ES2216996T3 - Construcciones para suministrar agentes terapeuticos a celulas neuronales. - Google Patents
Construcciones para suministrar agentes terapeuticos a celulas neuronales.Info
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Abstract
Una composición que comprende un agente terapéutico unido a un polipéptido, donde el polipéptido es un polipéptido no tóxico, para suministrar un agente terapéutico a una célula neuronal, que comprende un dominio de unión que se une a la célula neuronal y que comprende o procede de fragmentos de cadena pesada clostridial y un dominio de translocación que transloca el agente terapéutico al interior de la célula neuronal, donde el dominio de translocación no es un dominio HN de una toxina clostridial y no es un fragmento derivado de un dominio HN de una toxina clostridial y donde el agente terapéutico tiene la función de reducir la lesión neuronal posterior a una isquemia/reperfusión o tiene la función de promover el crecimiento neuronal después de una lesión.
Description
Construcciones para suministrar agentes
terapeúticos a células neuronales.
La presente invención se refiere a construcciones
para suministrar sustancias terapéuticas a células neuronales, a la
fabricación y uso de las mismas y, en particular, a construcciones
basadas en neurotoxinas clostridiales.
Actualmente se dispone de pocos tratamientos
eficaces para trastornos importantes del sistema nervioso central.
Tales trastornos incluyen enfermedades neurodegenerativas,
apoplejía, epilepsia, tumores cerebrales, infecciones y
encefalopatía por VIH, y los pacientes que sufren estas enfermedades
exceden con mucho a la morbilidad del cáncer y las enfermedades
cardíacas. El número de pacientes que sufren trastornos del SNC
tales como apoplejía y enfermedades neurodegenerativas está
empezando a incrementarse, particularmente en países desarrollados
donde está aumentando la edad media de la población. Según aumenta
la comprensión de la farmacología del cerebro y se esclarecen las
patologías subyacentes de las enfermedades, se vuelven patentes
ciertas estrategias terapéuticas potenciales. Sin embargo, todos
estos tratamientos se enfrentan al tremendo problema del suministro
eficaz de los agentes terapéuticos a las diversas poblaciones de
células neuronales implicadas. De esta manera, se requieren vectores
que puedan efectuar un suministro eficaz en las células neuronales
para una amplia serie de sustancias terapéuticas, incluyendo
fármacos, enzimas, factores de crecimiento, péptidos terapéuticos y
genes.
La lesión de isquemia/reperfusión inducida por
una apoplejía o por una lesión es un ejemplo notable en el que un
suministro rápido y eficaz de agentes terapéuticos produciría un
efecto beneficioso considerable. Las neuronas lesionadas por
traumatismo o isquemia producen niveles elevados de radicales de
oxígeno libres y liberan grandes cantidades de glutamato. Estas
sustancias, cuando están a una alta concentración, son tóxicas tanto
para las neuronas como para las células circundantes, lo cual
potencia y amplifica el proceso de lesión. Se ha demostrado que
ciertos agentes tales como la superóxido dismutasa o la glutamina
sintetasa que reducen los niveles de estas sustancias tóxicas,
reducen la muerte de las células neuronales en una diversidad de
modelos de isquemia in vitro e in vivo (Gorovits et
al. PNAS (1997) 94, 7024-7029; Francis et
al. Experimental Neurology (1997) 146, 435-443;
Lim et al. Ann.Thorac. Surg. (1986) 42,
282-286; Cuevas et al. Acta Anat. (1990) 137,
303-310). Un problema importante en el uso de tales
terapias es el suministro de concentraciones útiles del agente
activo en el sitio del traumatismo. Por lo tanto, los vectores
neuronales específicos podrían jugar un papel importante en la
dirección de tales compuestos a las células neuronales.
Los trastornos del sistema nervioso periférico,
tales como la enfermedad de neuronas motoras, son otros ejemplos de
enfermedades que se beneficiarían del suministro dirigido de agentes
terapéuticos. Tales terapias podrían tomar la forma de suministro de
fármacos o suministro de ADN por medio de estrategias de terapia
génica.
La terapia génica supone una promesa considerable
para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la
enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. La mayoría de
los vectores de suministro génico virales y no virales disponibles
actualmente carecen de especificidad de tejido, lo cual reduce tanto
su eficacia como la seguridad de su uso. Por lo tanto, se requieren
ligandos de dirección específicos para células neuronales adecuados
para una amplia serie de vectores génicos, para facilitar el
desarrollo de tratamientos eficaces para enfermedades
neuronales.
Las neurotoxinas botulínicas son una familia de
toxinas proteicas cuyo sitio primario de acción es la unión
neuromuscular, donde bloquean la liberación del transmisor
acetilcolina. La acción de estas toxinas sobre el sistema nervioso
periférico del ser humano y de los animales produce el síndrome
denominado botulismo, que se caracteriza por una parálisis muscular
flácida generalizada (Shone (1986) en "Natural Toxicants in
Foods", Editor D. Watson, Ellis Harwood, UK). Cada una de las
neurotoxinas botulínicas consta de dos subunidades unidas por
enlaces disulfuro; una subunidad pesada de 100 kDa que participa en
la unión inicial y en la internalización de la neurotoxina en la
terminación nerviosa (Dolly et al. (1984) Nature, 307,
457-460) y una subunidad ligera de 50 kDa que actúa
intracelularmente bloqueando el proceso de exocitosis (Mclnnes and
Dolly (1990) Febs Lett., 261, 323-326; de Paiva and
Dolly (1990) Febs Lett., 277, 171-174).
Las neurotoxinas clostridiales son potentes
inhibidores de la secreción de neurotransmisores dependiente de
calcio en células neuronales. Actualmente se considera que median
esta actividad por una escisión endoproteolítica específica de al
menos una de tres proteínas asociadas a la membrana presináptica o a
vesículas, VAMP, sintaxina o SNAP-25, que son
fundamentales en los acontecimientos de acoplamiento de vesículas y
fusión de membranas de la secreción de neurotransmisores. La
dirección a las células neuronales de las neurotoxinas tetánica y
botulínica se considera un suceso mediado por receptores por medio
del cual las toxinas se internalizan y posteriormente se dirigen al
compartimento intracelular apropiado donde realizan su actividad
endopeptidasa.
Las neurotoxinas clostridiales comparten una
arquitectura común de una cadena L catalítica (LC, aprox. 50 kDa)
unida por enlaces disulfuro a una cadena H de unión al receptor y
translocación (HC, aprox. 100 kDa). Se considera que el polipéptido
HC comprende todo o parte de dos dominios funcionales distintos. La
mitad carboxi-terminal de HC, que recibe el nombre
de dominio H_{C} (aprox. 50 kDa), está implicada en la unión
neuroespecífica de alta afinidad de la neurotoxina a receptores de
la superficie celular presentes en la neurona diana, mientras que se
considera que la mitad amino-terminal, que recibe
el nombre de dominio H_{N} (aprox. 50 kDa), media la translocación
de al menos alguna porción de la neurotoxina a través de las
membranas celulares de tal forma que la actividad funcional de la LC
se exprese dentro de la célula diana. El dominio H_{N} también
tiene la propiedad, en condiciones de bajo pH, de formar canales
permeables a iones en membranas lipídicas y, de alguna manera, esto
puede estar relacionado con su función de translocación. En el caso
de la neurotoxina botulínica de tipo A (BoNT/A), se considera que
estos dominios residen dentro de los restos aminoacídicos
872-1296 en el caso de H_{C}, dentro de los restos
aminoacídicos 449-871 en el caso de H_{N} y dentro
de los restos 1-448 en el caso de LC.
Por lo tanto, es posible proporcionar
definiciones funcionales de los dominios dentro de la molécula de
neurotoxina, como se indica a continuación:
- (A)
- cadena ligera de neurotoxina clostridial:
- -
- una metaloproteasa que presenta alta especificidad de sustrato por proteínas asociadas a vesículas y/o a la membrana plasmática implicadas en el proceso de exocitosis. En particular, escinde una o más de SNAP-25, VAMP (sinaptobrevina/celubrevina) y sintaxina
- (B)
- dominio H_{N} de cadena pesada de neurotoxina clostridial:
- -
- una porción de la cadena pesada que permite la translocación de esa porción de la molécula de neurotoxina de tal forma que se produce una expresión funcional de la actividad de la cadena ligera dentro de una célula diana
- -
- el dominio responsable de la translocación de la actividad endopeptidasa, después de la unión de la neurotoxina a su receptor de la superficie celular específico a través del dominio de unión, al interior de la célula diana
- -
- el dominio responsable de la formación de poros permeables a iones en membranas lipídicas en condiciones de bajo pH
- (C)
- dominio H_{C} de cadena pesada de neurotoxina clostridial:
- -
- una porción de la cadena pesada que es responsable de la unión de la holotoxina nativa al receptor o receptores de la superficie celular implicados en la acción de intoxicación de la toxina clostridial antes de la internalización de la toxina en la célula.
Actualmente no se conoce la identidad de los
marcadores de reconocimiento celular para estas toxinas y aún no se
han identificado especies de receptores específicos, aunque Kozaki
et al. han indicado que la sinaptotagmina puede ser el
receptor de la neurotoxina botulínica de tipo B. Es probable que
cada una de las neurotoxinas tenga un receptor diferente.
La toxina tetánica es muy similar
estructuralmente a las neurotoxinas botulínicas, pero su sitio
primario de acción es el sistema nervioso central, donde bloquea la
liberación de neurotransmisores inhibidores desde la sinapsis
central (células de Renshaw).
Se ha demostrado que las neurotoxinas tetánica y
botulínica de la mayoría de los siete serotipos, junto con sus
cadenas pesadas derivadas, se unen a una amplia diversidad de tipos
de células neuronales con altas afinidades en el intervalo
nanomolar, por ejemplo, la neurotoxina botulínica de tipo B (Evans
et al. (1986) Eur. J. Biochem. 154,
409-416).
Sin embargo, un obstáculo principal para el uso
de fragmentos de cadena pesada clostridial nativa como vectores de
suministro es que su estado altamente agregado en solución impide su
difusión de manera adecuada en el tejido corporal y, por lo tanto,
reduce su eficacia como vector de dirección. Otro problema
significativo relacionado con cualquier uso clínico propuesto de
fragmentos de la toxina tetánica nativa como ligandos de dirección
neuronal para terapia, es la existencia de anticuerpos circulantes
contra la toxina en la mayor parte de la población que se ha
inmunizado contra el tétanos. Es probable que la presencia de estos
anticuerpos reduzca la eficacia de construcciones basadas en
fragmentos de la toxina tetánica. De esta manera, los fragmentos de
neurotoxinas clostridiales no ofrecen soluciones para los problemas
identificados.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de las dificultades prácticas en el uso de
composiciones terapéuticas basadas en neurotoxinas clostridiales, y
en el desarrollo de polipéptidos modificados y polipéptidos híbridos
basados en fragmentos de neurotoxinas clostridiales que eviten los
inconvenientes mencionados anteriormente.
El documento
EP-A-439 954 describe una proteína
híbrida ternaria, en la que hay un dominio de unión, un dominio de
translocación y una entidad química a suministrar a las células.
Este documento no menciona el uso de proteínas clostridiales como
dominios de unión.
El documento
WO-A-99/09057 describe un método
para el suministro in vivo de una composición deseada en el
sistema nervioso humano o animal. La composición comprende un
fragmento proteolítico no tóxico de la toxina tetánica capaz de
unirse a las células nerviosas y que se transporta de forma
retrógrada a través de una sinapsis, en asociación con al menos una
molécula que tiene una función biológica.
El documento
WO-A-99/17806 describe una clase de
agentes que comprenden una lectina de unión a galactosa unida a un
derivado de una neurotoxina clostridial (cadena L). Estos agentes
pueden usarse en el tratamiento del dolor crónico.
Por consiguiente, un primer aspecto de la
invención proporciona una composición que comprende un agente
terapéutico unido a un polipéptido, donde el polipéptido es un
polipéptido no tóxico, para suministrar un agente terapéutico a una
célula neuronal, que comprende:
- un dominio de unión que se une a la célula neuronal y que comprende o procede de fragmentos de cadena pesada clostridial y
- un dominio de translocación que transloca el agente terapéutico al interior de la célula neuronal,
donde el dominio de translocación no es un
dominio H_{N} de una toxina clostridial y no es un fragmento o
derivado de un dominio H_{N} de una toxina clostridial y donde el
agente terapéutico tiene la función de reducir la lesión neuronal
posterior a una isquemia/reperfusión o tiene la función de promover
el crecimiento neuronal después de una
lesión.
En otro aspecto, la invención también proporciona
una composición que comprende un agente terapéutico unido a un
polipéptido, donde el polipéptido tiene la función de suministrar un
agente terapéutico a una célula neuronal, que comprende:
- un dominio de unión que se une a la célula neuronal y que comprende o procede de fragmentos de cadena pesada clostridial y
- un dominio de translocación que transloca el agente terapéutico al interior de la célula neuronal,
donde el dominio de translocación es un dominio
de translocación que no forma agregados, como se mide por su tamaño
en tampón fisiológico, y donde el agente terapéutico tiene la
función de reducir la lesión neuronal posterior a una
isquemia/reperfusión o tiene la función de promover el crecimiento
neuronal después de una
lesión.
Si la construcción es una construcción que forma
agregados, normalmente esto es evidente por la falta de solubilidad
de la construcción, y puede verse con una simple inspección visual
de la construcción en medio acuoso: los dominios que no forman
agregados producen construcciones de la invención que son
parcialmente o preferiblemente totalmente solubles, mientras que los
dominios que forman agregados producen agregados no solubles de
polipéptidos que tienen tamaños aparentes de muchas decenas o
incluso centenas de veces mayores que el tamaño de un solo
polipéptido. Generalmente, la construcción no debe formar agregados,
como se mide por el tamaño en electroforesis en gel, y el tamaño o
tamaño aparente de la construcción medida preferiblemente debe ser
menor de 5,0 x 10^{5} daltons, más preferiblemente menor de 1,5 x
10^{5} daltons, realizándose la medición convenientemente en PAGE
nativa usando condiciones fisiológicas.
Otro aspecto de la invención proporciona una
composición que comprende un agente terapéutico unido a un
polipéptido, donde el polipéptido tiene la función de suministrar un
agente terapéutico a una célula neuronal, que comprende:
- un dominio de unión que se une a la célula neuronal y que esta compuesto o procede de fragmentos de cadena pesada clostridiales y
- un dominio de translocación que transloca el agente terapéutico al interior de la célula neuronal,
donde el dominio de translocación se selecciona
entre (1) un dominio H_{N} de una toxina diftérica, (2) un
fragmento o derivado de (1) que retiene sustancialmente la actividad
de translocación del dominio H_{N} de una toxina diftérica, (3) un
péptido fusogénico, (4) un péptido que rompe la membrana y (5)
fragmentos de translocación y derivados de (3) y (4) y donde el
agente terapéutico tiene la función de reducir la lesión neuronal
posterior a una isquemia/reperfusión o tiene la función de promover
el crecimiento neuronal después de una
lesión.
Debe indicarse que la toxina botulínica C_{2}
no es un neurotoxina ya que no tiene especificidad neuronal, en su
lugar es una enterotoxina y es adecuada para uso en la invención
para proporcionar un dominio de translocación que no forme
agregados.
Otro aspecto de la invención proporciona una
composición que comprende un agente terapéutico unido a un
polipéptido, donde el polipéptido tiene la función de suministrar un
agente terapéutico o una célula neuronal, que comprende:
- un dominio de unión que se une a la célula neuronal y que comprende o procede de fragmentos de cadena pesada clostridial y
- un dominio de translocación que transloca el agente terapéutico al interior de la célula neuronal,
donde el polipéptido tiene una menor afinidad por
anticuerpos neutralizadores contra la toxina tetánica en comparación
con la afinidad por tales anticuerpos de la toxina tetánica nativa y
donde el agente terapéutico tiene la función de reducir la lesión
neuronal posterior a una isquemia/reperfusión o tiene la función de
promover el crecimiento neuronal después de una
lesión.
Los aspectos anteriores pueden mostrarse
individualmente o en cualquier combinación por los polipéptidos de
la invención y, de esta manera, un polipéptido preferido típico de
la invención (i) carece de las actividades neurotóxicas de las
toxinas botulínica y tetánica, (ii) presenta alta afinidad por
células neuronales correspondiente a la afinidad de una neurotoxina
clostridial para esas células, (iii) contiene un dominio que puede
realizar una translocación a través de las membranas celulares, y
(iv) existe en un estado menos agregado que la cadena pesada
correspondiente de la toxina botulínica o tetánica en tampones
fisiológicos.
Una ventaja significativa de los polipéptidos de
la invención es su estado no agregado que, de esta manera, hace que
sean útiles como polipéptidos solubles en situaciones en las que las
construcciones de la técnica anterior no lo eran y que se solucionen
la mayoría, si no todos los inconvenientes de las construcciones
previas basadas en neurotoxinas clostridiales.
Los polipéptidos de acuerdo con la invención
generalmente incluyen secuencias de los dominios H_{C} de las
neurotoxinas botulínica y tetánica, y estos dominios se combinan con
dominios funcionales de otras proteínas, de tal forma que se
conserven las funciones esenciales de la cadena pesada nativa, la
unión a las células neuronales. De esta manera, por ejemplo, el
dominio H_{C} de la neurotoxina botulínica de tipo F se fusiona
con el dominio de translocación derivado de la toxina diftérica para
proporcionar un fragmento de cadena pesada clostridial modificada.
Sorprendentemente, tales polipéptidos son más útiles como
construcciones para suministrar sustancias a células neuronales que
las cadenas pesadas clostridiales nativas.
De esta manera, de acuerdo con un aspecto
preferido de la invención, se proporciona un polipéptido que tiene
una secuencia de aminoácidos que comprende (a) una subsecuencia
basada en el fragmento H_{C} de la neurotoxina botulínica o
tetánica, y (b) una subsecuencia basada en un dominio de
translocación, por ejemplo, de la toxina diftérica, que no procede
de una neurotoxina clostridial, y donde dicho polipéptido (i) carece
de las actividades de neurotoxina de las toxinas botulínica y
tetánica, (ii) presenta alta afinidad por células neuronales, (iii)
contiene un dominio que puede realizar la translocación a través de
las membranas celulares, y (iv) existe en un estado menos agregado
que la cadena pesada correspondiente de la toxina botulínica o
tetánica en tampones fisiológicos.
La cadena pesada clostridial modificada
convenientemente se produce combinando el dominio de unión (dominio
H_{C}) de una neurotoxina clostridial con un dominio de
translocación no clostridial. De esta manera, por ejemplo, puede
construirse un fragmento de cadena pesada clostridial modificada a
partir del dominio de translocación de la toxina diftérica (resto
194-386) fusionado al dominio H_{C} de una toxina
botulínica (por ejemplo, fragmento H_{C} de tipo F, restos
865-1278; fragmento H_{C} de tipo A, restos
872-1296).
En otra realización de la invención, la cadena
pesada clostridial modificada se produce combinando el dominio
H_{C} de una neurotoxina clostridial con un péptido que rompe la
membrana que funciona como dominio de translocación,
convenientemente un péptido viral. De esta manera, por ejemplo,
puede construirse un fragmento de cadena pesada clostridial
modificada combinando el dominio H_{C} de una toxina botulínica
con un péptido basado en la hemaglutinina del virus de la influenza
HA2 (restos 1-23).
Los polipéptidos de la invención tienen
propiedades que hacen que sean útiles como ligandos de dirección a
neuronas; no son tóxicos y retienen la unión específica y de alta
afinidad a células neuronales presentada por las toxinas botulínica
o tetánica. Sin embargo, a diferencia de las cadenas pesadas
clostridiales nativas, las cadenas pesadas clostridiales modificadas
existen en un estado menos agregado en solución que mejora su acceso
a las células neuronales. Las construcciones preferidas son solubles
en solución acuosa, lo cual contrasta con el estado altamente
agregado de las construcciones de la técnica anterior.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un fragmento de cadena pesada tetánica modificada que, además de las
propiedades de las cadenas pesadas modificadas definidas
anteriormente, tiene la ventaja añadida de que tiene menor afinidad
por anticuerpos neutralizadores, presentes como resultado de la
inoculación de la vacuna antitetánica, en comparación con la cadena
pesada de la toxina tetánica nativa. Los polipéptidos de acuerdo con
este aspecto de la invención generalmente incluyen subsecuencias
derivadas de la cadena pesada de la toxina tetánica (restos
458-1315) y de las que se han reducido o eliminado
opcionalmente epítopos responsables de la inmunogenicidad de la
toxina tetánica. De esta manera, por ejemplo, es deseable eliminar
epítopos inmunogénicos asociados con el dominio H_{C} así como los
del dominio H_{N}. Aunque es posible eliminar epítopos retirando
un pequeño número de aminoácidos (por ejemplo, menos de 20 o
preferiblemente menos de 10 aminoácidos), se ha descubierto que los
epítopos asociados con la inmunogenicidad de la cadena pesada de la
toxina tetánica pueden reducirse con más rigurosidad reemplazando un
gran número de restos aminoacídicos (por ejemplo, al menos 100, al
menos 200 y preferiblemente 400 o más restos) por secuencias de
aminoácidos de otras toxinas.
De esta manera, de acuerdo con un aspecto
preferido de la invención relacionado con cadenas pesadas tetánicas
modificadas, se proporciona un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos que comprende (a) un dominio H_{N} derivado de una
fuente no clostridial (por ejemplo, toxina diftérica), (b) una o más
subsecuencias derivadas de la secuencia de un H_{C} botulínico, y
(c) una o más subsecuencias derivadas de la secuencia del dominio
H_{C} de la toxina tetánica, y donde dicho polipéptido (i) carece
de las actividades de neurotoxina de las toxinas botulínica y
tetánica, (ii) presenta alta afinidad por células neuronales que
corresponde a la unión neuronal de la neurotoxina tetánica, (iii)
contiene un dominio que puede realizar la translocación a través de
las membranas celulares, y (iv) tiene baja afinidad por anticuerpos
neutralizadores contra la toxina tetánica que están presentes como
resultado de la inoculación de la vacuna antitetánica.
Este último fragmento de cadena pesada tetánica
modificada puede producirse combinando el dominio de unión (dominio
H_{C}) de la neurotoxina tetánica con un dominio de translocación
no clostridial. De esta manera, por ejemplo, puede construirse un
fragmento de cadena pesada tetánica modificada a partir del dominio
de translocación de la toxina diftérica (restos
194-386) fusionado con el dominio H_{C} de una
toxina tetánica (restos 865-1315).
En otra realización de la invención, la cadena
pesada tetánica modificada procede de un dominio de translocación no
clostridial fusionado con el dominio H_{C} de una toxina
botulínica en la que se han insertado los dominios mínimos de la
toxina tetánica para conferir al híbrido resultante una actividad de
unión del tipo de la toxina tetánica. De esta manera, por ejemplo,
una cadena pesada tetánica modificada puede construirse a partir del
dominio de translocación de la toxina diftérica (restos
194-386) fusionado al dominio H_{C} de un
fragmento botulínico de tipo F (restos 865-1278) en
el que los restos 1097-1273 se han reemplazado por
secuencias homólogas de la toxina tetánica.
Las cadenas pesadas tetánicas modificadas tienen
propiedades que hacen que sean útiles como ligandos de dirección
neuronales; no son tóxicas y retienen la unión específica y de alta
afinidad a células neuronales que presenta la toxina tetánica. Sin
embargo, a diferencia de los fragmentos de unión de la toxina
tetánica nativa, los fragmentos de unión clostridiales modificados
tienen propiedades inmunogénicas diferentes que hacen que sean más
útiles clínicamente. Específicamente, las propiedades inmunogénicas
diferentes de los fragmentos de unión clostridiales modificados de
la invención reducen significativamente los problemas causados por
los anticuerpos existentes contra las secuencias de la toxina
tetánica nativa.
Aunque el uso de cadenas pesadas modificadas
basadas en neurotoxinas botulínicas como ligandos de dirección a
neuronas no padece el problema de los anticuerpos circulantes
preexistentes, la toxina tetánica es única entre las toxinas
clostridiales ya que tiene selectividad por las neuronas inhibidoras
(por ejemplo, las células de Renshaw) y, de esta manera, las cadenas
pesadas de la toxina tetánica modificadas son ligandos de dirección
valiosos para esta clase de neuronas. La toxina tetánica también
tiene la propiedad de que puede realizar un transporte retrógrado
desde el sistema nervioso periférico al central.
En otra realización de la invención, el fragmento
de la cadena pesada clostridial modificada se fusiona a un péptido
enlazador a través del extremo N del dominio de translocación al que
puede unirse un polipéptido de carga útil. Un ejemplo de tal péptido
enlazador es la secuencia CGLVPAGSGP (SEC ID Nº: 1), que contiene el
sitio de escisión por la proteasa trombina y un resto de cisteína
para la formación de puntes disulfuro. Tal enlazador peptídico
permite la producción de una proteína de fusión recombinante que
comprende una molécula terapéutica polipeptídica fusionada por el
péptido enlazador al extremo N del fragmento de la cadena pesada
clostridial modificada. Esta última proteína de fusión monocatenaria
después puede tratarse con trombina para proporcionar una proteína
bicatenaria en la que el polipéptido terapéutico está unido al
dominio de translocación del fragmento de cadena pesada clostridial
modificada por un enlace disulfuro. En otro ejemplo de un péptido
enlazador en el que el dominio de translocación no contiene un resto
de cisteína libre cerca de su extremo C, tal como ocurre cuando el
dominio de translocación es un péptido fusogénico, el péptido
enlazador contiene los dos restos de cisteína necesarios para la
formación del puente disulfuro. Un ejemplo de este último péptido
enlazador es la secuencia de aminoácidos: CGLVPAGSGPSAGSSAC (SEC ID
Nº: 2).
En otra realización de la invención, la cadena
pesada clostridial modificada se une a un polipéptido que puede ser
una enzima, factor de crecimiento, proteína o péptido que tiene
efectos terapéuticos beneficiosos cuando se suministra a células
neuronales. El polipéptido puede unirse a la cadena pesada
clostridial modificada por medios químicos. Como alternativa, el
polipéptido puede producirse como una proteína de fusión unida al
fragmento de unión clostridial modificado por tecnología
recombinante usando los péptidos enlazadores que se han descrito
anteriormente. En tal ejemplo, la construcción podría contener los
siguientes componentes:
una sustancia terapéutica polipeptídica;
un péptido enlazador; y
una cadena pesada clostridial modificada.
Un ejemplo de una carga útil terapéutica
polipeptídica es la superóxido dismutasa.
En otra realización de la invención, la cadena
pesada clostridial modificada se une directa o indirectamente a ADN
de tal forma que la construcción sea capaz de suministrar el ADN a
células neuronales, por ejemplo, a través del receptor para la
toxina tetánica. Tales construcciones tienen aplicaciones de terapia
génica y pueden usarse para activar o inactivar genes seleccionados
con la célula. El ADN puede estar contenido dentro de un liposoma o
puede condensarse a través de un péptido o proteína. La cadena
pesada clostridial modificada puede unirse químicamente a la
proteína que realiza la condensación del ADN por agentes de
acoplamiento químico. Como alternativa, la cadena pesada clostridial
modificada puede producirse como una proteína de fusión, por
tecnología recombinante, con un péptido que puede realizar la
condensación del ADN.
En otra realización de la invención, el fragmento
de cadena pesada clostridial modificada puede unirse a un virus
recombinante de tal forma que el virus modificado tenga un tropismo
alterado y sea capaz de transducir células a través del receptor de
la toxina tetánica. Tal construcción es de utilidad para corregir
defectos genéticos dentro de células neuronales por medio de la
activación o desactivación de genes seleccionados. El fragmento de
cadena pesada clostridial modificada puede unirse directamente a la
superficie del virus usando agentes de entrecruzamiento químico.
Como alternativa, el fragmento de cadena pesada clostridial
modificada puede unirse al virus recombinante a través de un
anticuerpo que se une específicamente al virus. En este caso, el
fragmento de unión clostridial modificado se acopla químicamente a
un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce específicamente
un marcador en la superficie del virus. Podría producirse una
proteína de fusión similar de fragmento de unión clostridial
modificado-anticuerpo por tecnología recombinante,
en la que el componente de anticuerpo es un anticuerpo monocatenario
recombinante.
En otra realización más de la invención, el
fragmento de cadena pesada clostridial modificada se une a un
sistema de liberación de fármacos, tal como una micropartícula
construida a partir de un polímero adecuado, por ejemplo
poli(lactida-co-glicolida),
polihidroxialconato, colágeno, poli(anhídrido
divinil-eter-comaleico),
poli(anhídrido
estireno-co-maleico) u otro polímero
útil en tales micropartículas. El fragmento de cadena pesada
clostridial modificada puede unirse al sistema de liberación de
fármaco por acoplamiento químico covalente, o por fuerzas
electrostáticas o hidrófobas. El fragmento de cadena pesada
clostridial modificada también puede encapsularse dentro del
vehículo de liberación junto con la carga útil terapéutica, siempre
que en la superficie quede expuesta una porción del fragmento de
unión clostridial modificado. Como alternativa, el fragmento de
cadena pesada clostridial modificada puede unirse, por el extremo N
o C, a un péptido o proteína para facilitar el acoplamiento del
fragmento al sistema de liberación de fármaco.
Se conocen otras estrategias por medio de las
cuales los fragmentos de unión de cadenas pesadas modificadas pueden
unirse a una serie de sustancias terapéuticas usando una diversidad
de técnicas de entrecruzamiento químico establecidas, y pueden
producirse diversas proteínas de fusión que contengan un fragmento
de unión clostridial modificado y otro polipéptido. Usando estas
técnicas, pueden dirigirse diversas sustancias a las células
neuronales usando los fragmentos de unión clostridiales modificados.
En la Tabla 1 presentada más adelante, se proporcionan con más
detalle ejemplos de posibles usos de los fragmentos de unión
clostridiales modificados como vectores de suministro neuronal.
Las construcciones de la invención pueden
introducirse en tejido neuronal o no neuronal usando métodos
conocidos en la técnica. Por medio de la unión específica posterior
al tejido de células neuronales, la construcción dirigida ejerce sus
efectos terapéuticos. Idealmente, la construcción se inyecta cerca
de un sitio que requiere intervención terapéutica.
La construcción de la invención puede producirse
como una suspensión, emulsión, solución o como un polvo liofilizado,
dependiendo de la aplicación y de las propiedades de la sustancia
terapéutica. La construcción de la invención puede resuspenderse o
diluirse en una diversidad de líquidos farmacéuticamente aceptables
dependiendo de la aplicación.
"Neurotoxina clostridial" significa la
neurotoxina tetánica o una de las siete neurotoxinas botulínicas,
recibiendo estas últimas los nombres de serotipo A, B, C_{1}, D,
E, F o G.
"Fragmento de cadena pesada clostridial
modificada" significa un fragmento polipeptídico que se une a
receptores de células neuronales de una manera similar a una cadena
pesada correspondiente derivada de la toxina botulínica o tetánica,
pero que difiere en su secuencia de aminoácidos y en sus propiedades
del fragmento correspondiente derivado de la toxina tetánica.
"Unión", en relación con los fragmentos de
cadena pesada botulínica y tetánica, significa la interacción
específica entre el fragmento clostridial y uno o más receptores de
la superficie celular o marcadores que tiene como resultado la
localización del fragmento de unión en la superficie celular. En el
caso de las neurotoxinas clostridiales, la propiedad de un fragmento
de poder "unirse" como un fragmento de un serotipo dado puede
demostrarse por competición entre el ligando y la toxina nativa por
su receptor en la célula neuronal.
"Unión de alta afinidad específica por la
célula neuronal correspondiente a la de una neurotoxina
clostridial" se refiere a la capacidad de un ligando para unirse
fuertemente a receptores de la superficie celular de células
neuronales que están implicados en la unión específica de una
neurotoxina dada. La capacidad de un ligando dado para unirse
fuertemente a estos receptores de la superficie celular puede
evaluarse usando ensayos de unión competitivos convencionales. En
tales ensayos, una neurotoxina clostridial radiomarcada se pone en
contacto con células neuronales en presencia de diversas
concentraciones de ligandos no radiomarcados. La mezcla de ligandos
se incuba con las células a baja temperatura (0-3ºC)
para impedir la internalización del ligando, y durante este tiempo
puede producirse una competición entre la neurotoxina clostridial
radiomarcada y el ligando no marcado. En tales ensayos, cuando el
ligando no marcado usado es el mismo que el de la neurotoxina
marcada, la neurotoxina clostridial radiomarcada se desplazará de
los receptores de las células neuronales según aumenta la
concentración de neurotoxina no marcada. Por lo tanto, la curva de
competición obtenida en este caso será representativa del
comportamiento de un ligando que muestra "especificidad de unión
de alta afinidad por células neuronales correspondiente a la de una
neurotoxina clostridial", como se usa en este documento.
"Dominio de translocación" significa un
dominio o fragmento de una proteína que realiza el transporte de sí
mismo y/o de otras proteínas y sustancias a través de una membrana o
bicapa lipídica. Esta última membrana puede ser la de un endosoma en
el que se producirá la translocación durante el proceso de
endocitosis mediada por receptores. Los dominios de translocación a
menudo pueden identificarse por la propiedad de que pueden formar
poros medibles en las membranas lipídicas a bajo pH (Shone et
al. Eur. J. Biochem. 167, 175-180). En la Figura
1 presentada más adelante se presentan con más detalle ejemplos de
dominios de translocación. En la solicitud, los dominios de
translocación a menudo se denominan "dominios H_{N}".
"Translocación", en relación con el dominio
de translocación, significa los acontecimientos de internalización
que se producen después de la unión a la superficie celular. Estos
acontecimientos conducen al transporte de sustancias al interior del
citosol de las células neuronales.
Las expresiones "sustancias terapéuticas" o
"agentes" significan cualquier sustancia, agente o mezcla de
los mismos que, si se suministrara por el fragmento de unión
clostridial modificado, sería beneficioso para el tratamiento de
enfermedades neuronales. Los ejemplos de éstos incluyen fármacos,
factores de crecimiento, enzimas y ADN empaquetado en diversas
formas (por ejemplo, virus modificados, liposomas catiónicos y ADN
condensado).
En la presente invención también se proporcionan
métodos para fabricar los polipéptidos de la invención por medio de
la expresión en una célula hospedadora de un ácido nucleico que
codifica el polipéptido, y el uso de un polipéptido o una
composición de acuerdo con la invención en el tratamiento de un
estado de enfermedad asociado con células neuronales.
La invención se ilustra a continuación en las
siguientes realizaciones específicas y va acompañada por los
dibujos, en los que:
la Fig. 1 muestra fragmentos de cadena pesada
clostridial modificada producidos por tecnología recombinante como
proteínas de fusión;
la Fig. 2 muestra fragmentos de cadena pesada
clostridial modificada producidos por tecnología recombinante; las
proteínas de fusión pueden contener una o más señales de péptidos de
purificación para ayudar a la purificación de la proteína; también
pueden incluirse uno o más sitios de escisión por proteasas para
permitir la eliminación de las señales de péptidos de purificación;
también pueden emplearse estrategias de purificación similares para
fragmentos de unión clostridiales modificados que contienen un
dominio de translocación;
la Fig. 3 muestra la unión de un fragmento de
unión clostridial modificado a una sustancia terapéutica; la cadena
pesada clostridial modificada contiene un dominio de translocación
que tienen un grupo tiol libre (un ejemplo de dominio de
translocación con esta propiedad es la secuencia de aminoácidos
194-386 de la toxina diftérica), un grupo amino
libre de la sustancia terapéutica se modifica con un reactivo de
entrecruzamiento (por ejemplo SPDP; Pierce & Warriner, UK Ltd.),
lo cual posteriormente permitirá la formación de conjugados usando
el tiol libre presente en el fragmento de unión clostridial
modificado;
la Fig. 4 muestra la formación de un conjugado
entre un fragmento de cadena pesada clostridial modificada y un
oligonucleótido como se describe en el Ejemplo 4;
la Fig. 5 muestra una estrategia para producir
una cadena pesada clostridial modificada recombinante como proteína
de fusión con una sustancia terapéutica polipeptídica. Esta última
se fusiona a la cadena pesada clostridial modificada por un péptido
enlazador. El péptido enlazador contiene un solo sitio de escisión
por proteasa (por ejemplo, que se reconoce por la trombina) y un
resto de cisteína. Son ejemplos de péptidos enlazadores (a)
CGLVPAGSGP; y (b) CGIEGRAPGP (SEC ID Nº: 18). El resto de cisteína
forma un puente disulfuro con otro resto de cisteína disponible en
el dominio de translocación del fragmento de cadena pesada
modificada. Si es deseable, por tratamiento con trombina después
puede producirse un producto bicatenario en el que la sustancia
terapéutica polipeptídica está unida a la cadena pesada a través de
un puente disulfuro;
la Fig. 6 muestra una comparación de la unión de
una cadena pesada modificada con la de la neurotoxina nativa en
membranas sinápticas neuronales, presentando la cadena pesada
modificada las características de unión de la neurotoxina tetánica
como se evalúa por el método descrito en el Ejemplo 7;
la Fig. 7 muestra la unión a membranas neuronales
de una cadena pesada clostridial modificada basada en el dominio de
unión de la neurotoxina botulínica de tipo F; en este ejemplo, la
cadena pesada modificada contenía el dominio de translocación
(H_{N}) de la toxina diftérica y el dominio de unión (H_{C}) de
la neurotoxina de tipo F; y
la Fig. 8 muestra una comparación de los tamaños
moleculares, en condiciones no desnaturalizantes, de una cadena
pesada clostridial modificada en comparación con una cadena pesada
nativa; la cadena pesada clostridial modificada (H_{N} de difteria
- H_{C} de BoNT/F) se procesa como un monómero de aproximadamente
70 kDa, mientras que una cadena pesada nativa (de BoNT/A) se procesa
como un agregado de más de 500 kDa.
Con más detalle, la figura 1 muestra ejemplos de
realizaciones de la invención que incorporan fragmentos de cadena
pesada clostridial modificada.
El dominio de unión procede de secuencias de las
neurotoxinas clostridiales:
(a) dominios H_{C}, por ejemplo
- BoNT/A, restos 872-1296
- BoNT/B, restos 859-1291
- BoNT/C, restos 867-1291
- BoNT/D, restos 863-1276
- BoNT/E, restos 846-1252
- BoNT/F, restos 865-1278
- BoNT/G, restos 864-1297
- Tétanos, restos 880-1315
(b) dominios H_{C} híbridos, por ejemplo
- híbridos del dominio H_{C} de BoNT/F y tétanos
(c) dominios H_{C} truncados
El dominio de translocación puede proceder de
varias fuentes:
(a) Toxinas bacterianas, por ejemplo, fragmento B
de toxina diftérica (restos 194-386).
(b) Péptidos fusogénicos virales, por ejemplo, de
la hemaglutinina del virus de la influenza HA-2.
(c) Péptidos sintéticos que rompen la membrana
(por ejemplo, Plank et al., J. Biol. Chem., 269,
12918-12924).
La Figura 2 muestra ejemplos de proteínas de
fusión recombinantes de fragmentos de cadena pesada clostridial
modificada que muestran posiciones de señales de péptidos de
purificación y sitios de escisión por proteasas específicos (por
tratamiento con la proteasa apropiada, la señales de péptidos de
purificación pueden retirarse del fragmento de unión clostridial
modificado).
Son ejemplos de señales de péptidos de
purificación:
His6
péptido S
péptido T7
péptido de unión a calmodulina
proteína de unión a maltosa
Son ejemplos de sitios específicos de escisión
por proteasa:
trombina
enteroquinasa
factor X
Para todas las manipulaciones genéticas se usaron
protocolos de biología molecular convencionales (por ejemplo,
Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual,
Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York). Se generó un gen completamente sintético que
codificaba las regiones H_{C} de la toxina botulínica de C.
botulinum tipo F (restos 865-1278) y de la
toxina tetánica (restos 880-1315) usando reacciones
de PCR Recursiva (Prodromou & Pearl 1992, Protein
Engineering, 5: 827-829) usando oligonucleótidos
de autocebado que contenían la secuencia deseada. Se ajustó la
tendencia de codones y la relación de bases GC/AT para facilitar la
expresión en E. coli. Los fragmentos se clonaron
secuencialmente en pLitmus 38 (New England Biolabs, Inc., Beverly,
MA) para montar el gen entero. Las construcciones para la expresión
se subclonaron en pMALc2 (NEB) reemplazando el fragmento
BamH1-EcoR1. Las reacciones de unión se usaron para
transformar E. coli JM109 (Promega).
El ADN plasmídico se amplificó, se purificó y se
analizó la presencia de la secuencia apropiada (Ausubel, et
al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, New York). Las construcciones génicas que se confirmó
que poseían las secuencias correctas después se utilizaron para
transformar el hospedador de expresión E. coli BL21 (DE3)
(Studier & Moffatt 1986, Journal of Molecular Biology,
189: 113-130).
En la fase de lectura de los productos génicos
también se incluyeron secuencias adicionales para añadir señales de
purificación por afinidad y uno o más sitios específicos de
proteasas para la eliminación posterior de estas señales de
afinidad.
Las proteínas recombinantes expresadas en pMAL se
produjeron con señales de proteínas de unión a maltosa amino
terminales que permitían purificar las proteínas por cromatografía
de afinidad sobre resina de amilosa. En resumen, se dejaron crecer
cultivos de E. coli BL21 (DE3) pMALc2-H_{C}
en caldo Terrific-ampicilina (100
\mugml^{-1})-kanamicina (30 \mugml^{-1}) a
una DO_{600} nm de 2,5-3,8 y se indujo la
expresión de proteínas por la adición de IPTG 1 mM durante
aproximadamente 2 horas. Las células se lisaron por
congelación/descongelación seguido de sonicación, los lisados se
eliminaron por centrifugación y los sobrenadantes se pusieron sobre
una columna de resina de amilosa y se eluyeron con maltosa. Todos
los tampones usados fueron los especificados por el fabricante.
Dentro de la proteína se incluyeron sitios para la proteasa trombina
o factor Xa para la eliminación posterior de estas señales de
purificación.
También serían aceptables otras secuencias
codificantes que permitan la expresión de la proteína deseada. En la
secuencia también pueden incorporarse otras señales o sitios de
unión. En la Figura 2 se resumen ejemplos de algunas de estas
opciones.
Usando las técnicas descritas en el Ejemplo 1, se
construyeron fragmentos de cadena pesada clostridial modificada por
medio de la fusión de dominios de los fragmentos H_{C} de
neurotoxinas botulínica de tipo F o tetánica con el dominio de
translocación de la toxina diftérica. Las secuencias de aminoácidos
de los ejemplos se muestran en la SEC ID Nº: 8-17,
que también proporciona ejemplos de cadenas pesadas tetánicas
modificadas en las que el fragmento H_{C} es un híbrido de
neurotoxina tetánica y botulínica de tipo F.
El polipéptido, proteína o enzima a unir al
fragmento de cadena pesada clostridial modificada primero se
modifica con un agente de entrecruzamiento adecuado. La
Mn-superóxido dismutasa (SOD) se modificó por
tratamiento con un exceso 15 molar de SPDP (Pierce) en tampón Hepes
0,05 M pH 7,0 que contenía NaCl 0,15 M, durante 60 minutos a 25ºC.
El exceso de SPDP se retiró por diálisis frente al mismo tampón a
4ºC durante 16 horas. La SOD sustituida después se mezcló en una
relación molar de 1:5 con el fragmento de cadena pesada clostridial
modificada fusionado a un dominio de translocación derivado de la
toxina diftérica (véase la Figura 3) y la mezcla se incubo a 25ºC
durante 16 horas. Después de la incubación, el conjugado de
SOD-fragmento de unión clostridial modificado se
purificó por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex
G200.
La poli-L-lisina
(M_{r}, 1000-4000) (10 mg) a usar para la
condensación de ADN se disolvió en 20 ml de tampón Hepes 20 mM pH
7,4 que contenía NaCl 0,15 M (HBS). A esta solución se le añadieron
0,6 mg de Sulpho-LC-SPDP (Pierce y
Warriner, UK Ltd.) y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 25ºC.
La poli-L-lisina activada después se
dializó frente a HBS a 4ºC usando un tubo de diálisis con un límite
de peso molecular de 1000 y después se diluyó hasta 1 mg/ml usando
HBS.
La condensación del ADN se realizó en tubos de
vidrio. Un ADN plasmídico purificado que contenía un gen que
codificaba una proteína terapéutica (o un gen indicador) bajo el
control de un promotor adecuado (por ejemplo, un promotor temprano
inmediato de CMV o un promotor específico neuronal, por ejemplo, el
promotor de enolasa específico de neuronas) se llevó a una
concentración de 1 mg/ml en HBS y se añadió a tubos de vidrio
seguido de la poli-L-lisina activada
preparada como se ha indicado anteriormente. La
poli-L-lisina activada se añadió en
diversas proporciones al ADN (véase la Tabla 2) y se incubó durante
90 minutos a 25ºC.
| Muestra Nº | ADN (\mug) | Poli-L-lisina Activada | HBS |
| 1 | 750 | 250 | 1500 |
| 2 | 1500 | 500 | 500 |
| 3 | 500 | 250 | 1750 |
| 4 | 1000 | 500 | 1000 |
Después de la incubación, se evaluó el tamaño de
las partículas de ADN condensadas usando un analizador del tamaño de
las partículas Brookhaven BI90. Las condiciones de incubación que
proporcionaron la mayor proporción de partículas de ADN condensadas
menores de 100 nM de diámetro se usaron para producir conjugados de
ADN-fragmento de unión clostridial modificado. La
cadena pesada clostridial modificada se dializó frente a HBS.
Los fragmentos dializados (100 \mug) después se
añadieron a 1 ml de ADN condensado y se incubaron durante 18 horas a
25ºC para formar la construcción de proteína de unión clostridial
modificada-ADN condensado (véase la Figura 4).
La construcción de cadena pesada clostridial
modificada-ADN condensado descrita en el Ejemplo 4
se diluyó con 2 ml de medio sin suero MEM. Se retiró el medio de
crecimiento de NG108 cultivado en placas de 12 pocillos, se añadió 1
ml de la construcción diluida y la mezcla se incubó durante 2 horas
a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2}. Después se añadió medio de
crecimiento (1 ml) a cada pocillo y la incubación se continuó en las
mismas condiciones durante 24-48 horas. Después de
este periodo, se examinaron las células.
En los experimentos en los que el ADN condensado
contenía un gen indicador que codificaba la proteína fluorescente
verde, varias de las células mostraron la expresión visible de la
proteína indicadora ilustrando un suministro satisfactorio del ADN
al interior de la célula neuronal. Se realizaron diversos
experimentos de control para confirmar que la transfección observada
en células NG108 estaba mediada por receptores.
Se descubrió que la transfección de células NG108
era dependiente de la presencia del fragmento de cadena pesada
clostridial modificada dentro de los conjugados (no se observó
transfección con las partículas de ADN condensado solas).
No se observó transfección en células no
neuronales (células Vero) usando los conjugados de cadena
pesada-ADN.
Se disolvieron 398 mg de
poli(lactida-co-glicolida) de
baja viscosidad interna (PM 3000) (Boehringer Mannheim) en 4 ml de
diclorometano. Esta solución se homogeneizó a 2000 rpm durante 150
segundos con 1 ml de solución de tampón que contenía la sustancia
terapéutica, tal como enzimas y/o fármacos. En el caso de la
Mn-superóxido dismutasa, se disolvieron 10 mg de la
enzima en tampón Hepes 10 mM pH 8,0 que contenía NaCl 100 mM. La
mezcla después se añadió a 50 ml de alcohol polivinílico al 8% y se
emulsionó a 2000 rpm durante 150 segundos más. La emulsión se vertió
en 300 ml de agua destilada ultrapura a 37ºC y se agitó durante 30
minutos a 37ºC. Las micropartículas se recogieron por centrifugación
a 10.000 x g durante 25 minutos a 20ºC y después se resuspendieron
en 300 ml de agua y se centrifugaron como se ha indicado
anteriormente. Este procedimiento de lavado después se repitió 4
veces más. Después de la centrifugación final, se retiró el
sobrenadante acuoso y las micropartículas se liofilizaron.
Se resuspendieron dos mg de micropartículas de
poli(lactida-co-glicolida) en
1 ml de tampón de activación (tampón MES 0,1 M, pH 6,0, que contenía
NaCl 0,5 M). Se añadieron
1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida
(EDC) sólida y N-hidroxisulfosuccinimida
(sulfo-NHS) a concentraciones de 2 mM y 5 mM
respectivamente y la mezcla se incubó durante 15 minutos a 25ºC. Las
micropartículas se lavaron por centrifugación durante 1 minuto a
10000 x g y se resuspendieron en 1 ml de tampón de activación. La
etapa de lavado se repitió 4 veces, después las micropartículas se
resuspendieron en 1 ml de tampón de activación que contenía una
concentración 33 \muM de un fragmento de cadena pesada clostridial
modificada y se incubaron durante 2 horas a 25ºC. La reacción
después se inactivó con hidroxilamina 10 mM. Después de 20 minutos a
25ºC, las micropartículas se lavaron en un tampón adecuado por
centrifugación como se ha descrito anteriormente.
Las neurotoxinas clostridiales pueden marcarse
con 125-yodo usando cloramina-T y su
unión a diversas células puede evaluarse por métodos convencionales
tales como los descritos en Evans et al. 1986, Eur. J.
Biochem., 154, 409 o Wadsworth et al. 1990, Biochem. J. 268,
123). En estos experimentos, se evaluó la capacidad de
construcciones de cadena pesada clostridial modificada para competir
con neurotoxinas clostridiales nativas por receptores presentes en
células neuronales o en sinaptosomas cerebrales. Todos los
experimentos de unión se realizaron en tampones de unión. En el caso
de las neurotoxinas botulínicas, este tampón constaba de: Hepes pH
7,0 50 mM, NaCl 30 mM, sacarosa al 0,25% y albúmina de suero bovino
al 0,25%. En el caso de la toxina tetánica, el tampón de unión era:
tampón MES 0,05 M pH 6,0 que contenía albúmina de suero bovino al
0,6%. En un experimento de unión típico, la neurotoxina clostridial
radiomarcada se mantuvo a una concentración fija comprendida entre 1
y 10 nM. Las mezclas de reacción se prepararon mezclando la toxina
radiomarcada con diversas concentraciones de neurotoxina no marcada
o construcción de cadena pesada clostridial modificada. La mezcla de
reacción después se añadió a células neuronales o a sinaptosomas
cerebrales de rata y después se incubó a 0-3ºC
durante 2 horas. Después de este período, las células neuronales de
los sinaptosomas se lavaron dos veces con tampón de unión enfriado
con hielo y la cantidad de neurotoxina clostridial marcada unida a
las células o a los sinaptosomas se evaluó por re-
cuento \gamma.
cuento \gamma.
En un experimento que usaba una construcción de
cadena pesada clostridial modificada que constaba de un dominio de
unión procedente de la toxina tetánica y un dominio de translocación
procedente de la toxina diftérica, se descubrió que la construcción
competía con la neurotoxina tetánica marcada con ^{125}I por
receptores presentes en las células neuronales de una manera similar
a la neurotoxina tetánica nativa no marcada (véase la Figura 6).
Estos datos demostraron que la construcción había retenido las
propiedades de unión de la neurotoxina nativa.
En otro experimento que usaba H_{N} de difteria
- H_{C} de BoNT/F como cadena pesada clostridial modificada, se
descubrió que la construcción competía con BoNT/F marcado con
^{125}I por receptores presentes en las membranas sinápticas
neuronales (Figura 7). Estos datos indican que la cadena pesada
clostridial modificada conserva las propiedades de unión a
receptores neuronales de BoNT/F.
La cadena pesada botulínica de tipo A se purificó
como se ha descrito previamente (Shone et al. 1985 Eur. J.
Biochemistry 151, 75-82) y la H_{N} de difteria
recombinante – H_{C} de BoNT/F se purificó como se describe en los
Ejemplos 1 y 2. La cadena pesada clostridial modificada se purificó
como una proteína de fusión de unión a maltosa, retirándose después
la proteína de fusión por tratamiento con el Factor Xa. Se
introdujeron muestras de la cadena pesada de tipo A (20 \mug) y
H_{N} de difteria - H_{C} de BoNT/F (10 \mug) en un gel de
poliacrilamida con Tris-glicina al
4-20% en tampón Tris-glicina. Las
muestras se sometieron a electroforesis hasta el equilibrio (sistema
de gel Novex; 43 voltios, 16 horas) y el gel se tiñó con azul de
Coomassie. Los resultados se muestran en la Figura 8. La banda
principal para H_{N} de difteria - H_{C} de BoNT/F parece
migrar muy cerca de su peso molecular previsto de aproximadamente 70
kDa. Por el contrario, la cadena pesada nativa de tipo A aparece
como una banda difusa a aproximadamente 500 kDa, en comparación con
un peso molecular estimado de 100 kDa, lo que sugiere la formación
de grandes agregados de proteína.
Se prepararon conjugados de cadena pesada
modificada recombinante-superóxido dismutasa que
comprendían una combinación de los siguientes elementos:-
- una superóxido dismutasa bacteriana, de
Bacillus stearothermophilus;
- una región enlazadora que permite la formación
de un enlace disulfuro entre la superóxido dismutasa y el dominio de
translocación y que también contiene un solo sitio de escisión por
proteasas para la escisión por el factor Xa o la trombina para
permitir la formación de una molécula bicatenaria;
- un dominio de translocación procedente de la
toxina diftérica o un péptido endosomolítico (fusogénico) procedente
de la hemaglutinina del virus de la influenza; y
- un dominio de unión específico para las células
neuronales procedente de la neurotoxina tetánica o botulínica de
tipo F.
Las secuencias de estos conjugados de cadena
pesada modificada recombinante-superóxido dismutasa
se muestran en las SEC ID Nº: 3-7.
Para confirmar la naturaleza de su estructura,
los conjugados de cadena pesada clostridial modificada
recombinante-superóxido dismutasa se convirtieron en
la forma bicatenaria por tratamiento con una proteasa única
correspondiente a las secuencias del sitio de escisión dentro de la
región enlazadora. Los conjugados que contenían el sitio de escisión
por trombina se trataron con trombina (20 \mug por mg de
conjugado) durante 20 horas a 37ºC; los conjugados que contenían el
sitio de escisión por el factor Xa se trataron con el factor Xa (20
\mug por mg de conjugado) durante 20 minutos a 22ºC.
En geles de SDS-PAGE, en
condiciones no reductoras, los conjugados aparecían como una banda
con una masa molecular de aproximadamente 120 kDa. En presencia de
agente reductor (ditiotreitol), se observaron dos bandas con masas
moleculares de aproximadamente 70-30 kDa
correspondientes a la cadena pesada clostridial modificada y a la
superóxido dismutasa respectivamente. Estos datos ilustran que,
después del tratamiento con la proteasa única, los conjugados
constan de los dos últimos componentes que están unidos por un
puente disulfuro.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
SEC ID Nº: 3
Construcción que contiene:
MnSOD de B. stearothermophilus
un enlazador que puede escindirse por
trombina
un dominio de translocación derivado de la toxina
diftérica
un dominio de unión procedente de la toxina
tetánica
SEC ID Nº: 4
Construcción que contiene:
MnSOD de B. stearothermophilus
un enlazador que puede escindirse por el factor
Xa
un dominio de translocación derivado de la toxina
diftérica
un dominio de unión procedente de la toxina
botulínica de tipo F
SEC ID Nº: 5
Construcción que contiene:
una secuencia líder mitocondrial de la MnSOD
humana
MnSOD de B. stearothermophilus
un enlazador que puede escindirse por el factor
Xa
un dominio de translocación derivado de la toxina
diftérica
un dominio de unión procedente de la toxina
tetánica
SEC ID Nº: 6
Construcción que contiene:
una secuencia líder mitocondrial de la MnSOD
humana
MnSOD de B. stearothermophilus
un enlazador que puede escindirse por
trombina
un dominio de translocación derivado de la toxina
diftérica
un dominio de unión procedente de la toxina
botulínica de tipo F
SEC ID Nº: 7
Construcción que contiene:
MnSOD de B. stearothermophilus
un enlazador que puede escindirse por el factor
Xa
un péptido de translocación del virus de la
influenza
un dominio de unión procedente de la toxina
botulínica de tipo F
Secuencia proteica para el dominio de
translocación de la toxina diftérica con H_{C} de BoNT/F
\newpage
SEC ID Nº: 8
Secuencia proteica para el dominio de
translocación de la toxina diftérica con H_{C} de TeNT
SEC ID Nº: 9
Secuencia proteica para el dominio de
translocación de la toxina diftérica con dominio II H_{C} de
TeNT
SEC ID Nº: 10
Secuencia proteica para el dominio de
translocación de la toxina diftérica con H_{C} de TeNT
truncado
\newpage
SEC ID Nº: 11
Secuencia proteica para el dominio de
translocación de la toxina diftérica con dominio I H_{C} de BoNT/F
y dominio II H_{C} de TeNT
SEC ID Nº: 12
Secuencia proteica para el dominio de
translocación de la toxina diftérica
SEC ID Nº: 13
Secuencia proteica para el dominio de
translocación de la enterotoxina botulínica C2 de Clostridium con
H_{C} de BoNT/F
\newpage
SEC ID Nº: 14
(a)
SEC ID Nº: 15
(b)
Secuencia proteica para el dominio de
translocación de la enterotoxina botulínica C2 de Clostridium con
H_{C} tetánico
\newpage
SEC ID Nº: 16
(a)
SEC ID Nº: 17
(b)
Claims (26)
1. Una composición que comprende un agente
terapéutico unido a un polipéptido, donde el polipéptido es un
polipéptido no tóxico, para suministrar un agente terapéutico a una
célula neuronal, que comprende:
- un dominio de unión que se une a la célula neuronal y que comprende o procede de fragmentos de cadena pesada clostridial y
- un dominio de translocación que transloca el agente terapéutico al interior de la célula neuronal,
donde el dominio de translocación no es un
dominio H_{N} de una toxina clostridial y no es un fragmento
derivado de un dominio H_{N} de una toxina clostridial y donde el
agente terapéutico tiene la función de reducir la lesión neuronal
posterior a una isquemia/reperfusión o tiene la función de promover
el crecimiento neuronal después de una
lesión.
2. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el dominio de translocación es además un
dominio de translocación que no forma agregados como se mide por el
tamaño en tampones fisiológicos.
3. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en la que el dominio de translocación se
selecciona adicionalmente entre (1) un dominio H_{N} de una toxina
diftérica, (2) un fragmento o derivado de (1) que retiene
sustancialmente la actividad de translocación del dominio H_{N} de
una toxina diftérica, (3) un péptido fusogénico, (4) un péptido que
rompe la membrana, y (5) fragmentos de translocación y derivados de
(3) y (4).
4. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipéptido tiene la
especificidad de unión de la toxina tetánica y menor afinidad por
anticuerpos neutralizadores contra la toxina tetánica en comparación
con la afinidad por tales anticuerpos de la cadena pesada de la
toxina tetánica nativa.
5. Una composición que comprende un agente
terapéutico unido a un polipéptido, en la que el polipéptido tiene
la función de suministrar un agente terapéutico a una célula
neuronal, que comprende:
- un dominio de unión que se une a la célula neuronal y que comprende o procede de fragmentos de cadena pesada clostridial y
- un dominio de translocación que transloca el agente terapéutico al interior de la célula neuronal,
donde el dominio de translocación se selecciona
entre (1) un dominio H_{N} de una toxina diftérica, (2) un
fragmento o derivado de (1) que retiene sustancialmente la actividad
de translocación del dominio H_{N} de una toxina diftérica, (3) un
péptido fusogénico, (4) un péptido que rompe la membrana, y (5)
fragmentos de translocación y derivados de (3) y (4), y donde el
agente terapéutico tiene la función de reducir la lesión neuronal
después de una isquemia/reperfusión o tiene la función de promover
el crecimiento neuronal después de una
lesión.
6. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 5, en la que el polipéptido tiene menor afinidad por
anticuerpos neutralizadores contra la toxina tetánica en comparación
con la afinidad por tales anticuerpos de la toxina tetánica
nativa.
7. Una composición que comprende un agente
terapéutico unido a un polipéptido, en la que el polipéptido tiene
la función de suministrar un agente terapéutico a una célula
neuronal, que comprende:
- un dominio de unión que se une a la célula neuronal y que comprende o procede de fragmentos de cadena pesada clostridial y
- un dominio de translocación que transloca el agente terapéutico al interior de la célula neuronal,
donde el polipéptido tiene menor afinidad por
anticuerpos neutralizadores contra la toxina tetánica en comparación
con la afinidad por tales anticuerpos de la toxina tetánica nativa y
donde el agente terapéutico tiene la función de reducir la lesión
neuronal después de una isquemia/reperfusión o tiene la función de
promover el crecimiento neuronal después de una
lesión.
8. Una composición de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en la que el dominio de unión comprende un
dominio H_{C} botulínico.
9. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en la que el dominio de unión comprende
un dominio H_{C} tetánico.
10. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en la que el dominio de unión comprende
un híbrido de un dominio H_{C} botulínico y un dominio H_{C}
tetánico.
11. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 10, basada en un fragmento botulínico de tipo B
(restos 859-1291), un fragmento de tipo A (restos
872-1296) o un fragmento de tipo F (restos
862-1278).
12. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 10, basada en un fragmento botulínico de tipo B
(restos 859-1291) reemplazando los restos
1093-1285 por la secuencia homóloga de la toxina
tetánica.
13. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 10, basada en un fragmento botulínico de tipo A
(restos 872-1296) reemplazando los restos
1103-1296 con la secuencia homóloga de la toxina
tetánica.
14. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 10, basada en un fragmento botulínico de tipo F
(restos 862-1278) reemplazando los restos
1097-1273 con la secuencia homóloga de la toxina
tetánica.
15. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un dominio H_{C}
tetánico y un dominio H_{N} diftérico.
16. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un dominio H_{C}
botulínico y un dominio H_{N} diftérico.
17. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-16, en la que la sustancia
terapéutica está unida químicamente a dicho polipéptido.
18. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-17, en la que la sustancia
terapéutica está unida a un dominio de translocación de dicho
polipéptido.
19. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 18, en la que la sustancia terapéutica es
una enzima, factor de crecimiento, proteína o péptido.
20. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 19, en la que el agente terapéutico se
produce como una proteína de fusión por métodos de tecnología
recombinante.
21. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 20, en la que el agente terapéutico es un
ácido nucleico útil como un agente terapéutico génico o un fármaco
antisentido.
22. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 21, en la que el ácido nucleico está contenido dentro
de un liposoma o está condensado a través de un péptido o proteína,
o por condensación usando un agente de acoplamiento químico.
23. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 21, en la que el ácido nucleico está presente en
forma de un virus recombinante.
24. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 21, en la que el virus tiene un tropismo alterado y
es capaz de transducir células a través de un receptor de toxina
clostridial.
25. Un método para fabricar una composición de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende
expresar en una célula hospedadora un ácido nucleico que codifica la
composición.
26. Uso de una composición de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad asociado
con células neuronales.
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