ES2217558T3 - Reconocimiento de productos genicos especificos de tumor en cancer. - Google Patents

Abstract

Método para detectar aberraciones cromosómicas en una muestra biológica por intermedio de la detección del producto génico específico de un tumor expresado exclusivamente por células tumorales utilizando al menos dos sondas diferentes dirigidas contra el producto génico que tiene por origen la aberración cromosómica, siendo cada sonda reactiva con sitios definidos en dicho producto génico. al menos una sonda es reactiva específicamente con el fragmento amino-terminal de la proteína y al menos una sonda es reactiva específicamente con el fragmento carboxi-terminal de la proteína.

Description

Reconocimiento de productos génicos específicos de tumor en cáncer.

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico del cáncer y a la aplicación de técnicas de diagnóstico en patología y hematología. Específicamente, la presente invención se refiere a las técnicas que indican la presencia de aberraciones cromosómicas mediante la detección de productos génicos específicos de tumor que se expresan exclusivamente en células tumorales que contienen dichos cromosomas.

Las anormalidades o aberraciones cromosómicas son unas de las causas principales de las enfermedades o trastornos genéticos, incluyendo los trastornos congénitos y las enfermedades adquiridas, tales como las enfermedades malignas. Las células malignas tienen un origen clónico común, ya que se supone que se originan a partir de una célula individual que crece de manera autónoma, que se ha apartado de las señales ambientales de regulación del crecimiento.

El término "cáncer" comprende un grupo heterogéneo de neoplásias, en el que cada tipo tiene sus propias características respecto a potencial de malignidad y a respuesta ante una terapia. Habitualmente, la efectividad del tratamiento del cáncer se determina empíricamente. Se selecciona el tratamiento más adecuado y más efectivo dependiendo de la progresión en el desarrollo del cáncer, del origen y la extensión del cáncer y del estado fisiológico del paciente. Actualmente, se puede escoger tratamiento quirúrgico, terapia de radiación y quimioterapia (o combinaciones de las terapias anteriores). No obstante, se ha observado que cada terapia conlleva efectos secundarios que comprometen enormemente los beneficios del tratamiento. Es evidente que un diagnóstico preciso de los diferentes tipos de cáncer es preeminente para ayudar a seleccionar la terapia más efectiva.

La base del cáncer proviene de aberraciones cromosómicas tales como translocaciones, inversiones, inserciones, deleciones y otras mutaciones dentro de los cromosomas o entre ellos. Con frecuencia, un cromosoma o dos cromosomas diferentes están involucrados en el desarrollo de un proceso maligno. De esta manera, se eliminan genes o fragmentos de genes del contexto fisiológico normal del cromosoma no aberrante y se fusionan con un cromosoma receptor o encuentran una localización en dicho cromosoma receptor, (sea éste el mismo o un segundo cromosoma) adyacente a genes o fragmentos de genes no relacionados (con frecuencia oncogenes o protooncogenes), en los que la nueva combinación genética puede ser el inicio de un proceso maligno.

Reordenaciones, tales como translocaciones, suceden con frecuencia siguiendo un patrón algo establecido, en el que se eliminan genes, o fragmentos de los mismos, del cromosoma no aberrante en un punto de corte o en una región de agrupamiento de los puntos de corte, y se insertan en el cromosoma receptor en una región de fusión, creando así genes reordenados (delecionados, translocados) o fusionados que son específicos para ese tipo de cáncer. Además, las reordenaciones o las translocaciones pueden ser recíprocas, ya que dos cromosomas intercambian partes y este hecho conduce a que las células contengan dos cromosomas reordenados recíprocamente, que ambos contienen nuevos genes de fusión.

Cuando se traduce el gen fusionado, genera un producto génico, el ARNm, que es único para el tumor. El ARNm quimérico comprende partes o fragmentos de dos ARNm que corresponden a los genes separados originalmente y fueron transcritos por dichos genes. Este ARNm específico de tumor se caracteriza de manera única por un punto de fusión, en el que se empalman los fragmentos de ARN. En algunos casos, estos puntos de fusión se pueden detectar hibridando sondas de ácidos nucleicos. No obstante, considerando la gran variación dentro de las reordenaciones individuales observadas en estas translocaciones y dependiendo de la localización del punto de corte en el gen no aberrante por medio del cual (incluso cuando las translocaciones se producen dentro de los dos mismos genes) se pueden generar diferentes genes específicos de tumor, se considera probable que en cada uno de estos tipos de cáncer surjan nuevos puntos de fusión. En consecuencia, la detección de cáncer mediante la detección específica del punto de fusión del producto génico específico de tumor (ARNm) nunca ha sido aplicable extensivamente.

Cuando el gen fusionado se fusiona siguiendo el marco de lectura, el ARNm de fusión se traduce en una proteína de fusión que es única para el tumor. La proteína comprende partes de dos proteínas que corresponden con los genes separados originalmente y fueron transcritas y traducidas por dichos genes. Las proteínas específicas de tumor se caracterizan de manera única por un punto de fusión, en el que se empalman las dos proteínas. Los puntos de fusión están expuestos antigénicamente, y contienen epítopos definidos que, a veces, se pueden detectar inmunológicamente. Sin embargo, considerando la gran variación dentro de las reordenaciones individuales observadas en estas translocaciones y dependiendo de la localización del punto de corte en el gen no aberrante por medio del cual (incluso cuando las translocaciones se producen dentro de los dos mismos genes) se pueden generar diferentes genes específicos de tumor, se considera probable que en cada uno de estos tipos de cáncer surjan nuevos puntos de fusión. En consecuencia, la detección de cáncer mediante detección específica del epítopo de punto de fusión de la proteína específica de tumor nunca ha sido aplicable extensivamente. Los productos génicos específicos de tumor (productos de fusión) de los genes fusionados o reordenados pueden contribuir al avance del desarrollo del cáncer.

Un área en la que se han estudiado relativamente bien las aberraciones cromosómicas (en comparación con otros tipos de cáncer) es el campo de la leucemia. En comparación con los tumores más malignos, la leucemia difiere en el grado de diferenciación de las células tumorales. Según la presentación clínica, las leucemias se dividen en formas agudas y crónicas, dependiendo de la rapidez en la que evolucionan y, si no se tratan, causan la muerte.

Dependiendo de la línea o líneas celulares involucradas en el proceso leucémico, las leucemias agudas se clasifican en leucemias linfoblásticas agudas (ALL) y leucemias no linfoblásticas agudas (ANLL), siendo la ALL el tipo más predominante (>80%) durante la infancia. Las leucemias crónicas son procesos malignos en los que las células leucémicas proliferantes incontroladas son capaces de madurar. Se distinguen dos subtipos, la leucemia linfocítica crónica (CLL) y la leucemia mieloide crónica (CML). Dentro de estos cuatro grupos, se observa una heterogeneidad considerable en la biología y el pronóstico, que, generalmente, se estratifica en características morfológicas. Esta estratificación tiene todavía muy poco valor en cuanto a la comprensión y la predicción del pronóstico en un paciente con leucemia, y en cuanto al desarrollo de una terapia racional.

No obstante, estudios de genética molecular de pacientes con leucemia han mostrado recientemente que se puede encontrar una gran variedad de aberraciones cromosómicas en las diferentes formas de leucemia. Un grupo consiste en reordenaciones génicas de la inmunoglobulina (IG) o del receptor de células T (TCR), que comprende reordenaciones génicas de antígeno-receptor que sobrepasan los procesos fisiológicos normales requeridos para generar la diversidad de las moléculas de antígeno receptor que tipifican la población de células linfoides. Se conoce un gran grupo de reordenaciones de IG y TCR típicas que están asociadas con la leucemia, en varias de las cuales se expresan las moléculas de antígeno receptor específicas de tumor. Otro grupo de aberraciones está formado por deleciones de un gen entero o de partes de un gen de un genoma. Como resultado de la deleción, las regiones promotoras que normalmente pertenecen al gen que se acaba de delecionar, pueden ejercer un control sobre otro gen, dando lugar a una transcripción aberrante del gen. Un ejemplo es la deleción de las regiones codificadoras del gen SIL en células T, que resulta en la transcripción del gen TAL1 normalmente no expresado en células T, que resulta en la expresión ectópica de la proteína de fusión TAL-1. Sin embargo, otro grupo está formado por translocaciones de fragmentos de genes entre cromosomas, dando lugar a genes de fusión que pueden transcribir proteínas de fusión únicas que contribuyen al desarrollo del proceso maligno. Ejemplos conocidos son las translocaciones que resultan en los genes de fusión BCR-ABL, encontradas en >95% casos de CML y en el 30% de los casos de ALL en adultos, y TEL-AML1, que se encuentra en el 25-30% de los casos de ALL infantil. No obstante, se conocen muchos más genes de fusión, tales como E2A-PBX1, ETO-AML1 y PML-RAR\alpha.

Las aberraciones cromosómicas se pueden detectar con una gran variedad de técnicas, varias de las cuales requieren la tecnología biomolecular moderna. Las técnicas tradicionales tales como los análisis citogenéticos por técnicas de análisis de bandas cromosómicas convencionales, aunque son muy precisas, suponen un trabajo intensivo, requieren personal calificado y, por lo tanto, son caras. El cariotipado automatizado es útil para algunas aplicaciones diagnósticas, tales como el diagnóstico prenatal, pero no es efectivo para el análisis de características complejas de procesos malignos. Además, es posible detectar un aumento de la actividad de proteínas, por ejemplo de la actividad tirosina quinasa (ver WO 95/31545) en células específicas de tumor. Las técnicas anteriores requieren células frescas, que no siempre están disponibles. Otras técnicas, más modernas, utilizan la transferencia Southern u otras técnicas de hibridación de ácidos nucleicos o técnicas de amplificación tales como la PCR, para detectar aberraciones cromosómicas bien establecidas para las que hay sondas de ácidos nucleicos o cebadores adecuados disponibles. Con estas técnicas, se pueden utilizar células frescas o congeladas, y, a veces, incluso muestras más antiguas que se hayan conservado adecuadamente (como por ejemplo después de una fijación con formalina), siempre que el ácido nucleico que se desee hibridar o amplificar permanezca accesible e intacto. Sin embargo, incluso con la tecnología moderna anterior, existen varios inconvenientes que dificultan la aplicación de estas técnicas de diagnóstico en el cribado rápido de aberraciones cromosómicas relacionadas con dichos procesos malignos.

Un ensayo de transferencia Southern dura entre 3 y 4 semanas, que representa demasiado tiempo para intervenir en la terapia de procesos malignos, y solamente permite analizar 10-15 kb de ácido nucleico por cada análisis de sonda.

La PCR, aunque en esencia es adecuada para pruebas de diagnóstico o incluso para cribados rápidos y masivos, solamente permite analizar de 0,1 a 2 kb de ácido nucleico (ADN o ARN) mediante análisis de PCR, dificultando en gran medida el cribado rápido de grandes extensiones de cromosomas y de regiones de fusión o de reagrupamiento de puntos de corte dentro de los cromosomas o de sus productos génicos. Un inconveniente adicional de la PCR es su sensibilidad inherente a cebadores mal apareados. Las alteraciones, sean pequeñas, normales o fisiológicas, que siempre pueden estar presentes en la secuencia de ácidos nucleicos del fragmento de gen complementario al cebador imposibilitarán la realización de la PCR con el efecto deseado y pueden dar lugar a diagnósticos erróneos y a resultados que sean falsos negativos. Especialmente los resultados falsos negativos convierten una prueba de diagnóstico basada en la PCR, aunque sea muy específica, en insuficientemente sensible para realizar un diagnóstico fiable, y es evidente que sólo un diagnóstico de procesos malignos fiable puede contribuir a una comprensión del pronóstico y al diseño de una terapia adecuada.

Las técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH) no dependen tanto del apareamiento exacto de las secuencias de ácidos nucleicos para conseguir resultados diagnósticos positivos, pero sólo se pueden utilizar para la detección de ADN cromosómico y no para la detección de productos génicos de los cromosomas. En general, el FISH emplea el análisis de sonda con sondas largas, principalmente inespecíficas, de ácidos nucleicos, aunque con frecuencia hibridan en condiciones de severidad variable, con los genes o los fragmentos de gen localizados en el cromosoma reordenado en la célula maligna. La utilización de sondas largas convierte al FISH en una técnica muy sensible. La unión de las sondas se detecta posteriormente por detección de las sondas con fluorocromos (con frecuencia, múltiples) a través de observación al microscopio de una población de células obtenida de la muestra analizada.

Sin embargo, incluso los protocolos de FISH utilizados comúnmente conllevan inconvenientes, relacionados, principalmente, con la selección de las sondas de ácidos nucleicos utilizadas en los protocolos de FISH habituales, que comportan, con frecuencia, resultados falsos positivos en el diagnóstico de aberraciones cromosómicas, que resultan en pruebas de diagnóstico que, aunque son sensibles, no son muy específicas, al menos no suficientemente específicas para emplear las técnicas de FISH estándares en pruebas de diagnóstico masivas o rápidas, y menos todavía en pruebas o cribados automatizados. Un resultado falso positivo requiere una tediosa repetición de las pruebas a los pacientes, o incluso a clientes desconfiados que se han sometido a protocolos de cribado de rutina, y puede alarmar enormemente a estas

\hbox{personas.}

La detección inmunológica de las proteínas de fusión resultantes de las aberraciones cromosómicas, aunque se ha intentado exhaustivamente, nunca ha tenido éxito. Esto se debe, principalmente, a la dificultad para encontrar reactivos inmunológicos que reaccionen exclusivamente con proteínas específicas de tumor en lugar de permitir la detección inmunológica de proteínas que no son de fusión también producidas normalmente por el cuerpo, aunque en niveles inferiores (ver por ejemplo Nagasaki y otros, J. Immunol. Methods 162, 235-245, 1993). Habitualmente, dichos anticuerpos interaccionan con proteínas celulares normales. Sólo cuando se conocen los puntos de fusión específicos se pueden seleccionar reactivos inmunológicos específicos que reaccionen específicamente con la proteína específica de tumor, mediante la unión selectiva al epítopo del punto de fusión. No obstante, la variación en los puntos de fusión es tan grande que la detección inmunológica específica solamente funciona en pocas ocasiones, con frecuencia únicamente siguiendo una estrategia de prueba paciente por paciente.

Además, las pruebas de diagnóstico anteriores conllevan el inconveniente de requerir laboratorios especializados y bien equipados y personal entrenado y muy capacitado. Además, las pruebas anteriores se utilizan únicamente en los casos de sospecha de procesos malignos, y no son adecuados para el cribado a gran escala de poblaciones que tengan riesgo de presencia de aberraciones cromosómicas. El cribado preventivo y a gran escala puede conducir a la detección precoz de procesos malignos, y, con frecuencia, después se puede interceptar el curso fatal de un proceso maligno en una etapa precoz de su desarrollo.

La presente invención proporciona ahora un método que se puede utilizar en pruebas de diagnóstico de aberraciones cromosómicas en muestras biológicas tales como muestras de sangre, muestras de suero, muestras de células, muestras de tejido, médula ósea, biopsias. La presente invención proporciona un método que se puede utilizar en pruebas de diagnóstico en las que se requiere tanto una gran sensibilidad como una gran especificidad. La presente invención proporciona un método que se puede realizar, opcionalmente, en laboratorios de rutina por personal con habilidades normales.

La presente invención se caracteriza por un método para determinar aberraciones cromosómicas en una muestra biológica vía detección exclusiva de un producto génico específico de tumor utilizando por lo menos dos sondas diferentes dirigidas al producto génico específico de tumor originado a partir de la aberración cromosómica. Una ventaja sorprendente de la presente invención es que proporciona un método para detectar aberraciones cromosómicas relacionadas con una gran variedad de tipos de cáncer, por ejemplo, la presente invención proporciona un método para detectar aberraciones cromosómicas relacionadas con la leucemia. La presente invención proporciona un método para detectar productos génicos específicos de tumor de varios tipos de aberraciones cromosómicas, por ejemplo, la presente invención proporciona un método para detectar productos génicos correspondientes a los genes fusionados encontrados en deleciones, inversiones o translocaciones cromosómicas. Como ejemplo de la presente invención se proporciona un método para detectar la aberración cromosómica Philadelphia encontrada en leucemias. La presente invención proporciona un método para detectar productos génicos específicos de tumor tales como ARNm específico de tumor y también proteína específica de tumor. Las sondas utilizadas por la presente invención se ajustan, opcionalmente, a la naturaleza del producto génico, la detección del ARNm se consigue utilizando al menos dos sondas de ácido nucleico diferentes, siendo cada una de ellas reactiva con sitios definidos del producto génico. La detección de proteína específica de tumor se consigue utilizando como sondas al menos dos proteínas de unión diferentes, siendo cada una de ellas reactiva con sitios definidos del producto génico. Como proteínas de unión, se conocen una gran variedad de proteínas, tales como moléculas de receptor, anticuerpos (sintéticos) policlonales o monoclonales, péptidos de unión o anticuerpos de fago obtenidos a partir de técnicas de visualización de fagos, entre otras. Utilizando anticuerpos, la presente invención proporciona un método para detectar aberraciones cromosómicas inmunológicamente. Como ejemplo de la presente invención, se proporciona un método por el que se detecta el producto génico específico de tumor mediante un procedimiento de sefarosa-transferencia Western. Sin embargo, se proporciona otro ejemplo de la presente invención con un método mediante el cual se detecta el producto génico específico de tumor con un ensayo de tira reactiva. No obstante, la presente invención también proporciona otros métodos mediante los que el producto génico específico de tumor se detecta con al menos dos sondas diferentes. Por ejemplo, la presente invención proporciona un método por el que el ARNm derivado de un gen fusionado se detecta con al menos dos sondas de ácido nucleico, de las cuales al menos una está dirigida a un fragmento de ARNm que comprende el extremo 5' del ARNm específico de tumor, y al menos otra está dirigida a un fragmento de ARNm que comprende el extremo 3' del ARNm específico de tumor, correspondiendo cada uno de dichos fragmentos a un ARNm no específico de tumor. Además, la presente invención proporciona un método mediante el cual una proteína derivada de un gen fusionado se detecta con al menos dos proteínas de unión, de las cuales al menos una está dirigida a un fragmento de proteína que comprende el fragmento amino-terminal de la proteína específica de tumor, y al menos otra está dirigida a un fragmento de proteína que comprende el fragmento carboxi-terminal de la proteína específica de tumor, correspondiendo cada uno de dichos fragmentos a una proteína no específica de tumor. Como ejemplo, la presente invención proporciona un método para detectar productos génicos específicos de tumor en los que el fragmento amino-terminal proteico del producto génico corresponde a la proteína ABL o BCR, mientras que el fragmento carboxi-terminal proteico corresponde a la proteína BCR o ABL, respectivamente. Con este ejemplo, se utilizan sondas que tienen especificidades de antígeno similares tal como se ha observado para los anticuerpos 7C6, ER-FP1, Yae, 8E9, G98-271.1.3, tal como se ha mostrado en la parte experimental. La presente invención proporciona un método que utiliza sondas que se pueden marcar o conjugar con moléculas marcadoras, tales como la biotina, la digoxigenina, enzimas tales como la peroxidasa, la fosfatasa alcalina, u otras moléculas marcadoras conocidas en este sector. La presente invención proporciona además un conjunto de diagnóstico que comprende todos los medios, tales como sondas (marcadas) o reactivos o sustrato o instrucciones, necesarios para poner en práctica el método según la presente invención. Los métodos o los conjuntos de diagnóstico proporcionados por la presente invención se utilizan preferiblemente para detectar aberraciones cromosómicas encontradas en ciertos tipos de cáncer, por ejemplo en la leucemia, sea en la detección de cáncer (residual) en pacientes o en el cribado global de cáncer en poblaciones de mayor tamaño.

Parte experimental

La parte experimental describe más en detalle la presente invención en relación con el campo de la leucemia.

La translocación recíproca t(9;22)(q34;q11), observada en la leucemia mieloide crónica (CML), la leucemia linfoblástica aguda (ALL), y la leucemia mieloide aguda (AML), es el resultado de la fusión de dos genes: BCR y ABL. Dependiendo de la localización del punto de corte en el gen BCR, se generan diferentes genes BCR-ABL específicos de tumor. Estos genes BCR-ABL se transcriben y se traducen en ARNm de BCR-ABL específico de tumor y en proteínas BCR-ABL específicas de tumor, respectivamente. Por lo tanto, existen dianas de diagnóstico diferentes, y cada una de ellas permite un diagnóstico específico de leucemias positivas t(9;22)(q34;q11).

Mientras la citogenética convencional se basa en la detección de aberraciones cromosómicas características (por ejemplo, el cromosoma Philadelphia: un cromosoma 22 pequeño), se utilizan otras técnicas para detectar específicamente el gen de fusión BCR-ABL (por ejemplo, la hibridación in situ fluorescente) o el ARNm de fusión BCR-ABL (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa). Aunque todas las técnicas mencionadas anteriormente están bien establecidas como técnicas de diagnóstico, ninguna de estas técnicas se puede realizar fácilmente de forma rutinaria y a corto plazo. Sin embargo, especialmente en la ALL, la presencia del cromosoma Philadelphia (Ph) está asociada a un mal pronóstico. Para mejorar el resultado de un mal pronóstico, las ALLs positivas a Ph requieren una identificación precoz para permitir regímenes de inducción intensiva o protocolos de tratamiento alternativos.

Se presenta una nueva técnica de diagnóstico basada en la detección exclusiva de proteínas de fusión específicas de tumor. Esta técnica está diseñada para la identificación de cánceres tales como las leucemias positivas a Ph en el primer diagnóstico de una manera rápida y simple.

El cromosoma Ph fue la primera aberración cariotípica que se encontró relacionada con tumor. Hasta el momento actual, el cromosoma Ph se ha identificado en varios trastornos hematopoyéticos; por ejemplo en la leucemia mieloide crónica (CML), la leucemia linfoblástica aguda (ALL), la leucemia mieloide aguda (AML), tanto en adultos como en niños.

El cromosoma Ph se genera por translocación recíproca entre los brazos largos de los cromosomas 9 y 22: t(9,22)(q34;q11) e implica al gen ABL en el cromosoma 9 y al gen BCR en el cromosoma 22. Ambos genes se interrumpen y se reordenan; dando lugar a un gen de fusión BCR-ABL específico de tumor en el cromosoma 22q- y en un gen de fusión ABL-BCR en el cromosoma 9+.

Aunque las descripciones del gen de fusión ABL-BCR todavía son limitadas, los genes de fusión BCR-ABL se han estudiado exhaustivamente durante las dos últimas décadas. Dependiendo de la localización cromosómica de los puntos de corte, se han identificado diferentes tipos de genes de fusión BCR- ABL. Se ha demostrado que los puntos de corte del gen BCR están agrupados en dos regiones: la región de punto de corte mayoritaria (M-BCR), formada por cinco exones denominados b1 a b5; y una región de punto de corte minoritaria (m-BCR), localizada en posición 5' en el gen BCR respecto a la M-BCR. En contraposición, los puntos de corte en el gen ABL se encuentran dispersos en distancias largas y la mayoría se producen en posición 5' respecto al exón a2. Tanto en los pacientes CML Ph+ como en los pacientes ALL Ph+ los puntos de corte en la M-BCR están distribuidos uniformemente: ya sea localizados entre los exones b2 y b3 o entre los exones b3 y b4. Los puntos de corte en ALL Ph+ se encuentran, no obstante, mayoritariamente (70% aproximadamente) en la m-BCR, localizada en un intrón entre los exones e1 y e2.

Ya que los puntos de corte se encuentran dispersos en distancias largas (especialmente en el gen ABL), se generan intrones de punto de fusión diferentes en los genes BCR-ABL. Aunque estos intrones de punto de fusión son muy variables entre pacientes Ph+ respecto a la longitud y secuencia de nucleótidos del intrón de punto de fusión del gen BCR-ABL, los puntos de fusión de los transcritos BCR-ABL son muy coherentes. Por consiguiente, dependiendo de la reordenación original del gen BCR-ABL, habitualmente se detecta un solo tipo de ARNm BCR-ABL: variable desde un ARNm de 7 kb que comprende una unión e1a2 hasta un ARNm BCR-ABL de 8,5 que comprende una unión b2a2 o b3a2. Ya que se mantiene el marco de lectura traduccional de los ARNms BCR-ABL, las células con leucemia Ph+ expresan proteínas BCR-ABL únicas.

Mientras los cromosomas Ph están presentes casi invariablemente en los casos de CML, los cromosomas Ph se detectan con menor frecuencia en células con leucemia de pacientes que padecen AML o ALL. El 5% de los casos de AML, del 25% al 30% de los adultos con ALL y del 3% al 5% de los niños con ALL todavía se diagnostican como Ph+. Tal como se refleja con una elevada proporción de fracaso del tratamiento y con la mortalidad, en las leucemias Ph+, tanto en adultos como en niños, los cromosomas Ph están señalados como factores de riesgo significantes al considerar el fracaso del tratamiento.

Es crucial identificar los factores de riesgo, tales como el cromosoma Ph. Los protocolos de tratamiento habituales se pueden mejorar identificando el t(9;22)(q11;q34) en una etapa precoz de la enfermedad. Actualmente, las leucemias Ph+ se identifican con un número de técnicas, tanto detectando el cromosoma aberrante, el gen, el ARNm o la proteína aberrante. No obstante, todas estas técnicas se caracterizan por especificaciones y limitaciones típicas que se deberían considerar antes de intentar diagnosticar leucemias positivas t(9;22)(q34;q11) de manera específica.

En este estudio los presentes inventores informan de una nueva técnica de diagnóstico: un ensayo desarrollado para discriminar entre las leucemias Ph+ y las leucemias Ph- en el primer diagnóstico, de una manera relativamente rápida y simple. El principio remarcable del ensayo se basa en la detección de proteínas específicas de tumor mediante anticuerpos reactivos específicamente con fragmentos correspondientes a las proteínas de fusión BCR- ABL y a fracciones de las proteínas originales no fusionadas BCR y ABL.

Materiales y métodos Muestras celulares

Líneas celulares: Se utilizaron seis líneas celulares Ph^{+} para examinar la especificidad del procedimiento de sefarosa-transferencia Western y también del ensayo de tira reactiva BCR-ABL: LAMA-84 y K562, KCL-22 y BV-173, y TOM-1 y ALL/MIK. Todas las líneas celulares se cultivaron en RP-MI-1640 complementado con suero fetal de ternera al 10%.

Muestras de células leucémicas: En el diagnóstico se utilizaron dos muestras de sangre periférica leucémica criopreservada procedente de pacientes con leucemia para examinar la especificidad del ensayo de tira reactiva BCR-ABL. Los datos clínicos y de laboratorio de estos pacientes se han descrito anteriormente: un paciente padecía una CML Ph negativa, con reordenación de los genes BCR-ABL b2a2, el otro padecía una B-ALL con precursor Ph positivo, con reordenación de los genes BCR-ABL e1a2.

Anticuerpos

Todos los anticuerpos utilizados se purificaron de proteína G y se clasificaron en: Anticuerpos de captura: anticuerpo monoclonal (moAb) 7C6 (ofrecido generosamente por el Dr. S. Dhut), dirigido al epítopo b2 presente en b2a2P210^{BCR-ABL}, b3a2P210^{BCR-ABL}, P160^{BCR} y P130^{BCR}; moAb ER-FP1, dirigido al punto de fusión e1a2 en e1a2P190^{BCR-ABL}; y moAb Yae (Santa Cruz Biotechn., Santa Cruz, CA, Estados Unidos) dirigido al amino-terminal de las proteínas E2A. Anticuerpos de detección: moAb 8E9 (ofrecido generosamente por el Dr. J. Wang), dirigido al dominio SH2 presente en e1a2P190^{BCR-ABL}, b2a2P190^{BCR-ABL},b3a2P190^{BCR-ABL} y P145^{ABL}; y moAb G98-271.1.3 (ofrecido generosamente por el Dr. G. Bain) dirigido al carboxi-terminal de las proteínas E2A. Ambos moAb 8E9 y moAb G98-271.1.3 se biotinilaron.

Procedimiento de sefarosa-transferencia Western

Las células se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS) enfriado con hielo y se lisaron en tampón de lisis (Tritón X-100 al 1%, dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,05%, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM en fosfato sódico 10 mM, pH 7,0), complementado con 40 \mul de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF: 100 mM en 2-isopropanol) en una concentración de 1 x 10^{7} células/ml durante 15 minutos. Después de centrifugar los lisados en una centrífuga Eppendorf para eliminar el material insoluble (5 minutos, 4ºC), se dividieron los sobrenadantes en volúmenes iguales correspondientes a 10^{7} células.

El procedimiento de sefarosa-transferencia Western se realizó añadiendo 10 \mug moAb 7C6 o bien 2 \mug moAb ER-FP1 al sobrenadante del lisado celular. La reacción antígeno-anticuerpo se dejó actuar durante dos horas en un agitador rotativo a 4ºC. A continuación, se añadieron 40 \mul de una suspensión de esferas de sefarosa GammaBind G al 80% (v/v) (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). Después de 30 minutos, se recogieron las esferas y se lavaron tres veces en tampón de lisis sin SDS. Se hirvieron las esferas durante 5 minutos en 60 \mul de tampón de muestra (Tris-HCl 60 mM, pH 6,8, glicerol al 10%, EDTA 10 mM, SDS al 2%, \beta-mercaptoetanol al 2% y azul de bromofenol al 0,03%. Las muestras de proteína se sometieron a SDS-PAGE al 6% y se transfirieron (Mini Protean; Bio Rad, Richmond, CA, Estados Unidos) a nitrocelulosa (0,45 \mum de tamaño de poro; Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Las hojas de nitrocelulosa se bloquearon con leche en polvo sin grasa al 5% (Protifar, Nutricia, Holanda) en PBS complementado con Tween-20 al 0,05% (MPBS al 5%).

A continuación, se incubaron las hojas durante dos horas a temperatura ambiente en presencia de moAb 8E9 biotinilado (2 \mug/ml) en MPBS al 1%. Después de tres lavados con PBS complementado con Tween-20 al 0,05%, se añadió fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (South. Biotech. Ass., Birmingham, Alabama, Estados Unidos) en una dilución 1:1500 y se dejó reaccionar durante una hora. La membrana de transferencia se lavó dos veces con PBS complementado con Tween-20 al 0,05% y, finalmente, con tampón acetato de veronal 0,15 M, pH 9,6. Para visualizar los complejos antígeno-anticuerpo, los presentes inventores utilizaron el sustrato de la fosfatasa alcalina azul de nitrotetrazolio / fosfato de 5-bromo-4-cloroindoxilo (NBT/BCIP; Sigma; St. Louis, MO, Estados Unidos) tal como se describió anteriormente.

Método de la tira reactiva BCR-ABL

Se aplicó cada uno de los anticuerpos de captura como una pequeña mancha individual en una tira de nitrocelulosa (0,45 \mum de tamaño de poro) (\pm 2 cm x 0,5 cm) y se secó con aire. Cada mancha contenía 2 \mug de moAb 7C6, 1 \mug de moAb ER-FP1 o bien 1 \mug de moAb Yae. A continuación, estas tiras de nitrocelulosa, llamadas "tiras reactivas" se lavaron con PBS complementado con Tween-20 al 0,05% y se bloquearon posteriormente en MPBS al 5% (1 hora, temperatura ambiente). En este punto, las tiras reactivas se pueden secar con aire y guardar en un contenedor hermético a 4ºC hasta una nueva utilización.

Los sobrenadantes de los lisados celulares (procesados y descritos en el primer párrafo de la sección anterior), correspondientes a 10^{7} células, se añadieron a las tiras reactivas. La formación del complejo antígeno -anticuerpo se dejó reaccionar toda la noche a 4ºC en un agitador rotativo. A continuación, las tiras reactivas se lavaron tres veces con PBS complementado con Tween-20 al 0,05% y los antígenos unidos se detectaron incubando la tira reactiva con una mezcla de moAb 8E9 biotinilado (2 \mug/ml) y moAb G98-271.1.3 (2 \mug/ml) biotinilado, diluido en MPBS al 1%. De aquí en adelante, las tiras reactivas se continuaron procesando tal como se ha descrito en la sección de materiales y métodos del procedimiento de sefarosa-transferencia Western.

Resultados

Para determinar si las proteínas de fusión BCR-ABL específicas de tumor se pueden reconocer exclusivamente con métodos inmunológicos, los presentes inventores desarrollaron un procedimiento de sefarosa-transferencia Western. Un procedimiento de sefarosa-transferencia Western es una combinación de una reacción de inmunoprecipitación con un anticuerpo de captura, seguido por un procedimiento de transferencia Western con un anticuerpo de detección.

Como anticuerpo de captura se utilizó MoAb 7C6 o MoAb ER-FP1, para precipitar proteínas de los lisados celulares de LAMA-84 y KCL-22, o de las células TOM-1, respectivamente. Después de la inmunotransferencia, se detectaron las proteínas precipitadas utilizando moAb 8E9 biotinilado como anticuerpo de detección y fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina. Estos experimentos de sefarosa-transferencia Western con combinaciones de anticuerpo 7C6/8E9, igual que los experimentos que utilizan combinaciones de anticuerpo ER-FP1/8E9 permitieron una detección exclusiva de las proteínas BCR-ABL. La combinación de anticuerpo ER-FP1 detecta las proteínas e1a2P190^{BCR-ABL} que no han sido detectadas por la combinación de anticuerpo 7C6/8E9. Sin embargo, la combinación de 7C6/8E9 detecta específicamente las proteínas b2a2P210^{BCR-ABL} y b3a2P210^{BCR-ABL}, que no son reconocidas, ninguna de las dos, por los anticuerpos ER-FP1.

En conclusión, los datos de sefarosa-transferencia Western descritos en la presente invención confirman que las proteínas de fusión BCR-ABL específicas de tumor se identifican exclusivamente con una selección y una mezcla apropiadas de anticuerpos.

Reconocimiento exclusivo de las proteínas BCR-ABL en un ensayo de tira reactiva

A continuación, los presentes inventores investigaron si se podía simplificar el procedimiento de sefarosa-transferencia Western. Utilizando el mismo conjunto de anticuerpos que en los experimentos de sefarosa-transferencia Western, se investigó la capacidad de un sistema de detección de BCR-ABL alternativo, denominado tira reactiva BCR-ABL, para identificar proteínas BCR-ABL exclusivamente.

La tira reactiva BCR-ABL está formada por tiras de nitrocelulosa en las que se han inmobilizado tres anticuerpos diferentes: 1) moAb 7C6, 2) moAb ER-FP1 y 3) moAb Yae. Para investigar si la tira reactiva BCR-ABL se puede utilizar para la determinación específica de proteínas BCR-ABL, se incubaron las tiras reactivas BCR-ABL con lisados celulares de: 1) células LAMA-84, 2) células KCL-22 o 3) células TOM-1. Las proteínas de fusión que se captaron mediante los anticuerpos inmobilizados se detectaron mediante una incubación posterior con una mezcla de moAb 8E9 biotinilado (8E9-bio, que reconoce el carboxilo terminal de ambas proteínas ABL y BCR-ABL) y de moAb biotinilado G98-272.1.3. (que reconoce el carboxilo terminal de las proteínas E2A) seguido de fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina.

La incubación de una tira reactiva BCR-ABL con lisados celulares de LAMA-84 o lisados celulares de KCL-22, resulta, después de incubación sucesiva con anticuerpos biotinilados (por ejemplo, 8E9-bioy G98.271.1.3-bio), estreptavidina-AP y su sustrato, en puntos visibles localizados en la mancha del anticuerpo moAb 7C6. La incubación de una tira reactiva BCR-ABL con lisados celulares de TOM-1, resulta, después de una incubación posterior con las moléculas mencionadas anteriormente, en una mancha visible localizada en la mancha del anticuerpo ER-FP1. Considerando los datos de sefarosa-transferencia Western descritos anteriormente, estos puntos representan proteínas BCR-ABL unidas.

En conjunto, estos datos demuestran que el ensayo de la tira reactiva BCR-ABL se puede aplicar en la detección exclusiva de proteínas BCR-ABL específicas de tumor.

En este punto, el ensayo de la tira reactiva BCR-ABL detecta específicamente proteínas BCR-ABL en lisados celulares obtenidos a partir de líneas celulares. A continuación, los presentes inventores investigaron si el ensayo de la tira reactiva BCR-ABL se puede aplicar en el diagnóstico específico de leucemias positivas BCR-ABL.

Dos muestras de sangre criopreservadas, enriquecidas con Ficoll, del paciente A y del paciente B, respectivamente, con leucemias BCR-ABL positivas diagnosticadas previamente, se lisaron e investigaron mediante el ensayo de la tira reactiva BCR-ABL y también con el procedimiento de sefarosa-transferencia Western. Las muestras de sangre del paciente A y del paciente B representan una CML Ph- con reordenación críptica de los genes b3a2BCR-ABL y una ALLL Ph+ con reordenación de los genes e1a2BCR-ABL, respectivamente. Ambas muestras dieron positivo a la presencia de la proteína de fusión BCR-ABL.

Discusión

La presencia del cromosoma Ph en células leucémicas está asociada con un mal pronóstico. Especialmente en la ALL, es importante distinguir las leucemias Ph+ de las leucemias Ph-, porque la presencia del cromosoma Ph identifica a un gran grupo de pacientes con un futuro incierto.

No obstante, este mal resultado terapéutico se puede mejorar a través de un inicio precoz de terapias de inducción más agresivas. Por consiguiente, los métodos de diagnóstico sensibles y fiables, que identifican al cromosoma Ph o a sus productos en una etapa precoz de la enfermedad, son extremadamente importantes en los diagnósticos de la ALL. Actualmente, el análisis citogenético convencional es el método seleccionado para identificar diversas anormalidades cromosómicas en la ALL. No obstante, los resultados obtenidos por análisis citogenético no son siempre fiables porque los resultados dependen enormemente del número de metafases investigadas. Solamente las instituciones con una experiencia especial en la citogenética de la ALL consiguen realizar un análisis de cariotipo con éxito en prácticamente todos los pacientes. Incluso entonces, algunas reordenaciones BCR-ABL crípticas se escapan de la detección con el análisis citogenético convencional.

A diferencia de la citogenética convencional, las técnicas de hibridación in situ fluorescentes no están limitadas a los análisis laboriosos de metafases. Se pueden identificar células de interfase Ph+ aplicando sondas dirigidas a los genes BCR y ABL, marcadas, cada una de ellas, con un fluorocromo diferente. Sin embargo, dependiendo de la colocalización de las dos señales de hibridación en una mancha, su sensibilidad es limitada, porque se puede observar una colocalización artefactual en células normales no malignas.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es hoy en día el método más sensible para detectar anormalidades genéticas. De hecho, el análisis molecular detecta, con frecuencia, aberraciones que no se observan cariotípicamente. No obstante, teniendo en cuenta que los puntos de corte se encuentran dispersos en distancias largas en los intrones de punto específico de fusión de tumor, el procedimiento de PCR solamente es aplicable después de la transcripción inversa del ARN mensajero BCR-ABL. Ya que es muy sensible, se requieren precauciones estrictas para evitar resultados falsos positivos (a causa de contaminación cruzada) y falsos negativos (a causa de degradación prematura del ARNm).

En la presente invención, los presentes inventores describen el desarrollo de una nueva técnica simple y rápida basada en la detección de dos sitios antigénicos definidos en la proteína de fusión BCR-ABL. La especificidad combinada de al menos dos anticuerpos diferentes permite la detección exclusiva de proteínas BCR-ABL en 24 horas.

Las suposiciones de los presentes inventores referentes a la detección exclusivamente inmunológica de proteínas BCR-ABL con la combinación de anticuerpos adecuada han demostrado ser correctas, tal como se probaron inicialmente en los experimentos de sefarosa-transferencia Western. Estos experimentos demuestran que las proteínas b3a2BCR-ABL y b2a2BCR-ABL se identifican específicamente con la combinación moAn 7C6/8E9-bio, mientras que las proteínas e1a2BCR-ABL se identifican específicamente con la combinación moAb ER-FP1/8E9-bio.

Los presentes inventores investigaron, a continuación, si el procedimiento de sefarosa-transferencia Western se podía simplificar todavía más. La tira reactiva BCR-ABL resultante, una pequeña tira de nitrocelulosa en la que se han inmovilizado tres anticuerpos diferentes, se examinó respecto a la especificidad y sensibilidad utilizando diferentes líneas celulares Ph+. Se confirmó la especificidad con el análisis de las líneas celulares Ph+: cada una expresaba un tipo diferente de proteína BCR-ABL. Estos resultados son coherentes y también se observaron al analizar otras líneas celulares Ph+ tales como K562, BV173 y MIK-ALL. Los resultados muestran que este ensayo puede actuar como método de cribado alternativo para detectar leucemias BCR-ABL positivas en un primer diagnóstico. Los análisis de tira reactiva de las dos muestras de células leucémicas con los genes BCR-ABL reordenados previamente descritos, mostraron que el diagnóstico inicial de leucemias BCR-ABL positivas es, de hecho, factible. Además, considerando la citogenética convencional, se ha demostrado su valor añadido con el análisis del paciente A. Aunque este paciente padecía una CML Ph negativa con reordenación críptica de los genes BCR-ABL, las proteínas BCR-ABL se identificaron fácilmente con el ensayo de la tira reactiva BCR-ABL.

Claims (14)

1. Método para detectar aberraciones cromosómicas en una muestra biológica por intermedio de la detección del producto génico específico de un tumor expresado exclusivamente por células tumorales utilizando al menos dos sondas diferentes dirigidas contra el producto génico que tiene por origen la aberración cromosómica, siendo cada sonda reactiva con sitios definidos en dicho producto génico.

2. Método, según la reivindicación 1, por el cual una aberración cromosómica puede causar leucemia.

3. Método, según las reivindicaciones 1 ó 2, por el cual una aberración cromosómica es una translocación.

4. Método, según la reivindicación 3, por el cual una translocación resulta en una aberración del cromosoma Philadelphia.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por el cual el producto génico específico de tumor es una proteína.

6. Método, según la reivindicación 5, por el cual la proteína se detecta inmunológicamente.

7. Método, según la reivindicación 6, por el cual la proteína específica de tumor se detecta con un procedimiento de sefarosa-transferencia Western.

8. Método, según la reivindicación 6, por el cual la proteína específica de tumor se detecta con el ensayo de tira indicadora.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, por el cual la proteína específica de tumor comprende un fragmento de proteína amino-terminal y un fragmento carboxi-terminal, ambos corresponden a una proteína diferente no específica de tumor.

10. Método, según la reivindicación 9, en el cual al menos una sonda es reactiva específicamente con el fragmento amino-terminal de la proteína y al menos una sonda es reactiva específicamente con el fragmento carboxi-terminal de la proteína.

11. Método, según la reivindicación 10, por el cual el fragmento amino-terminal de la proteína corresponde a la proteína ABL o BCR, mientras que el fragmento carboxi-terminal de la proteína corresponde a la proteína BCR o ABL, respectivamente.

12. Método, según la reivindicación 11, por el cual se selecciona al menos una sonda del grupo formado por los anticuerpos dirigidos al epítopo b2 presente en b2a2P210^{BCR-ABL}, b3a2P210^{BCR-ABL}, P160^{BCR} y P130^{BCR}, dirigido al punto de fusión e1a2 en e1a2P190^{BCR-ABL}; dirigido al amino-terminal de las proteínas E2A; dirigido al dominio SH2 presente en e1a2P190^{BCR-ABL}, b2a2P190^{BCR-ABL}, b3a2P190^{BCR-ABL} y P145^{ABL}; y dirigido al carboxilo terminal de las proteínas E2A.

13. Equipo de diagnóstico para detectar aberraciones cromosómicas en una muestra biológica a través de detección del producto génico específico de tumor expresado exclusivamente por células de tumor que comprenden al menos dos sondas diferentes dirigidas contra el producto génico originado por la aberración cromosómica, siendo cada sonda reactiva con sitios distintos de dicho producto génico.

14. Utilización de un método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o de un conjunto de diagnóstico, según la reivindicación 13, para la detección o el cribado de cáncer.