ES2217165T3 - Medida de la concentracion de una analito urinario despues de normalizar la conductividad, para diagnostico de enfermedades. - Google Patents

Abstract

Un método para el diagnóstico de una enfermedad en un paciente, que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de orina de dicho paciente; b) medir la concentración de uno o más analitos pertinentes para el diagnóstico de dicha enfermedad en dicha muestra de orina; c) medir la conductividad eléctrica de dicha muestra de orina; d) obtener un valor normalizado (NTV) para la concentración de analito, dividiendo dicha concentración de analito obtenida en la etapa b) entre la conductividad eléctrica de la muestra de orina obtenida en la etapa c); e) determinar si dicho paciente sufre dicha enfermedad, mediante la comparación del NTV obtenido en la etapa d) con un valor de referencia predeterminado.

Description

Medida de la concentración de un analito urinario después de normalizar la conductividad, para diagnóstico de enfermedades.

La presente invención se refiere al uso de medidas de conductividad eléctrica en la orina y de las concentraciones de analitos urinarios pertinentes en el diagnóstico de enfermedades. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de medidas normalizadas de conductividad de concentraciones de tromboxano en orina en el diagnóstico de cardiopatías agudas.

Antecedentes de la invención

Uno de los requisitos clave para el tratamiento eficaz de enfermedades es la disponibilidad de métodos exactos, convenientes y rápidos de diagnóstico. Aunque esto es cierto para todas las enfermedades, quizá es de lo más importante en el caso de enfermedades que potencialmente amenazan la vida, tal como cardiopatía aguda.

El grupo de enfermedades que afectan a los vasos sanguíneos y al corazón es una de las causas principales de morbimortalidad. En particular, el síndrome coronario agudo (ACS en inglés) es la causa principal de muerte en el mundo occidental. Aunque el grupo de enfermedades cardiovasculares, tomado con conjunto, consta de un gran número de enfermedades diferentes, cada una con sus propios factores patogenéticos específicos, un elemento común entre muchas de las enfermedades cardiovasculares más importantes es la formación de placas ateroscleróticas, con toda su variedad de consecuencias bioquímicas y patofisiológicas.

A escala mundial, cada año más de 70 millones de personas se presentan en los hospitales y otros centros de salud ambulatorios quejándose de dolor torácico. Sólo en los Estados Unidos de América, alrededor de seis millones de personas se presentan cada año con dolor torácico, una estadística que se refleja en el hecho de que la enfermedad cardiovascular da cuenta de un cuarto del gasto anual actual de salud en los Estados Unidos de América.

Puesto que la eficacia del tratamiento cae exponencialmente desde el momento de un suceso miocárdico, la capacidad para diagnosticar rápida y con exactitud la patología cardiovascular, y por ello comenzar el tratamiento apropiado en una etapa mucho más temprana, es crítica para reducir el número de muertes por cardiopatía.

Un beneficio médico adicional que se deriva de la detección mediante una tecnología mejorada de diagnóstico es la capacidad para detectar pacientes con riesgo de desarrollar lesiones ateroscleróticas y la patología cardiovascular (y cerebrovascular) subsiguiente. Esto es obviamente beneficioso para el desarrollo de estrategias fiables para la prevención de la enfermedad cardiovascular grave.

Finalmente, el desarrollo de ensayos de diagnóstico precoz y exacto permitirá a los servicios sanitarios reducir el número de días de permanencia innecesarios en el hospital, y de los ensayos caros que se administran, proporcionando ahorros significativos de coste. Actualmente, se estima que el coste total anual para el estudio de pacientes en busca de ACS, según la American College of Cardiology, es de alrededor de 6000 millones de dólares.

Los tromboxanos son compuestos que derivan de endoperóxidos de prostaglandinas que provocan agregación plaquetaria, contracción arterial y muchos otros efectos biológicos. Uno de tales compuestos, el tromboxano A_{2}, un compuesto oxitano-oxánico bicíclico biológicamente activo, altamente inestable, muestra propiedades muy potentes tanto vasoconstrictoras como agregadoras de plaquetas. Se ha encontrado que el tromboxano A_{2} desempeña un papel crucial en trastornos aterotrombóticos, y se ha encontrado que el aumento de la síntesis del mismo ocurre inmediatamente después de sucesos tales como angina inestable e infarto de miocardio agudo [Fitzgerald, D.J. et al. (1986) N. Engl. J. Med. 315:983-989]. Como se ha mencionado anteriormente, el tromboxano A_{2} es muy inestable, y se convierte rápidamente a metabolitos estables tales como 11-deshidrotromboxano B_{2} y 2,3-di-nortromboxano B_{2} (colectivamente denominados aquí más abajo como "tromboxano B_{2}"), que se excretan en la ori-
na.

Las propiedades eléctricas de disoluciones que contienen iones se pueden expresar de varias maneras diferentes. Una de tal propiedad definitoria es la de la resistencia a la corriente eléctrica. La resistencia eléctrica (R) se puede definir como:

R = \rho \ x \ (L/A)

en la que L y A son, respectivamente, la longitud y la sección transversal del medio cuya resistencia se está determinando, y \rho es la constante de proporcionalidad conocida como la resistividad de la muestra. Una medida habitualmente usada de las propiedades eléctricas de una disolución electrolítica es la conductividad, que se define como la inversa de la resistividad, y se mide habitualmente en unidades de Siemens por centímetro (S/cm).

La conductividad de la orina es, entre otras, una medida de la dilución urinaria, y como tal se ha usado en investigaciones de la patogénesis de varias enfermedades. Uno de tales ejemplos es la relación entre el grado de dilución urinaria y el riesgo de cristalización de oxalato de calcio. En un estudio [Tiselius, H.G. (1992) J. Urol. 148:990-994], se determinó la conductividad eléctrica de la orina a fin de evaluar el grado de dilución urinaria. Los resultados de este estudio sugieren que la monitorización de la dilución urinaria, mediante el uso de un conductímetro, puede proporcionar una herramienta útil de monitorización para la prevención de la formación de cálculos renales de calcio.

Es un propósito de esta invención proporcionar un método de análisis de la orina para el diagnóstico fiable de una variedad de trastornos y enfermedades quirúrgicas.

Es otro propósito de la invención proporcionar un método tal que sea técnicamente simple de realizar, que produzca resultados rápidos, obviando de este modo la necesidad de períodos prolongados de espera antes de que se puedan iniciar los regímenes apropiados de tratamiento.

Es un objetivo particular de la presente invención proporcionar un método tal que se pueda usar en el diagnóstico de cardiopatías agudas.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un ensayo de diagnóstico que se pueda usar muy precozmente en el desarrollo de cardiopatías, de forma que se pueda usar como una técnica de advertencia precoz, de primera ventana, que produzca datos fiables de diagnóstico.

Es un propósito adicional de la invención proporcionar un ensayo para el diagnóstico de cardiopatías agudas, que supere los problemas de los métodos de la técnica anterior.

Otros objetos y ventajas de la invención serán manifiestos a medida que transcurra la descripción.

Sumario de la invención

Se ha encontrado ahora sorprendentemente que se puede usar la medida tanto de la conductividad eléctrica como de la concentración de analitos pertinentes en muestras de orina como una herramienta fiable de diagnóstico y de predicción. Inesperadamente, se encontró que el uso de las determinaciones de la conductividad como medio para normalizar concentraciones de analito urinario conduce a un aumento significativo en la fiabilidad y exactitud del diagnóstico.

La invención se dirige principalmente a un método para el diagnóstico de una enfermedad en un paciente, que comprende las etapas de:

a) obtener una muestra de orina de dicho paciente;

b) medir la concentración de uno o más analitos pertinentes para el diagnóstico de dicha enfermedad en dicha muestra de orina;

c) medir la conductividad eléctrica de dicha muestra de orina;

d) obtener un valor normalizado (NTV) para la concentración del analito, dividiendo la concentración del analito obtenida en la etapa b) entre la conductividad eléctrica de la muestra de orina obtenida en la etapa c);

e) determinar si dicho paciente sufre de dicha enfermedad, por medio de la comparación del NTV obtenido en la etapa d) con un valor de referencia predeterminado.

Las etapas b) y c) anteriormente mencionadas se pueden realizar en cualquier orden, o como alternativa, se pueden realizar simultáneamente.

El término cardiopatía, como se usa aquí, se debe interpretar como procesos patológicos del corazón o de los vasos sanguíneos, incluyendo ateroscleropatías y procesos patológicos trombogénicos.

En una realización preferida del método de la invención, la enfermedad a diagnosticar es una cardiopatía aguda, y el analito urinario pertinente comprende uno o más tromboxanos seleccionados del grupo que consta de tromboxano B_{2}, 11-deshidrotromboxano B_{2}, 2,3-di-nortromboxano B_{2}, y mezclas de los mismos.

En una realización preferida del método de la invención, el tromboxano medido es tromboxano B_{2}.

Se pueden usar muchas técnicas de ensayo diferentes para realizar las medidas requeridas por el método de la invención. En una realización preferida de la invención, tanto la concentración del analito (por ejemplo, tromboxano) como la conductividad eléctrica se miden usando un ensayo amperométrico. Un ensayo amperométrico adecuado para uso en el método de la presente invención se describe en la Solicitud de Patente Israelí nº 132410, en trámite junto con la presente.

En otra realización preferida, tanto la concentración del analito (por ejemplo, tromboxano) como la conductividad eléctrica se miden usando un dispositivo a base de un semiconductor.

En aún otra realización preferida de la invención, la conductividad eléctrica de la muestra de orina se mide usando un conductímetro.

En una realización preferida adicional del método de la invención, la concentración del analito (por ejemplo, tromboxano) se determina usando un inmunoensayo. En una realización más preferida, dicho inmunoensayo es un inmunoensayo enzimático (EIA).

Todas las características y ventajas anteriores de la invención, y otras más, se entenderán mejor a partir de los siguientes ejemplos ilustrativos y no limitantes de realizaciones preferidas de la misma.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La concentración urinaria del analito pertinente, por ejemplo compuestos de tromboxano B_{2}, se puede determinar mediante el uso de cualquier técnica cuantitativa o semicuantitativa adecuada. Tales técnicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunoturbidimétricos, ensayos amperométricos, ensayos de tipo de tira diagnóstica, y medidas que usan dispositivos a base de semiconductores. Todas las técnicas anteriormente mencionadas se describen ampliamente en la técnica, y son bien conocidas por el experto.

La conductividad eléctrica urinaria se puede medir mediante cualquiera de las técnicas estándares conocidas en la técnica, incluyendo el uso de técnicas amperométricas y de conductímetros particulares. También se pueden usar dispositivos semiconductores en estado sólido. Lo más conveniente, la determinación tanto de la concentración de tromboxano urinario como de la conductividad eléctrica se podría obtener simultáneamente mediante el uso de canales separados del dispositivo semiconductor. Las dos corrientes eléctricas separadas, generadas de este modo, se podrían analizar separadamente, y se podrían producir resultados diagnósticos, según la técnica de análisis de datos que se describe en el siguiente Ejemplo.

Ejemplo Correlación de medidas de tromboxano/conductividad con el diagnóstico clínico Métodos Pacientes y muestras

Para este estudio se seleccionó al azar un grupo de 89 pacientes de edad comprendida entre 40-70 que se presentan en el servicio de urgencias de un hospital de zona grande. Se recogieron muestras de orina de cada uno de los pacientes antes de que se sometieran a cualquier procedimiento de diagnóstico o de tratamiento. Estas muestras de orina se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -20ºC durante períodos de menos de un mes, antes de ser usadas para los análisis bioquímicos.

A los pacientes también se les preguntó si estaban tomando en ese momento, o habían tomado recientemente, inhibidores de la ciclooxigenasa, tal como aspirina.

También se estudió el estado de cada paciente 30 días después de recoger la muestra de orina, según los siguientes dos criterios:

1. Ningún suceso cardíaco.

2. Libre de dolor torácico.

Al realizar la evaluación clínica anteriormente mencionada, el conjunto de pacientes se dividió en los siguientes subgrupos, según el resultado en admisión (es decir en el mismo día en que se obtuvieron las muestras de orina):

i.

Remisión al departamento de unidad coronaria/cardiología

ii.

Remisión al departamento de medicina interna del hospital

iii.

Excluidos

iv.

Todos pacientes

Se realizó la comparación del resultado clínico con el resultado obtenido de los análisis bioquímicos/de conductividad (véase a continuación en "Métodos de análisis de datos"), a fin de determinar la sensibilidad y especificidad de dichos análisis como herramientas de diagnóstico.

Métodos analíticos 1. Análisis de tromboxano B_{2}

Las concentraciones de tromboxano B_{2} en las muestras de orina se midieron usando una modificación del sistema Biotrak^{TM} (Amersham International plc, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra; código RPN 220). Las muestras congeladas de orina se descongelaron y se usaron directamente en el ensayo de tromboxano, sin realizar ningún pretratamiento. De forma resumida, se añadieron por duplicado 50 \mul de cada muestra o de patrón de tromboxano B_{2} a los pocillos de una placa de microtitulación previamente revestida con IgG anti-conejo de burro. Todas las diluciones de la disolución estándar se realizaron en un tampón de ensayo que consta de 0,1 M de tampón de fosfato, pH 7,5, que contiene 0,9% de cloruro de sodio y 0,1% de seroalbúmina bovina. También se usó el mismo tampón en la preparación de los pocillos de patrón cero (es decir, 0 pg de tromboxano B_{2}) y de unión no específica (es decir, tampón solamente). La cantidad de tromboxano B_{2} añadida a los pocillos del patrón varió entre 0,5 y 64 pg por pocillo. A continuación, se añadieron a cada pocillo (excepto para el pocillo del blanco espectrofotométrico) 50 \mul de antisuero antitromboxano B_{2} de conejo. Después de esto, se añadieron a cada pocillo (excepto para el pocillo del blanco) 50 \mul de disolución de conjugado de tromboxano B_{2} con peroxidasa de rábano picante, y la placa se incubó con agitación a temperatura ambiente durante una hora. Al final de este período de incubación, se aspiraron los contenidos de cada pocillo, y cada pocillo se lavó cuatro veces con 400 \mul de tampón de lavado (0,01 M de tampón de fosfato, pH 7,5, que contiene 0,05% de Tween 20). Inmediatamente después de la etapa de lavado final, se añadieron a cada pocillo 150 \mul de sustrato enzimático (que consta de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno). La placa se incubó entonces con agitación a temperatura ambiente durante exactamente 15 minutos, para permitir el desarrollo del producto coloreado de reacción. La reacción se detuvo por adición de 100 \mul de ácido sulfúrico 1 M en cada pocillo. Después del mezclamiento a conciencia, y en los 30 minutos de adición del ácido sulfúrico, la densidad óptica de cada pocillo se determinó a 450 nm usando un lector de
placas.

Se construyó una curva de calibración para los patrones de tromboxano B_{2}, representando gráficamente la cantidad conocida de tromboxano B (eje X) frente al porcentaje de anticuerpo unido (%B/B_{0}). Este último parámetro se calculó según la siguiente relación:

%B/B_{0} = [(OD del patrón de tromboxano - OD de la unión no específica)/ (OD de B_{0} - OD de la unión no específica)] x 100

(en la que cada lectura de la OD es la media para pocillos duplicados).

Las cantidades de tromboxano B_{2} en la muestra, para las muestras, se obtuvieron leyendo directamente de la curva de calibración.

2. Análisis de la conductividad

La conductividad eléctrica de cada una de las muestras de orina se midió usando un conductímetro CyberScan CON100 (Eutech Instruments Pte Ltd., Singapur).

3. Normalización de los resultados

Para cada muestra ensayada se obtuvo un valor de concentración de tromboxano B_{2} normalizado, dividiendo dicha concentración de tromboxano (medida en pg/ml) entre el valor de la conductividad (medido en mS/cm), ya sea usando una simple división o bien usando un modelo estadístico más avanzado. Para un análisis más fácil, todos los valores se transformaron en sus logaritmos naturales. De este modo, la normalización de las concentraciones de tromboxano se lograron restando el logaritmo natural del valor de la conductividad del logaritmo natural de la concentración de tromboxano.

Métodos de análisis de los datos

El punto de corte indica un valor que dicta si el estado del paciente es patológico o normal. El punto de corte se determinó según las curvas de Características Operativas del Receptor (ROC), que es una gráfica de la sensibilidad (o el valor positivo verdadero) frente al valor positivo falso. Este análisis optimiza la correlación entre los resultados del ensayo y el resultado clínico.

Los resultados de los diversos análisis descritos aquí anteriormente se recogieron y se analizaron según las dos siguientes "reglas" interpretativas.

Regla 1 - basada en la medida de la concentración de tromboxano B_{2} sola, en la que un resultado positivo (es decir, la presencia de cardiopatía) se indica mediante un valor de tromboxano transformado a logaritmo natural mayor que el valor de punto de corte de 5,1 para pacientes que no toman fármacos inhibidores de ciclooxigenasa (por ejemplo, aspirina), o mayor que el valor de punto de corte de 4,9 para pacientes que toman o han tomado recientemente tales fármacos.

Regla 2 - basada en la determinación de (ln de la concentración de tromboxano B_{2} - ln del valor de la conductividad) (es decir, la transformación logarítmica de la relación de la concentración de tromboxano B_{2} a la lectura de conductividad), en la que un resultado positivo (es decir, la presencia de cardiopatía) está indicado por un resultado mayor que el valor de punto de corte de 3,2, para pacientes que no toman fármacos inhibidores de la ciclooxigenasa (por ejemplo, aspirina), o mayor que el valor de punto de corte de 2,7, para pacientes que están tomando o han tomado recientemente tales fármacos.

Los valores de punto de corte son los valores de referencia usados en el método de la invención. Preferiblemente, tales valores de referencia se basan en resultados de ensayos de diagnóstico de grandes grupos de pacientes.

Tras el análisis de los datos según las reglas anteriores, y la tabulación de dichos datos, se determinó la sensibilidad y especificidad de cada regla según las siguientes definiciones:

Sensibilidad (%) = verdadero positivo/(falso negativo + verdadero positivo) x 100

Especificidad (%) = verdadero negativo/(falso positivo + verdadero negativo) x 100

Resultados

Los resultados que comparan el resultado clínico (cualquier suceso cardíaco/libre de dolor torácico) con los resultados de laboratorio, según se interpretan mediante cada una de las dos reglas anteriormente mencionadas, se dan en la Tabla I (Regla 1: sin normalización) y Tabla II (Regla 2: resultados normalizados). Para uno de los pacientes, la conductividad no se pudo determinar.

TABLA I

1

TABLA II

2

En la Tabla III (datos no normalizados) y en la Tabla IV (datos de conductividad normalizada) se muestran la especificidad y la sensibilidad de cada una de las dos Reglas (es decir, medidas de tromboxano no normalizadas y de conductividad normalizada) para cada uno de los grupos de pacientes.

TABLA III

	Datos de tromboxano no normalizados
Grupo de paciente	% de sensibilidad	% de especificidad
CCU Hospital/Cardiología	100	0
Medicina Interna del Hospital	70,9	0
Excluidos	87,5	28,5
Todos	80,7	18,7

TABLA IV

	Datos de tromboxano de conductividad normalizada
Grupo de paciente	% de sensibilidad	% de especificidad
CCU Hospital/Cardiología	90	100
Medicina Interna del Hospital	60	40
Excluidos	81,2	42,8
Todos	71,4	43,7

Se puede observar a partir de las Tablas III y IV que, mientras ambas reglas, interpretativas producen resultados que tienen niveles de sensibilidad aproximadamente similares, la Regla 2 (que usa concentraciones de tromboxano de conductividad normalizada) da resultados mucho mejores de la especificidad. La importancia del mayor nivel de especificidad del método de conductividad normalizada es que se puede usar para determinar de manera muchísimo más fiable qué pacientes no han sufrido un episodio cardíaco agudo, y por lo tanto se pueden excluir. De este modo, se concluye que los datos de concentración de tromboxano B_{2} de conductividad normalizada proporcionan una herramienta mucho más fiable para uso de diagnóstico en el diagnóstico de enfermedades coronarias agudas.

Claims (8)

1. Un método para el diagnóstico de una enfermedad en un paciente, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de orina de dicho paciente;

b) medir la concentración de uno o más analitos pertinentes para el diagnóstico de dicha enfermedad en dicha muestra de orina;

c) medir la conductividad eléctrica de dicha muestra de orina;

d) obtener un valor normalizado (NTV) para la concentración de analito, dividiendo dicha concentración de analito obtenida en la etapa b) entre la conductividad eléctrica de la muestra de orina obtenida en la etapa c);

e) determinar si dicho paciente sufre dicha enfermedad, mediante la comparación del NTV obtenido en la etapa d) con un valor de referencia predeterminado.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la enfermedad a diagnosticar es una cardiopatía aguda, y en el que el analito urinario pertinente comprende uno o más tromboxanos seleccionados del grupo que consta de tromboxano B_{2}, 11-deshidrotromboxano B_{2}, 2,3-di-nortromboxano B_{2}, y mezclas de los mismos.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que el tromboxano medido es tromboxano B_{2}.

4. Un método según la reivindicación 2, en el que tanto la concentración de tromboxano como la conductividad eléctrica se miden usando un ensayo amperométrico.

5. Un método según la reivindicación 2, en el que tanto la concentración de tromboxano como la conductividad eléctrica se miden usando un dispositivo a base de un semiconductor.

6. Un método según la reivindicación 2, en el que la conductividad eléctrica se mide usando un conductímetro.

7. Un método según la reivindicación 2, en el que la concentración de tromboxano se determina usando un inmunoensayo.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que el inmunoensayo es un inmunoensayo enzimático.