ES2217268T3 - Supresion de inhibidores. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A METODOS PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO DE TUMORES MALIGNOS, LA INVASION Y/O LA METASTASIS EN UN PACIENTE. EL METODO COMPRENDE LA SUPRESION DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE UN INHIBIDOR DE UNA PROTEASA O DE UNA ENZIMA DE DEGRADACION DE MATRIZ NO PROTEOLITICA (IPNME) EN EL TEJIDO DEL TUMOR MALIGNO O EN EL TEJIDO DEL TUMOR MALIGNO POTENCIAL. LA SUPRESION PUEDE LLEVARSE A CABO ADMINISTRANDO COMPUESTO QUE INTERACTUAN CON LA IPNME, PERO TAMBIEN MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE COMPUESTOS QUE INTERACTUEN CON LA TRANSCRIPCION DE GENES QUE CODIFICAN LA IPNME. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A METODOS PARA SELECCIONAR E IDENTIFICAR COMPUESTOS EN LOS METODOS TERAPEUTICOS, ASI COMO AL USO DE TALES COMPUESTOS EN EL TRATAMIENTO DE MALIGNIDADES.

Description

Supresión de inhibidores.

Descripción breve de la invención

Para invadir y extenderse, las células cancerígenas deben degradar proteínas de la matriz extracelular. Esta degradación es catalizada por la acción concertada de varios enzimas incluyendo proteasas y enzimas que degradan la matriz no proteolítica, por ejemplo, metaloproteasas tales como colagenasas intersticiales, estromalisinas y colagenasas tipo IV, proteasas aspárticas tales como la catepsina D, otros enzimas degradativos como la heparinasa, y serinproteasas como la plasmina (1, 73-76). La plasmina se forma a partir de su precursor, el plasminógeno, mediante dos activadores, el activador de plasminógeno tipo tisular (tPA) que está implicado en la trombolisis, y el activador de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA) que juega un papel central en el remodelamiento tisular, incluyendo la invasión cancerosa. La activación del plasminógeno se regula mediante dos inhibidores del activador de plasminógeno específicos (PA-I y PAI-2). Ambos uPA y PAI-1 están presentes en varios tipos de tejido canceroso, y recientemente se descubrió que niveles elevados de ambos uPA y PAI-1 en cáncer tisular de mama están asociados con una pobre prognosis.

Estudios inmunohistoquímicos y de hibridación in situ han revelado que en el tejido canceroso de colon y pecho, el PAI-1 está expresado predominantemente en células del estroma.

De acuerdo con la invención se contempla que el contenido elevado de PAI-1 encontrado en tumores malignos de pacientes con una pobre prognosis tal como se describe detalladamente más tarde, está implicado en la promoción del crecimiento tumoral, invasión y/o metástasis, muy probablemente mediante la protección del elemento del estroma del tumor de la degradación debida a la activación del plasminógeno formado en el microambiente durante la invasión. Esta invención se refiere a la supresión de inhibidores de proteasas y/o de otros enzimas degradantes de la matriz, en particular a la supresión de inhibidores de la activación de plasminógeno tales como PAI-1 en tejido canceroso resultando en la inhibición del crecimiento y/o invasión y/o metástasis del tumor, por ejemplo, permitiendo la auto-degradación del tejido tumoral, el deterioro de la migración de células cancerosas y/o el deterioro de angiogénesis tumoral.

Antecedentes generales Activador de plasminógeno tipo uroquinasa

La bioquímica del uPA ha sido revisada previamente (1). Ésta es una serínproteasa, que es sintetizada como un proenzima de cadena polipeptídica única glicosilada de aproximadamente 50 kD, el pro-uPA, que es virtualmente catalíticamente inactivo. El gen humano uPA está localizado en el cromosoma 10 y se transcribe en un mRNA largo de 2,5 Kb. El pro-uPA se convierte en uPA activo, que consiste de dos cadenas polipeptídicas (A y B) sostenidas juntamente mediante un enlace disulfuro, la cadena A que surge de la parte aminoterminal del pro-uPA, y la cadena B surgiendo de la parte carboxiterminal. La cadena A consiste de dos dominios estructurales, un domino de factor de crecimiento con homología a EGF, y un dominio kringle (2). La cadena B es homóloga a la parte catalítica de otras serínproteasas, tales como tripsina, quimiotripsina, y plasmina. Dos cadenas uPA pueden, mediante la metaloproteinasa matrilisina (o PUMP-1) (3), convertirse en una forma catalítica activa de 33 kD de uPA que consiste en la cadena B y la parte carboxiterminal de la cadena A (uPA de bajo peso molecular), y un fragmento no catalítico de 17 kD que consiste en la parte N-terminal de cadena A.

El uPA corta un único enlace peptídico en el plasminógeno, convirtiéndolo en plasmina, que degrada un amplio espectro de proteínas, incluyendo fibronectina, fibrina, y laminina (para revisión ver la referencia (1)). Además, la plasmina activa las formas latentes de algunas metaloproteasas (4) y afecta a varios sistemas de factores de crecimiento, por ejemplo, activando TGF-\beta latente (5,6) y disociando el IGF-I de su proteína de unión (7) y bFGF de la superficie de algunos tipos de células (8).

Muchas citoquinas y hormonas controlan la expresión de uPA de un modo específico celular (ver referencia (9)).

El uPA se produce a partir de muchos tipos de cultivos celulares de origen neoplásico. Se ha descubierto que explantes de tejido tumoral liberaban más uPA que los tejidos normales correspondientes. El uPA ha sido identificado en extractos a partir de carcinomas de pulmón humano, colon, endometrio, pecho, próstata y renales, melanomas humanos, tumores mamarios de ratones, el tumor de pulmón de Lewis de ratones, y en ascitis debida a carcinomatosis peritoneal humana. Un estudio immunohistoquímico de crecimiento invasivo y carcinomas de pulmón de Lewis en metástasis en ratones mostró consistentemente la presencia de uPA, pero también una heterogeneidad pronunciada en el contenido de uPA en diferentes partes de los tumores individuales. Se descubrió un contenido elevado de uPA en áreas con crecimiento invasivo y degradación de tejido normal de alrededor, mientras que en otras áreas no había uPA detectable. El uPA se localizó en el citoplasma de las células tumorales y envolviendo extracelularmente las células tumorales.

La degradación del tejido normal de alrededor es una característica principal de la capacidad de invasión de los tumores malignos. El descubrimiento constante de uPA en tumores malignos y los descubrimientos que indican que uPA juega un papel en la degradación de tejidos en sucesos fisiológicos normales ha llevado a la suposición de que el uPA juega un papel similar en el desarrollo del cáncer. La hipótesis de que uPA juega un papel en la destrucción de tejidos implica la asunción de que la plasmina, juntamente con otros enzimas proteolíticos, degrada la matriz extracelular. Es notable en este contexto que la mayoría de componentes de la matriz extracelular pueden ser degradados por la plasmina. Estos incluyen laminina, fibronectina, proteoglicanos, y posiblemente algunos tipos de colágeno, pero no todos. Además, la plasmina puede activar colagenasas latentes que a su vez pueden degradar los otros tipos de colágeno (4).

Muchos grupos de investigación han propuesto que las células tumorales invasivas secretan proteinasas que degradan la matriz y que una de las cascadas cruciales es el sistema de activación del plasminógeno. La regulación de la proteolisis puede tener lugar a muchos niveles incluyendo interacciones célula tumoral-célula huésped e inhibidores de proteasa producidos mediante las mismas células tumorales o células huésped. La expresión de enzimas de degradación de matriz no es específica de células tumorales. Las células tumorales activamente invasoras pueden simplemente responder a diferentes señales reguladoras comparadas con sus equivalentes no invasivas.

La asunción de que el sistema activador de plasminógeno, a través de la descomposición de proteínas de la matriz extracelular, juega un papel en la capacidad de invasión y destrucción de tejido normal durante el crecimiento de tumores malignos está respaldada por una variedad de descubrimientos. Éstos incluyen una estrecha correlación entre la transformación de células con virus oncogénicos y la síntesis de uPA, el descubrimiento que uPA está implicado en la destrucción de tejido en muchas condiciones no malignas, y la localización inmunohistoquímica del uPA en áreas de invasión de tumores (ver (1) para revisión).

Más soporte para esta hipótesis ha venido de estudios con anticuerpos anticatalíticos para uPA en sistemas modelo para la invasión y metástasis. Se descubrió que tales anticuerpos disminuían la metástasis al pulmón de un tumor humano productor de uPA, Hep-3, transplantado en la membrana corialantoica de embriones de pollos (11,12), la penetración de membranas amnióticas mediante células de melanoma B16 (13), la invasión de la membrana basal por varias líneas celulares murinas y humanas de origen neoplásico (14), y la formación de metástasis pulmonar después de una inyección intravenosa de células de melanoma B16 en ratón (15). En algunos de estos estudios (13,14), una activación de protocolagenasas catalizada por plasmina pareció ser una parte crucial del efecto de la activación del plasminógeno.

Receptor del activador del plasminógeno tipo uroquinasa

Un receptor de la superficie celular específico para uPA (uPAR) primero se detectó mediante una unión saturable de uPA a monocitos y células de tipo monocitos (16) y desde entonces ha sido encontrado en muchos tipos de cultivos de células cancerosas (17). El uPAR humano es una cadena única de polipéptidos, una proteína elevadamente glicosilada con un peso molecular de 55-60 kD (18). Es traducida a partir de un mRNA de 1,4 Kb (19), codificado por un único gen situado en el cromosoma 19. Éste consiste de tres dominios homólogos. El dominio amino-terminal (dominio 1) contiene la región de unión al ligando (20), que se une al dominio similar a EGF en la molécula uPA (21). El uPAR está anclado carboxi-terminalmente a la superficie celular por la mitad glicosil-fosfaditilinositol (22). Una función posible de este ancla lipídico es facilitar el movimiento de uPAR en la membrana celular. El uPAR puede ser segmentado por uPA y plasmina, liberando el dominio 1 y dejando los dominios 2 y 3 en la superficie celular (23).

El uPAR se une tanto al uPA activo como al pro-uPA con una elevada afinidad (k_{d} 10^{-9}-10^{-11} M), que depende del tipo celular. El pro-uPA puede ser activado cuando está unido al receptor, y el uPA unido al receptor es catalíticamente activo (17,24). La unión del pro-uPA al uPAR y la concomitante unión de la superficie celular al plasminógeno potencia fuertemente la generación de plasmina (24,25) y la superficie de las células que expresan uPAR son sitios preferentes para la activación del plasminógeno bajo condiciones fisiológicas (26).

La activación del pro-uPA unido a receptor es eficientemente catalizada por la plasmina unida a la superficie dando lugar a una fuerte amplificación de la reacción de activación del plasminógeno total (24). Otros varios enzimas proteolíticos, incluyendo la callicreina plasmática (27) y la catepsina B (28) pueden activar el pro-uPA. La relevancia fisiológica de estos últimos enzimas en la activación del pro-uPA queda por determinar y todavía no se sabe como la vía del uPA de la activación del plasminógeno es iniciada in vivo.

La síntesis del uPAR está regulada por citoquinas tales como TGF-\beta1, TGF-\beta2, EGF y por el promotor tumoral acetato miristato de forbol. Esta regulación ha sido en algunos casos trazada de nuevo a nivel transcripcional, pero también los cambios en la estabilidad del mRNA uPAR juegan un papel ((29,30) y L. Lund, comunicación personal).

Inhibidor del activador del plasminogeno tipo 1 y 2

La actividad del uPA está controlada por dos inhibidores específicos de la activación del plasminógeno, PAI-1 y PAI-2 (para revisión ver (31)). Estas moléculas son productos de diferentes genes, localizados en los cromosomas 7 y 18, respectivamente. Ambos son glicoproteínas con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y ambos pertenecen a la familia de los inhibidores de la serínproteasa (serpina). El PAI-1 y el PAI-2 se diferencian en su capacidad relativa de reaccionar con uPA y tPA y también en su reactividad inmunológica. El PAI-1 se autoinactiva en una forma latente pero está protegido de su inactivación uniéndose a la vitronectina (32). El uPA y tPA también son inhibidos por la proteasa nexina 1, que en contraposición con PAI-1 y PAI-2, también inhibe otras proteasas similares a tripsina tales como la plasmina y trombina (33). Los inhibidores se unen a la cadena B catalítica del uPA activo. Éstos no reaccionan con el pro-uPA. El PAI-1 inhibe el uPA unido a receptor casi tan eficientemente como el uPA en solución (24). Varios tipos celulares internalizan y degradan complejos entre uPA y PAI-1 o PAI-2 (34). En algunos casos esta internalización parece ser dependiente de la unión al receptor uPA (35) e informes recientes indican que el receptor
\alpha-2-macroglobulina en algunos tipos celulares también juega un papel en la internalización de los complejos

\hbox{uPA/PAI-1}

(36). La expresión de ambos PAI-1 y PAI-2 está regulada por una variedad de citoquinas, factores de crecimiento y hormonas (31). La regulación de varios componentes del sistema uPA parece ser independiente una de la otra (9,29-31). Localización del sistema uroquinasa de activación de plasminógeno en tejido canceroso

Estudios de la aparición y localización de varios componentes del sistema uPA han mostrado que ambos uPA y uPAR están expresados en focos invasivos en muchos cánceres experimentales y humanos que han sido investigados. Estos estudios han sido realizados a nivel de proteínas mediante inmunohistoquímica, y a nivel de mRNA mediante la hibridación in situ. Debido a la fuerte amplificación de la actividad proteolítica que es característica para la cascada de activación del plasminógeno, uPA y uPAR están en una cantidad muy baja en tejidos.

En el carcinoma de pulmón de Lewis de ratones altamente invasivo, la proteína uPA (37) y el mRNA (70) están expresados consistentemente por las células cancerosas en los focos invasivos, y utilizando un cDNA recientemente aislado para ratón uPAR (38) se ha descubierto que también el mRNA del uPAR en este carcinoma experimental está expresado por las células cancerosas invasoras (J. Eriksen, comunicación personal). La proteína PAI-1 no se encuentra en las áreas invasivas del carcinoma de pulmón de Lewis pero está expresado por las células cancerosas en áreas no invasivas, sugiriendo que este inhibidor juega un papel en la protección del tejido tumoral contra la degradación proteolítica (39).

Un descubrimiento interesante es que las células del carcinoma de pulmón de Lewis, cuando migran en el tejido normal envolvente sin degradarlo, a menudo expresan ambos mRNA de uPA y mRNA de PAI-1 (P. Kristensen, comunicación personal), sugiriendo que la actividad del uPA regulada por PAI-1 está implicada en la migración de células cancerosas. Un papel del uPA y PAI-1 en la migración celular es también apoyado por una localización diferente del uPA encontrado en contactos de sustrato célula-célula y célula focal en algunos tipos de cultivos celulares. Estas células también producen PAI-1 que servirá para regular la actividad del uPA, capacitándolo para actuar en una rotura direccional de tales contactos durante el movimiento celular (72). La implicación del uPA y PAI-1 en la migración de células cancerosas y metástasis es además apoyada por el descubrimiento de que cada 5 líneas celulares de melanoma las 2 que producen uPA, uPAR y PAI-1 eran las más eficientes en un ensayo de degradación de la matriz in vitro y más frecuentemente produjeron metástasis pulmonar en ratones nude in vivo.

De los cánceres humanos, los adenocarcinomas de colon han sido los más intensamente estudiados para la expresión de componentes del sistema de activación del plasminógeno. Ambos uPA y uPAR están presentes constantemente en el foco invasivo, pero la proteína uPA (40) y el mRNA (41) no se encuentran en las células cancerosas pero si en las células del estroma parecidas a fibroblasto situadas adyacentemente a las células cancerosas invasoras. El mRNA uPAR (41) y la proteína uPAR (C. Pyke, resultados no publicados) están localizados en células cancerosas y en macrófagos infiltrando tumores. Por lo tanto, en este tipo de cáncer, las células malignas y los macrófagos pueden posiblemente unirse y utilizar el uPA liberado a partir de las células similares a fibroblasto. El mRNA de PAI-1 está expresado en adenocarcinomas de colon mediante células endoteliales en el estroma del tumor (42), ya que no hay expresión de PAI-1 en el tejido normal envolvente, sugiriendo que el PAI-1 también en este tipo de cáncer juega un papel protegiendo el tejido tumoral contra la degradación. Otro posible papel del PAI-1 es participar en el proceso de angiogénesis del tumor (77).

En el cáncer de piel escamoso humano los mRNA de uPA y uPAR están expresados por las células cancerosas invasoras (43,44). En los carcinomas mamarios ductales la inmunoreactividad del uPAR está localizada en macrófagos infiltrando el foco invasivo (45), mientras que el mRNA del uPA se encuentra en células similares a fibroblastos adyacentes, y en algunos casos también en las células cancerosas (43,46). El PAI-1 ha sido detectado mediante inmunohistoquímica en células endoteliales, las células cancerosas y algunas células epiteliales no malignas en cáncer de mama (47).

Estos estudios por lo tanto muestran que hay una expresión consistente de uPA y uPAR en el foco invasivo y de PAI-1 en áreas no invasivas de tumores malignos así como en células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos, y que algunos de los componentes del sistema uPA son expresados por las células del estroma durante la invasión cancerosa.

Una expresión similar de la célula del estroma ha sido recientemente descubierta para varias metaloproteasas que se cree que están implicadas en la invasión cancerosa (48-52) y ahora está apareciendo una descripción de las células del estroma estando frecuentemente implicadas activamente en el proceso invasivo (para una revisión reciente ver (53)).

Significado pronóstico de uPA y PAI-1 en cáncer de mama

El primer estudio que relacionó el contenido de uPA en tejido de cáncer de mama para la prognosis de un paciente (54) midió los niveles de uPA probando la actividad del enzima presente en los extractos de tumor y demostró que una elevada actividad estaba significativamente asociada con un pequeño intervalo libre de enfermedad. Estudios subsecuentes midiendo el contenido de uPA mediante ELISA mostraron que elevados niveles de inmunoreactividad de uPA no estaba sólo asociada con una supervivencia sin recaída más pequeña sino que también fuertemente asociada con supervivencia global más corta (55-58).

Jänicke et al,. (56) por lo tanto se descubrió en un estudio de 115 pacientes con un tiempo de observación medio de 12,5 meses, que pacientes con niveles de uPA elevados tenían una supervivencia sin enfermedad significantemente más corta, siendo el riesgo relativo 21,1 (95% de intervalo de confianza 2,6-174,6). Esta asociación fue significativa tanto en pacientes con nódulos positivos como con nódulos negativos. De una manera similar, Duffy et al (55) descubrieron una correlación significativa entre supervivientes y el nivel de uPA en 166 pacientes con cáncer de mama con una observación media de 34 meses, siendo el riesgo relativo del 11,3 (95% de intervalo de confianza 1,22-99,0).

Estos dos estudios se realizaron con extractos detergentes de tejido canceroso mamario. Estos extractos contienen más uPA que esos realizados con tampones libres de detergente, tales como aquellos utilizados para la preparación rutinaria de citosoles para los receptores de hormona esteroídica (59). Mediante el uso de una combinación de una preparación de anticuerpos policlonales y tres anticuerpos monoclonales se construyó un ELISA que fácilmente detecta la inmunoreactividad de uPA en citosoles. Aunque los citosoles sólo contienen alrededor de un 12% de la inmunoreactividad óptima extraíble de uPA, hay un correlación próxima entre el uPA en los citosoles y la cantidad máxima extraíble (59). Con este ELISA uPA se realizó un estudio retrospectivo en citosoles almacenados de 190 pacientes de elevado riesgo pre- y post-menopáusicas que fueron protocolizadas por el Grupo de Cooperación Danés del Cáncer de mama y tuvo una media de tiempo de observación de 8,5 años (58). Un elevado uPA citosólico fue asociado significativamente en este estudio con una supervivencia global corta en ambos pacientes pre- y post-menopáusicas, el riesgo relativo siendo 2,0 (95% de intervalo de confianza 1,1-3,7) en las mujeres premenopáusicas.

En un estudio reciente de Foekens et al (60) el uPA fue evaluado en el citosol canceroso de mama de 671 mujeres. El uPa se encontró significativamente asociado con la supervivencia libre de recaída y la muerte ambas en el grupo de pacientes con nódulo negativo y en el grupo de pacientes con nódulo positivo.

También un nivel elevado de PAI-1 en tejido canceroso mamario, como se determinó por ELISA, parece estar asociado con una pobre prognosis (57,58). Jänicke et al. (57) por lo tanto descubrieron en un estudio de 113 pacientes con un tiempo de observación media de 25 meses que los pacientes con un nivel elevado de PAI-1 en su tumor primario tenían una supervivencia libre de recaída significativamente más pequeña que pacientes con un nivel de PAI-1 bajo, siendo el riesgo relativo 2,8 (95% de intervalo de confianza 0,98-8,3). En el estudio Danés de 190 pacientes con riesgo elevado de cáncer de mama (58), el nivel elevado de PAI-1 en los extractos citosólicos estaba significativamente correlacionado con la supervivencia global pequeña y con una supervivencia libre de recaídas pequeña en pacientes pre- y post-menopáusicas, siendo el riesgo relativo respecto a la supervivencia global 2,9 (95% de intervalo de confianza 1,5-5.8) en mujeres post-menopáusicas.

Hay una correlación positiva entre los niveles de uPA y PAI-1 en tejido canceroso de mama (47,57,58) mientras que los dos parámetros en los varios estudios no están, o están débilmente asociados con niveles de receptores de estrógeno y progesterona. En análisis multivariados incluyendo parámetros de pronóstico establecidos, tales como número de nódulos linfáticos tumor positivos, tamaño de tumor, y niveles de receptores de estrógeno y progesterona, se descubrió que los niveles de uPA o PAI-1 son independientes y son parámetros de pronóstico estadísticamente significativos en muchos grupos de pacientes estudiados (55,57,58). La determinación de los niveles de uPA y PAI-1 por lo tanto parecen añadir información significativa de pronóstico a la obtenida mediante los parámetros establecidos. Se debería señalar que esta información, al menos respecto a los niveles de PAI-1, puede ser obtenida a partir de citosoles preparados rutinariamente para análisis de receptores de hormonas esteroídicas.

Descripción detallada de la invención

El hecho de que el nivel elevado de PAI-1 en el tejido tumoral esté correlacionado con una pobre prognosis en el cáncer de mama y también en adenocarcinoma de pulmón (ver Ejemplo 1) sugiere que el PAI-1 promueve el crecimiento tumoral, la invasión y/o metástasis. Tal como se discutió anteriormente hay varios mecanismos por los que el PAI-1 juega un papel de promoción como protector del tejido tumoral contra la degradación por el sistema uPA, participando en la migración de las células, participando en la angiogénesis tumoral, o interfiriendo con la activación/inactivación de los factores de crecimiento. Es probable de que algunos inhibidores de otros enzimas proteolíticos extracelulares y otros enzimas degradantes de la matriz no proteolíticos jueguen un papel similar en la promoción del crecimiento tumoral, invasión y/o metástasis.

Por lo tanto, la invención se refiere al uso de un compuesto, que suprime la actividad inhibidora del PAI-1 en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno, para preparar una composición para inhibir el crecimiento tumoral maligno, invasión y/o metástasis en un paciente que ha sido determinado como predispuesto a tener un elevado riesgo de desarrollar un tumor maligno o que ha desarrollado un tumor maligno.

Mediante el uso de la invención el efecto inhibitorio del PAI-1 en el tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno está suprimido, inhibido o neutralizado, permitiendo así la degradación del tejido tumoral maligno o el tejido tumoral potencialmente maligno. Por el término "supresión" se entiende que la actividad inhibitoria de un inhibidor de la proteasa o de un enzima degradante de la matriz no proteolítico está significativamente reducida, es decir, en un grado de al menos un 25% pero preferiblemente reducido en un grado más elevado tal como alrededor de un 50%, 60%, 70% o aún mucho más como 75%, 80%, 90% o 95%. El grado de inhibición del PAI-1 por varios compuestos puede ser establecido mediante el uso de pruebas inhibitorias adecuadas. En el contexto presente, el término "compuesto" debería ser entendido en su contexto más amplio como una sustancia compuesta por dos o más elementos, de manera que los átomos de los elementos están firmemente unidos entre si y están presentes en proporciones definidas, el término por lo tanto incluye compuestos químicos convencionales como por ejemplo anticuerpos. Ejemplos de tales pruebas que pueden utilizarse por separado o sucesivamente están descritos en los Ejemplos 4, 5 y 6 utilizando la capacidad de una persona experimentada en el campo basándose en el entrenamiento en la especificación para desarrollar y utilizar otras pruebas similares para el propósito de cribar compuestos que sean capaces de suprimir la actividad inhibitoria de un inhibidor de una proteasa o de un enzima de degradación de la matriz no proteolítica.

Por lo tanto, el grado de supresión mencionado anteriormente se refiere a las pruebas in vitro, en donde la supresión tiene lugar en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno. Por lo tanto será necesario probar los compuestos que se ha descubierto que son inhibidores en pruebas in vitro y/o sistemas de pruebas animales in vivo también en ensayos clínicos para establecer si un cierto compuesto será adecuado para el uso en los métodos de acuerdo con la invención, estando el planteamiento y la conducción de tales ensayos clínicos en la habilidad de la persona experimentada en el campo.

Por el término "un paciente en el que se ha determinado un riesgo elevado de desarrollar un tumor maligno o que ha desarrollado un tumor maligno" se refiere a un ser humano (o animal) quien mediante el uso de cualquier medio de investigación o prueba conocida en el campo de la medicina y cirugía ha sido determinado para desarrollar un tumor maligno. Mediante el término "tener un riesgo elevado de desarrollar un tumor maligno" se pretende incluir la situación en la que no está definitivamente establecido que el humano o animal haya desarrollado un tumor maligno pero se contempla elevadamente probable que éste lo ha hecho o lo hará en un futuro cercano, es decir, dentro de los siguientes días, meses o años. Tal situación emergerá, por ejemplo, después de cirugía para un tumor maligno en cuya situación no puede ser generalmente excluido que la metástasis haya tenido lugar así como en determinadas situaciones clínicas en las que una o un número de pruebas clínicas o de laboratorio indican que el paciente ha desarrollado un tumor maligno pero la localización del tumor no está determinada y también en situaciones donde el paciente tiene una puntuación indicadora de riesgo elevado de un marcador tumoral tal como un marcador tumoral de suero o un gen o un producto génico que indica que el paciente está en un riego elevado de desarrollar un tumor maligno. Ejemplos de tales marcadores tumorales son bien conocidos en el campo.

El término "tumor maligno" o "tejido tumoral maligno" pretende designar las células tumorales malignas por si mismas, incluyendo micrometástasis, así como las células del estroma y de la matriz extracelular del tumor maligno, por ejemplo, células endoteliales, fibroblastos, macrófagos, leucocitos etc.

El término "tejido tumoral potencialmente maligno" pretende designar el tejido que tiene el potencial de desarrollarse hacia un tumor maligno; como un ejemplo de tejido tumoral potencialmente maligno se puede mencionar el carcinoma in situ.

El término "enzima de degradación de la matriz" tal como se usa aquí, denota un enzima que es capaz de degradar componentes de la matriz extracelular, i. a. proteínas. Los enzimas importantes que degradan la matriz son proteasas y por lo tanto un aspecto importante de la invención es el método anteriormente mencionado en donde la actividad inhibitoria de un inhibidor de proteasa está suprimida. Sin embargo, los enzimas no proteolíticos también juegan un papel en la degradación de la matriz, por ejemplo, los enzimas que degradan los proteoglicanos extracelulares.

De acuerdo con la invención tal supresión de la actividad inhibitoria de la PAI-1 en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno permite al PAI-1 degradar directa o indirectamente el tejido tumoral maligno o el tejido tumoral potencialmente maligno, y/o resulta en la interferencia con el proceso de la angiogénesis tumoral, y/o resulta en la interferencia con la capacidad migratoria de células tumorales malignas o de otras células en el estroma del tumor y/o resulta en interferencias con el efecto de factores de crecimiento.

El término "capacidad migratoria" tal como se usa aquí significa la capacidad de las células tumorales de invadir el tejido no maligno. Por lo tanto, el término se refiere a la capacidad de invasión de las células tumorales así como a su capacidad de formar metástasis. De esta manera, una interferencia con la capacidad de migración resultará en una reducción de la capacidad de invasión así como en la capacidad de formar tejido metastático.

El paciente puede ser tratado solamente con la composición preparada para el uso del compuesto. Sin embargo, en un número de casos, el paciente estará sujeto también a otras formas de tratamiento, por ejemplo, una operación en la que el tejido tumoral maligno es eliminado. En tales casos, la composición se usará como un tratamiento neoadyuvante, como un tratamiento pre-operativo, como un tratamiento adyuvante o como cualquier tipo de combinación de estos tratamientos. También combinaciones con fármacos citotóxicos, terapia endocrina e irradiación representan posibles estrategias para el tratamiento.

En ciertas circunstancias todavía no ha sido establecido que una persona haya desarrollado un tumor maligno, pero se considera elevadamente probable que ésta o éste estén en el proceso de desarrollar un tumor maligno o ha desarrollado un tumor maligno pero la localización del tumor aún no ha sido determinada. En una realización de la presente invención, el paciente es un paciente en el que se ha determinado un riesgo elevado de desarrollar un tumor maligno, por ejemplo, teniendo un grado indicador de riesgo elevado de un marcador tumoral tal como un marcador tumoral del suero o teniendo un gen o producto génico que indica que el paciente tiene un riesgo elevado de desarrollar un tumor maligno.

Para un número de tipos de tumores malignos, por ejemplo, cáncer mamario, tal como se describió anteriormente, un aumento en la concentración del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolíticos, siendo dicho inhibidor PAI-1, se ha determinado como un factor de pronóstico que indica una pobre prognosis para el paciente que tiene el tipo de tumor maligno en cuestión. El "aumento de concentración" puede por lo tanto estar por encima de un "valor normal" por ejemplo, una muestra de plasma o muestra de tejido de un tejido particular, o para un cierto tumor la concentración puede ser elevada cuando se comparan los valores de diferentes tumores del mismo tipo (ver como un ejemplo Ejemplo 1).

De esta manera, una realización muy importante de la presente invención se refiere a un uso de acuerdo con la invención en donde el paciente es un paciente que tiene una concentración elevada del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz, siendo dicho inhibidor PAI-1, en el tejido tumoral y/o en el plasma y/o suero. La concentración aumentada del inhibidor de proteasas o del enzima degradante de la matriz no proteolítica en el tejido tumoral maligno y/o en plasma se establece pre-operativamente o post-operativamente o se puede establecer en base a una muestra de plasma (con o sin operación) o una muestra del tumor maligno, por ejemplo una biopsia.

Esta realización es relevante en donde el paciente tiene un tumor de tipo maligno para el que ya se ha establecido que una concentración aumentada del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico, siendo dicho inhibidor PAI-1, en el tejido tumoral maligno y/o en plasma está asociado con una pobre prognosis. Para un número de tipos de tumores malignos no se conoce aún si una concentración aumentada del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico es un factor de pronóstico que indica un pobre pronóstico para el tipo de tumor maligno en cuestión. Para un tipo de tumor maligno, el grado de pronóstico de una concentración aumentada de un inhibidor de tejido tumoral maligno de la proteasa o enzima degradante de la matriz no proteolítico y/o una concentración aumentada de inhibidor plasmático de la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico se puede establecer usando un ensayo específico para el inhibidor de la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico. Un ejemplo del establecimiento de este grado de pronóstico para un tipo de cáncer determinado se da en el Ejemplo 1 con referencia al cáncer de pulmón usando un ELISA PAI-1.

También es útil un método para establecer el valor predictivo para tener beneficio de ser tratado con un compuesto que suprime la actividad inhibidora de un inhibidor de una proteasa o de un enzima degradante de la matriz no proteolítico en tejido tumoral maligno o tumor potencialmente maligno en un paciente individual, es decir, para predecir la probabilidad de una respuesta de un tratamiento con el compuesto en un paciente individual. Ejemplos de tipos de tumores malignos para los que se ha establecido o se establecerá son carcinomas de mama, carcinomas urológicos por ejemplo carcinoma de próstata y carcinoma de vejiga, carcinomas ginecológicos, por ejemplo, carcinoma de ovarios y carcinoma cervical, tumor pulmonar de células no pequeñas, cánceres gastrointestinales, por ejemplo adenocarcinoma de colón y cánceres gástricos, tumores cerebrales, sarcomas, malignidades hematológicas, por ejemplo, cánceres de piel y linfáticos, por ejemplo melanoma y cáncer de piel de células escamosas. También cualquier otro tipo de cáncer tal como por ejemplo cáncer de cuello y cabeza para los que se establece que una concentración aumentada del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico es un factor de pronóstico o tiene un valor predictivo están dentro del alcance de la invención.

En el alcance de esta invención está también un uso de acuerdo con la invención, en donde la concentración aumentada del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico se han establecido para ser un factor predictivo indicativo de la eficiencia del tratamiento en el tipo de tumor maligno en cuestión con el supresor del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico. Un ejemplo de un ensayo predictivo para identificar pacientes que potencialmente se beneficiaran de tal tratamiento que se describe en el Ejemplo 2 utilizando como ejemplo un adenocarcinoma broncogénico. Experimentos similares se pueden hacer para otros tipos de tumor.

Tal como se puede ver descrito en el ejemplo 2, se contempla que la eficacia del tratamiento de pacientes que sufren neoplasia maligna comprende la inhibición de un inhibidor de proteasas, se puede evaluar a priori determinando el nivel del inhibidor de proteasas en el tejido neoplásico o en otras muestras cogidas de los pacientes (plasma, suero, orina, etc.). Así, determinando el nivel de por ejemplo PAI-1 en tejido tumoral de un paciente, será posible establecer si hay cualquier justificación médica para el inicio de un tratamiento de inhibición de PAI-1 en el paciente.

Cuando se usa la composición el tejido tumoral maligno tal como se define anteriormente se degrada mientras que sustancialmente ningún otro tejido que no sea el tejido tumoral maligno se degrada en un factor o grado que proporcione efectos colaterales inaceptables.

PAI-1 se secreta por las células tumorales malignas mismas, incluyendo micrometástasis, y/o de los componentes del estroma del tumor maligno, por ejemplo células endoteliales, fibroblastos, macrófagos, leucocitos etc.

En particular, la invención se refiere a varios usos en donde la actividad de PAI-1 en el tejido tumoral se inhibe por la administración al paciente de un compuesto que suprime la actividad inhibidora del activador de plasminógeno de PAI-1.

Tal como se puede ver en el ejemplo 6, una vez que tal compuesto se ha identificado, particularmente el anticuerpo PAI-1 clon 2 (WO 87/00549). En realizaciones limitadas de la invención este anticuerpo, fragmentos activos del mismo, y/o equivalentes inmunológicos del mismo es el compuesto que se administra al paciente. La invención también se refiere al uso de este anticuerpo en la preparación de una composición para el tratamiento de malignidades neoplásicas.

Los anticuerpos se pueden usar como anticuerpos completos, fragmentos de los mismos (por ejemplo FV, (FV)_{2}, Fab, Fab', F(ab)_{2}), quiméricos, anticuerpos humanos o humanizados siempre que éstos se unan a PAI-1 de un modo apropiado. Los fragmentos de anticuerpo de cadena corta contienen solo las regiones CDR o partes de las mismas que confieren la unión específica a PAI-1 también apropiadas, especialmente si el anticuerpo es uno marcado.

El término "fragmento activo" en este contexto denota un fragmento de unión de la molécula, que también es capaz de proporcionar los mismos efectos biológicos en la molécula diana como es el anticuerpo por si mismo, aunque en algunos casos a concentraciones mayores que el anticuerpo. Por el término "equivalente inmunológico" se entiende una sustancia que exhibe sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo, y ejerce sustancialmente los mismos efectos en la molécula diana que el anticuerpo, aunque en algunos casos a concentraciones mayores que el anticuerpo apropiado.

Para la prevención de una respuesta inmune, se prefiere el uso de anticuerpos/compuestos que se asemejan tan estrechamente como es posible a anticuerpos de origen humano. Tales anticuerpos son, por ejemplo, anticuerpos quiméricos o humanizados (injerto-CDR). Tales anticuerpos normalmente se elaboran a partir de un anticuerpo monoclonal murino (ver por ejemplo, para revisión: Morrison (1992), Annu. Rev. Immunol. 10, 239-265; Winter and Milstein (1991), Nature 349, 293-299). En una realización específicamente preferida de la invención, anticuerpos humanos específicos tumorales (Borrebaeck et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3995-3999; Borrebaeck (1988), Immunol. Today 9, 355-359) se usan con propósitos terapéuticos. Además, es específicamente preferido para preparar Mabs humano vía exhibición de bibliotecas de fagos, tal como se describe, por ejemplo, por Griffith et al., EMBO J, 12 (1993) 725-734.

También los anticuerpos porcinos revelados en US 4.132.768 han demostrado no ser inmunogénicos o sólo muy débilmente inmunogénicos en seres humanos.

Los compuestos usados en terapia se pueden administrar parenteralmente, tal como intravascularmente, intraperitonealmente, subcutáneamente, intramuscularmente, usando formas conocidas en el campo farmacéutico. Los componentes de los fármacos activos de la presente invención se usan en forma de líquido, polvo o liofilizado y pueden ser combinados con un excipiente o diluyente apropiado, tal como agua, una solución salina, dextrosa acuosa, tampón acuoso, y similares. Los conservantes también se pueden añadir.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos usados en la presente invención se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por aquellos entendidos en el arte. Los compuestos se pueden también formular usando sales de adición básica o ácida farmacéuticamente aceptables. Además, los compuestos o sus sales se pueden usar en una forma hidratada apropiada.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, una cantidad terapéuticamente efectiva pero no tóxica de uno o más compuestos usados en esta invención se emplea en cualquier tratamiento. El régimen de dosis para el tratamiento se selecciona de acuerdo con una variedad de factores incluyendo el tipo, edad, peso, sexo y condición médica del paciente, tipo de tumor, la vía de administración, y el compuesto particular usado en el tratamiento. Un médico del campo general puede fácilmente determinar y prescribir la cantidad efectiva del fármaco requerida recordando logros conocidos de la terapia con anticuerpos. En tal procedimiento, el médico podría emplear dosis relativamente bajas al principio, y posteriormente, aumentar la dosis hasta obtener una respuesta máxima.

El uso descrito anteriormente también comprende uno, en donde el compuesto es un compuesto que suprime la actividad inhibitoria del activador de plasminógeno de PAI-1 inhibiendo la unión de PAI-1 a vitronectina y un uso, en donde el compuesto es un compuesto que inhibe la unión de PAI-1 a uPA, pero no inhibe la unión de uPA a uPAR. Un ejemplo de un compuesto apropiado es un compuesto que es capaz de unirse a PAI-1 pero no es capaz de convertir el plasminógeno en plasmina, por ejemplo una variante no catalítica, derivado o análogo de uPA. Otro ejemplo de un compuesto apropiado es un anticuerpo que es capaz de unirse a PAI-1 y por lo tanto inhibir la inactivación de uPA. Un tercer ejemplo es un compuesto unido a la proteasa, por ejemplo uPA, que previene el efecto del inhibidor, pero que no inhibe la proteasa. Tal compuesto puede ser un anticuerpo contra la proteasa. En aún otra realización de la invención el compuesto que es capaz de unirse a un inhibidor de la proteasa, puede tener un agente citotóxico acoplado al compuesto.

En un reciente estudio de hibridación in situ, el mRNA de PAI-1 se localizó en las células endoteliales en el estroma tumoral de carcinomas de mama ductal invasivo (C.Pyke, resultados sin publicar). La siguiente inmunohistoquímica confirmó la localización de PAI-1 en los vasos tumorales (C.Pyke, resultados sin publicar).

La asociación entre altos niveles de PAI-1 y una prognosis pobre en el cáncer de mama se puede relacionar con los hallazgos anteriormente descritos de mRNA de PAI-1 siendo expresados por células en el estroma tumoral y no por células en el tejido normal adyacente, sugiriendo una función de PAI-1 en la protección del tejido tumoral frente la degradación proteolítica que el tumor impone al tejido normal adyacente. Así, la inhibición de PAI-1 puede llevar a la degradación del estroma tumoral incluyendo vasos tumorales y por lo tanto la inhibición de la progresión tumoral.

En el Ejemplo 3 se describe la hibridación in situ para mRNA de PAI-1 y la inmunotinción de la proteína PAI-1 en el cáncer de pulmón humano. Para otros tipos de cáncer para los que se establece que una concentración aumentada de PAI-1 es un factor de pronóstico, se realizaron experimentos similares.

Con el fin de neutralizar los inhibidores de la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico en el tejido tumoral sería deseable aplicar una terapia local, reduciendo así los efectos secundarios potenciales en el tejido normal.

Una realización importante de la invención se refiere a un método de cribaje para seleccionar compuestos que son apropiados para suprimir la actividad inhibitoria de un inhibidor de una cierta proteasa o enzima degradante de la matriz no proteolítico por ejemplo, PAI-1 frente uPA,

el método comprende uno o más de los siguientes pasos:

1)

Un ensayo de cribaje en que la posible supresión de la actividad inhibidora de un inhibidor de una proteasa o de un enzima degradante de la matriz no proteolítico se determina por la adición del compuesto a un sistema que comprende inmovilizar el inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico, y solubilizar la proteasa o el enzima degradador de la matriz no proteolítica, la proteasa o el enzima degradador de la matriz no proteolítica unido al inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico siendo detectado por el enzima estando marcado o mediante la utilización de un anticuerpo marcado dirigido a la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico, o añadiendo el compuesto a un sistema que comprende proteasa inmovilizada o enzima degradadora de la matriz no proteolítica e inhibidor solubilizado de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico, inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico unido a la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico siendo detectado por el inhibidor estando marcado o mediante la utilización de un anticuerpo marcado dirigido al inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico.

2)

Un ensayo en el que la posible supresión de la actividad inhibitoria del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico en el tejido tumoral se determina mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende un inhibidor radiomarcado de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico y células tumorales que expresan la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico y detectando cualquier inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz unido a la proteasa o al enzima degradante de la matriz no proteolítico mediante el contaje gamma de las células.

3)

Un ensayo de cribaje, en el que la supresión potencial de la actividad inhibitoria de un inhibidor de una proteasa o un enzima degradante de la matriz no proteolítico por el compuesto está determinada mediante la utilización de todas las células para las que la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico está unido a la superficie, por ejemplo, mediante un receptor de proteasa, tal como uPA al receptor uPA.

El ensayo está basado en el principio descrito para determinar la inhibición del receptor unido a uPA mediante inhibidores del activador del plasminógeno (61). Este ensayo está basado en la inhibición de la generación de plasmina utilizando el sustrato fluorogénico específico de la plasmina H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-metilcumarina (Bachem). El efecto inhibitorio del compuesto de prueba contra PAI-1 es determinado mediante la comparación de la generación de curvas de plasmina obtenidas con las varias concentraciones del compuesto con curvas de generación de plasmina hechas con concentraciones variantes de PAI-1.

4)

Administrando un compuesto que ha sido establecido para suprimir la actividad inhibitoria de un inhibidor de una proteasa o de un enzima degradante de la matriz no proteolítico en el tejido tumoral a un ratón nude o rata nude que es inoculada con células tumorales malignas humanas que son capaces de la invasión y/o metástasis en el ratón o rata en presencia de la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico y el inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico, y seleccionando, como un compuesto adecuado, un compuesto que inhiba el crecimiento y/o invasión y/o metástasis de las células tumorales malignas en el ratón o rata.

Las células tumorales incluidas en este ensayo pueden estar produciendo proteasa o enzima degradante de la matriz no proteolítico pero no produciendo el inhibidor de la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico, siendo el inhibidor suministrado por tanto células de ratón como por otras células humanas con las que el ratón es inoculado; las células tumorales que producen el inhibidor de la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico, la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico siendo suministrado por células de ratón o células humanas con las que el ratón es inoculado; las células tumorales produciendo tanto la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico como el inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico o células tumorales que no producen ninguno de estos componentes, la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico y su inhibidor siendo suministrado por células de ratón o por células humanas inoculadas.

Una realización importante de la invención se refiere a un método como el descrito anteriormente, en donde el inhibidor de la proteasa es PAI-1.

Se entenderá que los compuestos seleccionados por los métodos descritos anteriormente son compuestos valiosos en el método de la invención por inhibir el crecimiento del tumor maligno, la migración, etc. así como en los usos de acuerdo con la invención. Tal compuesto también puede ser usado para la preparación de composiciones farmacéuticas tal como está descrito posteriormente.

Alternativamente, para generar inhibidores del PAI-1, el cribaje de actividad de la afinidad de librerías grandes de péptidos, elevadamente diversas expresadas en la superficie de partículas bacteriófagas filamentosas también se pueden realizar. Esta poderosa técnica recientemente desarrollada (81-84) está basada en la capacidad de fagos filamentosos de exhibir péptidos ajenos en sus superficies externas e implica el cribaje específico y la afinidad de purificación de bacteriófagos exhibiendo péptidos que son ligandos para una proteína particular (85). Las librerías de bacteriófagos filamentosos han sido satisfactoriamente utilizadas para identificar péptidos unidos a diversas moléculas tales como estreptavidina (86), proteína HLA de clase II (87), e incluso lectina (88).

El fago exhibe sistemas de vectores pComb3 (89) y pComb8 (90), desarrollados originalmente para la expresión de fragmentos Fab, pero también utilizados satisfactoriamente para la expresión de PAI-1 (91) así como para un fragmento aleatorio \alpha_{2}MR/LRP de la librería (92), resulta en una exhibición monovalente y multivalente respectivamente. Consecuentemente, la construcción de librerías de péptidos en ambos de los vectores exhibidos por el fago, pComb3 y pComb8 permitirá el aislamiento de bacteriófagos que contienen péptidos de baja y elevada afinidad de unión de
PAI-1, respectivamente.

En breve, los siguientes pasos podrán ser utilizados:

Inmovilización del PAI-1 en pocillos micro-titulados Costar. La incubación ("cribaje") con las librerías de fagos anteriormente mencionadas. Después de lavar los fagos unidos son eluidos utilizando glicina-HCl (pH 2,2) y neutralizados. Los fagos eluidos son entonces reamplificados. El protocolo de cribaje, lavado, elución y amplificación se repite tres veces en total. El DNA de fagos aislados después de la ronda final de cribaje, son aislados y el DNA de los "insertos de péptido" de los correspondientes fagos son secuenciados de acuerdo con procedimientos estándar de secuenciación de DNA. Los péptidos sintéticos pueden ser producidos y probados por su capacidad de inhibir la interacción del PAI-1/uPA en un ensayo in vitro (ver más tarde). Los motivos de consenso peptídico identificados como inhibidores de la función del PAI-1 serán extendidos en cada lado para la construcción de un nuevo fago que exhiba librerías de péptidos, y el procedimiento completo descrito será repetido para el aislamiento de nuevos péptidos con afinidades de unión más grandes para PAI-1 (93).

Las células tumorales incluidas en el ensayo mencionado anteriormente pueden producir uPA pero no PAI-1, el PAI-1 siendo suministrado por células de ratón o por células humanas con las que el ratón es inoculado; las células tumorales que producen PAI-1, el uPA siendo suministrado por células de ratón o por células humanas con las que el ratón es inoculado; las células tumorales produciendo ambas el uPA y el PAI-1 o las células tumorales que no producen ni uPA ni PAI-1, uPA y PAI-1 siendo suministrados por células de ratón o otras células humanas inoculadas.

En una realización importante de la invención el compuesto que es un supresor de PAI-1 en un tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno es utilizado en la composición, esto es, para inhibir el crecimiento de un tumor maligno, invasión y/o metástasis en un paciente en el que se ha determinado un elevado riesgo de desarrollar un tumor maligno o que ha desarrollado un tumor maligno, tal como un compuesto, que permite a la proteasa y al enzima degradante de la matriz no proteolítico degradar directamente o indirectamente el tejido tumoral maligno o el tejido tumoral potencialmente maligno mediante la supresión de la actividad inhibitoria de PAI-1 en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno.

En particular la invención se refiere a un compuesto que

1)

suprime la actividad inhibitoria del PAI-1 determinada mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende PAI-1 inmovilizado y proteasa solubilizada o enzima degradante de la matriz no proteolítico, la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico unido al PAI-1 siendo detectado por el enzima estando marcado o utilizando un anticuerpo marcado dirigido hacia la proteasa o al enzima degradante de la matriz no proteolítico, o mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende la proteasa inmovilizada o el enzima degradante de la matriz no proteolítico y PAI-1 solubilizado unido a la proteasa o al enzima degradante de la matriz no proteolítico siendo detectado por el PAI-1 estando marcado o utilizando anticuerpos marcados dirigidos al PAI-1 y/o

2)

suprime la actividad inhibitoria del PAI-1 en el tejido tumoral tal como se determina mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende el PAI-1 radiomarcado y células tumorales que expresan la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico y detectando cualquier PAI-1 unido a la proteasa o al enzima degradante de la matriz no proteolítico mediante el contaje gamma de las células, y/o

3)

suprime la actividad inhibitoria del PAI-1 determinado mediante la utilización de todas las células a las que la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico está unido en la superficie, por ejemplo mediante un receptor de la proteasa, tal como uPA al receptor uPA, y/o

4)

inhibe el crecimiento y/o invasión y/o metástasis de las células tumorales malignas humanas en un ratón nude o en una rata nude determinado mediante la administración al ratón nude o a la rata nude, que han sido inoculados con células tumorales malignas humanas que se sabe que invaden y/o causan metástasis en la presencia de la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico y PAI-1 y que son capaces de invasión y/o metástasis en el ratón, el compuesto que se ha determinado que causa la supresión de la actividad inhibitoria de PAI-1 en el tejido tumoral.

La invención se refiere al uso de un compuesto, que suprime la actividad inhibitoria de PAI-1 en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno, para preparar una composición para inhibir el crecimiento del tumor maligno, invasión y/o metástasis en un paciente en el que se ha determinado un riesgo elevado de desarrollar un tumor maligno o que ha desarrollado un tumor maligno.

En particular, la invención se refiere al uso tal como se describió anteriormente, en donde el compuesto

1)

inhibe la actividad de unión a uPA de PAI-1 determinada mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende PAI-1 inmovilizado y uPA solubilizado, uPA unido a PAI-1 siendo detectado por estar marcado o por la utilización de un anticuerpo anti-uPA marcado, o añadiendo el compuesto a un sistema que comprende el uPA inmovilizado y el PAI-1 solubilizado, PAI-1 unido a uPA siendo detectado por estar marcado o por la utilización de un anticuerpo anti-PAI-1 marcado, y/o

2)

inhibe la unión del PAI-1 al uPA determinada mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende PAI-1 marcado radiactivamente o un derivado del mismo y células que tengan uPA unido a la superficie celular de receptores uPA y detectando cualquier PAI-1 o derivado unido al uPA mediante contaje gamma de las células, y/o

3)

suprime la actividad inhibitoria del PAI-1 en uPa determinado mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende PAI-1 y células que tienen el uPA unido en la superficie celular a receptores uPA y detectando cualquier efecto de PAI-1 tanto directamente por un sustrato uPA cromogénico o indirectamente añadiendo plasminógeno y midiendo la generación de plasmina utilizando un sustrato específico de plasmina tal como el sustrato fluorogénico H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-metilcumarina (Bachem); el efecto inhibitorio del compuesto de prueba contra PAI-1 en 3) se determina entonces mediante la comparación de las curvas de generación de plasmina obtenidas con las varias concentraciones del compuesto con curvas de generación de plasmina hechas con concentraciones variantes de PAI-1 añadido,

para preparar una composición para tratar un paciente en el que se ha determinado que tiene un riesgo elevado de desarrollar un tumor maligno o quien ha desarrollado un tumor maligno mediante la inhibición de la actividad inhibitoria del activador del plasminógeno o el PAI-1 en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno.

Una realización de la invención se refiere al uso, en donde el compuesto adicionalmente

4)

inhibe la actividad del PAI-1 en tejido tumoral determinado mediante la adición del compuesto a las células malignas u otras células en el tejido tumoral que expresa PAI-1 y subsecuentemente añadiendo uPA, seguido por la medición de la actividad del uPA tanto directamente por un sustrato uPA cromogénico o indirectamente añadiendo plasminógeno y midiendo la generación de plasmina.

y otra realización de la invención se refiere al uso en donde el compuesto adicionalmente

5)

es capaz de inhibir el crecimiento y/o invasión y/o metástasis de células tumorales malignas humanas cuando se administra a un ratón nude o rata nude que es inoculada con células tumorales malignas humanas que se sabe que invaden y/o producen metástasis en presencia de uPA y PAI-1 y que son capaces de invasión y/o metástasis en el ratón.

Ejemplos Ejemplo 1 Valor pronóstico de PAI-1 en adenocarcinomas broncogénicos

En cáncer de pulmón de células no pequeñas el estadio de la enfermedad, incluyendo el tamaño tumoral y la implicación del nódulo linfático, en los estadios específicos, se ha informado de que está entre los factores más importantes de prognosis (62,63). Aunque a los pacientes con adenocarcinoma broncogénico se les extrae radicalmente mediante cirugía (estadio I y II), la supervivencia a los 5 años es pobre, con un 40% de supervivencia a los 5 años en el estadio I y un 10% en el estadio II (64). Por lo tanto se necesita un método para caracterizar y definir pacientes con un adenocarcinoma broncogénico y pobre prognosis, para seleccionar subgrupos de pacientes reseccionados radicalmente para quimioterapia adyuvante. Para nuestro conocimiento hoy en día no hay tal marcador de pronóstico utilizado en la práctica clínica.

Hemos estudiado retrospectivamente el significado de pronóstico de niveles de uPA y PAI-1 determinados por ELISA en extractos tumorales de pacientes con adenocarcinoma broncogénico. El estudio incluye 106 pacientes, todos habiendo tenido cirugía con un 81% de intentos de resección radical.

Este ejemplo describe un ensayo para la determinación de PAI-1 en extractos de tumor de adenocarcinomas broncogénicos.

Material y métodos Pacientes y extractos tumorales

El tejido de pacientes con adenocarcinomas broncogénicos se conservó a -80ºC. Los extractos tumorales se hicieron mediante un procedimiento que incluye el pre-enfriamiento del tejido en nitrógeno líquido, pulverización mecánica, extracción con un tampón que consiste de 75 mM acetato potásico, 0,3 M NaCl, 0,1 M L-arginina, 10 mM EDTA y 0,25% de Triton X-100 pH 4,2 seguido por centrifugación a 105.000 g durante 1 hora. El sobrenadante y el sedimento se almacenaron separadamente a -80ºC.

Todos los pacientes de los que se obtuvo el tejido tumoral, fueron operados en el Departamento de Cirugía Torácica, Hospital de Bispebjerg. Los pacientes tenían del estadio I a IIIb (Nueva Clasificación Internacional), el 81% habían sido reseccionados radicalmente (umbral de resección libre de tumor histopatológico y tumor macroscópico) mientras que el resto se encontró inoperable en el momento del punzamiento del tórax. El diagnóstico patológico, utilizando la clasificación de la OMS, se realizó en todos los casos por el mismo patólogo pulmonar experimentado. Los pacientes fueron seguidos regularmente en el departamento de seguimiento de pacientes hasta un año después de la resección, y si ya se encontraba libre de recaída, no se planeó ningún otro control. El tiempo de observación medio fue de 15,6 meses (rango de 0 a 73,5 meses). Los datos de supervivencia se obtuvieron a partir del registro danés central de muerte.

Los extractos de tumores se obtuvieron a partir de 106 pacientes con cáncer de pulmón. Los análisis del PAI-1 se realizaron en los extractos de todos los pacientes. El 70% de los pacientes (69 de 106), estaban en el estadio I de la enfermedad (T1N0 y T2N0). El tamaño tumoral histopatológico, número de nódulos linfáticos del mediastino tumor positivos, diagnóstico patológico, magnitud de la operación, edad y supervivientes totales fueron disponibles para todos los pacientes.

ELISA PAI-1

El PAI-1 se determinó utilizando un sándwich ELISA (18) con anticuerpos de detección y captura monoclonales. Como anticuerpo de captura se utilizó el clon 1 del anticuerpo monoclonal PAI-1 y como anticuerpo de detección se utilizó el clon 7 del anticuerpo monoclonal PAI-1 (PCT/DK86/00080, publicado como WO 87/00549). Este ensayo detecta ambos PAI-1 activo y latente, y además reconoce el PAI-1 unido a uPA y tPA (resultados no publicados, J. Grondahl-Hansen). El PAI-1 se midió en unidades interinas mediante la calibración con preparaciones estándar obtenidas a partir del Instituto Nacional de Estándares y Controles Biológicos, Hertfordshire, UK. Las intra- e intervariaciones para ambos ensayos estaban por debajo de 11%.

El contenido de proteínas de los extractos tumorales se determinó mediante Ensayo de Proteínas Biorad (Biorad, Richmond, CA).

Métodos estadísticos

Para la administración de bases de datos y estadísticas descriptivas, se utilizó el programa SPSS (Inc. SPSS, Versión 4,01, 1988). El análisis de tabla de vida de todos los supervivientes fue calculado mediante el método límite de producto (Kaplan-Meier) y el test de tendencias (Tarrone), se utilizó para determinar la igualdad de estratos para todos los pacientes (3 grupos). El test de rango Log se utilizó para pacientes en el estadio I (2 grupos). El modelo de riesgo proporcional Cox se utilizó para análisis multivariados de supervivientes totales (65), utilizando el programa BMDP.

Resultados Características de los pacientes

Se midió el PAI-1 en los sobrenadantes del extracto tumoral de adenocarcinomas broncogénicos de pacientes reseccionados quirúrgicamente. La tabla 1 muestra las características de los pacientes. Los pacientes a partir de los que se obtuvo el tejido se seleccionaron para cirugía que pretendía ser radical, resultando en la mayoría de los pacientes del material presente con la enfermedad en el estadio I y II (estadio de acuerdo con la Nueva Clasificación de Estadios Internacional). El 81% de los pacientes fueron radicalmente reseccionados, y no se encontraron pacientes que tuvieran metástasis distantes.

TABLA 1 Caracterización: 106 pacientes con adenocarcinoma broncogénico

Variable		Nº de pacientes
		N=106
Edad	< 65 años	53
	> 65 años	53
Sexo	Masculino	54
	Femenino	52
Tumor	T1	23
	T2	68
	T3	10
	T4	5
Nódulos linfáticos positivos	N0	78
	N1	10
	N2	18
Estadio	I	69
	II	8
	IIIa	23
	IIIb	6
Cirugía	Radical	86
	No radical	20

Distribución de los niveles PAI-1

La Figura 1 muestra la distribución de PAI-1 en los extractos del tumor. La distribución está sesgada hacia los valores más bajos. El valor medio de PAI-1 era de 0,86 unidades interinas/mg proteína (ámbito de 0,00 a 10,53). Los niveles de corte de los cuartiles inferiores y superiores de la distribución de las concentraciones de PAI-1 se identificaron para clasificar los pacientes en grupos con concentraciones bajas, medias y elevadas de PAI-1. En el
PAI-1 estos niveles fueron de 0,40 unidades interinas/mg proteína y 2,20 unidades interinas/mg proteína.

Para estudiar el significado del PAI-1 en pacientes con enfermedad local, el grupo de pacientes en el estadio I se investigó separadamente. En este grupo el valor medio de PAI-1 se utilizó para separar los pacientes en grupos con bajas y pobres concentraciones; este valor era de 0,775 unidades interinas/mg proteína (rango de 0,00 a 6,99).

Significado pronóstico de PAI-1

En los 106 pacientes se comparó la supervivencia total para pacientes con niveles bajos, medios y altos de PAI-1. Tal como se ve en la Figura 2, la supervivencia total fue significantemente mejor para pacientes con concentraciones bajas de PAI-1, que para pacientes con concentraciones medias o elevadas (P=0,017, test Tarone de tendencias). El significado pronóstico de PAI-1 se estudió mediante análisis univariados. Se descubrió que el PAI-1 tenía un impacto en el peligro de muerte con un riesgo relativo de 1,6 para bajos versus medios y 2,4 para bajos versus elevados (95% de intervalo de confianza de 1,1 a 2,3 y 1,7 a 3,5 respectivamente).

Asociación de PAI-1 con otras variables de pronóstico

La asociación entre el nivel de PAI-1 tumoral y otras variables de pronóstico se estudió utilizando el test X^{2}. Tal como se ilustra en la Tabla 2 no hay asociación significativa entre PAI-1 y otros factores de pronóstico, tales como edad, estadio de enfermedad, sexo, tamaño del tumor o número de nódulos linfáticos implicados.

TABLA 2 Test X^{2} para la asociación entre PAI-1 en extractos tumorales y otras variables en pacientes con adenocarcinomas broncogénicos

	Variable	Correlación con PAI-1
		Valor de P
	Edad	0,63
	Sexo	0,16
	Estadio	0,21
	Radicalidad	0,20
	Tamaño tumoral	0,59
	Nódulos linfáticos	0,22

Análisis multivariado

Para comparar el significado pronóstico del nivel de PAI-1 con el de otros parámetros, se realizó un análisis multivariado para los 104 pacientes que tenían todos los datos completos disponibles (Tabla 3). Las variables se eliminaron una a una del modelo de un modo para atrás y se reincluyeron sólo si el valor P era inferior a 0,05. Este PAI-1 izquierdo y el estadio como los dos únicos parámetros. Utilizando este análisis se descubrió que el nivel de
PAI-1 tumoral era una variable independiente significativa estadísticamente de la supervivencia total con un riesgo relativo de 1,5 para bajos versus medios y 2,3 para bajos versus elevados (95% de intervalo de confianza de 1,1 a 2,2 y 1,6 a 3,3, respectivamente).

TABLA 3 Análisis de regresión de Cox multivariado de 106 pacientes con un adenocarcinoma broncogénico

	Variable	Supervivencia Total	Riesgo relativo
		Valor P multivariado
	Estadio	>0,005	2,3
	PAI-1
	bajo vs. mediano	0,05	1,5 (1,1-2,2)
	bajo vs. elevado	0,005	2,3 (1,6-3,3)

Significado pronóstico de PAI-1 tumoral en subgrupos de pacientes

Respecto a pacientes con estadio I de enfermedad se comparó la supervivencia total para pacientes con niveles por debajo de los valores medios y aquellos con los valores por encima. Tal como se muestra en la Figura 3 había una asociación significativa entre PAI-1 y la supervivencia total (P=0,037).

Discusión

Este estudio retrospectivo de 106 pacientes con adenocarcinoma broncogénico, estadio I al IIIb, indica que niveles elevados de PAI-1 en sobrenadantes de extractos tumorales están asociados con una corta supervivencia total con significancia estadística. En un análisis multivariado incluyendo todos los pacientes y factores tales como edad y estadio, el tumor PAI-1 era un factor de pronóstico significativamente independiente para la supervivencia total.

En pacientes con enfermedad localizada (estadio I y II) la supervivencia a los 5 años es del 40% en el subgrupo del estadio I y del 10% en el subgrupo del estadio II (64). La determinación de los niveles de PAI-1 puede ser útil como marcador de pronóstico para seleccionar a los pacientes reseccionados radicalmente con adenocarcinoma broncogénico y una pobre prognosis para el tratamiento adyuvante. El presente estudio estaba limitado a adenocarcinomas en el grupo del Cáncer de Pulmón de Células No Pequeñas (NSCLC) en un número relativamente pequeño de pacientes. Por lo tanto, el valor pronóstico de PAI-1 debería ser más evaluado en materiales más grandes y en otros subgrupos de NSCLC. También, el valor pronóstico de PAI-1 en otros tipos de cáncer podría ser evaluado de una forma similar (78).

Ejemplo 2 Valor predictivo de las mediciones de PAI-1 en adenocarcinomas broncogénicos

Tal como se muestra en el Ejemplo 1, una proporción de los pacientes con cáncer de pulmón tienen niveles elevados de PAI-1 en sus tumores que predicen una pobre prognosis. Consecuentemente, los pacientes con niveles de PAI-1 elevados serán candidatos para un tratamiento teniendo como meta la inhibición de la unión de PAI-1 a uPA. Este ejemplo describe un ensayo predictivo para identificar pacientes que potencialmente se beneficiarán de tal tratamiento.

Material y métodos Pacientes

Los pacientes con adenocarcinoma broncogénico en el estadio I o II referidos por terapia adyuvante subsecuente a la resección radical de sus tumores de pulmón.

Extracción del tumor

El tejido tumoral de pacientes con adenocarcinoma broncogénico es almacenado a -80ºC. Los extractos tumorales están hechos mediante un proceso que incluye el pre-enfriamiento del tejido en nitrógeno líquido, pulverización mecánica, extracción con un tampón que consiste de 75 mM de acetato potásico, 0,3 M NaCl, 0,1 M L-arginina, 10 mM EDTA y 0,25% Triton X-100 pH 4,2, seguido por centrifugación a 105,000 g durante 1 hora. El sobrenadante y el sedimento se almacenan por separado a -80ºC.

ELISA PAI-1

El PAI-1 se determinó utilizando un sándwich ELISA (18) con anticuerpos de detección y captura monoclonales. Como anticuerpo de captura se utilizó el clon 1 del anticuerpo monoclonal PAI-1 y como anticuerpo de detección se utilizó el clon 7 del anticuerpo monoclonal PAI-1 (WO 87/00549). Este ensayo detecta ambos PAI-1 activo y latente, y además reconoce el PAI-1 unido a uPA y tPA (resultados no publicados, J. Grondahl-Hansen). El PAI-1 se midió en unidades interinas mediante la calibración con preparaciones estándar obtenidas del Instituto Nacional de Estándares y Controles Biológicos, Hertfordshire, UK. Las intra- e intervariaciones para ambos ensayos estaban por debajo de 11%.

El contenido de proteínas de los extractos tumorales se determinó mediante Ensayo de Proteínas Biorad (Biorad, Richmond, CA).

Tratamiento

Todos los pacientes que entran en este estudio, recibirán el tratamiento del inhibidor de la antiproteasa. Las respuestas clínicas se recogerán de acuerdo con los procedimientos estándar (EORTC). Los pacientes serán post-estratificados de acuerdo con el contenido del PAI-1 tumoral (los pacientes con niveles de PAI-1 por encima versus los de debajo del valor medio ya establecido de 0,775 unidades interinas/mg proteína (Ejemplo 1)) y el número y duración de respuestas objetivo serán comparadas entre los dos grupos de pacientes.

Ejemplo 3 Hibridación in situ para el mRNA de PAI-1 y la tinción inmunológica de proteína PAI-1 en cáncer de pulmón humano Inmunohistoquímica

Las secciones criogenizadas de 24 muestras de carcinoma pulmonar fueron utilizadas en inmunohistoquímica. Estos incluían 14 casos de carcinoma de células escamosas, 5 casos de adenocarcinomas, 3 casos de tumores mixtos (adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas) y 3 casos de carcinoma de células grandes indiferenciadas. Se obtuvo tejido de la mucosa normal adyacente reseccionado en el momento de la cirugía de tres de los pacientes. Los anticuerpos PAI-1 anti-humanos monoclonales (clones 1 y 2) se utilizaron para tinciones inmunohistoquímicas. Un anticuerpo monoclonal irrelevante (m-anti-TNP) se utilizó como un control negativo. Se ha mostrado previamente que los dos anticuerpos monoclonales están dirigidos contra dos epitopos diferentes en PAI-1. Las secciones criogenizadas de 5 \mum se sometieron a un método convencional APAAP (Fosfatasa Alcalina Anti Fosfatasa Alcalina) tal como se describió anteriormente (45).

Hibridación in situ

Se probaron 10 de las muestras anteriores mediante hibridación in situ para la presencia de mRNA de PAI-1 mediante un método descrito en detalle previamente (42). En breve, las sondas RNA 35-S marcadas, transcritas a partir de un fragmento par PstI-PstI de 504 bases de un cDNA PAI-1 humano se aplicaron a secciones digeridas de la proteinasa K desparafinada, hibridada durante toda la noche a 48ºC, entonces la RNAsa tratada y lavada con un tampón de elevada astringencia antes de ser revestida con una emulsión fotográfica. Las películas se revelaron después de 10-14 días de exposición.

Resultados Inmunohistoquímica

En todos los casos investigados se encontró un patrón idéntico de tinción con los dos anticuerpos. El anticuerpo anti-TNP monoclonal no dio tinción consistente. En todas las muestras se pudo demostrar la presencia del anfígeno PAI-1 a través de las partes del estroma del tejido canceroso. Las células parecidas a fibroblasto individuales dieron a menudo positivo de manera fuerte, pero a menudo la tinción fue marcadamente difusa y reticulada, siguiendo las fibrillas de colágeno. En 11 casos, todos los cuales eran del tipo escamoso, un número de células tumorales dieron también positivo para PAI-1. Tres ejemplos del tejido de la mucosa normal adyacente no contenían inmunoreactividad para PAI-1.

La Figura 4 muestra la tinción inmunológica para PAI-1 en un espécimen de tejido canceroso de pulmón. Nótese la intensa señal en el compartimiento del estroma.

Hibridación in situ

Se investigaron 10 de 24 casos de especimenes embebidos en parafina procesados rutinariamente, mediante hibridación para la presencia de mRNA para PAI-1. En todos estos especimenes se observó un patrón de expresión génica para PAI-1 muy similar a los patrones de tinción inmunológica.

Ejemplo 4 Esquema de cribaje

Los siguientes ejemplos describen un ejemplo de un esquema de cribaje de compuestos que comprende varios pasos sucesivos que se establece para identificar compuestos que pueden ser utilizados para inhibir la interacción entre PAI-1 y uPA y de esta manera ser utilizados como fármacos para inhibir el proceso metastático e invasivo.

El cribaje inicial de los compuestos se realiza, por ejemplo, mediante el uso del cribaje por ELISA del compuesto posteriormente descrito y si el compuesto muestra efecto inhibitorio, el posterior cribaje de los compuestos es realizado utilizando los próximos pasos en el esquema (Ejemplos 5 y 6).

El ELISA de cribaje de compuestos para su uso en el cribaje de compuestos capaces de inhibir la interacción PAI-1/uPA.

A un ensayo de sándwich de ELISA de dos anticuerpos se desarrolla para el cribaje de compuestos para su capacidad de inhibir la interacción entre PAI-1 y uPA en la solución. El efecto del compuesto a ser cribaje para inhibir la interacción se puede ensayar a varias concentraciones. En el presente caso, el compuesto X es probado y se examina el efecto de X en la interacción. Como un ejemplo, X es un anticuerpo monoclonal PAI-1 que inhibe la inhibición PAI-1 de uPA (WO 87/00549).

Materiales

1)

Placas de 96 pocillos (fondo plano elevada capacidad de unión, NUNC).

2)

Anticuerpo monoclonal PAI-1 purificado sin marcar, por ejemplo, el clon 1 (WO 87/00549).

3)

Clon 5 anti-uPA purificado (66) marcado con biotina.

4)

Avidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP).

5)

PAI-1 purificado compatible (SDS-activado).

6)

uPA recombinante (activado).

7)

Compuesto X

8)

Tampón PBS, pH 7,4 (PBS)

9)

PBS + 0,1% Tween 20, pH 7,4 (PBS/Tween)

10)

Tampón de bloqueo: polvo de leche desnatada 1% (SMP) en PBS.

11)

Tampón citrato: 0,1 M citrato, pH 5,0.

12)

Solución de sustrato: comprimidos de dicloruro de 1,2-fenilendiamina (OPD) en tampón citrato, por ejemplo, 3 comprimidos OPD en 15 ml de citrato.

13)

Tampón de parada: 1M H_{2}SO_{4}.

Procedimiento

1)

Cubrir los pocillos con 100 \mul del anticuerpo PAI-1 (20 \mug/ml) diluido en 0,1 M Na_{2}CO_{3}.

2)

Incubar durante toda la noche a 4ºC.

3)

Lavar los pocillos 5X en PBS/Tween.

4)

Bloquear los sitios que permanecen activos en los pocillos con un 1% de SMP/PBS, 200 \mul/pocillo, durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. Agitar suavemente.

5)

Lavar como en el paso 3).

6)

Añadir 100 \mul de PAI.1 (20 ng/ml).

7)

Incubar con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.

8)

Lavar como en el paso 3).

9)

Añadir una mezcla de 50 \mul de uPA (10 ng/ml) y 50 \mul del tampón de bloqueo en una mezcla de 50 \mul de uPA (10 ng/ml) y 50 \mul de diluciones en serie de X.

10)

Incubar como en el paso 7).

11)

Lavar como en el paso 3).

12)

Añadir 100 \mul del clon 5 biotinilado anti-uPA (2 \mug/ml).

13)

Incubar como en el paso 7).

14)

Lavar como en el paso 3).

15)

Añadir 100 \mul de avidina-HRP diluida 1:5000 en SMP/PBS/Tween.

16)

Incubar como en el paso 7).

17)

Lavar como en el paso 3).

18)

Lavar 1X en agua destilada.

19)

Añadir 100 \mul/pocillo de solución de sustrato.

20)

Parar la reacción con 100 \mul/pocillo de 1M H_{2}SO_{4}, cuando aparece un color amarillo brillante.

21)

Leer en un lector ELISA con un filtro de 490 nm con un filtro de 540 nm como referencia de fondo.

El ensayo ELISA descrito anteriormente puede ser construido de una forma similar con un anticuerpo uPA como anticuerpo de captura y anticuerpo o anticuerpos PAI-1 biotinilado o como anticuerpo(s) de detección.

Los fármacos candidatos para inhibir la unión de PAI-1 a uPA se pueden encontrar mediante el cribaje de librerías de fármacos que consisten de compuestos que aparecen naturalmente, moléculas pequeñas y péptidos. También se pueden utilizar un despliegue de bacteriófagos peptídicos aleatorios o librerías de péptidos sintéticos.

Ejemplo 5 Cribaje de compuestos por su capacidad para inhibir la unión de PAI-1 a uPA en la superficie celular

La capacidad de un compuesto para inhibir la unión de PAI-1 a uPA es examinada adecuadamente como un paso del esquema aspirando a identificar y caracterizar nuevos fármacos en potencia. Reemplazando el clon 2 del anticuerpo PAI-1 monoclonal (WO 87/00549) con el compuesto en prueba en varias concentraciones, la capacidad del compuesto de inhibir la unión del PAI-1 a uPA y de esta manera la prevención de la inactivación de uPA en la superficie celular puede ser evaluada.

El ensayo está basado en lo descrito para determinar la inhibición del receptor unido a uPA mediante inhibidores del activador del plasminógeno (61). Las células U937 (2 x 10^{7}/ml) se incuban con uPA (1,4 nM), después de lavar con glicina-HCl 0,05 M, 0,1 M NaCl, pH 3,0 para eliminar el uPA unido endógenamente. Las células son entonces lavadas para eliminar el exceso de uPA e incubadas en cubetas de fluorómetro plástico de 10 nm a 37ºC a una concentración final de 1 x 10^{6}/ml, con plasminógeno (20 \mug/ml) y el sustrato fluorogénico específico H-C-Val-Leu-Lys-7-amido-4-metilcumarina (Bachem) en 0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,4. El PAI-1 está incluido en estas incubaciones en la concentración de 1 \mug/ml, después de una pre-incubación con concentraciones variantes del anticuerpo o compuesto ensayado. El aumento en la fluorescencia debido a la hidrólisis del sustrato se mide en intervalos de 1 minuto durante 15 minutos, y la generación de plasmina determinada forma la velocidad de cambio en la intensidad de fluorescencia. El efecto inhibitorio del compuesto o anticuerpo ensayado contra PAI-1 es entonces determinado mediante la comparación de las curvas de generación de plasmina obtenidas con las varias concentraciones del compuesto con las curvas de generación de plasmina hechas con concentraciones variables de PAI-1 (0, 0,25, 0,5, 0,75 y 1 \mug/ml). Por lo tanto un porcentaje del efecto inhibitorio se obtiene a cualquier concentración del compuesto.

Ejemplo 6 Cribaje de compuestos por su capacidad de inhibir el proceso invasivo y metastático de las células cancerosas humanas en ratones nude

El último paso en el cribaje de compuestos que han sido mostrados en los pasos previos descritos anteriormente del esquema de cribaje del compuesto para inhibir la interacción entre PAI1 y uPA que de esta manera son compuestos potenciales para ser utilizados como fármacos para inhibir la progresión del cáncer, es evaluar el efecto del compuesto para inhibir el crecimiento así como también el proceso metastático e invasivo in vivo. Se ha desarrollado un modelo de ratón para evaluar el proceso metastático e invasivo de las células cancerosas humanas pueda ser mesurado (PCT/DK92/00306).

Este ejemplo describe un estudio experimental que utiliza anticuerpos PAI-1 monoclonales de neutralización como medio para inhibir la formación de metástasis del cáncer de mama humano xenotransplantado en ratón nude.

Método Línea celular

La línea celular de cáncer de mama humano BAG MDA-MB-231 se propagó rutinariamente en DMEM con un 5% de Suero de Feto de Ternero. Estas células han sido transducidas con el gen lacZ tal como se ha descrito previamente (67). La células para experimentos con ratones nude fueron cogidas utilizando un raspador celular en vez de utilizar enzimas.

Transducción retroviral

Para visualizar los tumores metastáticos, el tipo celular cancerígeno humano que va a ser utilizado en el ensayo se marca mediante una transducción o transfectando las células con un gen LacZ, de esta manera las células pueden ser visualizadas mediante un tinción X-gal. Esta transducción ha sido previamente realizada (67) utilizando MDA-MB-231 humano y MDA-MB-435 humano de células cancerosas. El gen lacZ codifica para \beta-D-galactosidasa, la actividad de la cual puede ser detectada mediante tinción con el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopirano-sido (X-gal), que da una reacción de color azul oscuro. Así, también se pueden detectar los tumores metastáticos microscópicos.

La transducción de las células cancerosas humanas seleccionadas se puede realizar tal como está descrito en (67).

Ratones

Se utilizaron ratones hembra nude de 6-8 semanas de edad nu/nu META/Bom (Bomholtgaard, Denmark). Los ratones se guardaron en banquetas esterilizadas de flujo laminar y todo el equipo utilizado se autoclavó.

Anticuerpos

Se utilizaron el clon 2 de los anticuerpos monoclonales PAI-1 (WO 87/00549), que neutraliza el efecto inhibitorio de PAI-1 (Romer, comunicación personal), y el clon 3 (WO 87/00549), que no influye en la actividad inhibitoria de PAI-1 (Romer, comunicación personal).

Farmacocinética del compuesto

Las características farmacocinéticas del compuesto o anticuerpo a ser cribaje deberían ser clarificadas para administrar y retener el compuesto o anticuerpo en una concentración efectiva en el ratón.

La administración del compuesto o anticuerpo a ser cribada depende de la naturaleza química del compuesto o anticuerpo y puede ser realizada mediante una inyección interperitoneal o inyección subcutánea, mediante la administración oral o aplicación local.

Por lo tanto, a los ratones se les inyectó intraperitonealmente una única dosis de tanto el clon 2 del anticuerpo monoclonal PAI-1 o el clon 3 (WO 87/00549) y a diferentes puntos de tiempo después de esta inyección los ratones se sangraron y se ensayó el suero para el contenido de anticuerpos PAI-1. Además, en el experimento con los animales que padecían un tumor, se obtuvo el suero de todos los animales tratados con anticuerpos anti-PAI-1 mediante el sangrado semanal de la vena de la cola. Las concentraciones de los anticuerpos PAI-1 se analizaron con la técnica ELISA.

Pretratamiento del ratón y células cancerosas transducidas

Puede ser una ventaja pretratar el ratón con un compuesto o anticuerpo para ser cribaje antes de inyectar las células cancerosas transducidas para obtener concentraciones satisfactorias del compuesto o anticuerpo. Además, las células cancerosas transducidas que van a ser inyectadas en el ratón pueden ser preincubadas en una solución que contenga el compuesto o anticuerpo para asegurar un contacto entre las células y el compuesto o anticuerpo. Normalmente varios experimentos en los que este pretratamiento es variado o excluido deberían ser realizados para clarificar y determinar el efecto total del compuesto o anticuerpo.

Por lo tanto, un número total de 2 x 10^{6} células BAG MDA-MB-231 se inocularon subcutáneamente en cada costado de los animales. Las células tumorales son situadas siempre inferiormente a la pared torácica. Un día antes de la inoculación celular se inyectan 250 \mug de anticuerpos en el ratón. Basado en estudios farmacocinéticas (Fig. 5A y 5B, que muestra una investigación farmacocinética del clon 2 y clon 3 de anticuerpos monoclonales anti-PAI-1, respectivamente, en ratón nude inyectado intraperitonealmente con 250 \mug de anticuerpo en el día 0) de los anticuerpos utilizados, se dio una segunda inyección de 250 \mug de anticuerpo cada semana. El ratón se sacrificó a las 6 semanas de la inoculación celular.

Medición del crecimiento del tumor

El crecimiento de los tumores debería ser medido para elucidar si el compuesto ensayado afecta al crecimiento del tumor además del posible efecto en el proceso invasivo y metastático.

Por lo tanto los tumores xenotransplantados se midieron dos veces a la semana en dos dimensiones y las curvas de crecimiento tumoral se construyeron en la bases de una función de Gompertz transformada.

Duración del ensayo de cribaje

La duración del ensayo depende de la naturaleza del compuesto o anticuerpo y del efecto del compuesto o anticuerpo en el crecimiento o capacidad de invasión del proceso metastático.

Examen de los tumores BAG MDA-MB-231 humanos xenotransplantados para PAI-1 humano

Los tumores xenotransplantados fueron eliminados quirúrgicamente de los animales y examinados mediante Northern blotting para la presencia de mRNA PAI-1 humano y mediante ELISA para la presencia de la proteína PAI-1 humana.

Examen de los tumores BAG MDA-MB-231 xenotransplantados para el ratón PAI-1

Los tumores xenotransplantados fueron eliminados quirúrgicamente de los animales y examinados para el mRNA PAI-1 de ratón mediante la hibridación in situ con una sonda específica de ratón.

Evaluación del proceso metastático e invasivo

El efecto del compuesto o anticuerpo en el proceso metastático e invasivo y en el crecimiento del tumor puede ser evaluado localmente y/o en los pulmones, los nódulos linfáticos y en la cavidad interperitoneal utilizando la diferenciación muy aparente entre células humanas y células de ratón hecha posible mediante la tinción (67-69).

Consecuentemente, en la autopsia, los pulmones fueron extirpados de cada animal y los pulmones se procesaron con X-gal de acuerdo con el método descrito por Brünner et al (67). Para confirmar la presencia de metástasis de células tumorales humanas, se fijaron las áreas azules de varios pulmones en formalina al 4% y procesados mediante histología rutinaria. Si un pulmón presentaba una o más áreas azules se registró como lesión metastásica positiva. Alternativamente, un ELISA para la \beta-D-galactosidasa tal como está descrito por Fujiwara et al (79), podría ser utilizado como una medida objetivo de propagación metastásica.

Resultados Resultados del examen de los tumores xenotransplantados

Los tumores BAG MDA-MB-231 expresaron abundantes mRNA y proteínas para el PAI-1 humano. Mediante la hibridación in situ, se mostró que el tumor xenotransplantado expresaba el PAI-1 del ratón en las células del estroma incluyendo los vasos que infiltran las células tumorales humanas.

Farmacocinética

La vida media del clon 2 del anticuerpo PAI-1 se estimó que fue aproximadamente de 4 días y para el clon 3 PAI-1 aproximadamente de 6 días (Figura 5A y 5B).

Inhibición de la metástasis de las células tumorales

Tal como vemos en la Tabla 4, 9 de cada 10 animales control sin tratar tuvo metástasis de pulmón. La inyección con el anticuerpo control, el clon 3 del anticuerpo PAI-1, resultó en una leve reducción en el número de animales con metástasis de pulmón (6 de cada 10) mientras que la inyección con el clon 2 del anticuerpo PAI-1 abolió significativamente la formación de metástasis de pulmón con sólo 1 de cada 10 de los ratones teniendo metástasis.

La extensión metastásica de las células cancerosas humanas se confirmó mediante la presencia de células cancerosas en los puntos azules, tal como se determinó mediante exámenes histológicos convencionales.

De una manera similar, otros inhibidores potenciales del PAI-1 se pueden probar en este modelo.

TABLA 4

Tratamiento	Metástasis pulmonar
Control sin tratar	9/10
Clon 3 PAI-1	6/10
Clon 2 PAI-1	1/10

Efectos de los anticuerpos PAI-1 en el crecimiento tumoral

El examen del efecto de los anticuerpos PAI-1 en el crecimiento tumoral mostró que ambos anticuerpos comparados con controles sin tratar, inducían un leve pero no significativo retraso en el crecimiento tumoral (Fig. 6 que muestra las curvas de crecimiento del área tumoral de la línea celular del carcinoma de mama humano BAG MDA-MB-231 inyectada subcutáneamente en ratones hembra nu/nu META/BOM en el día 0).

Después de estudios toxicológicamente apropiados se debería probar un compuesto activo en ensayos de fase I y fase II.

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Claims (23)

1. El uso de un compuesto que

suprime la actividad inhibitoria de un inhibidor de la proteasa o de un enzima degradante de la matriz no proteolítico en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno,

dicho inhibidor siendo inhibidor del activador del plasminógeno I (PAI-1)

para preparar una composición para inhibir el crecimiento tumoral maligno, la invasión y/o metástasis en un paciente en el que se ha establecido el riesgo de desarrollar un tumor maligno o que ha desarrollado un tumor maligno.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico directa o indirectamente degrada el tejido tumoral maligno o el tejido tumoral potencialmente maligno.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la supresión de la actividad inhibitoria de un inhibidor de una proteasa o de un enzima degradante de la matriz no proteolítico en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno interfiere con el proceso de la angiogénesis tumoral.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, en donde la supresión de la actividad inhibitoria de un inhibidor de la proteasa o un enzima degradante de la matriz no proteolítico en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno interfiere con la capacidad migratoria de las células tumorales malignas o de otras células en el estroma tumoral.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en donde el paciente es un paciente al que se le ha determinado un carcinoma in situ.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en donde la composición se utilizará preoperativamente.

7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en donde la composición será utilizada como un neoadyuvante, y/o como un adyuvante después de la eliminación del tejido tumoral maligno mediante una operación quirúrgica.

8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en donde el paciente es un paciente al que se le ha determinado un riesgo elevado de desarrollar un tumor maligno presentando un grado indicativo de alto riesgo de un marcador tumoral tal como un marcador tumoral en suero/plasma o presentando un gen o producto génico que indica que el paciente tiene un elevado riesgo de desarrollar un tumor maligno, dicho tumor maligno siendo seleccionado de un grupo que consiste de carcinomas mamarios, carcinomas urológicos, por ejemplo, carcinoma prostático y carcinoma de vejiga, carcinomas ginecológicos, por ejemplo, carcinoma ovárico y carcinoma cervical, tumores de pulmón de células no pequeñas, cánceres gastrointestinales, por ejemplo, adenocarcinoma de colón y cánceres gástricos, tumores cerebrales, sarcomas, malignidad hematológica, por ejemplo linfoma y cánceres de piel, por ejemplo melanoma y cáncer de piel de células escamosas.

9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, en donde el paciente es un paciente que tiene una concentración elevada del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico en el tejido tumoral maligno y/o en plasma y/o suero, dicho tumor maligno siendo seleccionado de un grupo consistente de carcinomas mamarios, carcinomas urológicos, por ejemplo, carcinomas de próstata y carcinomas de vejiga, carcinomas ginecológicos, por ejemplo, carcinomas ováricos y carcinoma cervical, tumores de pulmón de células no pequeñas, cánceres gastrointestinales, por ejemplo, adenocarcinoma de colón y cánceres gástricos, tumores cerebrales, sarcomas, malignidad hematológica por ejemplo linfoma y cánceres de piel por ejemplo melanoma y cáncer de piel de células escamosas.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la concentración incrementada del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico ha sido establecido como un factor de pronóstico indicando una pobre prognosis para el paciente que tiene el tipo de tumor maligno en cuestión, dicho tumor maligno siendo seleccionado a partir del grupo que consiste en carcinomas mamarios, carcinomas urológicos, por ejemplo, carcinoma de próstata y carcinomas de vejiga, carcinomas ginecológicos, por ejemplo, carcinomas ováricos y carcinoma cervical, tumores de pulmón de células no pequeñas, cánceres gastrointestinales, por ejemplo, adenocarcinoma de colon y cánceres gástricos, tumores cerebrales, sarcomas, malignidad hematológica por ejemplo linfoma y cánceres de piel por ejemplo melanoma y cáncer de piel de células escamosas.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la concentración incrementada del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico, se ha establecido como un factor predictivo que indica la eficiencia del tratamiento del tipo de tumor maligno en cuestión mediante la supresión de dicho inhibidor, dicho tumor maligno siendo seleccionado del grupo que consiste de carcinomas mamarios, carcinomas urológicos, por ejemplo, carcinoma de próstata y carcinomas de vejiga, carcinomas ginecológicos, por ejemplo, carcinomas ováricos y carcinoma cervical, tumores de pulmón de células no pequeñas, cánceres gastrointestinales, por ejemplo, adenocarcinoma de colon y cánceres gástricos, tumores cerebrales, sarcomas, malignidad hematológica por ejemplo linfoma y cánceres de piel por ejemplo melanoma y cáncer de piel de células escamosas.

12. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 2 a la 11, en donde el tejido tumoral maligno degradado, incluyendo las micrometástasis, es tejido comprendido de las mismas células tumorales malignas, la matriz extracelular y/o las células del estroma del tumor maligno, por ejemplo, células endoteliales, fibroblastos, macrófagos, leucocitos; y sustancialmente ningún otro tejido que el tejido tumoral maligno es degradado en una extensión o grado que da efectos colaterales tóxicos inaceptables.

13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 12, en donde el compuesto es un compuesto que suprime la actividad inhibitoria del activador de plasminógeno del PAI-1 mediante la inhibición de la unión de PAI-1 a la vitronectina.

14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, en donde el compuesto es un compuesto que inhibe el efecto del PAI-1 en uPA, pero no inhibe la unión de uPA a uPAR.

15. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 12, en donde el compuesto es un compuesto que

1)

inhibe la actividad de unión a uPA de PAI-1 determinado por la adición del compuesto a un sistema que comprende PAI-1 inmovilizado y uPA solubilizado, el uPA unido a PAI-1 siendo detectado por estar marcado o mediante un anticuerpo anti-uPA marcado, o añadiendo el compuesto a un sistema que comprende uPA inmovilizado y PAI-1 solubilizado, PAI-1 unido a uPA siendo detectado por estar marcado o mediante un anticuerpo anti-PAI-1 marcado, y/o

2)

inhibe la unión del PAI-1 a uPA determinado mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende PAI-1 radiomarcado o un derivado del mismo y células teniendo el uPA unido a la superficie celular de los receptores uPA y detectando cualquier PAI-1 o derivado unido a uPA mediante contaje gamma celular, y/o

3)

suprime la actividad inhibitoria de PAI-1 en uPA determinado mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende PAI-1 y células que tengan uPA unido a la superficie celular a receptores uPA y detectando cualquier efecto de PAI-1 tanto directamente mediante un sustrato uPA cromogénico o indirectamente mediante la adición de plasminógeno y midiendo la generación de plasmina utilizando un sustrato específico de plasmina tal como el sustrato fluorogénico H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-metilcumarina.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el compuesto adicionalmente

4)

inhibe la actividad de PAI-1 en tejido tumoral determinado mediante la adición del compuesto a las células malignas o otras células en el tejido tumoral expresando PAI-1 y subsecuentemente añadiendo uPA, seguido por la medición de la actividad de uPA tanto directamente mediante un sustrato uPA cromogénico o indirectamente mediante la adición de plasminógeno y midiendo la generación de plasmina.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en donde el compuesto adicionalmente

5)

inhibe el crecimiento y/o invasión y/o metástasis de células tumorales malignas humanas cuando son administradas a un ratón nude o a una rata nude que es inoculada con células tumorales malignas humanas que se sabe que invaden y/o metastatizan en presencia de uPA y PAI-1 y que son capaces de invasión y/o metástasis en el ratón.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el compuesto es un compuesto que se une a PAI-1 y no convierte plasminógeno en plasmina.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el compuesto es un derivado o variante de uPA o pro-uPA.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el compuesto es un anticuerpo que es capaz de unirse a PAI-1.

21. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 18 a 20, en donde el compuesto es capaz de unirse a PAI-1 tiene un fármaco citotóxico acoplado.

22. Un método para seleccionar un compuesto para su uso para preparar una composición para inhibir el crecimiento tumoral maligno, invasión y/o metástasis en un paciente en el que se ha determinado un elevado riesgo de desarrollar un tumor maligno o quien ha desarrollado un tumor maligno, el compuesto siendo capaz de suprimir la actividad inhibitoria de un inhibidor de una proteasa o de un enzima degradante de matriz no proteolítico en tejido tumoral maligno o tejido tumoral potencialmente maligno, el método comprende uno o más de los siguientes pasos

1)

un ensayo de cribaje en el que la posible supresión de la actividad inhibitoria de un inhibidor de una proteasa o de un enzima degradante de la matriz no proteolítico se determina mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende un inhibidor inmovilizado de la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico y la proteasa solubilizada o el enzima degradante de la matriz no proteolítico, la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico unido al inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico siendo detectado por el enzima marcado o mediante la utilización de un anticuerpo marcado dirigido a la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico, o añadiendo el compuesto a un sistema que comprende la proteasa inmovilizada o enzima degradante de la matriz no proteolítico e inhibidor solubilizado de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico, inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico unido a la proteasa o al enzima degradante de la matriz no proteolítico siendo detectado por el inhibidor estando marcado o utilizando un anticuerpo marcado dirigido al inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico,

2)

un ensayo en el que la posible supresión de la actividad inhibitoria del inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico en el tejido tumoral se determina mediante la adición del compuesto a un sistema que comprende un inhibidor de la proteasa radiomarcado o del enzima degradante de la matriz no proteolítico y células tumorales que expresan la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico y detectando cualquier inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico unido a la proteasa o al enzima degradante de la matriz no proteolítico mediante el contaje gamma de las células,

3)

un ensayo de cribaje, en el que la supresión potencial de la actividad inhibitoria de un inhibidor de una proteasa o de un enzima degradante de la matriz no proteolítico por el compuesto se determina mediante la utilización de células completas a las que se une la proteasa o el enzima degradante de la matriz no proteolítico en la superficie, por ejemplo, mediante un receptor de proteasa, tal como el uPA o el receptor uPA,

4)

un paso en donde un compuesto que ha sido establecido como supresor de la actividad inhibitoria de un inhibidor de una proteasa o un enzima degradante de la matriz no proteolítico en el tejido tumoral ha sido administrado a un ratón nude o una rata nude que ha sido inoculada con células tumorales malignas humanas que son capaces de invasión y/o metástasis en el ratón o rata en presencia de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico y el inhibidor de la proteasa o del enzima degradante de la matriz no proteolítico, y seleccionando, como un compuesto adecuado, un compuesto que inhibe el crecimiento y/o invasión y/o metástasis de las células tumorales malignas humanas en el ratón o la rata.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el inhibidor de la proteasa es PAI-1.