de acceso G187209,
G34390, M76222 y M76223 y otras fuentes publicadas. (F. Mailly et
al., A common variant in the gene for lipoprotein lipase
(asp9-asn): functional implications and prevalence
in normal and hyperlipidemic subjects, Arterioscler. Thromb.
Vasc. Biol. 15:468-78 [1995]; P.W.A. Reymer et
al., A lipoprotein lipase mutation (asn291ser) is associated
with reduced HDL cholesterol levels in premature
atherosclerosis, Nat Genet 1995; 10:28-34
[1995]; C. Heizmann et al., DNA polymorphism haplotypes of the
human lipoprotein lipase gene: possible association with high
density lipoprotein levels. Hum. Genet.
86:578-84 [1991]; G. Zuliani y H.H. Hobbs,
Tetranucleotide repeat polymorphism in the LPL gene, Nucleic
Acids Res. 18:4958 [1990]).
Se determinaron los genotipos del marcador
utilizando una PCR con los cebadores enumerados a continuación tal
como se recomienda por el fabricante de Ampli-Taq
Gold (Perkin Elmer, Foster City, CA) en un termociclador Perkin
Elmer 9600. (Todas las ejecuciones de PCR comenzaron con 95º durante
10 minutos para activar la polimerasa). Tras la digestión con la
enzima de restricción apropiada, se reunieron los productos de la
PCR para cada sujeto procedentes de las cinco reacciones de
obtención del genotipo y se pasaron juntos sobre geles de Long
Ranger al 6% en un secuenciador semiautomático de ADN (Secuenciador
de ADN ABI 373, Applied Biosystems, Foster City, CA) con tratamiento
de gel utilizando software Genescan y Genotyper.
D9N (exón 2). Se volvió a diseñar el
ensayo de Mailley et al. (1995) utilizando la secuencia de
GenBank de acceso G187209 de modo que el cebador directo
(5'-Hex-ACT CCG GGA ATG AGG T;
SEQ.ID.NO.: 107) portaba el tinte de detección y el cebador inverso
(CCA GAA AGA AGA GAT TTT GTC; SEQ.ID.NO.: 108) introdujo un sitio de
restricción para SalI si el fragmento de PCR portaba el alelo
D9N mutado, y daba como resultado un fragmento de 98 pb para el
alelo D (1 alelo) y un fragmento de 77 pb para el alelo N (2 alelos)
tras la digestión con SalI. Las condiciones de la PCR fueron
35 ciclos de 94ºC 30 segundos, 46ºC 30 segundos, 72ºC 30
segundos.
N291S (exón 6). Se siguió el procedimiento
de Reymer et al. (1995) con Hex añadido al cebador directo.
Las condiciones de la PCR fueron 35 ciclos de 94ºC 30 segundos, 60ºC
30 segundos, 72ºC 30 segundos. El cebador inverso introduce un sitio
para RsaI parcial de modo que el alelo N dio un fragmento de
242 pb (1 alelo) y el alelo S dio un fragmento de 218 pb (2 alelos)
tras la digestión con RsaI.
PvuII (intrón 6). Se volvió a
diseñar el ensayo de Li et al. (S. Li et al., PvuII RFLP
at the human lipoprotein [LPL] gene locus, Nucleic Acids Res.
16:2358 [1998]) utilizando la secuencia del GenBank de número de
acceso g34390 de modo que los fragmentos resultantes se desplazaran
menos de 350 pb de tamaño en el ABI 373. El cebador directo fue
5'-Tet-CTG CTT TAG ACT CTT GTC CAG
GTG (SEQ.ID.NO.: 109) y el cebador inverso fue
5'-GGG TTC AAG GCT CTG TCA GTG TCC (SEQ.ID.NO.:
110). Las condiciones de la PCR fueron 35 ciclos de 94ºC 30
segundos, 55ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos. Se detectó un
fragmento de 155 pb si el sitio para PuvII estaba presente (1
alelo) y se detectó un fragmento de 282 pb si el sitio para
PuvII estaba ausente (2 alelos).
(TTTA)_{n} (intrón 6). Se siguió
el procedimiento de Zuliani y Hobbs (1990) utilizando el cebador
GZ-15 marcado con FAM (5'-CCT GGG
TAA CTG AGC GAG ACT GTG TC-3'; SEQ.ID.NO.: 33) y el
cebador GZ-14 (5'-ATC TGA CCA AGG
ATA GTG GGA TAT A-3'; SEQ. ID. NO.: 34). Las
condiciones de la PCR fueron 35 ciclos de 94ºC 30 segundos, 68ºC 3
minutos. El alelo 1 se desplazó hasta un tamaño de 119 pb, 2 hasta
123 pb, 3 hasta 127 pb, 3 hasta 127 pb, 4 hasta 131 pb y 5 hasta 135
pb.
HindIII (intrón 8). Se utilizó el
ensayo de Heinzmann et al. (1987) para la fase 1 y luego se
volvió a diseñar la fase 2 utilizando la secuencia en el GenBank,
números de acceso M76722 y M76723. El cebador inverso fue
5'-Fam-GCA TCT GCC TTC AGC TAG ACA
TTG (SEQ.ID.NO.: 1) y el cebador directo fue 5'-TCT
TCC AGA AGG GTG AGA TTC CAA (SEQ.ID.No.: 2). Las condiciones de la
PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente para
PvuII. Utilizando este conjunto de cebadores de SEQ.ID.NO.: 1
y 2, se detectó un fragmento de 228 pb si el sitio de restricción
para HindIII estaba presente (1 alelo) y se detectó un
fragmento de 330 pb si estaba ausente (2 alelos).
Se probaron las diferencias en las
características en el nivel inicial entre los grupos de tratamiento
y entre los grupos de genotipo mediante un análisis de la varianza
de una vía o pruebas de Chi-cuadrado. Se utilizaron
los valores de TG y HDH transformados mediante logaritmo para
realizar todos los análisis estadísticos con el fin de ajustar sus
distribuciones asimétricas, pero están presentes en las tableas como
medias sin transformar + DE. Se probó la asociación entre el
empeoramiento del injerto y el genotipo de la LPL mediante la prueba
de Chi-cuadrado. Se utilizó la estadística de
Mantel-Haenszel para probar las interacciones entre
genotipos y grupos de tratamiento. La proporción de injertos que
mostraban empeoramiento por sujeto se utilizó como la medida
cuantitativa del empeoramiento del injerto, y se realizó una
regresión múltiple para esta proporción como una función del
genotipo y el grupo de tratamiento para identificar factores
pronóstico. Las variables ajustadas para esta característica
incluyeron la edad, sexo, índice de masa corporal, estado de
fumador, número de años desde la CABG, tensión arterial sistólica y
diastólica, uso de medicinas actual e historia familiar tal como se
enumera en la tabla 1. Todos los análisis estadísticos se llevaron a
cabo con software SAS (versión 6.12, SAS Institute, Cary, NC).
La tabla 1(a) compara las características
en el nivel inicial de los sujetos en los grupos de tratamiento
farmacológico intensivo y moderado. Se observaron diferencias
menores en el porcentaje de sujetos con una historia de accidente
cerebrovascular, porcentaje que utilizaba tratamientos para la
diabetes, tensiones arteriales sistólica y diastólica, y niveles
iniciales de LDL. La diferencia sumamente significativa en los
niveles en el equilibrio de colesterol total y
LDL-colesterol entre estos dos grupos refleja el
efecto del tratamiento farmacológico. Tal como se muestra en la
tabla 1(b), se observaron diferencias significativas entre
los 891 sujetos en el estudio genético y los 460 sujetos que no se
incluyeron: frecuencia de infarto de miocardio previo, 46% frente al
55%, p=0,001; fumadores 9% frente al 14%, p=0,005; años medios desde
la CABG hasta la inscripción, 4,7 frente a 5,2 años, p<0,001; y
uso de aspirina, 79% frente al 69%, p=0,001.
La obtención del genotipo de la cohorte de L.A.
para el polimorfismo HindIII de la LPL demostró que la
proporción de sujetos con empeoramiento del injerto aumentó con el
número de 2 alelos HindIII: 42% en los que no tienen ninguno
de los 2 alelos HindIII, 54% en los que tienen uno, y 72% en
los que tienen los dos (prueba X^{2} 2x3 de asociación,
p=0,05). Además, se calculó el porcentaje de injertos que mostraban
empeoramiento por sujeto y la media de este porcentaje también
aumentó con el número de 2 alelos HindIII de la LPL,
con un 22% en los sujetos con HindIII 1/2, 31% en los sujetos
con 1/1,y 53% en los sujetos con 2/2 (análisis de la varianza,
p=0,001).
Con este resultado, se obtuvo el genotipo de los
667 sujetos restantes. En la tabla 2, se muestra una comparación del
porcentaje de sujetos con empeoramiento del injerto para los dos
genotipos HindIII de la LPL para los 891 sujetos. Se
observó una diferencia significativa en el porcentaje de sujetos que
mostraba empeoramiento del injerto entre los que tienen el genotipo
HindIII 2/2 de la LPL comparado con los que tienen los
genotipos HindIII 1/1 y 1/2 de la LPL combinados; el
58% de los que tienen el genotipo HindIII 2/2 de la
LPL mostraron empeoramiento comparado con el 42% de los que
tienen 1/1 o 1/2 (razón de probabilidades = 1,9, intervalo de
confianza al 95% 1,2-3,2, p=0,011). La proporción
media de injertos que muestran empeoramiento por sujeto también
aumentó de manera significativa para los que tienen el genotipo
HindIII 2/2 de la LPL (40% para HindIII 2/2
comparado con 27% para HindIII 1/1 y 1/2 de la LPL;
p=0,0066). No hubo diferencias significativas en el empeoramiento
del injerto entre sujetos con los genotipos HindIII 1/1 y 1/2
de la LPL.
Se probaron cuatro polimorfismos adicionales de
la LPL para la asociación con el empeoramiento del injerto en
la cohorte completa del estudio genético (figura 1). Los datos de
empeoramiento completos estuvieron disponibles para 792 sujetos, los
datos de obtención del genotipo completos para cada marcador
representado en la figura 1: D9N (exón 2; Mailley et al.
[1995], N291S (exón 6; Reymer et al. [1995]), PvuII
(intrón 6; "1"=sitio está presente, "2"=sitio está
ausente; S. Li et al. [1998]), (TTTA)_{n} (intrón 6;
alelo 1 es de 119 pb, 2 es de 123 pb, 3 es de 127 pb, 4 es de 131
pb, 5 es de 135 pb; D.A. Wu et al., Quantitative trait locus
mapping of human blood pressure to a genetic region at or near the
lipoprotein gene locus on chromosome 8p22, J. Clin. Invest.
97:2111-18 [1996]), HindIII (intrón 8;
"1"=sitio está presente, "2"=sitio está ausente; C.
Heizmann et al. [1987]). Una designación de "X" es una
abreviatura de "otros" genotipos. El porcentaje de sujetos con
empeoramiento del injerto es el porcentaje de sujetos con uno o más
injertos que muestran una reducción del diámetro \geq 0,6 mm.
Sólo los polimorfismos (TTTA)_{n} y
HindIII se asociaron significativamente con empeoramiento del
injerto mediante la prueba Chi-cuadrado de
asociación. No hubo asociación entre el empeoramiento del injerto y
los polimorfismos funcionales D9N y N291S y tampoco asociación con
el polimorfismo PvuII. En comparación, el genotipo 4/4 del
polimorfismo (TTTA)_{n} se asoció con empeoramiento del
injerto: 63% de sujetos con (TTTA)_{n} 4/4 tuvieron
empeoramiento de uno o más injertos comparado con el 43% de los
sujetos con otros genotipos de (TTTA)_{n} (RP=2,2, IC al
95% 1,1-4,6; p=0,027). Se encontró que el
(TTTA)_{n} de 4 alelos estaba en fuerte desequilibrio de
segregación con el HindIII de 2 alelos (p<0,001, datos no
mostrados). En consecuencia, el genotipo combinado de
(TTTA)_{n} 4/4 y HindIII 2/2 también se asoció con
empeoramiento del injerto a un nivel de significación similar a los
genotipos de (TTTA)_{n} 4/4 o HindIII 2/2 solos.
El empeoramiento del injerto también se asoció
significativamente con el genotipo HindIII 2/2 de la
LPL y los polimorfismos del tetranucleótido
(TTTA)_{n} 4/4, tanto individualmente como juntos. El
polimorfismo HindIII 2/2 de la LPL no pareció actuar
mediante ninguna variable lipídica, pero se asoció con diferencias
significativas en la tensión arterial sistólica y diastólica.
En comparación, no se observaron asociaciones
entre los criterios de valoración clínicos y los polimorfismos de la
LPL, D9N, N291S o PvuII, lo que indica que la hasta
ahora desconocida mutación funcional asociada con el empeoramiento
del injerto está en desequilibrio de segregación con los
polimorfismos (TTTA)_{n} y HindIII, y por tanto,
reside en el extremo 3' del gen de la LPL.
El análisis por regresión múltiple demostró que
no hubo diferencias en los valores lipídicos en suero iniciales o de
equilibrio, o en la respuesta al tratamiento hipolipemiante entre
aquellos sujetos con el genotipo HindIII 2/2 de la LPL
y aquellos con los otros genotipos HindIII (es decir, 1/1 ó
1/2). Aunque la presente invención no se compromete con ningún
mecanismo particular, esta observación indica que el polimorfismo de
la LPL no actúa mediante un efecto sobre el
LDL-colesterol. Este resultado es congruente con el
de Peacock et al. (1992) que observaron una asociación entre
HindIII de 2 alelos de la LPL y la gravedad
angiográfica de la aterosclerosis sin observar diferencias
concomitantes en los niveles lipídicos en suero medios en ayunas en
una comparación de personas jóvenes que sobrevivieron a un infarto
de miocardio y controles con edad correspondiente.
Se observaron algunas diferencias significativas
en los factores de riesgo importantes para la aterosclerosis entre
el grupo de sujetos en el estudio genético descrito en el presente
documento, incluyendo: la frecuencia de infartos de miocardio
previos, fumadores, uso de aspirina y años medios desde la CABG
hasta la inscripción. Pero si se produjo un sesgo de supervivencia,
conduciría a una subestimación del efecto del genotipo
HindIII 2/2 de la LPL sobre el riesgo de empeoramiento
del injerto. Además, en los 891 sujetos para los que estaba
disponible el ADN, no hubo diferencias importantes entre los grupos
de tratamiento intensivo y moderado con respecto al efecto de
HindIII 2/2 sobre la respuesta al tratamiento con estatina,
tal como se describió anteriormente.
Para investigar los mecanismos potenciales de la
asociación entre el genotipo HindIII 2/2 de la LPL y
el empeoramiento del injerto, se compararon las características en
el nivel inicial y la respuesta de los sujetos a la acción
hipolipemiante de la lovastatina entre los sujetos (tabla 3). No se
observaron diferencias entre los valores iniciales para el
colesterol total, HDL-colesterol y triglicéridos.
Sin embargo, se observó una pequeña diferencia en el
LDL-colesterol, 159,6+2,1 mg/dl para los sujetos con
HindIII 2/2 comparado con 155,0+0,7 para 1/1 y 1/2, p=0,04.
No hubo diferencias en ninguno de los valores lipídicos obtenidos
como resultado del tratamiento farmacológico durante el ensayo, ni
fue significativamente diferente la cantidad de fármaco necesaria
para conseguir los valores lipídicos diana entre los dos grupos de
genotipo. En comparación con el perfil lipídico esencialmente
similar de los grupos de genotipo HindIII de la LPL,
los sujetos con HindIII 2/2 variaron conformemente en un
conjunto de parámetros fisiológicos. Tuvieron una tensión arterial
media superior, tensión sistólica de 138,6+2,1 mmHg frente a
133,7+0,6 para los sujetos con otros genotipos, p=0,03; y tensión
diastólica de 82,1+1,0 mmHg frente a 79,4+0,3 para los sujetos con
otros genotipos, p=0,02.
El análisis por regresión múltiple mostró que el
empeoramiento del injerto o la estenosis se asociaba con una
interacción entre el genotipo de la LPL y la tensión
arterial. El efecto observado de HindIII de la LPL
sobre la tensión arterial probablemente tiene aquí poco efecto
en sujetos normales. Sin embargo, en presencia de patología vascular
en curso o aterosclerosis clínica, un cambio moderado debido a un
factor genético podría ejercer un efecto mayor. Por ejemplo,
mientras que un aumento de la tensión arterial dentro del intervalo
normal tiene poco efecto en la población general, ligeros aumentos
en la tensión arterial son un factor de riesgo significativo para la
neuropatía en la diabetes de tipo I, de tal manera que se recomienda
la intervención para disminuir la tensión arterial para algunos
pacientes normotensos diabéticos de tipo I (J. Barzilay et al.,
Predisposition to hypertension: risk factor for nephropathy and
hypertension in IDDM, Kidney Int. 42:723-30
[1992]; E.J. Lewis et al., The effect of
angiotensin-converting enzyme inhibition on diabetic
nephropathy, N. Engl. J. Med. 329:1456-62
[1993]). Por tanto, para los pacientes con un genotipo de la
LPL desfavorable (por ejemplo, HindIII 2/2) pueden
estar indicados otros tratamientos además o en lugar del tratamiento
hipolipemiante con estatina para la prevención de la estenosis
aterosclerótica.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En la figura 2, se muestra el porcentaje de
sujetos con empeoramiento del injerto cuando se estratificaron por
grupo de tratamiento con lovastatina y genotipo HindIII de la
LPL. Los datos completos del genotipo HindIII de la
LPL y los datos de empeoramiento estuvieron disponibles para
786 sujetos.
El porcentaje más elevado de sujetos con
empeoramiento fue para aquellos con el genotipo HindIII 2/2
asignado al grupo de tratamiento hipolipemiante moderado (65%). El
porcentaje más bajo de sujetos con empeoramiento fue para aquellos
con el genotipo HindIII 1/1 ó 1/2 asignado al grupo de
tratamiento hipolipemiante intensivo (35%). Dentro del grupo de
genotipo HindIII 1/1 ó 1/2 de la LPL, el grupo de
tratamiento farmacológico moderado tuvo un porcentaje
significativamente superior de sujetos con empeoramiento del injerto
que el grupo de tratamiento intensivo, 49% comparado con el 35%,
razón de probabilidades = 1,8, intervalo de confianza al 95% 1,3 a
2,4, p<0,001. Dentro del grupo de tratamiento intensivo, el grupo
de genotipo HindIII 2/2 de la LPL, tuvo un porcentaje
significativamente superior de sujetos con empeoramiento del
injerto, 54% frente al 35%, RP=2,14, IC al 95%
1,11-4,11, p=0,23. El efecto del genotipo sobre el
empeoramiento del injerto, ajustado por tratamiento, fue
significativo a p=0,006, RP=2,06, IC al 95%
1,23-3,43, y el efecto del tratamiento sobre el
empeoramiento del injerto, ajustado por genotipo, fue significativo
a p=0,001, RP=1,78, IC al 95% 1,32-2,4. El efecto
combinado de ambos, el genotipo HindIII de la LPL
desfavorable con el tratamiento farmacológico moderado dio una
razón de probabilidades de 3,5 para el empeoramiento del injerto, IC
al 95% 1,4-8,7, p=0,002.
Utilizando la proporción de injertos con
empeoramiento por sujeto como variable dependiente, se probaron las
interacciones entre los factores utilizando el análisis por
regresión múltiple. Tras hacerse ajustes para la edad, sexo, índice
de masa corporal (BMI), fumadores, uso de medicación actual,
historia médica e historia familiar, el grupo de tratamiento
farmacológico (p=0,0001) y la interacción entre el genotipo
HindIII 2/2 de la LPL y la tensión arterial sistólica
(p=0,0046) permanecieron significativos. No se observó interacción
entre la dosis de lovastatina requerida para llevar a cada sujeto a
su nivel de LDL-colesterol objetivo y el genotipo
HindIII 2/2.
Cuando se estratificaron los sujetos por su
genotipo HindIII de la LPL y el grupo de tratamiento
farmacológico, cada factor tuvo un efecto similar sobre el
empeoramiento del injerto, con razones de probabilidades de 2,1 y
1,8, respectivamente. El efecto combinado de ambos, el genotipo
HindIII de la LPL desfavorable con la disminución de
lípidos moderada dio una razón de probabilidades para el
empeoramiento del injerto de 3,5 (IC al 95% 1,4-8,7,
p=0,002). Este análisis demuestra que el genotipo HindIII 2/2
de la LPL es un factor de riesgo independiente y aditivo para
el empeoramiento de los injertos con una razón de probabilidades de
la misma magnitud que para la disminución de lípidos en el ensayo
Post-CABG.
Se presentan las siguientes reivindicaciones,
siendo los ejemplos anteriores ilustrativos pero no una descripción
exhaustiva de las realizaciones de la presente invención.
\vskip0.333000\baselineskip
<110> Cedar-Sinai Medical
Center (Asignado)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Prueba genetica para determinar la
falta de respuesta al tratamiento farmatologico con estatina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> CEDAR-045110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<140> No asignado
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
2000-06-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<150> US 09/347,114
\vskip0.333000\baselineskip
<151>
1999-07-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatctgcct tcagctagac attg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttccagaa gggtgagatt ccaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaaacata agccctgaat c
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\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaacataa gccctgaatc g
\hfill21
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<210> 6
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipcctgaatcgc tcacagttat t
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<210> 7
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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\hfill21
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<210> 8
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatcgctcac agttattcag t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 9
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggcactgt ttcttgtaag t
\hfill21
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<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactatagtt tgcaaaatcc c
\hfill21
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<210> 11
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaacctccg agatgctacc tgga
\hfill24
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<210> 12
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatgctacc tggataatca aaga
\hfill24
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<210> 13
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipgatgctacct ggataatcaa agat
\hfill24
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<210> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 14
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttccagaag ggtgagattc caag
\hfill24
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<210> 15
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipccagaagggt gagattccaa gata
\hfill24
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<210> 16
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagaagggtg agattccaag ataa
\hfill24
\newpage
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<210> 17
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskipcccacccatg tgtacccata aaat
\hfill24
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<210>18
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskipccacccatgt gtacccataa aatg
\hfill24
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<210> 19
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskipcccatgtgta cccataaaat gaat
\hfill24
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<210> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212>DNA
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskipgtacccataa aatgaattac acag
\hfill24
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<210> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskipcccataaaat gaattacaca gaga
\hfill24
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 22
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\hskip-.1em\dddseqskipatgaattaca cagagatcgc tata
\hfill24
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<210> 23
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskipacacagagat cgctatagga ttta
\hfill24
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<210> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 24
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\hskip-.1em\dddseqskipttataacatt tccatcccca agat
\hfill24
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<210> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatctgcctt cagctagaca ttgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 26
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcattaag gaattagggc atct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatcaactc tgccatctct tagc
\hfill24
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<210> 28
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskiptcttatatgtta ctgggctttc acca
\hfill24
\newpage
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<210> 29
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\hfill24
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<210> 30
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 30
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcctagag cagtcttatg ttac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 31
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagcctaga gcagtcttat gtta
\hfill24
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<210> 32
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagacagccta gagcagtctt atgt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgggtaac tgagcgagac tgtgtc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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\newpage
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.333000\baselineskip
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<211> 22
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<212> DNA
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\vskip0.333000\baselineskip
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskiptcgctcacag ttattcagt
\hfill19
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskipcgctcacagt tattcagtg
\hfill19
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<210> 73
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 73
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\hskip-.1em\dddseqskipaatcccagca catttagtat
\hfill20
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\vskip0.333000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactatagttt gcaaaatccc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgagagctgg gattagaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagctggg attagaagt
\hfill19
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagctggga ttagaagtc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212>DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatcccagca catttagtat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccacccatg tgtacccata
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 9734
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 3867
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 81
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggacaaga gtctaaagca gcat
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatcgcttg aaccggaaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatcagtc ttaagagatc tgtg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacagatctc ttaagactga tggt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttcacct ggacaagagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtaactga gcgagaccgt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcacctgga caagagtcta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttgaaccg gaaag
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcacctggac aagagtctaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<212>DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtaactga gcgagaccgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccagcctg ggtaact
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaagagtct aaagcagcat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 668
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 3240
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaaaagag catatggtgg tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcccaggt atacatatgt aacta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcccaggta tacatatgta actaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaaagagc atatggtggt tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaagagca tatggtggtt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccaggtat acatatgtaa ctaac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagagcat atggtggttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttctctca gctcccagcc aacaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcacaccaa catggcccag gta
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcagctccc agccaacaac cagtc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcacacca acatggccca ggta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctcccagc caacaaccag tctcg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactccgggaa tgaggt
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagaaagaa gagattttgt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctttaga ctcttgtcca ggtg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggttcaagg ctctgtcagt gtcc
\hfill24
Claims (18)
1. Método de detección de la predisposición
genética en un sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento
farmacológico con estatina para la prevención de la estenosis
aterosclerótica, que comprende:
a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el
locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el
intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a
partir de una muestra de tejido recogida de un sujeto humano para
obtener los productos de amplificación, y
b) analizar los productos de amplificación para
determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para
HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa
humano,
en el que la homocigosidad para la ausencia de
dicho sitio de reconocimiento para HindIII indica una
predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento
farmacológico con estatina para la prevención de la estenosis
aterosclerótica.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la
muestra de tejido es una muestra de sangre.
3. Método según la reivindicación 1, que
comprende además restringir los productos de amplificación con una
enzima de restricción antes de analizar los productos de
amplificación.
4. Método según la reivindicación 3, en el que la
enzima de restricción es HindIII.
5. Método según la reivindicación 1, en el que se
utiliza un cebador oligonucleotídico en la amplificación de dichos
ácidos nucleicos.
6. Método según la reivindicación 1, en el que se
utiliza un oligonucleótido que comprende la secuencia 5'- GCA TCT
GCC TTC AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) en la
amplificación de dichos ácidos nucleicos.
7. Método según la reivindicación 1, en el que se
utiliza un cebador oligonucleotídico que comprende la secuencia
5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC
CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2) en la amplificación de dichos
ácidos nucleicos.
8. Método según la reivindicación 1, en el que se
utiliza un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia 5'- GCA
TCT GCC TTC AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) ó
5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC
CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2) en la amplificación de dichos
ácidos nucleicos.
9. Método según las reivindicaciones 1 y
5-8, en el que se utilizan un cebador
oligonucleotídico inverso que tiene la secuencia 5'- GCA TCT GCC TTC
AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) y un cebador
oligonucleotídico directo que tiene la secuencia
5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC
CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2) en la amplificación de dichos
ácidos nucleicos.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
se utiliza un cebador oligonucleotídico en la amplificación de
dichos ácidos nucleicos, comprendiendo dicho cebador una secuencia
nucleotídica de (SEQ.ID.NO.: 1), (SEQ.ID.NO.: 2), (SEQ.ID.NO.: 3),
(SEQ.ID.NO.: 4), (SEQ.ID.NO.: 5), (SEQ.ID.NO.: 6), (SEQ.ID.NO.: 7),
(SEQ.ID.NO.: 8), (SEQ.ID.NO.: 9), (SEQ.ID.NO.: 10), (SEQ.ID.NO.:
11), (SEQ.ID.NO.: 12), (SEQ.ID.NO.: 13), (SEQ.ID.NO.: 14),
(SEQ.ID.NO.: 15), (SEQ.ID.NO.: 16), (SEQ.ID.NO.: 17), (SEQ.ID.NO.:
18), (SEQ.ID.NO.: 19), (SEQ.ID.NO.: 20), (SEQ.ID.NO.: 21),
(SEQ.ID.NO.: 22), (SEQ.ID.NO.: 23), (SEQ.ID.NO.: 24), (SEQ.ID.NO.:
25), (SEQ.ID.NO.: 26), (SEQ.ID.NO.: 27), (SEQ.ID.NO.: 28),
(SEQ.ID.NO.: 29), (SEQ.ID.NO.: 30), (SEQ.ID.NO.: 31), (SEQ.ID.NO.:
32), (SEQ.ID.NO.: 35), (SEQ.ID.NO.: 36), (SEQ.ID.NO.: 37),
(SEQ.ID.NO.: 38), (SEQ.ID.NO.: 39), (SEQ.ID.NO.: 40), (SEQ.ID.NO.:
41), (SEQ.ID.NO.: 42), (SEQ.ID.NO.: 43), (SEQ.ID.NO.: 44),
(SEQ.ID.NO.: 45), (SEQ.ID.NO.: 46), (SEQ.ID.NO.: 47), (SEQ.ID.NO.:
48), (SEQ.ID.NO.: 49), (SEQ.ID.NO.: 50), (SEQ.ID.NO.: 51),
(SEQ.ID.NO.: 52), (SEQ.ID.NO.: 53), (SEQ.ID.NO.: 54), (SEQ.ID.NO.:
55), (SEQ.ID.NO.: 56), (SEQ.ID.NO.: 57), (SEQ.ID.NO.: 58),
(SEQ.ID.NO.: 59), (SEQ.ID.NO.: 60), (SEQ.ID.NO.: 61), (SEQ.ID.NO.:
62), (SEQ.ID.NO.: 63), (SEQ.ID.NO.: 64), (SEQ.ID.NO.: 65),
(SEQ.ID.NO.: 66), (SEQ.ID.NO.: 67), (SEQ.ID.NO.: 68), (SEQ.ID.NO.:
69), (SEQ.ID.NO.: 70), (SEQ.ID.NO.: 71), (SEQ.ID.NO.: 72),
(SEQ.ID.NO.: 73), (SEQ.ID.NO.: 74), (SEQ.ID.NO.: 75), (SEQ.ID.NO.:
76), (SEQ.ID.NO.: 77), (SEQ.ID.NO.: 78) o (SEQ.ID.NO.: 79), o que
comprende una secuencia que solapa con la secuencia de cualquiera de
éstas con respecto a su posición en la SEQ.ID.NO: 80 (secuencia de
referencia de Nickerson).
11. Método según la reivindicación 5, en el que
dicho cebador oligonucleotídico se marca con un tinte
fluorescente.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
dicho tinte fluorescente es SYBR Green I,
YO-PRO-1, naranja de tiazol, Hex,
pico green, edans, fluoresceína, FAM o TET.
13. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho fármaco de estatina es lovastatina, pravastatina,
simvastatina, atorvastatina, fluvastatina o cerivastatina.
\newpage
14. Método según la reivindicación 1, en el que
el sujeto humano tiene una enfermedad de la arteria coronaria y la
homocigosidad para la ausencia de dicho sitio de reconocimiento para
HindIII indica una predisposición genética en dicho sujeto
humano a la falta de respuesta al tratamiento con estatina para la
enfermedad de la arteria coronaria.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
el sujeto humano es un paciente con injerto de derivación de la
arteria coronaria.
16. Método según la reivindicación
1-2, 5 ó 14-15, más específicamente,
método de detección de la predisposición genética en un paciente con
injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) a la falta de
respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la
enfermedad de la arteria coronaria, que comprende:
a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el
locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el
intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a
partir de una muestra de sangre recogida de un paciente de CABG para
obtener los productos de amplificación; y
b) analizar los productos de amplificación para
determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para
HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa
humano,
indicando la homocigosidad para la ausencia de
dicho sitio de reconocimiento para HindIII la predisposición
genética de dicho paciente de CABG a la falta de respuesta al
tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la
arteria coronaria.
17. Método según las reivindicaciones 1, 9 ó
14-15, más específicamente un método de detección de
la predisposición genética en un paciente con injerto de derivación
de la arteria coronaria (CABG) a la falta de respuesta al
tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la
arteria coronaria, que comprende:
a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el
locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el
intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a
partir de una muestra de tejido recogida de un paciente de CABG para
obtener los productos de amplificación, utilizando un cebador
oligonucleotídico inverso que tiene la secuencia 5'- GCA TCT GCC TTC
AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) y un cebador
oligonucleotídico directo que tiene la secuencia
5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC
CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2); y
b) analizar los productos de amplificación para
determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para
HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa
humano,
indicando la homocigosidad para la ausencia de
dicho sitio de reconocimiento para HindIII la predisposición
genética de dicho paciente de CABG a la falta de respuesta al
tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la
arteria coronaria.
18. Método según las reivindicaciones 1, 4, 9 ó
14, más específicamente un método de detección de la predisposición
genética en un sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento
farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria
coronaria, que comprende:
a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el
locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el
intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a
partir de una muestra de tejido recogida de un sujeto humano para
obtener los productos de amplificación, utilizando un cebador
oligonucleotídico inverso que tiene la secuencia 5'- GCA TCT GCC TTC
AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) y un cebador
oligonucleotídico directo que tiene la secuencia
5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC
CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2);
b) restringir dichos productos de amplificación
con HindIII; y
c) analizar los fragmentos de restricción para
determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para
HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa
humano,
en el que la homocigosidad para la ausencia de
dicho sitio de reconocimiento para HindIII indica la
predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento
farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria
coronaria.
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