ES2212960T3 - Anticuerpos y metodos diagnosticos para la diagnosis de pestivirus. - Google Patents
Anticuerpos y metodos diagnosticos para la diagnosis de pestivirus.Info
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal capaz de unirse específicamente a un determinante antigénico con ERNS de un Pestivirus que es o que compite de forma cruzada con un anticuerpo monoclonal secretado por la línea celular de hibridoma 50F4.
Description
Anticuerpos y métodos diagnósticos para la
diagnosis de Pestivirus.
Los géneros Pestivirus, Flavivirus
y "grupo del virus de la hepatitis C" constituyen la familia
Flaviviridae. El género Pestivirus comprende
actualmente tres miembros, virus de la diarrea viral bovina (BVDV),
virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) y virus de la enfermedad
de la frontera (BDV). Recientemente, se ha descubierto la presencia
de un cuarto grupo distinto de Pestivirus que comprende aislados de
ganado y ovejas, y en la actualidad se acepta generalmente
denominar a estas especies adicionales BVDV-2; como
consecuencia, las cepas clásicas del BVDV se denominan
BVDV-1. En todo el mundo, BVDV-1 y
BVDV-2 se consideran como patógenos importantes del
ganado. Los dos pueden causar infecciones agudas (diarrea, fiebre,
síndrome hemorrágico) así como aborto, malformación e infección
persistente. Los animales persistentemente infectados representan
el principal reservorio del virus; tales animales pueden enfermar
de la enfermedad mortal de las mucosas (MD). Con respecto al impacto
económico, las pérdidas reproductivas son las más significativas.
El ensayo expuesto a continuación pretende identificar animales
infectados y animales especialmente infectados de forma
persistente. En los programas de control establecidos en algunos
países, los animales persistentemente infectados se retiran para
obtener rebaños sin BVDV.
Los animales persistentemente infectados se
generan por infección de un feto con una cepa no citopatogénica
(ncp) del BVDV durante el primer trimestre de gestación. Tales
animales adquieren tolerancia inmunológica a la cepa ncp particular
(no se detectan anticuerpos contra el virus persistente). Los
animales persistentemente infectados esparcen el virus en cantidades
considerables durante su vida y representan el principal reservorio
para el BVDV. Los animales persistentemente infectados pueden nacer
sin síntomas clínicos. Por lo tanto, la identificación y
erradicación de animales persistentemente infectados es un objetivo
importante en el control de la enfermedad.
Boulanger et al. (J. Gen. Virol. 72,
1195-1198, 1991) y Corapi et al. (Am. J.
Vet. Res. 51, 1388-1394, 1990) describen la
caracterización de un gran número de anticuerpos monoclonales
anti-BVDV (Moab). La mayoría de estos Moabs no
reconocen un determinante antigénico presente en todas las cepas del
BVDV que se examinan. Corapi et al. identificó un Moab que
es reactivo con un antígeno lineal determinante expresado en todas
las cepas del BVDV ensayadas. En estos documentos no se sugiere
ninguna aplicación diagnóstica de estos Moab.
Kosmidou et al., Veterinary Microbiology
47, 111-118, 1995 describe varios anticuerpos
monoclonales dirigidos contra la proteína CSFV (E_{ms}). Sin
embargo, estos anticuerpos no reaccionaron con la proteína E_{0}
de las cepas del BVDV.
Hulst et al., Journal of Virology,
72(1), 151-157, 1998, describe un anticuerpo
monoclonal contra E_{ms} de CSFV, que se usa para detectar la
expresión de proteínas virales en células infectadas con virus
recombinantes. No se menciona la reactividad con E_{ms} de
BVDV.
En la técnica existen varios métodos disponibles
para la diagnosis de la infección por BVDV en el ganado. Hasta
ahora, la detección de BVDV se realiza algunas veces por medio del
"método del cultivo de tejido" donde se preparan leucocitos a
partir de muestras de sangre y se inoculan en células susceptibles.
La infección de las células por BVDV se detecta por técnicas de
inmunotinción usando reactivos serológicos específicos. Este método
diagnóstico se considera el "patrón de oro" con respecto a la
especificidad y sensibilidad. Sin embargo, este método es bastante
laborioso, es largo, no puede automatizarse y, por tanto, no puede
aplicarse a grande números de muestras.
El ELISA de captura de antígenos ahora está
disponible en el comercio para la detección del BVDV y estos ensayos
superan algunos de los inconvenientes asociados con el método del
cultivo de tejido (Brinkhof et al., Veterinary Microbiology
50, 1-6, 1996; Fritzmeier et al.,
AFT-Tagung BVD-Bekämpfung, Octubre
de 1998, Hannover, Alemania).
La base de todos estos ensayos comerciales es:
(a) recubrimiento de placas de microtitulación con anticuerpos
monoclonales (Moab) o antisuero monoespecífico policlonal contra la
proteína no estructural NS2/3 para la captura de antígenos, (b)
detección del antígeno viral después de la incubación con una
muestra (obtenida a partir de leucocitos o muestras de órganos) por
un Moab o un antisuero monoespecífico policlonal. La sensibilidad
de los ensayos disponibles resultó ser menor del 100%. Además, los
ensayos disponibles en la actualidad requieren el uso de
preparaciones de leucocitos de sangre anticoagulada, o muestras de
tejidos o de sangre anticoagulada de los órganos de los animales de
ensayo.
También se ha descrito la detección del antígeno
de BVDV por medio de análisis FACS (separación de células activadas
por fluorescencia). Esta técnica también usa leucocitos y las
células infectadas con BVDV se identifican con anticuerpos contra el
antígeno NS2/3 del BVDV. Generalmente este método diagnóstico se
considera comparable con la infección de células de cultivo. Este
método también requiere la preparación de sangre y la disponibilidad
de equipamiento de laboratorio altamente especializado.
De esta forma, existe la necesidad de un método
diagnóstico sensible, rápido y práctico para determinan la infección
por Pestivirus en animales, en particular para determinar la
infección por BVDV en el ganado, especialmente en el marco general
de programas de erradicación en los que se tienen que controlar gran
cantidad de cabezas de ganado.
Además, existe una necesidad de un reactivo
diagnóstico para usar en tales métodos diagnósticos que sea
altamente específico (es decir, sin muestras positivas falsas) y
altamente sensible (sin muestras negativas falsas).
Para ese objetivo la presente invención
proporciona en un primer aspecto un anticuerpo monoclonal que es
capaz de unirse específicamente a un determinante antigénico de
E^{RNS} de un Pestivirus que es o que compite de forma cruzada
con un anticuerpo monoclonal expresando mediante la línea celular
de hibridoma 50F4-10-INT, depositada
en la ECACC, Salisbury, Reino Unido, el 5 de febrero de 1999 con el
número de acceso 99020505.
Se ha descubierto que un anticuerpo monoclonal,
de acuerdo con la invención, reconoce un epítopo muy conservado en
la proteína E^{RNS} (RNS = ribonucleasa soluble) de todos los
Pestivirus ensayados, incluyendo muchas cepas del BVDV, CSFV y BDV
diferentes. La detección de la glicoproteína E^{RNS} codificada
por Pestivirus (o anticuerpos contra esta glicoproteína) en una
muestra de ensayo indica que el animal del que se deriva la muestra
está infectado con el virus. Además, se ha descubierto que un
anticuerpo monoclonal, de acuerdo con la invención, es altamente
específico, es decir, el anticuerpo monoclonal puede distinguir
entre muestras negativas y positivas de animales, tales como
ganado, en contraste con un antisuero E^{RNS} policlonal
monoespecífico.
La proteína E^{RNS} representa una
glicoproteína estructural y como tal forma parte del Pestivirus.
Además, se segrega de las células infectadas (por ejemplo
leucocitos) conduciendo a una forma soluble de E^{RNS}. Por
consiguiente, ambas formas de E^{RNS} -tanto la forma soluble como
la asociada al virus- están presentes en las células así como en el
suero/plasma de animales infectados. Por el contrario, la proteína
NS2/3 sólo puede detectarse en células infectadas (Colett et
al., Virology 165, 191-199 y
200-208, 1988; Thiel et al., J. Virology
65, 4705-4712, 1991; Weiland et al.,
J. Virology 66, 3677-3682, 1992; Meyers
et al., Advances in Virus Research 47,
53-118, 1996; Rümenapf et al., J. Virology
67, 3288-3294, 1993).
Un anticuerpo monoclonal que compite de forma
cruzada con el anticuerpo monoclonal depositado específicamente es
un anticuerpo que se une al mismo determinante antigénico conservado
(conformacional) que el anticuerpo monoclonal depositado. Los
experimentos de competición cruzada son relativamente fáciles de
llevar a cabo (Waters et al., Virus Res. 22,
1-12, 1991) y, de esta forma, es fácil determinar
si un anticuerpo dado compite de forma cruzada con el anticuerpo
monoclonal designado específicamente anteriormente.
En resumen, tales anticuerpos monoclonales que
compiten de forma cruzada reactivos con el mismo determinante
antigénico conservado pueden obtenerse usando un espectro de
pestivirus definidos para exploración después de la inmunización de
ratones con células infectadas con pestivirus, virus purificado o,
preferiblemente, proteína E^{RNS} purificada (Wensvoort et
al., J. Gen. Virol. 71, 531-540, 1990;
Hulst et al., Virology 200, 558-565,
1994), seguido de fusión. Primero, se seleccionan anticuerpos
monoclonales que reaccionan con un determinante antigénico presente
en todas las cepas de pestivirus examinadas. Posteriormente, los
anticuerpos monoclonales seleccionados pueden usarse en un ELISA de
competición convencional con el anticuerpo monoclonal depositado
con el número de acceso de la ECACC 99020505 para identificar los
anticuerpos monoclonales que se unen al mismo determinante
antigénico conservado que el Moab depositado.
La tecnología de anticuerpos monoclonales se ha
establecido bien a partir el trabajo original de Köhler y Milstein
(Nature, 256, 495, 1975) y, en la actualidad, existen muchos
protocolos disponibles para la generación rutinaria de anticuerpos
monoclonales. Son técnicas apropiadas, por ejemplo, las de Gefter
et al., (Somatic Cell Genetics, 3, 231, 1977), Köhler
et al., (Eur. J. Immunol. 6, 292-295,
1976) y Goding ("Monoclonal antibodies: Principles and
Practice"; 3º Edición, 1996, Academic Press, Nueva York).
Normalmente, el protocolo usado es el
siguiente:
- un animal experimental (tal como un ratón) se
inmuniza expuesto con el antígeno contra el que se inducirán los
anticuerpos;
- después, las células del bazo del animal se
fusionan con las células de una línea celular de mieloma y las
células de fusión de hibridoma resultantes se cultivan en placas en
medio selectivo;
- la selección de anticuerpos específicos se
realiza mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo, mediante
el uso de anticuerpos anti-inmunoglobulina de otras
especies.
Preferiblemente, la presente invención
proporciona un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse
específicamente con un determinante antigénico conservado en la
proteína E^{RNS} del Pestivirus y que es el anticuerpo monoclonal
expresado por la línea celular de hibridoma depositada en la ECACC
con el número de acceso 99020505.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona una línea celular de hibridoma capaz de
expresar (y preferiblemente secretar) un anticuerpo monoclonal como
se ha descrito anteriormente. La generación líneas celulares de
hibridoma y la identificación de una línea celular de hibridoma que
expresa el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente
invención se ha descrito anteriormente.
Una línea celular de hibridoma de acuerdo con la
invención es la línea celular
50F4-10-INT, depositada en la ECACC
con el número de acceso 99020505.
Las propiedades ventajosas de un anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la invención, es decir, su alta
especificidad y sensibilidad, además de su reactividad con un
determinante antigénico que es accesible en un ensayo inmunológico
convencional, hacen del presente anticuerpo monoclonal un reactivo
muy apropiado en un ensayo diagnóstico para identificar la infección
por Pestivirus en animales, en particular, para identificar BVDV en
ganado infectado (persistentemente).
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la
presente invención proporciona un método para la diagnosis in
vitro de la infección por Pestivirus en animales que comprende
la etapa de examinar una muestra de ensayo de un animal sospechoso
de estar infectado con un Pestivirus con respecto a la presencia de
anticuerpos o antígenos de Pestivirus, caracterizado por que la
muestra de ensayo está contactada con un anticuerpo monoclonal como
se ha descrito anteriormente. En vista del hecho de que el
anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención reconoce un
epítopo conservado presente en todas las cepas del BVDV, CSFV y BDV
ensayadas, el método diagnóstico, de acuerdo con la invención, es
adecuado para la detección de estos virus en todos los animales
hospedadores de estos virus, incluyendo ganado, cerdos, ovejas y
cabras.
Preferiblemente, la presente invención se refiere
a un método para la diagnosis de infección por Pestivirus en
animales como se ha descrito anteriormente donde examina la
presencia de antígenos o anticuerpos de BVDV en una muestra de
ensayo obtenida del ganado.
El diseño del inmunoensayo puede variar y puede
ser similar a los inmunoensayos que se usan habitualmente en la
técnica para identificar la presencia de un antígeno o anticuerpos
de virus en muestras tomadas de seres humanos o animales. Por
ejemplo, el ensayo puede basarse en una reacción directa o de
competición. Además, los protocolos pueden usar soportes sólidos o
pueden usar material celular. La detección del Pestivirus, tal como
BVDV, antígenos o anticuerpos puede implicar el uso de anticuerpos
marcados (directa o indirectamente) y los marcajes pueden ser
enzimas, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o
de tinción. Los anticuerpos de detección pueden ser anticuerpos
monoclonales o policlonales monoespecíficos de E^{RNS}. En
particular, el anticuerpo de detección es un anticuerpo monoclonal
(marcado) de acuerdo con la presente invención. En el último caso,
el antígeno del Pestivirus puede capturarse mediste anticuerpos
policlonales anti-Pestivirus, en particular
anticuerpos monoespecíficos de E^{RNS}.
Preferiblemente, el método para la diagnosis de
la infección por Pestivirus es un ensayo con antígeno que se
caracteriza adicionalmente por que se examina la muestra de ensayo
con respecto a la presencia de antígenos de Pestivirus, en
particular BVDV y comprende las etapas de:
(i) incubar la muestra de ensayo con el
anticuerpo monoclonal,
(ii) permitir la formación de un complejo
anticuerpo-antígeno,
(iii) detectar la presencia del complejo
anticuerpo-antígeno.
En este método, el anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la invención puede unirse al determinante antigénico en
E^{RNS} conservado presente en las células infectadas o en forma
soluble en plasma o suero en la muestra de ensayo. Por lo tanto, en
principio, el método de acuerdo con la invención comprende los
ensayos con antígeno que se usan actualmente, tales como el
"método del cultivo de tejido", ELISA de captura de antígenos y
análisis FACS a los que se ha hecho referencia anteriormente.
En una realización preferida, la muestra de
ensayo se pone en contacto con el anticuerpo (captura) de acuerdo
con la invención que se recubre sobre un soporte sólido, tal como
una placa de microtitulación, una membrana, una tira de ensayo o la
superficie de una partícula, tal como una partícula de látex.
Aunque puede usarse una suspensión de leucocitos,
sangre entera o una muestra de tejido como muestra de ensayo en el
método de acuerdo con la presente invención, los presentes
inventores han descubierto que pueden obtenerse resultados
positivos particulares usando suero o plasma de animales sospechosos
de estar infectados con el BVDV. En el caso de que se use suero o
plasma como muestra de ensayo en el método de acuerdo con la
invención, se proporciona un método para la diagnosis de la
infección por BVDV que, por un lado, es muy sensible y específico y
que, por otro lado, es muy práctico, puede realizarse rápidamente y
permite el examen de un gran número de muestras de ensayo.
Por lo tanto, en una realización aún más
preferida de la invención, se proporciona un método para la
diagnosis de infección por Pestivirus en animales en el que la
muestra de ensayo contactada con el anticuerpo monoclonal de captura
descrito anteriormente es suero o plasma del animal, en particular
ganado, sospechoso de estar infectado.
Un método particularmente adecuado para la
diagnosis de infección por Pestivirus de acuerdo con la presente
invención como se ha descrito anteriormente es el bien conocido
ELISA.
En un ejemplo de ELISA, los pocillos de un placa
de microtitulación de poliestireno se recubren con un anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la invención seguido del bloqueo de los
sitios de unión no ocupados, por ejemplo, con leche desnatada.
Después, los pocillos de las placas recubiertas se incuban con el
suero o plasma de la muestra de ensayo. Después de la incubación, se
determina la presencia (o ausencia) del complejo
anticuerpo-antígeno detectando la E^{RNS} unida
con (por ejemplo biotina) anticuerpos policlonales monoespecíficos
o monoclonales marcados contra E^{RNS}. El anticuerpo marcado
ocupará los determinantes antigénicos libres en la proteína
E^{RNS} que no han sido ocupados por el anticuerpo monoclonal de
captura. Posteriormente, se puede añadir, por ejemplo peroxidasa de
rábano picante acoplado a avidina y la cantidad de peroxidasa se
mide mediante una reacción enzimática. Como alternativa, después de
la incubación con la muestra de ensayo, puede determinarse
directamente la cantidad de antígeno en E^{RNS} presente en el
suero o plasma usando un conjugado enzimático de anticuerpo
anti-E^{RNS} seguido de la reacción
enzimática.
El ELISA antígeno de acuerdo con la invención es
particularmente adecuado para identificar animales jóvenes, es
decir, menores de 3 meses de edad, en vista del hecho de que la
presencia de anticuerpos derivados maternales en tales animales no
influye en el resultado del ensayo.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un kit diagnóstico que comprende además de un anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la invención, medios para detectar si el
antígeno en E^{RNS} está unido al anticuerpo monoclonal de
captura. El anticuerpo monoclonal de captura y los medios de
detección pueden proporcionarse en distintos compartimentos del kit.
El anticuerpo monoclonal de captura se proporciona preferiblemente
unido a un soporte sólido. Los medios de detección comprenden un
segundo anticuerpo detectable marcado (monoclonal o policlonal) que
se une al Pestivirus, preferiblemente antígeno de BVDV.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la presente invención para la diagnosis in vitro
de Pestivirus, en particular infección por BVDV, CSFV y BDV en un
animal.
La expresión de la proteína recombinante
E^{RNS} se realizó mediante un baculovirus recombinante que
contiene el gen completo para la E^{RNS} de
CSFV-Alfort Tübingen (Windsich et al., J.
Virology 70, 352-358, 1996; Rümenapf et
al., supra; Hulst et al., Virology 200,
558-565, 1994). La purificación de extractos de
células de insecto infectadas se realizó por
inmuno-afinidad con un anticuerpo monoclonal
específico de E^{RNS}. Se inmunizaron ratones Balb/c hembra con
50 \mug de E^{RNS} recombinante purificada mezclada con
adyuvante de Freund por vía intraperitoneal (i.p.). Los días 5 y 2
antes de la fusión, se reforzó un ratón seleccionado con E^{RNS}
recombinante (50 \mug) sin adyuvante cada día hasta la fusión. Las
células del bazo se fusionaron con células de mieloma SP2/0 en
presencia de polietilenglicol. Los productos de fusión de colocaron
en placas de 96 pocillos y se cultivaron en presencia de medio HAT
(hipoxantina, amiopterina, timidina) para la selección de los
híbridos entre células de mieloma y células B. Los hibridomas que
segregaban anticuerpos específicos de E^{RNS} se identificaron
con un ELISA como se describe más adelante. Un día antes de la
selección se sustituyó el medio de cada pocillo con medio
fresco.
- placas ELISA: 96 pocillos,
- Anticuerpo de captura: Se usó IgG purificada de
ratones que se habían inmunizado con E^{RNS} purificada de
afinidad mediante baculovirus recombinante, que contienen el gen
para la E^{RNS} de CSFV-Alfort Tübingen para
recubrir las placas ELISA,
- Antígeno para la selección inicial: lisado de
células de insecto infectadas con el baculovirus recombinante que
expresa la E^{RNS} del CSFV,
- Antígenos para la caracterización adicional de
hibridomas: lisado de células PK15 infectadas con distintas cepas
del CSFV y lisados de células MDBK infectadas con distintas cepas
del BVDV/BDV,
- Solución de bloqueo: albúmina de suero bovino
al 1% en PBS/Tween 20 al 0,05%,
- Anticuerpo de detección: IgG de mono
anti-ratón conjugada con peroxidasa con mínima
reacción cruzada a proteínas en suero de conejo,
- Tampón de lavado ELISA:
Tris-HCl 20 mM pH 7,4/NaCl 300 mM/KCl 2,5 mM/Tween
20 al 0,05%,
- Sustrato: solución madre de 10 mg de TMB en 4
ml de DMSO.
- Tampón sustrato: acetato sódico 100 mM pH
5,6/Tween 20 al 0,05%,
- Sustrato de trabajo: 1,2 ml de solución madre
de TMB más 8,8 ml de tampón sustrato más 1,5 \mul de
H_{2}O_{2} al 30%,
- Solución de parada: H_{2}SO_{4} concentrado
diluido 1:4
- Recubrimiento: Cada pocillo de las placas ELISA
se recubrió con IgG de conejo anti E^{RNS} en PBS; el
recubrimiento se realizó durante una noche a 4ºC,
- Bloqueo: cada pocillo recibió 200 \mul de
solución de bloqueo; incubación a temperatura ambiente durante 60
minutos (agitador),
- Incubación con antígeno: cada pocillo se incubó
con lisado que contenía E^{RNS} (lisado de células de insecto
infectadas con baculovirus recombinante o lisado de células de
cultivo infectadas con pestivirus) diluido con solución de bloqueo;
incubación a temperatura ambiente durante 90 minutos (agitador),
- Incubación con sobrenadante de hibridoma: el
sobrenadante (10 a 25 \mul) se diluyó con solución de bloqueo;
incubación a temperatura ambiente durante 120 minutos
(agitador),
- Incubación con anticuerpo de detección a
temperatura ambiente durante 90 minutos (agitador) seguido de
incubación con sustrato de peroxidasa.
Se seleccionó el cultivo de hibridoma productor
de anti-E^{RNS}
50F4-10-INT (ECACC Nº 99020505) para
la reclonación y se examinó con respecto a sus características de
unión.
(a) El anticuerpo monoclonal 50F4 se ha
caracterizado principalmente por ELISA (como se ha descrito
anteriormente) usando extractos de células infectadas con una varios
pestivirus distintos. El Moab muestra reacción con la proteína
E^{RNS} de todas las cepas usadas (véase la Tabla 1). Las cepas de
pestivirus seleccionadas cubren las cuatro especies descritas de
pestivirus (CSFV, BVDV-1, BVDV-2 y
BDV) y la mayoría de los distintos subgrupos en las especies.
(b) El Moab reconoce la E^{RNS} por
inmunotransferencia. La reactividad se restringe a la proteína, que
se separa en condiciones no reductoras. Si la proteína se separa en
condiciones reductoras, el Moab no reconoce la E^{RNS} indicando
que el determinante antigénico conservado reactivo con el Moab es un
determinante antigénico conformacional.
| Antígeno | 50F4 |
| Células PK15 no infectadas | - |
| CSFV-Alfort Tübingen | + |
| CSFV-Schewinfurt | + |
| CSFV-Siegburg | + |
| CSFV-Riems | + |
| CSFV-Weilburg | + |
| CSFV-Rhön | + |
| CSFV-Alfort/187 | + |
| CSFV-Henken | + |
| CSFV-Celle | + |
| Antígeno | 50F4 |
| CSFV-Belgien | + |
| CSFV-Polen | + |
| CSFV-Brescia | + |
| CSFV-Eystrup | + |
| CSFV-Duvaxin | + |
| CSFV-Lothringen | + |
| CSFV-iffa | + |
| CSFV-Paderborn | + |
| Células MDBK no infectadas | - |
| BDV-X818 | + |
| BDV-Frijters | + |
| BDV-X878 | + |
| BDV-Deer GB | + |
| BDV-Osloss | + |
| BDV-Rispoval | + |
| BDV-ncp7 | + |
| BDV-Oregon | + |
| BDV-V85 | + |
| BDV-Singer | + |
| BDV-5322/97 | + |
| BDV-Gi I | + |
| BDV-Gi IV | + |
| BDV-890 | + |
El ELISA antígeno se realizó de acuerdo con los
protocolos convencionales:
A
- Recubrimiento: Cada pocillo de las placas ELISA
se recubrió con 5 \mul de sobrenadante de Moab 50F4 en 45 \mul
de PBS; el recubrimiento se realizó durante una noche a 4ºC,
- Bloqueo: Cada pocillo recibió 200 \mul de
solución de bloqueo (2% de leche desnatada en PBS/Tween 20 al
0,05%); incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos
(agitador),
- Incubación con muestras: Cada pocillo recibió
50 \mul de solución de bloqueo y 100 \mul de muestra
(suero/plasma); incubación a temperatura ambiente durante 180
minutos (agitador),
- Incubación con antisuero de conejo biotinilado
contra E^{RNS} diluida: 1:1000 en solución de bloqueo, 50 \mul
por pocillo; incubación a temperatura ambiente durante
90-120 minutos (agitador),
- Incubación con estreptavidina conjugada con
peroxidasa diluida 1:2000 en solución de bloqueo, 50 \mul por
pocillo; incubación a temperatura ambiente durante
45-60 minutos (agitador),
Las placas se lavan cuidadosamente entre cada una
de las etapas descritas anteriormente, de 4 a 5 veces con tampón de
lavado ELISA (Tris-HCl 20 mM pH 7,4/NaCl 300 mM/KCl
2,5 mM/Tween 20 al 0,05%).
- Incubación con sustrato TMB; 50 \mul por
pocillo; interrupción de la reacción enzimática con 50 \mul de
solución de parada por pocillo.
Se usó inicialmente una preparación de IgG de un
antisuero policlonal monoespecífico contra E^{RNS} como anticuerpo
de captura y también en una forma marcada como anticuerpo de
detección en un ELISA para la identificación de ganado
persistentemente infectado. Usando estos reactivos no se puede
distinguir entre muestras de ganado positivas y negativas, ya que se
obtuvieron falsos positivos (véase la Figura 1, muestra Nº 1489).
Este problema pudo solucionarse reemplazando el suero
monoespecífico policlonal contra a E^{RNS} como anticuerpo de
captura mediante el anticuerpo monoclonal 50F4. La Figura 1 muestra
el resultado de un ELISA usando las mismas muestras pero las dos
etapas diferentes del ensayo. Obviamente, la muestra Nº 1489 no
volvió a generar un resultado positivo falso. En este experimento,
la detección del antígeno unido se realiza con el antisuero
monoespecífico policlonal marcado contra E^{RNS}, pero puede ser
apropiado reemplazar el antisuero policlonal en la fase de
detección por un Moab.
B
En un ensayo adicional, usando los materiales
descritos en A., se recubrieron placas de 96 pocillos con 5
\mul de Moab 50F4/pocillo en tampón de recubrimiento (50
\mul/pocillo) durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar
repetidamente (4x) las placas se bloquearon con tampón de bloqueo
(200 \mul/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después
de retirar el tampón de bloqueo y de lavar repetidamente (3x) se
añadieron muestras de plasma (100 \mul/pocillo) y se incubaron
durante 1 hora a temperatura ambiente.
Después de lavar repetidamente (3x) se añadió
suero de conejo anti-E^{RNS} biotinilado
(100\mul/pocillo) en una dilución de 1:2000 y se incubó durante 1
hora a temperatura ambiente. A continuación se realizaron etapas de
lavado (3x) y se añadió el conjugado de
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1:2000
en PBS). Después de incubar durante 45 minutos a temperatura
ambiente, las placas se lavaron (3x) y se añadió sustrato TMB listo
para usar (100 \mul/pocillo). La reacción se interrumpió después
de 5-10 minutos por la adición de 50 \mul de
solución de parada.
Las placas se leyeron en un lector ELISA equipado
con una combinación de filtros de 450/620 nm.
Se ensayaron 135 muestras de sangre escogidas al
azar. A partir de las muestras de sangre, el plasma se preparó por
centrifugación y se empleó en el ELISA E^{RNS}. Las restantes
muestras de sangre se procesaron posteriormente para aislar el
virus en el cultivo celular usando procedimientos
convencionales.
Cuando se compararon los resultados de las
muestras de plasma ensayadas en el ELISA E^{RNS} con los
resultados respectivos del aislamiento del virus ("norma de
oro") se calculó una especificidad de 100% y una sensibilidad de
89% para el ELISA actual (Tabla 2).
A
En un ensayo comparativo, se examinó la
especificidad y sensibilidad de un ELISA antígeno de acuerdo con la
presente invención y un ELISA antígeno disponible en el mercado
(BVDV Antigen Test Kit FOR SERUM; disponible en Syracuse
Bioanalytical, Inc, Ithaca, Nueva York, Estados Unidos; solicitud
PCT WO 99/15900). El último ensayo usa el Moab 15C5 como anticuerpo
de captura específico contra E^{RNS}. El sistema detector es un
anticuerpo de cabra policlonal anti-BVDV junto en
conjugación con conjugado de
HRP-anti-cabra. El ensayo se
realiza de acuerdo con las instrucciones adjuntas en el kit del
ensayo.
El ensayo de acuerdo con la invención se realiza
como se describe en el kit del ensayo
CHEKIT-BVD-Virus-II
disponible por Dr. Bommeli AG, Berna, Suiza. Este ensayo usa
anticuerpos de conejo anti-E^{RNS} purificados de
afinidad como anticuerpos de captura y el Moab 50F4 del conjugado
HRP como sistema detector.
Se ensayaron 23 muestras de suero positivas y 23
negativas (de acuerdo con el aislamiento del virus). El ensayo de
acuerdo con la invención actuó de forma casi idéntica a la "norma
de oro" y fue ligeramente mejor que el ensayo comparativo donde
identificó una muestra positiva más y presenta mejores parámetros de
MV (Tabla 3):
| Aislamiento del virus (norma de oro) | ELISA antígeno basado en Moab | ELISA antígeno basado en Moab |
| 50F4 | 15C5 | |
| 23 positivos | 22 pos. 1 neg. | 21 pos. 2 neg. |
| 23 negativos | 23 neg. | 23 neg. |
| MV* positivos | 3,069 | 1,499 |
| MV* negativos | 0,157 | 0,192 |
| *MV es la media del valor medio de la lectura ELISA |
B
En un experimento comparativo, el ensayo de
acuerdo con la presente invención como se ha descrito en A.
(CHEKIT-BVD-Virus-II)
se comparó con el kit del ensayo de la técnica anterior (Dr.
Bommeli AG, Berna, Suiza). El último ensayo también es un ensayo de
detección de antígenos pero se basa en la detección del antígeno
NS2/3 del BVDV en preparaciones de leucocitos. Este ensayo usa un
Moab C16 específico de NS2/3 como anticuerpo de captura y
anticuerpo de cerdo anti-BVDV conjugado con HRP como
sistema detector.
Se descubrió que en el ensayo de acuerdo con la
invención, un gran número sustancial de muestras positivas
(determinadas por el aislamiento del virus) se identificó, de hecho,
como positivo en comparación con en ensayo de la técnica anterior
basado en el ELISA antígeno NS2/3 (Tabla 4).
| Aislamiento del virus (norma de oro) | ELISA antígeno basado en | ELISA antígeno basado en |
| detección de antígeno de | detección de antígeno | |
| E^{RNS} | NS2/3 | |
| 343 positivos | 327 pos. 16 neg. | 308 pos. 35 neg. |
| 263 negativos | 254 neg. 9 pos. | 261 neg. 2 pos. |
La Figura 1 muestra el resultado de dos ELISA
antígenos con dos anticuerpos de captura diferentes.
Izquierda: antisuero policlonal
anti-E^{RNS}
Derecha: Moab 50F4
Muestra Nº 1489: suero de animal no infectado
Muestra Nº 11137: suero de animal no
infectado
Muestra Nº 872: suero de animal persistentemente
infectado.
Claims (9)
1. Un anticuerpo monoclonal capaz de unirse
específicamente a un determinante antigénico con E^{RNS} de un
Pestivirus que es o que compite de forma cruzada con un anticuerpo
monoclonal secretado por la línea celular de hibridoma 50F4,
depositada en la ECACC con el número de acceso 99020505.
2. Una línea celular hibridoma capaz de secretar
un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un método para la diagnosis in vitro de
la infección por Pestivirus en animales que comprende las etapas de
examinar una muestra de ensayo de un animal que se sospecha que
está infectado con el Pestivirus con respecto a la presencia de
antígenos o anticuerpos de Pestivirus, caracterizado porque
la muestra de ensayo se pone en contacto con un anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizado porque se examina una muestra de ensayo de
ganado con respecto a la presencia de antígenos o anticuerpos del
BVDV.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 ó
4, caracterizado porque la muestra de ensayo se examina con
respecto a la presencia de antígenos de Pestivirus y comprende las
etapas de:
- (i)
- incubar la muestra de ensayo con el anticuerpo monoclonal,
- (ii)
- permitir la formación del complejo anticuerpo-antígeno,
- (iii)
- detectar la presencia del complejo anticuerpo-antígeno.
6. Un método de acuerdo con las reivindicaciones
3-5, caracterizado porque el anticuerpo
monoclonal se recubre en un soporte sólido.
7. Un método de acuerdo con las reivindicaciones
3-6, caracterizado porque la muestra de
ensayo es suero o plasma del animal sospechoso de estar infectado
con el Pestivirus.
8. Un método de acuerdo con las reivindicaciones
3-7, caracterizado porque el método para la
diagnosis es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA).
9. Un kit de ensayo para la detección de un
antígeno de Pestivirus, preferiblemente un antígeno del BVDV en una
muestra de ensayo, que comprende un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la reivindicación 1 y medios para detectar si el
anticuerpo monoclonal está unido al antígeno.
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