ES2215306T3 - Peptidomimeticos inhibidores de cd28/ctla-4 y composiciones farmaceuticas de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a peptidomiméticos capaces de inhibir la interación de CD28 y/o CTLA-4 con CD80m (B7-1) y CD86 (B7-2), y que presenta una secuencia de aminoácidos central, LeuMetTyrProProTyrTyr, que corresponde a los residuos 2 a 9 de SEQ ID NO:1. La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas y a un procedimiento de tratamiento de patologías y de trastornos a los que es posible remediar por inhibición de la interacción de CD28 y/o CTLA-4 con CD80 y CD86.

Description

Peptidomiméticos inhibidores de CD28/CTLA-4 y composiciones farmacéuticas de los mismos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a Peptidomiméticos capaces de inhibir la interacción de CD28 y/o CTLA-4 con CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2), y sus composiciones farmacéuticas. También se refiere al uso del peptidomimético para la preparación de composiciones farmacéuticas activas en patologías que requieren el agonismo o el antagonismo de CD28 y/o CTLA-4.

Descripción de la técnica anterior

La interacción del antígeno presentado, en el contexto del MHC de clase II, al complejo del receptor de antígenos de los linfocitos T (TCR), proporciona al linfocito T coadyuvante la primera señal para iniciar la proliferación de clones. Sin embargo, una activación óptima de los linfocitos T requiere una señal co-estimuladora además del acoplamiento del TCR. Aunque se han implicado diversas moléculas co-estimuladoras en la iniciación de la "segunda señal", es evidente que una de las señales principales es proporcionada por la interacción de CD28 con moléculas B27 (CD80 y CD86) presentadas en la superficie de la célula presentadora de antígenos (véase la Figura 1).

CD28 de la superficie celular es una glicoproteína de 201 aminoácidos, miembro de la superfamilia de proteínas Ig (Aruffo y Seed, 1987). Se encuentra en la naturaleza en forma de un homodímero y se expresa constitutivamente en la superficie del 80% de los linfocitos T humanos (en todas las células CD4^{+} y aproximadamente en 50% de las células CD8^{+}) y en virtualmente todos los linfocitos T de múridos (Linsley y Ledbetter, 1993). El acoplamiento de CD28 con su ligando natural B7-1 o B7-2 (CD80, CD86) da como resultado una segunda señal para el linfocito T y un incremento de la producción de IL-2, junto con el deterioro de la regulación de CD28 en relación con los niveles de ARNm y la expresión en la superficie celular (Linsley y col., 1993). La segunda señal se cree que es crucial para que el linfocito T específico del antígeno realice la proliferación. Una interferencia con esta segunda señal en presencia de la primera señal (señal TCR), da como resultado una anergia del linfocito T específico del antígeno (ausencia de sensibilidad) (Linsley y col., 1992). Durante el periodo en el que CD28 tiene deteriorada la modulación, se deteriora también de forma concomitante la regulación de una glicoproteína estrechamente relacionada, CTLA-4 (Freeman y col., 1992). En general se cree que CD28 proporciona la señal coestimuladora positiva para el crecimiento y la diferenciación, mientras que CTLA-4 es responsable de una señal negativa posterior a los acontecimientos de la activación celular (para una revisión, véase Lenschow y col., 1996).

CD28 y CTLA-4 se unen a la familia B7 de proteínas, principalmente a B7-2 y B7-1 (Azuma y col., 1993). En relación con B7-1, se conoce que la Ig CTLA-4 se une con una afinidad 20-100 veces superior que la Ig CD28 (Linsley y col., 1991).

Linfocitos B humanos y de múridos, aislados recientemente expresan niveles bajos de B7-2 pero no B7-1, sin embargo, los niveles de ambas B7s sufren un deterioro de la regulación después de la activación (Hathcock y col., 1994).

Estudios in vitro han demostrado que el bloqueo de la coestimulación de linfocitos T mediante la ruta de señalización de CD28, da como resultado el desarrollo de una anergia de los linfocitos T específicos del antígeno (Harding y col., 1991; Boussiotis y col., 1993., Linsley y col., 1991).

La Ig CTLA-4 se ha empleado en una amplia variedad de modelos animales para estudiar la eficacia in vivo del bloqueo de la ruta de señalización de CD28. Los primeros estudios in vivo, mostraban que la Ig CTLA-4 era capaz de suprimir respuestas humorales a un antígeno dependiente de linfocitos T (Linsley y col., 1992).

Otros estudios han demostrado que el bloqueo de la señal coestimuladora de CD28 es eficaz para evitar el rechazo de xenoinjertos (Lenschow y col., 1992), rechazo de aloinjertos cardiacos (Turka y col., 1992; Lin y col., 1993), lupus sistémico de múridos (Finck y col, 1994; Chu y col., 1996), enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD) (Wallace y col., 1995) y encefalomielitis alérgica experimental (EAE) (Cross y col., 1995; Perrin y col., 1995; Arima y col., 1996).

La administración de Ig CTLA-4 en el momento del trasplante alogénico, prolonga la supervivencia del injerto pero no logra evitar el rechazo (Turka y col., 1992). Si se retrasa la administración de la Ig CTLA-4 hasta 2 días después del trasplante, se observa una supervivencia a largo plazo del aloinjerto, así como una tolerancia frente a la estimulación posterior con aloantígeno in vivo (Lin y col., 1993; Sayegh y col., 1995).

Judge y col. (1996) han estudiado recientemente los mecanismos de acción in vivo de la Ig CTLA-4 y han encontrado que la administración retardada de la proteína, da como resultado una reducción del 80-90% de las citoquinas de tipo Th1 y atenúa en 50% la expansión de los linfocitos T específicos del antígeno. Por tanto, la Ig CTLA-4 puede ser capaz de regular el equilibrio entre las respuestas de tipo Th1 y Th2.

En conclusión, existe una amplia evidencia de que el bloqueo de la ruta coestimuladora de CD28 puede ser una diana terapéutica útil para la modulación inmunitaria. La Ig CTLA-4 está actualmente en la fase II de los ensayos clínicos en pacientes con psoriasis. Sin embargo, su uso práctico para la inmunoterapia crónica está limitado porque sólo se administra por vía parenteral y requiere dosis de mg/kg.

Una pequeña molécula mimética de CTLA-4/CD28 tendría grandes ventajas clínicas y comerciales y representa una carencia observada desde hace tiempo.

Estudios de mutagénesis dirigida al sitio con CTLA-4 y CD28 han implicado una extensión hexapéptida que incluye diversos sitios clave en la región CDR3 de la proteína, MetTyrProProProTyr (SEQ ID NO:31), como un sitio de contacto decisivo para la interacción con B7 (Peach y col., 1994).

El documento de solicitud de patente europea EP 682039 describe que las proteínas de fusión Ig CTLA-4 bloquean la interacción con el antígeno B7. También describe mutantes de CTLA-4 en los que algunos de los aminoácidos, incluyendo la secuencia MetTyrProProProTyr (SEQ ID NO:31), han sido reemplazados por Ala.

El documento de solicitud de patente internacional WO 95/33770 se dirige en general a ligandos para moléculas de la superficie de linfocitos T, especialmente CTLA-4, que inducen la apoptosis, específica de antígeno, del linfocito T activado. Los péptidos aislados que contienen fragmentos de CTLA-4 que constituyen el epítopo para tales uniones, también se describen y se reivindican. Tales epítopos incluyen la secuencia de aminoácidos ProProTyrTyrLeu (SEQ ID NO:32) que se solapa parcialmente con el hexapéptido MetTyrProProProTyr (SEQ ID NO:31) descrito anteriormente.

Científicos de Glaxo han intentado emplear recientemente péptidos restringidos lineal y conformacionalmente para reproducir esta región (Ellis y col., 1996). Sin embargo, el estudio de Glaxo no logra conseguir ninguna indicación productiva.

La cita de cualquier documento en esta memoria, no pretende ser una admisión de dicho documento como técnica anterior pertinente o como material considerado para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier información en forma de contenido o de fecha de cualquier documento, se basa en la información disponible para el solicitante en el momento de la presentación y no constituye una admisión de la exactitud de dicha información.

Sumario de la invención

Un objeto de la invención para superar las deficiencias de la técnica relacionada, tales como las mencionadas anteriormente, es proporcionar peptidomiméticos biológicamente activos de CD28 o de CTLA-4.

Por tanto, la presente invención proporciona peptidomiméticos de CD28 o CTLA-4 que son capaces de inhibir la interacción de CD28 y/o CTLA-4 con CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2). Los compuestos de la presente invención contienen una secuencia central que se corresponde con los residuos de aminoácidos 2 a 9 de la SEQ ID NO:1 y están ciclados y pueden incluir residuos de aminoácidos adicionales que sean N-terminales y/o C-terminales en relación con esta secuencia central.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye los compuestos de acuerdo con la presente invención y excipientes farmacéuticamente aceptables.

En la presente invención se proporciona también el uso de los compuestos de la presente invención para la fabricación de un medicamento para tratar patologías y enfermedades que mejoran con la inhibición de la interacción de CD28 y/o CTLA-4 con CD80 y CD86.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra esquemáticamente la implicación de CD28 en la activación de los linfocitos T coadyuvantes.

La Figura 2 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de CD28 (SEQ ID NO:33), CTLA-4 (SEQ ID NO:34) y REI (SEQ ID NO:35), empleadas para la formación del modelo molecular de CD28/CTLA-4.

La Figura 3 muestra un modelo molecular en forma de diagrama de cintas del homodímero de CTLA-4 basado en el molde de REI.

La Figura 4 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la proteína B7-1 (SEQ ID NO:36) con una cadena pesada de IgG del anticuerpo MCO (SEQ ID NO:37).

La Figura 5 muestra un diagrama de cintas de un complejo proteico monómero de CTLA-4/B7-1.

La Figura 6 muestra un gráfico de barras de una evaluación de los péptidos AT 199, 200 y 201 en una MLR humana (A frente a B).

La Figura 7 muestra un gráfico de barras de una evaluación de los péptidos AT 199, 200 y 201 en una MLR humana (B frente a A).

La Figura 8 muestra un gráfico de barras de una evaluación de los péptidos AT 199 ciclados y lineales en una MLR humana (A frente a B).

La Figura 9 muestra un gráfico de barras de una evaluación de los péptidos AT 199 y 201 en una MLR de múridos.

La Figura 10 muestra un gráfico de barras de un ensayo de toxicidad de los péptidos AT 199 y 200 en células THP-1, Jurkat y PBLs.

La Figura 11 muestra un gráfico de barras del efecto de los péptidos AT 199 y 200 sobre la estimulación mediada con PHA de PBL.

Descripción detallada de la invención

Los peptidomiméticos biológicamente activos de CD28 o CTLA-4 de acuerdo con la presente invención, han sido diseñados empleando una estrategia de modelo molecular basado en un diseño tipo "piel y hueso", tal y como se describe a continuación.

Ambas proteínas CD28 y CTLA-4 son miembros de la superfamilia de Ig homodímeras que constan de un único dominio variable de Ig. Se realizó una búsqueda de homología en la base de datos Brookhaven de estructuras conocidas y se encontró un ejemplo cristalizado de un homodímero de Ig (código-REI). La alineación de la secuencia empleada en los estudios de modelado se muestra en la Figura 2.

Los modelos de CTLA-4 y CD28 fueron construidos empleando sustituciones de la cadena lateral del molde REI. Debido a que la longitud del bucle de CDR3 en REI tiene dos aminoácidos menos que la región correspondiente en CD28 o CTLA-4, un bucle de CDR3 de longitud adecuada (obtenido de la base de datos Brookhaven, PDB1JHL.ENT) se injertó en la molécula del molde. El modelo construido nuevamente se minimizó hasta convergencia, empleando una función de conjugado-gradiente. Se emplearon cinco ciclos de dinámica de reasociación (repeticiones de una simulación dependiente de energía del mecanismo molecular, seguido de una minimización energética) para optimizar la estructura antes de una etapa final de minimización. En la Figura 3 se muestra un diagrama de cintas del homodímero CTLA-4.

El modelo molecular de la molécula B7-1 se construyó de forma análoga a la estrategia utilizada para CD28/CTLA-4. La mejor alineación que se encontró después de una búsqueda en la base de datos Brookhaven era el dominio variable y constante de la cadena pesada de Ig del anticuerpo MCO. La alineación de la secuencia empleada para construir el modelo B7-1 se muestra en la Figura 4.

Después de construir el modelo de B7-1, se construyó un modelo tentativo del complejo CTLA-4 (CD28)/B7-1. Numerosos grupos han publicado estudios extensos de mutagénesis dirigida al sitio que tenían como fin definir las superficies de CTLA-4/B7 implicadas en la formación del complejo (Peach y col., 1994, 1995; Guo y col., 1995). Estas mutaciones estaban alineadas con las proteínas modeladas y se emplearon como guía en la formación del complejo de unión homodímero. Para mayor simplicidad, la Figura 5 muestra sólo la molécula CTLA-4 monómera que interactúa con B7-1.

En la ingeniería genética de los peptidomiméticos de CD28 o CTLA-4 como inhibidores de la vía coestimuladora de CD28, los modelos moleculares descritos anteriormente se emplearon como moldes diseñados. Los peptidomiméticos de acuerdo con la presente invención que son capaces de inhibir la interacción de CD28 y/o CTLA-4 con las moléculas CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2), tienen una secuencia central de aminoácidos, LeuMetTyrProPoProTyrTyr que se corresponde con los residuos de aminoácidos 2 a 9 de la SEQ ID NO:1. Además de esta secuencia central de aminoácidos, el peptidomimético puede tener residuos de aminoácidos adicionales, N-terminales y/o C-terminales a los residuos de aminoácidos 2 a 9 de SEQ ID NO:1.

Preferentemente, hay un residuo Cys N-terminal colindante y C-terminal colindante con la secuencia central de aminoácidos, tal y como se muestra en la SEQ ID NO:1. Los peptidomiméticos de la presente invención están ciclados. Los peptidomiméticos ciclados de la presente invención incluyen la secuencia de SEQ ID NO:1 y la ciclación del péptido tiene lugar preferentemente mediante un puente disulfuro Cys-Cys entre el residuo 1 (Cys) y 10 (Cys) de SEQ ID NO:1. Por otro lado, el peptidomimético se puede ciclar con un enlazador, tal como un enlazador químico sintético que une con un puente el residuo 2 (Leu) y el residuo 9 (Tyr) de la secuencia central de aminoácidos que se corresponde con los residuos 2 a 9 de la SEQ ID NO:1. Por tanto, la ciclación tiene lugar preferentemente entre un aminoácido del residuo 2 y el residuo 9 de la SEQ ID NO:1. Otros ejemplos de enlazadores químicos sintéticos incluyen, pero no están limitados a los mismos, un puente salino Lys-Asp, ciclación con lantánido, ciclación de N-terminal con C-terminal, los enlazadores químicos descritos por Olson y col. (1993), etc.

En los peptidomiméticos de la presente invención también se prefiere que estén presentes hasta once residuos de aminoácidos adicionales y N-terminales a la secuencia central correspondiente a los residuos 2 a 9 de SEQ ID NO:1 y/o hasta once aminoácidos adicionales y C-terminales a la secuencia central. Más preferentemente, hay dos residuos de aminoácidos adicionales ambos N-terminales y C-terminales a la secuencia de SEQ ID NO:1, en donde estos residuos de aminoácidos adicionales son residuos de aminoácidos cargados positivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 es un ejemplo de una realización preferida de un peptidomimético ciclado de la presente invención, en donde la ciclación tiene lugar mediante un puente disulfuro Cys-Cys entre los residuos 3 y 12 de SEQ ID NO:2.

Los peptidomiméticos de acuerdo con la presente invención pueden incluir adicionalmente una o varias de las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20, que se pueden enlazar entre sí y/o a la secuencia de SEQ ID NO:1 o a la secuencia correspondiente a los residuos 2 a 9 de SEQ ID NO:1, directamente o a través de un enlazador químico sintético adecuado. Los peptidomiméticos de la presente invención también pretenden englobar los peptidomiméticos en los que uno o varios fragmentos bioisotéricos, tales como los usados normalmente en el diseño de fármacos, están presentes en combinación con los aminoácidos adicionales, N-terminales y/o C-terminales a la secuencia central de aminoácidos o en lugar de la misma.

Es notable que los peptidomiméticos de la presente invención no son fragmentos de las moléculas de CTLA-4/CD28, sino que han sido diseñados específicamente y seleccionados posteriormente entre numerosas posibilidades, basándose en los resultados de los ensayos biológicos mostrados en la sección de los Ejemplos.

La estrategia empleada para ello era identificar y explotar las superficies de contacto potenciales de las proteínas CD28/CTLA-4 con B7, así como seleccionar una región de la molécula CD28/CTLA-4, responsable de mediar en la formación del homodímero, como una forma de ruptura potencial de la presentación adecuada de los homodímeros.

Se han identificado seis regiones de las moléculas modeladas CD28/CTLA-4 como dianas potenciales (véase Tabla 1) para el diseño de péptidos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Péptidos clonados estudiados

1

La primera región se corresponde con el extremo amino de la proteína. Este, es una extensión alargada (cadena \beta) de aminoácidos y no es idóneo para la introducción de restricciones conformacionales. El extremo amino está previsto que se una directamente por debajo de la región CDR3 y forme parte de la superficie de contacto de
B7.

La segunda región se corresponde con la porción análoga de CDR1 de la proteína. Se ha observado mediante estudios de mutagénesis dirigida al sitio, que el dominio CDR1 está implicado en la unión a B7 (Peach y col., 1994). Debido a que la región CDR1 no forma un giro \beta apretado, sino que forma un bucle flojo, es difícil diseñar péptidos restringidos conformacionalmente que se parezcan mucho a esta región. La estrategia empleada para ello, era proporcionar la mayor flexibilidad posible a los péptidos restringidos diseñados a partir de esta región.

El tercer grupo de péptidos se preparó para la región del bucle entre los residuos 40-45 que representa uno de los sitios de contacto principal, pronosticado para mantener unido el homodímero. Debido a que CD28/CTLA-4 funcional expresada en la superficie celular está predominantemente en forma de un homodímero (existe alguna evidencia de que puede haber alguna implicación de presentación monómera a B7), el objetivo con estos análogos era romper la formación homodímera.

El cuarto grupo de péptidos se obtuvo a partir del bucle 60-65 (SEQ ID NO:15, 16 y 17) que no estaba previsto que formara parte de la superficie de contacto con B7, sino que constituye un bucle expuesto a la superficie principal. De acuerdo con el presente modelo de interacción, los péptidos diseñados a partir de esta región, no deben poseer ninguna actividad biológica. Si alguno de estos análogos manifestara actividad inhibidora, es una evidencia de que la interacción del presente modelo era incorrecta.

El bucle formado por los residuos 70-75 estaba previsto que estuviera directamente implicado en el contacto con B7. Se sintetizaron tres análogos a partir de esta región (véase Tabla 1, SEQ ID NO: 18, 19 y 20). AT 132 representa la secuencia natural restringida. La formación del modelo de este análogo sugiere que el bucle pretendido no se había formado de forma estable. AT 133 se diseñó para corregir esta inestabilidad, introduciendo una prolina (un residuo relativamente rígido que favorece el giro) para reemplazar el residuo de glicilo de alta flexibilidad. AT 135 es un análogo más corto que AT 133, con el que se intenta probar la contribución de los residuos que flanquean la porción central del bucle 70-75.

Finalmente, se aprovechó la región análoga a CDR3 de CTLA-4/CD28 (SEQ ID NO:21-30). Mutaciones individuales dirigidas al sitio, en esta región de Ig CTLA-4, suprimían completamente la unión a B7 (Peach y col., 1994). El diseño de análogos de esta región, sin embargo, presentaba algunos problemas considerables de ingeniería genética. La secuencia del hexapéptido central de esta región es MetTyrProProProTyr (SEQ ID NO:31). Estos son residuos relativamente hidrófobos y el segmento de triple prolina es conformacionalmente rígido. Desde el punto de vista del modelo molecular del complejo CTLA-4/B7, esta región está prevista que forme parte de un contacto profundo. La experiencia ha mostrado que la mayoría de los inhibidores eficaces de las interacciones proteína-proteína, tienden a necesitar una secuencia "guía", electrostáticamente activa que imite parte el "apretón de manos" inicial de este acontecimiento de unión. Consecuentemente, se empleó una variedad de acercamientos diferentes en la ingeniería del panel de análogos de CDR3. El análisis del área de la superficie que rodea la región CDR3 de la proteína, indicaba que está rodeada por un potencial cargado positivamente. Por tanto, se incorporaron lisina, arginina e histidina hacia los extremos de los análogos, para imitar este potencial positivo y para mejorar las propiedades de solubilidad del péptido sintetizado.

En el ejemplo específico de AT 199, se diseñó un análogo híbrido. Se incorporaron diversas estrategias para el diseño de este análogo. Primero, se incorporaron cuatro residuos altamente cargados (positivos) de forma adyacente a las cisteínas que flanqueaban ambos extremos amino y carboxi del análogo. Puesto que los residuos hidrófobos tienden a distanciarse de los residuos hidrófilos, este diseño también pretendía la partición del bucle MetTyrProProProTyr (SEQ ID NO:31), alejándolo de los residuos cargados positivamente y ayudar a forzar la correcta formación del giro de CDR3. Los residuos flanqueantes se seleccionaron para imitar residuos que están espacialmente yuxtapuestos a la región CDR3 en la proteína natural y están implicados en la unión a B7. También representan sitios importantes de contacto electrostático. La arginina en el extremo amino del análogo es una imitación de Arg33 en la proteína natural. El residuo de histidina en el extremo carboxilo del péptido pretende imitar a His2, en el extremo amino de la proteína que se encuentra directamente por debajo de la región CDR3.

Los péptidos AT 200 y AT 201 se diseñaron como testigos para AT 199. Previamente, Peach y col. (1994) habían mostrado que una única sustitución del residuo de metionina por un residuo de alanina en la región CDR3 da como resultado la supresión completa de la unión de Ig CTLA-4 a B7. Por tanto, AT 200 es idéntico en secuencia a AT 199, con la excepción de que la Met está sustituida por un residuo de Ala. AT 201 también es idéntico en secuencia a AT 199, exceptuando que la Met está sustituida por un residuo de Gly flexible.

Los peptidomiméticos de la presente invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, en particular, con los procedimientos de síntesis química, bien establecidos que emplean sintetizadores de péptidos automatizados en fase sólida, seguido de purificación mediante cromatografía. Más particularmente, los procedimientos descritos en la sección de los Ejemplos, se pueden seguir para la preparación y preferentemente la ciclación de tales péptidos.

La composición farmacéutica para tratar patologías y trastornos que se mejoran inhibiendo la interacción de CD28 y/o CTLA-4 con CD80 y CD86, de acuerdo con la presente invención, contiene un peptidomimético sustancialmente purificado como ingrediente activo. Dependiendo de si el peptidomimético incluye una o varias de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede incluir adicionalmente uno o varios péptidos separados que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20, que todavía no está presente en el peptidomimético.

Ejemplos de patologías y trastornos en los que los peptidomiméticos de acuerdo con la presente invención se pueden usar ventajosamente como un agente profiláctico, terapéutico o de diagnóstico, son enfermedades del sistema inmune y cáncer. Ejemplos específicos y no limitativos incluyen enfermedades autoinmunes, tales como psoriaris, esclerosis múltiple, lupus eritematoso, diabetes, artritis reumatoide y terapia contra el rechazo de trasplantes que incluye trasplantes de vísceras macizas y de células.

Otros objetos y ventajas de la invención serán evidentes con la siguiente descripción.

Una realización de la invención es la administración de una cantidad farmacológicamente activa del péptido de la invención a personas con riesgo de desarrollar patologías y trastornos que se mejoran con la inhibición de la interacción de CD28 y/o CTLA-4 con CD80 y CD86 o a personas que ya muestran tales patologías y trastornos.

Se puede emplear cualquier vía de administración compatible con el principio activo, pero se prefiere particularmente la administración por vía parenteral, debido a que se pueden conseguir efectos sistémicos en un corto periodo de tiempo. La administración por vía parenteral se puede realizar mediante una variedad de vías diferentes que incluyen la vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intranasal, oral, transdérmica o bucal, pero no están limitadas a las mismas.

Se entiende que la dosificación del péptido que se va a administrar será dependiente de la edad, sexo, salud, peso, tipo de tratamiento presente y la frecuencia del tratamiento. La dosificación se elabora para un paciente individual, tal y como lo propone y lo puede determinar un experto en la técnica. La dosificación puede ser entre 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, y preferentemente entre 0,1 y 1 mg/kg de peso corporal.

La composición farmacéutica para uso parenteral que incluye el principio activo y un vehículo adecuado, se puede preparar en forma inyectable. Los vehículos para la administración parenteral son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, agua, solución salina y tampones fisiológicos. El vehículo puede contener menores cantidades de excipiente para mantener la estabilidad y la isotonicidad de la solución.

La preparación de las composiciones farmacéuticas se puede realizar de acuerdo con modalidades ordinarias y preferentemente el contenido del péptido estará en el intervalo entre 10 mg/ml y 1000 mg/ml.

La invención se describe a continuación mediante los siguientes Ejemplos y Figuras acompañantes que no se deben entender de ningún modo como limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1 Síntesis de Péptidos

Se sintetizaron 34 péptidos empleando procedimientos convencionales de Fmoc, tal y como se describen a continuación, en donde las abreviaturas son las siguientes:

Acetonitrilo (ACN), bencilo (BZL), terc-butiloxi-carbonilo (BOC), diclorometano (DCM), diisopropiletilamina (DIEA), dimetilformamida (DMF), 5,5'-ditiobis[2-ácido nitrobenzoico] (DTNB), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
(FMOC), hexafluoro-fosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU), 1-hidroxibenzotriazol
(HOBt,), N-metil morfolina (NMM), N-metil pirrolidona (NMP), 2,2,5,7,8-pentametil-croman-6-sulfonilo (PMC), terc-butilo (tBu), trifenilmetilo (TRT), ácido trifluoroacético (TFA), ácido hepta-fluorobutárico (HFBA).

Resinas

La resina primera utilizada es una resina Rink de amida metilbencilhidrilamina, que es un soporte convencional para sintetizar péptidos con una amida C-terminal. Para los péptidos que necesitan un extremo C-terminal exento de ácido carboxílico, se emplean las resinas Wang con el primer aminoácido Fmoc fijado. Las resinas Wang que contienen un tratamiento con p-benciloxibencilo, son los soportes convencionales para la preparación de ácidos peptídicos mediante la estrategia de síntesis por cargas en fase sólida de Fmocs. Ambos tipos de resinas se pueden obtener de NovaBiochem.

Aminoácidos empleados en la síntesis

Aminoácidos Fmoc	Grupo protector
Ser, Thr, Asp, Glu	TBu
Cys, Asn, Gln, His	Trt
Arg	PMC
Lys	BOC
Trp	BOC
Ala, Gly, Ile, Met, Leu, Pro, Phe, Val	Ninguno

Conjunto de cadena

Las cadenas peptídicas protegidas se ensamblan inicialmente empleando la estrategia de FMOC en un sintetizador de péptidos de Applied Biosystem, Inc. Modelo 431A o en un sintetizador de péptidos de Rainin Symphony Multiple. Ambos sintetizadores utilizan los aminoácidos protegidos en N-terminal FMOC, con grupos protectores adecuados de la cadena lateral, 20% de piperidina para las desprotección N-terminal y HBTU para la activación de aminoácidos y acoplamiento.

Corte/Extracción

Las mezclas convencionales para el corte, empleadas para eliminar los grupos protectores de la cadena lateral y liberar el péptido de la resina: Mezcla A: 95% de TFA, 5% de agua desionizada.

Para los péptidos sin arginina, metionina, triptófano o los aminoácidos con el grupo protector tritilo (cisteína, histidina, asparagina, glutamina): Mezcla B: 82,5% de TFA, 5% de fenol, 5% de agua desionizada, 5% de tioanisol, 2,5% de etanoditiol.

Para los péptidos que contienen arginina o metionina: Mezcla B': 87% de TFA, 4,3% de agua desionizada, 4,3% de tioanisol, 4,3% de etanoditiol.

Una mezcla alternativa para péptidos con arginina o metionina: Mezcla C: 95% de TFA, 2,5% de agua desionizada, 2,5% de etanoditiol.

Para los péptidos sin arginina ni metionina y que contienen triptófano o el grupo protector tritilo: la reacción de corte se realiza empleando 100 mg-1 g de péptido-resina, situados en un recipiente de vidrio de 20 ml y enfriado en un baño de hielo. La mezcla de corte se prepara y también se enfría en un baño de hielo, a continuación se añade al péptido-resina para obtener un volumen final de aproximadamente 10 ml. El recipiente se retira del baño de hielo y se deja calentar a temperatura ambiente. El recipiente se tapa y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Después de 1,5 horas, la solución se filtra a vacío a través de un filtro de porosidad media a gruesa, en aproximadamente 30 ml de MTBE frío (éter metil-t-butílico). El recipiente de reacción se lava con 1 ml de TFA y se filtra a través del mismo embudo de filtro en el MTBE frío. La suspensión completa se transfiere a continuación a un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrífuga aproximadamente 10 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente. El material sobrenadante se aspira, el material precipitado se suspende de nuevo en 40 ml de MTBE frío y se centrífuga de nuevo. Esta etapa se repite una vez más. El material sobrenadante final se aspira y el material precipitado se trata con nitrógeno para evaporar la mayoría del éter restante. El péptido se disuelve entonces en 20-30 ml de ácido acético acuoso al 1%-10%, se diluye hasta aproximadamente 100-150 ml con agua desionizada, se congela superficialmente y se liofiliza.

Ejemplo 2 Ciclación

Los péptidos diseñados con dos cisteínas para la ciclación del enlace disulfuro, se procesan según uno de estos dos modos. Si se muestra por HPLC analítica que el péptido en bruto tiene al menos 65% de pureza, sin ningún pico secundario significativo (>20% de producto principal), primero se cicla el péptido, a continuación se purifica. Esto comprende aproximadamente el 90% de los péptidos producidos en la instalación. Si el péptido en bruto tiene productos de deleción secundarios, significativos, inicialmente se purifica, a continuación se cicla y después se purifica de nuevo.

El método de ciclación es la formación de un enlace disulfuro mediante oxidación con aire. Primero se disuelven 25 mg-100 mg de péptido en bruto en agua desionizada, con una proporción de péptido de 6-10 ml/mg. Mientras que se agita, el pH de la solución aumenta hasta aproximadamente 8,3 con NH_{4}HCO_{3} 1,0 M (pH 8,5). La solución se agita durante una noche a temperatura ambiente, con suficiente agitación para crear un vórtice que alcanza casi el fondo del recipiente. Al día siguiente (aproximadamente 18-24 h), se controla la ciclación del péptido mediante HPLC analítica de fase inversa, en busca de cambios característicos en el tiempo de retención y una absorbancia a 280 nm debido al enlace disulfuro. La solución se liofiliza a continuación y se almacena o purifica cargándola directamente en una columna de HPLC preparativa de fase inversa.

Purificación 1. HPLC preparativa de fase inversa

Nota: los péptidos que tienden a ser más hidrófobos en la naturaleza, se purifican empleando HFBA en lugar de TFA para mejorar la resolución cromatográfica del producto final.

Condiciones: Sistema - Waters Delta Prep. 4000

Columna - C18 en fase inversa de Vydac, 10 \mum, 2,2 x 25 cm (nº de cat. 218TP1022)

Tampones - A: agua/TFA al 0,1%

\hskip2.8cm

B: acetonitrilo/TFA al 0,1%

Caudal - 15 ml/minuto

Detección: detector UV de Waters 484, 220 nm

Gradiente - variable, generalmente 0,33% de B/min hasta 1,0% de B/min

Los péptidos en bruto liofilizados se preparan disolviendo 50-100 mg de péptido en 200 ml de TFA acuoso al 0,1%. Los péptidos ciclados ya en solución, con pH 8-8,5, se enfrían primero rápidamente con TFA no diluido para disminuir el pH hasta el intervalo de 2-3. La solución peptídica se carga a continuación directamente en la columna preparativa a través de la línea de depósito del tampón "A" y se inicia el programa del gradiente. Las fracciones recogidas se analizan por la noche en un sistema de HPLC analítico de toma automática de muestras. Las fracciones solapantes que se estiman con >95% de pureza mediante la integración del pico, se reúnen y se liofili-
zan.

Purificación Sep-Pak

Condiciones: Equipo - Baker, extracción en fase sólida con colector de 12 orificios

Columnas - Waters Vac, columnas de 2 cc, 2 g de Sep-Pak

Tampones - H_{2}O/0,1% de TFA

Soluciones de 20%, 30%, 50%, 99,9% de acetonitrilo/0,1% de TFA

Los péptidos liofilizados en bruto se prepararon disolviendo 15-25 mg de péptido en 8 ml de TFA acuoso al 0,1%. Las columnas Sep-Pak se acondicionaron en primer lugar con 30 ml de Acn al 99,9%/TFA al 0,1%, seguido de 30 ml de H_{2}O/0,1% de TFA. Las soluciones peptídicas se cargan, seguido de otro lavado de H_{2}O/0,1% de TFA, a continuación se eluyeron con tampones con 20% o 30% de Acn/0,1% de TFA. Se realiza un lavado final con 50% de Acn/0,1% de TFA para asegurar la elución completa y a modo de comparación. El volumen de carga, el lavado con H_{2}O, los volúmenes de 20%-30% de Acn y 50% de Acn se recogieron separadamente y se controlaron sobre HPLC analítica. Las soluciones de péptido eluidas se diluyen a continuación 3:1 con H_{2}O desionizada y se liofili-
zan.

Ejemplo 3 Caracterización 1. HPLC analítica de fase inversa (para controlar la homogeneidad del producto final)

Condiciones: Sistema - Waters 500 pumps, Autosampler 717, 490

Detector de UV de longitud de onda múltiple

Columna - Vydac C, 18,5 \mum, 0,46 x 25 cm (nº de cat. 218TP54)

Tampones - A: agua/TFA al 0,1%

\hskip2.8cm

B: acetonitrilo/TFA al 0,1%

Caudal - 1 ml/minuto

Detección: 214 nm, 280 nm

Gradiente - 2% de B/minuto

Las muestras de los péptidos liofilizados y purificados se preparan disolviendo 0,2-1,0 mg de péptido en TFA acuoso al 0,1% hasta tener una concentración de 0,5 - 1,0 mg/ml. Se inyectan 15-18 \mul en la columna y se eluyen con un programa de gradiente de 0-50% de ACN en 25 minutos. Los datos del cromatograma se recogen y se almacenan con el sistema del programa Expert-ease de Waters.

2. Espectrometría de masas (para controlar la homogeneidad y la estructura covalente)

Sistema: Perspective Biosystems Voyager Elite

Tipo: MALDI-TOF (desorción de la matriz asistida con láser/ionización mediante tiempo de vuelo)

Matriz: ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinnámico (Sigma, C-2020), 10 mg/ml en 67% de ACN/0,1% de TFA

Las muestras de péptido se preparan con una concentración de 1-10 \mumol en 50% de ACN/0,1% de TFA. A una placa con pocillos para análisis se aplican 0,5 \mul de muestra de péptido, seguido de 0,5 \mul de solución matriz y se deja secar. La placa de análisis se carga en la máquina y las muestras se escanean y se analizan empleando un método de extracción retardada con reflectron. Para cada muestra se recoge y se analiza una señal de datos acumulativos desde 32-128 impactos con láser. Cada serie incluye un pocillo de muestra con un péptido patrón para calibración.

3. Ensayo con reactivo de Ellman (para controlar la ciclación del enlace disulfuro)

La ciclación del enlace disulfuro de péptidos que contienen triptófano o tirosina, no se puede controlar mediante detección de UV con HPLC a 280 nm, debido a la alta absorbancia a esa longitud de onda. El ensayo con el reactivo de Ellman para estudiar la presencia de grupos sulfhidrilos libres de la cadena lateral de cisteína, es un indicador alternativo de la formación de enlaces disulfuro.

Los péptidos se preparan con concentraciones de 0,5 mmol en tampón de reacción (fosfato sódico 0,1 M, pH 8). El reactivo de Ellman, DNTB, se prepara con una concentración de 4 mg/ml y un patrón de hidrocloruro de cisteína monohidrato con una concentración de 0,5 mmol en el mismo tampón de reacción. Se mezclan 250 \mul de muestra, 50 \mul de reactivo de Ellman y 2,5 ml de tampón de reacción y se incuban a temperatura ambiente durante 15 min. También se somete a ensayo una muestra en blanco de tampón de reacción y una muestra patrón de cisteína. Un color amarillo indica la presencia de grupos sulfhidrilo libres.

Ejemplo 4 Respuesta linfocitaria mixta humana (MLR)

Aislamiento de PBLs: Se obtuvo sangre completa de donantes del banco sanguíneo Interstate, Memphis, TN. Los especimenes de sangre se trataron en una instalación de depósito con nivel 2 de bioseguridad, tal y como está recomendado para especimenes sanguíneos potencialmente infecciosos, en el manual de CDC/NIH "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories"; 3ª edición, 1993, página 10. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separaron de los eritrocitos y de los granulocitos mediante purificación con ficoll-hypaque. La sangre periférica completa se diluyó 1:2 en PBS y 30 ml se depositaron sobre 15 ml de ficoll-hypaque en tubos de polipropileno de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 400 x g durante 30 min a 25ºC. Después de la centrifugación, se recogió la interfaz entre la capa superior de plasma y la capa inferior de ficoll, las células se lavaron 2x en RPMI-1640 y se realizaron recuentos de células viables empleando azul de tripano. Las células que se van a utilizar como sensibles en el ensayo, se almacenaron sobre hielo hasta que se completó el tratamiento con mitomicina C de las células estimuladoras.

Tratamiento con mitomicina C de estimuladores

PBMC aisladas tal y como se ha descrito anteriormente, para emplear como estimuladores en el ensayo, se ajustaron a 2-4 x 10^{6} células/ml en medio completo (RPMI 1640 que contenía 10% de suero AB humano termoinactivado, glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM y 100 U/ml de penicilina- 100 \mug/ml de estreptomicina), y se trataron con mitomicina C (25 \mug/ml) durante 30 min en baño de agua a 37ºC. Después del tratamiento, las células se lavaron 3x con 5 volúmenes de medio completo y se realizaron los recuentos de células viables empleando azul de tripano. Para establecer testigos de la estimulación autóloga, también se trataron algunas células sensibles con mitomicina C, tal y como se ha mencionado anteriormente.

Ig CTLA-4 y péptidos

Se produjo una proteína de fusión purificada de Ig CTLA-4, tal y como describen Steurer y col., 1995, a partir de la línea celular NS-1 amablemente cedida por Dr. T. Strom (Beth Israel Hospital, Boston, MA), en forma de una solución de 1 mg/ml en PBS estéril. La proteína se almacenó congelada a -80ºC. Después de descongelar, se almacenaron partes alícuotas a 4ºC. Los péptidos purificados se liofilizaron de acuerdo con procedimientos conocidos. Los péptidos fueron reconstituidos en PBS estéril, pH 7,4 con una concentración de 2 mM, se dividieron en partes alícuotas en tubos de micrófuga y se almacenaron congelados a -20ºC. Para el ensayo se descongeló una parte alícuota del péptido y se diluyó hasta 200 \muM en medio completo.

Ensayo de la respuesta linfocitaria mixta (humana)

Para el ensayo de un factor en la respuesta linfocitaria mixta alogénica (MLR), se extendieron en placas las células sensibles con 10^{5} células/pocillo y las células estimuladas con 5 x 10^{4} células/pocillo, en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se incubaron con diluciones en serie del anticuerpo (Ab) Leu 3A anti-CD4 (1 \mug/ml-0,06 \mug/ml) por triplicado, o un Ab testigo compatible con un isótopo. Como testigo adicional, se utilizó la ciclosporina A con 1 \mug/ml.

La Ig CTLA-4 se diluyó en serie y se sometió a ensayo desde 10 \mug/ml hasta 0,15 \mug/ml. Los péptidos se sometieron a ensayo directamente o en presencia de una dosis pico constante de Ig CTLA-4 con 0,5 \mug/ml. Las placas se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%, durante 7 días.

La proliferación de las células se determinó sometiendo los pocillos a impulsos con ^{3}H-Tdr (1 \muCi/pocillo) durante las 18 últimas horas del ensayo. Las placas se cosecharon empleando un cosechador de placas Tomtec y se determinaron las cuentas incorporadas empleando un lector Wallac de microbetaplacas plus.

Ensayos de estimulación con mitógenos

Para estos ensayos se incubaron PBMC purificados con ficoll-hypaque (10^{5} células/pocillo) en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano, con las concentraciones indicadas de fitohemoaglutinina (PHA; 5, 2,5, 1,25, 0,5 \mug/ml) durante 3 días a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5%/aire humidificado. Las células se incubaron en presencia o en ausencia de distintas concentraciones de Ig CTLA-4, mAb anti-CD80 purificado (1 \mug/ml), mAb anti-CD86 (1 \mug/ml) y los péptidos 199 y 201 diluidos en serie desde 100 \muM hasta 12,5 \muM para el periodo del ensayo.

La proliferación de las células se determinó sometiendo a impulsos los pocillos con ^{3}H-Tdr (1 \muCi/pocillo) durante las últimas 6 horas del ensayo. Las placas se cosecharon empleando un cosechador de placas Tomtec y se determinaron las cuentas incorporadas mediante un lector de microbetaplacas plus de Wallac.

Ejemplo 5 MLR en múridos

Se procedió con MLRs en múridos de un solo factor, empleando esplenocitos de ratón C57B1/6 como estimuladores y esplenocitos BalB/c como sensibles.

Aislamiento de esplenocitos de ratón

Los bazos se extirparon de ratones (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) de 6-8 semanas de edad. Las células se separaron de la cápsula empleando portaobjetos de vidrio congelados y estériles, y se lavaron 1x con RPMI 1640 frío. Los eritrocitos se lisaron tratando la suspensión de células del bazo con tampón frío de cloruro de amonio y Tris (2 ml/bazo) durante 3 min sobre hielo. Después de la lisis, las células se lavaron 2x en 5 volúmenes de medio completo (RPMI 1640 que contenía 10% de FBS termoinactivado, glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM, 100 U/ml de penicilina-100 \mug/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM y aminoácidos no esenciales 1 m).

Las células adherentes al plástico se separaron de los esplenocitos de ratones Balb/c, ajustando la concentración de células a 3 x 10^{6} células/ml en medio completo e incubando las células durante 1,5-2 h a 37ºC en frascos T-75. Después de la incubación, se recogieron las células no adherentes lavando suavemente los frascos y se determinó el tanto por ciento recuperado (60-70%). Las células Balb/C sensibles se almacenaron sobre hielo hasta completar el tratamiento con mitomicina C de las células estimuladoras.

Tratamiento con mitomicina C de estimuladores

Después de la lisis de RBC, los esplenocitos de ratones C57B1/6 se ajustaron hasta 2-4 x 10^{6} células/ml en medio completo y se trataron con mitomicina C (50 \mug/ml) durante 30 min a 37ºC en CO_{2} al 5% humidificado, en atmósfera de aire. Después del tratamiento, las células se lavaron 3x con 5 volúmenes de medio completo y se determinaron las células viables empleando recuento con azul de tripano.

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Para establecer testigos de la estimulación autóloga, también se trataron algunas células sensibles con mitomicina C, tal y como se ha mencionado anteriormente.

Ensayo de respuesta linfocitaria mixta (múridos)

Para el ensayo se extendieron en placas células sensibles y estimuladoras, con 105 células/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se incubaron con diluciones en serie de un Ab anti-CD4 (50 ng/ml-0,05 ng/ml) por triplicado, o un Ab testigo con isotipo compatible. La ciclosporina A con 1 \mug/ml se empleó como testigo adicional. Los péptidos CD28/CTLA-4 199 y 201 se diluyeron en serie y se sometieron a ensayo con una concentración final de 100 \muM hasta 1,56 \muM. La Ig CTLA-4 diluida en serie desde 10 \mug/ml, se usó como testigo positivo para inhibir la MLR.

Testigos aleatorizados adecuados del péptido y testigos de la matriz fueron incluidos en cada ensayo. Las placas fueron incubadas a 37ºC en CO_{2} al 5% humidificado, en atmósfera de aire, durante 4 días. La proliferación de las células se determinó sometiendo a impulsos los pocillos con ^{3}H-Tdr (1 \muCi/pocillo) durante las últimas 6 h del ensayo. Las placas se recogieron y se determinaron las cuentas incorporadas, tal y como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 6 Escrutinio biológico de los péptidos en el ensayo de MLR humana y de unión a Ig CTLA-4

Se sometieron a ensayo un total de 34 péptidos para inhibir la proliferación de los linfocitos en la MLR humana. Cada péptido se sometió a ensayo en una MLR con dosis en el intervalo desde 12,5 hasta 100 \muM. La actividad de cada péptido se identificó asignando un + y un - al péptido, dependiendo de su capacidad para inhibir la proliferación de linfocitos en la MLR (cpms).

A - fue asignado si todas las concentraciones del péptido sometido a ensayo proporcionaban <15% de cambio en cpm.

A +, ++ o +++ fue asignado dependiendo del grado de inhibición causado por el péptido, en donde:

+ fue asignado cuando la concentración del péptido sometido a ensayo proporcionaba >20% de cambio en cpm;

\text{++} fue asignado si el péptido sometido a ensayo proporcionaba >25% de cambio en cpm en una forma dependiente de la dosis; y

\text{+++} fue asignado si el péptido sometido a ensayo proporcionaba >50% de cambio en cpm en una forma dependiente de la dosis. Además de la MLR, estos 34 péptidos también fueron evaluados en un ensayo de unión de Ig CTLA-4/B7 en el que se examinó la capacidad de estos péptidos para afectar a la unión de Ig CTLA-4 con B7 en linfocitos B Cess, mediante análisis por FACS.

Como con la MLR, se asignó un + o un - a cada péptido dependiendo de su capacidad para efectuar la unión de Ig CTLA-4 a linfocitos B Cess; en donde - representa una falta de cambio en la unión, + representa un cambio menor de <10% en la unión y un ++ representa un cambio de >20% en la unión. Los resultados de la MLR y el análisis de la unión a B7 se muestran en la Tabla 3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Visión de conjunto de los datos de la MLR/Unión con el panel de péptidos

2

Los datos de cada péptido fueron analizados sin preferencias, de modo que los resultados de los ensayos anteriores no se consideraron para determinar si a un péptido se le asigna un + o un -.

Como se puede observar en la tabla anterior, sólo un pequeño número de péptidos exhibían actividad en alguno de estos ensayos. Estos péptidos que mostraban actividad o en la MLR o en el ensayo de unión (ATs nº 106, 107, 128, 131, 132, 133, 135, 136, 199) se volvieron a someter a ensayo varias veces para determinar si la observación inicial era reproducible.

Basándose en los resultados acumulativos de este análisis, los péptidos que mostraban una inhibición semi-reproducible o en la MLR o en el ensayo de unión, o en ambos, fueron seleccionados para otros análisis. Los péptidos seleccionados eran AT 106, 128, 133, 135 y 136, y más tarde, el péptido AT 199.

Análisis de péptidos positivos procedentes del primer escrutinio (AT 106, 128, 133, 135 y 136)

Puesto que los péptidos AT 106, 128, 133, 135 y 136 mostraban alguna actividad en los ensayos de MLR y/o de unión durante el escrutinio primario, estos péptidos fueron seleccionados para otros análisis. Estos péptidos se sometieron de nuevo al ensayo de MLR y de unión, tanto de forma individual como en combinación. En dos MLRs, ninguno de estos péptidos por sí mismo tenía algún efecto consistente sobre la MLR a concentraciones de hasta 200 \muM. Los análisis de estos mismos péptidos en el ensayo de unión a linfocitos B Cess, no mostraba efecto sobre la unión de Ig CTLA-4.

Identificación y evaluación de AT 199

Durante el curso de nuestro intento de escrutinio, los tres últimos péptidos sometidos a ensayo eran los péptidos 199, 200 y 201. Los resultados de las dos MLRs humanas en donde se comparaba la actividad de AT 199, 200 y 201, en el intervalo de dosis de hasta 100 \muM, se muestran en la Figura 6 y 7.

Como se puede observar en una MLR, AT 199 inhibía la proliferación de linfocitos en -70%, mientras que en la otra MLR la inhibía -30%. El grado de proliferación de linfocitos (30.000 cpm) era el mismo en ambos ensayos. Aunque no tenemos una explicación para la menor inhibición de AT 199 en esta MLR, se han observado tendencias similares para Ig CTLA-4 y puede ser una función del estado de las células empleadas para generar la MLR. El que AT 199 no pareciera inhibir ambas MLRs tan eficazmente, hace sugerir que este péptido no es citotóxico y que la actividad de AT 199 es biológicamente significativa. AT 199 se sometió a ensayo en un total de 6 ensayos de MLR humanas y era activa en 5 de 6.

Los análisis por espectrometría de masas de cada uno de estos análogos, mostraba que se obtenía la masa esperada, sin embargo, AT 199 contenía una porción significativa de producto lineal (32%).

Para mostrar que la actividad observada de AT 199 no era debida a un artefacto de la síntesis y para distinguir si el análogo replegado o la forma lineal libre del análogo era responsable del comportamiento inhibidor observado en la MLR, se produjeron tres nuevas cargas de AT 199.

AT 199.2A era una resíntesis de AT 199.1, en donde los estados de replegamiento se prolongaron hasta 5 días y el pH del tampón de replegamiento era desde un pH 8,5 hasta pH 10,0 para ayudar en la eficacia del procedimiento.

AT 199.2B se trató con yodoacetamida para purificar un análogo puramente lineal. Este procedimiento modifica los sulfhidrilos libres mediante una simple alquilación de los azufres, de modo que las cisteínas no están impedidas estéricamente ni tampoco son reactivas ni están disponibles para formar un puente disulfuro.

AT 199.3 era una resíntesis de AT 199.1 empleando los protocolos originales sin cambios. La Tabla 4 muestra un sumario de los análogos de AT 199 sintetizados y los resultados de una reacción de Ellman cuantitativa para determinar el equilibrio entre poblaciones cicladas covalentemente y lineales libres.

TABLA 4 Resultados del contenido en sulfhidrilo libre de los análogos de AT 199

Péptido	% de ciclación frente a % lineal
AT 199.1	68% cicl.: 32% lin.
AT 199.2A	94,1% cicl. : 5,9% lin.
AT 199.2B	0% cicl. : 100% lin.
AT 199.3	98,4% cicl. : 1,6% lin.

Las cargas sintetizadas de nuevo de AT 199 se utilizaron para consignar más específicamente si laspoblaciones lineales o cicladas de AT 199 eran responsables de la actividad observada en este análogo (nota - no está claro por qué AT 199.3 se cicla más eficazmente que AT 199.1, ya que se emplearon procedimientos idénticos). La población de péptido lineal que contenía sulfhidrilos libres, se redujo en más de un orden de magnitud en el análogo AT 199.3, en relación con la carga original. Si la actividad observada en las MLRs previas era debida a los análogos lineales libres, entonces se esperaría observar una reducción considerable de la actividad en el AT 199.3. El perfil de inhibición asociado con el AT 199.2B alquilado, debería ser capaz de informarnos sobre si la actividad observada está relacionada o no con la especificidad de la conformación.

Evaluación de AT 199.3, 199.2A y 199.2B en la MLR humana

Tal y como se ha descrito anteriormente, se realizó otra síntesis de AT 199 (199.3) junto con la generación de una versión lineal (199.2B) y una versión totalmente ciclada (199.2A) de AT 199. Estos péptidos fueron evaluados en diferentes MLRs humanas en comparación con el péptido AT 201 y en presencia y ausencia de Ig CTLA-4 (0,5 \mug/ml).

AT 199.3 y 199.2A inhibían 30% y 50% la MLR respectivamente, con 100 \muM en una MLR, y 70% y 25%, respectivamente, en otra MLR. AT 199.2B, por otro lado, inhibía <10% en la MLR con la mayor concentración (100 \muM) sometida a ensayo. Partiendo de este resultado, llegamos a la conclusión de que AT 199 requiere una conformación ciclada para ser activa.

Estos péptidos también fueron sometidos a ensayo para estudiar la actividad en otras 2 MLRs en las que Ig CTLA-4 tenía un pico con 0,5 \mug/ml. Los resultados de uno de estos estudios se muestran en la Figura 8.

AT 199.3, cuando se añadía con 0,5 \mug/ml de Ig CTLA-4, inhibía la MLR más que la Ig CTLA-4 por sí misma. AT 199.2A también era aditiva cuando se añadía en combinación con Ig CTLA-4, pero AT 199.2B y el péptido 201 no tenían efecto cuando se añadían junto con Ig CTLA-4. Estos resultados sugieren que la AT 199 ciclada tiene actividad inhibiendo la MLR humana y puede mejorar el efecto de Ig CTLA-4.

Evaluación de AT 199 en una MLR de múridos

La secuencia primaria de CTLA-4 es muy similar entre seres humanos y ratones. Una Ig CTLA-4 de múrido se utilizó durante estos estudios para inhibir una MLR humana. Por tanto, la actividad de AT 199 fue sometida a ensayo en una MLR de múrido. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 9.

AT 199.3 inhibía la MLR de múridos en \sim85%, lo que era similar a la inhibición con 10 \mug/ml de la Ig CTLA-4 por sí misma. El péptido 201 en este mismo ensayo inhibía sólo \sim25%. Por tanto, parece que AT 199 es activa, como Ig CTLA-4, en el sistema humano y en el sistema de ratón.

Evaluación de la toxicidad de los péptidos AT 199 y 201

Para determinar si la actividad de AT 199 era debida a un efecto específico sobre la proliferación de linfocitos en la MLR o debida a una inhibición no específica de la proliferación de linfocitos en general (es decir, toxicidad), se sometió a ensayo la toxicidad de AT 199 sobre células THP-1, Jurkat y PBLs inactivos y activados. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 10.

Tal y como se observa en la Figura 10, no se observó inhibición de THP-1, Jurkat o de los PBLs primarios inactivos en presencia de 100 \muM de AT 199.

AT 199 fue sometido a ensayo para estudiar la inhibición de PBLs activados con PHA. La activación con PHA, aunque no se dirige específicamente a la ruta de CD28, tiene cierta dependencia de esta ruta, dependiendo de la concentración de la PHA empleada para activar los linfocitos. Para determinar el AT 199 de la activación con fitohemoaglutinina (PHA) sobre la señalización de CD28, se incluyó Ig CTLA-4 en cada ensayo.

El efecto de AT 199 sobre una activación representativa con PHA, se muestra en la Figura 11. Como se puede observar en la Figura 11, 10 \mug/ml de Ig CTLA-4 inhibían la activación con PHA en \sim40-50% con ambas concentraciones de PHA (2,5 y 5 \mug/ml). AT 199, por otro lado, tenía sólo un efecto menor en la inhibición de la activación con PHA en este experimento, sugiriendo que la activación con PHA de los linfocitos de este donante particular sólo funcionaba parcialmente a través de la ruta de CD28. Por tanto, AT 199 no es tóxico para linfocitos, pero parece tener menor potencia que Ig CTLA-4 para actuar sobre la ruta de B7/B28.

AT 199, obtenido a partir del dominio CDR3, era el único péptido de los 34 análogos analizados que mostraba una inhibición significativa y reproducible en la MLR por sí misma. La inhibición dependía de la dosis y mostraba un IC_{50} aparente entre 50-100 \muM. Peach y col. (1994) han mostrado que una sola sustitución de Met por Ala en la región CDR3 de CTLA-4 humana, destruye la capacidad de la proteína de unirse a B7. Basándose en esta observación, se sintetizaron dos péptidos testigos de AT 199, en los que la Met se cambió por Ala (AT 200) o por Gly (AT 201). Aparte de estos cambios individuales de aminoácidos, los péptidos testigos eran idénticos a AT 199. Estos péptidos testigos no inhibían ninguna de las MLRs tanto como AT 199, en donde fueron sometidos a ensayo. Por tanto, AT 199 parece mostrar una especificidad de secuencia en su capacidad para inhibir la MLR.

AT 199 se trató con yodoacetamida para alquilar los azufres en el péptido, de modo que no se pudiera formar un puente disulfuro. Este péptido lineal, AT 199.2B, no tenía efecto sobre la proliferación de la MLR. Por tanto, AT 199 parece poseer especificidad conformacional.

AT 199 y sus testigos análogos fueron sometidos a ensayo para estudiar una toxicidad manifiesta y la inhibición no específica. Los péptidos fueron añadidos a cultivos en crecimiento de células THP-1, células Jurkat y linfocitos primarios de sangre periférica (PBLs). No se observó un efecto sobre el crecimiento de ninguno de estos cultivos celulares, lo que indicaba que la inhibición observada en la MLR no era debida a la toxicidad.

Para estudiar un mecanismo no anticipado de la inhibición, se sometió a ensayo AT 199 empleando la estimulación de PBLs con PHA. La fitohemoaglutinina (PHA) es una lecitina extraída de la alubia roja y es una mezcla de cinco glicoproteínas tetrámeras. PHA estimula los linfocitos T en presencia de células accesorias (pero no linfocitos B) reticulando una variedad de moléculas decisivas de la superficie de los linfocitos T, que incluyen CD3, CD2, CD4, CD8 y LFA-1 (Geppert, 1992). La implicación de CD28 en esta estimulación es dependiente del grado de reticulación con PHA. Con una concentración adecuada de PHA, la interacción simultánea de los receptores de la superficie celular da como resultado una respuesta proliferativa que puede desviar la necesidad de señales coestimuladoras específicas, tales como CD28. Esto se puede vigilar examinando la inhibición de Ig CTLA-4 de la mitogénesis de PHA. AT 199 no inhibía los linfocitos T estimulados con PHA bajo las mismas condiciones en las que MLR se inhibía considerablemente. Ig CTLA-4 inhibía ligeramente la activación con PHA. Por tanto, estos datos son compatibles con un efecto biológico dirigido a un aspecto específico de la activación de linfocitos T.

A partir de los datos mostrados en esta memoria empleando 34 péptidos, se puede concluir que se ha aislado al menos 1 péptido (AT 199) que inhibe solo una respuesta inmune humana dependiente de CD28.

La referencia a etapas de métodos conocidos, a etapas de métodos convencionales, a métodos conocidos o a métodos convencionales, no es de ningún modo una admisión de que cualquier aspecto, descripción o realización de la presente invención esté descrita, se ilustre o se sugiera en la técnica anterior.

La descripción anterior de las realizaciones específicas da a conocer con seguridad la naturaleza general de la invención, que el experto puede modificar y/o adaptar fácilmente, aplicando sus conocimientos de la técnica (que incluyen los contenidos de las referencias citadas en esta memoria) para diversas aplicaciones, tales como realizaciones específicas, sin una experimentación indebida, sin apartarse de la presente invención. Por ello, tales adaptaciones y modificaciones pretenden estar dentro del significado y el rango de equivalentes de las realizaciones descritas, basándose en los estudios y las guías presentadas en esta memoria. Se debe entender que la fraseología o la terminología de esta memoria tiene el fin de describir y no de limitar, de modo que la terminología o la fraseología de la presente memoria descriptiva debe ser interpretada por los expertos en la técnica basándose en los estudios y las guías presentadas en esta memoria, junto con los conocimientos de un experto común en la técnica.

Referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 14, John B. Gorsiraweg

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: CURACAO

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: EL TAYAR, Nabil

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 143 Gerald Road

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Milton

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: Massachussetts

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):02186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BLECHNER, Steven

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 40 Harestwood Drive

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: West Bridgewater

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: Massachussetts

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):02379

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: JAMESON, Brad

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 76 Robbins Street

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Milton

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: Massachussetts

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):02186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: TEPPER, Mark

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 60 Eagle Drive

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Canton

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: Massachussetts

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):02021

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDOS INHIBIDORES DE CD28/CTLA-4, SUS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MÉTODO PARA UTILIZAR LOS MISMOS

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 37

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: BROWDY AND NEIMARK, P.L.L.C.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 419 Seventh Street N.W. Ste. 300

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Washington

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: D.C.

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

C.P.: 20004

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERADOR: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-JUN-1998

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/049.470

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-JUN-1997

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: YUN, Allen C

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 37.971

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE ORDEN: EL TAYAR=1 PCT

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (202) 628-5197

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (202) 737-3528

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Lys Cys Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Cys His His}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Tyr Leu Val Lys Gln Ser}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Val Ala Gln Pro Ala}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Val Glu Gln Pro Ala}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Cys Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu Phe Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu Phe Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Cys Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:10

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Glu Tyr ALa Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Ser Ala Val Glu Val}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Lys Thr Gly Phe Asn Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Glu Cys Thr Phe Cys Asp Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asp Asp Ser Ile Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Ser Gly Asn Gln Val Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Ser Pro Asn Gln Val Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Pro Asn Gln Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Tyr Pro Pro Tyr Leu Arg Gly Gly Lys Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Gly Lys Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Tyr Pro Pro Gln Tyr Gly Lys Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Lys Ala Lys Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Arg Gly Gly Lys Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Lys Ala Lys Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Lys Cys Leu Ala Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Cys His His}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Lys Cys Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Cys His His}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Tyr Pro Pro Pro Tyr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Pro Tyr Tyr Leu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

4

2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 109 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 103 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:36:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys}

\sac{Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp}

\sac{Gln Lys Glu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:37:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Ala Leu Ser Leu Thr Cys}

\sac{Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Asn Thr Ile Leu Tyr Tyr Trp Ser Trp}

\sac{Ile Arg Gln Pro Pro}

Claims (20)

1. Un compuesto que comprende los residuos de aminoácidos 2 a 9 de la SEQ ID NO:1 y que está ciclado mediante un enlazador entre los residuos de aminoácidos 2 y 9 de SEQ ID NO:1.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente 1 a 11 aminoácidos, N-terminales a los residuos de aminoácidos 2 a 9 de SEQ ID NO:1.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los aminoácidos 1 a 11, N-terminales a los residuos de aminoácidos 2 a 9 de la SEQ ID NO:1, son aminoácidos cargados positivamente.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente los aminoácidos 1 a 11, C-terminales a los residuos de aminoácidos 2 a 9 de la SEQ ID NO:1.

5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en el que los aminoácidos 1 a 11, C-terminales a los residuos de aminoácidos 2 a 9 de SEQ ID NO:1, son aminoácidos cargados positivamente.

6. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el enlazador es un puente disulfuro Cys-Cys.

7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una o varias secuencias de aminoácidos, seleccionadas entre el grupo consistente en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20.

8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 que está ciclada mediante un puente disulfuro Cys-Cys entre los residuos de aminoácidos 1 y 10 de SEQ ID NO:1.

9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende adicionalmente una o varias secuencias de aminoácidos seleccionadas entre el grupo consistente en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20.

10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en el que una o varias secuencias de aminoácidos seleccionadas entre el grupo consistente en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20, están enlazadas entre sí y/o con aminoácidos de la SEQ ID NO:1 directamente o mediante un enlazador.

11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende adicionalmente 1 a 10 aminoácidos, N-terminales a los residuos de aminoácidos 1 a 10 de SEQ ID NO:1.

12. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 11, en el que los residuos de aminoácidos 1 a 10, N-terminales a los residuos de aminoácidos 1 a 10 de SEQ ID NO:1, son aminoácidos cargados positivamente.

13. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende adicionalmente 1 a 10 aminoácidos, C-terminales a los residuos de aminoácidos 1 a 10 de SEQ ID NO:1.

14. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 13, en el que los aminoácidos 1 a 10, C-terminales a los residuos de aminoácidos 1 a 10 de SEQ ID NO:1, son aminoácidos cargados positivamente.

15. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende adicionalmente dos aminoácidos cargados positivamente, ambos N-terminal y C-terminal a los residuos de aminoácidos 1 a 10 de SEQ ID NO:1.

16. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para uso como un medicamento.

17. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades del sistema inmune y del cáncer.

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la enfermedad del sistema inmune se selecciona entre las enfermedades autoinmunes, tales como psoriasis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso, diabetes, artritis reumatoide, y la terapia para el rechazo de trasplantes que incluyen vísceras macizas y trasplantes celulares.

20. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de patologías y trastornos que se mejoran con la inhibición de la interacción de CD28 y/o CTLA-4 con CD80 y CD86.