ES2214500T3 - Inhibidores de factor xa. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA COMPUESTOS QUE INHIBEN ESPECIFICAMENTE LA ACTIVIDAD DEL FACTOR X{SUB,A}. LOS COMPUESTOS CONSISTEN EN LA ESTRUCTURA X{SUB,1}-YIR-X{SUB,2}, DONDE X{SUB,1} ES H, ACILO, ALQUILO, ACILALQUILO, ARILALQUILO, O UNO O MAS AMINOACIDOS, Y X{SUB,2} ES UN GRUPO C-TERMINAL MODIFICADO, UNO O MAS GRUPOS PROTECTORES DE CARBOXI, O UNO O MAS AMINOACIDOS O OTRO SUSTITUYENTE, Y Y,I Y R, SON TIROSINA, ISOLEUCINA, Y ARGININA, RESPECTIVAMENTE, O ESTRUCTURAS PEPTIDOMIMETICAS U ORGANICAS QUE TIENEN LA MISMA ACTIVIDAD FUNCIONAL QUE Y,I Y R, RESPECTIVAMENTE. ADEMAS, LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN COMPUESTO DE ESTRUCTURA A1-A2-(A3){SUB,M}-B, DONDE M ES 0 O 1. EL COMPUESTO DE LA INVENCION PUEDE SER LINEAL O CICLICO, Y PUEDE TENER APROXIMADAMENTE DE 2 A 43 RESIDUOS DE LONGITUD. EL COMPUESTO DE LA INVENCION SE CARACTERIZA, EN PARTE, EN QUE INHIBE ESPECIFICAMENTE LA ACTIVIDAD DEL FACTOR X{SUB,A} CON UNA K{SUB,I} <= 100{MI}M, PREFERIBLEMENTE <= 2NM, Y NO INHIBE SUSTANCIALMENTE LA ACTIVIDAD DEOTRAS PROTEASAS IMPLICADAS EN LA CASCADA DE COAGULACION. LA INVENCION PROPORCIONA ADEMAS METODOS PARA INHIBIR ESPECIFICAMENTE LA ACTIVIDAD DEL FACTOR X{SUB,A} Y PARA INHIBIR LA COAGULACION DE LA SANGRE IN VITRO Y EN UN INDIVIDUO, Y METODOS PARA DETECTAR LOS NIVELES O LA ACTIVIDAD DEL FACTRO X{SUB,A}.
Description
Inhibidores de factor Xa.
La presente invención se refiere, en general, a
la inhibición de proteínas coagulantes de la sangre y, de manera más
particular, a inhibidores específicos de la enzima coagulante de la
sangre, el factor Xa.
La capacidad para formar coágulos de sangre es
vital para la supervivencia. En determinados estados patológicos,
sin embargo, la formación de coágulos de sangre en el interior del
sistema circulatorio es, en sí misma, una fuente de morbididad. Así,
en ocasiones, puede ser deseable prevenir la formación de coágulos
de sangre. No obstante, no es deseable inhibir por completo el
sistema de coagulación, podría sobrevenir una hemorragia amenazante
para la vida.
Con el fin de reducir la formación intravascular
de coágulos de sangre, los expertos en la materia han intentado
desarrollar un inhibidor eficaz de la protrombinasa o del factor
Xa, que se incorpora al complejo de protrombinasa, en donde activa
la trombina durante la formación del coágulo.
Concentraciones apropiadas de un inhibidor del
factor Xa aumentarían el nivel de agentes formadores de
protrombinasa necesarios para iniciar la coagulación, pero sin
prolongar de manera indebida el proceso de coagulación una vez
obtenida una concentración umbral de trombina. Sin embargo, a pesar
de que la necesidad de este inhibidor se viene reconociendo desde
hace largo tiempo, hasta el momento no se dispone de un inhibidor
eficaz y específico del factor Xa para uso en clínica.
En muchas aplicaciones clínicas, existe una
elevada necesidad de tratamiento anticoagulante. Los medicamentos
actualmente disponibles no resultan satisfactorios en numerosas
aplicaciones clínicas específicas. Por ejemplo, alrededor de 50% de
los pacientes sometidos a una sustitución total de cadera desarrolla
una trombosis venosa profunda (TVP). Las terapias actualmente
autorizadas incluyen dosis fijas de heparina de bajo peso molecular
(HBPM) y dosis variables de heparina. Incluso con estos regímenes
farmacológicos, 10% a 20% de los pacientes desarrollan TVP y 5% a
10% desarrollan complicaciones hemorrágicas.
Otra situación clínica para la que se requieren
mejores anticoagulantes se refieren a pacientes sometidos a
angioplástia coronaria transluminal y en riesgo de sufrir un
infarto de miocardio o afectos de angina creciente. La terapia
actual, convencionalmente aceptada, consistente en la administración
de heparina y aspirina, se asocia con 6% a 8% de índice de oclusión
vascular súbita dentro de las 24 horas siguientes al procedimiento.
La tasa de complicaciones hemorrágicas que requieren terapia de
trasfusión debido al uso de heparina ronda también un 7%.
Adicionalmente, aun cuando las oclusiones retrasadas son
importantes, la administración de heparina tras la finalización de
los procedimientos es de escaso valor y puede resultar
perjudicial.
Los inhibidores de coagulación sanguínea más
extensamente utilizados son heparina y los polisacáridos sulfatados
relacionados, HBPM y sulfato de heparina. Estas moléculas ejercen
sus efectos anticoagulantes estimulando la fijación de un regulador
natural del proceso de coagulación, la antitrombina III, a la
trombina y al factor Xa. La actividad inhibitoria de la heparina
está dirigida fundamentalmente a la trombina, que se inactiva
aproximadamente 100 veces más rápidamente que el factor Xa. Aunque
están relacionados con la heparina, el sulfato de heparina y la
HBPM son inhibidores algo más potentes de Xa que de trombina, las
diferencias in vitro son escasas (3-30 veces)
y los efectos in vivo pueden ser inconsecuentes. Hirudina e
hirulog son dos anticoagulantes específicos adicionales para la
trombina, que en la actualidad se encuentran en fases de ensayos
clínicos. Sin embargo, estos anticoagulantes que inhiben la
trombina también se asocian con complicaciones hemorrágicas.
Estudios preclínicos en babuinos y perros han
demostrado que los inhibidores específicos del factor Xa impiden la
formación de coágulos sin producir los efectos secundarios
hemorrágicos observados con los inhibidores directos de la
trombina. Estos inhibidores del factor Xa incluyen, por ejemplo,
2,7-bis-(4-amidino-benciliden)-cicloheptanona
y éster metílico de
N\alpha-tosilglicil-3-amidino-fenilalanina
("TENSTOP"), que poseen concentraciones inhibitorias efectivas
(K_{i}'s) de aproximadamente 20 nM y 800 nM, respectivamente. El
ácido
(+)-(2S)-2-(4-({(3S)-1-acetimidoil-3-pirrolidinil}-oxi)-fenil)-3-(7-amidino-2-naftil)-propanoico
es también un representante de una clase de inhibidores del factor
Xa (Katakura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
197:965-972 (1993)). No obstante, hasta la fecha
estos compuestos no se han desarrollado clínicamente.
También se han identificado inhibidores proteicos
específicos del factor Xa que incluyen, por ejemplo, antiestatina
("ATS") y el péptido anticoagulante de la garrapata
("TAP"). ATS, que se aísla de la sanguijuela, Haementerin
officinalis, contiene 119 aminoácidos y tiene una K_{i} para
el factor Xa de 0,05 nM. TAP, que se aísla de la garrapata,
Ornithodoros moubata, contiene 60 aminoácidos y tiene una
K_{i} para el factor Xa de aproximadamente 0,5 nM.
En una serie de sistemas de modelos animales se
ha investigado la eficacia de ATS y TAP producidos por técnicas
recombinantes. Ambos inhibidores disminuyen el tiempo de sangrado
en comparación con otros anticoagulantes e impiden la coagulación en
el modelo de trombosis venosa profunda de vena yugular ligada,
inducida por tromboplastina. Los resultados alcanzados en este
modelo se correlacionan con los obtenidos usando el medicamento de
elección actual, heparina.
La administración subcutánea de ATS ha demostrado
también ser un tratamiento eficaz en el modelo de coagulación
intravascular diseminada (DIC) inducida por tromboplastina. TAP
previene de manera efectiva la trombosis arterial "de alto
cizallamiento" y el "caudal reducido" causado por la
colocación quirúrgica de un injerto de poliéster ("DACRON") a
niveles que produjeron una prolongación clínicamente aceptable del
tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), es decir, una
prolongación menor que aproximadamente el doble. En comparación, la
heparina estándar, incluso a dosis que provocan un incremento de
cinco veces del aPTT, no previno la trombosis y el caudal reducido
en el interior del injerto. El aPTT es un ensayo clínico de
coagulación especialmente sensible a los inhibidores de
trombina.
ATS y TAP no se han desarrollado clínicamente. Un
inconveniente importante de estos dos inhibidores es que la
administración de las dosis repetidas necesarias produce la
generación de anticuerpos neutralizantes, limitando de esta forma su
potencial uso clínico. Además, los tamaños de ATS y TAP hacen
imposible su administración oral, limitando más todavía el número de
pacientes que se pueden beneficiar con estos agentes.
Un inhibidor específico del factor Xa tendría un
valor práctico importante en medicina práctica. En particular, un
inhibidor del factor Xa sería eficaz bajo circunstancias en las que
los actuales medicamentos de elección, heparina y polisacáridos
sulfatados relacionados, carecen de eficacia o sólo son
marginalmente efectivos. Existe, por tanto, la necesidad de un
inhibidor de la coagulación sanguínea específico para el factor Xa,
de bajo peso molecular, que sea eficaz, pero no produzca efectos
secundarios no deseados. La presente invención satisface esta
necesidad y proporciona, asimismo, ventajas relacionadas.
La presente invención proporciona compuestos que
inhiben específicamente la actividad del factor Xa. Un compuesto de
la invención tiene la estructura
X_{1}-R1-R2-R3-X_{2}
en la
cual
X_{1} es H, acilo, alquilo o arilalquilo;
R1 es Tyr;
R2 es Ile;
R3 es Arg;
y
X_{2} se selecciona del grupo consistente en un
grupo C-términal modificado, uno o más grupos
carboxi-protectores, y uno o más aminoácidos u otro
sustituyente, en el que el grupo C-terminal
modificado se modifica por la reducción del grupo carboxi del
extremo C a un alcohol o aldehído, o por formación de un éster oral,
o por sustitución del grupo carboxi con un sustituyente;
incluidas las sales farmacéuticamente aceptables
del mismo.
Además, la invención proporciona un compuesto de
la estructura
X_{1}-YIR-X_{2}
en la
cual
X_{1} es H, acilo, alquilo o arilalquilo; y
X_{2} se seleccione del grupo consistente en un
grupo C-terminal modificado, uno o más grupos
carboxi-protectores, y uno o más aminoácidos u otro
sustituyente, en el que el grupo C-terminal
modificado se modifica por reducción del grupo carboxi del extremo C
a un alcohol o aldehído, o por la formación de un éster oral, o por
sustitución del grupo carboxi con un sustituyente;
incluidas las sales farmacéuticamente aceptables
del mismo, en el que Y, I y R se refieren a los aminoácidos
tirosina, isoleucina y arginina, respectivamente, y a estructuras
péptido-miméticas u orgánicas que poseen las mismas
actividades funcionales que tirosina, isoleucina y arginina,
respectivamente. Además, un compuesto de la invención tiene la
estructura
A1-A2-(A3)_{m}-B, según se
define en este documento.
Un compuesto de la invención puede ser lineal o
cíclico, con una longitud de entre aproximadamente 2 y 43 residuos
y estar modificado en el extremo N, el extremo C o ambos. Estos
compuestos muestran una inhibición específica de la actividad del
factor Xa con una K_{i} \leq 100 \muM, preferentemente una
K_{i} \leq 2 nM, y no inhiben sustancialmente la actividad de
otras proteasas que intervienen en la cascada de coagulación.
Ejemplos específicos de estos compuestos incluyen
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH_{3})O(CH_{3});
Ac-Tyr-{\Psi(CH_{2}NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2}
(en el que "\Psi" indica un enlace
pseudo-peptídico que, por ejemplo, puede ser un
enlace reducido como se indica con "(CH_{2}NH)"; enlaces
pseudo-peptídicos se indican con "\Psi" entre
paréntesis, "(\Psi)";
Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH_{2}(4-piridilo);
Ac-Tyr-Ile-{\Psi(CH_{2}NH)}-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Chg-Arg(NO_{2})-{\Psi(CH_{2}NH)}-Leu-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-{\Psi(COCH_{2})}-Gly-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N)-Leu-Ala-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH_{2};
Tyr-Ile-Arg-NH_{2};
(D)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropil)Gly-NH_{2};
ciclo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly);
Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-
pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; y sales farmacéuticamente aceptables y derivados C-terminales tales como amidas, ésteres, alcoholes y aldehídos de los mismos (véase, también, la Tabla 5). Asimismo, se proporcionan métodos para inhibir específicamente la actividad del factor Xa. Igualmente, se proporcionan métodos para detectar niveles o actividad de factor Xa.
pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; y sales farmacéuticamente aceptables y derivados C-terminales tales como amidas, ésteres, alcoholes y aldehídos de los mismos (véase, también, la Tabla 5). Asimismo, se proporcionan métodos para inhibir específicamente la actividad del factor Xa. Igualmente, se proporcionan métodos para detectar niveles o actividad de factor Xa.
La Figura 1 es un diagrama esquemático de la
cascada de coagulación sanguínea.
La Figura 2 representa un ejemplo de una
estructura para un compuesto de la invención.
La Figura 3 muestra el esquema de síntesis para
preparar algunos compuestos de la invención.
La coagulación de la sangre es un proceso
complejo en el que interviene una serie progresivamente amplificada
de reacciones de activación enzimática, en las que los cimógenos
del plasma se activan de manera secuencial por proteólisis
limitada. Desde el punto de vista mecánico, la cascada de
coagulación sanguínea se ha dividido en vías intrínsecas y
extrínsecas, que convergen en la activación del factor X; la
generación subsiguiente de trombina tiene lugar a través de una
única vía común (véase la Figura 1).
Las pruebas actuales indican que la vía
intrínseca juega un papel importante en el mantenimiento o
crecimiento de la formación de fibrina, en tanto que la vía
extrínseca resulta crítica en la fase de iniciación de la
coagulación sanguínea. Se acepta, por lo general, que la coagulación
sanguínea se inicia físicamente con la formación de un complejo de
factor tisular/factor VIIa. Una vez que se ha formado, este complejo
inicia rápidamente la coagulación, activando los factores IX y X. El
factor Xa recién generado forma, entonces, un complejo uno a uno con
el factor Va y fosfolípidos para formar un complejo de
protrombinasa, que es responsable de convertir el fibrinógeno
soluble en fibrina insoluble. A medida que transcurre el tiempo, se
suprime la actividad del complejo de factor VIIA/factor tisular
(vía extrínseca) por medio de una proteína inhibidora de proteasa
tipo Kunitz, TFPI, que, cuando forma un complejo con el factor Xa,
puede inhibir directamente la actividad proteolítica del factor
VIIa/factor tisular. Con el fin de mantener el proceso de
coagulación en presencia de un sistema extrínseco inhibido, se
produce factor Xa adicional a través de la actividad, mediada por la
trombina, de la vía intrínseca. De este modo, la trombina desempeña
una doble función autocatalítica, mediando su propia producción y la
conversión de fibrinógeno en fibrina.
La naturaleza autocatalítica de la generación de
trombina es una importante salvaguarda contra la hemorragia
incontrolada y garantiza que, una vez que exista un nivel umbral
determinado de protrombinasa, la coagulación sanguínea proseguirá
hasta su compleción, determinando, por ejemplo, el final de la
hemorragia. De esta forma, resulta altamente deseable agentes que
inhiban la coagulación sin inhibir directamente la trombina.
La presente invención proporciona péptidos YIR,
que son compuestos que inhiben la actividad del factor Xa, pero no
inhiben de manera sustancial la actividad de otras proteasas que
intervienen en la vía de coagulación sanguínea. Como se utiliza en
este documento, la expresión "compuesto" o "péptido YIR"
hace referencia a un péptido de
Tyr-Ile-Arg (YIR) de origen no
natural y análogos o miméticos del mismo, capaces de inhibir la
actividad del factor Xa. En el presente documento, se hace
referencia a la secuencia YIR, como tal, como "motivo YIR" y
consiste en el tripéptido
tirosina-isoleucina-arginina o un
equivalente funcional del mismo tal como
pAph-Chg-PalMe(3),
pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}
y pAph-Chg-AMP(4) (véanse las
abreviaturas en la Tabla 1). Estos compuestos de la invención
contienen al menos un motivo YIR o un equivalente funcional del
mismo, y son capaces de inhibir específicamente la actividad del
factor Xa. Por comodidad, las expresiones "compuesto" Y
"péptido YIR" se utilizan ampliamente en este documento para
hacer referencia a los péptidos de la invención, incluidos los
equivalentes funcionales tales como análogos de péptidos, miméticos
de péptidos y compuestos orgánicos sintéticos. Una función
equivalente de un péptido YIR de la invención se puede
caracterizar, en parte, por poseer una estructura como la descrita
en este documento, y por tener una K_{i} \leq 100 \muM para
inhibir la actividad del factor Xa (véase el Ejemplo XXXVII).
Análogos peptídicos de un péptido YIR de la
invención incluyen, por ejemplo, péptidos que contienen aminoácidos
que no están presentes naturalmente, o aminoácidos químicamente
modificados, siempre que el compuesto conserve la actividad
inhibitoria del factor Xa (véase, por ejemplo, la Tabla 2). Del
mismo modo, miméticos peptídicos son estructuras químicas no
aminoácidas que imitan la estructura de un péptido YIR de la
invención y conservan la actividad inhibitoria del factor Xa. Estos
miméticos se caracterizan generalmente por exhibir características
físicas similares tales como tamaño, carga o hidrofobia, que se
presenta en la orientación espacial apropiada, a las que se
encuentran en el péptido YIR normal de contrapartida. Un ejemplo
específico de mimético peptídico es un compuesto en el cual el
enlace amida entre uno o más de los aminoácidos está sustituido, por
ejemplo, por un enlace carbono-carbono u otro
enlace, como es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo,
Sawyer, en Peptide Based Drug Design, págs.
387-422 (ACS, Washington DC 1995), que se incorpora
al presente documento como referencia). De esta forma, la invención
proporciona, adicionalmente, compuestos inhibidores del factor Xa
que poseen la estructura
A1-A2-(A3
\hbox{) _{m} }-B, en la que m es
1, según se describe en este documento (véase más adelante).
Ejemplos de estos péptidos, que pueden ser compuestos miméticos, se
proporcionan en este documento.
Como se usa en este documento, el término
"aminoácido" se utiliza en su sentido más amplio para dar a
entender los veinte aminoácidos de origen natural, que se traducen
del código genético y comprenden los bloques de construcción de
proteínas, incluidos, a menos que se indique lo contrario,
L-aminoácidos y D-aminoácidos, así
como aminoácidos químicamente modificados tales como análogos de
aminoácidos, aminoácidos naturales que no se incorporan
habitualmente a proteínas tales como norleucina, y compuestos de
síntesis química que tienen las propiedades, conocidas en la
técnica, de un aminoácido. Dentro de la definición de
"aminoácidos" se incluyen, por ejemplo, análogos o miméticos de
fenilalanina o prolina, que permiten la misma restricción de
conformación de los compuestos peptídicos que la Phe o Pro
naturales, y que son conocidos para los expertos en la técnica. Se
hace referencia a estos análogos o miméticos en el presente
documento como "equivalentes funcionales" de un aminoácido.
Roberts y Vellaccio (The Peptides: Analysis, Synthesis,
Biology, Eds. Gross y Meienhofer, Vol. 5, pág. 341, Academic
Press, Inc., N.Y. 1983, que se incorpora a este documento como
referencia) enumeran otros ejemplos de aminoácidos y análogos de
aminoácidos. En la Tabla 1 se encuentran las abreviaturas de
aminoácidos, análogos de aminoácidos y estructuras miméticas.
| Compuesto | Abreviatura nº 1 | Abreviatura nº 2 |
| \beta-(2-piridil)-alanina | Pal(2) | |
| \beta-(3-N-metilpiridinio)-alanina | PalMe(3) | |
| \beta-(3-piridil)-alanina | Pal(3) | |
| \beta-(4-piridil)-alanina | Pal(4) | |
| (4-(N-metilpiridinio))metilo | AMP(4) | |
| \beta-Alanina | \betaAla | |
| (N-metilpiridinio)metilo | AMP | |
| \beta-Valina | \betaVal | |
| 1-(4-(N-metilpiridinio)et-1-ilo | AEMP(4) | |
| 1-(N-metilpiridinio)et-1-ilo | AEMP | |
| 1-Isoquinolincarboxi | 1-Iqc | |
| 1-Naftilalanina | Nal(1) | |
| 1-piperidinocarbonil-amida | PIPA | |
| 2,2,5,7,8-pentametil-croman-6-sulfonilo | Pmc | |
| 2-Benzofuranocarboxi | Bzf | |
| 2-Naftilalanina | Nal(2) | |
| 2-Pirazinocarboxi | Pza | |
| 2-Quinolinocarboxi | 2-Qca | |
| 3-(2-tiazolil)-L-alanina | Tza | |
| 3,5-dibromotirosina | Tyr(3,5-Br) | Y(3,5-Br) |
| 3,5-dinitrotirosina | Tyr(3,5-NO_{2}) | Y(3,5-NO_{2}) |
| 3,5-diyodotirosina | Tyr(3,5-I) | Y(3,5-I) |
| 3-hidroxiprolina | Hyp | |
| 3-Isoquinolincarboxi | 3-Iqc | |
| 3-Yodotirosina | Tyr(3-I) | Y(3-I) |
| 4-Morfolinocarbonilamida | MORA | |
| 4-N,N-dimetilamino-piridina | DMAP | |
| 4-Quinolinocarboxi | 4-Qca | |
| 5-Aminoindol-2-carboxi | 5AM2IN | |
| 5-Benzimidazolcarboxi | 5-Bzim | |
| 5-Cloroindol-2-carboxi | CICA | |
| 5-Fluoroindol-2-carboxi | FICA |
TABLA 1
(continuación)
| Compuesto | Abreviatura nº 1 | Abreviatura nº 2 |
| 5-Hidroxi-indol-2-carboxi | 5-Hic | |
| 5-Nitroindol-2-carboxi | 5NOINDC | |
| 9-Fluorenilmetiloxi-carbonilo | Fmoc | |
| Acetilo | Ac | |
| Ácido \gamma-carboxiglutámico | Gla | |
| Ácido 2,3-diamino-propiónico | Dap | |
| Ácido 2,4-diamino-butírico | Dab | |
| Ácido aspártico | Asp | D |
| Ácido cafeico | Caff | |
| Ácido fenilmalónico | Pma | |
| Ácido glutámico | Glu | E |
| Ácido iminodiacético | Ida | |
| Ácido isonicotínico | Isn | |
| Ácido isonipecótico | Ina | |
| Ácido L-pipecolónico | Pip | |
| Ácido mercapto-\beta,\beta-ciclo-pentametilen-propiónico | Mpp | |
| Ácido mercaptoacético | Mpa | |
| Ácido mercaptopropiónico | Mpr | |
| Ácido nicotínico | Nic | |
| Ácido nipecótico | Npa | |
| Ácido N-metil-isonico-tínico | IsnMe | |
| Ácido N-metil-nicotínico | NicMe | |
| Alanina | Ala | A |
| Amidina | AMDN | |
| Amidoxima (C(NH_{2})=N-OH) | (CNOH.NH_{2}) | |
| Arginina | Arg | R |
| Asparagina | Asn | N |
| Bencilo | Bzl | |
| Benciloxicarbonilo | Chz | |
| Benzoílo | Bz | |
| Carbonildiimidazol | CDI | |
| Ciclohexilalanina | Cha | |
| Ciclohexilglicina | Chg | |
| Ciclohexilo | Chx | |
| Cisteína | Cys | C |
| Dimetilamidinio derivado de DAB | Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N) | |
| Dimetilamidinio derivado de Dap | Dap(N^{\beta}-C_{3}H_{7}N) | |
| Dimetilamidinio derivado de ornitina | Orn(N^{\delta}-C_{3}H_{7}N) | |
| DL-indolin-2-carboxi | 2-INCA | |
| Enlazador SCAL unido a "TENTAGEL" | SCAL-TG | |
| Fenilalanina | Phe | F |
| Fenilglinina | Pgl | |
| Fenilo | Ph | |
| Formilo | For | |
| Glicina | Gly | G |
| Glutamina | Gln | Q |
| Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino) | Bop | |
| -fosfonio | ||
| Hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio | PyBroP | |
| Histidina | His | H |
| Homoarginina | hArg | hR |
| Isobutilo | iBu |
TABLA 1
(continuación)
| Compuesto | Abreviatura nº 1 | Abreviatura nº 2 |
| Isoleucina | Ile | I |
| Isopropanol | iPrOH | |
| Leucina | Leu | L |
| Lisina | Lys | K |
| m-Amidinofenilalanina | mAph | |
| Metanol | MeOH | |
| Metionina | Met | |
| N,N-Diisobutilcarbox-amida | DIBA | |
| N,N-Diisopropilcarbox-amida | DIPA | |
| N-Hidroxibenzotriazol | HOBt | |
| N-Metilmorfolina | NMM | |
| Norarginina | nArg | nR |
| Norleucina | Nle | nL |
| Norvalina | Nva | nV |
| O-Metil-tirosina | Tyr(Me) | Y(Me) |
| Ornitina | Orn | |
| p-Amidinofenilalanina | pAph | |
| p-Aminofenilalanina | Phe(NH_{2}) | F(pNH_{2}) |
| p-Clorofenilalanina | Phe(Cl) | F(pCl) |
| p-Fluorofenilalanina | Phe(F) | F(pF) |
| p-Guanidinofenilalanina | Phe(Gua) | F(pGua) |
| p-Hidroxifenilglicina | Pgl(OH) | |
| Piperidinilo | PIP | |
| p-Nitrofenilalanina | Phe(NO_{2}) | F(pNO_{2}) |
| Prolina | Pro | P |
| p-Toluenosulfonilo | Tos | |
| Sarcosina | Sar | |
| Serina | Ser | S |
| S-terc-butilo | SBut | |
| t-Butilo | tBu, But | |
| t-Butiloxicarbonilo | Boc | |
| t-Butiloxicarbonilo | Boc | |
| Terc-leucina | Tle | |
| Tetrahidroisoquinolina-3-carboxilo | Tic | |
| Tirosina | Tyr | Y |
| Treonina | Thr | T |
| Trifluoroacetilo | Tfa | |
| Triptófano | Trp | W |
| Valina | Val | V |
| \begin{minipage}{145mm} *Los aminoácidos en configuración D se designan ya sea por el prefijo D usando el código de tres letras (por ejemplo, D-Ala, D-Cys, D-Asp. D-Trp) o con letras minúsculas usando el código de una letra (a, c, d, w, respectivamente)\end{minipage} |
Como se usa en este documento, la expresión
"actividad del factor Xa" se refiere a la capacidad del factor
Xa, por sí mismo o junto con sub-unidades conocidas
como complejo de protrombinasa, para catalizar la conversión de
protrombina en trombina. Cuando se utiliza en referencia a la
actividad del factor Xa, el término "inhibición" incluye la
inhibición tanto directa como indirecta de la actividad del factor
Xa. La inhibición directa de la actividad del factor Xa se puede
lograr, por ejemplo, mediante la fijación de un péptido YIR de la
invención al factor Xa o a protrombinasa, de forma que se impida la
fijación de protrombina al sitio activo del complejo de
protrombinasa. La inhibición indirecta de la actividad del factor Xa
se puede lograr, por ejemplo, mediante la fijación de un compuesto
de la invención a factor Xa soluble, de forma que se impida su unión
con el complejo de protrombinasa.
Como se usa en este documento, el término
"específico", cuando se utiliza en referencia a la inhibición
de la actividad del factor Xa significa que el péptido YIR puede
inhibir la actividad del factor Xa sin inhibir, de manera
sustancial, la actividad de otras proteasas especificadas, incluida
plasmina y trombina (usando la misma concentración del inhibidor).
Estas proteasas intervienen en la coagulación sanguínea y en la
cascada de fibrinolísis (véase la Tabla 2; véase, también, el
Ejemplo XXVII).
Los resultados de la Tabla 2 demuestran que los
péptidos YIR de la invención son de utilidad como inhibidores del
factor Xa, pero que no inhiben de forma sustancial la actividad de
otras serin-proteasas tales como plasmina o
trombina, que intervienen en el proceso de coagulación sanguínea y
fibrinolisis.
Como se usa en este documento, el término
"sustituyente" se refiere a cualquiera de diversos grupos
químicos que se sustituye en la columna vertebral peptídica o
cadena lateral de un péptido, análogo peptídico, mimético o
compuesto orgánico descrito en este documento. Un sustituyente
puede incluir cualquiera de una variedad de diferentes restos
conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo,
Giannis y Kolter, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
32:1244-1267 (1993), que se incorpora al presente
documento como referencia). En este documento se describen numerosos
ejemplos que muestran la sustitución de un sustituyente, incluida,
por ejemplo, la sustitución de un sustituyente pNH_{2} en la
fenilalanina para obtener F(pNH_{2}), y la sustitución de
un halógeno en tirosina para obtener, por ejemplo,
Y(3-I) o Y(3,5-I).
Adicionalmente, un sustituyente puede ser, por ejemplo, un
heteroátomo tal como nitrógeno (N; véase, por ejemplo, Pal), oxígeno
(O; véase, por ejemplo, O-metiltirosina) o azufre
(S; véase, por ejemplo, Tyr(SO_{2}H)), que puede estar
sustituido con un sustituyente. De esta forma, un resto que contenga
N, S u O tal como -SO_{2}H se considera un "sustituyente",
según la definición de este documento. Además, una sustituyente
puede ser un grupo amino-protector o un grupo
carboxilo-protector.
Como se usa en este documento, el término
"alquilo" se utiliza en el sentido más amplio, para dar a
entender cadenas saturadas o insaturadas, lineales, ramificadas o
cíclicas de aproximadamente 1 a 13 átomos de carbono. De esta forma,
el término "alquilo" incluye, por ejemplo, grupos metilo,
etilo, n-propilo, isopropilo,
sec-butilo, 1-metilbutilo,
2,2-dimetilbutilo, 2-metilpentilo,
2,2-dimetilpropilo, n-pentilo y
n-hexilo, grupos alquileno, cadenas cíclicas de
átomos de carbono tales como grupos ciclohexilo y ciclopentilo, así
como combinaciones de cadenas lineales o ramificadas y cadenas
cíclicas de átomos de carbono tales como un grupo
metil-ciclohexilo o
ciclopropil-metileno. Además, se debe reconocer que
un alquilo según la presente definición puede estar sustituido con
un sustituyente. De forma similar, el término "acilo" se
utiliza en su sentido más amplio para dar a entender cadenas
saturadas o insaturadas, lineales, ramificadas o cíclicas de
aproximadamente 1 a 13 átomos de carbono, que contienen un grupo
carboxilo. De este modo, el término "acilo" comprende, por
ejemplo, grupos tales como formilo, acetilo, benzoílo y
similares.
El término "arilo" se refiere a grupos
aromáticos que contienen aproximadamente 5 a 13 átomos de carbono y
al menos un grupo "de anillo" que tiene un sistema de
electrones pi conjugado. Ejemplos de arilos incluyen, por ejemplo,
grupos arilo heterocíclicos, grupos biarilo, y análogos y derivados
de los mismos, todos los cuales pueden estar opcionalmente
sustituidos con uno o más sustituyentes. El término
"arilalquilo" hace referencia a un alquilo según la definición
anterior, sustituido con un grupo arilo. Grupos arilalquilo
adecuados incluyen bencilo, picolilo y similares, todos los cuales
pueden estar opcionalmente sustituidos.
Los términos "heteroalquilo",
"heteroarilalquilo" y "heteroarilo" también se utilizan
en este documento y se refieren a un alquilo, un arilalquilo y un
arilo, respectivamente, que está sustituido con uno o más
heteroátomos tales como un átomo N, O o S. Adicionalmente, el
término "heterocíclico" se usa en referencia a un grupo
alquilo o arilo cíclico que está sustituido con uno o más
heteroátomos. Se describen numerosos ejemplos de heteroalquilos,
heteroarilalquilos, heteroarilos y heterocíclicos, por ejemplo, en
las Tablas 1 y 3, o se conocen de otra forma en la técnica.
Los péptidos de la invención se pueden modificar
en el extremo N o C utilizando un grupo
amino-protector o carboxi-protector,
respectivamente. En el presente documento, se describen numerosas
modificaciones de este tipo (véase, por ejemplo, la Tabla 3). El
extremo N de un péptido o análogo peptídico se puede modificar
químicamente, de forma que el grupo aminoácido
N-terminal esté sustituido, por ejemplo, con un
acetilo, ciclopentilcarboxi, isoquinolilcarboxi, furoílo, tosilo,
pirazincarboxi u otro grupo similar, que puede estar sustituido con
un sustituyente como se ha descrito anteriormente. El grupo amino
N-terminal también puede estar sustituido, por
ejemplo, con un enlace amida inverso. Se debe reconocer que en el
presente documento la expresión "grupo amino" se utiliza
ampliamente para referirse a cualquier grupo amino libre, incluido
un grupo amino primario, secundario o terciario, presente en un
péptido. En comparación, la expresión "extremo N" se refiere al
grupo \alpha-amino del primer aminoácido presente
en un péptido designado de forma convencional.
El extremo N de un péptido de la invención se
puede proteger enlazando al mismo un grupo
amino-protector. La expresión "grupo
amino-protector" se utiliza ampliamente en este
documento para referirse a un grupo químico capaz de reaccionar con
un grupo amino libre, incluido, por ejemplo, el grupo
\alpha-amino presente en el extremo N de un
péptido de la invención. AL reaccionar con el mismo, un grupo
amino-protector protege el grupo amino, reactivo de
otra forma, contra reacciones indeseables que puedan ocurrir, por
ejemplo, durante un procedimiento de síntesis o debido a la
actividad de exopeptidasa sobre un compuesto final. La modificación
de un grupo amino también puede proporcionar ventajas adicionales,
incluido, por ejemplo, el incremento de la solubilidad o de la
actividad del compuesto. En este documento, se describen diversos
grupos amino-protectores (véase la Tabla 3), o
conocidos de otra forma, e incluyen, por ejemplo, grupos acilo tales
como acetilo, picoloílo, terc-butilacetilo,
terc-butiloxicarbonilo,
benciloxi-carbonilo, grupos benzoílo incluida, por
ejemplo, una benciloxima tal como
2-aril-2-O-benciloxima
(véase el Ejemplo XVI), así como un residuo aminoacilo que se puede
modificar con un grupo amino-protector. Se describen
otros grupos amino-protectores, por ejemplo, en
The Peptides, eds. Gross y Meienhofer, Vol. 3 (Academic
Press, Inc., N.Y., 1981); y Greene y Wuts en Protective Groups in
Organic Synthesis, 2ª ed., páginas 309-405 (John
Wiley & Sons, Nueva York (1991), los cuales se incorporan al
presente documento como referencias. El producto de cualquiera de
estas modificaciones del grupo amino N-terminal de
un péptido o análogo peptídico de la invención se designa en este
documento como "derivado N-terminal".
Del mismo modo, un grupo carboxi tal como el
grupo carboxi en el extremo C de un péptido se puede modificar
químicamente usando un grupo carboxi-protector. Las
expresiones "grupo carboxi" y "extremo C" se utilizan de
manera consistente con las expresiones "grupo amino" y
"extremo N", según se han definido anteriormente. Un grupo
carboxi como el que está presente en el extremo C de un péptido se
puede modificar por reducción del grupo carboxi
C-terminal a un alcohol o aldehído, o por formación
de un éster oral, o por sustitución del grupo carboxi con un
sustituyente tal como tiazolilo, ciclohexilo u otro grupo. Los
ésteres orales son bien conocidos en la técnica e incluyen, por
ejemplo, grupos alcoximetilo tales como metoximetilo, etoximetilo,
iso-propoximetilo y similares; grupos
\alpha-alcoxi-(C_{1} a
C_{4})-etilo tales como metoxietilo, etoxietilo,
propoxietilo, isopropoxietilo y similares; grupos
2-oxo-1,3-dioxolen-4-il-metilo
tales como
5-metil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il-metilo,
5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il-metilo
y similares; grupos alquil-(C_{1} a
C_{3})-tiometilo tales como metiltiometilo,
etiltiometilo, isopropil-tiometilo y similares;
grupos aciloximetilo tales como pivaloiloximetilo,
\alpha-acetoximetilo y similares; grupo
etoxicarbonil-1-metilo; grupos
\alpha-aciloxi-\alpha-metilo
sustituido tales como \alpha-acetoxietilo; grupos
3-ftalidilo o 5,6-dimetilftalidilo;
grupos 1-(alquil-(C_{1} a
C_{4})-oxi-carbonil-oxi)et-1-ilo
tales como el grupo
1-(etoxicarboniloxi)-et-1-ilo;
y el grupo 1-(alquil-(C_{1} a
C_{4})-aminocarboniloxi)-et-1-ilo
tal como el grupo
1-(metil-aminocarboniloxi)-et-1-ilo.
Un péptido de la invención se puede modificar
enlazando al mismo un grupo carboxi-protector. Los
grupos carboxi-protectores son bien conocidos en la
técnica y, al estar unidos a un péptido, protegen un grupo carboxi
contra reacciones indeseables (véase, por ejemplo, Greene y Wuts,
véase antes, páginas 224-276 (1991), que se
incorpora a este documento como referencia). El experto reconocerá
que estas modificaciones anteriormente descritas, que se pueden
efectuar sobre el grupo amino N-terminal o el grupo
carboxi C-terminal de un péptido, se pueden llevar a
cabo de manera similar sobre cualquier grupo amino o carboxi
reactivo presente, por ejemplo, sobre una cadena lateral de un
aminoácidos o un análogo de aminoácido en un péptido de la
invención. Los métodos para llevar a efecto estas modificaciones se
describen en este documento o son conocidos de cualquier otra forma
en la técnica.
La presente invención proporciona compuestos que
inhiben específicamente la actividad del factor Xa. Un compuesto de
la invención tiene la estructura general
X_{1}-R1-R2-R3-X_{2}
en la
cual
X_{1} es H, acilo, alquilo o arilalquilo;
R1 es Tyr;
R2 es Ile;
R3 es Arg;
y
X_{2} se selecciona del grupo consistente en un
grupo C-terminal modificado, uno o más grupos
carboxi-protectores, y uno o más aminoácidos u otro
sustituyente, en el que el grupo C-terminal
modificado se modifica por la reducción del grupo carboxi
C-terminal a un alcohol o aldehído, o por formación
de un éster oral, o por sustitución del grupo carboxi con un
sustituyente;
incluidas la sales farmacéuticamente aceptables
del mismo.
Adicionalmente, la invención proporciona un
compuesto de la estructura
X_{1}-YIR-X_{2}
en la
cual
X_{1} es H, acilo, alquilo o arilalquilo; y
X_{2} se seleccione del grupo consistente en un
grupo C-terminal modificado, uno o más grupos
carboxi-protectores, y uno o más aminoácidos u otro
sustituyente, en el que el grupo C-terminal
modificado se modifica por reducción del grupo carboxi
C-terminal a un alcohol o aldehído, o por la
formación de un éster oral, o por sustitución del grupo carboxi con
un sustituyente;
incluidas las sales farmacéuticamente aceptables
del mismo,
La invención proporciona también un compuesto que
inhibe específicamente la actividad del factor Xa, que tiene la
fórmula general
A1-A2-(A3)_{m}-B, en la
cual m es 1.
La estructura general descrita en este documento
representa los diversos compuestos de la invención, que conservan
actividad inhibitoria del factor Xa tal como la impartida por el
tripéptido YIR. Las estructuras descritas en esta memoria
representan también compuestos que contienen aminoácidos de origen
no natural, miméticos de aminoácidos y otras estructuras orgánicas y
sustituyentes que exhiben una función similar. Estos equivalentes
funcionales proporcionan los agrupamientos espaciales apropiados de
las cargas y fuerzas deseadas que confieren una eficaz función
inhibitoria del factor Xa.
Ejemplos específicos de los compuestos de la
invención incluyen, por ejemplo,
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH_{3})O(CH_{3});
Ac-Tyr-{\Psi(CH_{2}
NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH_{2}(4-piridilo); Ac-Tyr-Ile-{\Psi(CH_{2}NH)}-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-Tyr-Chg-Arg(NO_{2})-{\Psi(CH_{2}NH)}-Leu-NH_{2}; Ac-Tyr-Ile-Arg-{\Psi(COCH_{2})}-Gly-Pro-NH_{2}; Ac-Tyr-Ile-Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}
N)-Leu-Ala-NH_{2}; Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH_{2}; Tyr-Ile-Arg-NH_{2}; D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropil)Gly-NH_{2}; ciclo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly); Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-Arg-
Leu-Pro-NH_{2}; y Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}. En las Tablas 3 y 5 se muestran, por ejemplo, péptidos YIR adicionales de la invención.
NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH_{2}(4-piridilo); Ac-Tyr-Ile-{\Psi(CH_{2}NH)}-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-Tyr-Chg-Arg(NO_{2})-{\Psi(CH_{2}NH)}-Leu-NH_{2}; Ac-Tyr-Ile-Arg-{\Psi(COCH_{2})}-Gly-Pro-NH_{2}; Ac-Tyr-Ile-Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}
N)-Leu-Ala-NH_{2}; Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH_{2}; Tyr-Ile-Arg-NH_{2}; D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropil)Gly-NH_{2}; ciclo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly); Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-Arg-
Leu-Pro-NH_{2}; y Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}. En las Tablas 3 y 5 se muestran, por ejemplo, péptidos YIR adicionales de la invención.
Por ejemplo, en un compuesto de la invención A1
se selecciona del grupo consistente en Tyr, F(pNH_{2}).
mAph, pAph y Nal(2), que contiene 0 ó 1 grupo
amino-protector; A2 se selecciona del grupo
consistente en Ile y Chg; A3 se selecciona del grupo consistente en
Arg, PalMe(3),
Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N),
Dap(N^{\beta}-C_{3}H_{7}N) y
Orn(N^{\delta}-C_{3}H_{7}N); y B se
selecciona del grupo consistente en -H. -OH, -NH_{2}, uno a cinco
aminoácidos o sus equivalentes funcionales, y un grupo
carboxi-protector. Ejemplos de estos compuestos
incluyen
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH_{2}-Chx;
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx;
Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
ciclopentilo-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
2-furoílo-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
5-Me-tienilo-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
y
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol
(véase también la Tabla 3).
La elección de incluir un L- o
D-aminoácido en un compuesto de la presente
invención puede depender, en parte, de las características deseadas
del péptido. Por ejemplo, la incorporación de uno o más
D-aminoácidos puede conferir una estabilidad
incrementada al compuesto in vitro o in vivo.
Igualmente, la incorporación de uno o más
D-aminoácidos puede aumentar o disminuir la
actividad farmacológica del compuesto. En algunos casos, puede ser
deseable permitir al compuesto que permanezca activo durante tan
sólo un breve período de tiempo. En estos casos, la incorporación de
uno o varios L-aminoácidos al compuesto puede
permitir que peptidasas endógenas de un individuo digieran el
compuesto in vivo, limitando de esta forma la exposición del
individuo al compuesto activo. El experto en la técnica puede
determinar las características deseables requeridas para el
compuesto de la invención tomando en consideración, por ejemplo, la
edad y el estado general de salud de un individuo.
Un compuesto de la invención se puede sintetizar
químicamente utilizando, por ejemplo, un sintetizador automatizado
(véase el Ejemplo 1). La modificación selectiva de un grupo
reactivo tal como un grupo presente en una cadena lateral de un
aminoácido o un grupo reactivo N-terminal o
C-terminal en un péptido, puede impartir
características deseables tales como una mayor solubilidad o una
función inhibitoria potenciada a un compuesto de la invención.
Cuando se emplean métodos de síntesis de fase
sólida, la composición química de un compuesto se puede manipular
mientras el péptido en formación está unido a la resina, o después
de que éste se haya escindido de la resina, para obtener, por
ejemplo, un derivado N-terminal tal como un
compuesto acetilado en el extremo N. Modificaciones similares se
pueden realizar también a un grupo carboxi de un compuesto, incluido
un grupo carboxi del extremo C que, por ejemplo, se puede amidar. Un
experto en la técnica puede sintetizar, asimismo, un péptido YIR de
la invención usando química orgánica de fase de solución. Un
compuesto sintetizado se puede purificar empleando métodos bien
conocidos tales como cromatografía líquida de alto rendimiento de
fase inversa (RP-HPLC; véase el Ejemplo I), u otros
métodos de separación basados, por ejemplo, en el tamaño, carga o
hidrofobia del compuesto. De manera similar, se pueden utilizar
métodos bien conocidos tales como análisis de secuencia de
aminoácidos o espectrometría de masa (MS) para caracterizar la
estructura de un compuesto de la invención (véase el Ejemplo I).
Los péptidos YIR de la invención pueden ser
lineales o cíclicos (véase, por ejemplo, la Tabla 3 más adelante).
La ciclación se puede lograr formando un puente entre dos residuos,
restos o sustituyentes no adyacentes, que pueden encontrarse dentro
o fuera del motivo YIR. La ciclación también se puede llevar a
cabo, por ejemplo, formando un puente entre uno de los residuos en
el interior del motivo YIR y un residuo, resto o sustituyente no
adyacente, fuera de la secuencia YIR. Por ejemplo, se pueden ciclar
péptidos o miméticos peptídicos a través de enlaces
S-S, -CH_{2}-S,
-CH_{2}-O-CH_{2}-, lactámicos o
éster, o de la forma anteriormente descrita (véase Hruby, Life
Sci. 31:189-199 (1982); Toniolo, Int. J.
Pept. Prot. Res. 35:287-300 (1990); Kates et
al., Tetr. Lett. 34:1549-1552 (1993), cada uno
de los cuales se incorpora a este documento como referencia).
Como se utiliza en este documento, la expresión
"fuera del motivo YIR" significa no incluir un residuo
tirosina, isoleucina o arginina de la secuencia YIR o su
equivalente presente en un péptido YIR de la invención. Por el
contrario, la expresión "dentro del motivo YIR" significa
incluir al menos uno de los residuos tirosina, isoleucina y arginina
de la secuencia YIR o su equivalente. El término "puente", al
referirse a un compuesto cíclico, significa un enlace formado entre
dos aminoácidos no adyacentes presentes en un péptido YIR de la
invención.
La ciclación se puede conseguir mediante la
formación, por ejemplo, de un enlace disulfuro o un enlace lactámico
entre X_{1} y X_{2}. Residuos capaces de formar un enlace
disulfuro incluyen, por ejemplo, Cys, Pen, Mpr y Mpp y sus
equivalentes que contienen el grupo 2-amino.
Residuos capaces de formar un puente lactámico incluyen, por
ejemplo, Asp, Glu, Lys, Orn, ácido
\alpha,\beta-diaminopropiónico, ácido
\alpha-amino-adípico, ácido
\alpha,\gamma-diaminobutírico, ácido
diaminoacético, ácido diaminobenzoico y ácido mercaptobenzoico. Los
compuestos descritos en este documento se pueden ciclar, por
ejemplo, a través de un enlace lactámico, que puede utilizar un
grupo de cadena lateral de un residuo no adyacente para formar una
unión covalente con el grupo amino N-terminal de
X_{1} o de Y. Asimismo, se pueden usar estructuras alternativas de
puente para ciclar los compuestos de la invención, incluidos, por
ejemplo, péptidos y miméticos peptídicos, que se pueden ciclar a
través de enlaces S-S-, -CH_{2}-S,
-CH_{2}-O-CH_{2}-, lactámico,
éster o de otro tipo (véanse, por ejemplo, Hruby, obra citada, 1982;
Toniolo, obra citada, 1990; Kates et al., obra citada,
1993).
Una composición de la presente invención se puede
proporcionar en forma de una composición homogénea o como una mezcla
de compuestos que contienen diversas combinaciones de sustituyentes.
La flexibilidad conferida por la elección de sustituyentes permite
un elevado grado de control sobre las propiedades
físico-química de los análogos de compuestos
peptídicos. La elección del sustituyente influye, igualmente, sobre
la afinidad de fijación del compuesto (véanse los Ejemplos).
Diversos compuestos que contienen diferentes
disposiciones de los sustituyentes exhiben niveles diferentes de
actividad inhibitoria para el factor Xa. Estos compuestos se
sintetizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en los
Ejemplos. El ensayo de la actividad inhibitoria de los péptidos se
llevó a cabo empleando los ensayos descritos en los Ejemplos XXXVII
y XXXVIII. Mediante el uso de estos métodos, un experto en la
técnica puede sintetizar un compuesto de la forma aquí descrita,
incluida una modificación del mismo, y determinar la actividad
inhibitoria sobre el factor Xa del compuesto.
La invención proporciona compuestos que inhiben
específicamente la actividad del factor Xa. Estos compuestos tienen
una K_{i} \leq 100 \muM, preferentemente \leq 2 nM, para la
actividad del factor Xa y no inhiben de manera sustancial la
actividad de otras proteasas que intervienen en la coagulación y
fibrinolisis, en relación con la inhibición del factor Xa (véase la
Tabla 2, anterior). Estas otras proteasas incluyen, por ejemplo,
trombina y plasmina. La especificidad de los compuestos de la
invención se demuestra en el Ejemplo XXXVII, más adelante (véase
también la Tabla 2, anterior).
Un compuesto de la invención se puede utilizar
convenientemente como anticoagulante, que se puede poner en contacto
con una muestra de sangre para prevenir la coagulación. Por
ejemplo, se puede poner en contacto una cantidad eficaz de un
compuesto de la invención con una muestra de sangre recién extraída
para prevenir la coagulación de la muestra de sangre. Como se usa
en este documento, la expresión "cantidad eficaz", cuando se
utiliza en referencia a un compuesto de la invención, significa una
cantidad de un compuesto que inhibe la actividad del factor Xa. El
experto en la técnica reconocerá que una cantidad eficaz de un
compuesto de la invención se puede determinar usando los métodos
descritos en este documento (véanse los Ejemplos XXXVII y XXXVIII),
o conocidos en la técnica de cualquier otra forma.
A la vista de la utilidad descrita de un
compuesto de la invención, el experto en la técnica reconocerá,
igualmente, que un agente tal como la heparina se puede sustituir
con un compuesto de la invención. Este uso de un compuesto de la
invención puede tener como resultado, por ejemplo, un ahorro de
costes comparado con otros anticoagulantes.
Adicionalmente, un compuesto de la invención se
puede utilizar para la preparación de una composición farmacéutica
para el tratamiento de una serie de trastornos clínicos, incluidos,
por ejemplo, el tratamiento de un trastorno cardiovascular o de una
complicación asociada, por ejemplo, con una infección o intervención
quirúrgica. Ejemplos de trastornos cardiovasculares incluyen
re-estenosis posterior a una angioplastia, síndrome
de distrés respiratorio del adulto, fracaso multiorgánico, ictus y
un trastorno de coagulación intravascular diseminada. Ejemplos de
complicaciones relacionadas con la cirugía incluyen, por ejemplo,
trombosis venosa profunda y venosa próximal, que se puede producir
tras una intervención quirúrgica. e esta forma, un compuesto de la
invención resulta útil como medicamento para reducir o inhibir la
coagulación no deseada en un individuo.
Dado que un péptido YIR de la invención puede
inhibir la actividad del factor Xa, un compuesto de este tipo puede
ser útil para la preparación de una composición farmacéutica para
reducir o inhibir la coagulación sanguínea en un individuo. Como se
usa en este documento, el término "individuo" significa un
vertebrado, incluido un mamífero como el ser humano, en el cual el
factor Xa interviene en la cascada de coagulación.
La coagulación sanguínea en un individuo se puede
reducir o inhibir por medio de una preparación farmacéutica que
contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido YIR de
la invención. Como se usa en este documento, la expresión
"cantidad terapéuticamente eficaz" significa la dosis de un
péptido YIR que se debe administrar a un individuo para inhibir la
actividad del factor Xa en el mismo. Más específicamente, una
cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención
inhibe la actividad catalítica del factor Xa ya sea de manera
directa, en el interior del complejo de protrombinasa o como una
subunidad soluble, o de forma indirecta, inhibiendo la fijación del
factor Xa en el complejo de protrombinasa. De manera particular,
estos compuestos pueden inhibir la actividad del factor Xa con una
K_{i} \leq 100 \muM y, preferentemente, con una K_{i}
\leq 2 nM. La cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar
usando los métodos descritos, por ejemplo, en los Ejemplos XXXVII y
XXXVIII, o conocidos de cualquier otra forma en la técnica.
En la práctica de la invención, la dosificación
particular para obtener una cantidad terapéuticamente eficaz de una
composición farmacéutica dependerá de una serie de consideraciones,
incluyendo, por ejemplo, la naturaleza o gravedad de la enfermedad,
el programa de administración y la edad y características físicas
del individuo. Se puede establecer una dosificación apropiada
usando enfoques clínicos bien conocidos en medicina. De esta forma,
la invención proporciona un método para inhibir específicamente la
actividad del factor Xa poniendo en contacto el factor Xa con un
compuesto que tenga la secuencia
X_{1}-R1-R2-R3-X_{2},
X1-YIR-X_{2} o
A1-A2-(A3)_{m}-B, en la
que me es 1, o un equivalente funcional del mismo.
Un compuesto de la invención se utilizará, por lo
general, para la preparación de una composición farmacéutica en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La
expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" hace
referencia a un medio o composición que es atóxico para un
individuo, o que posee una toxicidad aceptable, según la
determinación de una agencia reguladora apropiada. Como se usa en
este documento, la expresión vehículo farmacéuticamente aceptable
comprende cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales
tales como solución salina tamponada con fosfato, agua, una
emulsión tal como emulsión de aceite/agua o de agua/aceite, o
cualquiera de los diversos tipos de agentes humectantes. Martin (en
Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª ed. (Mack Publishing Co.,
Easton 1975, que se incorpora a este documento como referencia)
describe vehículos farmacéuticos adecuados y sus formulaciones.
Estas composiciones contendrán, en general, una cantidad
terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención, junto con
una cantidad adecuada de vehículo, de forma que comprenda la
dosificación apropiada para la administración a un individuo. De
este modo, los compuestos reivindicados pueden ser de utilidad en la
preparación de medicamentos para inhibir la actividad del factor Xa
y la coagulación sanguínea en un individuo.
Vehículos farmacéuticamente aceptables pueden
incluir, por ejemplo, otros medios, compuestos o modificaciones de
un compuesto inhibidor del factor Xa que potencien su función
farmacológica. Un medio farmacéuticamente aceptable puede incluir,
por ejemplo, una sal por adición de ácido tal como una sal formada
con un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico, ácido
bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico o ácido perclórico, o
con un ácido orgánico tal como ácido acético, ácido oxálico, ácido
maleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido
succínico o ácido malónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables
incluyen, por ejemplo, nitrato inorgánico, sulfato, acetato,
malato, formiato, lactato, tartrato, succinato, citrato,
p-toluenosulfonato, y similares, incluyendo, sin
estar limitado a, cationes basados en metales alcalinos o
alcalino-térreos tales como sodio, litio, potasio,
calcio o magnesio, así como amonio atóxico, cationes de amonio
cuaternario y amina tales como amonio, metilamonio, dimetilamonio,
trimetilamonio, tetrametilamonio, etilamonio, trietilamonio y
tetraetilamonio.
Ejemplos de modificaciones que potencian la
función farmacológica del compuesto incluyen, por ejemplo,
esterificación tal como la formación de ésteres alquílicos-(C_{1}
a C_{6}), preferentemente, ésteres alquílicos-(C_{1} a C_{4}),
en los que el grupo alquilo es una cadena lineal o ramificada.
Otros ésteres aceptables incluyen, por ejemplo, ésteres de
cicloalquilo-(C_{5} a C_{7}) y ésteres de arilalquilo tales como
ésteres bencílicos. Estos ésteres se pueden preparar a partir de
los compuestos descritos en este documento, usando métodos
convencionales bien conocidos en la técnica de la química de
péptidos.
Modificaciones farmacéuticamente aceptables
pueden incluir, también, por ejemplo, la formación de amidas
peptídicas. Estas modificaciones amídicas, que se pueden efectuar
sobre los compuestos de la invención, incluyen, por ejemplo, las
derivadas de amoniaco, aminas dialquílicas-(C_{1} a C_{6}), en
las que los grupos alquilo son cadenas lineales o ramificadas, o
arilaminas que tienen varias sustituciones. En el caso de aminas
secundarias, la amina puede estar también en forma de un heterociclo
de 5 ó 6 miembros que contiene, por ejemplo, un átomo de nitrógeno.
Los métodos para preparar estas amidas son bien conocidos en la
técnica.
En otra realización de la invención, se puede
usar un péptido YIR en un ensayo para identificar la presencia del
factor Xa, o para aislar el factor Xa de forma sustancialmente
pura. Preferentemente, el compuesto de la invención está marcado,
por ejemplo, con una radioisótopo, y el compuesto marcado se
detecta usando un método convencional útil para detectar la marca
particular. Además, se puede utilizar convenientemente un péptido
YIR como sonda para detectar la localización o cantidad de actividad
del factor Xa in vivo, in vitro o ex vivo.
Se entiende que las modificaciones que no afectan
sustancialmente a la actividad de las diferentes realizaciones de
esta invención se incluyen en la invención descrita en esta
memoria. En consecuencia, los siguientes ejemplos pretenden
ilustrar, pero no limitar, la presente invención.
Los materiales de partida utilizados en la
síntesis se obtuvieron de proveedores químicos tales como Aldrich,
Sigma, Fluka, Nova Biochem y Advance Chemtech. Durante la síntesis
de estos compuestos, los grupos funcionales de los derivados de
aminoácidos empleados en estos métodos se protegieron bloqueando los
grupos para impedir reacciones colaterales durante las etapas de
acoplamiento. Ejemplos de grupos protectores adecuados y de su uso
se describen en The Peptides, véase antes, 1981, y en el Vol. 9,
Udenfriend y Meienhofer, ed. 1987, que se incorpora a este documento
como referencia.
Se utilizó en general la síntesis de péptidos de
fase sólida para producir los compuestos de la invención. Estos
métodos los describen, por ejemplo, Steward y Young (Solid Phase
Peptide Synthesis (Freeman y Co., San Francisco, 1969), que se
incorpora a este documento como referencia).
A menos que se indique lo contrario, los péptidos
se sintetizaron sobre resina de poliestireno reticulada con
divilbenceno al 1%. Se acopló un enlazador sensible al ácido
(Enlazador de Rink) al soporte sólido (Rink, Tetr. Lett.
28:3787 (1987); Sieber, Tetr. Lett. 28:2107 (1987), los
cuales se incorporan a este documento como referencia). El
acoplamiento se llevó a cabo usando
N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) en presencia de
una cantidad equivalente de HOBt. Todos los acoplamientos se
efectuaron en N,N-dimetilformamida (DMF) o DMF:
diclorometano (mezcla 1:1) a temperatura ambiente (TA) durante 40
min. La compleción del acoplamiento se monitorizó por el ensayo de
ninhidrina.
La desprotección del grupo Fmoc se consiguió
usando piperidina al 50% en DMF durante 10 min. La cantidad de Fmoc
liberada se determinó a partir de la absorbancia a 300 nm de la
solución tras la desprotección, volumen de lavados y peso de la
resina usada en la síntesis. Se llevó a cabo un segundo
acoplamiento (doble) cuando el acoplamiento en primera instancia
fue incompleto. El ciclo de cada acoplamiento y de los métodos fue
el siguiente:
| Etapa | Acción | Reactivo y disolvente |
| 1 | 1 g de Resina peptídica | 10 ml de DMF |
| 2 | Exceso de 2,4 veces de | |
| derivado de aminoácido | ||
| 3 | 2,4 equivalente | DIC |
| 4 | 2,4 equivalente | HOBt |
| 5 | Acoplar durante 40 min | |
| 6 | Lavar (3 x 8 ml) | DMF |
| 7 | Ensayo de ninhidrina | |
| 8 | Desprotección (10 min) | 8 ml piperidina al 50%/DMF |
| 9 | Lavar (6 x 8 ml) | DMF |
| 10 | Lavar (2 x 8 ml) | Diclorometano |
| 11 | Ensayo de ninhidrina | |
| 12 | Repetir, a partir de la etapa 2 |
Después de finalizar la construcción del péptido
sobre la resina, se llevó a cabo la desprotección final de Fmoc,
seguida a continuación por ciclos de lavado normal y determinación
de la cantidad de grupo Fmoc liberada por la desprotección. En
algunos casos, el péptido no protegido por N^{a} se acetiló
agitando la resina peptídica con un exceso de 20 veces de anhídrido
acético/piridina (1:1) en DCM durante 15 min. La resina peptídica
se lavó entonces sucesivamente con DCM, DMF y DCM, secándola luego
al vacío.
La resina peptídica se suspendió en cóctel de
reactivo K (King et al., Int. J. Pept. Prot. Res.
36:255-266 (1990), que se incorpora al documento
como referencia)(5 ml/g de resina peptídica) durante 180 min a RT,
a continuación la mezcla de escisión se filtró en éter dietílico
anhidro y el precipitado sólido se aisló por centrifugación y se
secó al vacío sobre gránulos sólidos de KOH. El péptido seco se
sometió a purificación por HPLC usando un gradiente apropiado de
TFA al 0,1% en agua y acetonitrilo (ACN). Tras recoger el pico que
contenía el producto sintético pretendido, la solución peptídica se
liofilizó y el péptido se sometió a un proceso de identificación que
incluyó MS de electro-rociadura y análisis de
aminoácidos para confirmar que se había sintetizado el compuesto
correcto.
Para la purificación de los péptidos, se disolvió
una muestra de péptido crudo liofilizado en una mezcla de TFA acuosa
al 0,1% que contenía 10% a 50% de ACN. La solución peptídica se
filtró habitualmente a través de una jeringa conectada a un filtro
de nailon de 0,45 \mum "ACRODISC" 13 (Gelman Sciences; Ann
Arbor MI). Se inyectó un volumen adecuado de solución peptídica
filtrada en una columna semi-preparativa C18 (Vydac
Protein and Peptide C18, 218TP1010; The Separation Group; Hesperia
CA). Se mantuvo el caudal de un gradiente o una mezcla isocrática
de tampón TFA al 0,1% y ACN (calidad de HPLC) como eluyente, usando
una HPLC "SYSTEM GOLD" de Beckman. La elución del péptido se
monitorizó por detección UV a 230 nm (Beckman, System Gold, Módulo
Programable de Disolvente 126 y Módulo Detector Programable 166,
controlado por software "SYSTEM GOLD"). Tras identificar el
pico correspondiente al compuesto en síntesis, usando MS, se
recogió el compuesto, se liofilizó y ensayó biológicamente. Se
llevó a cabo una MS usando un instrumento SCIEX API III+.
Adicionalmente, se efectuó una RMN usando un instrumento de General
Electric (300 mHz). Para la RMN, las muestra se midieron
típicamente en hexadeutero-dimetilsulfóxido o
deutero-cloroformo (CDCl_{3}; Aldrich).
Se prepararon aldehídos de aminoácidos usando
métodos bien conocidos en la técnica. Han informado sobre aldehídos
de aminoácidos y péptidos, por ejemplo, Fehrentz y Castro,
Synthesis 676 (1983); Bajusz et al., J. Med. Chem.
33:1729 (1990); Kawamura et al., Chem. Pharm Bull., 17:1902
(1969), y Someno et al., Chem. Phar. Bull., 34:1748 (1986),
todos los cuales se incorporan a este documento como referencia. La
síntesis de enlaces peptídicos reducidos se llevó a cabo al nivel
del dipéptido en solución (por ejemplo,
Tyr-{\Psi(CH_{2}NH)}-Ile) y, a continuación, el dipéptido
adecuadamente protegido se acopló al resto del péptido sobre
resina, usando síntesis de péptidos de fase sólida. De manera
alternativa, el aldehído de aminoácido protegido se acopló al
péptido sobre resina, usando métodos descritos por Ho et al
(Pept. Res. 6:10-12 (1993) y las referencias
citadas en ese artículo, todos los cuales se incorporan a este
documento como referencia).
Para la síntesis de
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH_{2},
se utilizó 1 g de resina Rink (0,6 mmol de NH_{2}(g de
resina) en el procedimiento descrito anteriormente. El péptido
resultante se analizó por MS. (M+H)^{+} hallado 659,4,
calculado (calc.) 659,9.
Para la síntesis de
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2},
se utilizó 1 g de resina Rink (0,6 mmol de NH_{2}/G de resina) en
el procedimiento descrito en el Ejemplo I. El péptido resultante
tuvo un (M+H)^{+} hallado de 685,4, calc. 685,9.
Se utilizó 1 g de resina Rink (0,6 mmol de
NH_{2}/ g de resina). Se aplicó la síntesis general de fase
sólida anteriormente descrita. Tras la desprotección de Tyr y el
lavado adecuado de la resina peptídica, se añadieron 50 eq de
isobutilaldehído en DMF que contenía ácido acético glacial al 2%.
La mezcla resultante se agitó durante 4 horas a RT. Después de
lavar la resina peptídica con DMF que contenía ácido acético al 2%
(2 x 8 ml), se agregó 1 g de NaBH_{3}CN en 10 ml de DMF que
contenía ácido acético al 2%. La resina peptídica se agitó durante
30 min, a continuación la resina peptídica se filtró y se agregó
una mezcla reciente de NaBH_{3}CN en DMF/ácido acético y la
reacción continuó durante 30 min adicionales.
A continuación, la resina peptídica se lavó con
DMF/ácido acético al 2% (2 x 8 ml) y DMF (2 x 8 ml). La resina
peptídica monoalquilada resultante se acetiló con una mezcla de
anhídrido acético-trietilamina en DMF (30 eq, 6 h).
Después del lavado adecuado de laresina peptídica, el péptido se
escindió y desprotegió de la forma descrita en el Ejemplo I. El
péptido purificado por HPLC se analizó por MS. (M+H)^{+}
hallado 758,4, calc. 758,5.
Se utilizó el mismo protocolo descrito en el
Ejemplo IV para preparar la resina
(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-Rink.
La trifluoroacetilación final se llevó a cabo tratando la resina
peptídica con anhídrido de trifluoroacetano 0,7 M en presencia de
diisopropiletilamina (DIEA) y
N-metil-imidazol (NMI) (1;3:0,3 eq)
durante 45 min. La escisión del péptido de la resina y el
aislamiento del péptido se efectuaron de la forma descrita en el
Ejemplo IV. El péptido purificado se identificó por MS.
(M+H)^{+} hallado 812,4, calc. 812,5.
La síntesis de
Boc-Arg(N^{G}-Tos)-N(CH_{3}O(CH_{3})
se obtuvo de acuerdo con el procedimiento de la bibliografía
(Fehrentz y Castro, véase antes, 1983). Se mezcló
Boc-Arg(N^{Y}-Tos)-N(CH_{3})O(CH_{3})
(200 mg) con 5 ml de ácido trifluoroacético (TFA) a TA y se agitó
durante 20 min. La desaparición del material de partida se
monitorizó por cromatografía de capa fina (CCF) usando
CHCl_{3}:MeOH:CH_{3}COOH (90:9:1) y se visualizó por
nebulización de ninhidrina e iluminación UV. La evaporación del TFA
remanente al vacío y el secado al vacío sobre gránulos de KOH dio
como resultado un material sólido con la masa apropiada.
(M+H)^{+} hallado 371,2, calc. 371,4.
En un matraz se disolvieron 150 mg del material
anteriormente preparado en 1 ml de DMF, se agregaron entonces 57
\mul de trietilamina y la mezcla se enfrió a 0ºC. En un segundo
matraz, se disolvieron 171 mg de
Z-Tyr-Ile-OH
(Biochem Bioscience Inc., Filadelfia PA) en tetrahidrofurano
anhidro (THF) y se enfrió a -10ºC, agregando a continuación 44
\mul de NMN y 52 \mul de cloroformiato de isobutilo bajo
N_{2} y la mezcla se agitó durante 15 min. Se agregó una solución
de Arg(Tos)N(CH_{3})OCH_{3} en DMF
preparada anteriormente al anhídrido mixto de dipéptido
Z-Tyr-Ile-OH y la
mezcla se agitó a -10ºC durante 30 min y, luego, durante la noche a
TA.
Después del procesamiento de la mezcla de
reacción según se ha descrito en el Ejemplo I, el péptido se secó al
vacío y se purificó una pequeña porción por HPLC y se analizó por
MS; el péptido tuvo el peso molecular esperado (781). El péptido
resultante
Z-Tyr-Ile-Arg(Tos)-N(CH_{3})OCH_{3}
se mezcló con 500 \mul de anisol y se sometió a desprotección de
HF por el procedimiento habitual. Después del procesamiento, se
aislaron 169 mg del producto
Tyr-Ile-Arg-N(CH_{3})O(CH_{3})
y se identificó por MS (hallado 493,6, calc. 494). EL péptido
residual se disolvió entonces en 1 ml de HCl 1M y se liofilizó.
Se disolvió
Tyr-Ile-Arg-N(CH_{3})OCH_{3}
\cdot 2 HCl (76 mg) en ACN, se enfrió a 0ºC y se agregaron 13
\mul de piridina, seguidos de 15 \mul de anhídrido acético. La
mezcla se agitó a 0ºC durante 3 h y la compleción de la reacción se
monitorizó por el ensayo de ninhidrina. Después de agitar a TA
durante 8 h, se procesó la mezcla de reacción y el producto,
Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH_{3})OCH_{3},
se caracterizó por MS (hallado 535,6, calc. 535,3).
Se hicieron reaccionar 4,6 g (10,0 mmol) de
Fmoc-Tyr(But)-OH, 2,1 g (10,1
mmol) de diciclohexil-carbodiimida (CDD), 1,26 g (10
ml mmol) de bencilmercaptano y 0,12 g de DMAP en DCM de la forma
descrita por Ho y Ngu (J. Org. Chem. 58:2315 (1993), que se
incorpora a este documento como referencia). Después de procesar, se
aisló
Fmoc-Tyr(But)-S-CH_{2}C_{6}H_{5}
y, tras la reducción del tioéster por agitación con trietilsilano
en presencia de Pd al 10% sobre carbón y purificación por
cromatografía instantánea, se obtuvo un rendimiento de 81% de
Fmoc-Tyr(But)-H. Los ensayos
de RMN y masa del producto fueron acordes con el intervalo
esperado.
A una solución de 0,516 g (1,82 mmol) de
TFA-Ile-(O-alilo) en 2 ml de DMF se
agregaron 0,73 g (1,66 mmol) de
Fmoc-Tyr(But)-OH y 0,209 g
(3,32 mmol) de NaBH_{3}CN en 20 ml de AcOH al 1% en DMF. Después
de 2 h, la mezcla de reacción se procesó y el producto final se
purificó por cromatografía instantánea (acetato etílico:hexano, 35:
65) para dar un producto oleoso que tiene la RMN y MS adecuadas.
(M+H)^{+} hallado 599, calc. 598,7.
A 0,467 g (0,78 mmol) de
Fmoc-Tyr(But)-{\Psi(CH_{2}NH)}-Ile-O-alilo
en 10 ml de DCM se agregaron 89 \mul (1,56 mmol) de HOAC, 20
\mul de trietilamina (TEA) y 0,02 g de
PdCl_{2}(PH_{3})_{2}\cdot231 \mul (0,86
nmol) de Bu_{3}SnH en una porción y la mezcla se agitó durante 1
h a TA. Después del procesamiento habitual de la mezcla de reacción,
el producto se purificó por cromatografía instantánea
(CHCl_{3}-MeOH, 20:1) para dar un rendimiento de
69% (0,319 g) del péptido esperado. (M+H)^{+} hallado 559,
calc. 558. A continuación,
Fmoc-Tyr(But)-{\Psi(CH_{2}NH)}-Ile-OH
se acopló a resina
Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink
usando la metodología de fase sólida descrita en el Ejemplo I. La
resina peptídica terminada
Ac-Tyr(But)-{\Psi(CH_{2}NH)}-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink
se desprotegió y escindió de la forma habitual, según se ha
descrito en el Ejemplo I y se purificó por HPLC sobre una columna
C18.
Se acopló resina de oxima (DeGrado y Kaiser,
J. Org. Chem. 45:1295 (1980) (0,862 g de 0,6 mmol/g) durante
una noche con Boc-Arg(Tos)-OH
en presencia de DIC/HOBt. La resina se lavó con DMF, luego DCM y se
acetiló con anhídrido acético/DIEA (1;1 eq) en DCM. Después de lavar
la resina con DCM, DMF y DCM, se desprotegió con TFA al 25% en DCM
durante 30 min. La resina desprotegida se lavó con DCM, isopropanol
t DCM. Se acopló TFA.Arg(Tos)-OxmR con
Boc-Ile-OH en forma de anhídrido
simétrico (3 eq) en presencia de 1,5 eq de DIEA en DCM. Se repitió
el ciclo de lavado, acetilación y desprotección, anteriormente
descrito. Tras la desprotección, se acopló
Boc-Tyr(2-BrZ)-OH
de manera similar a Ile y, a continuación, la resina peptídica
terminada
Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos=-OxmR
se desprotegió y acetiló para dar
Ac-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR.
La resina peptídica se secó al vacío para dar un rendimiento total
de 0,216 g.
A un tercio de la resina se agregaron 100 \mul
(800 \mumol) de 4-(dimetilamino)piridina en presencia de
60 \mul de ácido acético glacial y 120 \mul de DIEA en 6 ml de
DCM. La resina se agitó durante una noche a TA. Tras la filtración
de la solución de DCM, la resina se lavó con 3 ml de DMF y se
combinaron los lavados con el filtrado de DCM. Después de la
evaporación del disolvente, se desprotegió el péptido residual con
HF/anisol y se procedió de la forma habitual para obtener el
péptido esperado. Se llevó a cabo una MS de
electro-rociadura. (M+H)^{+} hallado 582,3,
calc. 582.
Se sintetizó aldehído a partir de 1 g de
Boc-Ile-N(Me)OMe de la
forma descrita por Fehrentz y Castro (véase antes, 1983). El
aldehído se identificó por CCF y RMN de la forma descrita en la
referencia bibliográfica.
La síntesis de resina tripeptídica se llevó a
cabo por el método general de fase sólida descrito en el Ejemplo
I.
Se acopló
Boc-Ile-H a la resina tripeptídica
Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA
por aminación reductora usando NaBH_{3}CN en DMF que contenía
ácido acético al 1%. El grupo Boc se escindió de la manera habitual
y se acopló Ac-Tyr-OH usando
DIC/HOBt. La resina peptídica terminada (0,7 g) se desprotegió y
escindió a partir de la resina, usando una mezcla de HF/tioanisol.
Se purificaron por HPLC 19 mg del
Ac-Tyr-Ile{\Psi(CH_{2}NH)}-Arg-Leu-Pro-NH_{2}
sobre una columna C18 para dar aproximadamente 5 mg del péptido
esperado con una pureza > 90%. (M+H)^{+} hallado 688,4,
calc. 687,9.
Se acoplaron 0,2 g de SCAL-TG
(0,2 mmol NH_{2}/g) (Patek y Lebl, Tetr. Lett.
32:3891-1894 (1991), que se incorpora a este
documento como referencia) con
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Dab(Boc)-OH,
Fmoc-Ile-OH y
Fmoc-Tyr(But)-OH usando los
métodos descritos en el Ejemplo I. Tras la acetilación del extremo N
y desprotección de la cadena lateral por TFA, la resina peptídica
Ac-Tyr-Ile-Dab-Leu-Ala-ACL-TG
se lavó, neutralizó y trató con PyBroP/NMI 0,3 M en DMF durante 2
h. El péptido terminado se escindió de la resina usando
trifenil-fosfina/(CH_{3})_{3}
SiCl en DCM (3 x 1 h), seguido por TFA al 100% (1 h). Tras el aislamiento del péptido bruto por precipitación de éter dietílico, el péptido se liofilizó a partir de una solución acuosa al 0,1% de TFA. El péptido Ac-Tyr-Ile-Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N)-Leu-Ala-NH_{2} se purificó por HPLC y se caracterizó por MS. (M+H)^{+} hallado 676,4, calc. 676,4.
SiCl en DCM (3 x 1 h), seguido por TFA al 100% (1 h). Tras el aislamiento del péptido bruto por precipitación de éter dietílico, el péptido se liofilizó a partir de una solución acuosa al 0,1% de TFA. El péptido Ac-Tyr-Ile-Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N)-Leu-Ala-NH_{2} se purificó por HPLC y se caracterizó por MS. (M+H)^{+} hallado 676,4, calc. 676,4.
A 1,0 g de resina Rink (0,48 mmol de NH_{2}/g)
se acopló Fmoc-Pal(3)-OH,
Fmoc-Ile-OH y
Fmoc-Tyr(But)-OH usando los
métodos descritos en el Ejemplo I. A 0,25 g de la resina peptídica
terminada,
Fmoc-Tyr(But)-Ile-Pal(3)-Rink,
se agregaron 500 \mul de yoduro metílico (MeI) en DCM y la resina
peptídica se agitó durante 6 h. La resina peptídica terminada,
Fmoc-Tyr(But)-Ile-PalMe(3)-Rink,
se desprotegió, acetiló y escindió de la forma descrita en el
Ejemplo I. Una porción del péptido bruto se purificó por HPLC y el
péptido final se caracterizó por MS.
Se acopló 1 g de SCAL-TG (0,29
mmol de NH_{2}/g( (véase el Ejemplo X) con
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Arg(Pmc)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Tyr(But)-OH y
Fmoc-Glu(OtBu)-OH usando los
métodos descritos en el Ejemplo I. Tras la separación de Fmoc, la
resina peptídica se acetiló y se lavó con DMF y, luego, con DCM. La
resina peptídica,
Ac-Glu(OtBu)-Tyr(But)-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Lys(Boc)-SCAL-TG,
se desprotegió con reactivo K, se lavó, neutralizó y cicló usando
BOP/HOBt/DIEA (5:5:5 eq) en DMF durante 2 h. La finalización del
acoplamiento se monitorizó por el ensayo de ninhidrina según lo ha
descrito Kaiser (Kaiser et al., Anal. Biochem., 34:595
(1970), que se incorpora al documento como referencia). Tras la
ciclación, el péptido se escindió a partir de la resina, se
purificó por HPLC y se caracterizó por MS. (M+H)^{+}
hallado: 844,5, calc. 844,5.
Durante la noche se acopló 1 g de resina de oxima
(véase el Ejemplo VIII) (0,6 mmol de NH_{2}/g) con
Boc-Gly-OH en presencia de DIC/HOBt.
Después del lavado y desprotección de la resina, se acoplaron
Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-Ile-OH y
Boc-Tyr(2-BrZ)-OH
usando los métodos descritos en el Ejemplo VIII. Un tercio de la
resina peptídica, resina
Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-Gly-oxima,
se desprotegió y acopló con Boc-Gly por DIC/HOBt-
La resina peptídica terminada se desprotegió, neutralizó y cicló
durante una noche en DMF que contenía ácido acético al 1%. La resina
se filtró y lavó (DMF), el filtrado se combinó y el disolvente
orgánico se separó por evaporación al vacío. El péptido residual se
desprotegió (HF/anisol), liofilizó, se purificó por HPLC y se
caracterizó por MS. (M+H)^{+} hallado 547,8, calc.
547,8.
Para la síntesis de glicinas
N-sustituidas, se utilizó el procedimiento de
Zuckermann et al. (J. Am. Chem. Soc. 114:10646 (1992), que se
incorpora a este documento como referencia). Se acopló 1 g de
SCAL-TG (0,29 mmol de NH_{2}/g) (véase el Ejemplo
X) con ácido bromoacético a través de un anhídrido simétrico en
DCM/DMF. Cada reacción de acoplamiento se repitió dos veces. A la
resina
Br-CH_{2}CO-SCAL-TG
se agregó
Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}NH_{2}
en DMSO y la resina se agitó durante 2 h. Tras la desprotección, se
repitió el proceso alternando el acoplamiento de
Br-CH_{2}COOH a la resina y la reacción de la
resina de ácido bromoacético con la amina apropiada. La resina
(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(Boc-NH-(CH_{2})_{3})Gly-SCAL-TG
se acetiló con anhídrido acético/DIEA/NMI (1:1:0,25) en DMF durante
una noche. Tras la desprotección del grupo Boc, la resina,
Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-aminopropil)Gly-SCAL-TG,
se trató con hidrocloruro de carboxiamidinopirazol 1,8 M
(Bernatowicz et al., J. Org. Chem.,
57:2497-2502 (1992), que se incorpora a este
documento como referencia) en presencia de DIEA (1:1) en DMF durante
3 h a TA. La finalización de la guanilación se monitorizó por el
ensayo de Kaiser. Se llevó a cabo la escisión y el procesamiento
del péptido resultante de la forma descrita en el Ejemplo X y se
analizó por MS. (M+H)^{+} hallado 502,3, calc. 502,3.
El tetrapéptido protegido de partida,
Fmoc-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Ala-Rink,
se preparó por la estrategia de Fmoc sobre resina Rink (véase el
Ejemplo I). Tras la desprotección de Fmoc de la resina peptídica,
se acoplaron consecutivamente
Fmoc-Ida(OMe)-OH (3 eq; DIC,
HOBt) y Fmoc-Ser(tBu)-OH (7
eq; anhídrido simétrico). La desprotección final y el cierre
espontáneo del anillo se llevaron a cabo de forma simultánea
mediante exposición durante 1 h a piperidina al 50%/DMF. Después de
las etapas de lavado, el péptido final se escindió y desprotegió
usando TFA/tioanisol/H_{2}O (95:2,5:2,5). El péptido resultante
se procesó de la forma anteriormente descrita y se analizó por HPLC
(>95%) y por MS. (M+H)^{+} hallado 655,4, calc.
655,38.
Se acoplaron 0,2 g de resina Rink con
Fmoc-Arg(Pmc)-OH,
Fmoc-Ile-OH, seguido de la retirada
de la protección de Fmoc (véase el Ejemplo I). A la resina
peptídica, Ile-Arg(Pmc)-Rink,
se acopló
Ph-C(NOCH_{2}Ph)-COOH
usando el protocolo DIC/HOBt anteriormente descrito. La resina
peptídica terminada,
Ph-C(NOCH_{2}Ph)-CO-Ile-Arg(Pm)-Rink,
se procesó de la forma descrita en el Ejemplo I y se analizó por
MS. (M+H)^{+} hallado 524,3, calc. 524,6.
La síntesis se llevó a cabo sobre 100 mg de
resina Rink (0,48 mmol/g) de acuerdo con el método del Ejemplo I,
usando los siguientes derivados de aminoácidos:
Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Arg(Pmc)-OH,
Fmoc-Ile-OH y
Fmoc-pAph-(Fmoc)-OH (mezcla
racémica). La escisión y aislamiento del péptido se llevaron a cabo
de la forma descrita en el Ejemplo I. Se aislaron los dos péptidos
diastereoisómeros por RP-HPLC y se identificaron
por MS. (M+H)^{+} hallado 754,4, calc. 754,5.
La secuencia peptídica se construyó sobre 0,25
de resina
Fmoc-Arg(Pmc)-Sasrin (0,5
mmol de NH_{2}/g de resina; Bachem Bioscience), utilizando el
método descrito en el Ejemplo I. Después de la desprotección y
acetilación del Fmoc N-terminal, el péptido
protegido se escindió de la resina por escisión reductora como
alcohol C-terminal (Mergler et al.,
Peptides, págs. 177-178 (eds. Schneider y
Eberle; Leiden 1993), que se incorpora a este documento como
referencia). La resina peptídica se agitó con una solución de
NaBH_{4} (4 eq) en 2 ml de THF: EtOH (6:1) durante 24 h. Tras la
reacción de escisión, la resina se lavó con DCM y, entonces, se
combinaron y liofilizaron la solución de escisión y los lavados. El
péptido liofilizado se desprotegió por tratamiento con
TFA/agua/tioanisol (90:5:5) durante 2 h y se aisló por
precipitación. El péptido purificado por HPLC se analizó por MS.
(M+H)^{+} hallado 505,3, calc. 505, 3.
El alcohol peptídico protegido se preparó de la
forma descrita en el Ejemplo XVIII. Se disolvieron 10 mg de
material bruto en DCM/ACN y se trató con anhídrido acético (2 mmol)
en presencia de TEA (2,4 mmol) durante 20 min. La solución se
filtró, se evaporó y el péptido se desprotegió de la forma
anteriormente descrita. El péptido purificado por HPLC se analizó
por MS. (M+H)^{+} hallado 547,3, calc. 547,3.
Se funcionalizó 1 g de resina "TENTAGEL S"
NH2 (0,28 mmol de NH_{2}/g de resina; Rapp Polymer; Tubinga,
Alemania) con enlazador SCAAL de la forma descrita en el Ejemplo X
y se acoplaron los siguientes aminoácidos:
Fmoc-Pro-OH;
Fmoc-Leu-OH;
Fmoc-Orn(Boc)-OH y
Fmoc-Chg-OH. La resina peptídica
Fmoc-Chg-Orn(Boc)-Leu-Pro-SCAL-TG
se trató con TFA al 50% en DCM (1 lavado durante 1 min y, a
continuación, 1 lavado durante 30 min), se lavó 3 veces con DCM, se
neutralizó con DIEA al 5% en DCM (2 x 30 seg) y 2 veces con DCM. A
la resina peptídica se agregó una solución de 1,5 g de hidrocloruro
de acetimidato etílico (Aldrich) en 4 ml 1:1 piridina: DIEA y 3 ml
de DMF y el acoplamiento se prosiguió durante la noche a TA.
La resina peptídica,
Fmoc-Chg-Orn(C(NH)CH_{3})-Leu-Pro-SCAL-TG,
se desprotegió con piperidina al 20% en DMF durante 12 min, se lavó
4 veces con DMF, 4 veces con DCM y se acoplo
Fmoc-Phe(pNH-BOC)-OH
usando acoplamiento de DIC/HOBt en DMF. La desprotección de Fmoc y
la acetilación con anhídrido acético: piridina (1:1) durante 20 min
dio la resina peptídica,
Ac-Phe(pNH-BOC)-Chg-Orn(C(NH)CH_{3})-Leu-Pro-SCAL-TG.
La reducción del enlazador SCAL y la escisión del péptido, seguida
de purificación por HPLC del producto bruto dio el compuesto
esperado. (M+H)^{+} hallado 740,2, calc. 740,48.
Se acoplaron 0,5 g de SCAL-TG
(0,32 mmol de NH_{2}/g) con
Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Dap(Boc)-OH y
Fmoc-Ch-OH. Se separó el grupo Boc
de la cadena lateral usando TFA al 50% durante 20 min y la resina
peptídica se neutralizó lavando con DIEA/DCM al 10%. El grupo
aminoácido libre de la cadena lateral se transformó en el grupo
dimetil-amidinio por tratamiento de la resina
peptídica con PyBroP 0,3 M/NMI en DMF dante 20 min. La
desprotección del grupo Fmoc con piperidina al 50%/DMF durante 60
min dio como resultado el intercambio del grupo
dimetil-amidinio por el de piperidinio en la cadena
lateral de Dap. La secuencia se completó mediante el acoplamiento
de Fmoc-Phe(Boc)-OH y
desprotección del grupo Fmoc. El péptido se acetiló y escindió de
la forma descrita en el Ejemplo X. El péptido purificado por HPLC se
analizó por MS. (M+H)^{+} hallado 752,4, calc. 752,4.
H-Phe(pCN)-OH
racémico se sintetizó según el método de malonato de acetamida
(Wagner et al., Patente de la RDA nº 155.954, emitida el 21
de julio de 1982; re-examinada el 9 de noviembre de
1988, que se incorpora a este documento como referencia). El
Ac-pAph-OH racémico se sintetizó por
conversión del grupo ciano por amonolísis del correspondiente
tioimidato metílico (ofrecido por reacción del grupo ciano con
sulfuro de hidrógeno) y subsiguiente metilación con MeI.
Se utilizaron 1 g de resina "TENTAGEL"
(sustitución = 0,21 mmol de NH_{2}/g de resina) y enlazador Knorr
(Bernatowicz et al., Tetr. Lett. 30:4645 (1989), que se
incorpora a este documento como referencia) para la síntesis del
péptido. El dipéptido,
Fmoc-Chg-Pal-Knorr-TG,
se ensambló de la forma descrita en el Ejemplo I.
Subsiguientemente, se metiló la 3-piridinalanina con
1 ml de MeI en DCM durante una noche. Después de la desprotección
de Fmoc, se acopló Ac-pAph-OH usando
el método DIC/HOBt y el péptido se procesó de la forma descrita en
el Ejemplo I. (M+H)^{+}
hallado 550,3, calc. 550,31.
hallado 550,3, calc. 550,31.
El pentapéptido,
Ac-Tyr(But)-Chg-Phe(pCN)-Leu-Pro-Knorr-TG,
se ensambló sobre 0,4 g de "TENTAGEL" (sustitución = 0,2 mmol
de NH_{2}/g de resina) de la forma descrita en el Ejemplo I. La
resina se trató durante una noche en una jeringa cerrada con 8 ml
de piridina/trietilamina (75:25) saturada con H_{2}S. La tioamida
fijada a la resina se metiló usando 0,5 ml de MeI en 8 ml de
acetona durante 30 min a 50ºC y, seguidamente, se lavó con acetona
y metanol. La tioimida metílica se hizo reaccionar con acetato de
amonio en metanol durante 3 h a 55ºC para obtener el compuesto
final, que se escindió de la resina y se purificó de la forma
anteriormente descrita. (M+H)^{+} hallado 761,4, calc.
760,43.
Se sintetizó
Ac-DL-Phe(pCN)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}
(péptido bruto) sobre 1 g de resina Rink (0,6 mmol de NH_{2}/g de
resina), de la forma descrita en el Ejemplo I. Se disolvieron 125
mg de péptido bruto en 50 ml de MeOH y se agregó una suspensión de
0,5 ml de Ni Raney (Aldrich). La mezcla del péptido y el catalizador
se hidrogenó a 35 psi durante 4 h a TA. El catalizador se filtró y
la solución se evaporó a sequedad. El residuo se liofilizó a partir
de TFA acuoso al 0,1% que contenía ACN al 30%. El producto bruto
seco se purificó por HPLC y se analizó por MS.
(M+H)^{+}
hallado 741,4, calc. 741,7.
hallado 741,4, calc. 741,7.
Se mezclaron 21,1 mg de péptido bruto preparado
de la forma descrita en el Ejemplo XXIV con 60,3 mg de NH_{2}OH
\cdot HCl (Aldrich) en 1,5 ml de MeOH, 0,7 ml de piridina y 0,5
ml de TEA. La mezcla se agitó durante 72 h a TA y, a continuación,
el disolvente y los materiales volátiles se evaporaron al vacío. El
péptido se purificó por HPLC y se analizó por MS.
(M+H)^{+} hallado 770,4, calc. 770,3.
Sólo para información
técnica
Se prepararon compuestos
A1-A2-B, es decir, compuestos
A1-A2-(A3)_{m}-B, en los
que m es 0, de la forma descrita en la Figura 3. En pocas palabras,
el acoplamiento de
N-acetil-4-cianofenilalanina
racémica con el éster metílico de
L-ciclohexilglicina,
(H-Chg-OMe), dio una mezcla de dos
dipéptidos diastereoisómeros, que se separaron por
cromatografía.
N-acetil-4-cianofenilalanina
racémica se resolvió parcialmente mediante la formación de una sal
con el éster metílico de L-ciclohexilglicina. La
D,L-sal menos soluble cristalizó fácilmente y el
acoplamiento subsiguiente proporcionó
Ac-f(pCN)-Chg-OMe
en forma sustancialmente pura. Los "licores madre" se
enriquecieron en la L,L-sal y el acoplamiento
condujo a
Ac-F(pCN)-Chg-OMe
bruto, que se purificó adicionalmente por cromatografía sobre gel
de sílice. Estos ésteres dipeptídicos se hidrolizaron a los
correspondientes ácidos usando hidróxido de litio en metanol/agua a
TA. Ambos ácidos dipeptídicos se convirtieron en amidas sustituidas
por acoplamiento convencional con las aminas apropiadas, RNH_{2}.
Las aminas que no estuvieron disponibles en el comercio se
prepararon usando métodos químicos convencionales.
La conversión de los grupos ciano a las
correspondientes amidinas se llevó a cabo usando métodos químicos
convencionales, ya sea a través de la tioamida y tioimidato
metílico, o por hidrogenación de la correspondiente amidoxima
(Ejemplo XXV). Esta última se obtuvo haciendo reaccionar el nitrilo
con hidroxilamina. Los ejemplos descritos a continuación ilustran
la preparación de los compuestos del título por estos métodos
seleccionados. Se reconoce que los compuestos de la invención se
pueden preparar usando otros métodos diversos y que los
procedimientos utilizados en este documento como ejemplo se han
seleccionado por comodidad.
La síntesis de
Ac-pAph-Chg-NHCH_{2}-(4-metilpiridinio)
se llevó a cabo por conversión de
Ac-F(pCN)-Chg-NHC
H_{2}-(4-piridilo), usando los métodos descritos en el Ejemplo XXII. El compuesto final se purificó por HPLC de la forma descrita en el Ejemplo I. Análisis de MS: (M+H)^{+} hallado 493,3, calc. 493,29.
H_{2}-(4-piridilo), usando los métodos descritos en el Ejemplo XXII. El compuesto final se purificó por HPLC de la forma descrita en el Ejemplo I. Análisis de MS: (M+H)^{+} hallado 493,3, calc. 493,29.
El material de partida se preparó de la forma
siguiente:
a) Ac-(D,L)-F(pCN), 2,32 g
(10 mmol) se disolvió en 75 ml de etanol por calentamiento. Se
agregó éster metílico de L-ciclohexilglicina (1,75
g, 10 mmol) y la mezcla se agitó durante 2 h a TA. Los cristales
precipitados se separaron por filtración y se secaron para dar 1,55
g de D,L-sal. El filtrado se evaporó parcialmente y
se diluyó con éter. Los cristales separados se recogieron y secaron
para dejar 2,1 g de L,L-sal contaminada con
D,L-sal. La L,L-sal bruta se combinó
con 20 ml de DMF, 0,71 g de HOBt y 1,18 g de DCC. La mezcla se
agitó durante 24 h a TA. La urea se separó por filtración y el
filtrado se evaporó. El residuo se disolvió en cloruro de metileno y
la solución se lavó con HCl 1N y bicarbonato sódico acuoso
saturado. La capa orgánica se secó y evaporó. El residuo se
cromatografió sobre 60 g de gel de sílice usando acetona al 20% (en
volumen) en cloruro de metileno para elución. La cristalización de
las fracciones limpias combinadas a partir de cloruro de
metileno/éter/hexano proporcionó 1,6 g de
AC-F(pCN)-Chg-OMe
en forma de cristales incoloros con un punto de fusión (p.f.) de
178-180ºC.
b) Una mezcla de 1,93 g (5 mmol) de
Ac-F(pCN)-Chg-OMe
(del Ejemplo XXVII a anterior), 100 ml de metanol, 10 ml de agua y
0,75 g de hidróxido de litio hidratado se agitó bajo nitrógeno
durante 24 h a TA. Tras la adición de 2 ml de ácido acético, los
disolventes se evaporaron y el residuo se dividió entre cloruro de
metileno que contenía isopropanol al 20% y HCl 1N. La capa orgánica
se secó y evaporó y el residuo cristalizó a partir de cloruro de
metileno/éter/hexano para dejar 1,6 g de
Ac-F(pCN)-Chg-OH
en forma de cristales incoloros con un p.f. de
216-218ºC.
c) Una mezcla de 150 mg (0,4 mmol) de
Ac-F(pCN)-Chg-OH
(anterior), 65 mg (0,6 mmol) de
4-aminometilpiridina, 124 mg (0,6 mmol) de DCC, 60
mg (0,44 mmol) de HOBt y 5 ml de DMF se agitó durante 20 h a TA. La
urea se separó por filtración y el filtrado se evaporó. El residuo
se suspendió con metanol y el producto insoluble se recogió por
filtración para dejar 140 mg de
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH_{2}-(4-piridilo).
Se obtuvo una muestra analítica por cromatografía sobre gel de
sílice usando acetonitrilo:cloruro de metileno:metanol (4:5:1). El
sólido cristalino tuvo un p.f. > 250ºC.
Este compuesto se preparó haciendo reaccionar 150
mg de
Ac-f(pCN)-Chg-NHCH_{2}-(4-piridilo)
(véase antes) con sulfuro de hidrógeno, luego con yoduro de metilo
y acetato de amonio. El producto se aisló por HPLC en forma de
material homogéneo. Análisis de MS: (M+H)^{+} hallado
493,3, calc. 493,29.
El material de partida se preparó de la forma
siguiente:
a) Una mezcla de 2,8 g de
Ac-f(pCN), éster metílico de
(L)-ciclohexilglicina, 940 mg de HOBt, 1,57 g de
DCC y 30 ml de DMF se agitó durante 2 días a TA. La urea se separó
por filtración y el filtrado se evaporó. El residuo se disolvió en
cloruro de metileno y la solución se lavó con HCl 1N y carbonato
sódico acuoso al 10%. La fase orgánica se secó y evaporó. La
cristalización del residuo a partir de cloruro de
metileno/éter/hexano dio 2,05 g de
Ac-f(pCN)-Chg-OMe
incoloro, con un p.f. de 181-183ºC.
b) Hidrólisis de 1,93 g de
Ac-f(pCN)-Chg-OMe
(anterior) con 0,75 g de hidróxido de litio monohidratado en 100 ml
de metanol y 10 ml de agua. Se trató de la forma descrita para el
L,L-isómero del Ejemplo XXVII, anterior, cristalizó
a partir del cloruro de metileno/éter, para producir 1,65 g de
Ac-f(pCN)-Chg-OH,
con un p.f. de 180-182ºC.
c) Una mezcla de 225 mg de
Ac-f(pCN)-Chg-OH
(anterior), 100 mg de 4-aminometilpiridina, 90 mg
de HOBt, 180 mg de DCC y 6 ml de DMF se agitó durante un fin de
semana a TA. La urea se separó por filtración y el filtrado se
evaporó. El residuo se agitó con metanol y se separaron los sólidos
por filtración para dejar 190 mg de
Ac-f(pCN)-Chg-NHCH_{2}-(4-piridilo)
cristalino, con un p.f.> 250ºC.
Una mezcla de 125 mg de
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH_{2}CH_{2}(3-piridilo),
2 ml de DMSO, 10 ml de piridina y 5 ml de trietilamina se saturó
con sulfuro de hidrógeno mientras se enfrió en hielo/agua. Después
de agitar en un vial sellado durante la noche a TA, los disolventes
se evaporaron y el residuo se recogió con acetona/éter y se secó
para dejar 125 mg de la tioamida. Este material se combinó con 2 ml
de DMSO, 5 ml de acetona y 0,75 ml de yoduro metílico, y la mezcla
se agitó en un vial sellado durante la noche a TA. Tras la dilución
con tolueno, los disolventes se evaporaron y el residuo se agitó
con éter. El éter se decantó, se sustituyó por éter fresco y se
continuó agitando hasta que el material resinoso solidificó;
seguidamente, el éter remanente se separó por filtración y el
residuo se
secó.
secó.
El residuo resultante se disolvió en 20 ml de
metanol y se trató con 0,3 ml de ácido acético y 0,4 g de acetato
de amonio. La mezcla se calentó a 55-60ºC durante
2,5 h y, a continuación, se evaporaron los disolventes. El residuo
se disolvió en agua/ACN/TFA y se liofilizó. El producto bruto se
purificó por HPLC. Análisis de MS: (M+H)^{+} hallado
507,3, calc. 507,31.
El material de partida se obtuvo de la forma
siguiente. Una mezcla de 150 mg (0,4 mmol) de
Ac-F(pCN)-Chg-OH,
120 mg (0,6 mmol) de dihidrocloruro de
2-(3-piridil)etilamina, 125 mg de DCC, 60 mg
de HOBt, 0,5 ml de diisopropiletilamina y 10 ml de DMF se agitó
durante 24 h a TA. Tras la evaporación del disolvente, el residuo
se agitó con metanol y el producto insoluble se recogió por
filtración y se lavó con metanol y éter para dejar 110 mg de
cristales incoloros. El filtrado se evaporó y el residuo se
disolvió en cloruro de metileno/isopropanol. Esta solución se lavó
con carbonato sódico acuoso al 10%, se secó y evaporó. El residuo
se cromatografió sobre 14 g de gel de sílice usando cloruro de
metileno:acetona:metanol (5:4:1) para dar 40 mg de
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH_{2}CH_{2}(3-piridilo),
con un p.f. de 265-268ºC.
b) Dihidrocloruro de
2-(3-piridil)etilamina se preparó de la forma
siguiente. Una mezcla de 1,3 g de
3-piridil-acetonitrilo,
aproximadamente 3 g de níquel Raney y 30 ml de metanol que contenía
amoniaco al 10% en volumen se hidrogenó a 35 psi durante 20 horas,
usando un hidrogenador de Parr. El catalizador se separó por
filtración sobre celita y el filtrado se evaporó. El residuo se
disolvió en cloruro de metileno, se secó con sulfato de magnesio,
se filtró y evaporó. El producto se convirtió en el dihidrocloruro
usando cloruro de hidrógeno en dioxano. La cristalización a partir
de metanol/éter dio 1,4 g de cristales incoloros, con un p.f. de
145-148ºC.
Este compuesto se preparó usando métodos
descritos anteriormente, haciendo reaccionar
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH_{2}
CH_{2}(4-piridilo) con sulfuro de hidrógeno, seguido de metilación con yoduro metílico y reacción con acetato de amonio. El producto bruto se purificó por HPLC. Análisis de MS: (M+H)^{+} hallado 507,3, calc. 507,31.
CH_{2}(4-piridilo) con sulfuro de hidrógeno, seguido de metilación con yoduro metílico y reacción con acetato de amonio. El producto bruto se purificó por HPLC. Análisis de MS: (M+H)^{+} hallado 507,3, calc. 507,31.
El material de partida se obtuvo acoplando
Ac-F(pCN)-Chg-OH
con dihidrocloruro de 2-(4-piridil)etilamina
de la forma descrita en el Ejemplo XXIX anterior.
Dihidrocloruro de
2-(4-piridil)etilamina se preparó de la forma
descrita para el dihidrocloruro de
2-(3-piridil)etilamina (anterior) por
hidrogenación de
piridil-4-acetonitrilo sobre níquel
Raney en presencia de amoniaco. El dihidrocloruro tuvo un p.f. de
220ºC.
Este compuesto se preparó usando métodos
similares a los descritos anteriormente para tratar
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH_{2}(4-cianofenilo)
con sulfuro de hidrógeno en DMSO, piridina y trietilamina. La
bis-tioamida obtenida se metiló con yoduro metílico
en DMSO/acetona, a continuación se hizo reaccionar con acetato de
amonio de la forma anteriormente descrita. El producto bruto se
purificó por HPLC. Análisis de MS: (M+H)^{+} hallado
520,3, calc. 520,30.
El material de partida se obtuvo del modo
siguiente. Una mezcla de 75 mg (0,2 mmol) de
Ac-F(pCN)-Chg-OH,
50 mg (0,3 mmol) de hidrocloruro de
(4-cianofenil)metilamina, 62 mg de DCC, 30 mg
de HOBt, 0,2 ml de DIEA y 2 ml de DMF se agitó durante 24 h a TA.
Después de filtrar, el disolvente se evaporó y el residuo se
disolvió en cloruro de metileno que contenía isopropanol al 20%. La
solución se lavó con HCl 1N y carbonato sódico acuoso al 10%, a
continuación se secó y evaporó. El residuo se agitó con una pequeña
cantidad de metanol/agua y los sólidos separados se recogieron y
secaron para dejar 80 mg de
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH_{2}(4-cianofenilo).
El hidrocloruro de
(4-cianofenil)metilamina se preparó de la
forma siguiente. Una mezcla de 2 g (10 mmol) de
\alpha-bromo-p-tolunitrilo,
2 g (10,8 mmol) de ftalamida de potasio y 30 ml de DMF se calentó a
reflujo durante 1 min. Después de enfriar, la mezcla se acidificó
con ácido acético y se diluyó con agua para cristalizar el
producto. Los cristales se filtraron, lavaron con agua y se secaron
para dejar 2,24 g de
N-(4-cianofenil)metilftalamida con un p.f. de
182-184ºC.
Se suspendieron 1,5 g de
N-(4-cianofenil)-metilftalamida en
50 ml de metanol en ebullición y se trató con 1 ml de hidracina
hidrato. Después de 5 min se obtuvo una solución transparente. Se
evaporó el metanol y el residuo se trató con HCl 2N. La suspensión
se calentó a ebullición y, seguidamente, se enfrió sobre hielo. Los
sólidos se separaron por filtración y el filtrado se evaporó. El
residuo se disolvió en agua. La solución se calentó nuevamente a
ebullición, se enfrió y filtró. El filtrado se alcalinizó con
hidróxido sódico y se extrajo con cloruro de metileno que contenía
isopropanol. La fase orgánica se secó y evaporó y el residuo se
convirtió en la sal hidrocloruro, cristalizó a partir de
isopropanol/éter y dio 0,43 g de cristales incoloros con un p.f.
>260ºC.
El hidrocloruro de
(3-cianofenil)metilamina se preparó haciendo
reaccionar
\alpha-bromo-m-tolunitrilo
con ftalimida de potasio para dar
N-(3-cianofenil)metilftalimida con un p.f. de
147-148ºC. La reacción se este material con el
hidrocloruro como se ha señalado anteriormente, dio
(3-cianofenil)metilamina con un p.f. de
223-226ºC.
Este compuesto se preparó usando métodos como los
anteriormente descritos. Se trató
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH_{2}(3-cianofenilo)
con sulfuro de hidrógeno en DMSO, piridina y trietilamina. La
bis-tioamida obtenida se metiló con yoduro metílico
en DMSO/acetona y, a continuación, se hizo reaccionar con acetato
de amonio de la forma anteriormente descrita. El producto bruto se
purificó por HPLC. Análisis de MS: (M+H)^{+} hallado
520,3, calc. 520,30.
El material de partida se obtuvo de la forma
siguiente. Una mezcla de 300 mg (0,8 mmol) de
Ac-F(pCN)-Chg-OH,
200 mg (1,2 mmol) de hidrocloruro de (3-
cianofenil)metilamina, 250 mg de DCC, 120 mg de HOBt, 0,8 ml
de DIEA y 10 ml de DMF se agitó durante 24 h a TA. Después de
filtrar, el disolvente se evaporó y el residuo se disolvió en un
gran volumen de cloruro de metileno que contenía isopropanol al
20%. La solución se lavó con HCl 1N y carbonato sódico acuoso al
10%, se secó y evaporó. El residuo se agitó con isopropanol/éter y
los sólidos separados se recogieron y secaron para dejar 400 mg de
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH_{2}(3-cianofenilo).
Una mezcla de diastereoisómeros del compuesto del
título se preparó haciendo reaccionar una mezcla de dos
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-piridilo)
diastereoisómeros con sulfuro de hidrógeno, luego con MeI y acetato
de amonio. Los diastereoisómeros se separaron por HPLC. Análisis de
MS: (M+H)^{+} hallado 507,3, calc. 507,31.
El material de partida se preparó de la forma
siguiente. Una mezcla de 150 mg (0,4 mmol) de
Ac-F(pCN)-Chg-OH,
120 mg (0,6 mmol) de dihidrocloruro de
1-(4-piridil)etilamina racémico, 125 mg de
DCC, 60 mg de HOBt, 0,5 ml de DIEA y 10 ml de DMF se agitó durante
24 h a TA. Después de filtrar, el disolvente se evaporó y el
residuo se disolvió en un gran volumen de cloruro de metileno que
contenía isopropanol al 20%. La solución se lavó con carbonato
sódico acuoso al 10%, se secó y evaporó. El residuo se agitó con
isopropanol/éter y los sólidos separados se recogieron y secaron
para dejar 125 mg de
Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-piridilo)
en forma de mezcla de diastereoisómeros.
Dihidrocloruro de
1-(4-piridil)etilamina racémico se preparó de
la forma siguiente. Una mezcla de 1 g de
4-acetilpiridin-N-óxido, 2 g de
níquel Raney y 30 ml de metanol que contenía amoniaco al 20% (en
volumen) se hidrogenó durante 24 h a 30 psi. El catalizador se
separó por filtración sobre celita y el filtrado se evaporó. El
residuo se disolvió en cloruro de metileno, se filtró y evaporó. El
residuo se disolvió en isopropanol y se trató con cloruro de
hidrógeno en éter. Los cristales precipitados se recogieron y
secaron para producir 0,9 g de material con un p.f. de
198-200ºC.
La síntesis de ácido
2-(p-cianobencil)malónico se logró por un
procedimiento modificado (véase Pinori et al., Patente de
EE.UU. Nº 5.061.911 (octubre 1991), que se incorpora a este
documento como referencia). A una solución de 3,8 g de
2,2-dimetil-1,3-dioxano-4,6-diona
(ácido de Maldrum; Aldrich) y 1,12 g de NaCNBH_{3} (Aldrich) en 25
ml de DMF se agregaron 2,3 g de p-cianobenzaldehído
(Aldrich) y la mezcla se agitó durante 2 h a TA. A la mezcla de
reacción se agregaron 400 ml de agua y la solución se enfrió en un
baño de hielo y el pH se ajustó a 3,8-4 por adición
gota a gota de una solución acuosa de HCl al 20%. El precipitado
blanco se recogió en un embudo de Buchner de vidrio centrado y se
lavó con agua fría. El precipitado recogido se secó al vacío sobre
CaCl_{2} durante 24 h. La RMN del sólido recogido en CDCl_{3}
indicó el compuesto
2,2-dimetil-5-(p-ciano)bencil-1,3-dioxano-4,6-diona
(DCBD), que posee un p.f. de 135-142ºC y una R_{f}
de 0,45 (CHCl_{3}: MeOH:ácido acético; 95:4:1).
A 1,5 ml de diisopropilamina en 45 ml de DCM se
agregaron 3 ml de
N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA)
y la reacción se sometió a reflujo en un matraz de reacción equipado
con un agitador magnético y un condensador, guardado con un tubo de
CaCl_{2} durante 7 h. Después de enfriar la solución a TA, se
agregaron 0,8 g de DCBD y la mezcla de reacción se sometió a reflujo
durante 3 h (hasta finalizar la conversión al producto, según indicó
la CCF). Después de enfriar la mezcla de reacción, se agregaron con
cuidado 5-8 ml de solución acuosa de HCl al 20%.
Tras la separación de las capas, la capa orgánica se lavó con agua,
se secó (MgSO_{4}) y evaporó a sequedad para dar un producto
limpio que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
La identificación de los compuestos se logró por RMN en CDCl_{3}
y MS.
La resina peptídica
DIPA(m)Phe(pCN)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink
se sintetizó según el método descrito en el Ejemplo I. La resina
peptídica resultante se trató con hidrocloruro de hidroxilamina del
modo descrito en el Ejemplo XXV para dar
DIPA(m)Phe(pC(NOH)NH_{2})-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink.
Tras la escisión del péptido de la resina y liofilización, el
producto bruto (120 mg) se disolvió en 80 ml de MeOH y 10 ml de
solución saturada de NH_{2} en MeOH. A la mezcla de reacción se
agregaron 0,25 ml de suspensión de níquel Raney (Aldrich) y la
mezcla se hidrogenó a 45 psi durante 24 h. El catalizador se filtró
y el disolvente se evaporó a sequedad, y el residuo se liofilizó
desde una solución 1:1 de TFA al 0,1% en solución acuosa y ACN. El
péptido bruto se purificó por HPLC y el compuesto se identificó por
MS. (M+H)^{+} hallado 824,2, calc. 824,5.
| Nº | Compuesto | Calc. | (Hallado) |
| 1. | Ac-(2-CF_{3}Bzl)-Y-I-R-L-P-NH_{2} | 860,5 | (860,3) |
| 2. | Ac-(CH_{3}CH_{2}CH_{2}CH(CH_{3})CH_{2})-Y-I-R-L-P-NH_{2} | 786,5 | (786,5) |
| 3. | CH_{2}OCO-Y-I-R-L-P-NH_{2} | 742,4 | (742,4) |
| 4. | Ac-Y-Chg-R-NH_{2} | 518,2 | (518,2) |
| 5. | Nal(2)-Cha-R-D(O-Alilo)-NH_{2} | 679,4 | (679,4) |
| 6. | y-Tle-R-Nle-P-NH_{2} | 660,4 | (660,4) |
| 7. | Phe(pF)-I-R-L-P-NH | 662,3 | (662,3) |
| 8. | Ac-(D)Tic(OH)-I-R-L-P-NH_{2} | 714,4 | (714,4) |
| 9. | Ac-Phe(pCN)-I-R-L-P-NH_{2} | 711,4 | (711,4) |
| 10. | Ac-Phe(pCONH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2} | 755,4 | (755,4) |
| 11. | y-Chg-R-NH_{2} | 476,2 | (476,2) |
| 12. | Ac_W-Chg-R-L-P-NH_{2} | 751,3 | (751,3) |
| 13. | Ac-Y-I-R-NH-CH(CH_{3})-(CH_{2})_{2}-CH_{3} | 562,3 | (562,3) |
| 14. | Ac-Y-Pgl-R-L-P-NH_{2} | 722,2 | (722,2) |
| 15. | Ac-Y-Chg-R-Ina-NH_{2} | 629,4 | (629,4) |
| 16. | Ac-Tza-Chg-R-NH_{2} | 509,3 | (509,3) |
| 17. | Ac-Y-Chg-R-Pip-NH_{2} | 629,4 | (629,4) |
| 18. | Ac-Phe(pNH_{2})-Chg-R-NH_{2} | 517,2 | (517,2) |
| 19. | Ac-(Bzl)G-(Chx)Gly-(3-guanidinopropil)G-NH_{2} | 502,3 | (502,3) |
| 20. | Ac-Y-Chg-R-ol. acetato | 547,3 | (547,3) |
| 21. | Ac-Y-Chg-R-OCH_{3} | 533,3 | (533,3) |
| 22. | Ac-Y-Chg-R-OH | 519,3 | (519,3) |
| 23. | Bz-Y-Chg-R-NH_{2} | 532,2 | (532,2) |
Se midió la inhibición de la actividad del factor
Xa. Sin embargo, cualquier medición de actividad biológica tal como
el efecto de un péptido YIR de la invención sobre la coagulación,
potencia in vivo, semivida in vivo, biodisponibilidad
oral, potencia oral o semivida se puede determinar como medida de la
actividad de un péptido de la invención.
Se muestran muchos cambios específicos. Por
ejemplo, se combinaron dos cambios para demostrar la obtención de
una mejora adicional de actividad combinando cambios, incluso cuando
los cambios simples originales no mejoraron de forma significativa
la actividad. Cambios químicos únicos produjeron
Ac-Y-I-R-L-P,
que tuvo una K_{i} = 0,49 \muM e
(iBu)Y-I-R-L-P.
que tuvo una K_{i} = 2,6 \muM, comparados con el compuesto
original,
Y-I-R-L-P
(K_{i} = 5,3 \muM). La combinación de estos dos cambios produjo
Ac-(iBu)Y-I-R-L-P-NH_{2},
que tuvo una K_{i} = 0,04 \muM. De esta forma, estos resultados
ponen de manifiesto que un péptido de la invención que tenga una
combinación de dos cambios químicos pueden tener una actividad
inhibitoria sustancialmente incrementada del factor Xa, en
comparación con los análogos con cambios únicos, aun cuando un
compuesto original tal como
(iBu)Y-I-R-L-P-NH_{2}
no tuvo una actividad significativamente mejorada en comparación
con el
Y-I-R-L-P-NH_{2}
parental.
La Tabla 3 ejemplifica modificaciones químicas
específicas que dieron como resultado compuestos con valores de
K_{i} entre 100 \muM y 1 pM para la inhibición del factor
Xa.
Para información técnica, la tabla incluye
también compuestos que no corresponden a las fórmulas genéricas de
las reivindicaciones.
La capacidad de un compuesto de la invención para
inhibir el factor Xa, trombina, plasmina, elastasa y tripsina se
evaluó determinando la concentración de péptido YIR que inhibe la
actividad enzimática en 50% (CI_{50}). Se utilizaron enzimas
purificadas en ensayos cromogénicos. Para determinar la constante de
inhibición, se corrigió el valor de CI_{50} para la competición
con el sustrato, usando la fórmula:
K_{i} = CI_{50} X (1/{1 +
(concentración de sustrato)/K_{m} de
sustrato)})
(Chen y Prusoff, Biochem. Pharmacol.
22:3099-3018 (1973), que se incorpora a este
documento como referencia).
Se utilizó tampón TBS (Tris-Cl 50
mM, pH 7,8, NaCl 200 mM, PEG-8000 al 0,05% (peso en
volumen), NaN_{3} al 0,02% (p/v)) para este ensayo. La CI_{50}
se determinó combinando en pocillos adecuados de una placa de
microtitulación de semi-área de Costar 25 \mul de factor Xa humano
(Enzyme Research Laboratories, Inc.; South Bend IN) en
TBS-P; 40 \mul de DMSO al 10% (en volumen) en
TBS-P (control no inhibido) o diversas
concentraciones de un péptido a ensayar diluido en DMSO al 10% (en
volumen) en TBS-P; y sustrato S-2765
(N\alpha-benciloxicarbonil-D-Arg-Gly-L-Arg-p-nitroanilida;
Kabi Pharmacia, Inc.; Franklin, OH) en TBS-P.
Los ensayos se llevaron a cabo
pre-incubando el inhibidor peptídico más la enzima
durante 10 min, iniciando entonces el ensayo mediante la adición de
sustrato para obtener un volumen final de 100 \mul. Se midió la
velocidad inicial de la hidrólisis del sustrato cromogénico por la
variación de absorbancia a 405 nm, usando un lector de placa
cinético Bio-tek Instruments (Ceres UV900Hdi) a 25ºC
durante la porción lineal de la curva del tiempo (habitualmente,
1-5 min tras la adición del sustrato). La
concentración de inhibidor que provocó un descenso de 50% de la
velocidad de hidrólisis del sustrato se predijo por regresión lineal
después de trazar las velocidades relativas de hidrólisis
(comparadas con el control no inhibido), frente al log de la
concentración del péptido. La concentración enzimática fue 0,5 M y
la concentración de sustrato fue 140 \muM.
Para este ensayo se utilizó tampón
TBS-P- La CI_{50} se determinó de la forma
descrita en el Ejemplo XXXVII.a., con la excepción de que el
sustrato fue S-2366
(L-PyroGlu-L-Pro-L-Arg-p-nitroanilida;
Kabi) y la enzima fue trombina humana (Enzyme Research Laboratories,
Inc., South Bend IN). La concentración de enzima fue 1 nM y la
concentración de sustrato fue 175 \muM.
Para este ensayo se usó tampón
TBS-P. La CI_{50} se determinó de la forma
descrita en el Ejemplo XXXVII.a., con la excepción de que el
sustrato fue S-2251
((D)-Val-L-Leu-L-Lys-p-nitroanilida;
Kabi) y la enzima fue plasmina humana (Kabi). La concentración de
enzima fue 5 nM y la concentración de sustrato fue 300 \muM.
Para este ensayo se usó tampón
TBS-P que contenía CaCl_{2} 10 mM. La
determinación de CI_{50} se efectuó de la forma descrita en el
Ejemplo XXXVII.a., con la excepción de que el sustrato fue BAPNA
(Benzoil-L-Arg-p-nitroanilida;
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y la enzima fue tripsina
pancreática bovina (Tipo XIII, tratada con TPCK; Sigma). La
concentración de enzima fue 50 nM y la concentración de sustrato fue
300 \muM.
Se utilizó tampón Tris-Cl, pH
7,4, NaCl 300 mM,
N-metil-pirrolidona al 2% (en
volumen), NaN_{3} al 0,01% (p/v) para este ensayo. La CI_{50} se
determinó de la forma descrita en el Ejemplo XXXVII.a., con la
excepción de que el sustrato fue
succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida
(Calbiochem-Nova Biochem Corp., San Diego, CA) y la
enzima fue elastasa neutrófila humana (Athens Research and
Technology, Inc., Athens, GA). La concentración de enzima fue 75 nM
y la concentración de sustrato fue 600 \muM.
Los valores de K_{i} para compuestos de ensayo
seleccionados, comparados con el compuesto de control "TENSTOP"
(éster metílico de
N-alfa-tosil-Gly-p-amidino-fenilalanina;
American Diagnostica, Inc; Greenwich, CT), que es un inhibidor
reversible del factor Xa (Sturzebecher et al., Thromb. Res.
54:245-252 (1989); Hauptmann et al., Thromb.
Haem. 63:220-223 (1990), ambos incorporados a
este documento como referencias) se muestran en la anterior Tabla 2.
Los resultados demuestran que los péptidos YIR de la invención
pueden inhibir la actividad del factor Xa, pero que no inhiben de
manera sustancial la actividad de otras diversas
serin-proteasas, incluidas trombina y plasmina, que
intervienen en el proceso de coagulación sanguínea y
fibrinolisis.
Se evaluó la capacidad de los compuestos de la
invención para inhibir la actividad del factor Xa. Se evaluó la
eficacia de diversos compuestos por el ensayo de tiempo de
protrombina (PT) in vitro, usando plasma humano de donantes
combinado. Asimismo, se utilizó un ensayo ex vivo en el que
el plasma se recogió en distintos momentos tras la administración
intravenosa (iv) de un compuesto a ratas y conejos, o la
administración intraduodenal a ratas, y se analizaron usando el
ensayo PT para determinar la semivida en plasma. El ensayo PT se
inició con una dilución de tromboplastina seleccionada para obtener
un parámetro de coagulación extendido y altamente reproducible, al
que se denomina "ensayo PT diluido", según se describe más
adelante. También se determinó la eficacia de diversos compuestos
usando un modelo de trombosis in vivo en rata por anastomosis
arteriovenosa.
Se agregaron 100 \mul de plasma humano
combinado, pobre en plaquetas (PPP), precalentado (37ºC) a una copa
de fibrómetro (Baxter Diagnostics, Inc.; McGaw Park, IL). Se
agregaron 50 \mul de diversas concentraciones de un compuesto de
ensayo en TBS-BSA con calcio
(Tris-Cl 50 mM, NaCl 100 mM, albúmina de suero
bovino al
0,1% /p/v), CaCl_{2} 20 mM). En los experimentos de control, se agregó TBS-BSA con calcio pero sin compuesto de ensayo para la medición del tiempo de coagulación no inhibido. Se agregaron 150 \mul de tromboplastina precalentada y diluida de conejo (Baxter) con calcio a la copa del fibrómetro y se inició el temporizador del fibrómetro. Se obtuvo una curva de dilución de tromboplastina de conejo antes de ensayar el compuesto y se utiliza para elegir una dilución de tromboplastina que permita aproximadamente 30 seg de tiempo de PT para los controles no inhibidos. Se calculó la concentración experimental que dio una inhibición de 50% de la coagulación (CE_{50}) con el compuesto de ensayo (véase la Tabla 4, más adelante) a partir de los tiempos de la curva de dilución.
0,1% /p/v), CaCl_{2} 20 mM). En los experimentos de control, se agregó TBS-BSA con calcio pero sin compuesto de ensayo para la medición del tiempo de coagulación no inhibido. Se agregaron 150 \mul de tromboplastina precalentada y diluida de conejo (Baxter) con calcio a la copa del fibrómetro y se inició el temporizador del fibrómetro. Se obtuvo una curva de dilución de tromboplastina de conejo antes de ensayar el compuesto y se utiliza para elegir una dilución de tromboplastina que permita aproximadamente 30 seg de tiempo de PT para los controles no inhibidos. Se calculó la concentración experimental que dio una inhibición de 50% de la coagulación (CE_{50}) con el compuesto de ensayo (véase la Tabla 4, más adelante) a partir de los tiempos de la curva de dilución.
De manera alternativa, se llevó a cabo el ensayo
de tiempo de protrombina diluida usando el modo de
"investigación" en un instrumento de coagulación automatizada
ACL3000-plus de Instrumentation Laboratories (IL)
(IL; milán, Italia). Se diluyó la tromboplastina hasta obtener un
tiempo de coagulación de 30-35 segundos. Este tiempo
de coagulación se consideró como actividad 100%. Se estableció una
curva estándar de calibración por dilución seriada de 2 veces del
reactivo de tromboplastina diluido (tromboplastina de cerebro de
conejo marca IL). Durante el ensayo, se mezcló una muestra de 50
\mul (plasma separado por centrifugación) con 100 \mul de
reactivo de tromboplastina y se efectuaron lecturas nefelométricas
durante 169 segundos. El tiempo de coagulación se determinó de la
velocidad máxima de cambio de la difusión de luz, calculada por el
instrumento. La inhibición se expresa como actividad porcentual,
según se determina por comparación con la curva de calibración.
El compuesto de ensayo se administró por vía iv a
través de la vena caudal (rata) o de la vena auricular (conejo)
según un protocolo aceptado. Se extrajeron muestras de 1 ml de
sangre a intervalos de tiempo tras la administración de un compuesto
de ensayo de una arteria carótida (rata) o auricular (conejo)
provista de una cánula. Después de la centrifugación para obtener
PPP, el plasma se almacenó de inmediato sobre hielo o se
congeló.
Para la determinación del tiempo de protrombina
diluida, el plasma se precalentó y se analizó de la forma
anteriormente descrita. La inhibición porcentual se calculó a partir
de una curva de dilución de tromboplastina, que se hizo pasar con
cada serie de muestras, y se usó para determinar el tiempo al que
aproximadamente 50% de la actividad anticoagulante inicial permanece
en el plasma (T1/2). Los resultados de este experimento demuestran
que los péptidos YIR de la invención pueden inhibir la coagulación
sanguínea tanto in vitro como in vivo, tras su
administración (véase la Tabla 4).
| CE_{50} | T_{1/2} | ||
| Humano | |||
| combinado | Rata | Conejo | |
| Estructura | in vitro | ex vivo | ex vivo |
| Ac-Y-Chg-R-NH_{2} | 2,5 \muM | 5 min | 5 min |
| Ac-Y-Chg-R-L-P-NH_{2} | 225 nM | 5 min | 5 min |
| Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH_{2} | 140 nM | 6 min | 5 min |
| Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH_{2} | 300 nM | 15 min | 10 min |
Asimismo, se examinó la actividad anticoagulante
de diversos compuestos usando el ensayo de tiempo de protrombina
diluida ex vivo tras la administración iv en bolo de
diversas dosis en ratas. Los compuestos enumerados en la Tabla 5
demostraron una inhibición de al menos 30% 10 min después de la
administración de \leq 2 mg/kg del compuesto indicado. Estos
resultados ponen de manifiesto que distintos péptidos YIR
representativos de la invención tienen una actividad anticoagulante
sustancial. Las estructuras de todos los compuestos enumerados en la
Tabla 5 se confirmó por MS y AA.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ 1. \+
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH _{2} -Chx\cr
\+ 2. \+
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT\cr
\+ 3. \+
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx\cr
\+ 4. \+
Ac-F(pNH _{2} )-Chg-Dab(N ^{Y} -C _{3} NH _{7} )L-P-NH _{2} \cr
\+ 5. \+
Bz-F(pNH _{2} )-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 6. \+
Tos-F(pNH _{2} )-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 7. \+
Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 8. \+
Ac-pAph-Chg-AMP(4)\cr
\+ 9. \+
y-Chg-R-L-NH _{2} \cr
\+ 10. \+
Ac-F(pNH _{2} )-Chg-R-ol\cr
\+ 11. \+
Ciclopentil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH _{2} \cr
\+ 12. \+
3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH _{2} \cr
\+ 13. \+
Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH _{2} \cr
\+ 14. \+
3-Iqc-F(pNH _{2} )-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 15. \+
Ac-F(pNH _{2} )-Chg-R-tiazolilo\cr
\+ 16. \+
2-Furoil-pAph-Chg-PalMe(3)-NH _{2} \cr
\+ 17. \+
5-Me-tienil-Co-pAph-Chg-PalMe(3)-NH _{2} \cr
\+ 18. \+
Ac-Nal(2)-Chg-R-tiazolilo\cr
\+ 19. \+
2-Bzf-f(pNH _{2} )-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 20. \+
Ac-pAph-Chg-Dab(N ^{Y} -C _{3} NH _{7} )-L-P-NH _{2} \cr
\+ 21. \+
Ac- Orn-Nal(2)-Chg-PalMe(3)-Sar-E -NH _{2} \cr
\+ 22. \+
Ac-Phe(3-I-4-NH _{2} )-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 23. \+
Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 24. \+
Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH _{2} \cr
\+ 25. \+
Ac-pAph-Chg-R-Pen(CH _{2} COOH)-P-NH _{2} \cr
\+ 26. \+
Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 27. \+
Ac-F(pNH _{2} )-Chg-R-(Me)L-P-NH _{2} \cr
\+ 28. \+
Ac-F(pNH _{2} )-Chg-R-Oet\cr
\+ 29. \+
Ac-F(pNH _{2} )-Chg-Orn(N ^{\delta} -C _{3} H _{7} N)-L-P-NH _{3} \cr
\+ 30. \+
Ac-F(pNH _{2} )-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 31. \+
Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH _{2} \cr
\+ 32. \+
Ac-pAph-Chg-Dab(N ^{Y} -C _{3} H _{7} N)\cr
\+ 33. \+
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH _{2} \cr}
| 34. | Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH_{2} | |
| 35. | Ac-pAph-Chg-R-NH_{2} | |
| 36. | Ac-pAph-Chg-R-OH | |
| 37. | Ac-Y-Chg-R-NH-Nip-NH_{2} | |
| 38. | Ac-K-Nal(2)-Chg-R-Hyp-E-NH_{2} | |
| 39. | DIPA-pAph-Chg-R-L-P-NH_{2} | |
| 40. | DIPA-mF(pNH_{3})-Chg-R-L-P-NH_{2} | |
| 41. | Isn-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2} | |
| 42. | Pza-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2} | |
| 43. | Tfa-(iBu)F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2} | |
| 44. | Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH_{2} | |
| 45. | Tfa-(iBu)Y-I-Orn(N^{\delta}-C_{3}H_{7}N)-L-P-NH_{2} | |
| *- el subrayado indica la porción cíclica del compuesto. |
En algunos experimentos, los compuestos de ensayo
se administraron a la rata usando un protocolo de dosificación
intraduodenal. Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley
machos, con un peso aproximado de 300 g, con una combinación de
ketamina/xilazina, por vía subcutánea, de acuerdo con un protocolo
aceptado. Se insertó una cánula en la arteria carótida derecha para
la extracción de muestras de sangre. Se practicó una laparotomía y
se insertó una cánula en el duodeno en forma de aguja con punta de
balón, sujetándola en el lugar para asegurar que la sutura fuera
distal al punto de inserción. Se colocó una ligadura adicional
próximal al punto de inserción para prevenir la filtración del
contenido gástrico. Se analizó la eficacia de la sutura para
prevenir que un compuesto alcanzase el punto de inserción por un
ensayo de presión a la conclusión de cada experimento. El punto de
inserción estuvo aproximadamente a 4 cm de la unión
duodeno-estómago. Los compuestos se administraron en
1 ml de solución salina normal. Se extrajo una muestra de sangre de
0,7 ml antes de la administración del compuesto de ensayo y a los
15, 30, 60, 90 y 120 min después de la administración. El plasma se
separó por centrifugación, y se analizó en el mismo la inhibición
de la coagulación, utilizando el ensayo de tiempo de protrombina
diluida.
Los siguientes compuestos mostraron una
inhibición de al menos 30% en el ensayo de tiempo de protrombina
diluida tras la administración intraduodenal de \leq 50 mg/kg del
compuesto:
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH_{2}-Chx;
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx;
Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ac-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ac-Aph-Chg-AMP(4);
Ciclopentil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
2-furoil-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
5-Me-tienil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-F(pNH_{2})-Chg-R-ol,
y
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol.
Se evaluó la eficacia antitrombótica de diversos
compuestos de la invención utilizando la anastomosis arteriovenosa
(AV) extracorpórea de rata. El circuito de anastomosis AV consistió
en un tubo de polietileno (PE) 60, de una longitud de 20 cm
insertado en la arteria carótida derecha, un tubo de PE 160 de 6 cm
de longitud que contenía una hebra de algodón mercerizado de 6,5 cm
de longitud (5 cm expuestos al flujo sanguíneo) y un segundo tubo
de PE 60 de 20 cm que completaba el circuito en la vena yugular
izquierda. La totalidad del circuito se llenó con solución salina
normal antes de la inserción.
Los compuestos de ensayo se administraron por
infusión continua en la vena caudal, usando una bomba de jeringa y
un catéter de mariposa (volumen de infusión: 1.02 ml/h). Un
compuesto se administró durante 30 min, se abrió la anastomosis y se
permitió que la sangre circulara durante un tiempo de 15 min
(total, 45 min de infusión). Al final del período de 15 min, la
anastomosis se bloqueó y se retiró cuidadosamente la hebra,
pesándola en una balanza analítica. La inhibición porcentual de la
formación de trombos se calculó usando el peso del trombo obtenido
en ratas de control, en las que la infusión fue de solución
salina.
Los siguientes compuestos inhibieron el
crecimiento de trombos en al menos 30% tras una infusión de \leq
33 \mug/kg/min:
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH_{2}-Chx;
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx;
Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-N
H_{2}; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-AMP(4); Ciclopentil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; 2-Furoil-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; 5-Me-tienil-CO-pAph-
Chg-PalMe(3)-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol, y Tos-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2}.
H_{2}; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-AMP(4); Ciclopentil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; 2-Furoil-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2}; 5-Me-tienil-CO-pAph-
Chg-PalMe(3)-NH_{2}; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol, y Tos-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2}.
Claims (18)
1. Un compuesto que inhibe específicamente la
actividad del factor Xa, que tiene la fórmula general
X_{1}-R1-R2-R3-X_{2}
en la
cual
X_{1} es H, acilo, alquilo o arilalquilo;
R1 es Tyr;
R2 es Ile;
R3 es Arg;
y
X_{2} se selecciona del grupo consistente en un
grupo C-terminal modificado, uno o más grupos
carboxi-protectores, y uno o más aminoácidos u otro
sustituyente, en el que el grupo C-terminal
modificado se modifica por la reducción del grupo carboxi del
extremo C a un alcohol o aldehído, o por formación de un éster
oral, o por sustitución del grupo carboxi con un sustituyente;
incluidas la sales farmacéuticamente aceptables
del mismo.
2. Un compuesto que inhibe específicamente la
actividad del factor Xa, que tiene la fórmula general
A1-A2-A3-B
en la
cual
A1 es Tyr, F(pNH_{2}), mAph, pAph o
Nal(2), que contiene 0 ó 1 grupo
amino-protector;
A2 es Ile o Chg;
A3 es Arg, PalMe(3),
Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N),
Dap(N^{\beta}-C_{3}H_{7}N) u
Orn(N^{\delta}-C_{3}H_{7}N);
y
B es -H, -OH, -NH_{2}, uno a cinco aminoácidos
o un grupo carboxi-protector;
incluidas las sales farmacéuticamente aceptables
del mismo.
3. El compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en
el que el grupo amino-protector se selecciona del
grupo consistente en formilo, acetilo, picoloílo,
terc-butilacetilo,
terc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo,
2-aril-2-O-benciloxima,
aminoacilo, benzoílo, tosilo, 3-fenoxipropiónico,
5-benzimidazolcarboxi,
CClF_{2}-CO, CF_{2}H-CO,
CF_{3}-CF_{2}CO,
CH_{3}-CHCl-CO,
CH_{3}-O-CO,
CH_{3}-SO_{2},
CH_{3}CH_{2}-O-CO, Cl_{2}CHCO,
ClCH_{2}CO,
(pOH)C_{6}H_{4}-CH_{2}CH(OH)-CO,
(pOH)C_{6}H_{4}-CH_{2}CHOH-CO,
(pOH)C_{6}H_{4}-OCH(CH_{3})CO,
(pOH)C_{6}H_{4}-OCH_{2}CO,
4-MeO-C_{6}H_{4}-CO,
N-morfolinil-CO,
Ph-C(NOCH_{2}Ph)-CO,
Ph-CH=CH-O,
Ph-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-CO,
Ph-CH_{2}CH_{2}CO, trifluoroacetilo, o es una
sustitución del grupo amino N-terminal con un grupo
ciclopentilcarboxi, isoquinolilcarboxi o pirazinocarboxi.
4. El compuesto según las reivindicaciones 1 a 3,
en el que la sal farmacéuticamente aceptable es una sal por adición
de ácido.
5. El compuesto según la reivindicación 4, en el
que la sal por adición de ácido es una sal formada con un ácido
inorgánico seleccionado del grupo consistente en ácido clorhídrico,
ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico o ácido
perclórico, o es una sal formada con un ácido orgánico seleccionado
del grupo consistente en ácido acético, ácido oxálico, ácido
maleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido
succínico o ácido malónico.
6. El compuesto según las reivindicaciones 1 a 5,
en el que la sal farmacéuticamente aceptable se selecciona del
grupo consistente en nitrato inorgánico, sulfato, acetato, malato,
formiato, lactato, tartrato, succinato, citrato, y
p-toluenosulfonato.
7. El compuesto según la reivindicación 6, en el
que la sal farmacéuticamente aceptable es
p-toluenosulfonato.
8. El compuesto según las reivindicaciones 1 y 3
a 7, en el que X_{1} se selecciona del grupo consistente en
metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
sec-butilo, 1-metilbutilo,
2,2-dimetilbutilo, 2-metilpentilo,
2,2-dimetilpropilo, n-pentilo,
n-hexilo, ciclopentilo, ciclohexilo,
metil-ciclohexilo, y
ciclopropil-metileno, formilo, acetilo, benzoílo,
bencilo, picolilo.
9. El compuesto según las reivindicaciones 1 y 3
a 7, en el que el éster oral se selecciona del grupo consistente
en grupos alcoximetilo, grupos
\alpha-alcoxi-(C_{1} a
C_{4})-etilo, grupos
2-oxo-1,3-dioxolen-4-il-metilo,
grupos alquil-(C_{1} a C_{3})-tiometilo, grupos
aciloximetilo, grupos
\alpha-aciloxi-\alpha-metilo
sustituido, grupos 1-(alquil-(C_{1} a
C_{4})-oxicarboniloxi)et-1-ilo,
y grupos 1-(alquil-(C_{1} a
C_{4})-aminocarboniloxi)et-1-ilo.
10. El compuesto según la reivindicación 9, en el
que el éster oral se selecciona del grupo consistente en
metoximetilo, etoximetilo, iso-propoximetilo,
metoxietilo, etoxietilo, propoxietilo, isopropoxietilo,
5-metil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il-metilo,
5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il-metilo,
metiltiometilo, etiltiometilo, isopropil-tiometilo,
pivaloil-oximetilo,
\alpha-acetoximetilo,
etoxicarbonil-1-metilo,
\alpha-acetoxietilo, 3-ftalidilo,
5,6-dimetilftalidilo,
1-(etoxicarboniloxi)et-1-ilo,
y
1-(metilaminocarbonil-oxi)et-1-ilo.
11. El compuesto según las reivindicaciones 1 a
10, seleccionado del grupo consistente en:
CF_{3}C(O)-(iBu)Phe(NH_{2})-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
CF_{3}C(O)-(iBu)Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Phe(3I,4NH_{2})-Chg-Arg-Aleu-Pro-NH_{2};
CF_{3}C(O)-Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
(5-benzimidazolil)-Phe(NH_{2})-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
CF_{3}C(O)-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(Chx-CH_{2})Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
D-Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Trp-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-Arg-Gla-Pro-NH_{2};
Ac-(iBu)Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Phe(p-CONH_{2})-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Phe(pNH_{2})-Chg-Arg-(Me)Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(Chx-CH_{3})Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-Pal(3)Me-Leu-Pro-NH_{2};
(Benzoil)-Phe(pNH_{2})-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(metilpentanil)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(2-metilbutil)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Phe(pNH_{2})-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(iBu)-Phe(pNH_{2})-Chg-ArgLeu-Pro-NH_{2};
Ac-(Chx-CH_{2})-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
(2-benzofuroil)-pAph-Chg-Pal(3)Me-NH_{2};
Ac-(iBu)Phe(pNH_{2})-Chg-Arg-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-Arg-NH_{2};
CF_{3}C(O)-(iBu)Phe(pNH_{2})-Chg-Arg-NH_{2};
Ac-pAPh-Chg-Arg-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-Pal(3)Me-NH_{2};
CF_{3}C(O)(iBu)-Tyr-Ile-Arg-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH_{2}-Chx;
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT;
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx;
Ac-F(pNH_{2})-Chg-Dab(N^{Y}-C_{3}NH_{7})-L-P-NH_{2};
Bz-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Tos-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH_{2};
y-Chg-R-L-NH_{2};
Ac-F(pNH_{2})-Chg-R-ol;
Ciclopentil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
3-Iqc-pAPh-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
3-Iqc-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-F(pNH_{2})-Chg-R-NH-2-tiazolilo;
2-Furoil-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
5-Me-2-tienil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ac-Nal(2)-Chg-R-NH-2-tiazolilo;
2-Bzf-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N)-L-P-NH_{2};
Ac-(iBupAph-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-R-Pen(CH_{2}COOH)-P-NH_{2};
Ac-pAPh-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-F(pNH_{2})-Chg-R-(Me)L-P-NH_{2};
Ac-F(pNH_{2})-Chg-R-OEt;
Ac-F(pNH_{2})-Chg-Orn(N^{\delta}-C_{3}H_{7}N)-L-P-NH_{2};
Ac-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N)-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-R-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-R-OH;
DIPA-(m)pAph-Chg-R-L-P-NH_{2};
DIPA-(m)F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Isn-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Pza-F(pNH_{2})-Chg-R-L-P-NH_{2};
Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH_{2};
Tfa-(iBu)Y-I-Orn(N^{\delta}-C_{3}H_{7}N)-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH_{2}-Chx;
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx;
Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ciclopentil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
2-Furoil-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
5-Me-tienil-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol;
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-Pro-NH_{2};
Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH_{3})O(CH_{3});
Ac-Tyr-{\Psi(CH_{2}NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH_{2}(4-piridilo);
Ac-Tyr-Ile-{\Psi(CH_{2}NH)}-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Chg-Arg(NO_{2})-}\Psi(CH_{2}NH)}-Leu-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Arg-{\Psi(COCH_{2})}-Gly-Pro-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-Dab(N^{Y}-C_{3}H_{7}N)-Leu-Ala-NH_{2};
Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH_{2};
Tyr-Ile-Arg-NH_{2};
D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropil)Gly-NH_{2};
Ciclo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly);
Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-pAph-Chg-PalMe-NH_{2};
Ac-D-pAph-Chg-Pal(Me)-Leu-Pro-NH_{2};
Ac-D-pAph-Chg-Pal(Me)-NH_{2};
y
Ac-Phe(pNH_{2})-Chg-Arg-Leu-Pro-NH_{2}.
12. Composición farmacéutica que contiene un
compuesto según las reivindicaciones 1 a 11.
13. Composición farmacéutica según la
reivindicación 12, que comprende, adicionalmente, un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
14. Uso de un compuesto según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de una composición
farmacéutica para inhibir específicamente la actividad del factor
Xa.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que la
preparación farmacéutica sirve para el tratamiento de un trastorno
cardiovascular seleccionado del grupo consistente en
re-estenosis tras angioplástia, síndrome de distrés
respiratorio del adulto, fracaso multiorgánico, ictus y trastorno
de coagulación intravascular diseminada.
16. Uso según la reivindicación 14, en el que la
preparación farmacéutica sirve para el tratamiento de
complicaciones asociadas con intervenciones quirúrgicas
seleccionadas del grupo consistente en trombosis venosa profunda y
venosa próximal.
17. Uso según la reivindicación 14, en el que la
preparación farmacéutica sirve para reducir o inhibir la
coagulación sanguínea.
18. Uso de un compuesto según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 como anticoagulante para prevenir la
coagulación de una muestra de sangre.
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