ES2212989T3 - Nueva cepa de la bacteria pantoea agglomerans, (erwinia herbicola) y su utilizacion como agente de control biologico de las enfermedades fungicas de frutas. - Google Patents
Nueva cepa de la bacteria pantoea agglomerans, (erwinia herbicola) y su utilizacion como agente de control biologico de las enfermedades fungicas de frutas.Info
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Abstract
Se describe un cultivo biológico substancialmente puro de una cepa bacteriana de la especie Pantoea agglomerans, también conocida como Erwinia herbicola, depositada con el número CECT-4920, y su utilización como antagonista para el control biológico de los hongos responsables de la podredumbre de la fruta. La efectividad de dicho antagonista resulta ser muy elevada y es comparable a los productos fungicada más utilizados. Dicha actividad se manifiesta con especial intensidad cuando se producen condiciones de almacenamiento a bajas temperaturas. El antagonista resulta efectivo para combatir la podredumbre causada por, entre otros microorganismos, los hongos de las especies Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum y Rhizopus stolonifer.
Description
Nueva cepa de la bacteria Pantoea
agglomerans, (Erwinia herbicola) y su utilización como
agente de control biológico de las enfermedades fúngicas de
frutas.
La presente invención se refiere a una nueva cepa
de la bacteria Pantoea agglomerans y a su utilización como
antagonista para el control biológico de las infecciones de la
fruta con el objetivo de prevenir la podredumbre de la misma.
Las enfermedades de postcosecha de las frutas
producen pérdidas anuales en la agricultura que se estiman, a nivel
mundial, en una cantidad del orden de un 15% a un 20% del total de
las cosechas.
En la actualidad, el sistema más utilizado para
combatir a los hongos causantes de la podredumbre de las frutas es
el control químico, mediante tratamiento de las mismas con
productos fungicidas. El empleo de los fungicidas está bastante
extendido a nivel mundial y se estima que supone hasta el 26% de
los pesticidas de los mercados europeo y asiático y, en el caso del
mercado norteamericano, hasta el 6%.
La utilización masiva de dichos productos
fungicidas ha generado una serie de problemas, tales como la
aparición de cepas patogénicas resistentes - lo que repercute en el
incremento progresivo de los costes de los tratamientos y en el
aumento de los niveles de pérdidas por podredumbre - y el incremento
de residuos de fungicidas en los frutos que provoca problemas de
tipo sanitario y dificulta las exportaciones a los países que poseen
una reglamentación sanitaria restrictiva sobre el tema.
Ante dicho problema y la creciente demanda de
productos libres de residuos por parte de los consumidores, se ha
comenzado a desarrollar, hace relativamente pocos años, una
actividad investigadora con el fin de encontrar nuevos métodos
alternativos para el control de las enfermedades de los frutos,
siendo una de las alternativas más prometedoras el control biológico
de los hongos causantes de la podredumbre mediante el uso de
microorganismos. Dicho control biológico se fundamenta en la acción
inhibidora de algunos microorganismos sobre el crecimiento y acción
de los hongos patógenos. Así, Janisiewicz W.J. and Marchi, A.,
Plant Disease 76:555 (1992), describen la utilización de
Pseudomonas syringae como agente de biocontrol de postcosecha
para combatir la podredumbre de las peras; Huang, Y.; Wild, B.L. and
Morris, S.C., Annals Applied Biological
120:367-372 (1992), describen la utilización
de Bacillus pumilus como agente de biocontrol de postcosecha
para combatir el moho verde (Penicillium digitatum) en
cítricos.
Se ha descrito también el empleo de diferentes
cepas de levaduras como agentes de control biológico de
enfermedades de postcosecha de los frutos. Por ejemplo, Viñas, I.;
Usall, J.; Teixidó, N. and Sanchis, V., International Journal of
Food Microbiology 40:9-16 (1998), han
descrito la utilización de Candida sake como agente de
control biológico de los principales hongos patógenos en
postcosecha de manzanas, y en las solicitudes de patente
WO-92/18009 y WO-96/30495, esta
última equivalente de la patente española
ES-2089981, y en la solicitud de patente
norteamericana US-7-745796,
publicada como documento NTIS (National Technical Information
Service) número PB92-102334, también se describe la
utilización de cepas del género Candida con el mencionado
objetivo.
Sin embargo, los agentes bacterianos resultan de
particular interés como agentes de biocontrol, pues son de fácil y
rápido crecimiento y aplicación y porque resultan bien conocidas
para el experto una serie de formulaciones para bacterias que
permiten aumentar la supervivencia de las mismas una vez
aplicadas.
Bryck et al. Biocontrol, 1998, Vol. 43
pags. 97-106, describe que dos cepas de Erwinia
herbicola aisladas en Polonia en hojas de manzanos, llamadas B66 y
B90, mostraron cierta actividad "in vitro" contra
Botrytis cinerea y Penicillium expansum y sugirió que
podrían servir para proteger manzanas. No existen depósitos de B66
y b90 disponibles públicamente.
Shoelberg P.L. et al.
Phytopathology, 1994, Vol. 84, No, 10, pag. 1152, describe
en unos resumenes muy escuetos que varias cepas de Pseudomonas
sp. , Enterobacter aerogenes y una levadura no
identificada inhibían la putrefacción de la manzana debida al
Penicilium expansum. No existen depósitos públicamente
disponibles.
Gulati M.K. et al. Mitt. Biol.
Bundesanstalt Landfostwirstschaft, 1998, No. 357, page 338,
describen un test para controlar los patógenos vegetales que
provocan la putrefacción roja de raíces elaborado con una cepa
concreta de Erwinia herbicola (G-584). Se
describen unos pobres resultados y no existe un depósito
públicamente disponible.
Dock L.L. et al. Journal of Food
Protection, 1998, Vol. 61 (12), pags 1661-1665,
describe que una cepa no identificada de Erwinia sp. aislada en
cebollas en Dinamarca puede actuar como agente para controlar el
crecimiento de Botrytis cinerea en manzanas almacenadas bajo
atmósfera modificada. No existe ningún depósito públicamente
disponible.
El-Goorani et al. J.
Phytopathology, 1992, Vol. 136, pages 335-339,
describe nueve cepas de E.herbicola (Pantoea agglomerans)
obtenidas de una colección personal de cultivos no disponibles
públicamente. Dichas cepas de E. erbicola son productoras
de antibioticos y su actividad se prueba contra E. amilovora, un
patógeno vegetal, no un patógeno frutal, que causa el fuego
bacteriano en huéspedes rosáceos.
La patente
US-A-5783411 se refiere al uso de
una cepa de Pantoea agglomerans , con un número de depósito
NRL B21048, como un inhibidor para la enfermedad de la putrefacción
seca de las patatas.
En la patente
US-A-4045910 se describe una cepa de
Erwinia herbicola, variedad ananus, denominada por sus
inventores M232A, y depositada en la Colección Americana de
Cultivos Tipo con el número de identificación ATCC 31225, así como
su empleo para reducir el riesgo de congelación de las plantas.
Por su parte, en la patente
US-A-4569841 se describe una cepa de
E. herbicola, denominada por los inventores
EHO-10, y depositada en la Colección Americana de
Cultivos Tipo con el número de identificación ATCC 39368, así como
su empleo para combatir enfermedades bacterianas en las plantas y en
especial el Fuego bacteriano, no para combatir las enfermedades
fúngicas de la fruta.
El objeto de la presente invención es
proporcionar un cultivo biológico substancialmente puro de una
nueva cepa de la bacteria Pantoea agglomerans (Erwinia
herbicola) capaz de actuar como antagonista altamente efectivo
para el control biológico de los hongos patógenos responsables de la
podredumbre de la fruta de pre y postcosecha y que mantiene su
efectividad en condiciones de baja temperatura y en atmósfera
empobrecida en oxígeno.
Otro objeto de la presente invención consiste en
la utilización de dicho antagonista, por sí solo o junto a otros
agentes antifúngicos y/o adyuvantes, para prevenir la podredumbre
de la fruta recolectada, durante su almacenamiento.
Todavía otro objeto de la presente invención
consiste en proporcionar un método para la mejor conservación de la
fruta recolectada en diferentes condiciones de almacenamiento, en
lo que respecta a temperatura y atmósfera de oxígeno y dióxido de
carbono.
Se adjuntan a la presente descripción, para una
mejor comprensión de la misma, pero sin efectos limitativos, 10
hojas con dibujos de los que, a continuación, se expone una breve
descripción. Debe entenderse que cuando se hace referencia a
conservación en condiciones de frío convencional hay que entender
condiciones de temperatura igual o inferior a 5ºC y una
concentración de oxígeno propia de la atmósfera ambiental sin
modificar.
La figura 1 es una representación gráfica de las
curvas de crecimiento de la cepa CECT-4920, en
medio NYDB y medio peptona, en condiciones de conservación a
1ºC.
La figura 2 es una representación gráfica de las
curvas de crecimiento de la cepa CECT-4920, en
medio NYDB y medio peptona, en condiciones de conservación a
30ºC.
La figura 3 es una representación gráfica de
evolución de la población de la cepa CECT-4920,
aplicado en heridas de 3 x 3 x 3 mm^{3} en manzanas "Golden
Delicious", en condiciones de conservación a 20º y 30ºC.
La figura 4 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en peras "Rocha", inoculadas con Botrytis
cinerea 10^{3}, 10^{4} y 10^{5} ufc/ml, causados por
inoculación del antagonista CECT-4920. Datos
obtenidos después de 7 días de incubación a 20ºC.
La figura 5 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en peras "Blanquilla", inoculadas con
Penicillium expansum 10^{3}, 10^{4} y 10^{5} ufc/ml,
causados por inoculación del antagonista CECT-4920.
Datos obtenidos después de 7 días de incubación a 20ºC.
La figura 6 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en peras "Conference", inoculadas con
Rhizopus stolonifer 10^{3}, 10^{4} y 10^{5} ufc/ml,
causados por inoculación del antagonista CECT-4920.
Datos obtenidos después de 7 días de incubación a 20ºC.
La figura 7 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de frutos
podridos en naranjas "Valencia Late", inoculadas con
Penicillium digitatum 10^{5} y 10^{6} ufc/ml, causados
por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos
obtenidos después de 7 días de incubación a 20ºC.
La figura 8 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de frutos
podridos en naranjas "Valencia Late", inoculadas con
Penicillium italicum 10^{5} y 10^{6} ufc/ml, causados
por inoculación del antagonista CECT-4920. Datos
obtenidos después de 7 días de incubación a 20ºC.
La figura 9 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en manzanas "Early Red One", inoculadas con
Penicillium expansum, causados por inoculación del
antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 30
días de incubación en frío convencional.
La figura 10 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre, en manzana "Fuji" inoculadas con
Penicillium expansum, causados por inoculación del
antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 30
días de incubación en frío convencional.
La figura 11 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en peras "Alejandrina", inoculadas con
Penicillium expansum, causados por inoculación del
antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 30
días de incubación en frío convencional.
La figura 12 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en peras "Decana de Comice", inoculadas con
Penicillium expansum, causados por inoculación del
antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 30
días de incubación en frío convencional.
La figura 13 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en manzanas "Golden Delicious", inoculadas con
Botrytis cinerea, causados por inoculación del antagonista
CECT-4920. Datos obtenidos después de 30 días de
incubación en frío convencional.
La figura 14 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en manzanas "Golden Delicious", inoculadas con
Penicillium expansum, causados por el baño de los frutos con
el antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de
90 días de incubación en atmósfera controlada: 1% O_{2}- 1%
CO_{2}; 2% O_{2}- 1% CO_{2}; 2% O_{2}- 2% CO_{2}; 2%
O_{2}- 4% CO_{2}; 2% O_{2}- 6% CO_{2}; 3% O_{2}- 3%
CO_{2}; 3% O_{2}- 6% CO_{2}.
La figura 15 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
del total de podredumbres en naranjas "Valencia Late", sin
inoculación artificial de patógeno, causados por inoculación del
antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 60
días de incubación a 3,5ºC y diferentes condiciones de atmósfera
controlada 1,5% O_{2}- 1,5% CO_{2}; 3% O_{2}- 3% CO_{2}; 5%
O_{2}- 3% CO_{2;} y 8% O_{2}- 5% CO_{2}.
La figura 16 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en peras "Blanquilla", inoculadas con
Penicillium expansum, causados por el baño de los frutos con
el antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de
90 días de incubación en frío convencional.
La figura 17 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en manzanas "Golden Delicious", inoculadas con
Botrytis cinerea, causados por el baño de los frutos con el
antagonista CECT-4920. Datos obtenidos después de 90
días de incubación en atmósfera controlada: 1% O_{2}- 1%
CO_{2}.
La figura 18 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de reducción
de podredumbre en peras "Rocha", inoculadas con Penicillium
expansum, causados por la inmersión en 8 x 10^{7} ufc/ml del
antagonista CECT-4920 y por la aplicación del
fungicida químico Imazalil a una dosis comercial. Datos
comparativos obtenidos después de 5,5 meses de incubación a 1ºC de
temperatura.
La figura 19 es una representación en forma de
diagrama de barras tridimensional de los porcentajes de frutos
podridos en naranjas "Valencia Late", inoculadas con
Penicillium digitatum 10^{5} y 10^{6} ufc/ml, causados
por inoculación del antagonista CECT-4920 y el
aditivo alimentario, bicarbonato sódico. Datos obtenidos después de
7 días de incubación a 20ºC.
Los autores de la presente invención han logrado
aislar una nueva cepa de la especie actualmente reconocida como
Pantoea agglomerans (Beijerinck, 1988) Gavini, Mergaert,
Beji, Mielcarek, Izard, Kersters y De Ley, 1989, pero también
conocida por sus sinónimos Erwinia herbicola (Löhnis, 1911)
Dye 1964, Enterobacter agglomerans (Beijerinck, 1988) Ewing y
Fife, 1972 y Erwinia milletiae (Kawakami y Yoshida, 1920)
Magrou 1937, que muestra una efectividad muy elevada como
antagonista de las especies de hongos causantes de las enfermedades
de las frutas antes y después de su cosecha (pre y postcosecha), en
una amplia gama de temperaturas y atmósferas de oxígeno, lo que
permite su utilización industrial para el control biológico de
dichas especies fúngicas y prevenir la podredumbre de la fruta.
La cepa de la presente invención se ha aislado de
la superficie de manzanas, mediante un lavado con agua estéril
seguido de un baño en ultrasonidos con tampón fosfato, y se ha
depositado un cultivo de la misma, de acuerdo con las provisiones
del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de
microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes, en
la autoridad internacional de depósito Colección Española de
Cultivos Tipo, con domicilio en la Facultad de Ciencias Biológicas,
Universidad de Valencia, 46100 Burjasot (Valencia) España, que le
ha asignado el número de depósito CECT-4920.
El aislado de CECT-4920 ha sido
identificado como Pantoea agglomerans y tras su aislamiento,
se cultivó en el medio sólido peptona-agar,
consistente en peptona, almidón, dextrosa y agar, en el medio
líquido peptona consistente en peptona, almidón y dextrosa y en el
medio líquido NYDB, consistente en caldo de extracto de levadura y
dextrosa.
Morfológicamente, la cepa
CECT-4920 forma colonias de color amarillo,
redondas, bien definidas y es móvil. Tiene crecimiento aeróbico en
medio peptona-agar a 30ºC, y crecimiento anaerobio
en medio Tioglicolato a 30ºC, y presenta las características
bioquímicas que se detallan en las tablas I y II:
El crecimiento in vitro del microorganismo
de la cepa CECT-4920, en medio NYDB y medio
peptona, a pH inicial de 7, se produce en condiciones aeróbicas, a
temperaturas de incubación de 1 y 30ºC. Como se observa en las
figuras 1 y 2 el microorganismo presenta un crecimiento similar en
los dos medios de cultivo, y el máximo poblacional a 1ºC se alcanza
a los 15 días de incubación, y a 30ºC a las 30 horas de incubación,
ambos en el medio peptona.
En el gráfico de la figura 3, se muestra el
elevado crecimiento de la cepa CECT-4920 en heridas
artificiales en la fruta, que es donde el antagonista tiene que
actuar, pues la mayoría de los hongos patógenos de la fruta
necesitan una herida para iniciar el proceso de infección. Se
observa un crecimiento similar a 20ºC y a 30ºC.
La inoculación del microorganismo en la
superficie de la fruta muestra un gran crecimiento en condiciones
de atmósfera controlada de 3% de oxígeno y de 3% de dióxido de
carbono a temperatura de 1ºC, que son propias de las condiciones de
largo almacenamiento en las centrales hortofrutícolas.
El aislado CECT-4920 se puede
obtener, tanto a nivel de laboratorio como para su uso industrial,
mediante su cultivo en un medio apropiado, empleando técnicas
convencionales suficientemente conocidas por el experto. Por
ejemplo, se puede obtener mediante el cultivo de la cepa original en
medio NYDB, a pH 7, en un recipiente provisto de aireación y
agitación, a temperaturas comprendidas entre 1 y 37ºC, durante
periodos del orden de 20 a 50 horas. El máximo poblacional (6 x
10^{9} ufc/ml) para el medio NYDB a 30ºC, en un recipiente de 6
litros, se alcanza después de 24 horas. Una vez finalizado el
periodo de incubación, se procede a separar los microorganismos del
medio de cultivo mediante técnicas convencionales de sedimentación,
centrifugación o filtrado, y el cultivo se puede conservar, por
ejemplo, mediante congelación en criobolas.
El antagonista CECT-4920 se puede
aplicar a la superficie de los frutos mediante cualquier técnica
convencional. Por ejemplo, se puede preparar una dispersión del
cultivo en agua y proceder a la pulverización o ducha del fruto en
el campo, antes de la recolección, o bien efectuar el tratamiento
durante el proceso de manipulación del fruto recolectado, antes de
proceder al almacenamiento, en cuyo caso el tratamiento se puede
realizar también por inmersión.
Las concentraciones efectivas del antagonista
CECT-4920 en la dispersión de aplicación para el
tratamiento de las frutas pueden ser variables, en función de
factores tales como el tipo de fruto, la madurez del mismo, la
concentración del hongo patógeno en el fruto, la temperatura y
humedad de conservación, etc. Habitualmente el rango de
concentraciones efectivas se encuentra en
10^{7}-2x10^{8} ufc/ml (unidades formadoras de
colonias por mililitro), lo que para bacterias es considerada una
concentración baja, pero dicho margen no debe ser considerado como
limitativo del objeto de la presente invención.
El aislado de CECT-4920 es muy
efectivo en el control biológico de diferentes especies de hongos
patógenos de las frutas que incluyen, pero no se limitan, a
Botrytis cinerea, Penicillium digitatum,
Penicillium expansum, Penicillium italicum y
Rhizopus stolonifer. Su efectividad en la prevención de la
podredumbre de la fruta no se limita al almacenamiento de la misma
en condiciones de temperatura y concentración de oxígeno ambientales
sino que, debido a las características del microorganismo ya
comentadas anteriormente, su empleo da también excelentes resultados
en condiciones de almacenamiento de frigoconservación y atmósfera
controlada, muy utilizadas por las centrales hortofrutícolas.
La efectividad del aislado
CECT-4920 en el control de los hongos patógenos es
comparable a la del fungicida Imazalil, producto químico derivado
del imidazol (1-[2-(2,
4-diclorofenil)-2-(2-propeniloxi)etil]-1H-imidazol),
uno de los fungicidas más empleado en el mundo en postcosecha de
frutos, lo que supone que el aislado CECT-4920
constituye una alternativa eficaz para dicho producto químico, con
la ventaja de carecer de las características de toxicidad del
mismo.
El antagonista CECT-4920 se puede
aplicar junto a otros agentes antifúngicos y/o adyuvantes, ceras,
aditivos alimentários, por ejemplo bicarbonato sódico, y sustancias
de baja toxicidad.
El antagonista CECT-4920 puede
ser utilizado sólo, como agente de control biológico de los hongos
patógenos de las frutas, o puede ser utilizado en combinación
conjuntamente con otros agentes antifúngicos sintéticos y/o
antagonistas biológicos, por ejemplo con levaduras de la especie
Candida sake, tales como las descritas en la patente española
ES-2089981 y en la solicitud de patente
norteamericana US-7-745796,
anteriormente citadas.
El aislado CECT-4920 puede ser
empleado con efectividad para combatir la podredumbre de todo tipo
de frutos, tanto los de pepita, tales como manzanas, peras y
membrillo, en cualquiera de sus variedades, como los cítricos, tales
como naranjas, limones y mandarinas, en cualquiera de sus
variedades, y también los de hueso, tales como melocotones,
albaricoques, cerezas y ciruelas, en cualquiera de sus
variedades.
Los ejemplos que se exponen a continuación se
deben interpretar como un medio auxiliar para una mejor comprensión
de la invención y no como limitaciones al objeto de la misma.
Se sembró el antagonista
CECT-4920 en un tubo de ensayo con medio
peptona-agar y se incubó a 27ºC durante
24-48 horas. Seguidamente, a partir de dicho tubo
de ensayo, se sembró en un matraz Erlenmeyer con 50 ml de medio NYDB
que se incubó en un agitador orbital a 150 rpm y a 30ºC durante 24
horas. A continuación se centrifugó el contenido del matraz a 7.500
rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El sedimento
se dispersó en 50 ml de agua destilada estéril y, a partir de dicha
dispersión se prepararon las concentraciones deseadas del
antagonista mediante el cálculo de la transmitancia de la
suspensión microbiana en el espectofotómetro, como medida indirecta
de la concentración del antagonista. La equivalencia entre la
transmitancia y la concentración de microorganismos se efectuó
mediante recuento de viables en placa Petri en medio
peptona-agar. Para cada caso, las concentraciones se
expresan en ufc/ml (unidades formadoras de colonias por
mililitro).
El ensayo se realizó en 3 variedades de peras
("Blanquilla", "Conference" y "Rocha") sanas que
fueron limpiadas con agua y dejadas secar y en las que se
realizaron dos perforaciones por fruto, de dimensiones 3 x 3 x 3
mm^{3} aproximadamente. Las dos incisiones se situaron en la misma
cara de la pera, localizadas una en la parte superior y otra en la
parte inferior. La unidad de muestra estaba formada por tres peras
y por cada tratamiento se realizaron tres repeticiones.
Las tres especies fúngicas ensayadas fueron
Botrytis cinerea, Penicillium expansum y Rhizopus
stolonifer y la titulación de las suspensiones de esporas de
las mismas se realizó a partir de cultivos jóvenes de
5-7 días, sembrados en medio PDA (patata, dextrosa y
agar), e incubadas a 25ºC de temperatura, mediante el raspado de las
colonias en agua estéril con Tween 80. A continuación se procedió
al recuento de esporas en cámara Thoma, fijándose la concentración
deseada, expresada en ufc/ml.
Lotes de tres peras preparadas como se ha
explicado anteriormente se inocularon con 25 \mul de la
suspensión de antagonista CECT-4920, a las
concentraciones de 2 x 10^{7}, 8 x 10^{7} y 1 x 10^{8} ufc/ml.
Una vez secas las frutas, se procedió a la inoculación de 20 \mul
de las suspensiones tituladas de patógeno de las tres especies
seleccionadas, a las concentraciones de 10^{3}, 10^{4} y
10^{5} ufc/ml. Paralelamente se preparó la prueba control en
donde se sustituyó la suspensión del antagonista por agua destilada
estéril.
Todas las frutas tratadas se colocaron en
alvéolos, se dejaron secar y se colocaron en cajas para su
incubación a 20ºC, con 80% de humedad relativa, durante 7 días. El
período de incubación se fijó en base al tiempo que se precisa para
que las peras control presenten diámetros de podredumbre grandes.
Tras dicho período de incubación, se procedió a la lectura de los
resultados, midiendo los diámetros de podredumbre de todas las
perforaciones realizadas.
Los datos de lectura del diámetro de podredumbre
de las diferentes repeticiones se sometieron a un análisis
estadístico consistente en efectuar un análisis de la varianza y,
una vez comprobado que dicho análisis de la varianza resultaba
significativo (\alpha<0,01 a \alpha<0,05), se efectuó una
separación de medias de acuerdo con la Prueba de Rango Múltiple de
Duncan, cuyos resultados se expresan con las letras del alfabeto
minúsculas (a, b, c, d,...), de manera que tratamientos con la
misma letra son estadísticamente iguales y tratamientos con letras
diferentes son estadísticamente diferentes.
En la tabla III se exponen los resultados
obtenidos en el caso del control biológico de Botrytis
cinerea en la variedad "Rocha", en la tabla IV en el de
Penicillium expansum en la variedad "Blanquilla", y en
la tabla V en el de Rhizopus stolonifer en la variedad
"Conference".
La expresión gráfica de los resultados de dichas
tablas se encuentra, respectivamente, en las figuras 4, 5 y 6.
Los datos recogidos en las mencionadas tablas
III, IV y V, así como su representación gráfica en las figuras 4, 5
y 6, muestran en tres variedades de pera la alta efectividad del
antagonista CECT-4920 en el control de las tres
especies de hongos patógenos ensayados y, en consecuencia, en la
prevención de la podredumbre de las frutas.
El ensayo se realizó en naranjas "Valencia
Late" sanas que fueron limpiadas con agua, a continuación
desinfectadas con una solución de hipoclorito sódico a una
concentración de 0,5% de cloro, vueltas a lavar con agua y dejadas
secar. Una vez secos los frutos, se realizó una incisión, por cada
naranja, de dimensiones de 5 mm de longitud y de 2 mm de profundidad
aproximadamente. La incisión se situó en la zona ecuatorial de la
naranja. La unidad de muestra estaba formada por cinco naranjas y
por cada tratamiento se realizaron cuatro repeticiones.
Las dos especies fúngicas ensayadas fueron
Penicillium digitatum y Penicillium italicum y la
titulación de las suspensiones de esporas de las mismas se realizó
siguiendo el método de trabajo explicado en el ejemplo 2.
Lotes de cinco naranjas preparadas como se ha
explicado anteriormente se inocularon con 25 \mul de la
suspensión titulada de patógeno de las dos especies seleccionadas,
a las concentraciones de 10^{5} ufc/ml y 10^{6} ufc/ml. Una vez
secas las frutas, se procedió a la pulverización durante 5 segundos
de la suspensión de antagonista CECT-4920, a las
concentraciones de 4 x 10^{7} y 3 x 10^{8} ufc/ml. Paralelamente
se preparó la prueba control en donde se sustituyó la suspensión
del antagonista por agua destilada estéril.
Todas las frutas tratadas se colocaron en
alvéolos, se dejaron secar y se colocaron en cajas para su
incubación a 20ºC, con 80% de humedad relativa, durante 7 días.
Tras dicho período de incubación se procedió a la lectura de los
resultados, contando el número de frutas podridas.
Los datos de lectura del número de frutas
podridas de las diferentes repeticiones se sometieron a un análisis
estadístico de la misma manera que en el ejemplo 2 y se exponen en
las tablas VI y VII.
La expresión gráfica de los resultados de dichas
tablas se encuentra, respectivamente, en las figuras 7 y 8.
Los datos recogidos en las mencionadas tablas VI
y VII, así como su representación gráfica en las figuras 7 y 8,
muestran la alta efectividad del antagonista
CECT-4920 en el control de las principales especies
de hongos patógenos en cítricos, Penicillium digitatum y
Penicillium italicum.
Siguiendo el método de trabajo explicado en el
ejemplo 2, se efectuaron ensayos con diez frutos por repetición y
tres repeticiones por tratamiento. Este ensayo se realizó sobre
manzanas de las variedades, "Early Red One" y "Fuji", y
peras de las variedades "Blanquilla", "Rocha", "Decana
de Comice" y "Alejandrina".
Se inocularon 25 \mul de dispersión acuosa del
antagonista CECT-4920, a dos concentraciones 8 x
10^{7} y 1 x 10^{8} ufc/ml, y 20 \mul de inóculo de
Penicillium expansum, a la concentración de 10^{4} ufc/ml.
Todas las frutas tratadas se colocaron en alvéolos para su
incubación a 1ºC, con 90-98% de humedad relativa,
durante 30 días. Tras dicho período de incubación se procedió a la
lectura de los resultados, midiendo los diámetros de podredumbre de
todas las perforaciones realizadas.
Los resultados obtenidos se exponen en las tablas
VIII, IX, X y XI.
Como se observa en las tablas anteriores y en las
figuras 9, 10, 11 y 12, los resultados obtenidos muestran un
elevado grado de eficacia, en condiciones de frigoconservación, en
el control de Penicillium expansum, en las diferentes
variedades de pera y manzana, algunas de ellas incorporadas
recientemente en el mercado frutícola europeo.
\newpage
Se efectuó un ensayo, bajo las mismas condiciones
del ejemplo 4, utilizando como inóculo de hongo patógeno 20 \mul
de inóculo de Botrytis cinerea a la concentración de
10^{4} ufc/ml.
Los resultados obtenidos, después del tratamiento
estadístico ya mencionado, se exponen en la tabla XII, y la
expresión gráfica de estos resultados se presenta en la figura
13.
Los resultados de reducción del diámetro de
podredumbre fueron satisfactorios, principalmente para la
concentración del antagonista CECT-4920 de 8 x
10^{7} ufc/ml.
Para este ensayo la dispersión de antagonista se
preparó, a mayor escala, de la siguiente manera:
Se sembró el antagonista
CECT-4920 en un tubo de ensayo con medio
peptona-agar y se incubó a 27ºC durante
24-48 horas. Seguidamente, a partir de dicho tubo
de ensayo, se sembró en un fermentador, provisto de agitador y
sistema de aireación, con 6.000 ml de medio NYDB y se incubó a 30ºC
durante 24 horas. A continuación se centrifugó el contenido del
fermentador a 7.500 rpm durante 10 minutos y se descartó el
sobrenadante. El sedimento se dispersó en agua estéril y, a partir
de dicha dispersión, se prepararon las concentraciones deseadas del
antagonista de la misma manera que en el ejemplo 1.
Se utilizaron quince manzanas "Golden
Delicious" por repetición y tres repeticiones por tratamiento.
En cada manzana se realizaron dos perforaciones con un punzón. Las
dos perforaciones se situaron en caras opuestas del fruto,
localizadas en la zona ecuatorial.
Las manzanas se trataron con el antagonista
CECT-4920, mediante la inmersión de los frutos en
baños que contenían dispersiones de antagonista a concentraciones
de 2 x 10^{7} y 8 x 10^{7} ufc/ml. Se utilizó un lote de
cuarenta y cinco frutas sin tratar que constituyó la prueba control.
A continuación, las manzanas, una vez secas, se sumergieron en un
baño con una suspensión titulada de Penicillium expansum a
la concentración de 10^{4} ufc/ml.
Todas las frutas se pusieron en alvéolos, y se
dividieron en siete lotes distintos, que se almacenaron durante 90
días a 1ºC en microcámaras con las siguientes condiciones de gases:
1% O_{2}- 1% CO_{2}; 2% O_{2}- 1% CO_{2}; 2% O_{2}- 2%
CO_{2}; 2% O_{2}- 4% CO_{2}; 2% O_{2}- 6% CO_{2}; 3%
O_{2}- 3% CO_{2}; y 3% O_{2}- 6% CO_{2}.
Los resultados se leyeron y trataron
estadísticamente, tal como se ha explicado anteriormente, y se
exponen en la tabla XIII. Su representación gráfica se expone en la
figura 14.
El análisis de los resultados, indica que el
antagonista CECT-4920 mantiene su efectividad en el
control de Penicillium expansum en las más variadas
condiciones de atmósfera controlada.
El ensayo se realizó sobre naranjas "Valencia
Late", recogidas en campo, que sin cualquier limpieza previa se
perforaron como se explicó en el ejemplo 3. La unidad de muestra
estaba formada por cuarenta frutos y por cada tratamiento se
realizaron tres repeticiones.
En este ensayo no se inocula ningún hongo; se
trata de inoculación natural, pues en los frutos cítricos los
hongos patógenos provienen en su mayoría del campo.
Se preparó el antagonista
CECT-4920 a gran escala, siguiendo el método
explicado en el ejemplo 6. Los frutos se trataron con el antagonista
durante 1 minuto mediante la inmersión de los frutos en un baño que
contenía la dispersión del microorganismo CECT-4920
a una concentración de 1 x 10^{8} ufc/ml. Se preparó una prueba
control, donde se sustituyó el baño del antagonista con un baño de
agua.
Todas las frutas se pusieron en alvéolos, y se
dividieron en cinco lotes distintos, que se almacenaron durante 60
días a 3,5ºC en microcámaras con las siguientes condiciones de
gases: 1,5% O_{2}- 1,5% CO_{2}; 3% O_{2}- 3% CO_{2}; 5%
O_{2}- 3% CO_{2}; y 8% O_{2}- 5% CO_{2}.
Los resultados se leyeron y trataron
estadísticamente como ya se ha explicado y se exponen en la tabla
XIV. Su representación gráfica se expone en la figura 15.
Del análisis de los resultados se puede concluir
que el antagonista CECT-4920 presenta una elevada
eficacia en el control de los hongos patógenos de los cítricos en
diversas condiciones de atmósfera controlada, permitiendo así
lograr uno de los objetivos más importantes en el sector citrícola,
que es el de alargar el período de conservación, objetivo muy
limitado en conservación en condiciones de frío convencional.
Para este ensayo la dispersión de antagonista se
preparó a gran escala, siguiendo el método explicado
anteriormente.
El ensayo se realizó en pera "Blanquilla" y
manzana "Golden Delicious" que se trataron como se explicó en
el ejemplo 6. La unidad de muestra estaba formada por 20 frutos y
por cada tratamiento se realizaron cuatro repeticiones.
Una vez tratadas las frutas en los baños que
contenían la dispersión del antagonista CECT-4920 a
concentraciones de 2 x 10^{7} y 8 x 10^{7} ufc/ml e inoculadas
con el hongo patógeno, mediante un baño con la suspensión titulada
de esporas, se separaron en dos lotes y se almacenaron durante 90
días: un lote en frío convencional (1ºC y oxígeno ambiente) y otro
en condiciones de atmósfera controlada (pera: 0,5ºC y 3% de
oxígeno; manzana: 1ºC y 1% de oxígeno).
Las dos especies fúngicas ensayadas fueron
Botrytis cinerea y Penicillium expansum a la
concentración de 10^{4} ufc/ml.
Los resultados se leyeron y trataron de la misma
manera que en los ejemplos anteriores. Como ejemplos, en la tabla
XV se expone el resultado del control de Penicillium expansum
en peras "Blanquilla" almacenadas en atmósfera controlada,
y en la tabla XVI el control de Botrytis cinerea en manzanas
"Golden Delicious" almacenadas en frío convencional. Su
representación gráfica se expone en las figuras 16 y 17.
Como se observa en las tablas anteriores y en las
figuras 16 y 17, los resultados obtenidos muestran un elevado grado
de eficiencia en el control de los hongos patógenos, Penicillium
expansum y Botrytis cinerea en condiciones de
conservación en atmósfera baja en oxígeno, y también en atmósfera
convencional, durante un largo período de tiempo.
El ensayo se efectuó con pera "Rocha"
siguiendo la metodología explicada en el ejemplo 6. La unidad de
muestra estaba formada por diez frutos, y por cada tratamiento se
realizaron cuatro repeticiones.
Tanto el antagonista CECT-4920
como el fungicida Imazalil se aplicaron mediante baño de los frutos
en soluciones o dispersiones de los mismos. El antagonista se
aplicó a la concentración de 8 x 10^{7} ufc/ml y el Imazalil a la
dosis recomendada en el producto comercial y, a continuación, las
peras se inocularon con el patógeno de la especie Penicillium
expansum, mediante un baño a una concentración de 10^{4}
ufc/ml.
Los frutos se incubaron en condiciones de frío
convencional durante 5,5 meses, al cabo de los cuales se procedió a
la lectura de los resultados y a su tratamiento estadístico.
Los resultados obtenidos se exponen en la tabla
XVII y su representación gráfica en la figura 18.
Se observa que la efectividad del antagonista
CECT-4920 y la del Imazalil es estadísticamente
igual después de 5,5 meses en frigoconservación.
Los frutos se prepararon siguiendo el método
explicado en el ejemplo 3, y los ensayos se efectuaron con veinte
naranjas "Valencia Late" por repetición y tres repeticiones
por tratamiento.
El aditivo alimentario seleccionado fue el
bicarbonato sódico (NaHCO_{3}) a una concentración del 2%.
Las naranjas se inocularon con 25 \mul de la
suspensión titulada de Penicillium digitatum a la
concentración de 10^{6} ufc/ml. Posteriormente los frutos
inoculados se sumergieron en la solución de bicarbonato sódico
durante 2,5 minutos. Una vez secas las frutas, se procedió a
sumergirlas en la solución del antagonista
CECT-4920, a la concentración de 1 x 10^{8}
ufc/ml, durante 1 minuto.
Paralelamente, después del inóculo del patógeno,
se prepararon las tres pruebas control, que consistieron en la
inmersión de la fruta en las siguientes soluciones: bicarbonato
sódico al 2% durante 2,5 minutos; antagonista
CECT-4920, a la concentración de 1 x 10^{8}
ufc/ml, durante 1 minuto; agua corriente durante 1 minuto.
Después de secas las frutas, se colocaron en
alvéolos para su incubación a 20ºC, con 80% de humedad relativa,
durante 7 días. Tras dicho período se realizó la lectura de los
resultados como se explicó en los ejemplos anteriores.
Los resultados obtenidos se exponen en la tabla
XVIII y su representación gráfica en la figura 19.
\newpage
De los resultados se puede observar la elevada
eficacia del antagonista CECT-4920, que además se
ve significativamente mejorada cuando el tratamiento del
antagonista se hace conjuntamente con el aditivo alimentario.
El depósito del microorganismo se ha efectuado de
acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el
reconocimiento del deposito de microorganismos para el propósito
del procedimiento de patentes, en la autoridad internacional de
depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con residencia
en el Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias
Biológicas, Universidad de Valencia, 46100 Burjasot (Valencia)
España. El depósito se efectuó el 11 de julio de 1997, y el CECT
le asignó el número de depósito CECT-4920.
El depósito está a disposición del público, bajo
las condiciones previstas en el mencionado Tratado de Budapest, si
bien dicha disponibilidad no se puede interpretar como una licencia
para practicar el objeto de la presente invención infringiendo los
derechos del solicitante de la presente patente.
Claims (13)
1. El cultivo biológico substancialmente puro de
la cepa de la especie Pantoea agglomerans, depositada con el
número CECT-4920.
2. La utilización del cultivo
CECT-4920 de la reivindicación 1 como antagonista
para el control biológico de los hongos patógenos responsables de la
podredumbre en los frutos.
3. La utilización, de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizada porque los hongos patógenos
pertenecen a cualquiera de las especies Botrytis cinerea,
Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium
italicum y Rhizopus stolonifer.
4. La utilización, de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizada porque los frutos son de los
conocidos como de pepita, especialmente manzanas, peras y
membrillos, en cualquiera de sus variedades.
5. La utilización, de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizada porque los frutos son de los
conocidos como cítricos, especialmente naranjas, limones y
mandarinas, en cualquiera de sus variedades.
6. La utilización, de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizada porque los frutos son de los
conocidos como de hueso, especialmente melocotones, albaricoques,
cerezas y ciruelas, en cualquiera de sus variedades.
7. Un método para prevenir la podredumbre de los
frutos de postcosecha caracterizado porque la fruta se
trata, antes o después de su recolección, con un preparado del
cultivo CECT-4920 de la reivindicación 1.
8. Un método, de acuerdo con la reivindicación 7,
caracterizado porque el tratamiento se efectúa por medio de
la pulverización, mojado o inmersión de los frutos en o con una
dispersión acuosa del antagonista CECT-4920.
9. Un método, de acuerdo con la reivindicación 7,
caracterizado porque el tratamiento se efectúa con aditivos
alimentarios en conjunto con una dispersión acuosa del antagonista
CECT-4920.
10. Un método, de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizado porque el tratamiento se efectúa con una
mezcla de una dispersión acuosa del antagonista
CECT-4920 y uno o más microorganismos antagonistas
de los hongos patógenos responsables de la podredumbre de los
frutos.
11. Un método, de acuerdo con las reivindicación
8, caracterizado porque la concentración del antagonista
CECT-4920 en la dispersión acuosa está comprendido
entre 10^{7} y 2x10^{8} ufc/ml.
12. Un método, de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizado porque los frutos se conservan después de
su recolección en condiciones de almacenamiento a temperatura y
atmósfera de oxígeno ambientales.
13. Un método, de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizado porque los frutos se conservan después de
su recolección en condiciones de almacenamiento a temperatura
inferior a 5ºC y atmósfera con contenido de oxígeno inferior al
8%.
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