ES2211982T3 - Inmunidad contra la leucotoxina de pasteurella haemolytica. - Google Patents

Abstract

EL COMPLEJO DE LA ENFERMEDAD RESPIRATORIA BOVINA (ERB) O PASTEUROLOSIS NEUMONICA ES UNA ENFERMEDAD MULTIFACTORIAL DONDE UNA COMBINACION DE INFECCION VIRAL, AMBIENTE ADVERSO Y MAL ESTADO INMUNOLOGICO PUEDEN COMBINARSE PARA PREDISPONER LOS ANIMALES A LAS INFECCIONES BACTERIANAS. LA EXOTOXINA, O LEUCOTOXINA (LKT), PUEDE CONTRIBUIR EN LA PATOGENIA AL DAÑAR LAS DEFENSAS PRIMARIAS DEL PULMON Y LAS RESPUESTAS INMUNOLOGICAS SUBSIGUIENTES O AL CAUSAR INFLAMACION COMO RESULTADO DE LA LISIS LEUCOCITARIA. LA PRESENTE INVENCION APORTA UN MICROORGANISMO MODIFICADO QUE PRODUCE UNA TOXINA LKT, DONDE LA MENCIONADA TOXINA ESTA PARCIAL O TOTALMENTE INACTIVADA. EN UNA CONFIGURACION ADICIONAL DE LA PRESENTE INVENCION, SE APORTA UN MICROORGANISMO MODIFICADO DONDE UN OPERON DE LA TOXINA LKT QUE INCLUYE UN GEN ESTRUCTURAL DE LKT Y/O UN ACTIVADOR POSTRANSLACIONAL DEL ORGANISMO ESTA PARCIAL O TOTALMENTE INACTIVADO. LOS PRESENTES SOLICITANTES HAN ENCONTRADO QUE UN PRECURSOR DE LA TOXINA LKT TIENE UNA ACTIVIDAD TOXICAREDUCIDA. SORPRENDENTEMENTE, EL PRECURSOR DE LA TOXINA LKT ES CAPAZ DE INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNE EN UN ANIMAL QUE OFRECE PROTECCION CRUZADA CONTRA EL DESAFIO HETEROLOGO CON UN MICROORGANISMO QUE PRODUCE LA TOXINA LKT. UN MICROORGANISMO QUE PRODUCE NATURALMENTE UNA TOXINA LKT PUEDE MODIFICARSE PARA QUE PRODUZCA UN PRECURSOR INACTIVO DE LA TOXINA LKT MEDIANTE LA ELIMINACION DEL ACTIVADOR POSTRANSLACIONAL DEL PRODUCTO PRECURSOR. POR TANTO, EN UNA CONFIGURACION PREFERIDA, EL MICROORGANISMO ES INCAPAZ DE PRODUCIR UN ACTIVADOR POSTRANSLACIONAL DEL PRECURSOR DE LA TOXINA LKT O PRODUCE UN ACTIVADOR POSTRASLACIONAL INACTIVADO DEL PRECURSOR DE LA TOXINA LKT. EL ACTIVADOR POSTRANSLACIONAL PUEDE SER UN PRODUCTO DEL GEN LKT C.

Description

Inmunidad contra la leucotoxina de Pasteurella haemolytica.

La presente invención se refiere a microorganismos genéticamente modificados apropiados para utilizarlos como vacunas vivas. La presente invención se refiere también a la utilización de microorganismos modificados como vectores biológicos. La presente invención se refiere además a composiciones vacunales.

El complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRD), tifus o pasteurelosis neumónica, es una enfermedad multifactorial por la que una combinación de infección vírica, ambiente adverso y un estadio inmunológico deficiente pueden combinarse para predisponer a los animales a infecciones bacterianas. La BRD constituye una causa principal de pérdidas económicas en la industria alimentaria del ganado. El microorganismo principal asociado con la enfermedad es la bacteria Pasteurella haemolytica serotipo 1. (Schiefer et al 1978). Bajo condiciones normales la P. haemolytica constituye un componente de la flora normal del tracto respiratorio superior, y sólo cuando los mecanismos pulmonares de eliminación están dañados, es cuando la colonización del pulmón tiene lugar, dando lugar a la enfermedad (Frank y Smith, 1983). Se han asociado diversos factores de virulencia con P. haemolytica, incluyendo las estructuras superficiales tales como el polisacárico capsular (Adam et al, 1984), y una extoxina secretada que es termolábil y específica para los leucocitos de los rumiantes (Shewen y Wilkie, 1982).

La exotosina, o leucotoxina (Lkt), puede contribuir a la patogénesis dañando las defensas pulmonares primarias y posteriormente las respuestas inmunes o causando inflamación como resultado de lisis leucocitaria. La caracterización de la Lkt ha mostrado que es un miembro de la familia RTX de toxinas (Strathdee y Lo, 1989) que son producidas por diversas bacterias, incluyendo a Actinobacillus spp, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Bordetella pertussis, y la mayoría caracterizada producida por E.coli. Todas las toxinas RTX actúan produciendo poros en las células diana, interrumpiendo por ello el equilibrio osmótico, que conduce a la ruptura de la célula diana. Aunque el, modo de acción es idéntico para las toxinas de RTX, sus células diana varían mucho en el tipo y especificidad de las especies cruzadas. Estructuralmente, esta familia de toxinas se caracteriza por la presencia de estructuras repetitivas ricas en glicina en el interior de la toxina, que se unen al calcio y pueden tener un papel en el reconocimiento y unión a la célula diana, a una región de dominios hidrofóbicos que están implicados en la formación de los poros, en el requerimiento para la activación post traduccional y en la dependencia de una secuencia señal C-terminal para la secreción. La producción y la secreción de una toxina RTX activa requiere la actividad de por lo menos cuatro genes, C, A, B y D. El gen A codifica la toxina estructural, el gen C codifica un activador post-traduccional y los genes B y D codifican proteínas que son necesarias para la secreción de la toxina activa. La Lkt es codificada por un operon que está compuesto por cuatro genes contiguos (CABD), que se transcriben mediante un único promotor. La Lkt difiere de varias otras toxinas RTX, que presentan una amplia especificidad de la célula huésped, poseyendo una especificidad de la célula diana que se limita a los leucocitos de los rumiantes (Revisado :Coote, 1992).

La Lkt se ha asociado también con la inmunidad protectora; con anticuerpos anti-toxina en el ámbito que se relaciona con la resistencia a la enfermedad, y una vacuna comercial del sobrenadante del cultivo (Presponse: Langford Inc.., Guelph, Ontario, Canadá) que contiene Lkt y que se muestra eficaz para reducir la incidencia y gravedad de la neumonía después de una estimulación experimental y en la alimentación (Gentry et al., 1985; Mosier et al., 1986; 1989; Shewen y Wilkie, 1987; Shewen et al., 1988). Esta vacuna del sobrenadante del cultivo, además de inducir anticuerpos anti-Lkt, estimula asimismo una respuesta inmunitaria para otros antígenos solubles que se encuentran en el sobrenadante del cultivo, y por tanto, no puede reivindicarse una correlación directa entre anti-Lkt y la protección.

La utilización de las vacunas inactivadas de Pasteurella en el campo ha tenido un éxito limitado para controlar la pasteurelosis neumónica, no habiendo protegido, la administración de vacunas inactivadas, contra la enfermedad, o, en algunos casos, ha conducido a un aumento de ésta (Bennett, 1982; Morter et al, 1982). Las vacunas inactivadas también presentan las desventajas de necesitar la utilización de adyuvantes, pueden dar lugar a reacciones in situ, y en varios casos, necesitan la dosificación múltiple para obtener la protección.

Cruz et al (Molecular Microbiology 4, 1933-1939 (1990)) describe el efecto de deleciones en el gen clonado LktA de Pasteurella haemolytica sobre la función de la leucotoxina de pasteurella. Guthmiller et al (Microbial Pathogenesis 18, 307-321 (1995) describe el efecto de mutaciones en los genes de las toxinas LktB y LktD sobre la leucotoxina en Actinobacillus actinomycetemcomitans.

Constituye un objetivo de la presente invención mitigar uno o más de los problemas de la técnica anterior.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un microorganismo modificado que produce una toxina Lkt, en el que dicha toxina Lkt es parcial o totalmente inactivada.

El término "modificado" incluye la modificación mediante técnicas de ADN recombinante u otras técnicas tales como la mutagénesis química o la inducida por radiación. Allí donde las técnicas del ADN recombinante implican la introducción del ADN extraño en las células huésped, el ADN puede introducirse mediante cualquier procedimiento adecuado. Los procedimientos adecuados incluyen la transformación de las células competentes, transducción, conjugación y electroporación.

En la presente invención, se proporciona un microorganismo modificado con un operon de la toxina Lkt que incluye un gen estructural Lkt en el que el activador post traduccional está parcial o totalmente inactivado.

El término "operón de la toxina Lkt" tal como se utiliza aquí en las reivindicaciones y en la descripción, tiene el propósito de incluir los genes implicados en la expresión de una toxina Lkt que constituya un producto del operon de la toxina Lkt. Los genes incluidos en el operon de la toxina Lkt incluyen el gen activador post traduccional (C), el gen estructural (A) y los genes B y D que codifican proteínas que son necesarias para la secreción de la toxina Lkt activada.

El término "parcial o completamente inactivado" tal como se utiliza aquí en las reivindicaciones y en la descripción, incluye la modificación de un gen mediante técnicas de ADN recombinante que incluyen la introducción y deleción del ADN del gen, que incluye la sustitución única o múltiple de los nucleótidos, la adición y/o deleción que incluye la deleción parcial o total del gen, utilizando un constructo diana o la segregación plasmídica; y la mutagénesis sitio específica química o la inducida mediante radiación.

Los presentes solicitantes han encontrado que un precursor de la toxina Lkt redujo la actividad tóxica. Sorprendentemente, los presentes solicitantes encontraron también que el precursor de la toxina Lkt es capaz de inducir una respuesta inmune en un animal que ofrece protección cruzada contra el estímulo heterólogo con un microorganismo que produce la toxina Lkt.

De acuerdo con esto, en una forma de realización preferida de la invención, la toxina Lkt inactivada es un precursor de la toxina Lkt. El precursor puede ser un producto de expresión no procesado del gen estructural Lkt. El gen estructural Lkt puede ser el gen Lkt A.

Los presentes solicitantes encontraron que un microorganismo que produce naturalmente una toxina Lkt puede tratarse mediante técnicas de ingeniería genética para producir un precursor inactivo de la toxina Lkt, eliminando el activador postraduccional del producto precursor. De acuerdo con esto, el microorganismo es incapaz de producir un activador postraduccional del precursor de la toxina Lkt o produce un activador postraduccional inactivado del precursor de la toxina Lkt. El activador postraduccional puede ser un producto del gen Lkt C.

En una forma de realización preferida, el gen Lkt C del microorganismo es inactivado o eliminado parcial o completamente. El gen Lkt C puede ser inactivado mediante mutagénesis sitio-específica. El gen Lkt C puede ser inactivado mediante cualquier sustitución nucleótida única o múltiple, adición y/o deleción. Preferentemente, el gen Lkt C es inactivado mediante recombinación homóloga utilizando un constructo diana. Éste puede incluir un marcador seleccionable flanqueado por secuencias homólogas a las secuencias que flanquean el sitio de inserción deseado. El marcador seleccionable puede ser un gen que confiere resistencia a una sustancia tóxica tal como el mercurio o puede ser un determinante de la resistencia a un antibiótico. El determinante de la resistencia antibiótica puede ser un gen que codifica la resistencia a la amplicilina, la resistencia a la kanamicina o la resistencia a la estreptomicina.

En algunas circunstancias, puede no desearse tener un gen funcional de resistencia antibiótica incorporado a un microorganismo modificado. De acuerdo con esto, la presente invención considera un constructo diana que incluye elementos genéticos, tales como secuencias repetidas, que facilitan la excisión del gen de resistencia al antibiótico, una vez que el constructo diana ha experimentado la recombinación homóloga con el cromosoma del huésped.

La presente invención considera asimismo un constructo diana que no incluye un marcador seleccionable. Por ejemplo, el constructo diana puede incluir un segmento del gen Lkt C que contiene una deleción. La recombinación homóloga del constructo diana con el cromosoma huésped puede dar lugar a la introducción de una deleción en el gen Lkt C cromosómico. La selección para los recombinantes puede entonces basarse en la ausencia de producción de la toxina Lkt.

El constructo diana puede introducirse directamente en la célula huésped de forma lineal. Alternativamente, el constructo diana puede introducirse mediante un vector suicida o que no se replique. El vector suicida puede ser cualquier plásmido que no experimente la replicación en el microorganismo huésped. Los microorganismos que producen naturalmente las toxinas Lkt no son huéspedes tolerantes, a menudo, para los vectores pEP. De acuerdo con esto, los vectores pEP constituyen ejemplos de vectores suicidas que pueden utilizarse en la presente invención.

En otra forma de realización, puede alcanzarse la mutagénesis sitio específica mediante la técnica de la segregación plasmídica. Por ejemplo, un plásmido que contiene un fragmento de un gen Lkt C interrumpido por un gen marcador seleccionable, puede ser introducido en un microorganismo. El microorganismo puede ser transformado posteriormente con un segundo plásmido que contiene un segundo gen marcador seleccionable. Las células huésped que contienen ambos plásmidos, pueden entonces hacerse pasar a través de medios que seleccionan sólo el segundo plásmido. La selección de éste puede actuar contra el mantenimiento del primer plásmido. Éste puede, por ello, perderse, pero en algunos casos, puede tener lugar la recombinación del fragmento del gen Lkt C interrumpido que contiene el marcador seleccionable en el cromosoma. Este proceso puede por lo tanto alentar la recombinación del gen Lkt C interrumpido en el gen Lkt C cromosómico, inactivando de este modo el gen Lkt C cromosómico.

En un aspecto posterior de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que codifica una toxina Lkt en el que dicha toxina Lkt está parcial o totalmente inactivada, el cual vector codifica un gen de la toxina Lkt que incluye un gen activador postraduccional y estructural Lkt en el que dicho gen activador postraduccional Lkt está parcial o completamente inactivado.

El término "vector de expresión" tal como se utiliza aquí en las reivindicaciones y en la descripción, incluye un elemento cromosómico o extracromosómico que es capaz de expresar una secuencia de ADN que incluye una secuencia del ADN extraño.

El producto del gen Lkt A puede expresarse a partir de un gen Lkt A cromosómico. El gen cromosómico Lkt A puede localizarse en su posición natural en el cromosoma, o puede insertarse en el cromosoma en una posición distinta que aquélla. Además, el producto del gen Lkt puede expresarse a partir de un gen Lkt A localizado en un elemento extracromosómico tal como un plásmido. En una forma de realización, por tanto, un elemento extracromosómico que contenga un gen Lkt A puede introducirse en un microorganismo que posea un gen Lkt A cromosómico funcional y un gen Lkt C cromosómico inactivado. El producto Lkt A expresado a partir del elemento extracromosómico puede suplementar el producto Lkt A expresado a partir del gen cromosómico.

Alternativamente, el producto del gen Lkt A puede expresarse enteramente a partir de un gen o genes Lkt A localizados en elementos extracromosómicos tal como los plásmidos. Los genes Lkt A localizados en elementos extracromosómicos pueden expresarse en presencia o en ausencia de selección para el elemento extracromosómico. De este modo, en una forma de realización, un elemento extracromosómico que contenga un gen Lkt A puede introducirse en un microorganismo al que le falten genes Lkt C y Lkt A cromosómicos funcionales. El microorganismo al que le faltan genes Lkt C y Lkt A funcionales puede producirse mediante mutagénesis del microorganismo. Esta puede dar lugar a una deleción de los genes Lkt C y Lkt A o de sus partes.

El elemento extracromosómico puede ser un vector recombinante de expresión que incluya el gen Lkt A. Preferentemente, el vector recombinante de expresión permite la expresión del gen Lkt A en microorganismos que producen naturalmente toxinas Lkt. El vector recombinante de expresión puede permitir la expresión del gen Lkt A en P.haemolytica. El vector recombinante de expresión puede derivarse de un plásmido pIG. El plásmido recombinante puede derivarse de pIG3B. El plásmido recombinante puede ser pIG3B-Lkt.

Los sistemas vectoriales bacterianos que se basan en APP (Ph) proporcionan un medio alternativo para entregar moléculas vacunales de "ADN desnudo" a las células huésped. Dichos sistemas de expresión vacunal del ADN desnudo incluirán un plásmido capaz de replicarse en el sistema bacteriano, y un promotor eucariótico que controle la expresión del gen extraño/recombinante de interés.

En una forma de realización preferida, el microorganismo es capaz de producir una o más proteínas funcionales que faciliten la secreción de las moléculas de la toxina Lkt. El microorganismo puede tener genes funcionales Lkt B y/ó Lkt D. En otra forma de realización, el microorganismo es incapaz de producir, por lo menos, una de las proteínas implicadas en la secreción de las moléculas de la toxina Lkt o produce por lo menos una proteína inactiva implicada en la secreción de las moléculas de la toxina Lkt. El microorganismo puede tener un gen inactivo Lkt B y/o un gen Lkt D. Así, el microorganismo puede ser incapaz de secretar moléculas de toxina Lkt activa o inactiva.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición vacunal para la inducción de una respuesta inmunológica en un animal huésped al que se ha inoculado con dicha composición vacunal, la cual composición incluye un precursor de la toxina Lkt. El precursor de la toxina Lkt puede consistir en un producto de expresión no procesado de un gen estructural Lkt. Éste puede ser un gen Lkt A.

La presente invención proporciona además una composición vacunal para la inducción de una respuesta inmunológica en un animal huésped al que se ha inoculado con dicha composición vacunal, la cual incluye el microorganismo modificado que produce una toxina Lkt, en el que dicha toxina Lkt es parcial o completamente inactivada. Preferentemente, la toxina Lkt inactivada es un precursor de una toxina Lkt. El precursor puede ser un producto de expresión no procesado de un gen estructural Lkt. El gen estructural Lkt puede ser un gen Lkt A. El microorganismo es Pasteurella haemolytica. Preferentemente, el gen Lkt C del microorganismo es inactivado o eliminado.

En una forma de realización preferida, la composición vacunal que incluye un microorganismo modificado es una vacuna viva.

Una composición vacunal de la presente invención, puede incorporarse en cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable con o sin adyuvantes añadidos o moléculas inmunoestimuladoras.

El adyuvante puede ser de cualquier tipo apropiado. El adyuvante puede seleccionarse a partir de aceites vegetales o emulsiones suyas, sustancias activas superficiales, por ejemplo, hexadecilamina, ésteres de octadecil aminoácidos, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecil-amonio, N,N-dicoctadecil-N'-N'bis (2-hidroxietil-propano diamina), metoxihexadecilglicerol, y polipoles plurónicos; poliaminas, por ejemplo, pirano, dextransulfato, poli IC, carbopol; péptidos, por ejemplo, muramil dipéptido, dimetilglicina, tuftsin; complejos de estimulación inmunológica (ISCOMS); emulsiones de aceite; y geles minerales y suspensiones. Una suspensión mineral tal como alumbre, es decir, se prefiere hidróxido de aluminio (Al(OH)_{3}), fosfato de aluminio o sulfato de aluminio. El adyuvante puede encontrarse en cantidades de 1 a 75% en peso aproximadamente, basándose en el peso total de la composición vacunal.

Se apreciará que una vacuna según la presente invención, que incluye un precursor de la toxina Lkt, o un microorganismo capaz de producir un precursor de la toxina Lkt, pueda proporcionar protección contra diversas serovariantes de un microorganismo que produce la correspondiente toxina Lkt.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector biológico que incluye una bacteria Pasteurella haemolytica, en el que dicha bacteria se ha modificado de forma que es incapaz de producir una toxina Lkt activa.

La bacteria modificada es incapaz de producir un activador postraduccional del precursor de la toxina Lkt, o produce un activador postraduccional inactivado del precursor de la toxina Lkt. El activador postraduccional puede ser un producto de un gen Lkt C. En una forma de realización preferida, el gen Lkt C de la bacteria modificada es inactivado o eliminado. El gen Lkt C puede ser inactivado mediante cualquier sustitución nucleótido única o múltiple, adición y/o deleción.

El gen Lkt C puede inactivarse introduciendo un constructo diana que contiene un marcador seleccionable en el gen cromosómico Lkt C mediante recombinación del sitio específico. el constructo diana puede incluir elementos genéticos, tales como unidades de repetición, que facilitan la excisión del gen de resistencia antibiótica, una vez que el constructo diana ha experimentado la recombinación homóloga con el cromosoma huésped. Alternativamente, un constructo diana que no contenga un marcador seleccionable, puede utilizarse para introducir una deleción en el gen cromosómico Lkt C.

El producto del gen Lkt A puede expresarse a partir de un gen Lkt A cromosómico. El gen cromosómico Lkt A puede localizarse en su posición natural en el cromosoma, o puede insertarse en el cromosoma en una posición distinta que aquélla. Además, el producto del gen Lkt puede expresarse a partir de un gen Lkt A localizado en un elemento extracromosómico tal como un plásmido. Alternativamente, el producto del gen Lkt A puede expresarse enteramente a partir de un gen o genes Lkt A localizados en elementos extracromosómicos tales como plásmidos.

En una forma de realización preferida, el microorganismo es capaz de producir una o más proteínas funcionales que faciliten la secreción de las moléculas de la toxina Lkt. El microorganismo puede tener genes funcionales Lkt B y/ó Lkt D. En otra forma de realización, el microorganismo es incapaz de producir, por lo menos, una de las proteínas implicadas en la secreción de las moléculas de la toxina Lkt o produce por lo menos una proteína inactiva implicada en la secreción de las moléculas de la toxina Lkt.

El término "vector biológico" se utiliza en su sentido más amplio para incluir un medio biológico apropiado para la expresión de moléculas biológicamente activas. El medio biológico es preferentemente un microorganismo viable, aunque podrían utilizarse organismos muertos. El vector biológico puede no ser patogénico o convertirse en avirulento, o puede proporcionarse en cantidades no patogénicas o avirulentas efectivas. El término "moléculas biológicamente activas" incluye moléculas funcionales tales como factores de crecimiento, hormonas, enzimas, antígenos o sus partes antigénicas, citoquinas tales como interleucinas, interferones y factores de necrosis tumoral. Las moléculas pueden expresarse naturalmente mediante el vector biológico. Alternativamente, las moléculas pueden ser moléculas recombinantes que se expresan transformando el vector biológico con un plásmido que transporta un gen o genes que codifican la molécula biológicamente activa y que se expresa entonces; o integrando en el genoma huésped el plásmido y/o el gen o genes y/ó sus partes, que incluye el cromosoma y/o cualquier elemento extracromosómico que se encuentre natural o no naturalmente, en el que se expresan el gen o genes o sus partes.

Se apreciará que un vector biológico de la presente invención puede utilizarse para proporcionar una o más proteínas útiles al animal huésped. Las proteínas que se proporcionaron de este modo pueden actuar sinérgicamente para provocar un aumento de la reacción en el animal huésped. Por ejemplo, el vector biológico puede producir un antígeno en combinación con una molécula que aumenta una respuesta inmunogénica al antígeno en el animal huésped. La molécula que aumenta la respuesta inmunogénica puede ser una citoquina.

También se apreciará que un vector biológico de la presente invención puede utilizarse para proporcionar una vacuna multivalente. El término "vacuna multivalente" se utiliza en su sentido más general y abarca un microorganismo modificado capaz de inducir una respuesta inmune a dos o más distintos epítopos antigénicos en o expresados por el microorganismo modificado en el que dos o más epítopos son nativos para éste. Más habitualmente, sin embargo, una vacuna multivalente incluye un microorganismo modificado capaz de inducir una respuesta inmune para formas virulentas de dicho microorganismo, así como para los antígenos heterólogos expresados por dicho microorganismo (tales como los antígenos recombinantes o los que se han introducido mediante transducción, conjugación o transformación) y que no son nativos para el microorganismo. A este respecto, una vacuna multivalente puede dirigirse a dos o más agentes patogénicos. Las vacunas multivalentes preferidas son aquéllas capaces de inducir una respuesta inmune contra una toxina Lkt y para, por lo menos, un epítopo antigénico que pertenezca a uno o más agentes patogénicos. Estos pueden ser seleccionados de entre patógenos bacterianos tales como Pasteurella spp., Haemophilus spp., Moraxella spp., Leptospira spp., Streptococcus spp., Salmonella spp., E.coli, Fusobacterium spp., Clostridium spp., Mycobacterium spp. Los agentes patogénicos pueden también ser seleccionados de entre endoparásitos tales como Haemonchus spp., Trichostrongylus Spp., o ectoparásitos tales como Boophilus spp. Altrernativamente, los agentes patogénicos pueden seleccionarse a partir de patógenos vírales tales como el virus de la diarrea vírica (BVDV), el virus de la parainfluenza (PI3), la rinotraqueítis bovina infecciosa (IBR), coronavirus, rotavirus.

\newpage

La presente invención proporciona además un procedimiento para producir una P. haemolytica que produce una toxina Lkt que es parcial o totalmente inactivada, el cual procedimiento incluye

proporcionar un microorganismo que produce una toxina Lkt activa; e

inactivar o eliminar el gen Lkt C.

La presente invención proporciona además un procedimiento para producir una P. haemolytica modificada que produce una toxina Lkt que es parcial o completamente inactivada, el cual procedimiento incluye

proporcionar un microorganismo que es incapaz de producir una toxina Lkt activa; e

introducir un gen funcional Lkt A en dicho microorganismo.

La invención, en un aspecto todavía, proporciona un procedimiento para vacunar un animal contra un microorganismo que produce una toxina Lkt, el cual procedimiento incluye la administración a dicho animal de una cantidad inmunológicamente efectiva de una vacuna según la presente invención.

El procedimiento de vacunación puede utilizarse en el tratamiento de animales productivos tales como cerdos, ganado, ovejas, cabras. El procedimiento de vacunación puede también utilizarse en el tratamiento de animales de compañía tales como caballos, perros y gatos. El procedimiento de vacunación puede también utilizarse en el tratamiento humano. En una forma de realización preferida, el procedimiento de vacunación se utiliza en el tratamiento del ganado. Preferentemente, el procedimiento de vacunación se utiliza en el tratamiento del complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRD).

La administración de una vacuna o vector vacunal según la presente invención puede realizarse por cualquier vía apropiada, tal como mediante la oral o la parenteral. La administración puede ser (a través de la) mucosa, tal como nasal o vaginal. Alternativamente, la administración puede ser intramuscular, intradérmica, subcutánea, o intraperitoneal. La preparación puede ser en forma líquida o seca. La vía de administración seleccionada puede también necesitar componentes adicionales tales como inhibidores de la proteasa, anti-inflamatorios y similares.

La invención, todavía en un aspecto ulterior, proporciona un procedimiento para vacunar un animal contra un organismo patogénico, el cual procedimiento incluye la administración a dicho animal de una cantidad efectiva de un vector vacunal según la presente invención, en el cual dicho vector vacunal sintetiza una cantidad inmunológicamente efectiva de un antígeno de dicho organismo patogénico.

En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de una toxina Lkt inactiva, el cual procedimiento incluye el cultivo de un microorganismo modificado según la presente invención, y la recuperación de la toxina inactiva producida por dicho microorganismo. La toxina Lkt inactiva producida por este procedimiento puede, por ejemplo, utilizarse como el inmunógeno activo en una vacuna para estimular una respuesta inmune protectora contra la toxina Lkt.

Desde el principio hasta el final de la descripción y las reivindicaciones de la presente memoria, la palabra "comprender" y las variaciones de ésta, tales como "que comprende" y "comprende", no tiene el propósito de excluir otros aditivos, componentes, enteros o etapas.

Con objeto de que la invención pueda entenderse más fácilmente, se proporcionan los siguientes ejemplos no limitantes.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Construcción de un cassette de expresión Lkt para E.coli. El gen Lkt se clonó en pQE, que se estructura con la secuencia conductora poly HIS para permitir la expresión de Lkt. El gen de resistencia a la kanamicina de pUC4K, se clonó en un único sitio de restricción Xhol 5' de las secuencias promotoras pQE-Lkt/reguladoras. El plásmido resultante, pQE-LktK, contiene el gen Lkt bajo expresión regulada, unido al gen de resistencia a la kanamicina.

Figura 2. Mapa enzimático de restricción parcial de pIG3 (Figura 2A), un plásmido de 4,2 kb que codifica la resistencia a la estreptomicina, aislado de una cepa Australiana del Actinobacillus pleuropneumoniae. Se encontró que un fragmento PstI. de 2,3 kb (pIG317) era suficiente para codificar la replicación plasmídica y conferir resistencia a la estreptomcina cuando se auto ligó, y se transformó en E.coli o P.haemolytica. El vector plasmídico pIG3B, que contenía un sitio múltiple de clonación (MCS) y una parte del gen lac, se construyó introduciendo el fragmento Haell de pIC19R en el sitio único EcoRI de pIG317 (Figura 2B). Los sitios únicos de restricción enzimática se indican para pIG3B (C), con la excepción de PstI que corta en el MCS y en la estructura del plásmido (Figura 2C).

Figura 3. Construcción de un cassette de expresión de Lkt para utilizarlo en P.haemolytica. El cassette Lkt de expresión, unido al gen de resistencia a la kanamicina, de pQE-LktK, se aisló como un fragmento enzimático de restricción SphIl, se trató con la T4 ADN polimerasa para generar extremos romos, y se clonó en el único sitio EcoRV de pIG3B. En el sitio de clonación múltiple de pIG3B, no se indica la totalidad de los únicos sitios enzimáticos de restricción.

Figura 4. Análisis de transferencia Western de la cepa Ph:Lkt^{-} que contiene el cassette de expresión Lkt. Mediante transferencia Western, se examinaron muestras de cultivos que crecían exponencialmente de cepas EMAI, Ph:Lkt^{-} de P. haemolytica, y la cepa Ph:Lkt^{-} que contenía el cassette (pIG3B-Lkt) de expresión Lkt. Se detectaron bandas de toxinas utilizando antisueros de conejo producidos contra la Lkt. Los antisueros Lkt se unieron a un polipéptido, que correspondía en tamaño al de Lkt en las preparaciones de las cepas EMAI y Ph:Lkt^{-}/plG3B-Lkt de P. haemolytica, pero no reconocen una banda con un tamaño similar en la cepa Ph:Lkt^{-} deficiente en Lkt.

Figura 5. Cassettes basadas en pIG para la expresión de CAT en Ph. Se construyó una serie de cassettes de expresión basadas en pIG, para la expresión del gen CAT en Ph. Cada plásmido tenía la misma estructura con el promotor alineado con el extremo 5' del gen CAT. Los promotores utilizados en el estudio fueron: el promotor Ph Lkt; el promotor DNT aislado de la toxina dermonecrótica de Pasteurella multocida; y el promotor APX1 aislado de la toxina APX1 del Actinobacillus pleuropneumoniae.

Materiales y métodos Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

Las cepas de P. haemolytica utilizadas en este estudio se obtuvieron del NSW Dept. Agriculture, Elizabeth Macarthur Institute, Menangle (EMA; Australia), o de la American Type Collection (ATCC). Las cepas de P.haemolytica se hicieron crecer en caldo de infusión de corazón cerebro (BHI) a 37ºC con agitación continua. Se preparó agar sangre añadiendo hematíes de sangre desfibrinada de oveja estéril al 5%, a agar BHI. Se utilizaron antibióticos a una concentración final de 25 \mug/ml de kanamicina. La cepa DH5\alpha de E.coli se utilizó desde el principio al final de este estudio, utilizando técnicas estándar, tal como se expresó en Sambrook et al., (1989).

Aislamiento del ADN genómico de P.haemolytica

Las bacterias presentes en 1 ml de un cultivo nocturno de P.haemolytica EMAI, que crecieron en BHI, se recuperaron mediante centrifugación, descartándose el sobrenadante. El sedimento se volvió a suspender en 1 ml de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,5/1 mM EDTA), que contenía lisozima (7,5 mg/ml), y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Después de lo cual, la solución se ajustó hasta una concentración final de 0,1 M MaC1, SDS al 1%, y 2,5 \mug/ml Proteinasek, y se continuó la incubación durante la noche a 50ºC. Al día siguiente, la preparación se ajustó a 0,5 M NaCl y se extrajo dos veces con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (100:99:1, V/V/V), y el ADN genómico se precipitó entonces añadiendo 0,6 volúmenes de isopropanol.

Aislamiento y clonación del gen Lkt

La amplificación del gen Lkt se realizó utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 50 \mul que incluían 50 \etag de ADN genómico (EMAI), 3 \etag del iniciador oligonucleótido, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl_{2}, 200 mg/ml BSA, 200 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, más 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus, USA).

Las reacciones se cubrieron con un volumen igual de aceite de parafina y se calentaron hasta 94ºC durante 1 minuto, se enfriaron hasta 55ºC durante 2 minutos, y se calentaron hasta 72ºC durante 5 minutos. Este ciclo se repitió 35 veces utilizando un ciclador térmico de ADN Perkin-Elmer-Cetus. Se diseñaron oligonucleótidos específicos basados en la secuencia publicada del gen Lkt (Lo et al., 1987; Highlander et al., 1989). La secuencia de los dos oligonucleótidos fue 5' CGCGGATCCCGGGCCATGGGAACTAGACTTACAACC 3' y 5' CGCGAATTCTTAAGCTGCTCTAGC 3' y se diseñaron para producir un producto PCR con un sitio BamH1 en el extremo 5' y un sitio EcoRI en el extremo 3' para facilitar la clonación. Los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando un Sintetizador de ADN génico Assembler Plus (Pharmacia, Sweden). Los productos de las reacciones PCR, que correspondían al peso molecular predicho del gen Lkt, se aislaron a partir de geles de agarosa mediante aclaramiento génico (BRESATech, Australia), se digerieron mediante enzimas de restricción (BamHI y EcoRI), se clonaron en los sitios correspondientes de pUC18 (Yanish-Perron, et al, 1985), para formar el plásmido pUC-Lkt. La confirmación de clones que contienen el gen Lkt se alcanzó mediante secuenciación bicatenaria (resultados que no se muestran).

Transformación de P. haemolytica con ADN plasmídico

Se prepararon P. haemolytica electrocompetentes inoculando caldo BHI con una única colonia a partir de una placa de agar sangre/BHI nocturna. El cultivo se hizo crecer hasta que se alcanzó una OD_{600} de 0,8, en cuyo momento el cultivo se encontraba en crecimiento semilogarítmico (datos que no se muestran). Las bacterias se recuperaron mediante centrifugación, y se lavaron 3 veces en glicerol al 15%, y se volvieron a suspender en 1/50 del volumen original. Se transformaron alícuotas (50 \mul) de P. haemolytica electrocompetentes con ADN plasmídico, utilizando las condiciones siguientes: 1000 \Omega, 2,25 kV y 25 \muF, en cubetas de 0,2 cm. Después de electroporación, las células transformadas se hicieron crecer en caldo BHI, agitando a 37ºC durante cuatro horas, sin selección antibiótica, antes de sembrarlas en agar BHI que contenía la apropiada selección antibiótica.

Producción de antisueros

El marco de lectura abierto de Lkt derivado mediante PCR, se subclonó a partir de pUC-Lkt en el vector de expresión pGEX2T, de forma que formara parte de la estructura (o se estructurara) con el gen GST. La proteína de fusión GST-Lkt se purificó mediante cromatografía de afinidad de GST siguiendo las instrucciones de los fabricantes (Pharmacia, Suecia).

Se administraron a conejos un total de tres dosis de proteína purificada (100 \mug) con intervalos de dos semanas, la primera de las cuales dosis se aplicó con adyuvante completo de Freund, realizándose las vacunaciones ulteriores con adyuvante incompleto de Freund. Los sueros se recuperaron dos semanas después de la última revacunación.

Análisis de transferencia western

Se llevó a cabo el análisis de transferencia Western mediante el procedimiento de Sambrook et al., (1989). El suero de conejo producido contra la proteína de fusión GST-Lkt se utilizó para la detección de Lkt a una dilución de 1/50. El conjugado, utilizado en una dilución de 1 en 1.000 fue antisuero conjugado con HRP aislado mediante afinidad con anti-suero de Ig de conejo, de oveja, con tetrametilbencidina (McKimm-Breschkin 1990) como sustrato. Las muestras bacterianas para el análisis de transferencia Western se prepararon diluyendo por la noche cultivos 1 en 20 en el medio de crecimiento apropiado, e incubando a 37ºC con agitación vigorosa hasta que se alcanzó una OD_{600} de 0,8. En este momento, muestras que contenían 20 \mul del cultivo total se analizaron mediante SDS-PAGE, y las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa (Bio-Rad) utilizando una Célula de transferencia Bio-Rad, tal como se describe en las especificaciones del fabricante.

Construcción de un cassette de expresión Lkt para P. haemolytica

El marco de lectura abierto de Lkt (ORF), se subclonó a partir de pUC-Lkt en el vector de expresión pQE30 (IQAGEN Inc., Chatsworth, CA, USA) que se estructura con la señal poly-His de purificación, tal como se muestra en la Figura 1. La expresión del gen Lkt de pQE30 (pQE-Lkt) estaba bajo el control del promotor fágico T5 de E.coli y de dos secuencias del operador lac. Para facilitar la subclonación de este elemento de expresión desde pQE-Lkt en los plásmidos alternativos, se aisló el gen de resistencia a la kamamicina de pUC4K (Pharmacia) y se empleó como lanzadera a través de plC20R antes de clonarse en pQE-Lkt, tal como se esquematiza en la Figura 1. El plásmido resultante, pQE-LktK, contiene el gen de la resistencia a la kanamicina y el gen Lkt, unido al promotor T5, flanqueados ambos por sitios enzimáticos de restricción SphI únicos (Figura 1).

Un plásmido apropiado para transformar la P.haemolytica se ha desarrollado en nuestro laboratorio. El plásmido parental se aisló de una cepa Australiana de Actinobacillus pleuropneumoniae y se ha desarrollado en el vector plasmídico pIG3B, tal como se esquematiza en las Figuras 2A, 2B y 2C. El fragmento del enzima de restricción SphI que contiene el gen Lkt, y las señales de regulación de la transcripción, se aisló a partir de pQE-T1K, y se subclonó en el sitio EcoRV de pIG3B para producir el vector de expresión pIG3B-Lkt del gen Lkt A de P.haemolytica, tal como se esquematiza en la Figura 3.

Construcción de la cepa vacunal de P. haemolytica

Durante un procedimiento de mutagénesis sitio específica del cromosoma de la cepa EMAI de P. haemolytica, diseñada para eliminar una pequeña parte del gen Lkt C, se obtuvo un aislamiento que fracasó en producir una zona de hemólisis sobre las placas de agar sangre. Una caracterización ulterior de esta cepa (Ph:Lkt^{-}) mostró que era deficiente en la producción tanto de Lkt C como de A.

La cepa Ph:Lkt^{-} se transformó con pIG3B-Lkt tal como se describe en Materiales y Métodos, y el ADN se aisló de las colonias de resistencia a la kanamicina y se analizó mediante digestión enzimática de restricción para confirmar los perfiles predichos de pIG3B-Lkt.

Caracterización de la cepa vacunal de P.haemolytica

Cultivos nocturnos de la cepa Ph:Lkt^{-} que contenía pIG3B-Lkt, así como las cepas Ph:Lkt^{-} y ATCC de P. haemolytica, se examinaron mediante transferencia Western utilizando antisueros producidos en conejos contra la proteína Lkt purificada mediante afinidad GST. A partir de la transferencia Western (Figura 4), puede apreciarse que la cepa Ph-Lkt^{-} no se unió específicamente a ningún anticuerpo que se encontrara en el suero, mientras que tanto la cepa ATCC de tipo salvaje como la cepa Ph:Lkt^{-} que contenía plG3B-Lkt, produjeron proteínas del peso molecular predicho de Lkt, que reaccionaron con el antisuero Lkt.

Ejemplo 1 Evaluación de la cepa vacunal Ph Tox - en el ganado

El ganado, a la edad aproximadamente de 1 año, se sangró antes de utilizarlo para confirmar la ausencia de anticuerpos preexistentes para pH, después de lo cual se distribuyeron en dos grupos al azar de tres animales. En el día 0, un grupo de tres recibió 50 ml de un cultivo que crecía exponencialmente de Ph-Lkt (equivalente a 5 x 10^{10} c.f.u.) mediante inoculación intratraqueal. Antes del experimento de vacunación, se habían llevado a cabo experimentos en los que se administraban al ganado dosis de la cepa vacunal Ph-Lkt^{-} que oscilaban entre 5 x 10^{10} a 2 x 10^{11}, y se controlaban respecto a síntomas clínicos, realizándose la necropsia 1 semana después de la estimulación para determinar si se habían desarrollado lesiones pulmonares. En todas las dosis que se probaron no se evidenciaron lesiones pulmonares y el ganado no exhibió temperaturas que no fueran las normales. El segundo grupo sirvió como controles no vacunados. En el día 14, los animales se volvieron a vacunar como en el día 0. En el día 28, todo el ganado se había estimulado con 100 ml de un cultivo en crecimiento exponencial de Ph de tipo salvaje (equivalente a 1x10^{11} c.f.u.) mediante inoculación directa en la tráquea. Los síntomas clínicos se controlaron durante los siguientes 8 días, en cuyo momento todo el ganado se sometió a eutanasia, clasificándose las lesiones pulmonares.

El número y gravedad de las lesiones pulmonares que se encontraban en cada uno de los animales después de la necropsia, 8 días después de la estimulación, se presentan en la Tabla 1. La estimulación de los controles no vacunados con Ph llevó a una neumonía aguda en 2 de los 3 animales estimulados. El tercer animal no mostró síntomas de infección Ph después de la autopsia, posiblemente debido a un error en el suministro del estímulo mediante la tráquea, o alternativamente, como Ph constituye un comensal en muchos animales, este animal puede haber desarrollado inmunidad para Ph antes del estímulo. Dentro del grupo vacunado de animales, sólo uno desarrolló algún síntoma de infección Ph. Esta fue en forma de varios lóbulos de consolidación (menores que 1 cm de tamaño) en el lóbulo apical derecho.

Este experimento demuestra claramente el potencial de Ph-Lkt^{-} para utilizarse como una vacuna viva con el fin de proteger al ganado contra la BRD inducida por Ph. Se encontró que el estímulo con la cepa Ph-Lkt^{-} no indujo lesiones en los pulmones de los animales (hasta una dosis de 10^{11} c.f.u.), y por tanto, la cepa vacunal no afecta al ganado de forma perjudicial. En experimentos emprendidos para determinar la dosis estimulante más apropiada, el estímulo con la Ph del tipo salvaje a una dosis triple de la utilizada en este experimento, condujo a la meurte del animal (3 de 3) en menos de 48 horas. Incluso cno un estímulo extremo de 1 x 10^{11} c.f.u,, sólo uno de los animales vacunados mostró algún síntoma de infección por Ph, y ésta se produjo a un nivel mucho más reducido que el observado en dos de los tres controles no vacunados. La caracterización ulterior de las lesiones en este animal, mostró que eran crónicas, superiores en duración a los 8 días de edad (es decir, que estaban presentes antes del estímulo). Se encontró que la Ph aislada de estas lesiones produjo Lkt y por tanto, no era la cepa vacunal. Posiblemente, estas lesiones provinieran del establecimiento durante la vacunación, de una inyección oportunística de la Ph de tipo salvaje. Aunque un animal desarrolló síntomas menos importantes de la infección por Ph de la cepa Ph-Lkt^{-}, es razonable concluir que la expresión de una forma inactiva de la Lkt, conocida por tener un papel en la inmunidad protectora, aumentará, a partir de esta cepa los niveles de protección obtenidos. El potencial para expresar formas inactivas de la Lkt a partir de esta cepa. se ha demostrado en otra parte en este documento (Figura 4).

Expresión de proteínas extrañas a partir de vectores Ph

El potencial para expresar genes recombinantes a partir de Ph, se demostró más temprano en este documento, en el que se expresó el gen Lkt a partir de un plásmido, dentro de la cepa Ph Tox^{-}. Se apreció que el Lkt expresado a partir del plásmido reaccionaba con antisueros generados contra Lkt en transferencias Western (Figura 4). Además de la expresión del Lkt a partir de Ph, también es posible que antígenos adicionales pudieran ser expresados a partir de una cepa Ph, que se habría convertido en primer lugar en avirulenta mediante la modificación del operón Lkt, para generar vacunas multivalentes.

Para demostrar además que el potencial de Ph actúa como un vector bacteriano, se construyó una serie de cassettes de expresión basadas en pIG (Figura 5) en las que se utilizaron varios promotores para gobernar la expresión del gen de la cloramfenicol acetil transferasa (CAT). El gen CAT codifica un enzima que ofrece resistencia al antibiótico cloramfenicol, y se cuantifica fácilmente en reacciones enzimáticas. Los promotores utilizados para gobernar la expresión del gen CAT en Ph se aislaron, en nuestro laboratorio, a partir de varias bacterias pertenecientes a la familia Pasteurellaceae. Los diversos cassettes promotor/CAT (pIG-CAT) se construyeron en E. coli, transformándose entonces en Ph tal como se describe en materiales y métodos. El ADN plasmídico se aisló a partir de colonias resistentes a antibióticos y se analizó mediante digestión enzimática de restricción para confirmar los perfiles predichos. Se encontró que todas las cepas Ph que se transformaron con los cassettes CAT de expresión, eran resistentes al antibiótico cloranfenicol. Los niveles de la actividad CAT expresados mediante cada constructo se cuantificaron en ensayos enzimáticos.

Una muestra de un cultivo que crecía exponencialmente de Ph/pIG-CAT se sedimentó, y las bacterias se volvieron a suspender en Tris pH 8,0. Se aislaron proteínas solubles a partir de las bacterias mediante tratamiento con ultrasonidos y centrifugación, y el extracto se utilizó en ensayos de CAT, conteniendo los ensayos enzimáticos CAT 150 \mul de tampón de reacción (Cloranfenicol 1 mg/ml, ^{3}H-CoA 0,1 \mul/150 \mul (Amersham International), Tris pH 8,0) y 50 \mul de extracto proteico. Se dejó que las reacciones se llevaran a cabo durante 30 minutos, estimándose el nivel de actividad enzimática CAT mediante contaje de centelleo, utilizando el líquido de centelleo Econoflur (Dupont). Las reacciones enzimáticas CAT están basadas en la transferencia, mediante el enzima CAT, del grupo ^{3}H desde un sustrato insoluble en disolventes orgánicos (líquido de centelleo) hasta un producto soluble orgánico. Se encontró que todos los promotores que se evaluaron eran apropiados par alcanzar la expresión del gen extraño en el interior de Ph, con unos niveles de CAT obtenidos significativamente superiores que los niveles anteriores de base (Tabla 2) para todos los constructos Ph/pIG-CAT.

El desarrollo de Ph como un sistema vectorial bacteriano permitirá que proteínas extrañas, con significado comercial, se suministren a las mucosas del ganado. El tipo de proteína que podría suministrarse incluye citoquinas, que controlan y regulan el sistema inmune, que servirían para regular al alza, no específicamente el sistema inmune. La molécula o moléculas podrían también constituir antígenos protectores para otras bacterias patogénicas, con tal que tuvieran el potencial para construir vacunas multivalentes. Dichas vacunas tendrían el potencial para ofrecer protección para más de una enfermedad después de una vacunación única.

Tabla 1

Lesiones pulmonares que se encuentran en el ganado después de necropsia

Se vacunó el ganado dos veces con Ph-Lkt^{-} a intervalos de dos semanas, y se estimuló con la Ph de tipo salvaje dos semanas después de la vacunación final. Las necropsias se realizaron 8 días después de la estimulación, registrando las lesiones pulmonares.

Grupo 1

Animales no vacunados y estimulados

1.	Sin síntomas de infección por Ph
2 \textamp 3.	Neumonía aguda y consolidación de pleuritis adherente aguda del lóbulo pulmonar apical derecho. Un
	animal presentaba también una adhesión localizada entre el lóbulo diafragmático derecho y el pericar-
	dio.

Grupo 2

Animales vacunados y estimulados

1 \textamp 2.	Sin síntomas de infección por Ph.
3.	Presencia de varios lobulillos, de menos de 1 cm, en el lóbulo apical derecho. (lesiones crónicas, ma-
	yores que 8 días de edad)

Tabla 2

Expresión del gen CAT en el interior de Ph

Ph se transformó con varios constructos promotor/CAT y el nivel de la expresión del gen CAT se expresó utilizando reacciones enzimáticas. Los resultados se expresan como contajes por 30 segundos. Esto sirvió como un control negativo para medir la fragmentación espontánea del sustrato CAT.

Promotor	Actividad CAT
Sin promotor	200
Lkt	29.300
APX1	40.000
DNT	44.500

Referencias

Adam, C., Knights, J.M., Mudridge, A., Lindon, J.C., Baker, P.R.W., Beesley, J.E., Spacey, B., Carig, G.R., y Nagy, L.K. (1984) Purification, characterization, and immunological properties of serotype-specific polysaccharide of Pastereulla haemolytica (serotypeA1) organisms. J. Gen. Microbiol. 130:2415-2426.

Bennett, B.W., (1982). Efficacy of Pastereulla bacterins for yearling feedlot heifers. Bovine Pract. 3:26-30.

Coote, J.G., (1992). Structural relationships among the RTX determinants of Gram-negative bacteria. FEMS Micro. Rev. 88:137-162.

Frank, G.H., y Smith, P.C., (1983). Prevalence of Pastereulla haemolytica in tranpsorted calves. Am J. Vet. Res. 44: 981-985.

Gentry, M.J., Confer, A.W., y Panceirta, R.J., (1982). Serum neutralization of cytotoxin from Pasteurella haemolytica leukotoxin gene cluster. DNA 8:15-28.

Lo, R.Y.C. Strathdee, C.A., y Shewen, P.E., (1987). Nucleotide sequence of the leukotoxin genes of Pasteurella haemolytica A1. Infection and Immunity. 55: 1987-1996.

Morter, R.L., Amstutz, H.E., Crandell, R.A., (1982). Clinical evaluation of prophylactic regimens for bovine respiratory disease. Bovine Prac. 17:56/58.

McKimm-Breschkin, J.L., (1990). The use of tetramethylbenzidine for solid phase immunoassays. J. Immunol. Methods 135:277-280.

Mosier, D.A., Confer, A.W., Hall, S.M., Gentry, M.J. y Panciera, R.J., (1986). Enzyme-linked immunosorbant assay for the detection of serum antibodies to Pasteurella haemolytica cytotoxin (leukotoxin) in cattle. J. Clin Microbiol. 24: 218:222.

Mosier, D.A. Simons, K.R., Confer, A.W., Panciera, R.J., y Clinkenbeard, K.D., (1989). Pasteurella haemolytica antigens associated with resistance to pneumoic pasteurellosis. Infect. Immun. 57:711-716.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y.

Schiefer, B., Ward, G.E. y Moffatt. R.E., (1978) Correlation of microbiological and histological findings in bovine fibrinous pneumonia. Vet Pathol. 15:313-321.

Shewen P.E. y Wilkie B.N., (1982) Cytotoxin of Pasteurella haemolytica acting on bovine leukocytes. Infect, Immun. 35:91-94.

Shewen, P.E. y Wilkie B.N., (1987) Vaccination of calves with leukitoxic culture supernatant from Pasteurella haemolytica Can. J. Vet. Res. 52:30-36.

Strathdee, A.A. y Lo, R.Y.C., (1989) Cloning, nucteotide sequence, and characterisation of genes encoding the Pasteurella haemolytica leukotoxin determinant. J. Bact 171: 916-928.

Yanisch-Perron, C. Vieira, J., and Messing, J., (1985). Improved M13 phage cloning vectors and host strains; nucleotide sequence of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33:103-119.

Claims (26)

1. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente que comprende un operón de la toxina Lkt que incluye un gen estructural Lkt y un gen activador postraduccional de Lkt parcial o completamente inactivado que produce una toxina Lkt, en la que dicha toxina Lkt está parcial o completamente inactivada.

2. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según la reivindicación 1, que induce en un huésped una inmunidad protectora para el polipéptido estructural Lkt y para la infección por Pasteurella haemlytica.

3. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según la reivindicación 1 ó 2, en la que la toxina Lkt parcial o totalmente inactivada es un precursor de una toxina Lkt.

4. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la toxina Lkt parcial o completamente inactivada constituye un producto no procesado de la expresión de un gen estructural Lkt.

5. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el gen estructural es un gen Lkt A.

6. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el activador postraduccional está parcial o completamente eliminado.

7. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el activador postraduccional es un producto de un gen Lkt C.

8. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el activador postraduccional está parcial o completamente inactivado mediante técnicas de ADN recombinante, que incluyen la introducción y deleción de ADN del gen que codifica el activador postraduccional incluyendo la sustitución única o múltiple de los nucleótidos, la adición y/o deleción incluyendo la deleción parcial o completa del gen, la recombinación homóloga utilizando un constructo diana o la segregación plasmídica y la mutagénesis específica del sitio inducida químicamente o mediante radiación.

9. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que Pasteurella haemolytica es incapaz de producir por lo menos una de las proteínas que están implicadas en la secreción de un producto del gen de la toxina Lkt.

10. Pasteurella haemolytica modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que Pasteurella haemolytica posee un gen Lkt B parcial o completamente inactivado y/ó un gen Lkt D parcial o completamente inactivado.

11. Vector de expresión que codifica una toxina Lkt inactiva, el cual vector de expresión comprende un operón de la toxina Lkt, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 8.

12. Vector de expresión según la reivindicación 11, que se selecciona de entre el grupo que incluye plG3B y plG3B-Lkt.

13. Producto del operón de la toxina Lkt codificado por un vector de expresión según la reivindicación 11 ó la 12.

14. Composición vacunal para inducir una respuesta inmunológica a una toxina Lkt en un animal huésped, la cual composición vacunal incluye un producto del gen de la toxina Lkt según la reivindicación 13.

15. Composición vacunal para inducir una respuesta inmunológica a una toxina Lkt en un animal huésped, la cual composición vacunal incluye una Pasteurella haemolytica modificada según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. Composición vacunal según la reivindicación 14 ó la 15 para inducir una respuesta inmunológica a un conjunto de serovariantes de un microorganismo que produce la correspondiente toxina Lkt.

17. Vector biológico que incluye un microorganismo modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y que proporciona además moléculas biológicamente activas capaces de aumentar una respuesta en un animal huésped.

18. Vector biológico según la reivindicación 17, en el que dicha molécula biológicamente activa se selecciona de entre el grupo formado por moléculas funcionales tales como factores de crecimiento, hormonas, enzimas, antígenos o partes antigénicas suyas, citoquinas tales como interleucinas, interferones y factores de necrosis tumoral.

19. Vector biológico según la reivindicación 17 ó 18, en el que dicha molécula biológicamente activa se expresa mediante el vector biológico con un plásmido que transporta un gen que codifica la molécula biológicamente activa.

20. Vector biológico según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que dicho microorganismo es capaz de inducir una respuesta inmune para dos o más epítopos antigénicos nativos.

21. Vector biológico según la reivindicación 20, en el que dicha respuesta inmune es inducida para una forma virulenta de dicho microorganismo y para antígenos heterólogos expresados por dicho microorganismo.

22. Vector biológico según la reivindicación 20 ó la 21, en el que dicha respuesta inmune es inducida contra una toxina Lkt y por lo menos un epítopo antigénico de uno o más agentes patogénicos, seleccionados a partir de patógenos bacterianos que incluyen a Pasteurella spp., Haemophilus spp., Moraxella spp., Leptospira spp., Streptococcus spp., Salmonella spp., E.coli, Fusobacterium spp., Clostridium spp., Mycobacterium spp; endoparásitos que incluyen a Haemonchus spp., Trichostrongylus spp.; ectoparásitos que incluyen a Boophilus spp; patógenos vírales tales como el virus de la diarrea vírica (BVDV), el virus de la parainfluenza (PI3), la rinotraqueítis bovina infecciosa (IBR), coronavirus, rotavirus.

23. Procedimiento para producir una Pasteurella haemolytica genéticamente modificada que produce una toxina Lkt inactiva, en el que dicha toxina Lkt es parcial o totalmente inactivada, el cual procedimiento incluye

proporcionar una Pasteurella haemolytica que produce una toxina Lkt activa; e

inactivar parcial o totalmente un gen activador postraduccional de Lkt en la Pasteurella haemolytica.

24. Utilización de una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, para la preparación de un medicamento para vacunar un animal contra un microorganismo que produce la toxina Lkt.

25. Utilización de una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, para la preparación de un medicamento para utilizarlo en el tratamiento del complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRD).

26. Procedimiento para la producción de una toxina Lkt inactiva, el cual procedimiento incluye el cultivo de una Pasteurella haemolytica genéticamente modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y la recuperación de la toxina parcial o totalmente inactiva producida por dicho microorganismo.