ES2217280T3 - Metodo para la deteccion del espectro de resistencia antibiotica de especies de microbacterias. - Google Patents

Abstract

METODO PARA LA DETECCION DEL ESPECTRO DE RESISTENCIA ANTIBIOTICA DE ESPECIES DE MYCOBACTERIUM PRESENTES EN UNA MUESTRA, POSIBLEMENTE ACOPLADAS A LA IDENTIFICACION DE LAS ESPECIES DE MYCOBACTERIUM IMPLICADAS, QUE COMPRENDE LOS PASOS DE: (I) SI FUERA NECESARIO LIBERAR, AISLAR O CONCENTRAR LOS ACIDOS POLINUCLEICOS PRESENTES EN LA MUESTRA; (II) SI FUERA NECESARIO AMPLIFICAR LA PARTE RELEVANTE DE LOS GENTES CON RESISTENCIA ANTIBIOTICA PRESENTES EN DICHA MUESTRA CON AL MENOS UN PAR INICIADOR ADECUADO; (III) HACER HIBRIDOS LOS ACIDOS POLINUCLEICOS DEL PASO (I) O (II) CON AL MENOS UNA DE LAS SONDAS DEL GEN RPOB, COMO SE ESPECIFICA EN LA TABLA 2, BAJO LAS CONDICIONES ADECUADAS DE HIBRIDACION Y LAVADO; (IV) DETECTAR LOS HIBRIDOS FORMADOS EN EL PASO (III), (V) INFERIR EL ESPECTRO DE RESISTENCIA ANTIBIOTICA DE MYCOBACTERIUM, Y POSIBLEMENTE LAS ESPECIES DE MYCOBACTERIUM IMPLICADAS DE LA SEÑAL(ES) DE HIBRIDACION DIFERENCIAL OBTENIDAS EN EL PASO (IV).

Description

Método para la detección del espectro de resistencia antibiótica de especies de microbacterias.

La presente invención se refiere al campo de micobacterias resistentes a fármacos.

La presente invención se refiere a métodos y kits para la detección de ácidos nucleicos micobacterianos en muestras biológicas.

La identificación de la mayoría de especies de Micobacterium clínicamente importantes, en particular de Micobacterium tuberculosis, es tediosa y consume tiempo, debido a los procedimientos de cultivo que toman hasta 6 semanas. El diagnóstico rápido de infección por Micobacterium es muy importante puesto que la enfermedad puede amenazar a la vida y ser altamente contagiosa. Sólo recientemente se han desarrollado algunos métodos -todos hacen uso de uno o más procedimientos de amplificación- para detectar e identificar especies de Micobacterium sin la necesidad del cultivo (Claridge et al., 1993). La mayoría de estos métodos están aún en evaluación, y su beneficio en aplicaciones rutinarias sigue siendo cuestionable. Además, estos métodos no resuelven el problema de la detección de la resistencia a fármacos de Micobacterium, la cual aún se hace en cultivo.

Puesto que la frecuencia de la resistencia a múltiples fármacos en la tuberculosis está creciendo constantemente (Culliton, 1992), está claro ahora que el diagnóstico temprano de M. tuberculosis y el reconocimiento rápido de la resistencia a la mayoría de los tuberculostáticos es esencial para la terapia y un control óptimo de la epidemia resurgente.

Los antibióticos usados para el tratamiento de infecciones por M. tuberculosis son principalmente isoniazida y rifampicina, administrados bien separadamente o bien como una combinación de ambos. Ocasionalmente se usan pirazinamida, etambutol y estreptomicina; en el futuro, otras clases de antibióticos, como (fluoro)quinolonas, se pueden convertir en los tuberculostáticos preferidos.

Puesto que la mayoría de micobacterias resistentes a múltiples fármacos también pierden susceptibilidad a la rifampicina, se considera que la resistencia a la rifampicina es un marcador potencial para la tuberculosis resistente a multifármacos. Por esta razón, la detección de la resistencia a rifampicina puede ser de particular importan-
cia.

Para la mayoría de las cepas de M. tuberculosis examinadas hasta ahora, se ha elucidado el mecanismo responsable de la resistencia a rifampicina (y análogos como rifabutina). La rifampicina (y análogos) bloquean el ARN polimerasa interaccionando con la subunidad \beta de esta enzima. Telenti et al. (1993a) encontró que las mutaciones en una región limitada de la sub-unidad \beta de ARN polimerasa del M. tuberculosis da lugar a la insensibilidad del ARN polimerasa a la acción de la rifampicina. Esta región está limitada a un tramo de 23 codones en el gen rpoB. Los autores describen 17 cambios de aminoácidos que provocan la resistencia a rifampicina (Telenti et al., 1993b). Estos cambios de los aminoácidos están provocados por mutaciones puntuales o eliminaciones en 15 nucleótidos u 8 codones de aminoácidos, respectivamente, dispuestos en un tramo de 67 nucleótidos o 23 codones de aminoácidos.

Telenti et al. (1993a y b) describieron un método de PCR-SSCP para detectar las mutaciones pertinentes responsables de la resistencia a rifampicina (SSCP se refiere a polimorfismos de conformación de hebra única). El análisis de SSCP se puede realizar usando radioactividad o usando marcadores fluorescentes. En el último caso, es necesario un equipo sofisticado y caro (un aparato de secuenciación automatizada de ADN). El enfoque del SSCP descrito también tiene otras limitaciones con respecto a la especificidad y sensibilidad que pueden impedir su uso rutinario. La muestra sólo se puede analizar adecuadamente de forma directa si se observa microscópicamente una carga significativa de bacterias (resultado de microscopía: >90 organismos/campo), y se puede observar en aparatos de separación de hebras de muestras de ADN brutas, lo que complica la interpretación de los resultados.

Kapur et al. (1994) describe 23 alelos rpoB distintos asociados con la resistencia a rifampicina. Además de las mutaciones descritas por Telenti et al. (1993a), se describen algunos alelos rpoB mutantes nuevos. Sin embargo, los alelos que aparecen más frecuentemente siguen siendo los mismos que los descritos anteriormente.

En M. leprae, la base molecular de la resistencia a rifampicina fue descrita por Honoré y Cole (1993). Igualmente aquí, la resistencia provenía de mutaciones en el gen rpoB, que codifica la subunidad beta de ARN polimerasa de M. leprae. Sólo se analizó un número limitado de cepas resistentes de M. leprae (9), y en la mayoría de ellas (8/9) la resistencia fue debida a una mutación que afecta al resto Ser-425.

Las micobacterias clínicamente importantes distintas de M. tuberculosis y M. leprae a menudo muestran una resistencia innata, pero variable, a rifampicina. Este es el caso de M. avium y M. intracellulare, patógenos humanos para los que sólo hay opciones limitadas de tratamiento. Guerrero et al. (1994) comparó las secuencias del gen rpoB de diferentes aislados de M. avium y M. intracellulare con la de M. tuberculosis. Las diferencias están presentes a nivel de nucleótidos pero se encontró una identidad completa de aminoácidos con M. tuberculosis sensibles a rifampicina. Estos hallazgos sugieren que se aplica otro mecanismo de resistencia, posiblemente una barrera de permeabilidad, para M. avium y M. intracellulare.

La detección específica de mutaciones puntuales o pequeñas eliminaciones se pueden enfocar elegantemente usando procedimientos de hibridación, tales como el ensayo de hibridación inverso. Sin embargo, la complejidad observada en la parte pertinente del gen rpoB no permite un desarrollo directo de la sonda. Como se ejemplificará posteriormente, fue uno de los objetos de la presente invención diseñar un enfoque específico que permita la detección de la mayoría, si no todas, de las mutaciones encontradas hasta ahora, de una manera rápida y conveniente sin la necesidad de un equipo sofisticado.

El mecanismo de resistencia a isoniazida (INH) es considerablemente más complejo que el de rifampicina. Al menos están implicados dos productos génicos en la resistencia a INH. Primero, está la catalasa-peroxidasa que se cree convierte la INH a una molécula activada. Por tanto, las cepas que no producen catalasa-peroxidasa en virtud de un gen katG defectuoso o eliminado, ya no son susceptibles a INH (Zhang et al., 1992; Stoeckle et al., 1993). En este contexto, se debería mencionar que la asociación entre la resistencia a INH y la pérdida de actividad de catalasa ya fue señalada en los años cincuenta (Middlebrook, 1954 a y b; Youatt. 1969).

La segunda molécula implicada en el producto génico inhA, que se cree que desempeña un papel en la biosíntesis del ácido micólico. Se postula que la molécula activada de INH interactúa directa o indirectamente con este producto, y probablemente evita la biosíntesis apropiada del ácido micólico. Esta hipótesis se basa en la reciente observación que la sobre-expresión del gen inhA de tipo silvestre, o un cambio particular de aminoácidos (S94A) en el producto génico inhA, confiere resistencia a INH (Banerjee et al., 1994).

Brevemente, y en cierto modo simplificado, se puede establecer que en ciertas cepas de M. tuberculosis la resistencia a INH puede estar mediada por:

-

la pérdida de actividad de catalasa-peroxidasa

-

la presencia de ciertos cambios de aminoácidos en la proteína inhA

-

el nivel de expresión de la proteína inhA de tipo silvestre

También, otros mecanismos pueden estar implicados confiriendo resistencia a INH y los fármacos relacionados. La importancia de estos factores en el espectro total de los mecanismos de resistencia a INH aún ha de ser evaluada. Esta cuestión puede ser acatada por medio de técnicas de sondas de ADN si se pueden desarrollar sondas de ADN viables a partir de secuencias disponibles de ADN del gen katG (EMBL nº X68081) y del gen inhA (EMBL nº U02492) de M. tuberculosis. Estos ensayos de sonda también se podrían aplicar entonces para la detección de la resistencia a fármacos en muestras biológicas.

Para la detección de la resistencia a estreptomicina y (fluoro)quinolonas, se puede seguir el mismo enfoque que para la rifampicina. La resistencia a estos antibióticos también se induce mediante mutaciones puntuales en una región limitada de uno o más genes. La mutaciones puntuales en el gen de girasa confiere resistencia a (fluoro)quinolonas (EMBL nº L27512). La resistencia a la estreptomicina se correlaciona con mutaciones en el gen de ARNr 16S o el gen de la proteína ribosómica S12 (rpsL) (Finken et al., 1993; Douglas y Steyn, 1993; Nair et al., 1993).

En la solicitud internacional WO 93/22454 se ha descrito la resistencia debida a cambio de nucleótidos en los genes katG, rpoB y rpsL. Para cada uno de los diferentes genes en M. tuberculosis, sólo se especificó con detalle una de las muchas posibles mutaciones. R461L para katG. S425L (equivalente a S531L descrito por Telenti y col., y la presente invención) para rpoB, y K42R para rpsL.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método rápido y fiable para la determinación de la resistencia a rifampicina (y/o rifabutina) de M tuberculosis presente en una muestra biológica.

También es un objeto de la presente invención proporcionar métodos que permitan la detección e identificación de especies de Micobacterium en una muestra biológica, directamente acoplado a la monitorización del espectro de resistencia antibiótica.

Es más particularmente un objeto de la presente invención proporcionar un método para detectar la presencia de Micobacterium tuberculosis en una muestra biológica directamente acoplado a la detección de la resistencia a rifampicina (y/o rifabutina).

Más particularmente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para detectar la presencia de Micobacterium leprae en una muestra biológica directamente acoplado a la detección de la resistencia a rifampicina (y/o rifabutina).

Más particularmente, es un objeto de la presente invención seleccionar un conjunto particular de sondas, capaz de discriminar secuencias de tipo silvestre de secuencias mutadas que confieren resistencia a rifampicina (y/o rifabutina), usándose este conjunto particular de sondas en las mismas condiciones de hibridación y de lavado.

Además, es un objeto de la presente invención combinar un conjunto de sondas seleccionadas capaces de discriminar secuencias de tipo silvestre de secuencias mutadas que confieren resistencia a rifampicina (y/o rifabutina) con otro conjunto de sondas seleccionadas capaces de identificar la especie de micobacteria presente en la muestra biológica, con lo que todas las sondas se pueden usar en las mismas condiciones de hibridación y de lavado.

Otro objeto de la invención es proporcionar kits para la detección de resistencia a antibióticos en micobacterias, posiblemente acoplados a la identificación de la especia micobacteriana implicada.

Todos los objetos de la presente invención se han cumplido mediante las siguientes realizaciones específicas.

La selección de las sondas preferidas de la presente invención se basa en el principio de Ensayo de Sonda Lineal (LiPA) que es un ensayo de hibridación inversa usando sondas oligonucleotídicas inmovilizadas como líneas paralelas sobre una tira de soporte sólido (Stuyver et al. 1993; solicitud internacional WO 94/12670). Este enfoque es particularmente ventajoso puesto que es rápido y simple de llevar a cabo. El formato de hibridación inversa, y más particularmente el enfoque de LiPA, tiene muchas ventajas prácticas comparado con otras técnicas de ADN o formatos de hibridación, especialmente cuando es preferible o inevitable el uso de una combinación de sondas para obtener la información pertinente buscada.

Sin embargo, se entenderá que cualquier otro tipo de ensayo de hibridación o formato que use cualquiera de los conjuntos de sondas seleccionadas como se describe posteriormente en la invención, está también cubierto por la presente invención.

El enfoque de hibridación inversa implica que las sondas se inmovilizan a un soporte sólido, y que el ADN diana se marca a fin de permitir la detección de los híbridos formados.

Las siguientes definiciones sirven para ilustrar los términos y expresiones usados en la presente invención.

El material diana en estas muestras puede ser ADN o ARN, por ejemplo ADN genómico o ARN mensajero, o versiones amplificadas de los mismos. Estas moléculas también se denominan poli(ácidos nucleicos).

El término "sonda" se refiere a oligonucleótidos específicos de secuencias de una sola hebra, que tienen una secuencia que es complementaria a las secuencias diana a detectar.

El término complementario, como se usa aquí, significa que la secuencia de la sonda de una sola hebra es exactamente complementaria a la secuencia de la diana de una sola hebra, definiéndose la diana como la secuencia en la que está localizada la mutación a detectar. Puesto que la aplicación actual requiere la detección de desemparejamiento de un único par de base, se requieren condiciones muy restrictivas para la hibridación, permitiendo en principio solo la hibridación de secuencias exactamente complementarias. Sin embargo, son posibles variaciones en la longitud de las sondas (véase más abajo), y se debería señalar que, puesto que la parte central de la sonda es esencial para sus características de hibridación, pueden ser permisibles posibles derivaciones de la secuencia de la sonda frente a la secuencia diana, hacia la cabeza y la cola de la sonda, cuando se usan secuencias de sondas más largas. Estas variaciones, que se pueden transferir a partir del conocimiento normal en la técnica, sin embargo se deben evaluar siempre de forma experimental, a fin de comprobar si da como resultado características de hibridación equivalentes a las de las sondas exactamente complementarias.

Preferiblemente, las sondas tienen una longitud de 5 a 50 nucleótidos, más preferiblemente de alrededor de 10 a 25 nucleótidos. Los nucleótidos, como se usan en la presente invención, pueden ser ribonucleótidos, desoxiribonucleótidos, y nucleótidos modificados, tales como inosina o nucleótidos que contienen grupos modificados que no alteran esencialmente sus características de hibridación. Las secuencias de las sondas se representan en la memoria descriptiva como oligonucleótidos de ADN de una sola hebra desde el extremo 5' hasta el 3'. Es obvio para el experto en la técnica que se puede usar como tales cualquiera de las sondas especificadas más abajo, o en su forma complementaria, o en su forma de ARN (en la que T se sustituye por U).

Las sondas usadas en la invención se pueden preparar mediante clonado de plásmidos recombinantes que contienen injertos que incluyen las secuencias nucleotídicas correspondientes, si es necesario excluyendo a estos últimos de los plásmidos clonados usando las nucleasas adecuadas y recuperándolos, por ejemplo, mediante fraccionamiento según el peso molecular. Las sondas también se pueden sintetizar químicamente, por ejemplo mediante el método convencional del fosfotriéster.

La expresión "soporte sólido" se puede referir a cualquier sustrato al que se puede acoplar una sonda oligonucleotídica, con la condición de que retenga sus características de hibridación, y con la condición de que el nivel de fondo de hibridación permanezca bajo. Habitualmente, el sustrato sólido será una placa de microtitulación, una membrana (por ejemplo, nylon o nitrocelulosa) o una microesfera (perla). Antes de la aplicación a la membrana, o la fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico a fin de facilitar la fijación o mejorar la eficacia de la hibridación. Tales modificaciones pueden englobar la formación de homopolímeros en la cola, de acoplamiento con grupos reactivos diferentes, tales como grupos alifáticos, grupos NH_{2}, grupos SH, grupos carboxílicos, o el acoplamiento con biotina, haptenos o proteínas.

El término "marcado" se refiere al uso de ácidos nucleicos marcados hipotéticamente. El marcado hipotético se puede llevar a cabo mediante el uso de nucleótidos marcados hipotéticamente incorporados durante la etapa de polimerasa de la amplificación, tal como se ilustra por Saiki et al (1988) o Bej et al. (1990), o cebadores marcados hipotéticamente, o mediante cualquier otro método conocido por la persona experta en la técnica. La naturaleza del marcador puede ser isotópica (^{32}P, ^{35}S, etc) o no isotópica (biotina, digoxigenina, etc.).

El término "cebador" se refiere a una secuencia oligonucleotídica de una sola hebra capaz de actuar como un punto de iniciación para la síntesis de un producto de extensión con cebador, que es complementario a la hebra de ácido nucleico a copiar. La longitud y la secuencia del cebador debe ser tal que deben permitir cebar la síntesis de los productos de extensión. Preferiblemente, el cebador tiene una longitud de alrededor de 5-50 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerá de la complejidad de las dianas de ADN o ARN requeridas, así como de las condiciones de uso del cebador, tales como temperatura y fuerza iónica.

El hecho de que los cebadores de amplificación no tengan que emparejarse exactamente con la secuencia molde correspondiente para garantizar la amplificación apropiada se documenta extensamente en la bibliografía (Kwok et al., 1990).

El método de amplificación usado puede ser una reacción en cadena de polimerasa (PCR; Saiki et al., 1988), reacción en cadena de ligasa (LCR; Landgren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), amplificación a base de secuencias de ácido nucleico (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), un sistema de amplificación a base de transcripción (TAS; Kwoh et al., 1989), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA; Duck. 1990; Walter et al., 1992) o amplificación por medio de replicasa Q\beta (Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989) o cualquier otro método adecuado para amplificar moléculas de ácidos nucleicos conocido en la técnica.

Los oligonucleótidos usados como cebadores o sondas también pueden comprender análogos nucleotídicos tales como fosforotiatos (Matsukura et al., 1987), alquifosforotiatos (Millar et al., 1979) o ácidos nucleicos peptídicos (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993), o pueden contener agentes intercalantes (Asseline et al., 1984).

Al igual que con la mayoría de las otras variaciones o modificaciones introducidas en la secuencias de ADN originales, estas variaciones necesitarán adaptaciones con respecto a las condiciones en las que se deba usar el oligonucleótido para obtener la especificidad y sensibilidad requeridas. Sin embargo, los resultados eventuales de la hibridación serán esencialmente los mismos que los obtenidos con los oligonucleótidos no modificados.

La introducción de estas modificaciones puede ser ventajosa a fin de incluir positivamente las características tales como la cinética de hibridación, la reversibilidad de la formación del híbrido, la estabilidad biológica de las moléculas oligonucleotídicas, etc.

La "muestra" puede ser cualquier material biológico tomado directamente del ser humano infectado (o animal), o después del cultivo (enriquecimiento). El material biológico puede ser, por ejemplo, expectoraciones de cualquier tipo, broncolavados, sangre, tejido de la piel, biopsias, material del cultivo sanguíneo linfocítico, colonias, cultivos líquidos, suelo, muestras fecales, orina, etc.

Las sondas usadas en la invención se diseñan para obtener el comportamiento óptimo en las mismas condiciones de hibridación de forma que se puedan usar en conjuntos para la hibridación simultánea; esto aumenta enormemente la utilidad de estas sondas, y da como resultado una ganancia significativa de tiempo y de trabajo. Evidentemente, cuando se prefieran otras condiciones de hibridación, todas las sondas se deben adaptar en consecuencia añadiendo o eliminando un número de nucleótidos en sus extremos. Se entenderá que estas adaptaciones concomitantes deben dar lugar a esencialmente el mismo resultado, a saber, que las sondas respectivas aún se hibridarán específicamente con la diana definida. Tales adaptaciones también pueden ser necesarias si el material amplificado debe ser de naturaleza de ARN y no ADN, como en el caso del sistema NASBA.

Para diseñar sondas con las características deseadas, se pueden aplicar las siguientes directrices útiles conocidas por la persona experta en la técnica.

Debido a que la extensión y especificidad de las reacciones de hibridación, tales como las descritas aquí, se ven afectadas por un gran número de factores, la manipulación de uno o más de esos factores determinará la sensibilidad y especificidad exacta de una sonda particular, tanto si es perfectamente complementaria a su diana como si no. La importancia y el efecto de diversas condiciones de ensayo, explicadas aquí posteriormente, son conocidas por los expertos en la técnica.

Primeramente, se debe escoger la estabilidad del híbrido de ácido nucleico de [sonda:diana] para que sea compatible con las condiciones del ensayo. Esto se puede lograr evitando secuencias largas ricas en AT, terminando los híbridos con pares de base G:C, y diseñando la sonda con una Tm apropiada. Los puntos de comienzo y final de la sonda se deben escoger de forma que la longitud y % de GC den como resultando una Tm de alrededor de 2-10ºC mayor que la temperatura a la que se llevará a cabo el ensayo final. La composición de la base de la sonda es importante debido a que los pares de base G-C muestran una mayor estabilidad térmica comparada con los pares de base A-T, debido al enlace de hidrógeno adicional. De este modo, la hibridación implica ácidos nucleicos complementarios de contenido más elevado de G-C será estable a mayores temperaturas.

Las condiciones tales como la fuerza iónica y la temperatura de incubación en las que se usará una sonda también se deben tener en cuenta cuando se diseña una sonda. Se sabe que la hibridación aumentará a medida que aumenta la fuera iónica de la mezcla de reacción, y que la estabilidad térmica de los híbridos aumentará con el aumento de la fuerza iónica. Por otro lado, los reactivos químicos, tales como formamida, urea, DMSO y alcoholes, que destruyen los enlaces de hidrógeno, aumentarán la restricción de la hibridación. La desestabilización de los enlaces de hidrógeno mediante tales reactivos puede reducir enormemente la Tm. En general, la hibridación óptima para sondas oligonucleotídicas sintéticas de alrededor de 10-50 bases de longitud ocurre aproximadamente 5ºC por debajo de la temperatura de fusión de un dúplex dado. La incubación a temperaturas por debajo de la óptima puede permitir que se hibriden secuencias de bases desemparejadas y, por lo tanto, puede dar lugar a una especificidad reducida.

Es deseable tener sondas que se hibriden sólo en condiciones de elevada restricción. En condiciones de elevada restricción sólo se formarán híbridos de ácidos nucleicos muy complementarios; los híbridos sin un grado suficiente de complementariedad no se formarán. En consecuencia, la restricción de las condiciones de ensayo determina la cantidad de complementariedad necesaria entre dos hebras de ácidos nucleicos que forman un híbrido. El grado de restricción se escoge de forma que maximice la diferencia en estabilidad entre el híbrido formado con la diana y el ácido nucleico no diana. En el presente caso, se necesita detectar cambios de pares de base únicos, lo que requiere condiciones de restricción muy elevada.

En segundo lugar, las sondas se deben colocar para minimizar la estabilidad del híbrido de ácido nucleico [sonda:no diana]. Esto se puede lograr minimizando la longitud de complementariedad perfecta por organismos no diana, evitando regiones de homología ricas en GC por secuencias no diana, y colocando la sonda para cubrir tantos desemparejamientos desestabilizantes como sea posible. El hecho de que una secuencia de sonda sea útil para detectar sólo un tipo específico de organismo depende enormemente de la diferencia de estabilidad térmica entre los híbridos [sonda:diana] y los híbridos [sonda:no diana]. Al diseñar las sondas, las diferencias en estos valores de Tm deben ser tan grandes como sea posible (por ejemplo, al menos 2ºC, y preferiblemente 5ºC).

La longitud de la secuencia de ácido nucleico diana y, en consecuencia, la longitud de la secuencia de la sonda también puede ser importante. En algunos casos, puede haber varias secuencias de una región particular, que varían en localización y longitud, que producirán sondas con las características deseadas de hibridación. En otros casos, una secuencia puede ser significativamente mejor que otra que difieren simplemente en una única base. Aunque es posible que los ácidos nucleicos que no son perfectamente complementarios se hibriden, el intervalo más largo de secuencia de bases perfectamente complementarias normalmente determinará principalmente la estabilidad del híbrido. Aunque se pueden usar sondas de poligonucleótidos de diferentes longitudes y composición de base, las sondas oligonucleotídicas preferidas para uso en esta invención están entre alrededor de 5 y 50 (más particularmente 10-25) bases de longitud y tienen un tramo suficiente en la secuencia que es perfectamente complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana.

En tercer lugar, las regiones en el ADN o ARN diana que se sabe forman estructuras internas fuertes inhibidoras de la hibridación son menos preferidas. Igualmente, se deben evitar con una autocomplementariedad intensa. Como se ha explicado anteriormente, la hibridación es la asociación de dos hebras sencillas de ácidos nucleicos complementarios para formar una doble hebra enlazada por hidrógeno. Es implícito que si una de las dos hebras está total o parcialmente implicada en un híbrido, será menos capaz de participar en la formación de un nuevo híbrido. Si hay suficiente autocomplementariedad, pueden formarse híbridos intramoleculares e intermoleculares en las moléculas de un tipo de sonda. Tales estructuras se pueden evitar mediante el diseño cuidadoso de las sondas. Diseñando una sonda de forma que una parte sustancial de la secuencia de interés sea de una sola hebra, se puede aumentar enormemente la velocidad y extensión de la hibridación. Hay disponibles programas de ordenador para buscar este tipo de interacción. Sin embargo, en ciertos casos, puede no ser posible evitar este tipo de interacción.

La presente invención proporciona un método para la detección de resistencia a rifampicina (y/o rifabutina) de M. tuberculosis presente en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

(i)

si es necesario, liberar y aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra;

(ii)

si es necesario, amplificar la parte pertinente del gen rpoB presente en dichos ácidos polinucleicos con al menos un par adecuado de cebadores;

(iii)

hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con un conjunto seleccionado de sondas de tipo silvestre de rpoB en condiciones apropiadas de hibridación y de lavado, solapando dicho conjunto la región de mutación completa del gen rpoB delimitado en la figura 1, y comprendiendo al menos una de las siguientes sondas (véase Tabla 2):

	S1	(SEQ ID NO 1)
	S11	(SEQ ID NO 2)
	S2	(SEQ ID NO 3)

	S3	(SEQ ID NO 4)
	S33	(SEQ ID NO 5)
	S4	(SEQ ID NO 6)
	S44	(SEQ ID NO 7)
	S444	(SEQ ID NO 43)
	S4444	(SEQ ID NO 8)
	S5	(SEQ ID NO 9)
	S55	(SEQ ID NO 10)
	S555	(SEQ ID NO 39)
	S5555	(SEQ ID NO 40)
	S55C	(SEQ ID NO 44)
	S55M	(SEQ ID NO 45)
	S6	(SEQ ID NO 11)
	S66	(SEQ ID NO 12)

(iv)

detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v)

determinar la susceptibilidad a la rifampicina (sensibilidad frente a resistencia) de M. tuberculosis presente en la muestra a partir de la señal o señales de hibridación diferencia obtenidas en la etapa (iv).

El término "susceptibilidad" se refiere a la característica fenotípica de la cepa de M. tuberculosis que es resistente o sensible al fármaco, según se determina en métodos de cultivo in vitro, más específicamente a rifampicina (y/o rifabutina). La resistencia a rifampicina se revela por la ausencia de hibridación con al menos una de las sondas S.

Las condiciones estándares de hibridación y de lavado son, por ejemplo, 3X SSC (citrato salino de sodio), FA (formamida) desionizada al 20%, a 50ºC. También se pueden usar otras disoluciones (SSPE (disolución salina de fosfato de sodio con EDTA), TMACI (cloruro de tetrametilamonio), etc.), y otras temperaturas, con la condición de que se mantenga la especificidad y sensibilidad de las sondas. Si es necesario, se han de llevar a cabo ligeras modificaciones de las sondas en longitud o en secuencia para mantener la especificidad y sensibilidad requeridas en las circunstancias dadas. El uso de las sondas anteriormente mencionadas, cambiando las condiciones a 1,4X SSC, 0,07% de SDS, a 62ºC, conduce a los mismos resultados de hibridación que los obtenidos en condiciones estándares, sin la necesidad de adaptar la secuencia o la longitud de las sondas.

Los pares adecuados de cebadores se pueden elegir a partir de una lista de pares de cebadores como se describe a continuación.

En una realización más preferente, los ácidos polinucleicos anteriormente mencionados de la etapa (i) o (ii) se hibridan con al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o diecisiete de las sondas S anteriormente mencionadas, preferiblemente con 5 ó 6 sondas S, que, tomadas juntas, cubren la "región de mutación" del gen rpoB.

La expresión "región de mutación" significa la región en la secuencia del gen rpoB en la que están localizadas la mayoría, si no todas, de las mutaciones responsables de la resistencia a rifampicina. Esta región de mutación se representa en la fig. 1.

En una realización más preferente, los ácidos polinucleicos anteriormente mencionados de la etapa (i) o (ii) se hibridan con un conjunto seleccionado de sondas de tipo silvestre de rpoB, comprendiendo dicho conjunto al menos una y, preferentemente, todas las sondas siguientes (véase Tabla 2):

\newpage

	S11	(SEQ ID NO 2)
	S2	(SEQ ID NO 3)
	S33	(SEQ ID NO 5)
	S4444	(SEQ ID NO 8)
	S55 o S5555	(SEQ ID NO 10 o 40)

En otra realización particular, el conjunto de sondas S como se describe anteriormente, o al menos una de ellas, se pueden combinar con una o más sondas SIL, que detectan mutaciones silenciosas en el gen rpoB. Una sonda SIL preferente es SIL-1 (SEQ ID NO 13, véase Tabla 2).

En otra realización de la invención, el conjunto de sondas S y posiblemente sondas SIL, se puede combinar con al menos una sonda R que detecta una mutación específica asociada con la resistencia a rifampicina.

Las sondas R se seleccionan del siguiente grupo de sondas (véase Tabla 2):

	R1	(SEQ ID NO 46)
	R2	(SEQ ID NO 14)
	R2B	(SEQ ID NO 47)
	R2C	(SEQ ID NO 48)
	R3	(SEQ ID NO 49)
	R4A	(SEQ ID NO 15)
	R44A	(SEQ ID NO 16)
	R444A	(SEQ ID NO 17)
	R4B	(SEQ ID NO 18)
	R44B	(SEQ ID NO 19)
	R444B	(SEQ ID NO 20)
	R4C	(SEQ ID NO 50)
	R4D	(SEQ ID NO 51)
	R4E	(SEQ ID NO 52)
	R5	(SEQ ID NO 21)
	R55	(SEQ ID NO 22)
	R5B	(SEQ ID NO 53)
	R5C	(SEQ ID NO 54)

Preferiblemente, el conjunto de sondas S y posiblemente sondas SIL se puede combinar con al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más sondas R.

Lo más preferible, el conjunto de sondas S y posiblemente sondas SIL se combina con al menos una sonda R del siguiente grupo restringido de sondas:

	R2	(SEQ ID NO 14)
	R444A	(SEQ ID NO 17)
	R444B	(SEQ ID NO 20)
	R55	(SEQ ID NO 22)

En el caso en el que se combinen sondas S y R, la resistencia a rifampicina se revela por la ausencia de hibridación con una de las sondas S y posiblemente mediante una señal de hibridación positiva con la sonda R correspondiente.

Puesto que algunas mutaciones puede que aparezcan con más frecuencia que otras, por ejemplo, en ciertas áreas geográficas (véase, por ejemplo, la Tabla 5), o en circunstancias específicas (pro ejemplo más bien en comunidades cerradas), puede ser apropiado detectar solamente mutaciones específicas, usando un conjunto seleccionado de sondas S y/o R. Esto daría como resultado un ensayo más simple, que cubriría las necesidades en ciertas circunstancias. Según Telenti et al. (1993a y b), la mayoría de las mutaciones descritas en su publicación son relativamente raras (3% o menos): las mutaciones predominantes son S531L (51,6%), H526Y (12,5%), D516V (9,4%) y H526D (7,8%).

En otra realización de la invención, las S, SIL o R anteriormente mencionadas se pueden combinar con al menos una sonda específica de la especie para M. tuberculosis, permitiendo la identificación simultanea de Micobacterium tuberculosis y la detección de la resistencia a rifampicina, escogiéndose dicha sonda específica de la especie del siguiente grupo de sondas (véase Tabla 2):

	MT-POL-1	(SEQ ID NO 23)
	MT-POL-2	(SEQ ID NO 24)
	MT-POL-3	(SEQ ID NO 25)
	MT-POL-4	(SEQ ID NO 26)
	MT-POL-5	(SEQ ID NO 27)

Lo más preferible, la sonda de M. tuberculosis específica de la especie es:

MT-POL-1

(SEQ ID NO 23)

En aún otra realización de la invención, las sondas S, SIL, R o MT-POL anteriormente mencionadas se pueden combinar con al menos una sonda específica de la especie para M. paratuberculosis, M. avium, M. scrophlaceum, M. kansaii, M. intracellulare (y cepas de MAC) o M. leprae, siendo dichas sondas respectivamente MP-POL-1 (SEQ ID NO 28), MA-POL-1 (SEQ ID NO 29), MS-POL-1 (SEQ ID NO 38), MK-POL-1 (SEQ ID NO 55), MI-POL-1 (SEQ ID NO 68) y ML-POL-1 (SEQ ID NO 57) (véase tabla 2B) o cualquier sonda, específica de la especie, derivada de la secuencia de la parte pertinente del gen rpoB de M. paratuberculosis (SEQ ID NO 35), M. avium (SEQ ID NO 36), M. scrophulaceum (SEQ ID NO 37), M. kansasii (SEQ ID NO 56) o cepas de MAC (SEQ ID NO 69), como se representa respectivamente en las figuras 5, 6, 7, 8 y 11. Se debe observar que las secuencias representadas en las figs. 5-8 y 11 son nuevas. La secuencia del fragmento del gen rpoB de M. intracellulare y M. leprae se ha descrito por otros (Guerrero et al. 1994: Honore y Cole, 1993).

La expresión "cepas de MAC" significa cepas de "complejo de M. avium" conocidas por la persona experta en la técnica de la taxonomía micobacteriana. Este grupo más bien heterogéneo de cepas de MAC puede comprender, sin embargo, cepas que son genotípicamente más bien similares a M. intracellulare. Este también es el caso de ITG 926 aislada, de la que la secuencia rpoB se muestra en la fig. 11. La sonda MI-POL-1, derivada de la SEQ ID NO 69 y de la secuencia de rpoB M. intracellulare publicada, es por lo tanto específica para M. intracellulare y algunas cepas de MAC juntas.

Se debe subrayar que todas las sondas anteriormente mencionadas, incluyendo las sondas específicas de especies, están contenidas en la secuencia del gen rpoB, y más particularmente en la secuencia del fragmento amplificado del gen rpoB. Además, como se ilustra adicionalmente en los ejemplos, las sondas descritas anteriormente como "preferentes" se diseñan de tal forma que se pueden usar simultáneamente, en las mismas condiciones de hibridación y de lavado. Estos dos criterios implican que una única etapa de amplificación y de hibridación es suficiente para la detección simultánea de la resistencia a rifampicina y la identificación de la especies micobacterianas involucradas.

En una realización preferente, y a título de ejemplo, se describe un método para detectar M. tuberculosis y su resistencia a rifampicina, que comprende las etapas de:

(i)

si es necesario, liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra;

(ii)

si es necesario, amplificar la parte pertinente del gen rpoB con al menos un par adecuado de cebadores;

(iii)

hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con el siguiente conjunto de sondas en las condiciones apropiadas de hibridación y de lavado

MT-POL-1

S11

S2

S33

S4444

S55 o S5555

R2

R444A

R444B

R55

(iv)

detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v)

determinar la presencia de M. tuberculosis y su susceptibilidad a rifampicina a partir de la señal o señales de hibridación diferencial obtenidas en la etapa (iv).

A fin de detectar los organismos micobacterianos y su patrón de resistencia con el conjunto seleccionado de sondas oligonucleotídicas, se puede usar cualquier método de hibridación conocido en la técnica (transferencia de punto convencional, transferencia Southern, sándwich, etc.).

Sin embargo, a fin de obtener resultados rápidos y fáciles si está implicada una multitud de sondas, lo más conveniente puede ser un formato de hibridación inverso.

En una realización preferida, el conjunto seleccionado de sondas se inmoviliza a un soporte sólido. En otra realización preferida, el conjunto seleccionado de sondas se inmoviliza a una banda de membrana de una manera en línea. Dichas sondas se pueden inmovilizar individualmente o como mezclas en localizaciones delineadas en el soporte sólido.

Una de realización específica muy aceptable para el usuario del método preferente anteriormente mencionado es el método de LiPA, en el que se inmoviliza el conjunto anteriormente mencionado de sondas en líneas paralelas en una membrana, como se describe posteriormente en los ejemplos.

Las sondas R anteriormente mencionadas detectan mutaciones que ya se han descrito en la técnica anterior (Telenti et al., 1993a y 1993b). Sin embargo, como si ilustra posteriormente en los ejemplos, mediante la actual invención se describen cuatro nuevas mutaciones asociadas con resistencia a la rifampicina en M. tuberculosis, aún no descritas por otros. Usando las sondas S de la actual invención, se pueden detectar nuevas mutaciones así como mutaciones ya descritas en la técnica anterior. El concepto único del uso de un conjunto de sondas S que cubren la región completa de mutación en el gen rpoB permite detectar la mayoría, si no todas, de las mutaciones en el gen rpoB responsable de resistencia a rifampicina, incluso aquellas mutaciones que aún no se han descrito hasta ahora.

Las cuatro nuevas mutaciones de rpoB (D516G, H526C, H526T y R529Q) se señalan en la Tabla 1 con un asterisco. A título de ejemplo, la secuencia del alelo H526C mutante de rpoB se representa en la Fig. 2 (SEQ ID NO 34).

La invención también proporciona cualquier sonda o conjunto de cebadores diseñados para detectar específicamente o amplificar específicamente estas nuevas mutaciones del gen rpoB, y cualquier método o kits que usen dichos conjuntos de cebadores o sondas.

En otra realización, la invención también proporciona un método para la detección de resistencia a rifampicina (y/o rifabutina) de M. leprae presente en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

(i)

si es necesario, liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra;

(ii)

si es necesario, amplificar la parte pertinente del gen rpoB con al menos un par adecuado de cebadores;

(iii)

hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con un conjunto seleccionado de sondas de tipo silvestre de rpoB en condiciones apropiadas de hibridación y de lavado, solapando dicho conjunto la región completa de mutación del gen rpoB que corresponde a la región de mutación descrita en la Figura 1, que comprende al menos una de las siguientes sondas (véase Tabla 2):

	ML-S1	(SEQ ID NO 58)
	ML-S2	(SEQ ID NO 59)
	ML-S3	(SEQ ID NO 60)
	ML-S4	(SEQ ID NO 61)
	ML-S5	(SEQ ID NO 62)
	ML-S6	(SEQ ID NO 63)

(iv)

detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v)

determinar la susceptibilidad a rifampicina (sensibilidad frente a resistencia) de M. leprae presente en la muestra a partir de la señal o señales de hibridación diferencial obtenidas en la etapa (iv).

La resistencia a rifampicina se revela por la ausencia de hibridación con al menos una de las sondas S de ML.

En otra realización de la invención, la sondas S de ML anteriormente mencionadas se pueden combinar con una sonda específica de la especie para M. leprae, ML-POL-1, lo que permite la identificación simultánea de M. leprae y la detección de la resistencia a rifampicina, estando representada dicha sonda específica de la especie en SEQ ID NO 57.

Se debe señalar que las sondas S de ML anteriormente mencionadas y las sondas ML-POL-1 están todas contenidas en el mismo fragmento amplificado del gen rpoB de M. leprae, y se diseñan de tal forma que todas se pueden usar en las mismas condiciones de hibridación y de lavado.

A partir del siguiente grupo de conjuntos (véase Tabla 2) se puede escoger un conjunto de cebador, que permite la amplificación de la región de mutación del gen rpoB de M. tuberculosis:

	P1 y P5	(SEQ ID NO 30 y 33)
	P3 y P4	(SEQ ID NO 31 y 32)
	P7 y P8	(SEQ ID NO 41 y 42)

P2 y P6, en combinación con (P1 y P5) o (P3 y P4) o (P7 y P8). Lo más preferible, el conjunto de cebadores es el siguiente:

P3 y P4

(SEQ ID NO 31 y 32)

Un conjunto de cebadores que permite la amplificación de la región de mutación del gen rpoB en micobacterias en general, es decir, en al menos M. tuberculosis, M. avium, M. paratuberculosis, M. intracellulare, M. leprae, M. scrophulaceum, se puede usar, por ejemplo, en muestras en las que se sospecha la presencia de micobacterias distintas de M. tuberculosis, y en las que es deseable tener un método de detección más general. El conjunto de cebadores está compuesto de un cebador 5', seleccionado del siguiente conjunto:

	MGRPO-1	(SEQ ID NO 64)
	MGRPO-2	(SEQ ID NO 65)

y un cebador 3', seleccionado del siguiente conjunto:

\newpage

	MGRPO-3	(SEQ ID NO 66)
	MGRPO-4	(SEQ ID NO 67)

La secuencia de estos cebadores se muestra en la Tabla 2B.

Los cebadores se pueden marcar con un marcador de elección (por ejemplo biotina). Se pueden usar sistemas de amplificación de diana a base de cebadores diferentes, y preferiblemente la amplificación mediante PCR, como se expone en los ejemplos. Se puede usar PCR de una sola vuelta o PCR anidada.

La invención también proporciona un kit para determinar el espectro de resistencia a rifampicina de micobacterias presentes en una muestra biológica, posiblemente acoplado a la identificación de la especie micobacteriana implicada, que comprende los siguientes componentes:

(i)

cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra;

(ii)

cuando sea apropiado, al menos uno de los conjuntos de cebadores anteriormente definidos;

(iii)

al menos uno de los conjuntos de sondas de la invención, posiblemente fijas a un soporte sólido;

(iv)

un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;

(v)

una disolución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha disolución;

(vi)

cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.

La expresión "tampón de hibridación" significa un tampón que permite que ocurra una reacción de hibridación entre las sondas y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o los productos amplificados, en las condiciones restrictivas apropiadas.

La expresión "disolución de lavado"\cdot significa una disolución que permite el lavado de los híbridos formados en las condiciones restrictivas apropiadas.

Leyendas de las tablas

La Tabla 1 resume los cambios de nucleótidos y aminoácidos (descritos por Telenti et al. (1993a y b), Kapur et al. 1994, y la presente invención) en el fragmento del gen rpoB de aislados de M. tuberculosis resistentes a rifampicina. La numeración de los codones es igual al de la Fig. 1. Las nuevas mutaciones descritas por la actual invención se indican con un asterisco (*).

La Tabla 2 enumera las secuencias de los cebadores y sondas seleccionados para el gen rpoB.

2A: M. tuberculosis

2B: otra especie micobacteriana

La Tabla 3 muestra los resultados de hibridación obtenidos con la sonda MT-POL-1, con ADN de diferente especie micobacteriana y no micobacteriana.

La Tabla 4 muestra algunos resultados representativos obtenidos con LiPA para algunos aislados de M. tuberculosis que son secuencidados, y la interpretación de los diferentes patrones de LiPA.

La Tabla 5 muestra la aparición de las diferentes mutaciones rpoB en M. tuberculosis en diferentes áreas geográficas. Abreviaturas: Bel= Bélgica. Bengla= Bangladesh. Bur-Fa= Burkina Faso, Buru= Burundi, Can= Canadá, Chi= Chile, Col= Colombia, Egy= Egipto, Gui= Guinea, Hon= Honduras, Pak= Pakistán, Rwa= Ruanda, Tun= Túnez.

La Tabla 6 muestra una comparación de los resultados de LiPA frente a la determinación de la resistencia a rifampicina en cultivos para M. tuberculosis, S= sensible, R= resistente.

Leyendas de las figuras

La Fig. 1 representa la secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido de la región de mutación del gen rpoB y la subunidad \beta de ARN polimerasa, respectivamente, de una cepa de Micobacterium tuberculosis de tipo silvestre (es decir, no resistente) (ITG 9081). La numeración de los codones (aminoácidos) es la misma que en Telenti et al. (1993a). Se subrayan los nucleótidos o aminoácidos implicados en los cambios inductores de la resistencia. Se encasillan las mutaciones observadas. Las barras horizontales indican las posiciones de algunas de las sondas oligonucleotídicas (se indica una sonda por grupo).

La Fig. 2 muestra la secuencia nucleotídica parcial del alelo mutante rpoB recientemente descrito de la cepa ITG 9003 de M. tuberculosis (SEQ ID NO 34).

La Fig. 3 muestra los resultados obtenidos en tiras de LiPA con sondas S44 y S4444 aplicadas a diferentes concentraciones en la tira de la membrana. Como material diana, se usaron preparaciones de ácidos nucleicos de cepas ITG 8872 e ITG 9081 de M. tuberculosis.

La Fig. 4 da una comparación del comportamiento de las sondas S44 y S4444 en una conformación de ensayo de sonda en línea. Las sondas en la tira A y B son idénticas excepto para S44 y S4444. Las hibridaciones se realizaron usando material amplificado que se origina a partir de la cepa ITG 8872 de M. tuberculosis.

La Fig. 5 muestra la secuencia nucleotídica parcial del gen rpoB provisional de la cepa 316F de M. paratuberculosis (SEQ ID NO 35).

La Fig. 6 muestra la secuencia nucleotídica parcial del gen rpoB provisional de la cepa ITG 5887 de M. avium (SEQ ID NO 36).

La Fig. 7 muestra la secuencia nucleotídica parcial del gen rpoB provisional de la cepa ITG 4979 de M. scrofulaceum (SEQ ID NO 37).

La Fig. 8 muestra la secuencia nucleotídica parcial del gen rpoB provisional de la cepa ITG 4987 de M. kansaii (SEQ ID NO 56).

La Fig. 9 muestra algunas mutaciones de rpoB en M. tuberculosis, y sus patrones de LiPA correspondientes. La nomenclatura de las mutaciones es como se describe en la Tabla 1. La nomenclatura del patrón de LiPA es la siguiente:

wt= hibridación positiva con todas las sondas S, e hibridación negativa con todas las sondas R;

\DeltaS1-5= ausencia de hibridación con la sonda S respectiva;

R2, 4A, 4B, 5= hibridación positiva con las sondas R respectivas, y ausencia de hibridación con la sonda S correspondiente;

C= línea de control positiva; debe ser positiva cuando el ensayo se lleva a cabo de forma apropiada;

Mtb= sonda MT-POL.

Solo se menciona una sonda de cada grupo, pero representa todo el grupo; por ejemplo, S5 representa S5, S55, S555, S5555, S55C, S55M.

La Fig. 10 muestra la frecuencia de las diferentes mutaciones encontradas en la cepa de M. tuberculosis resistentes a rifampicina analizada mediante LiPA. La nomenclatura es la misma que la de la Fig. 9. "Mix" significa que había una mezcla de cepas en la muestra. "Doble" significa la presencia de dos mutaciones en la cepa.

La Fig. 11 muestra la secuencia nucleotídica parcial del gen rpoB provisional de la cepa ITG 926 de MAC (SEQ ID NO 69).

Ejemplo 1 Amplificación del fragmento del gen rpoB en M. tuberculosis

Después de la extracción del ácido nucleico a partir de aislados micobacterianos (bien cultivados o bien presentes en fluido o tejido corporal), se usaron 2 \mul de producto para amplificar la parte pertinente del gen rpoB usando una o más combinaciones entre los cebadores 5' (P1 (SEQ ID NO 30), P2, P3 (SEQ ID NO 31) y P7 (SEQ ID NO 41)) y los cebadores 3' (P4 (SEQ ID NO 32), P5 (SEQ ID NO 33), P6 y P8 (SEQ ID NO 42)).

La secuencia de estos cebadores se da en la Tabla 2. Los P1, P3, P4, P5, P7 y P8 son secuencias de cebadores nuevas, descritas por la actual invención. P2 y P6 ya se han descrito previamente (Telenti et al. 1993a).

Estos cebadores se pueden marcar con un marcador de elección (por ejemplo, biotina). Se pueden usar diferentes sistemas de amplificación de diana a base de cebadores. para la amplificación usando la PCR, las condiciones usadas son las descritas a continuación. La amplificación de una sola vuelta con cebadores P1 y P5 implicó 35 ciclos de 45 segundos/94ºC, 45 segundos/58ºC, 45 segundos/72ºC. Si era preferible una PCR anidada, en la segunda vuelta se usaron cebadores P3 y P4, y se realizaron 25 ciclos (45 segundos/94ºC, 60 segundos/68ºC) comenzando con 1 \mul del producto de la primera vuelta.

Si se usó P3 y P4 en una PCR de una única vuelta, se utilizó el siguiente protocolo de ciclo: 30 ciclos de 1 min/95ºC, 1 min/55ºC, 1 min/72ºC. Se usó el mismo protocolo de ciclo para un conjunto de cebadores P2/P6.

Las PCR se realizaron habitualmente en un volumen total de 50 \mul que contiene 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 2,2 mM de MgCl_{2}, 200 \mul de cada dNTP, 0,01% de gelatina y 1 U de Taq polimerasa.

Las concentraciones de los cebadores oscilaron entre 10 y 25 pmoles/reacción.

Puesto que el conjunto de cebadores P3/P4 produjo señales significativamente más fuertes después de la hibridación que el conjunto de cebadores P2/P6, se usó el primer conjunto de cebadores para todos los demás experimentos de hibridación. Se usó el conjunto de cebadores P2/P6 para el análisis de secuencias. La PCR anidada, que usa P2 y P6 como cebadores externos y P3 y P4 como cebadores internos (biotinilados), se usó solo para la detección directa en muestra clínicas (expectoraciones y biopsias).

La longitud del producto amplificado, según se monitoriza mediante electroforesis en gel de azarosa, es la siguiente:

Conjunto de cebadores P1/P5	379 pares de bases
Conjunto de cebadores P3/P4	257 pares de bases
Conjunto de cebadores P2/P6	411 pares de bases
Conjunto de cebadores P7/P8	339 pares de bases

Ejemplo 2 Secuenciación de fragmentos del gen rpoB a partir de cepas de M. tuberculosis

Se amplificó el ADN extraído de aislados micobacterianos que se sabe son resistentes o sensibles a rifampicina, usando el conjunto de cebadores P2/P6 (de los cuales P6 se biotiniló en el extremo 5'). La secuenciación directa del producto de PCR de una sola hebra se realizó usando perlas revestidas con estreptavidina y el kit de secuenciación Taq Dye Deoxy Terminador/Cycle en un secuenciador de ADN ABI373A (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) según se recomienda por el fabricante. Los cebadores usados para la secuenciación fueron los mismos que los usados para la amplificación (P2 o P6).

Como era de esperar, todas las cepas sensibles (= sensible en cultivos y sensible en el patrón de LiPA) secuenciada (7) produjeron una secuencia de tipo silvestre (sin mutación). En la mayoría de las cepas resistentes se pudo identificar una mutación. La mayoría de estas mutaciones se han descrito previamente (Telenti et al., 1993a, 1993b, Kapur et al. 1994). Sin embargo, en la actual invención se describen 4 nuevas mutaciones: D516G, H526C, H526T y R529Q (véase también la Tabla 1 (*)). La secuencia completa de fragmento rpoB amplificado del alelo mutante H526C (aislado ITG 9003) se muestra en la Fig. 2 (SEQ ID NO 34) a título de ejemplo.

Unas pocas cepas (3/180, véase Tabla 6) fueron resistentes a rifampicina en cultivo, pero mostraron un patrón de LiPA de tipo silvestre. Después de la secuenciación, estos aislados mostraron todos una secuencia del gen rpoB de tipo silvestre, confirmando los resultados de la hibridación. Por lo tanto, es posible que para estos aislados se aplique un mecanismo molecular diferente de la resistencia a rifampicina.

Ejemplo 3 Desarrollo de la tira de ensayo de sonda en línea (LiPA)

El principio y protocolo del ensayo de sonda en línea fue como se describió anteriormente (Stuyver et al., 1993) con unas pocas excepciones. En lugar de incorporar dUTP biotinilado, se usaron cebadores biotinilados, y la hibridación y el lavado restrictivo se realizaron a 50ºC en 3 x SSC/formamida desionizada al 20%.

Las mutaciones en el gen rpoB que conducen a la resistencia a rifampicina se localizan principalmente en un área pequeña del gen que abarca 67 nucleótidos (23 codones de aminoácidos). Al menos están implicados 17 nucleótidos, interespaciados de forma uniforme en toda esta región, en las mutaciones que conducen a al menos 28 cambios diferentes de aminoácidos. Tal complejidad de cambios de nucleótidos plantea problemas para la detección de todos estos cambios en una única etapa de hibridación. En principio, por sitio mutado se necesitaría una sonda de tipo silvestre, y por cambio de nucleótido una sonda mutante que detectara específicamente esta mutación particular. Por tanto, un ensayo de hibridación implicaría al menos alrededor de 35 sondas oligonucleotídicas específicas de secuencia que haría este ensayo complejo de fabricar y de usar y, en consecuencia, comercialmente menos atractivo.

Por lo tanto, se diseñó un enfoque particular haciendo uso de sondas (S) de tipo silvestre cuidadosamente escogidas, abarcando cada una más de un sitio polimórfico y solapando el área completa de importancia (véase Fig. 1). Al hacerlo así, el conjunto de al menos 10 sondas de tipo silvestre se pudo reducir hasta un total de cinco o seis sondas. Estas sondas se ajustaron meticulosamente de forma experimental de forma que la presencia de cada mutación que causa la resistencia en la región de mutación de rpoB dio como resultado una disminución claramente detectable en la estabilidad del híbrido entre la diana y al menos una de estas sondas en las mismas condiciones de hibridación y de lavado.

Puesto que con esta combinación de sondas se pueden detectar todas las mutaciones pertinentes descritas hasta ahora, se puede monitorizar la resistencia a rifampicina en aislados de Micobacterium tuberculosis. Este conjunto de sondas también es capaz de detectar la presencia de mutaciones no descritas, por ejemplo la mutación TGC en la posición 526 en la cepa ITG 9003.

Aunque tomada estrictamente la adición de sondas (R) mutantes al panel seleccionado de sondas de tipo silvestre es obsoleta, para fines científicos puede ser de información para detectar el punto exacto de la mutación presente. Por lo tanto, se diseñaron 4 sondas mutantes (R2, R4A, R4B, R5), se corresponden a las mutaciones que ocurren de forma más frecuente y que, tomadas juntas, son capaces de identificar positivamente más del 70% de todos los casos resistentes (véase Fig. 10). Se pueden añadir sondas mutantes adicionales (por ejemplo, R1, R2B, R2C, R3, R4C, R4D, R4E, R5B, R5C) a este conjunto de 4, a fin de identificar positivamente los casos resistentes clínicamente más importantes. La adición de estas sondas también añade la fiabilidad del ensayo, puesto que la aparición de una sonda mutante debe dar como resultado inevitablemente la desaparición de una sonda de tipo silvestre, y no se trabaja con infecciones mixtas. En algunos casos, puede ser de importancia clínica distinguir entre las diferentes mutaciones posiblemente presentes. Esta situación puede ocurrir, por ejemplo, en la posición del aminoácido 516. Si en esta posición el aminoácido normal (tipo silvestre) presente (ácido aspártico) cambia a una valina o tirosina, se induce un nivel elevado de resistencia o un nivel intermedio de resistencia a rifampicina; sin embargo, los datos sin publicar parecen indicar que se mantiene la sensibilidad a rifabutina. Por tanto, para infecciones por cepas con esta mutación, la rifabutina sería todavía eficaz, mientras que no lo sería la rifampicina. Lo mismo puede ser cierto para el codón 511 pero, según lo que se conoce, estos son los únicos sitios de mutación para los que puede ser diferente el efecto de rifampicina y rifabutina; habitualmente, las cepas resistentes a rifampicina también son resistentes a rifabutina.

A fin de desarrollar una tira de LiPA para detectar la presencia de mutaciones que generan resistencia a rifampicina (y/o rifabutina) en M. tuberculosis, se sintetizaron un total de 36 sondas oligonucleotídicas, y se evaluaron en un ensayo de hibridación inversa. La secuencia de estas sondas se muestra en la Tabla 2A (sondas de tipo silvestre y sondas de mutación). El primer conjunto de sondas ensayada fue: S1, S2, S3, S4, S5, R2, R4A, R4B y R5. En las condiciones usadas para la hibridación inversa, la mayoría de las sondas no se concertó como se esperaba teóricamente, y que se pudieron introducir modificaciones que condujeran a síntesis y evaluación de las siguientes sondas adicionales: S11, S33, S44, S4444, S5555, R44A, R444A, R44B, R444B, R55. A partir del panel total de sondas, se seleccionaron para uso posterior las sondas que muestran las características más óptimas con respecto a la especificidad y sensibilidad, en las mismas condiciones experimentales.

Las sondas preferidas con secuencias de tipo silvestre (5 sondas) que juntas solapan toda la región rpoB de interés son: S11, S2, S33, S4444 y S55 o S5555 (véase Tabla 2). La resistencia se detectará mediante una pérdida de señal de hibridación con cualquiera de estas sondas S.

Las sondas preferidas de mutación (sondas R) son: R2, R444A, R444B y R55 (véase Tabla 2). En algunos casos de resistencia, una pérdida de la señal de hibridación con las sondas S puede estar acompañada de una señal de hibridación positiva con la sonda R correspondiente.

A título de ejemplo, en la Fig. 9 se muestran algunas de las mutaciones de rpoB y su patrón LiPA correspondiente.

Aunque las sondas del mismo grupo (por ejemplo, sondas S4, S44, S444 y S4444) difieren sólo ligeramente entre sí, sus características de hibridación pueden variar considerablemente. Esto se ilustra a título de ejemplo en un experimento en el que se compara el comportamiento de las sondas S44 y S4444 usando productos de PCR que se originan a partir de dos cepas de M. tuberculosis (ITG 8872 e ITG 9081), mostrando ambas una secuencia de tipo silvestre en una región diana de las sondas S44 y S4444. A continuación se muestra la diferencia entre ambas sondas:

8

La sonda S44 se escogió en una base teórica a partir de la secuencia génica conocida (Telenti et al., 1993a). Esta sonda sería teóricamente la mejor sonda para discriminar desemparejamiento en el codón CAC (subrayado), puesto que este codón está en la parte central de la sonda. Sin embargo, en contraste con las reglas generales, el comportamiento de la sonda S4444 demostró ser significativamente mejor (como se describe en el siguiente experimento).

Ambas sondas se aplicaron a tiras de nitrocelulosa en cantidades diferentes (2,4, 1,2 y 0,6 pmoles/tira). Después de la fijación y bloqueo de las tiras, las sondas se hibridaron con fragmentos de PCR biotinilados (procedentes de las cepas ITG 8872 e ITG 9081) como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la Fig. 3.

En las condiciones de hibridación usadas (3 x SSC, formamida desionizada al 20%, 50ºC), las señales obtenidas con la sonda S44 son muy débiles. Por otro lado, la sonda S4444 genera señales muy fuertes y fiables. En consecuencia, se prefiere la sonda S4444 con respecto a S44 para uso en una tira de LiPA. Este efecto dramático no solo se puede atribuir a la diferencia de longitud de ambas sondas, sino también parece que la localización tiene importancia. Lo más probable, la estructura secundaria de la región diana de la sonda influye enormemente en las características de hibridación.

En la Fig. 4 se muestran los resultados de otro experimento, en el que se compara el comportamiento de ambas sondas en el compuesto de las otras sondas. Ambas tiras A y B se procesan de forma idéntica usando un producto amplificado que se origina a partir de la cepa ITG 8872. Ambas tiras son casi idénticas excepto que la tira A contiene la sonda S44 (0,6 pmoles), y la tira B contiene a la sonda S4444 (0,1 pmoles) y el orden de las sondas aplicadas a la tira es diferente. En la tira A, la sonda S44 es negativa, mientras que en la tira B la sonda S4444 es claramente positiva, aunque en ambos casos hay un perfecto emparejamiento entre la diana y la sonda, y en ambos casos se habría esperado un resultado positivo.

Estos resultados ilustran claramente que el diseño de la sonda, especialmente en las condiciones fijas del formato de hibridación inversa (las mismas condiciones para cada sonda), no es directo y que las sondas se han de evaluar meticulosamente antes de que se pueda usar en un formato de hibridación inversa.

En general, se puede establecer que las sondas adecuadas no siempre se pueden derivar simplemente en una base teórica a partir de una secuencia génica conocida.

Aunque no se detectan entre los aislados ensayados en la actual invención, la presencia de una mutación silenciosa puede dar lugar a un patrón resistente sobre las tiras (pérdida de una sonda de tipo silvestre) mientras que la cepa es sensible. Hasta ahora sólo se ha descrito una sustitución silenciosa (en el codón 528: CGC \rightarrow CGT; Telenti et al., 1993a). Esta mutación daría como resultado una desestabilización de híbrido con la sonda S-4444. Sin embargo, añadiendo a la tira una sonda específica para la mutación silenciosa (sonda SIL-1, Tabla 2), se puede discriminar esta mutación silenciosa de las mutaciones inductoras de la resistencia, y se podría evitar la mal interpretación del patrón observado. Además, las sondas SIL se pueden aplicar sobre la tira en la misma localización que las sondas S correspondientes (sondas mixtas). Al hacerlo así, no se observaría ninguna pérdida de señal de hibridación como resultado de la mutación silenciosa.

A fin de detectar la inserción de mutaciones que confieren resistencia a rifampicina, 514insF y 514insFM (véase Fig. 1), se diseñaron dos nuevas sondas de tipo silvestre, S6 y S66, cuyas secuencias se representan en la Tabla 2. La hibridación con ácidos nucleicos originados a partir de cepas que contienen estas mutaciones de inserción, da como resultado la ausencia de una señal de hibridación con S6 y S66 (véase también la Tabla 1).

A fin de identificar positivamente más mutaciones que las detectadas por el conjunto de R2, R4A, R4B y R5, se diseñó un número de sondas R adicionales, que se pueden añadir a la tira de LiPA, usando las mismas condiciones de hibridación y de lavado. Junto con las sondas R anteriormente descritas, las sondas R adicionales (R1, R2B, R2C, R3, R4C, R4D, R4E, R5B, R5C) permiten una identificación positiva de las mutaciones encontradas más frecuentemente en la colección de cepas ensayada en la actual solicitud.

Ejemplo 4 Sonda específica para el complejo de M. tuberculosis

Se desarrolló un ensayo de sonda en línea a fin de permitir la detección simultánea de las mutaciones que provocan la resistencia a rifampicina, directamente acoplado a la detección del patógeno M. tuberculosis in casu.

Puesto que es extremadamente ventajoso ser capaz de detectar simultáneamente la presencia de M. tuberculosis y la presencia o ausencia de un gen o mutación que provoca la resistencia al fármaco, el objetivo fue desarrollar una sonda de M. tuberculosis contenida en el mismo fragmento de PCR como al menos uno de los marcadores de resistencia importante a identificar. Por lo tanto, se secuenciaron los genes de rpoB de aislados que no eran de M. tuberculosis. Estos organismos fueron: M. paratuberculosis 316F, M. avium ITG5887, M. scrophulaceum ITG4979 y M. kansaii ITG4987. Las secuencias de los fragmentos del gen rpoB correspondientes se muestran en la Fig. 5 a 8, respectivamente. Además, la secuencia de los fragmentos del gen rpoB de M. lepra y M. intracellulare es conocida de la bibliografía (Honoré y Cole, 1993; Guerrero et al., 1994). La comparación de estas secuencias con la secuencia del gen rpoB de M. tuberculosis permitió delinear una región específica (fuera de la región responsable de la resistencia) en el fragmento del gen rpoB a partir de la cual parece factible el desarrollo de sondas potencialmente específicas para M. tuberculosis. Se evaluó adicionalmente una sonda oligonucleotídica (denominada posteriormente como MT-POL-1), derivada de esta región con la siguiente secuencia:

CGA CGT GGA GGC GAT CAC ACC

(SEQ ID NO 23)

con respecto a su sensibilidad y especificidad por la hibridación en tiras de LiPA. Las condiciones de amplificación y de hibridación fueron como se describe anteriormente. Los resultados se resumen en la Tabla 3. Además de las cuatro cepas de M. tuberculosis enumeradas en la Tabla 3, se analizaron 521 aislados químicos de M. tuberculosis adicionales: todos los aislados dieron una señal de hibridación positiva. Evidentemente, también las cepas de M. bovis se hibridan con la sonda, pero no es clínicamente importante distinguir M. tuberculosis del M. bovis para este fin. De hecho, en toda la solicitud, la expresión "M. tuberculosis" se puede sustituir por "complejo de M. tuberculosis", que ser refiere a M. tuberculosis s.s., M. bovis, M. africanum y M. microti, sin afectar a la significancia de los resultados.

Aunque, usando los conjuntos de cebadores descritos en el Ejemplo 1, se puede obtener un producto de PCR con ADN de alguna otra especie de Micobacterium, e incluso algunos microorganismos genéticamente no relacionados que también pueden estar presentes en el conducto respiratorio, ninguna de estas bacterias mostró hibridación con la sonda MT-POL-1 seleccionadas. En conclusión, se puede establecer que la sonda seleccionada es muy específica para las cepas del complejo de M. tuberculosis, y que es 100% sensible a M. tuberculosis. También pueden ser útiles otras sondas procedentes de esta región para la detección específica de cepas del complejo de M. tuberculosis, tales como: MT-POL-2, MT-POL-3, MT-POL-4 y MT-POL-5 (véase Tabla 2).

De forma similar, se pueden usar las siguientes sondas para diferenciar cepas de M. avium, M. paratuberculosis, M. scrophulaceum, M. kansaii, M. intracellulare y M. leprae entre sí y de otras micobacterias: MA-POL-1, MP-POL-1, MK-POL-1, MI-POL-1 y ML-POL-1, respectivamente (véase Tabla 2B).

Ejemplo 5 Evaluación de tiras de LiPA para M. tuberculosis

Se prepararon tiras de LiPA que tienen las siguientes sondas (además de una línea de control positiva): MT-POL-1, S11, S2, S33, S4444, S5555, R2, R444A, R444B, R55.

Estas tiras se hibridaron con productos de PCR a partir de cepas de M. tuberculosis para las que se determinó la secuencia del gen rpoB pertinente. En la Tabla 4 se resumen algunos resultados representativos.

Los resultados de hibridación se correlacionan completamente con los resultados de la secuenciación, indicando que las sondas usadas pueden discriminar a nivel de un único desemparejamiento. Cada mutación determinada se podría detectar bien por la ausencia de una de las sondas de tipo silvestre (sondas S) o bien por la ausencia de una sonda de tipo silvestre junto con la presencia de la sonda mutante correspondiente (sonda R). En el último caso, la mutación exacta presente se puede derivar de los resultados de hibridación. Sin embargo, el conocimiento de la mutación exacta presente no es necesario para determinar si se trabaja o no con una cepa resistente a rifampicina, puesto que cada mutación detectada confiere resistencia. Las cepas sensibles, es decir cepas sin mutaciones en la parte pertinente del gen rpoB, dan reacciones positivas en todas las sondas S mientras que todas las sondas R puntúan de forma negativa (= patrón wt).

Ejemplo 6 Detección directa de cepas de M. tuberculosis y de la resistencia a rifampicina en muestras clínicas

Se analizaron sesenta y ocho muestras clínicas procedentes de diferentes orígenes geográficos (13 y 35 muestras de esputo procedentes de Bélgica y de Ruanda, respectivamente, y 20 biopsias de nódulos linfáticos procedentes de Burundi), todas positivas en cultivo para M. tuberculosis y mantenidas a -20ºC. La preparación de las muestras para la amplificación se basó en el procedimiento de Boom et al. (1990) modificado por De Beenhouwer et al. (expuesto). Se llevó a cabo un enfoque de PCR anidada para la región pertinente del gen rpoB con cebadores internos biotinilados (P3 y P4). Después del ciclo térmico, el producto amplificado se incubó con la tira de LiPA. La resistencia a rifampicina se determinó en Löwenstein-Jensen usando el método de proporción de Canetti et al. (1963). Para cepas resistentes, se determinó la MIC (Concentración Inhibidora Mínima) de rifampicina en agar 7H10 (Heifets, 1988). Microscópicamente, 20 muestras (29,4%) fueron negativas, 15 (22,1%) débilmente positivas (1 + o menos según la escala de la American Thoracic Society) y 33 (48,5%) fuertemente positivas (\geq +2) con la tinción de Ziehl-Neelsen.

La LiPA detectó sensibilidad a rifampicina en 49 especímenes (sólo sondas de M. tuberculosis y de tipo silvestre positivas) y resistencia en 19 especímenes (sonda de M. tuberculosis positiva, perdiéndose una de las sondas de tipo silvestre, y eventualmente una de las sondas de mutación positivas). Los ensayos in vitro de susceptibilidad a rifampicina confirmaron estos resultados con tres excepciones. Para todas las cepas sensibles, se observó un patrón de sonda sensible indicando que no se detectaron en esa serie posibles mutaciones silenciosas. Se encontró que todas las cepas que muestran un patrón de resistencia son resistentes mediante técnicas convencionales. Para los tres especímenes (procedentes de tres pacientes resistentes a múltiples fármacos, de Ruanda) se obtuvo un patrón sensible mediante PCR-LiPA, mientras que el cultivo reveló resistencia (MIC > 2 \mug/ml en 7H10). La secuenciación de la región rpoB de estas cepas confirmó la secuencia del gen de tipo silvestre, implicando posiblemente un mecanismo diferente de resistencia a rifampicina en estos casos, o una mutación en otra parte del gen rpoB. También es interesante observar que el sistema de PCR anidada dio resultados positivos para todas las muestras ensayadas positivas en cultivo, incluyendo 20 muestras negativas a Ziehl-Neelsen. En otro experimento (datos no mostrados), que incluye 17 muestras de esputos de especies negativas procedentes de casos clínicamente sospechosos de tuberculosis negativos en cultivo, no se obtuvo ninguna señal en absoluto con el sistema LiPA, indicando que las infecciones no fueron causadas de forma muy probable por M. tuberculosis.

En un experimento subsiguiente, se analizó en LiPA una gran colección de muestras clínicas procedentes de diferentes orígenes geográficos. Los resultados se muestran en la Tabla 5. De las 137 cepas resistentes encontradas, un número bastante grande se puedo atribuir a una de las mutaciones representadas por las sondas R (R2, R4A, R4B, R5). De forma interesante, algunas mutaciones parece que fueron más frecuentes en algunos países según se compara con otros (por ejemplo, en Túnez y Egipto; R4B (=H526D), en Ruanda: R5 (S531L)). Esto puede conducir eventualmente a diferentes formatos de ensayo para diferentes países.

De un total de 213 cepas resistentes a rifampicina analizadas mediante LiPA en la actual solicitud, 151 (71%) se pudieron atribuir a las mutaciones S531L, H526D, D516V o H526Y, y de este modo fueron detectables mediante una señal positiva con, respectivamente, sondas R5, R4B, R2 y R4A (véase Fig. 10).

De un total de 180 cepas analizadas tanto mediante cultivo como mediante LiPA, se realizó una identificación correcta (sensible/resistente) en 164 (=91,1%) de las cepas (véase Tabla 6). En tres cepas resistentes, los resultados de LiPA y la secuenciación mostraron un fragmento del gen rpoB de tipo silvestre, lo que indica que el mecanismo de resistencia a rifampicina no se pudo atribuir a mutaciones en la parte investigada del gen rpoB.

Trece de las 180 cepas analizadas fueron resistentes en LiPA, pero parecieron ser sensibles en cultivo. Sin embargo, después de recultivar 2 de estas 13 cepas en medio 7H11 sintético en lugar del medio de Löwenstein-Jensen tradicional, resultaron ser resistentes a rifampicina de todos modos. Este hallazgo no publicado hasta ahora muestra que el medio de Löwenstein-Jensen convencional no se recomienda para la determinación de la susceptibilidad antibiótica de micobacterias (posiblemente debido a la presencia de trazas de antibióticos encontradas en huevos comercialmente disponibles usados para preparar el medio de Löwenstein-Jensen). Por lo tanto, es de esperar que el porcentaje de cepas discrepantes que son resistentes en LiPA pero sensibles en cultivo (en este caso 13/180 = 7,2%) sea mucho menor (y posiblemente 0%) cuando el cultivo se realiza en un medio sintético como 7H11.

De forma interesante, la mayoría de los aislados resistentes a rifampicina (>90%) examinados en la actual solicitud fueron además resistentes a isoniazidas, y de este modo resistentes a multifármacos (definición de resistencia a multifármacos = resistente a al menos isoniazida y rifampicina). De este modo, la resistencia a rifampicina se puede considerar como un marcador potencial para la resistencia a multifármacos, y el ensayo de LiPA anteriormente descrito puede ser por lo tanto una herramienta importante para el control de la tuberculosis resistente a multifárma-
cos.

En conclusión, el método descrito anteriormente permite la identificación correcta de M. tuberculosis, y la detección simultánea de resistencia a rifampicina directamente en muestras clínicas sin precultivar. Permite la detección fácil de resistencia a rifampicina directamente en una muestra clínica en menos de 24 horas.

Ejemplo 7 Detección de resistencia a rifampicina en M. leprae

El enfoque de detección anteriormente descrito también se puede aplicar a la detección de M. leprae presente en muestras biológicas acopladas con la detección de su resistencia a rifampicina. La secuencia del gen rpoB de M. leprae se describió de forma temprana por Honoré y Cole (1993). Ellos solo identificaron un número ilimitado de mutaciones responsables de la resistencia a rifampicina en M. leprae. Se puede esperar razonablemente que, similar a M. tuberculosis, un lote de otras mutaciones pueden provocar resistencia a rifampicina en M. leprae, y que la mayoría de estas mutaciones estarán localizadas en un área más bien restrictiva del gen rpoB, que corresponde a la "región de mutación" descrita anteriormente en esta solicitud.

Por lo tanto, se selecciona un conjunto de sondas de tipo silvestre que solapan la región de mutación putativa en el gen rpoB de M. leprae (véase Tabla 2B):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ ML-S1 \+ (SEQ ID NO 58)\cr \+\+\cr  \+
ML-S2 \+ (SEQ ID NO 59)\cr \+\+\cr  \+
ML-S3 \+ (SEQ ID NO 60)\cr \+\+\cr  \+
ML-S4 \+ (SEQ ID NO 61)\cr \+\+\cr  \+
ML-S5 \+ (SEQ ID NO 62)\cr \+\+\cr  \+
ML-S6 \+ (SEQ ID NO
63)\cr}

La resistencia a la rifampicina se revela por una ausencia de hibridación con al menos una de estas sondas ML-S. Este conjunto de sondas ML-S detectará mutaciones que provocan la resistencia a rifampicina en esta región, incluso aunque aún no se haya especificado la secuencia de estas mutaciones.

Las sondas ML-S anteriormente mencionadas se han diseñado cuidadosamente de tal forma que todas se puedan usar en las mismas condiciones de hibridación y de lavado. Lo mismo sirve para la sonda ML-POL-1 específica de la especie, en la que las sondas ML-S se pueden combinar para una detección simultánea de M. leprae y su resistencia a rifampicina.

Todas las sondas mencionadas en este ejemplo están contenidas en el mismo fragmento del gen rpoB de M. leprae, que se puede obtener mediante PCR usando un conjunto de cebadores escogidos de MGRPO-1 o MGRPO-2 (cebadores 5') y MGRPO-3 o MGRPO-4 (cebadores 3').

TABLA 1

10

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TABLA 2 Cebadores y sondas seleccionados del gen rpoB

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13

130

TABLA 3 Resultados de la hibridación obtenidos con la sonda MT-POL-1

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17

TABLA 6 Comparación de los resultados de LiPA frente a la determinación de resistencia a rifampicina en cultivo, para M. tuberculosis

	Cultivo
	S	R
LiPA	S	71	3
	R	13	93

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Claims (26)

1. Método para la detección de resistencia a rifampicina y/o rifabutina de la especie del complejo Micobacterium tuberculosis presente en una muestra, que comprende las etapas de:

(i)

si es necesario, liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra;

(ii)

si es necesario, amplificar la parte pertinente del gen rpoB presente en dichos ácidos polinucleicos con al menos un par adecuado de cebadores;

(iii)

hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con un conjunto de sondas de tipo silvestre, al menos una de las cuales es una sonda S de la Tabla 2, solapando dicho conjunto la región completa de mutación del gen rpoB delimitado en la figura 1, en condiciones apropiadas de hibridación y de lavado;

(iv)

detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v)

inferir la susceptibilidad a rifampicina (sensibilidad frente a resistencia) de la especie Micobacterium presente en la muestra a partir de la señal o señales de hibridación diferencial obtenidas en la etapa (iv).

2. Método según la reivindicación 1, en el que la especie Micobacterium es M. tuberculosis.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho conjunto de sondas de tipo silvestre consta de 5 ó 6 sondas de tipo silvestre.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el conjunto de sondas de tipo silvestre en la etapa (iii) se combina además con al menos una sonda específica de la especie para M. tuberculosis, M. paratuberculosis, M. avium, M. scrophulaceum, M. kansaii, M. intracellulare (y cepas de MAC) o M. leprae.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la sonda o sondas específicas de la especie para M. tuberculosis se seleccionan del grupo que consta de:

MT-POL-1 (SEQ ID NO 23), MT-POL-2 (SEQ ID NO 24), MT-POL-3 (SEQ ID NO 25), MT-POL-4 (SEQ ID NO 26), MT-POL-5 (SEQ ID NO 27).

6. Método según la reivindicación 4, en el que la sonda o sondas específicas de la especie para M. paratuberculosis se seleccionan del grupo que consta de:

MP-POL-1 (SEQ ID NO 28),

y/o cualquier sonda específica de M. paratuberculosis derivada de la secuencia de la parte pertinente del gen rpoB de M. paratuberculosis (SEQ ID NO 35).

7. Método según la reivindicación 4, en el que la sonda o sondas específicas de la especie para M. avium se seleccionan del grupo que consta de:

MA-POL-1 (SEQ ID NO 29),

y/o cualquier sonda específica de M. avium derivada de al secuencia de la parte pertinente del gen rpoB de M. avium (SEQ ID NO 36).

8. Método según la reivindicación 4, en el que la sonda o sondas específicas de la especie para M. scrophulaceum se seleccionan de grupo que consta de:

MS-POL-1 (SEQ ID NO 38),

y/o cualquier sonda específica de M. scrophulaceum derivada de la secuencia de la parte pertinente del gen rpoB de M. scrophulaceum (SEQ ID NO 37).

9. Método según la reivindicación 4, en el que la sonda o sondas específicas de la especie para M. kansaii se seleccionan de grupo que consta de:

MK-POL-1 (SEQ ID NO 55),

y/o cualquier sonda específica de M. kansaii derivada de la secuencia de la parte pertinente del gen rpoB de M. kansaii (SEQ ID NO 56).

10. Método según la reivindicación 4, en el que la sonda o sondas específicas de la especie para M. intracellulare (y cepas MAC) se seleccionan de grupo que consta de:

MI-POL-1 (SEQ ID NO 68),

y/o cualquier sonda específica de la cepa de MAC derivada de la secuencia de la parte pertinente del gen rpoB de una cepa de MAC (SEQ ID NO 69).

11. Método según la reivindicación 4, en el que la sonda o sondas específicas de la especie para M. leprae se seleccionan de grupo que consta de:

ML-POL-1 (SEQ ID NO 57).

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho conjunto de sondas de tipo silvestre en la etapa (iii) se combina además con al menos una sonda de mutación silenciosa de rpoB.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho conjunto de sondas de tipo silvestre en la etapa (iii) se combina además con al menos una de las sondas de mutación de rpoB de la Tabla 2.

14. Método según la reivindicación 1-13, en el que dicho conjunto de sondas de tipo silvestre comprende al menos una sonda (S) seleccionada del grupo que consta de:

S11 (SEQ ID NO 2), S2 (SEQ ID NO 3), S33 (SEQ ID NO 5), S4444 (SEQ ID NO 8), S55 (SEQ ID NO 10), S5555 (SEQ ID NO 40),

15. Método según la reivindicaciones 1-13, en el que dicho conjunto de sondas de tipo silvestre comprende al menos las siguientes sondas (S):

S4444 (SEQ ID NO 8),

y

S55 o S5555 (SEQ ID NO 10) o (SEQ ID NO 40).

16. Método según la reivindicaciones 1-13, en el que dicho conjunto de sondas de tipo silvestre consta de todas las siguientes sondas (S):

\newpage

S11 (SEQ ID NO 2), S2 (SEQ ID NO 3), S33 (SEQ ID NO 5), S4444 (SEQ ID NO 8),

y

S55 o S5555 (SEQ ID NO 10) o (SEQ ID NO 40).

17. Método según las reivindicaciones 12 a 16, en el que la sonda de mutación silenciosa de rpoB consta de:

SIL-1 (SEQ ID NO 13).

18. Método según las reivindicaciones 13-17, en el que la sonda o sondas R se seleccionan del grupo que consta de:

R2 (SEQ ID NO 14), R444A (SEQ ID NO 17), R444B (SEQ ID NO 20,

y

R55 (SEQ ID NO 22).

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, que usa una sonda o un conjunto de cebadores diseñados para detectar específicamente o amplificar las siguientes nuevas mutaciones del gen rpoB:

-

D516G, que representa una mutación en el codón 516 del gen rpoB, que da como resultado un cambio del aminoácido D a G,

-

H526C, que representa una mutación en el codón 526 del gen rpoB, que da como resultado un cambio del aminoácido H a C,

-

H526T, que representa una mutación en el codón 526 del gen rpoB, que da como resultado un cambio del aminoácido H a T,

-

R529Q, que representa una mutación en el codón 529 del gen rpoB, que da como resultado un cambio del aminoácido R a Q.

20. Método para la detección de resistencia a rifampicina y/o rifabutina de Micobacterium leprae presente en una muestra, que comprende las etapas de:

(i)

si es necesario, liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra;

(ii)

si es necesario, amplificar la parte pertinente del gen rpoB con al menos un par adecuado de cebadores;

(iii)

hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con un conjunto de sondas de tipo silvestre que comprenden al menos una sonda (S) seleccionada del grupo que consta de:

ML-S1 (SEQ ID NO 58), ML-S2 (SEQ ID NO 59), ML-S3 (SEQ ID NO 60),

ML-S4 (SEQ ID NO 61), ML-S5 (SEQ ID NO 62),

y

ML-S6 (SEQ ID NO 63),

solapando dicho conjunto la región completa de mutación del gen rpoB correspondiente a la región de mutación descrita en la figura 1, en condiciones apropiadas de hibridación y de lavado;

(iv)

detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v)

inferir la susceptibilidad a rifampicina (sensibilidad frente a resistencia) de la especie Micobacterium presente en la muestra a partir de la señal o señales de hibridación diferencial obtenidas en la etapa (iv).

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que las sondas se inmovilizan en un soporte sólido.

22. Conjunto de sondas de tipo silvestre para la detección de resistencia a rifampicina y/o rifabutina de la especie del complejo Micobacterium tuberculosis, caracterizado porque dicho conjunto solapa toda la región de mutación de rpoB delimitada en la figura 1, y comprende al menos una sonda S procedente de la Tabla 2.

23. Conjunto de sondas de tipo silvestre según la reivindicación 22, comprendiendo dicho conjunto 5 ó 6 sondas de tipo silvestre.

24. Una composición que comprende cualquiera de los conjuntos de sondas de tipo silvestre como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23.

25. Un kit para inferir el espectro de resistencia a rifampicina y/o rifabutina de la especie del complejo Micobacterium tuberculosis presente en una muestra biológica, posiblemente acoplado a la identificación de la especie micobacteriana implicada, que comprende los siguientes componentes:

(i)

cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra;

(ii)

cuando sea apropiado, un conjunto de cebadores para la amplificación del gen rpoB;

(iii)

al menos uno del conjunto de sondas de tipo silvestre, como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, posiblemente fijas a un soporte sólido;

(iv)

un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;

(vi)

una disolución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha disolución;

(vii)

cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.

26. Kit según la reivindicación 25, para la detección de resistencia a rifampicina y/o rifabutina de M. tuberculosis, en el que el conjunto de sondas de tipo silvestre en la etapa (iii) consta del conjunto definido en las reivindicaciones 22 a 23.