ES2212015T3 - Reactivos para el ensayo inmunologico de la dietilamida del acido lisergico. - Google Patents
Reactivos para el ensayo inmunologico de la dietilamida del acido lisergico.Info
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA: EL ACIDO LISERGICO (LSD) DE FORMULA EN LA QUE R{SUP,1} Y R{SUP,2} SE SELECCIONAN INDEPENDIENTEMENTE ENTRE H O R{SUP,3} R{SUP,4}, CON LA CONDICION DE QUE AL MENOS UNO DE R{SUP,1} Y R{SUP,2} ES H, PERO AMBOS, R{SUP,1} Y R{SUP,2} NO SON SIMULTANEAMENTE H; R{SUP,3} ES UN ENLACE O UN HIDROCARBURO DE CADENA LINEAL O RAMIFICADA SATURADO DE ENTRE 1 Y 10 ATOMOS DE CARBONO CUANDO R{SUP,4} ES COR{SUP,5} O R{SUP,3} ES UN HIDROCARBURO DE CADENA LINEAL O RAMIFICADA SATURADO DE ENTRE 1 Y 10 ATOMOS DE CARBONO EN LA QUE R{SUP,4} ES NHR{SUP,5}; R{SUP,5} SE SELECCIONA ENTRE H, L O LX; L ES UN GRUPO DE UNION Y X ES UN MOLECULA DETECTORA O VEHICULO UNIDA MEDIANTE L, ION DEL ACIDO LISERGICO Y SUS METABOLITOS EN MUESTRAS DE FLUIDOS BIOLOGICOS MEDIANTE UN INMUNOENSAYO, EL CUAL COMPRENDE UN CONJUGADO MARCADO DE FORMULA I LA CUANTIFICACION DE LA LSD Y SUS METABOLITOS EN MUESTRAS DE FLUIDOS BIOLOGICOS, EL CUAL UTILIZA EL CONJUGADO MARCADO.
Description
Reactivos para el ensayo inmunológico de la
dietilamida del ácido lisérgico.
Esta invención se refiere a nuevos derivados de
dietilamida del ácido lisérgico, al uso de estos derivados en la
obtención de anticuerpos anti-(dietilamida de ácido lisérgico) y al
uso de estos anticuerpos como reactivos en inmunoensayos mejorados
de la dietilamida del ácido lisérgico y de sus metabolítos en
muestras de líquidos biológicos.
La dietilamida del ácido
(+)-lisérgico, la
9,10-dideshidro-N,N-dietil-6-metilergolina-8\beta-carboxamida,
conocida como LSD, es un alucinógeno que actúa en el sistema
nervioso central y altera la percepción sensorial. La ingestión de
20 a 80 \mug de LSD es suficiente para inducir la alucinación
(Nelson, C. y Foltz, R., Anal. Chem. 64,
1578-1585, 1992). El uso del LSD ha sido y continúa
siendo un problema para los organismos farmacológicos y legislativos
de todo el mundo. Los métodos actuales empleados para determinar los
niveles de LSD y de sus metabolítos, por ejemplo el
N-desmetil-LSD
(nor-LSD), en líquidos biológicos, por ejemplo en
suero y orina son la espectroscopía de fluorescencia, el tándem
CG+EM, la cromatografía HPLC y el ensayo radioinmune (RIA). Sin
embargo, la espectroscopía de fluorescencia presenta interferencias
no específicas y no distingue entre LSD, sus metabolítos y otros
alcaloides del cornezuelo del centeno. La cromatografía HPLC produce
interferencia no específica menor con la fijación de anticuerpos.
Sin embargo, este método requiere mucha dedicación de tiempo y no es
idóneo para la exploración rutinaria de un gran número de muestras.
Los inmunoensayos poseen muchas ventajas sobre los métodos
mencionados anteriormente, incluido la exploración farmacológica
rápida y, lo que es más importante, una gran sensibilidad.
En los inmunoensayos de fármacos del tipo LSD se
pone en contacto una muestra líquida biológica, de la que se
sospecha que contiene dicho fármaco o sus metabolítos, con
anticuerpos en presencia de un derivado marcado de LSD (marcador).
En la medida en que el fármaco o sus metabolítos están presentes en
la muestra, surgirá una competencia de unión con los anticuerpos y
la cantidad de derivado marcado que queda fijado o unido se reducirá
en proporción al grado de competición entre el fármaco o sus
metabolítos existentes en la muestra.
Ya se ha descrito el inmunoensayo de
fluorescencia del LSC (B. Law y col., Anal. Proc. 20, 606,
1983). El inmunoconjugado que se utiliza para generar anticuerpos
se obtiene partiendo del resto carboxilo del ácido lisérgico (ver
p.ej. H. Van Vunakis, Proc. Nat. Acad. Sci. 68,
1483-1487, 1971) y se espera que los anticuerpos
derivados del mismo tengan una gran reactividad cruzada con un gran
número de alcaloides del cornezuelo del centeno. El trazador
empleado en este sistema de ensayo se obtiene por conjugación de la
fluoresceinamida con el resto ácido de la molécula. La sensibilidad
del sistema de ensayo se sitúa en el intervalo de 5 a 40 ng/ml de
LSD. Aunque este método tiene la ventaja de ser rápido, su límite de
detección es más pequeño que el RIA.
Se ha descrito un inmunoensayo del LSD en el que
se obtiene el inmunoconjugado de LSD a partir del resto carboxilo
del ácido lisérgico (ver H. Van Vunakis, Proc. Nat. Acad. Sci.
68, 1483-1487, 1971). Sin embargo, los
anticuerpos derivados del inmunoconjugado no son muy específicos del
LSD. Se ha constatado que diversos alcaloides del cornezuelo del
centeno, por ejemplo la ergosina, la ergonovina, la ergotamina y la
metilsergida (también conocida como metilergonovina), compiten por
la unión con los anticuerpos de LSD, obteniéndose falsos positivos
molestos.
En el documento WO 97/19100, que es un documento
intermedio, y en Chem. Abs. 80:78869m se describen conjugados de
LSD o sus derivados con BSA como sustancia soporte (vehículo)
inmunogénica unida a través del nitrógeno indólico del LSD. En el
documento US-4 375 414 se describen conjugados de
derivados de LSD con albúmina de suero humano (HSA) unidos a través
del nitrógeno indólico.
En los documentos WO 92/03163 y FR 2282115 se
describen conjugados de otros haptenos y fármacos con BSA mediante
un grupo de unión. En los documentos WO 96/10179 y WO 93/20070 se
describen conjugados de otros fármacos no LSD y soportes o moléculas
de detectores distintos de la BSA.
La técnica anterior no aborda el método de unir
el LSD o sus derivados con la molécula de soporte en una forma
químicamente estable.
Se ha descrito otro inmunoensayo del LSD en
muestras de suero y de orina (ver W.A. Ratcliffe, Clin. Chem.
23(2), 169-174, 1977), en el que se obtiene
el inmunoconjugado mediante una reacción de tipo Mannich (J. March,
Advanced Org. Chem., 4ª edición, 900, 1992) por condensación del LSD
con albúmina de suero bovino (BSA) en presencia de formaldehído
(Tauton-Ribgy, Science 181, 165, 1973). El
inmunoconjugado obtenidos genera anticuerpos de LSD que tiene una
baja reactividad cruzada con un gran número de alcaloides del
cornezuelo del centeno. La unión formada en la condensación deriva
del grupo indol de la molécula de LSD.
La unión es similar a la de un acetal y la
imidazolina (denominado "aminocetal"), que actúa como grupo
protector del nitrógeno del indol. Dado que estos grupos son
susceptibles de hidrólisis en medio ácido, esta unión puede
eliminarse fácilmente por hidrólisis en medio ácido (ver p.ej. A.J.
Stern y col., J. Org. Chem. 54, 2953 (1989); D.A. Evans y
col., J. Am. Chem. Soc. 103, 5813 (1981); y A. Giannis y
col., Tetrahedron 44, 7177 (1988)). La
N,N'-diisopropilidenfenilalanil-leucina
que lleva el enlace "aminocetal" se elimina simplemente
calentado el material en una solución al 10% en agua a 60ºC y pH
neutro (ver P.M. Hardy y col., Chem. Soc., Perkin I, 1954 (1977)).
Por lo tanto, el método que da lugar a un enlace inestable no es
idóneo para obtener haptenos y reactivos que lleven un enlace
estable para el inmunoensayo.
Por lo tanto, es muy deseable un método de
inmunoensayo no radioisotópico para detectar con rapidez el LSD y
sus metabolítos, en especial en muestras de orina. Es deseable
además disponer de un derivado de LSD que lleva un enlace estable no
eliminable a partir del cual puedan generarse haptenos e
inmunógenos. Por otro lado, los anticuerpos empleados para detectar
el LSD y sus metabolítos deberían ser muy específicos y no sufrir
reacciones cruzadas con otros alcaloides del cornezuelo del
centeno.
La presente invención proporciona derivados
hapteno que son útiles para obtener reactivos de tipo hapteno,
reactivos de tipo anticuerpo y reactivos de tipo trazador que tengan
mejores prestaciones cuando se utilizan en inmunoensayos para la
detección de la dietilamida del ácido lisérgico (LSD) y sus
metabolítos. En una forma de ejecución de la presente invención se
derivatiza el núcleo del LSD a partir del nitrógeno indólico para
formar un derivado aminoalquil-hapténico. En otra
forma de ejecución se obtienen los derivados a partir del nitrógeno
de piperidina de la molécula del nor-LSD. La
derivatización preferida se realiza por alquilación, formándose un
grupo funcional que puede seguir modificándose para unirse a un
grupo de enlace adecuado, un grupo antigénico o un grupo marcador,
proporcionando reactivos estables para el inmunoensayo.
Los compuestos de la presente invención se
derivan del LSD y tienen la fórmula
en la
que
(a) R^{1} es -A-R^{3}; A es
un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de
1 a 10 átomos de carbono y R^{3} es NHR^{4} y R^{2} es
CH_{3}; o bien
(b) R^{1} es H y R^{2} es
-A-R^{3}; A es un enlace o es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es COR^{4}, o bien A es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es NHR^{4}.
R^{4} es LX, L es un grupo de enlace
homobifuncional o heterobifuncional, elegido entre el grupo formado
por el suberimidato de dimetilo, el
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo, el diisotiocianatobenceno, el
cloruro de 4-isotiocianatobenzoílo, el éster
m-maleimidobenzoílo de la
N-hidroxisuccinimida, el cloruro de
[4'[[-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonilo
y el cloruro de
5-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi-5-oxopentanoílo
y X es una molécula de detector o de soporte (vehículo).
La estabilidad de estos compuestos viene dada por
la introducción de enlaces idóneos entre el resto del fármaco y el
grupo de enlace, las proteínas soporte o las moléculas de
detector.
Los grupos de enlace ya son conocidos en la
técnica. Se utilizan para activar, es decir proporcionar un sitio
disponible en un derivado del fármaco para sintetizar un hapteno. El
uso de un grupo de enlace puede ser ventajoso o no o puede ser
necesario o no en función del hapteno en cuestión y de los pares de
soporte (vehículo). La selección de un grupo apropiado de enlace es
familiar para el experto en la materia. Véase p.ej. las patentes
US-5 144 030 y US-5 237 057. Los
expertos en la materia saben perfectamente que solo las
combinaciones de átomos que son químicamente compatibles pueden
contener el grupo de enlace, p.ej. que permita un enlace covalente
entre un soporte y un hapteno, traduciéndose en la formación de un
enlace amida, tiourea o tioéter, en función de la naturaleza de los
grupos de enlace empleados.
Los grupos de enlace convencionales, incluidos
los engarces (linkers) homobifuncionales y heterobifuncionales, son
idóneos para unirse a los derivados amínicos de LSD de la presente
invención para activar los derivados con vistas a la síntesis
posterior de haptenos de LSD e inmunógenos de la presente invención.
Son ejemplos de engarces bifuncionales idóneos L el suberimidato de
dimetilo (DMS), el
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo (SDPD), el diisotiocianatobenceno,
el cloruro de 4-isotiocianatobenzoílo, el éster
m-maleimidobenzoílo de la
N-hidroxisuccinimida (MBS) (Pierce, Rockford, IL,
EE.UU.), el cloruro de
[4'[[-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonilo
y el cloruro de
5-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi-5-oxopentanoílo.
Los compuestos idóneos de la fórmula I que tienen dichos engarces
(linkers) bifuncionales son por ejemplo la
1-[[[(4-isotiocianatofenil)carbonil]amino]-butil]-N,N-dietil-D-lisergamida,
la
1-[3-[[[4'-[[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonil]amino]propil]-N,N-dietil-D-lisergamida,
la
1-[[5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il]-1,5-dioxopentil]oxi]-2,5-pirrolidinadiona
y la
1-[[[4'-[[[3-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il]propil]amino]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonil]oxi]-2,5-pirrolidinadiona.
En el sentido en que se emplea en la descripción,
el término "molécula soporte" indica aquellos materiales que
tienen la propiedad de dar con independencia una respuesta
inmunogénica en el animal hospedante y que pueden estar unidos
mediante enlace covalente a los derivados haptenos descritos en
ella. El material soporte idóneo incluye por ejemplo proteínas,
compuestos poliméricos naturales o sintéticos, por ejemplo
polipéptidos. Como materiales soporte son preferidos en particular
las proteínas.
La identidad de los materiales proteicos
empleados en la obtención de un inmunógeno de la presente invención
no es crítica. Son ejemplos de proteínas idóneas, útiles para la
práctica de esta invención, la gammaglobulina bovina, la
tiroglobulina bovina (BTG) y la albúmina de suero bovino (BSA),
siendo preferidas las dos proteínas citadas en último lugar. En
general es preferido, aunque no necesario, que las proteínas
empleadas sean externas a los hospedantes animales en los que tienen
que segregarse anticuerpos contra el LSD o sus metabolítos y
derivados.
Fijando el derivado hapteno de la presente
invención sobre un grupo formado por un soporte inmunogénico se
podrán obtener y aislar antisueros y anticuerpos policlonales así
como anticuerpos monoclonales, que son reactivos útiles para los
inmunoensayos destinados a detectar el LSD o sus metabolítos. Los
soportes se emplean de forma habitual porque los compuestos de bajo
peso molecular (en este caso, el hapteno) por lo general no son
inmunogénicos cuando se administran por sí mismos. Si un soporte se
conjuga con un hapteno y se utiliza el conjugado en calidad de
inmunógeno, entonces pueden generarse anticuerpos del hapteno que no
se obtendrían por la simple inmunización del hapteno.
Los derivados, por ejemplo los haptenos, pueden
fijarse también sobre una gran variedad de trazadores, moléculas de
detección o de soporte, por métodos ya conocidos de la técnica, que
proporcionan un gran número de reactivos útiles en los distintos
formatos de inmunoensayos. Para la detección se pueden fijar
moléculas de detector, por ejemplo fluoróforos, por ejemplo la
fluoresceína, para obtener trazadores o grupos marcados
radiactivamente o grupos quimioluminíscentes. El hapteno puede
fijarse sobre micropartículas, incluido el látex coloreado, para
utilizarse en formatos de detección espectrofotométrica u óptica
directa, por ejemplo los ensayos de aglutinación de látex o de
tirillas cromatográficas. El grupo fijado puede ser también una
molécula de detección indirecta, por ejemplo un asociado de
transferencia energética, una enzima u otro grupo que se detecta en
una reacción química ulterior.
En la presente invención, los derivados haptenos
de LSD se activa y se fijan sobre proteínas, por ejemplo proteínas
soportes del tipo BSA o BTG, para formar inmunógenos.
Además, estos grupos soporte se utilizan en forma
de reactivos de inmunoensayo, es decir, las cuerdas para la
fijación del hapteno sobre matrices (estructuras) sólidas, o grupos
marcadores por ejemplo micropartículas, marcadores radiactivos, que
forman conjugados del marcador. Los conjugados de marcador se
emplean como reactivos en inmunoensayos o en los ensayos de placa de
microvaloración ELISA para competir con el fármaco en la fijación
sobre anticuerpos. Los conjugados de marcador pueden utilizarse por
ejemplo en ciertos formatos de ensayo para recubrir placas de
ensayo de microvaloración. Son ejemplos de conjugados de marcadores
idóneos la
1-[[[(4-tioureafenil)carbonil]amino]butil]-N,N-dietil-D-lisergamida-BTG,
la
1-[[[3-carbonil(1,1'-bifenil-4-il]carbonil]aminopropil]D-lisergamida-BSA,
el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,5-dioxopentilo-BTG
y el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,5-dioxopentilo-BSA.
La invención se refiere también a un reactivo
para la inmunocuantificación (es decir cuantificación de un
inmunoensayo) de la dietilamida del ácido lisérgico y de sus
metabolítos en muestras biológicas líquidas, que consta de un
conjugado de marcador que es un compuesto de la fórmula I en la que
X es una molécula soporte que consta de albúmina de suero bovino
(BSA) o de tiroglobulina bovina (BTG). Los conjugados idóneos de
marcador son la
1-[[[(4-tioureafenil)carbonil]amino]butil]-N,N-dietil-D-lisergamida-BTG,
el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,
5-dioxopentilo-BTG y en especial la
1-[[[3-carbonil(1,1'-bifenil-4-il]carbonil]aminopropil]D-lisergamida-BSA
y el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,
5-dioxopentilo-BSA.
La invención se refiere además a un inmunoensayo
que utiliza dicho reactivo.
En una forma de ejecución de la presente
invención, hemos encontrado de forma inesperada que los nuevos
derivados de la fórmula I pueden obtenerse introduciendo un elemento
espaciador (spacer arm) en el nitrógeno indólico del resto LSD para
obtener derivados de LSD que se ajustan a la fórmula
en la que R^{1} es -A-R^{3};
A es un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que
tiene de 1 a 10 átomos de carbono y R^{3} es NHR^{4} y R^{2}
es CH_{3}; R^{5} es LX, en el que L es un grupo de enlace
homobifuncional o heterobifuncional, elegido entre el grupo formado
por el suberimidato de dimetilo, el
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo, el diisotiocianatobenceno, el
cloruro de 4-isotiocianatobenzoílo, el éster
m-maleimidobenzoílo de la
N-hidroxisuccinimida, el cloruro de
[4'[[-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonilo
y el cloruro de
5-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi-5-oxopentanoílo
y X es una molécula de detector o de soporte (vehículo), por
ejemplo la BSA o la
BTG.
La invención se refiere además a un compuesto de
la fórmula
en la
que
(a) R^{1} es -A-R^{3}; A es
un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de
1 a 10 átomos de carbono y R^{3} es NHR^{4} y R^{2} es
CH_{3}; o bien
(b) R^{1} es H y R^{2} es
-A-R^{3}; A es un enlace o es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es COR^{4}, o bien A es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es NHR^{4}'.
R^{4}' se elige entre H y LH, L es un grupo de
enlace homobifuncional o heterobifuncional, elegido entre el grupo
formado por el suberimidato de dimetilo, el
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo, el diisotiocianatobenceno, el
cloruro de 4-isotiocianatobenzoílo, el éster
m-maleimidobenzoílo de la
N-hidroxisuccinimida, el cloruro de
[4'[[-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonilo
y el cloruro de
5-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi-5-oxopentanoílo.
El método preferido para introducir el elemento
espaciador (spacer arm) o espaciador en la molécula de LSD consiste
en la alquilación. Los espaciadores ya son conocidos en la técnica y
se emplean habitualmente para proporcionar un espacio adicional
entre un hapteno y la molécula de soporte. Los espaciadores típicos
tienen de 1 a 20 átomos de carbono y pueden tener de 0 a 10
heteroátomos o grupos que contengan heteroátomos, por ejemplo N, O,
COOH o S, y pueden ser de cadena lineal o ramificada. En la presente
invención se introduce el espaciador en la molécula de LSD mediante
un agente alquilante idóneo, elegido por ejemplo entre el
4-bromobutirato de etilo, el acetato de yodoetilo,
el ácido 4-bromometilbenzoico, el ácido acrílico y
la acriloína. La alquilación del nitrógeno indólico empleando
agentes alquilantes del tipo yoduro de metilo o bromuro de
n-butilo ya se ha descrito (ver E. Santaniello,
Synthesis 617 (1979)); también la bencilación con yoduro de bencilo
(ver Y. Kiguawa, Synthesis 421 (1981); la
N-alquilación del 3-acetilindol
empleando bromuros de alquilo (ver T. Kurihara,
Synthesis-Stuttgart 4, 396 (1987); la
N-alquilación del ácido dihidrolisérgico por el
nitrógeno indólico con tosilato de ciclopentilo empleando KOH en
polvo en DMSO (ver G. Marzoni y col.,
Synthesis-Stuttgart, 7, 651 (1987); la
obtención del derivado N-metilo de la ergolina (ver
patente US-4 754 037). Aplicando estas condiciones
(véase p.ej. Marzoni y col., Synthesis-Stuttgart
7, 651 (1987)) que incluyen la alquilación con
N-(4-yodobutil)ftalimida sobre el centro del
nitrógeno indólico no se obtiene un derivado alquilado de LSD.
Ninguno de los métodos conocidos describe la derivatización
realizada con éxito del LSD sobre el nitrógeno indólico, que es la
posición a partir de la cual se generan los derivados estables de
LSD de la presente invención.
En la presente invención pueden utilizarse
agentes alquilantes conocidos, por ejemplo el benzoato de
4-(bromome-
til)-t-butilo, los nitrilos de haloalquilo, el bromoacetonitrilo y el acetato de bromo-t-butilo, para obtener el enlace estable deseado. Con el fin de alquilar el nitrógeno indólico, hemos considerado necesario generar en primer lugar un anión en el nitrógeno indólico. A continuación se hace reaccionar el anión con un agente alquilante idóneo para formar una amina.
til)-t-butilo, los nitrilos de haloalquilo, el bromoacetonitrilo y el acetato de bromo-t-butilo, para obtener el enlace estable deseado. Con el fin de alquilar el nitrógeno indólico, hemos considerado necesario generar en primer lugar un anión en el nitrógeno indólico. A continuación se hace reaccionar el anión con un agente alquilante idóneo para formar una amina.
Las figuras de 1 a 4 presentan esquemas idóneos
de I a IV para obtener los compuestos de la invención. Los productos
intermedios interesantes de estos esquemas son p.ej. la
1-(3-aminobutil)-N,N-dietil-D-lisergamida
(derivado 5), la
1-(3-aminopropil)-N,N-dietil-D-lisergamida
(derivado 10) y la
8\beta-6-(3-aminopropil)-9,10-dideshidro-N,N-dietilergolina-8-carboxamida
(derivado 23).
En un método preferido de generar los derivados
de LSD, que se presenta en el esquema I de la figura 1, el anión
nitrógeno indólico se genera con
n-butil-lítio en presencia de
hexametil-fosforamida (HMPA) o, con preferencia, de
N,N'-dimetilpropilenurea (DMPU) en lugar de la
HMPA, que es más tóxica. A continuación se hace reaccionar el anión
resultante con la N-(4-yodobutil)ftalimida,
obteniéndose el compuesto 4. La desprotección de la ftalimida en
hidrazina anhidra proporciona el derivado de LSD funcionalizado 5,
que se emplea para generar el hapteno e inmunógeno
correspondientes.
Hemos seleccionado el engarce (linker)
bifuncional, el cloruro de 4-isotiocianatobenzoílo,
compuesto 6 (ver K. Ziegler y col., Biochem. Biophys. Acta
773, 11-22 (1987)) para convertir la amina en
el hapteno 7. Este hapteno se transforma después en el inmunógeno de
LSD correspondiente 8, la
1-[[[(4-tioureafenil)carbonil]-amino]butil]-N,N-dietil-D-lisergamida-BTG,
del modo que se ilustra en el esquema I de la figura 1. El
inmunógeno 8 se utiliza después para generar anticuerpos
anti-LSD, denominados G648 y G651, con arreglo al
método descrito en el ejemplo 26.
En una síntesis alternativa se activan los
derivados de LSD para formar marcadores haptenos estables y
conjugados de marcadores empleados en los inmunoensayos para
detectar el LSD y sus metabolitos. El LSD es sensible a la luz y al
pH básico. A un pH superior a 7, la molécula sufre una epimerización
en la posición C-8, resultando una formación parcial
de iso-LSD. En caso de exposición prolongada a la
luz, el LSD se oxida en la posición C-9,
produciéndose una pérdida del grupo olefina. Por lo tanto es
deseable obtener derivados activados que generen marcadores haptenos
estables y conjugados de marcadores que sean capaces de resistir un
almacenaje de larga duración, un criterio supremo cuando se formulan
reactivos para el uso conveniente en un entorno de producción.
La síntesis del nuevo hapteno 13 se ilustra en el
esquema II de la figura 2. Para la síntesis de los haptenos se hace
reaccionar el nitrógeno indólico con
N-(3-yodopropil)ftalimida y se trata con
hidrazina anhidra, obteniéndose la amina 10, a la que está unido un
grupo de enlace. Los grupos de enlace convencionales, por ejemplo
el cloruro de isotiocianatobenzoílo, el DSS y el SPDP, son idóneos
para la síntesis de haptenos. Con todo, el grupo de enlace más
preferido es un engarce heterobifuncional 12, que se ha constatado
que confiere una buena estabilidad general a los compuestos. La
unión del grupo de enlace 12 con la LSD-amina 10 en
condiciones anhidras da lugar al hapteno 13. El nuevo hapteno 13 se
une a la BSA del modo descrito en el ejemplo 14, proporcionando un
conjugado de marcador 14, la
1-[[[3-carbonil-(1,1'-bifenil-4-il]carbonil]-aminopropil]-D-lisergamida-BSA,
representada a continuación.
Los nuevos reactivos se ensayan en un
inmunoensayo ELISA, descrito en el ejemplo 27. Se utiliza el
N-indol derivado del conjugado de marcador
LSD-BSA 14, que contiene un engarce (linker)
bifenilo, para competir frente a concentraciones conocidas de LSD
por la fijación de anticuerpos anti-LSD, G648 y
G651, surgidos del inmunógeno 8 de LSD. Los datos recogidos en el
ejemplo 27 permiten trazar la curva de respuesta a la dosis que se
representa en la figura 4.
La curva de la figura 5 pone de manifiesto que
los anticuerpos anti-LSD, surgidos del inmunógeno 8
del LSD, fijan o se unen al conjugado de marcador de LSD 14. El LSD
libre compite con el conjugado de marcador de BSA 14 por fijar los
anticuerpos anti-LSD, de modo que la presencia de
LSD se traduce en una disminución o una inhibición de las uniones
anticuerpo-antígeno. Los resultados indican que el
nuevo conjugado de marcador de LSD 14 puede utilizarse como reactivo
en el ensayo ELISA para determinar el LSD en combinación con
derivados de LSD que tengan diferentes grupos de enlace.
Se constata que los dos anticuerpos surgidos del
inmunógeno 8 del LSD, el G648 y el G651, se unen o fijan al
principal metabolito del LSD, el nor-LSD. En la
figura 6 se presenta una curva generada a partir del ensayo ELISA en
placas de microvaloración, descrito en el ejemplo 27, empleando como
patrón el nor-LSD.
La curva de inhibición de la figura 6, generada a
partir de los datos recogidos en el ejemplo 27, demuestra que el
derivado 14 del LSD, obtenido a partir del nitrógeno indólico de la
molécula de LSD, compite en un modo dependiente de la dosis con el
nor-LSD por fijar anticuerpos generados a partir del
inmunógeno 8 del LSD y por lo tanto es útil en un inmunoensayo
destinado detectar el nor-LSD.
Además de los nuevos derivados de LSD descritos
antes, derivados del nitrógeno indólico del LSD, hemos sintetizado
también otro grupo de derivados de LSD partiendo del nitrógeno
piperidínico de la molécula de LSD para obtener un derivado de LSD
que se ajusta a la fórmula siguiente:
en la que R^{1} es H y R^{2} es
-A-R^{3}; A es un enlace o un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 10 átomos
de carbono, cuando R^{3} es COR^{4}, o A es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es NHR^{4}; R^{4} es LX, en el que L es
un grupo de enlace homobifuncional o heterobifuncional, elegido del
grupo formado por el suberimidato de dimetilo, el
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo, el diisotiocianatobenceno, el
cloruro de 4-isotiocianatobenzoílo, el éster
m-maleimidobenzoílo de la
N-hidroxisuccinimida, el cloruro de
[4'[[-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonílo
y el cloruro de
5-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi-5-oxopentanoílo,
y X es una molécula de detector o de soporte, por ejemplo BSA o
BTG. Estos derivados se emplean para sintetizar haptenos adicionales
e inmunógenos útiles como reactivos para diversos formatos de
inmunoensayos de LD, incluida el formato de placa de
microvaloración.
La síntesis de derivados a partir del nitrógeno
piperidínico requiere formar el nor-LSD antes de
proceder a la derivatización. En el esquema III de la figura 3 se
ilustra la síntesis del nor-LSD 16 y del hapteno de
LSD 19, del inmunógeno de LSD 20 y del conjugado de marcador 21
formado a partir del nitrógeno piperidínico. Para esta síntesis se
trata el LSD con BrCN, obteniéndose el derivado ciano 15, que
mediante el tratamiento posterior con Zn en ácido acético (HOAc)
proporciona el nor-LSD 16. Se une el
nor-LSD con el engarce (linker) bifuncional 18 en
presencia de trietilamina (TEA), obteniéndose el hapteno 19 de LSD
derivado del N piperidínico que se une posteriormente con la BSA
para proporcionar el conjugado de marcador 21 más preferido, el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,
5-dioxopentilo-BSA. Ver figura 3.
Este conjugado es útil como reactivo adicional para el inmunoensayo
del LSD, si se utiliza junto con los anticuerpos obtenidos a partir
del inmunógeno 8. En el ensayo ELISA descrito en el ejemplo 27 se
genera una curva de dosis-respuesta empleando el
LSD como patrón. En la figura 7 se representa la curva de
inhibición, trazada a partir de los datos recogidos en el ejemplo 27
del LSD por acción del conjugado de marcador de BSA 21.
Los resultados de la figura 7 indican que el LSD
libre compite con el conjugado de marcador de BSA 21 por unirse a
los anticuerpos anti-LSD, de modo que la presencia
de LSD provoca una disminución (o inhibición) de las uniones
anticuerpo-antígeno. El conjugado de marcador de
LSD es, pues, útil como reactivo en el ensayo ELISA para determinar
el LSD.
Se sintetiza otro hapteno de LSD derivado del
nitrógeno piperidínico que contiene un engarce bifenilo. La
síntesis de este hapteno se ilustra en esquema IV de la figura 4.
Se hace reaccionar el nor-LSD 16 con la
3-yodoftalimida 2 en K_{2}CO_{3} para obtener
el compuesto 22. La hidrazinólisis proporciona la amida 23 que
después reacciona con el engarce 12 para dar el hapteno 24 de LSD,
la
1-[[[4'-[[[3-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietil-amino)carbonil]ergolin-6-il]propil]amino]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonil]oxi]-2,5-pirrolidinadiona.
El grupo de enlace bifenilo, que tolera mejor la luz que los grupos
de enlace monofenil-alifáticos, proporciona un
derivado de LSD más estable.
Además de la obtención del
N-aminopropil-nor-LSD
23 se sintetiza también un carboxialquilo funcionalizado sobre el
átomo de nitrógeno del nor-LSD. La obtención de los
derivados de ácido butírico resultantes se describe en los ejemplos
24 y 25.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar más
las formas de ejecución de la presente invención. La siguiente
descripción se entenderá mejor con referencia a las siguientes
figuras de 1 a 7.
Las figuras de 1 a 4 presentan esquemas idóneos
de I a IV para la obtención de compuestos de la invención, que se
utilizan en los ejemplos.
La figura 5 presenta la curva de
dosis-respuesta para la competición entre el LSD y
la
1-[[[3-carbonil-(1,1'-bifenil-4-il]carbonil]aminopropil]-D-lisergamida-BSA
por fijar los anticuerpos anti-LSD.
La figura 6 presenta la curva de
dosis-respuesta para la competición entre el
nor-LSD y la
1-[[[3-carbonil-(1,1'-bifenil-4-il]carbonil]aminopropil]-D-lisergamida-BSA
por fijar los anticuerpos anti-LSD.
La figura 7 presenta la curva de
dosis-respuesta para la competición entre el LSD y
el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,
5-dioxopentilo-BSA por fijar los
anticuerpos anti-LSD.
Las denominaciones numéricas de los compuestos en
los encabezados de los ejemplos 1-25, dentro de los
ejemplos y en las figuras 5-7 se refieren a las
fórmulas estructurales presentadas en las figuras
1-4 (esquemas de I a IV).
Se trata una mezcla de 4,0 g (0,015 moles) de
ácido D-lisérgico y 200 ml de DMF seca en atmósfera
de argón con 3,6 g (0,022 moles) de
carbonil-diimidazol (CDI) y se agita a temperatura
ambiente durante 1 hora. Se trata la mezcla reaccionante con 15,2 ml
(0,15 moles) de dietilamina y se agita a temperatura ambiente
durante una noche. Se concentra la mezcla reaccionante a presión
reducida. Se recoge el residuo en 250 ml de CH_{2}Cl_{2} y se
lava con 250 ml de H_{2}O. Se elimina el material insoluble por
filtración y se separan las capas. Se lava la porción orgánica con
250 ml de una solución saturada de salmuera, se seca con
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentra a presión reducida. Se
cromatografía el residuo a través de 500 g de gel de sílice
empleando como eluyente una mezcla de CH_{3}OH al 3% en
CH_{2}Cl_{2}, de este modo se obtienen 3,65 g (75,7%) de
D-LSD, [\alpha]_{D} = +50,4º
(concentración = 1%; CHCl_{3}) en forma de sólido amorfo de color
ligeramente marrón. El epímero 8\alpha (también conocido como
iso-LSD) tiene una [\alpha]_{D} = +226º
(concentración = 1%; CHCl_{3}).
Se trata una solución de 10,0 g (0,04 moles) de
N-(3-bromopropil)-ftalimida en 240
ml de acetona con 41,7 g (0,25 moles) de yoduro potásico y se agita
a temperatura ambiente durante 4 días. Se filtra la mezcla
reaccionante y se diluye el líquido filtrado con 800 ml de éter y se
filtra de nuevo a través de Celite. Se concentra el líquido filtrado
a presión reducida. Se recristaliza el sólido amarillo resultante en
550 ml de hexano (se filtra en caliente y se mantiene en ebullición
hasta que el volumen se reduce a 300 ml), obteniéndose 10,71 g
(91,1%) de 2 en forma de agujas de color blanco mate.
Se trata una solución de 5,0 g (0,018 moles) de
N-(4-bromobutil)ftalimida en 116 ml de
acetona con 20,7 g (0,125 moles) de yoduro potásico y se agita a
temperatura ambiente durante 5 días. Se filtra la mezcla
reaccionante y se diluye el líquido filtrado con 400 ml de éter y se
filtra de nuevo a través de Celite. Se concentra el líquido filtrado
a presión reducida. Se recristaliza el sólido amarillo resultante en
300 ml de hexano (se filtra en caliente y se mantiene en ebullición
hasta que el volumen se reduce a 150 ml), obteniéndose 4,0 g (68,6%)
de 3 en forma de agujas blancas.
Se enfría a -78ºC en atmósfera de argón una
solución de 2,0 g (6,18 mmoles) de D-LSD en 40 ml de
THF seco en un baño de acetona-hielo seco. Se trata
la solución con 6,0 ml de una solución 1,6 M de
n-butil-lítio y después con 20 ml de
dimetilpropilen-urea y se agita a -78ºC durante 15
minutos. Se trata la mezcla reaccionante con una solución de 3,0 g
(9,1 mmoles) de la N-(4-yodobutil)ftalimida
3 en 6 ml de N,N'-dimetilpropilurea (DMPU) y
se agita a -78ºC durante 2 horas, después a temperatura ambiente
durante 90 minutos. Se concentra la mezcla reaccionante a presión
reducida, obteniéndose un aceite. Se diluye el aceite con 100 ml de
acetato de etilo y se lava con 5 x 50 ml de H_{2}O, se seca con
sulfato sódico anhidro y se concentra a presión reducida. Se
cromatografía el residuo a través de 400 g de gel de sílice
empleando como eluyente una mezcla de metanol al 3% en cloruro de
metileno, de este modo se obtienen 900 mg del compuesto 4 en forma
de sólido amorfo y 800 mg de material ligeramente menos puro, que
combinado con el anterior arroja un rendimiento del 52%.
Se trata una solución de 900 mg (1,7 mmoles) del
compuesto 4 en 25 ml de metanol con 0,385 ml (12,3 mmoles) de
hidrazina anhidra y se agita a temperatura ambiente durante una
noche. Se concentra la mezcla reaccionante a presión reducida. Se
trata el residuo con 25 ml de una mezcla 9:1 de cloruro de metileno
: metanol y se separan los sólidos insolubles por filtración. Se
cromatografía el líquido filtrado a través de 200 g de gel de sílice
empleando como eluyente una mezcla de metanol al 25% en cloruro de
metileno, de este modo se eluyen en primer lugar las impurezas,
después se emplea como eluyente una mezcla de trietilamina al 2% y
metanol al 25% en cloruro de metileno para eluir el producto,
obteniéndose 563 mg (83%) del compuesto 5 en forma de sólido amorfo
de color amarillo.
Se mantiene en ebullición a reflujo durante 6
horas una mezcla de 500 mg (2,79 mmoles) de isotiocianato de
4-carboxifenilo y 5 ml de cloruro de tionilo. Se
concentra la mezcla reaccionante a presión reducida y se somete el
sólido resultante durante una noche al vacío generado por una bomba
de alto vacío. Se tritura el sólido en una pequeña cantidad de
hexano y se recoge por filtración con succión, obteniéndose 516 mg
(93%) del compuesto 6 en forma de sólido blanco mate.
Se enfría a 0ºC una solución de 370 mg (0,94
mmoles) del compuesto 5 en 15 ml de THF seco y se trata con una
solución de 190 mg (0,96 mmoles) del compuesto 6 en 5 ml de
THF seco, se agita a 0ºC durante 30 minutos y después a temperatura
ambiente durante una noche. Se trata la mezcla reaccionante con
0,14 ml (1,0 mmoles) de trietilamina y se agita a temperatura
ambiente durante 2 horas. Se concentra la mezcla reaccionante a
presión reducida. Se disuelve el residuo en cloruro de metileno, se
lava con H_{2}O, se seca con sulfato sódico anhidro y se concentra
a presión reducida. Se cromatografía el residuo a través de 200 g de
gel de sílice empleando como eluyente una mezcla de metanol al 3% en
cloruro de metileno, de este modo se obtienen 325 mg (62%) del
compuesto 7 en forma de sólido amorfo de color castaño,
[\alpha]_{D} = +47,5º (concentración = 0,91%;
CHCl_{3}).
Se enfría a 0ºC una solución de 698 mg de BTG en
20 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 7,5, y se trata con 58 ml de DMSO
que se añaden por goteo, muy lentamente, durante un período de 2
horas. Se trata la mezcla con una solución de 90 mg (0,16 mmoles)
del compuesto 7 en 2 ml de DMSO que se añaden por goteo, muy
lentamente. Se agita la mezcla reaccionante a temperatura ambiente
durante 18 horas, se vierte en una bolsa de diálisis con un corte
(cutoff) de pesos moleculares 50 kDa y se dializa del modo
siguiente: 2 litros de DMSO al 75% en tampón fosfato potásico (KPi)
50 mM, pH 7,5, a temperatura ambiente durante 2 horas; 2 litros de
DMSO al 50% en KPi 50 mM, pH 7,5, a temperatura ambiente durante 2
horas; 2 litros de DMSO al 30% en KPi 50 mM, pH 7,5, a temperatura
ambiente durante 2 horas; 2 litros de DMSO al 15% en KPi 50 mM, pH
7,5, a temperatura ambiente durante 2 horas; y 4 x 4 litros de KPi
50 mM, pH 7,5, a 4ºC durante 6 horas cada operación. Se filtra el
conjugado resultante a través de un filtro estéril de 0,22 \mum,
obteniéndose 116 ml del conjugado 8 de LSD-BTG. La
concentración de proteína se determina por el ensayo de proteínas
"Coomasie blue" y arroja el valor de 5,3 mg/ml. El ensayo TNBS
indica una modificación del 63,8% de lisinas disponibles en la
BTG.
Se enfría en atmósfera de argón a -78ºC una
solución de 3,57 g (0,011 moles) de D-LSD en 70 ml
de THF seco en un baño de acetona-hielo seco. Se
trata la solución con 6,7 ml de una solución 2,5 M de
n-butil-litio y después con 35 ml
de N,N-dimetilpropilen-urea (DMPU) y
se agita a -78ºC durante 15 minutos. Se trata la mezcla reaccionante
con una solución de 5,4 g (0,017 moles) de la
N-(3-yodopropil)ftalimida 2 (obtenida con
arreglo al método descrito en el ejemplo 2) en 10 ml de DMPU y se
agita a -78ºC durante 90 minutos, después a temperatura ambiente
durante 2 horas. Se elimina el THF a presión reducida. Se diluye el
aceite con 200 ml de acetato de etilo, se lava con 5 x 100 ml de
H_{2}O, se seca con sulfato sódico anhidro y se concentra a
presión reducida. Se cromatografía el residuo a través de 500 g de
gel de sílice empleando como eluyente una mezcla de metanol al 3% en
cloruro de metileno, de este modo se obtienen 1,5 g de producto en
forma de sólido amorfo. Se reúnen las fracciones mixtas y se
cromatografían dos veces más a través de 250 mg de gel de sílice,
obteniéndose 0,6 g adicionales de producto, con lo cual el
rendimiento global es de 2,1 g (37,5%) del compuesto 9.
Se trata una solución de 2,1 g (4,1 mmoles) del
compuesto 9 en 35 ml de metanol con 0,92 ml (29,3 mmoles) de
hidrazina anhidra y se agita a temperatura ambiente durante una
noche. Se concentra la mezcla reaccionante a presión reducida. Se
trata el residuo con 25 ml de cloruro de metileno, se separan los
sólidos insolubles por filtración y se cromatografía el líquido
filtrado a través de 300 g de gel de sílice empleando como eluyente
una mezcla de metanol al 15% en cloruro de metileno, de este modo se
eluyen en primer lugar las impurezas, después se emplea como
eluyente una mezcla de trietilamina al 2% y metanol al 15% en
cloruro de metileno para eluir el producto, obteniéndose 1,24 g
(79,5%) del compuesto 10 en forma de sólido amorfo de color
amarillo.
Se trata una mezcla de 2,0 g (8,2 mmoles) de
ácido 4,4'-bifenildicarboxílico en 40 ml de THF
seco con 5,0 ml (55,0 mmoles) de cloruro de oxalilo y después con
0,02 ml de DMF seca. Se agita la mezcla reaccionante a temperatura
ambiente durante 10 minutos, después se mantiene en ebullición a
reflujo durante 90 minutos. Se concentra la mezcla reaccionante a
presión reducida, obteniéndose un aceite amarillo. Se recristaliza
este en una mezcla de THF y éter, obteniéndose 1,67 g (73%) del
compuesto 11 en forma de agujas amarillas.
Se trata una solución de 1,67 g (6,0 mmoles) del
compuesto 11 en 65 ml de THF seco con 710 mg (6,17 mmoles) de
N-hidroxisuccinimida y después con 0,835 ml (6,0
mmoles) de trietilamina. Se agita la mezcla reaccionante a
temperatura ambiente durante 2 horas, después se filtra para
eliminar el HCl de trietilamina. Se concentra el líquido filtrado a
presión reducida, obteniéndose 2,0 g (93%) del compuesto 12 en forma
de sólido de color amarillo pálido.
Se enfría a 0ºC en baño de hielo y atmósfera de
argón una solución de 850 mg (2,375 mmoles) del compuesto 12 en 65
ml de THF seco, después se trata con una solución de 900 mg (2,365
mmoles) del compuesto 10 en 50 ml de THF seco y se le añaden por
goteo durante un período de 20 minutos 0,6 ml (4,3 mmoles) de
trietilamina. Se agita la mezcla reaccionante a 0ºC durante 1 hora,
después se calienta a temperatura ambiente con agitación, durante 1
hora. Se concentra la mezcla a presión reducida y se disuelve el
residuo en 100 ml de cloruro de metileno. Se lava la solución con
100 ml de H_{2}O, 100 ml de una solución saturada de bicarbonato
sódico, 100 ml de una solución saturada de salmuera, se seca con
sulfato sódico anhídro y se concentra a presión reducida,
obteniéndose un residuo marrón. Este se cromatografía en una columna
corta a través de 100 g de gel de sílice, empleando como eluyente en
primer lugar cloruro de metileno y después una mezcla 9:1 de cloruro
de metileno : éter para eluir las impurezas, después con una mezcla
14:1 de cloruro de metileno : alcohol isopropílico para eluir el
producto, de este modo se obtienen 650 mg (39%) del compuesto 13 en
forma de sólido de color crema, [\alpha]_{D} = +34,3º
(concentración = 0,45%; CHCl_{3}).
El hapteno de LSD del ejemplo 13 se disuelve en
DMF 100% en una concentración de 5 mg/ml y se añade a una solución
de BSA hasta una concentración final de 200 \mug de derivado de
LSD/ml, 20 mg de BSA/ml y DMF al 20% en KPi 50 mM, pH 7,5. Después
se dializa este conjugado en tubo de diálisis con un corte (cutoff)
de pesos moleculares de 25.000 daltones en dos condiciones: (1) DMF
al 20% en KPi 50 mM, pH 7,5, 10 diálisis, seguidas por DMF al 10% en
KPi 50 mM, pH 7,5, 10 diálisis y DMF al 0% en KPi 50 mM, pH 7,5,
10^{3} diálisis. (2) DMF al 20% en KPi 50 mM, pH 7,5, 10^{2}
diálisis seguidas por DMF al 10% en KPi 50 mM, pH 7,5, 10^{2}
diálisis y DMF al 0% en KPi 50 mM, pH 7,5, 10^{3} diálisis. El
número de moléculas de LSD por BSA en el conjugado
LSD-BSA se determina midiendo la fluorescencia del
conjugado LSD-bifenil-BSA 14. Se
registra la fluorescencia del no fármaco-BSA en la
misma concentración de BSA que para el conjugado
LSD-bifenil-BSA 14. Como patrón de
fluorescencia se utiliza el derivado LSD-bifenilo
13. Se determina la concentración de BSA con una proteína total de
ROCHE (número de producto: 44903/44026) empleando como patrón 50
mg/ml de BSA nativa.
Una solución de 3,0 g (28,3 mmoles) de bromuro de
cianógeno (= cianuro de bromo) a reflujo en 200 ml de cloroformo
seco se trata en atmósfera de argón con una solución de 2,0 g (6,2
mmoles) del compuesto 1 (D-LSD) en 100 ml de
cloroformo seco que se añade por goteo durante un período de 20
minutos. Se mantiene la mezcla reaccionante en ebullición a reflujo
durante 1 hora, después se enfría a temperatura ambiente. Se lava la
mezcla reaccionante dos veces con una solución de ácido tartárico al
1% en agua. Se reúnen las fases acuosas, se extraen una vez con 50
ml de cloroformo. Se reúnen las dos porciones orgánicas y se secan
con sulfato sódico anhídro y se concentran a presión reducida,
obteniéndose un residuo negro. Se cromatografía este a través de 250
g de gel de sílice empleando como eluyente acetato de etilo, de este
modo se obtienen 1,5 g (73%) del compuesto 15 en forma de sólido
amorfo de color amarillo pálido.
Se mantiene en ebullición a reflujo en atmósfera
de argón durante 4 horas una mezcla de 1,2 g (3,6 mmoles) del
compuesto 15, 2,1 g (32,1 mmoles) de cinc en polvo, 11 ml de ácido
acético (HOAc) y 2,1 ml de H_{2}O. Se enfría la mezcla
reaccionante y se decanta del residuo de cinc, después se concentra
a presión reducida hasta un volumen pequeño. Se diluye el concentra
con 10 ml de H_{2}O y se basifíca a pH 9 con hidróxido amónico
concentrado, enfriando en un baño de hielo. Se extrae el precipitado
gomoso resultante con 4 x 50 ml de cloruro de metileno. Después de
la primera extracción se agrega una cantidad adicional de hidróxido
amónico concentrado para reajustar el pH a 9. Se secan los extractos
orgánicos combinados con sulfato sódico anhídro y se concentran a
presión reducida. Se cromatografía el residuo a través de 150 g de
gel de sílice empleando como eluyente metanol al 10% en acetona, de
este modo se obtienen 500 mg (45%) del compuesto 16
(nor-LSD) en forma de sólido amorfo de color
ligeramente marrón y 200 mg (18%) del compuesto 17
(nor-iso-LSD) en forma de sólido
amorfo de color ligeramente marrón. Se obtienen además 400 mg de una
mezcla de ambos epímeros. 16: [\alpha]_{D} = +34,3º
(concentración = 0,455%; CHCl_{3}); 17: [\alpha]_{D} =
+208,9º (concentración = 1,37%; CHCl_{3}).
Se trata en atmósfera de argón una solución de
10,0 g (0,088 moles) de anhídrido glutárico en 50 ml de THF seco con
10,0 g (0,087 moles) de N-hidroxisuccinimida y se
calienta a reflujo durante 3,5 horas. Se concentra la mezcla
reaccionante a presión reducida, obteniéndose un aceite. Se
cristaliza el aceite en 50 ml de acetato de etilo, obteniéndose 9,2
g (46%) de ácido
5-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]-5-oxo-pentanóico,
que se trata con 16 ml de cloruro de tionilo y se calienta a 45ºC en
atmósfera de argón durante 3 horas. Se concentra la mezcla
reaccionante a presión reducida para obtener un sólido blanco que se
tritura con una pequeña cantidad de éter y se recoge por filtración
con succión. Se seca el producto durante una noche con alto vacío,
obteniéndose 8,7 g (88%) del compuesto 18 en forma de sólido
blanco.
Se trata una solución de 200 mg (0,65 mmoles) del
compuesto 16 en 10 ml de THF seco, en atmósfera de argón, con 161
mg (0,65 mmoles) del compuesto 18 y después con 0,2 ml (1,4 mmoles)
de trietilamina seca. Se agita la mezcla reaccionante a temperatura
ambiente durante 30 minutos y después se concentra a presión
reducida. Se disuelve el residuo en cloruro de metileno, se lava con
H_{2}O y una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico, se
seca con sulfato sódico anhídro y se concentra a presión reducida,
obteniéndose 330 mg (98%) del compuesto 19 en forma de sólido amorfo
de color amarillo.
Se enfría a 0ºC una solución de 700 mg de BTG en
13 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 7,5, y se trata con 13 ml de DMSO
que se añaden por goteo, muy lentamente. Una vez finalizada la
adición se añade por goteo, muy lentamente, una solución de 84 mg
(0,16 mmoles) del compuesto 19 en 1 ml de DMSO. Se agita la mezcla
reaccionante a temperatura ambiente durante 18 horas, se vierte en
una bolsa de diálisis con un corte (cutoff) de peso moleculares de
50 kDa y se dializa del modo siguiente: 2 litros de DMSO al 50% en
KPi 50 mM, pH 7,5, a temperatura ambiente durante 2 horas; 2 litros
de DMSO al 25% en KPi 50 mM, pH 7,5, a temperatura ambiente durante
2 horas; 2 litros de KPi 50 mM, pH 7,5, al 100% a temperatura
ambiente durante 2 horas; y 7 x 4 litros de KPi 50 mM, pH 7,5, a 4ºC
durante 6 horas cada operación. Se filtra el conjugado resultante a
través de un filtro estéril de 0,22 \mum, obteniéndose el
conjugado 20 de LSD-BTG. La concentración de
proteína se determina por el ensayo de proteínas "Coomasie
blue" y arroja el valor de 12,1 mg/ml. El ensayo TNBS indica una
modificación del 45% de lisinas disponibles en la BTG.
Se enfría a 0ºC una solución de 1,1 g de BSA en
22 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 7,5, y se trata con 22 ml de DMSO
que se añaden por goteo, muy lentamente. Una vez finalizada la
adición se retiran 4 ml, que se mantienen aparte como referencia. A
los 40 ml restantes (1 g de BSA) se les añade por goteo una solución
de 12 mg (0,02 mmoles) del compuesto 19 en 0,5 ml de DMSO. Se agita
la mezcla reaccionante a temperatura ambiente durante 18 horas, se
vierte en una bolsa de diálisis con un corte (cutoff) de peso
moleculares de 50 kDa y se dializa del modo siguiente: 2 litros de
DMSO al 50% en KPi 50 mM, pH 7,5, a temperatura ambiente durante 2
horas; 2 litros de DMSO al 25% en KPi 50 mM, pH 7,5, a temperatura
ambiente durante 2 horas; 2 litros de KPi 50 mM, pH 7,5, al 100% a
temperatura ambiente durante 2 horas; y 7 x 4 litros de KPi 50 mM,
pH 7,5, a 4ºC durante 6 horas cada operación. Se filtra el
conjugado resultante a través de un filtro estéril de 0,22 \mum,
obteniéndose el conjugado 21 de LSD-BSA. La
concentración de proteína se determina por el ensayo de proteínas
"Coomasie blue" y arroja el valor de 14,6 mg/ml. La proporción
de hapteno/BSA es de 0,8.
Se trata una solución de 568 mg (1,84 mmoles) del
compuesto 16 en 17 ml de DMF seca con 413 mg (4,2 mmoles) de
carbonato potásico anhídro y después con 653 mg (2,1 mmoles) de
N-(3-yodopropil)-ftalimida 2 y se
agita a 40ºC durante una noche. Se concentra la mezcla reaccionante
a presión reducida, se diluye el residuo con cloruro de metileno,
se lava con H_{2}O, se seca con sulfato sódico anhídro y se
concentra a presión reducida. A continuación se cromatografía el
producto a través de 150 g de gel de sílice empleando como eluyente
acetato de etilo, de este modo se obtienen 833 mg (91%) del
compuesto 22 en forma de sólido amorfo amarillo.
Se trata una solución de 820 mg (1,65 mmoles) del
compuesto 22 en 30 ml de metanol con 0,4 ml (12,7 mmoles) de
hidrazina anhidra y se agita a temperatura ambiente durante una
noche. Se filtra la mezcla reaccionante y se concentra a presión
reducida. Se cromatografía el residuo a través de 100 g de gel de
sílice empleando como eluyente una mezcla de trietilamina al 2% y
metanol al 15% en cloruro de metileno. Se reúnen las fracciones que
contienen producto y se vuelven a cromatografiar a través de 150 g
de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla de trietilamina
al 2% y metanol al 15% en cloroformo, de este modo se obtienen 560
mg (93%) del compuesto 23 en forma de sólido amorfo amarillo.
Una solución de 1,32 g (3,7 mmoles) del compuesto
12 en 50 ml de cloruro de metileno seco se enfría a 0ºC en atmósfera
de argón y se trata con una solución de 535 mg (1,46 mmoles) del
compuesto 23 en 50 ml de cloruro de metileno seco, que se añade por
goteo durante un período de 30 minutos. Una vez finalizada la
adición se lava la mezcla reaccionante con una solución acuosa
saturada de bicarbonato sódico, se seca con sulfato sódico anhídro y
se concentra con vacío. Se cromatografía el residuo a través de 100
g de gel de sílice empleando como eluyente alcohol isopropílico al
5%. Se reúnen las fracciones que contienen producto y se concentran
a presión reducida, obteniéndose un sólido amarillo. Se recoge el
sólido en éter y se concentra cinco veces para eliminar el alcohol
isopropílico residual, obteniéndose 280 mg (28%) del compuesto 24 en
forma de sólido amarillo.
Una solución de 1,1 g (3,5 mmoles) del compuesto
16 en 35 ml de DMF seca se trata en atmósfera de argón con 800 mg de
carbonato potásico anhídro, después con 2 ml de bromobutirato de
etilo, se agita a 40ºC durante 6 horas y a continuación a
temperatura ambiente durante una noche. Se concentra la mezcla
reaccionante a presión reducida. Se diluye el residuo con cloruro de
metileno, se lava con H_{2}O, se seca con sulfato sódico anhídro y
se concentra a presión reducida. Se cromatografía el residuo a
través de 200 g de gel de sílice empleando acetato de etilo como
eluyente, de este modo se obtienen 780 mg (52%) del compuesto 25, el
epímero 8\beta, en forma de sólido amarillo amorfo. Se obtienen
además 84 mg del epímero 8\alpha y 395 mg de una mezcla de
epímeros 8\alpha y 8\beta.
Se trata una solución de 400 mg (0,94 mmoles) del
compuesto 25 en 16 ml de metanol y 8 ml de H_{2}O con 1,6 g de
carbonato potásico y se agita a temperatura ambiente durante 3
días. Se vierte la mezcla reaccionante en un embudo de decantación
y se diluye con 50 ml de cloruro de metileno y 50 ml de H_{2}O. Se
neutraliza la capa acuosa con HCl 6N hasta pH 7. Se agita la mezcla
vigorosamente dentro del embudo de decantación. Se separan las fases
y se extrae la porción acuosa 2 veces más con cloruro de metileno.
Se reúnen los extractos orgánicos, se secan con sulfato sódico
anhídro y se concentran a presión reducida, obteniéndose 330 mg
(88%) del compuesto 26 en forma de sólido de color castaño.
Se mezcla el inmunógeno 1:1 con el adyuvante de
Freund. Se administran a cinco cabras inyecciones en varios sitios
de la espalda del modo siguiente:
| 1ª semana | adyuv. Freund completo | 1,0 mg | espalda |
| 2ª semana | incompleto | 1,0 mg | espalda |
| 3ª semana | incompleto | 1,0 mg | espalda |
| 4ª semana | incompleto | 1,0 mg | espalda |
| 8ª semana | incompleto | 0,5 mg | espalda |
| mensualmente | incompleto | 0,5 mg | espalda |
Seis meses después de que los animales hayan
recibido el inmunógeno apropiado, se extrae sangre de los mismos y
se evalúan los antisueros en el ensayo ELISA en placa de
microvaloración, empleando el conjugado LSD-BSA
apropiado como material de recubrimiento de la placa, del modo
descrito en el ejemplo 27.
Se recubren hoyos de placa de microvaloración
(Costar, MA) de poliestireno de 96 hoyos de alta fijación en cada
caso con 50 \mul de un conjugado de LSD-BSA
(diluido con tampón azida de PBS, pH 7,2) y se mantienen en
incubación a temperatura ambiente durante 2 horas o bien entre 2 y
8ºC durante una noche. Se lavan las placas 3 veces con tampón PBS.
Se dispensan 100 \mul de BSA al 1% en tampón azida de PBS a cada
hoyo y se incuba la placa a temperatura ambiente durante 2 horas. Se
lavan las placas 3 veces con PBS que contiene un 0,05% de TWEEN®-20
(Sigma). Se añaden como control 50 \mul de LSD o de
nor-LSD diluido en BSA-tampón azida
de PBS, o bien 50 \mul de BSA al 1% en tampón azida de PBS sin
fármaco. Se añaden a cada hoyo 50 \mul de antisueros apropiados en
BSA al 1% en tampón azida de PBS. Se incuban las placas a 37ºC
durante 1 hora, después se lavan 3 veces con
PBS-TWEEN®-20. Se añaden a cada hoyo 50 \mul de
conjugado de fosfatasa alcalina anti-cabra (Fisher
Scientific) y se incuba la placa a 37ºC durante 1 hora. Se lava la
placa 3 veces con tampón PBS-TWEEN®-20 y se añaden a
cada hoyo 50 \mul de fosfato de p-nitrofenilo
(Sigma). Se incuban las placas a temperatura ambiente durante 30
minutos. Se interrumpe la reacción por adición de 50 \mul de NaOH
3N y se mide la densidad óptica resultante empleando un lector de
placas de microvaloración a una longitud de onda de 405 nm. A
continuación se presentan los datos obtenidos durante los ensayos.
En las figuras 5-7 se presentan las curvas
resultantes de inhibición o desplazamiento del LSD.
Los datos se representan en la curva de
inhibición de la figura 5:
| Concentración (ng/ml) | G648 (OD) | G651 (OD) |
| 0 | 1,05 | 1,17 |
| 0,5 | 0,8 | 1,05 |
| 1 | 0,33 | 0,75 |
| 5 | 0,25 | 0,39 |
Los datos se representan en la curva de
inhibición de la figura 6:
| nor-LSD (ng/ml) | G651 (OD) |
| 0 | 1,38 |
| 1 | 1,2 |
| 5 | 0,88 |
| 5 (LSD) | 0,63 |
Los datos se representan en la curva de
inhibición de la figura 7:
\newpage
| Concentración (ng/ml) | G651 (OD) | G648 (OD) |
| 0 | 0,67 | 0,7 |
| 0,5 | 0,5 | 0,52 |
| 1 | 0,33 | 0,37 |
| 5 | 0,19 | 0,17 |
Claims (9)
1. Un compuesto que se ajusta a la fórmula
en la
que
(a) R^{1} es -A-R^{3}; A es
un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de
1 a 10 átomos de carbono y R^{3} es NHR^{4} y R^{2} es
CH_{3}; o bien
(b) R^{1} es H y R^{2} es
-A-R^{3}; A es un enlace o es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es COR^{4}, o bien A es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es NHR^{4};
R^{4} es LX, L es un grupo de enlace
homobifuncional o heterobifuncional, elegido entre el grupo formado
por el suberimidato de dimetilo, el
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo, el diisotiocianatobenceno, el
cloruro de 4-isotiocianatobenzoílo, el éster
m-maleimidobenzoílo de la
N-hidroxisuccinimida, el cloruro de
[4'[[-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonilo
y el cloruro de
5-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi-5-oxopentanoílo
y X es una proteína de detector o de soporte (vehículo).
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que
X es una proteína de soporte que está formada por albúmina de suero
bovino (BSA) o tiroglobulina bovina (BTG).
3. El compuesto de la reivindicación 2, que se
elige entre el grupo formado por
1-[[[(4-tioureafenil)carbonil]amino]butil]-N,N-dietil-D-lisergamida-BTG,
la
1-[[[3-(4'-carbonil)(1,1'-bifenil-4-il]carbonil]aminopropil]D-lisergamida-BSA,
el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,5-dioxopentil-BTG
y el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,5-dioxopentilo-BSA.
4. Reactivo para la inmunocuantificación de la
dietilamida del ácido lisérgico y de sus metabolítos en
muestrasbiológicas líquidas, que contiene un conjugado de marcado
que es un compuesto de la reivindicación 2 ó 3.
5. Reactivo según la reivindicación 4, en el que
el conjugado de marcado se elige entre la
1-[[[3-(4'-carbonil)(1,1'-bifenil-4-il]carbonil]aminopropil]D-lisergamida-BSA
y el
5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il-1,5-dioxopentilo-BSA
6. Inmunoensayo para la cuantificación de la
dietilamida del ácido lisérgico y de sus metabolítos en muestras
biológicas líquidas, que consiste en utilizar un conjugado de
marcador que es un compuesto de la reivindicación 2 ó 3.
7. Un compuesto que tiene la fórmula
en la
que
(a) R^{1} es -A-R^{3}; A es
un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de
1 a 10 átomos de carbono y R^{3} es NHR^{4} y R^{2} es
CH_{3}; o bien
(b) R^{1} es H y R^{2} es
-A-R^{3}; A es un enlace o es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es COR^{4}, o bien A es un hidrocarburo
saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de
carbono cuando R^{3} es NHR^{4}';
\newpage
R^{4}' se elige entre H y LH, L es un grupo de
enlace homobifuncional o heterobifuncional, elegido entre el grupo
formado por el suberimidato de dimetilo, el
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo, el diisotiocianatobenceno, el
cloruro de 4-isotiocianatobenzoílo, el éster
m-maleimidobenzoílo de la
N-hidroxisuccinimida, el cloruro de
[4'[[-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil-4-il]carbonilo
y el cloruro de
5-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi-5-oxopentanoílo.
8. El compuesto de la reivindicación 7, que se
elige entre el grupo formado por la
1-[[[(4-isotiocianatofenil)carbonil]amino]-butil]-N,N-dietil-D-lisergamida,
la
1-[3-[[[4'-[[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]carbonil][1,1'-bifenil]-4-
il]carbonil]amino]propil]-N,N-dietil-D-lisergamida,
la
1-[[5-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il]-1,5-dioxopentil]oxi]-2,5-pirrolidinadiona
y la
1-[[[4'-[[[3-[8\beta-9,10-dideshidro-8-[(dietilamino)carbonil]ergolin-6-il]propil]amino]carbonil][1,1'-bifenil]-4-il]carbonil]oxi]-2,5-pirrolidinadiona.
9. El compuesto de la reivindicación 7, que se
elige entre el grupo formado por la
1-(3-aminobutil)-N,N-dietil-D-lisergamida,
la
1-(3-aminopropil)-N,N-dietil-D-lisergamida
y la
8\beta-6-(3-aminopropil)-9,10-dideshidro-N,N-dietilergolina-8-carboxamida.
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