ES2215793T3

ES2215793T3 - Material de cromatografia y procedimiento de utilizacion del mismo.

Info

Publication number: ES2215793T3
Application number: ES00992208T
Authority: ES
Inventors: Jochen Tittgen
Original assignee: Tittgen Dr Biotechnologie
Current assignee: Tittgen Dr Biotechnologie
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2020-12-20
Also published as: CA2394746A1; DE50005627D1; JP2003524157A; US6800752B2; WO2001046686A9; CN1244403C; WO2001046686A2; ATE261579T1; WO2001046686A3; EP1242816A2; JP3987342B2; CA2394746C; DE19962577A1; CN1413300A; DK1242816T3; AU771618B2; AU3921801A; US20030040621A1; EP1242816B1

Abstract

Material de cromatografía para la separación de mezclas de ácido nucleico con un soporte y funciones de intercambiadores de iones aplicadas sobre éste, caracterizado porque el soporte comprende un material fibroso.

Description

Material de cromatografía y procedimiento de utilización del mismo.

La presente invención se refiere a un material de cromatografía para la separación de mezclas de ácido nucleico y a un procedimiento para la separación de mezclas de ácido nucleico utilizando este material de cromatografía.

La aplicación de la cromatografía, así como los materiales de cromatografía que se emplean son imprescindibles en el campo de la bioquímica, medicina, farmacia y tecnología genética. Con la ayuda de materiales de cromatografía se separan y aislan rápida y sistemáticamente biomoléculas como ácidos nucleicos y proteínas. A menudo, en la biología molecular es preciso aislar ácidos nucleicos determinados a partir de una mezcla que existe de forma natural a partir de más de cien componentes distintos, que están contenidos en esta mezcla en concentraciones de menos de 0,1%. Por consiguiente, las exigencias a un procedimiento cromatográfico y al material de cromatografía utilizado comprenden, por una parte, el aislamiento cuantitativo de los ácidos nucleicos y, por otra parte, la separación cuantitativa de impurezas, a fin de depurar el ácido nucleico como especie molecular hasta la homogeneidad para el siguiente análisis.

En los procedimientos de cromatografía conocidos, se emplean materiales de cromatografía inorgánicos granulados con tamaños de grano y de poro definidos, cuya superficie se modifica con un reactivo de silanización para la fabricación de una fase estacionaria. A continuación, la reacción con un reactivo que forma un intercambiador de aniones o de cationes, lleva al material de cromatografía acabado.

Por ejemplo, en el documento WO 91/05606 se describe un material de soporte para la cromatografía que está indicado para la separación de distintos tipos de ácido nucleico. Como soportes se tienen en cuenta gel de sílice, óxido de aluminio, dióxido de titanio, vidrio poroso o resinas. El material de soporte debe poseer un tamaño de grano de 3 a 500 \mum con un tamaño de poro de, aproximadamente, 10 a 1000 nm y una superficie específica de 5 a 800 m^{2}/g. La superficie de este soporte granulado se silaniza con alcoxisilanos. Por otra parte, se describe un material de soporte cromatográfico sobre una base de gel de sílice con grupos intercambiadores de aniones que se mantienen junto con una hidroxilamina secundaria mediante transformación del alcoxisilano.

Según el documento EP 0 104 210 se describen también materiales de gel de sílice con un tamaño de grano de 3 a 100 \mum que poseen un tamaño de cavidad de 10 a 1000 nm y una superficie específica de 5 a 800 m^{2}/g. Éstos se tratan superficialmente con un medio de silanización y se emplean con funciones de intercambiador iónico en la cromatografía para la separación de ácidos nucleicos.

Finalmente, por el documento EP 0744025 se conoce un material de cromatografía en el que un soporte de gel de sílice se mezcla con un reactivo de silanización, eligiendo materiales de soporte que posean un diámetro de poro de 4 a 6 nm. El tamaño de partícula del soporte es de 1 a 500 \mum.

En las separaciones cromatográficas de mezclas de ácido nucleico utilizando los materiales de cromatografía granulados convencionales se ha comprobado que las separaciones requieren mucho tiempo. Si, por ejemplo, se empleó como soporte una columna determinada para la cromatografía con un gel de sílice modificado, había que contar con que bajo condiciones de gravity-flow era preciso aceptar un tiempo de adsorción de los ácidos nucleicos en el soporte de, como mínimo, 20 minutos.

Los materiales de cromatografía conocidos hasta ahora poseen, además, una porosidad definida, dado que, según la opinión generalizada, sólo una superficie porosa, es decir, aumentada del soporte garantiza una carga suficiente con intercambiadores iónicos. Sin embargo, esta porosidad tiene el inconveniente de que la calidad de la separación del ácido nucleico no es la óptima. Esto debe atribuirse a que durante la separación, otras sustancias contenidas en la mezcla como ARN o proteínas, se difunden en los poros y, por consiguiente, influyen negativamente en el proceso de separación.

Por lo tanto, la presente invención se basaba en la tarea de poner a disposición un material de cromatografía que, en un tiempo mínimo, pueda llevar a cabo una separación de mezclas de ácido nucleico, siendo posible al mismo tiempo conseguir una disolución excelente de las mezclas de ácido nucleico y la consecuente pureza de los ácidos nucleicos a aislar.

Continúa siendo tarea de la presente invención poner a disposición un procedimiento con el que sea posible, en un tiempo mínimo, separar una mezcla de ácido nucleico con una disolución y pureza máximas de los distintos componentes.

Estas tareas se resuelven con las características de la reivindicación 1 y de la reivindicación 12.

La presente invención se refiere a un material de cromatografía para la separación de mezclas de ácido nucleico con un soporte y las funciones de intercambiador iónico aplicadas comprendiendo el soporte un material fibroso.

Las subreivindicaciones se refieren a formas de realización preferentes del material de cromatografía según la invención.

La invención se refiere a un procedimiento para la separación de mezclas de ácido nucleico con el material de cromatografía según la invención, realizándose la separación cromatográfica de los ácidos nucleicos por medio de la actuación de una fuerza.

Las subreivindicaciones se refieren a formas de realización preferentes del procedimiento según la invención.

Finalmente, la invención se refiere a un kit para la separación de mezclas de ácido nucleico que contiene un material de cromatografía según la presente invención. El kit comprende el material de cromatografía según la invención en la disposición deseada junto con los respectivos tampones para la realización de la separación cromatográfica de mezclas de ácido nucleico con el material de cromatografía.

La invención se explica por medio de las figuras. Éstas muestran:

Fig. 1 un ejemplo para una columna con el material de cromatografía según la invención;

Fig. 2 la separación de componentes de la mezcla de ácido nucleico en un gel de agarosa empleando el material de cromatografía según la invención;

Fig. 3 la separación de componentes de la mezcla de ácido nucleico en un gel de agarosa utilizando un material de cromatografía del estado de la técnica y

Fig. 4 la separación de componentes de la mezcla de ácido nucleico en un gel de agarosa empleando el material de cromatografía según la invención.

Según la invención se ha comprobado sorprendentemente que se puede conseguir una capacidad de separación considerablemente mejorada si el soporte del material de cromatografía comprende un material fibroso cuya superficie no se aumenta o sólo se hace de forma insignificante. En contra de la opinión predominante, el material de cromatografía según la invención se puede cargar con una cantidad correspondiente de grupos de intercambiadores iónicos funcionales, a fin de garantizar una capacidad de separación óptima.

La superficie específica del soporte está en un campo de 0,05 a 50 m^{2}/g, preferentemente en el campo de 1 a 10 m^{2}/g, en especial 1 a 5 m^{2}/g.

Como soporte se tienen en cuenta aquellos materiales fibrosos que están indicados para la modificación de su superficie con funciones de intercambiador iónico. Un material adecuado para el soporte son, por ejemplo, las microfibras, prefiriéndose las microfibras de vidrio. Estos materiales poseen una superficie sin poros.

En una forma de realización preferente, el material fibroso se puede someter a un tratamiento con ácido o lejía antes de su utilización como soporte.

El soporte fibroso puede consistir en una masa que se puede usar directamente para la cromatografía. No obstante, también es posible continuar tratando la masa en formas adecuadas para la separación.

Se ha demostrado que para muchas aplicaciones, el material de cromatografía según la invención comprende ventajosamente un soporte que se configura en forma de membrana. Para una capacidad idónea del material de cromatografía resulta preferente que la membrana posea un grosor de, al menos, 0,05 mm independientemente de la superficie total.

En una forma de realización preferente del material de cromatografía según la invención, la membrana es de una sola capa. Sin embargo, también es posible prever la membrana con varias capas, según la capacidad deseada de la separación.

El soporte del material de cromatografía según la invención se ha transformado con un reactivo de silanización. Como reactivo de silanización se puede utilizar, por ejemplo, uno como el que se describe en el documento WO 91/05606. Según los procedimientos conocidos también se pueden aplicar a la fase estacionaria grupos de intercambiadores iónicos o grupos de intercambiadores catiónicos. En el documento WO 91/05606 se describe un ejemplo.

El material de cromatografía según la invención tiene la ventaja de que con él es posible llevar a cabo, en un tiempo mínimo, un proceso de separación de mezclas de ácido nucleico. El motivo puede verse en que incluso en caso de fuerzas intensas, por ejemplo, vacío, existe un tiempo de retención suficiente para la separación de los ácidos nucleicos en el material de cromatografía según la invención que posee una densidad de material más elevada que los materiales de cromatografía habituales. En virtud de la elevada densidad que se puede generar, la separación de los ácidos nucleicos se puede llevar a cabo con un volumen de lecho del intercambiador de iones muy bajo. Los volúmenes de lavado y de elusión son respectivamente reducidos.

Con el material de cromatografía según la invención, la separación de mezclas de ácido nucleico se lleva a cabo con la máxima precisión y también pureza de las fracciones a obtener. Esto se demuestra especialmente en comparación con los materiales de cromatografía granulados habituales. Con este objetivo se aplicaron mezclas de ácido nucleico antes de la separación en ARN y ADN y después de la separación mediante el material de cromatografía según la invención y dos materiales de cromatografía habituales sobre un gel de agarosa.

La figura 2 muestra la separación de los componentes de la mezcla de ácido nucleico con el material de cromatografía según la invención. Las distintas trazas muestran los recorridos por la columna:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Traza L: \+ cleared lysate antes de la separación\cr  Traza D: \+
recorrido de columnas\cr  Traza W 1: \+ primer lavado\cr  Traza W 2:
\+ segundo lavado\cr  Traza E: \+
elusión\cr}

El mismo experimento se realizó con materiales de cromatografía habituales. A este respecto, nos remitimos a las figuras 3 y 4. En las trazas se aplican los mismos recorridos de columna.

En la figura 2 se puede ver que en el eluido en la traza E, el ARN se separa completamente de. ADN de plasmagen. También se puede reconocer con claridad que los distintos recorridos antes de la elusión no conllevan ninguna pérdida de ADN.

Las figuras 3 y 4 muestran la separación de componentes de una mezcla de ácido nucleico con materiales de cromatografía granulados habituales. Especialmente en la depuración en la figura 3 se muestra una fuerte pérdida de ADN en la traza E. Por otra parte, se produce un mal empobrecimiento de ARN, lo que se puede ver en la traza W 2, donde todavía son arrastradas cantidades importantes de ARN en el segundo ciclo lavado.

En la figura 4 también se puede reconocer un mal empobrecimiento en la utilización de otro material de cromatografía habitual. La traza W 2 aún lleva una cantidad considerable de ARN en el segundo lavado.

Otra ventaja frente a los materiales de cromatografía granulados habituales consiste en que el eluido E no contiene ningún tipo de partícula del material de cromatografía (fines). Esto conduce a una notable mejora de la calidad de los ácidos nucleicos obtenidos.

El procedimiento según la invención para la separación de mezclas de ácido nucleico utilizando el material de cromatografía según la invención se caracteriza porque éste se lleva a cabo aplicando una fuerza.

En una forma de realización preferente, el procedimiento se ejecuta mediante la aplicación de un vacío.

Por ejemplo, después de la aplicación de la muestra de la mezcla de ácido nucleico, el material de cromatografía según la invención se somete a un vacío que provoca una separación en, aproximadamente, 20 segundos. Esto es totalmente contrario a las columnas de gel de sílice habituales que con, como mínimo, 10 veces el volumen de lecho del intercambiador de iones en el gravity-flow, requieren una duración de separación de, al menos, 20 minutos.

El material de cromatografía según la invención se puede emplear prácticamente en todos los procedimientos cromatográficos. Entre ellos cuentan la cromatografía de columnas, separaciones en Spincolumns y Spincups o separaciones en el procedimiento Batch, en los que el material de cromatografía está en suspensión o fijado en recipientes de reacción, microplacas de títulos, puntas de pipeta, varillas de agitación o cintas de prueba.

En la separación cromatográfica en Spincups se emplea la fuerza centrífuga, separando cromáticamente la muestra introducida en Spincups en la máquina centrifugadora.

Con el material de cromatografía según la invención se puede separar cualquier mezcla de ácido nucleico de una forma muy efectiva. Por consiguiente, es posible aislar con la máxima pureza el ADN de mezclas que junto a grandes cantidades de ARN sólo contienen cantidades muy reducidas de ADN. En este caso, se puede suprimir totalmente el empleo de sustancias tóxicas como fenol, cloroformo o etidiumbromuro. Por otra parte, las separaciones se pueden llevar a cabo completamente evitando
ARNasa.

En la figura 1 se muestra un ejemplo para una columna que se ha configurado con el material de cromatografía según la invención. En una columna de material sintético usual en el comercio (1) con una salida que se estrecha hacia abajo para la aplicación de un vacío, se prevé una frita inferior (2) con un grosor de 1 mm que cierra con la salida. Sobre la misma se aplica el material de cromatografía según la invención (3) en forma de una membrana de microfibras de vidrio con un grosor de 2 mm. Finalmente se coloca sobre la misma una frita superior (4) con un grosor de 1 mm.

En todos los demás procedimientos de cromatografía como, por ejemplo, en Spin-cups o en microplacas de títulos (96-Well-Plates).

El procedimiento según la invención para la separación de mezclas de ácido nucleico utilizando el material de cromatografía según la invención se lleva a cabo en un simple gradiente escalonado mediante lavado de la disposición cargada con la mezcla de ácido nucleico y posterior eluido del ácido nucleico deseado con una solución salina tamponada adecuada. La mayor parte del ARN se separa durante el enlace del ADN en el material de cromatografía según la invención, limpiando el ARN aún restante durante el proceso de lavado. Por consiguiente, no es necesario un tratamiento con ARN.

Si la separación cromatográfica se lleva a cabo, por ejemplo, en una columna o microplaca de título, acto seguido tiene lugar en un tiempo muy reducido, es decir, unos 20 segundos, una separación en la disposición de los componentes aplicando un vacío. También se obtiene una separación con una eficiencia excelente en Spincups que se introducen en una centrifugadora, llevándose a cabo la separación mediante la fuerza centrífuga en un período de tiempo reducido como 20 segundos aproximadamente.

El material de cromatografía según la invención se puede introducir en el mercado de distintas maneras. Por ejemplo, es posible ofrecer el material de cromatografía según la invención en la disposición deseada como kit junto con el equipo necesario para la cromatografía, por ejemplo, con los tampones. Naturalmente también se incluyen otras formas de comer-
cio.

La invención se ilustra por medio de los siguientes ejemplos, no obstante sin limitarse a los mismos.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de cultivos bacterianos

Para los preparados de plasmagen se preparan cultivos de e.coli de acuerdo con la práctica microbiológica usual. El primer día se realiza un frotis de individualización de un cultivo de cepa congelada en un medio selectivo (por ejemplo, agar LB con ampicilina como antibiótico). Después de una incubación durante la noche a 37ºC, se inocula el segundo día una colonia individual bien lavada en 50-300 ml de medio líquido (por ejemplo, LB) al que se ha añadido el correspondiente antibiótico. Después de otra incubación nocturna a 37ºC en el agitador con buena ventilación (200-300 rpm) se aumentan en su caso los volúmenes de cultivo o se retiran directamente los cultivos crecidos. En caso de una ampliación, se inocula la cantidad correspondiente de medio líquido fresco mezclado con el antibiótico en el cultivo del día anterior, con un 1% de su volumen, que se incuba durante toda la noche a 37ºC en el agitador con 200-300 rpm.

Para un minipreparado se utilizan de uno a tres ml del cultivo con plasmagen high copy o de 5 a 20 ml de cultivo con plasmagen low copy. En los preparados medianos y máximos se emplean mayores cantidades.

Ejemplo 2 Aislamiento del ADN de las bacterias

La cantidad de cultivo de bacterias indicada en el ejemplo 1 para un minipreparado se centrifuga en un recipiente de centrifugación apropiado durante 3 minutos a 13.000 x g, desechándose completamente el medio excedente. El medio que eventualmente refluya del borde del recipiente de centrifugación se elimina con la pipeta y se desecha igualmente. Las bacterias pelletizadas se resuspenden completamente mediante texado previo en 0,4 ml de tampón de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA/100 \mum/ml de ARNasa. No se deberán poder detectar grumos celulares ni grupos celulares.

Las células suspendidas se lisan añadiendo 0,4 ml de tampón de 200 mM NaOH/0,1% (w/v) SDS. Las células suspendidas se mezclan con el tampón de lisis mediante repetidas inversiones hasta obtener una fase homogénea. Debido al ADN genómico de bacterias emergido, esta fase es muy viscosa. Se incuba durante un máximo de 5 minutos a temperatura ambiente.

La mezcla de lisis se neutraliza añadiendo 0,4 ml de tampón de 3.1-3.4 M de acetato potásico (pH 5,5 con ácido acético). Una vez añadido el tampón, se vuelve a mezclar mediante repetidas inversiones hasta obtener una fase homogénea. Esta fase es ahora muy líquida. No puede haber restos viscosos en el lisado celular.

El producto precipitado en la neutralización compuesto por proteínas bacterianas y fragmentos celulares se centrifuga durante 10 minutos con \geq 13.000 x g a temperatura ambiente, retirando con la pipeta el remanente claro ("Cleared Lysate").

Ejemplo 3 Preparación de una columna con material de cromatografía según la invención

5 g de fibra de vidrio no porosa con una superficie específica de 5 m^{2}/g se mezclan en 750 ml de xilol seco con 60 g de glicidoxipropiltrimetoxisilano y 0,13 ml de trietilamina. La mezcla de reacción se desgasifica mediante triple aplicación de un vacío y posterior aireado con nitrógeno y se calienta a 130ºC durante 4 horas con exclusión de aire y de humedad. Se procede a la filtración y al lavado con xilol y tetrahidrofurano. La fibra de vidrio modificada se seca al vacío a 50ºC.

Posteriormente, el producto se mezcla con 750 ml y 42 g de dietilamina y se calienta bajo reflujo durante 18 horas. El producto se lava con dioxano y metanol y se seca al vacío a 70ºC. La masa de fibra de vidrio así modificada con función de intercambio de aniones se convierte ahora en una membrana de intercambio de aniones. La masa de fibra de vidrio se leviga en acetona, se lamina o se funde para obtener la forma deseada y después se seca. Una membrana según el diámetro de la columna se corta después y se coloca en el dispositivo según la figura 1.

Ejemplo 4 Separación del ADN de bacterias

La columna según el ejemplo 3 se coloca sobre una cámara de vacío adecuada (por ejemplo, VacMan, Promega). La membrana de intercambio de iones se equilibra con 2 ml de tampón de 100 mM NaAc/HAC (pH 5,0)/600 mM NaCl. Para ello, el tampón se introduce con la pipeta en la columna atravesando completamente la membrana mediante la aplicación de un vacío de chorro de agua. La bomba de vacío permanece conectada hasta que la membrana ya no aspire visiblemente ningún líquido. Después se desconecta el vacío.

En la columna se carga el "Cleared Lysate" del ejemplo 2, haciéndolo pasar completamente por la membrana mediante aplicación del vacío de chorro de agua. Nuevamente la bomba de vacío permanece conectada hasta que la membrana ya no aspire, a simple vista, ningún líquido. Después el vacío se desconecta.

Para la eliminación de componentes enlazados de forma no específica, la columna se lava con 2,5 ml de tampón de 100 mM NaAc/HAC (pH 5,0)/600 mM NaCl. Para ello, el tampón se introduce con la pipeta en la columna atravesando completamente la membrana mediante la aplicación de un vacío de chorro de agua. La bomba de vacío permanece conectada hasta que la membrana ya no aspire visiblemente ningún líquido. Después se desconecta el vacío. Esta fase de lavado se repite una vez en el caso de los preparados mínimos y medianos.

La columna se retira de la cámara de vacío, eluyendo el ADN de plasmagen unido a la membrana mediante adición de 0,8 ml de tampón de 100 mM Tris-HCl (pH 8,5)/1250 mM NaCl directamente en un recipiente apropiado. El tampón se introduce en la columna con la ayuda de la pipeta y se hace pasar manualmente por la membrana con ayuda de un troquel apropiado. Es conveniente que el tampón de elusión se haga pasar a presión en una rápida sesión de goteo pero en ningún caso en forma de chorro. Es preciso que las distintas gotas se puedan reconocer a simple vista.

Los productos eluidos se mezclan con un 0,7 en volumen de isopropanol (temperatura ambiente) agitando perfectamente. El ADN de plasmagen así precipitado se centrifuga durante un mínimo de 30 minutos a \geq 13.000 x g y 4ºC desechando el remanente. El ADN pelletizado se lava una vez con etanol al 80%, se vuelve a centrifugar, después se seca (dejándolo reposar a temperatura ambiente o al vacío) y disolviendo posteriormente el ADN seco en una cantidad apropiada de tampón TE o agua durante 10 minutos a 37ºC.

El ADN de plasmagen disuelto se mide espectrofotométricamente y se analiza en un gel de agarosa.

La figura 2 muestra la separación de los componentes de la mezcla en un gel de agarosa al 1% con un tampón TAE, pH 8,3. En las distintas trazas se han aplicado los siguientes componentes:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Traza L: \+ Cleared Lysate antes de la separación\cr  Traza D: \+
Paso de columnas\cr  Traza W1: \+ Primer lavado\cr  Traza W2: \+
Segundo lavado\cr  Traza E: \+
Eluido\cr}

En las trazas L, D y W1 se puede reconocer claramente que el preparado sigue teniendo ARN. Una separación completa de los componentes de la mezcla de ácido nucleico se puede ver sin embargo claramente en el producto eluido de la traza E que sólo muestra el ADN de plasmagen sin las impurezas del ARN.

Ejemplo 5 Separación del ADN de bacterias

El mismo ADN de bacteria utilizado en el ejemplo 2 se introdujo a través de una columna de la compañía Macherey-Nagel (NUCLEOBOND Kits) que contenía un material de cromatografía tradicional y se separó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se representan en la figura 3.

Ejemplo 6 Separación del ADN de bacterias

Se utilizó un material de cromatografía tradicional de la compañía Qiagen (Qiagen Plasmid Kits) para separar las bacterias del ejemplo 2. Se trabajó siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se representan en la figura 4.

Claims

1. Material de cromatografía para la separación de mezclas de ácido nucleico con un soporte y funciones de intercambiadores de iones aplicadas sobre éste, caracterizado porque el soporte comprende un material fibroso.

2. Material de cromatografía según la reivindicación 1, caracterizado porque la superficie específica del soporte es de 0,5 a 50 m^{2}/g.

3. Material de cromatografía según, al menos, una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el material fibroso se compone de microfibras.

4. Material de cromatografía según la reivindicación 3, caracterizado porque las microfibras son microfibras de vidrio.

5. Material de cromatografía según, al menos, una de las reivindicaciones 1 y 4, caracterizado porque el material fibroso existe en forma de una masa.

6. Material de cromatografía según la reivindicación 5, caracterizado porque la masa se configura como masa.

7. Material de cromatografía según, al menos, una de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque la membrana posee un grosor de, como mínimo, 0,05 mm.

8. Material de cromatografía según la reivindicación 7, caracterizado porque la membrana es de una sola capa.

9. Material de cromatografía según la reivindicación 7, caracterizado porque la membrana es de varias capas.

10. Material de cromatografía según, al menos, una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el soporte se transforma con un reactivo de silanización.

11. Material de cromatografía según la reivindicación 10, caracterizado porque los grupos de intercambiadores de iones se acoplan mediante el reactivo de silanización.

12. Material de cromatografía según la reivindicación 10, caracterizado porque los grupos de intercambiadores de cationes se acoplan mediante el reactivo de silanización.

13. Procedimiento para la separación de mezclas de ácido nucleico utilizando un material de cromatografía según, al menos una de las reivindicaciones 1a 12, caracterizado porque la separación cromatográfica se realiza por medio de la actuación de una fuerza.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque se aplica un vacío.

15. Procedimiento según las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque la separación cromatográfica se lleva a cabo en una columna o en microplacas de títulos.

16. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la separación se realiza mediante fuerza centrífuga.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque la separación se realiza en Spincups en la centrifugadora.

18. Procedimiento según, al menos, una de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque la separación cromatográfica se realiza en un gradiente escalonado.

19. Procedimiento según, al menos, una de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado porque no se utiliza ningún ARNasa.

20. Kit para la separación de mezclas de ácido nucleico que contiene un material de cromatografía según, al menos, una de las reivindicaciones 1 a 12.