ES2212357T3 - Peptidos bifidogenos y su uso. - Google Patents

Peptidos bifidogenos y su uso.

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ES2212357T3 ES98951420T ES98951420T ES2212357T3 ES 2212357 T3 ES2212357 T3 ES 2212357T3 ES 98951420 T ES98951420 T ES 98951420T ES 98951420 T ES98951420 T ES 98951420T ES 2212357 T3 ES2212357 T3 ES 2212357T3
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Abstract

Péptido seleccionado del grupo que comprende: R1-EVAARARVVW-R2 R1-ARRARVVWAAVG-R2 R1-ARRARVVWCAVGE-R2 R3-CIAL-R4 - R1-ARRARVVWCAVG-R2 en donde R1, R3 representan independientemente uno de otro, - NH2, un aminoácido o un péptido con hasta 100 aminoácidos y R2, R4 representan independientemente uno de otro, COOH, CONH2, un aminoácido o un péptido con hasta 100 aminoácidos así como derivados amidados, acetilodos, sulfatodos, fosforilodos, glicosilodos, oxidados, o fragmentos con propiedades bifodógenas y péptidos, que se pueden producir químicamente a través de combinaciones de los péptidos, fragmentos o derivados.

Description

Péptidos bifidógenos y su uso.
La presente invención se refiere a péptidos bifidógenos, a medicamentos que contiene los péptidos según la invención, así como al uso de los péptidos bifidógenos.
Se sabe que la leche protege el estado de salud de los lactantes. Esto se atribuye muchas veces a la influencia de la leche sobre la formación de una flora intestinal típica de lactantes, que consiste en más de 90% de Bifidobacterium bifidum.
El documento WO 90/13642 A da a conocer la secuencia de la lactoferrina humana.
En Bellamy et al.: "Antibacterial spectrum of lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin", Journal of Applied Bacteriology, Vol. 73, nº 6, 1992, páginas 472 a 479 y Odell E.W. et al.: "Antibacterial activity of peptides homologous to a loop region in human lactoferrin", FEBS Letters, Vol. 382, nº 1 a 2, 1996, páginas 175 a 178, se da a conocer la actividad antibacteriana de los péptidos lactoferricina B y H, que proceden de lactoferrinas bovinas y humanas.
Es misión de la presente invención la preparación de péptidos que tienen una influencia positiva sobre la flora intestinal.
La misión según la invención se soluciona mediante péptidos con las características de la reivindicación 1.
Los péptidos según la invención tienen actividad antimicrobiana contra bacterias que no se encuentran en la flora intestinal normal de lactantes o que se encuentran sólo en cantidades pequeñas y que fomentan el crecimiento de bacterias deseadas tales como bifidobacterias, ya que fomentan el crecimiento de bifidobacterias más que el de otras bacterias o selectivamente inhiben sólo las bacterias no deseadas. Esta propiedad de promover un crecimiento favorable a bifidobacterias se denomina bifidógena.
Los péptidos según la invención presentan la siguiente secuencia de aminoácidos:
R^{1}-EVAARARVVW-R^{2},
R^{1}-ARRARVVWAAVG-R^{2},
R^{1}-ARRARVVWCAVGE-R^{2},
R^{1}-ARRARVVWCAVG-R^{2},
R^{3}-CIAL-R^{4}
en donde
R^{1}, R^{3} representan, independientemente uno de otro, -NH_{2}, un aminoácido o un péptido con hasta 100 aminoácidos y
R^{2}, R^{4} representan independientemente uno de otro, -COOH, -CONH_{2}, un aminoácido o un péptido con hasta 100 aminoácidos
así como derivados amidados, acetilados, sulfatados, fosforilados, glicosilados, oxidados, o fragmentos con propiedades bifodógenas y péptidos, que se puede producir químicamente a través de combinaciones de los péptidos, fragmentos o derivados.
Preferiblemente, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} presentan una longitud de hasta 50, más preferiblemente de hasta 20 y lo más preferiblemente de hasta 10 aminoácidos.
Los péptidos según la invención se pueden conseguir por purificación de la leche de vaca o humana. Alternativamente, es posible también la expresión en organismos modificados genéticamente o la preparación por síntesis péptidica química.
Otro aspecto de la invención son los ácidos nucleicos que codifican los péptidos bifidógenos.
Los péptidos y/o los ácidos nucleicos según la invención pueden estar confeccionados junto con adyuvantes farmacéuticos normales en medicamentos. Para ello se usan preferiblemente preparaciones galénicas y se eligen formas de aplicación en los que los péptidos acceden al sitio de acción sin que se degraden.
Ventajosamente se usan los péptidos según la invención en cantidades de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal. Cantidades de ácidos nucleicos eficaces son, por ejemplo, 0,01 mg a 100 mg/kg de peso corporal. La cantidad se encuentra preferiblemente en el intervalo de 1 a 10 mg/kg de peso corporal para los péptidos y ácidos nucleicos.
También, los péptidos según la invención se pueden combinar con nutrientes en alimentos.
Además de ello se pueden incluir los péptidos según la invención y/o los anticuerpos dirigidos contra péptidos junto con otros adyuvantes en agentes de diagnóstico.
Los péptidos y ácidos nucleicos según la invención son apropiados para el tratamiento de enfermedades causadas por una colonización microbiana deficiente tales como infecciones, inflamaciones, tumores inducidos por microbios, enfermedades degenerativas asociadas con microbios, diarrea, cólicos, anormalidad de la flora bucal, intestinal y vaginal, caries. Por ejemplo, la colonización microbiana deficiente puede tratarse de bacterias, hongos, levaduras, protistas, virus, micoplasmas, filaria y/o plasmodios.
Los péptidos según la invención también son apropiados como adyuvantes en la preparación de alimentos en el sentido de auxiliarse de la fermentación.
Es especialmente preferible que se utilicen juntos dos o más péptidos que tienen dos o más de las secuencias de péptidos según la invención. Los diferentes espectros de acción de las sustancias individuales o sustancias, las secuencias individuales o péptidos según la invención permiten conseguir, en el caso de la presencia de resistencia de microorganismos, una inhibición óptima de los microorganismos no deseados a través de una combinación apropiada de secuencias o a través de una combinación de sustancias individuales.
Los siguientes Ejemplos han de explicar más la invención.
Ejemplo de referencia 1
Tratamiento de la leche
A leche humana se le añade pepsina (20 mg/g de proteína), después de haberse ajustado a un pH de 3,5 con HCl. La reacción enzimática se incubó durante dos horas a 37ºC y se detuvo por calentamiento durante cinco minutos. A continuación se centrifugó (20 min, 60.000 g a 4ºC) y se eliminó la grasa de la leche. La disolución restante se mezcló con TFA al 0,1% y se centrifugó de nuevo para separar proteínas de alto peso molecular precipitadas.
Purificación por HPLC de un péptido bifidógeno de la leche
Para la purificación de péptidos bifidógenos de la leche, es necesario combinar entre sí diferentes procedimientos de separación por HPLC para conseguir una preparación lo más pura posible a través de una separación óptima y para separar componentes inactivos no deseados. Las respectivas muestras, que resultan después de cada etapa de separación, tienen que ensayarse en dos sistemas de ensayo, es decir, un ensayo de crecimiento con bacterias bífidas en combinación con un ensayo de crecimiento con E. coli como diana (véase los Ejemplos 3 y 4). Para la purificación, es necesaria la combinación de al menos una etapa cromatográfica en fase inversa (preferiblemente dos etapas cromatográficas en fase inversa) y el empleo de una separación por HPLC de intercambio de cationes. Tiene que aplicarse la respectiva muestra pobre en sales en el bioensayo para conseguir un resultado de rastreo lo más óptimo posible.
La primera etapa de separación se llevó a cabo con una columna Parcosil-C18 (1 x 12,5 cm, 100 \ring{A}, Biotek, Heidelberg, Alemania).
Tampón A: TFA al 0,1%
Tampón B: acetonitrilo con TFA al 0,1%
Gradiente: 0 a 60% B en 45 minutos
Caudal: 2 ml/min
Detección: 280 nm (véase la Figura 1)
Se somete de nuevo la fracción 23 a cromatografía en la misma columna y un gradiente más plano (véase la figura):
Tampón A: TFA al 0,1%
Tampón B: acetonitrilo con TFA al 0,1%
Gradiente: 0 a 20% B en 5 minutos
20 a 50% B en 45 minutos
Detección: 214 nm (véase la Figura 2)
Se somete de nuevo la fracción 16 de la anterior etapa de separación a cromatografía en la misma columna, pero con otros eluyentes para modificar la selectividad de la separación.
Tampón A: TFA al 0,1%
Tampón B: TFA al 0,1% en metanol
Gradiente: 0 a 40% B en 5 minutos
40 a 70% B en 45 minutos
Detección: 214 nm (véase la Figura 3)
Se somete de nuevo la fracción activa 21 a cromatografía con HPLC de intercambio catiónico:
Columna: Parcosil Pepkat, 4 x 50 mm, 300 A, 5 mm, Biotek, Heidelberg
Tampón A: tampón fosfato 10 mM pH 4,5
Tampón B: tampón A con NaCl 1 M
Caudal: 0,75 ml/min
Gradiente: 0 a 15% B en 5 minutos
15 a 50% B en 35 minutos
Detección: 214 nm (véase la Figura 4)
Se eliminan las sales de todas las fracciones obtenidas en proceso corto de HPLC en fase inversa antes de someterlas al ensayo antimicrobiano y de actividad bifidógena.
Se identificaron los siguientes péptidos por espectroscopía de masas y secuenciación de aminoácidos:
La fracción 9 contenía el componente bifidógeno puro
YQRRPAIAINNPYVPRTYYANPAVVRPHAQIPQRQYLPNSHPPTVVRRPNLHPSF
(caseína K-63-117)
La fracción 10 contiene el componente bifidógeno
GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPICCIQA
(neutrófilo-lactoferrina-20-67)
y la fracción 11 contiene el componente bifidógeno con una masa de aducto de +16, lo que apunta a que se trata de un producto de oxidación (presumiblemente es una metionina oxidada).
Los dos péptidos y el producto de oxidación tienen actividad bifidógena.
Ejemplo de referencia 2
Detección de la actividad reguladora del crecimiento de E. coli
Las fracciones de HPLC se emplearon con E. coli K12. El ensayo se lleva a cabo en 3 g/l de caldo de soja tríptico (Sigma) como se indica a continuación:
Para cada ensayo, se inocularon nuevamente los cultivos de E. coli K12 (firma Sigma, Deisenhofen, Alemania, número de pedido T8907) en caldo tríptico de soja (Manual de Difco, 10ª edición., pág. 1027). La incubación de estas bacterias se efectuó siempre en condiciones aerobias a 37ºC durante 16 horas. Los péptidos a ensayar se añadieron a una disolución de ensayo que consistía en 200 ml de 3 g/l de caldo tríptico de soja en placas de 96 pocillos para el cultivo de células y se sembraron con un inóculo de 20 ml de una suspensión diluida de bacterias. La absorción fotométrica del inóculo, medida a 500 nm, ascendió a 0,05. Después de 16 horas se determinó el crecimiento de las bacterias bajo la influencia de los péptidos fotométricamente en el lector ELISA y se determinó manualmente bajo un microscopio.
Ejemplo de referencia 3
Detección de la actividad reguladora del crecimiento sobre Bifidobacterium bifidum
Para cada ensayo se inocularon los cultivos de Bifidobacterium bifidum ATCC 29521 en caldo Elliker (Difco, Detroit, EE.UU.) (triptona 20 g, extracto de levadura 5 g, gelatina 2,5 g, dextrosa 5 g, lactosa 5 g, sacarosa 5 g, cloruro sódico (NaCl) 4 g, acetato sódico 1,5 g, ácido ascórbico 0,5 g). La incubación de estas bacterias se efectuó siempre en condiciones aerobias a 37ºC durante 16 a 18 horas. Al péptido del ensayo, se le añadió una disolución de ensayo que consistía en 200 ml de Elliker Broth 50% en placas de 96 pocillos para el cultivo de células y se las sembró un inóculo de 20 ml de una suspensión diluida de bacterias. La absorción fotométrica del inóculo, medida a 500 nm, ascendió a 0,05. Después de 16 horas se determinó el crecimiento de las bacterias bajo la influencia de los péptidos fotométricamente en el lector ELISA y se determinó manualmente bajo un microscopio. Como control positivo, se servía N-actetilglucosamina. Para este ensayo, sólo se pueden emplear cultivos de bífidos que reaccionan con N-acetilglucosamina. Después de algunos pasos, las bifidobacterias pierden esta propiedad, y ya no se pueden usar para este ensayo de crecimiento.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Wolf-Georg Forssmann
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Feodor-Lynen-Strasse 31
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
LOCALIDAD: Hannover
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 30625
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN: Péptidos bifidógenos
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
INFORMACIÓN INFORMÁTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
SOPORTE INFORMÁTICO: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIN Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPA)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID. Nº 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Ala Ala Arg Ala Arg Val Val Trp}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SECUENCIA ID. Nº 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys Ala Val Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) ESPECIFICACIONES DE LA SECUENCIA ID. Nº 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys Ala Val Gly Glu}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) ESPECIFICACIONES DE LA SECUENCIA ID. Nº 22:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE LA CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Ala Ala Val Gly}

Claims (5)

1. Péptido seleccionado del grupo que comprende:
R^{1}-EVAARARVVW-R^{2}
R^{1}-ARRARVVWAAVG-R^{2}
R^{1}-ARRARVVWCAVGE-R^{2}
R^{1}-ARRARVV 
\uelm{W}{\uelm{\para}{ \hskip-0.3cm
R ^{3} -CIAL-R ^{4} }}
CAVG-R^{2}
en donde
R^{1}, R^{3} representan independientemente uno de otro, -NH_{2}, un aminoácido o un péptido con hasta 100 aminoácidos y
R^{2}, R^{4} representan independientemente uno de otro, COOH, CONH_{2}, un aminoácido o un péptido con hasta 100 aminoácidos
así como derivados amidados, acetilodos, sulfatodos, fosforilodos, glicosilodos, oxidados, o fragmentos con propiedades bifodógenas y péptidos, que se pueden producir químicamente a través de combinaciones de los péptidos, fragmentos o derivados.
2. Péptido según la reivindicación 1 con la Sec. ID. Nº 8, 14, 16 y 22.
3. Medicamento que contiene al menos un péptido según la reivindicación 1 ó 2.
4. Uso de péptidos según la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades causadas por una colonización microbiana deficiente de, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, protistas, virus, micoplasmas, filaria, plasmodios, tales como infecciones, inflamaciones, tumores inducidos por microbios, enfermedades degenerativas asociadas con microbios, diarrea, cólicos, anormalidad de la flora bucal, intestinal y vaginal, caries.
5. Uso de ácidos nucleicos que codifican los péptidos según la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades causadas por una colonización microbiana deficiente de, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, protistas, virus, micoplasmas, filaria, plasmodios, tales como infecciones, inflamaciones, tumores inducidos por microbios, enfermedades degenerativas asociadas con microbios, diarrea, cólicos, anormalidad de flora bucal, intestinal y vaginal, caries.
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DE59810294D1 (de) 2004-01-08
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