ES2217566T3 - Uso de asparaginasa de wolinella succionogenes para tratar enfermedades asociadas con la dependencia de asparagina. - Google Patents
Uso de asparaginasa de wolinella succionogenes para tratar enfermedades asociadas con la dependencia de asparagina.Info
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para producir recombinantes de derivados de asparaginasa de la Wolinella succinogenes. Además, la invención se refiere a los procedimientos para modificaciones covalentes de proteínas, incluyendo asparaginasas, mediante acilación. Algunas realizaciones proporcionan el marcado epitópico del término amino de la W. succinogenes asparaginasa. Otras realizaciones se refieren a procedimientos de utilización terapéutica de la nueva forma homotetramérica del W. succinogenes asparaginasa, así como el empleo del recombinante marcado epitópicamente o no epitópicamente marcado de W. succinogenes asparaginasa (o una análogo covalentemente modificado de este) en el tratamiento terapéutico de enfermedades hematológicas malignas y no malignas y otras enfermedades en los que el empobrecimiento o eliminación de la asparagina sería eficaz o que responde a la disminución o desaparición de la asparagina así como a su utilización potencial en el tratamiento terapéuticode enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, SIDSA y SLE.
Description
Uso de asparaginasa de Wolinella
succinogenes para tratar enfermedades asociadas con la
dependencia de asparagina.
Esta solicitud reivindica prioridad frente a la
solicitud de patente provisional de EE.UU. 60/049.085, presentada el
9 de junio de 1997.
La presente invención se refiere a asparaginasa
de Wolinella succinogenes nativa y acilada recombinante y sus
análogos, que poseen una potente actividad in vitro e in
vivo frente a enfermedades relacionadas con la dependencia de
asparagina y, en particular, a composiciones que comprenden
asparaginasa de Wolinella succinogenes nativa y acilada
recombinante y su uso en la fabricación de medicamentos para el
tratamiento de enfermedades que responden a la depleción de
asparagina, incluyendo varias enfermedades hematológicas,
autoinmunitarias e infecciosas.
Las asparaginasas son enzimas que catalizan la
desamidación de L-asparagina (actividad
asparaginasa) y L-glutamina (actividad
glutaminasa). Véase Cantor, P. S. & Schimmell, M. R.,
Enzyme Catalysis, 2ª ed., (T. Pettersonn & Y. Tacashi,
eds.), Sanders Scientific Press, Nueva York pág.
219-23 (1990). La L-glutamina sirve
como donante de amidas en la biosíntesis de las purinas, así como en
otras reacciones de transaminación y, por tanto, desempeña un papel
en el metabolismo del ADN y de los nucleótidos cíclicos.
La actividad bioquímica in vivo de la
asparaginasa se documentó por primera vez en el suero de cobayas en
1922 (véase Clementi, A., La désamidation enzimatique de
l'asparagina chez les differentes espèces-animales
et la signification physiologique de sa presence dans l'organisme,
19 Arch. Intern. Physiol. 369 (1922)).El posterior
descubrimiento de que la asparaginasa aislada de suero de cobaya era
el agente activo que inhibía el crecimiento in vivo de
ciertos tumores de mamíferos dependientes de asparagina, sin que se
produjeran efectos perjudiciales concomitantes sobre el tejido
normal (véase Broome, J. D., Evidence that the asparaginase
activity of guinea pig serum is responsible for its
anti-lymphoma effects, 191 Nature 1114
(1961)) sugería que esta enzima podría utilizarse como agente
antineoplásico. Dado que la L-asparagina no es un
aminoácido esencial, inicialmente se pensó que la asparaginasa
representaba un prototipo único de quimioterapia selectiva en la que
el tratamiento podría dirigirse de forma específica y selectiva
contra células dependientes de asparagina. Sin embargo, a causa de
los bajos niveles de asparaginasa en el suero de cobayas fue
necesario desarrollar una fuente más práctica de esta enzima
antineoplásica.
Posteriormente, se mostró que la asparaginasa
microbiana aislada de Escherichia coli y de Erwinia
carotovora actuaba como un potente agente antileucémico
(véase Howard, J. B. & Carpenter, F. H.,
L-asparaginase from Erwinia carotovora:
substrate specifity and enzymatic properties, 247 J. Biol.
Chem. 1020 (1972); Campbell, H. A., y col., Two
asparaginases from Escherichia coli B: their separation,
purification and anti-tumor activity, 6
Biochemistry 721 (1967)), y cuando una de estas enzimas se
usó en combinación con el agente quimioterapéutico vincristina y el
corticosteroide prednisona para el tratamiento de leucemia humana
linfoblástica aguda o indiferenciada aguda, se comunicó una tasa de
remisión global del 93% (véase Ortega, J. A., y col.,
L-asparaginase, vincristine and prednisone for the
induction of first remission in acute lymphocytic leukemia, 37
Cancer Res. 5353 (1977)).
Mientras que estas asparaginasas poseen una
potente actividad antileucémica, el uso clínico de las asparaginasas
microbianas mencionadas anteriormente dio como resultado un amplio
intervalo de toxicidad para el huésped (por ejemplo, disfunción
hepática, renal, esplénica, pancreática y coagulación sanguínea) y
una inmunosupresión pronunciada (véase Ohno, R. & Hersh,
E. M., Immunosuppressive effects of L-asparaginase,
30 Cancer Res. 1605 (1970)), a diferencia de la asparaginasa
aislada del suero de cobaya (véase Cooney, D. A., y col.,
L-asparaginase and L-asparagine
metabolism, 10 Ann. Rev. Pharmacol. 421 (1970)).
El estudio de los efectos del tratamiento con
asparaginasa de E. coli sobre la histología del bazo y sobre
las poblaciones de linfocitos reveló una reducción marcada del
tamaño y la reactividad de los centros germinales esplénicos, que
estaba asociado de forma concomitante con una reducción marcada de
las células citoplásmicas que contienen inmunoglobulinas
(inmunoblastos de células B; véase Distasio, J. A., y
col., Alteration in spleen lymphoid populations associated with
specific aminoacid depletion during L-asparaginase
treatment, 42 Cancer Res. 252 (1982)). Además, el estudio de
la subpoblación de linfocitos dentro del bazo reveló que había una
reducción del 40% en el porcentaje de células de la superficie que
expresan inmunoglobulinas (células B) acompañada de un aumento de la
proporción de células que expresan Thy-1.2 (células
T), mientras que la proporción entre las células
Lit-2 y Lit-1 permaneció invariable
en comparación con el grupo de animales control. Estos resultados
apoyaban la hipótesis de que la glutamina o la glutamina combinada
con la depleción de asparagina que inicialmente resultó de la
administración de asparaginasa de E. coli, produjo una
disminución marcada de las células linfocíticas del bazo de la línea
de células B.
Otro importante efecto clínico adverso asociado
con el tratamiento tradicional con asparaginasa microbiana es la
disfunción hepática (véase Schein, P. S., y col., The
toxicity of E. coli asparaginase, 29 Cancer Res. 426 (1969)).
Los pacientes tratados con asparaginasa de E. coli
generalmente exhiben menores niveles plasmáticos de albúmina,
antitrombina III, colesterol, fosfolípidos y triglicéridos. Entre
otros marcadores de disfunción y enfermedad hepáticas inducidas por
asparaginasa se incluyen cambios grasos degenerativos, retraso en el
aclaramiento de bromosulfoftaleína y aumento de los niveles en suero
de la transaminasa oxalacética-glutámica y la
fosfatasa alcalina. Aunque algunos investigadores han comunicado que
dosis bajas de asparaginasa de E. coli dan como resultado
pocas complicaciones hepatotóxicas, sin embargo, algunos marcadores
sensibles de función hepática en algunos pacientes en tratamiento
con dosis bajas todavía revelan enfermedad hepática significativa,
que puede dar lugar a coagulopatía potencialmente letal (véase
Crowther, D., Asparaginase and human malignant disease, 229
Nature 168 (1971)).
Los efectos hepatotóxicos de las asparaginasas
microbianas pueden ser un resultado de su capacidad para hidrolizar
tanto asparagina como glutamina. Una diferencia bioquímica entre las
asparaginasas de E. coli y E. carotovora y la enzima
derivada de cobayas es la actividad amidohidrolasa inespecífica
asociada con las enzimas microbianas (véase Howard, J. B.
& Carpenter, F. H., (1972) supra; Campbell, H. A., y
col., (1967) supra). Por ejemplo, se ha mostrado que la
asparaginasa de E. coli posee un nivel 130 veces mayor de
actividad de glutaminasa en comparación con la actividad
asparaginasa de Wolinella succinogenes (anteriormente
clasificada como Vibrio succinogenes). Como resultado, los
pacientes tratados con las asparaginasas microbianas muestran una
marcada reducción de los niveles en suero de glutamina y asparagina
(véase Schrek, R., y col., Effects of
L-glutaminase on transformation and DNA synthesis of
normal lymphocytes, 48 Acta Haematol. 12 (1972)), que puede
demostrar una posible correlación entre la privación de glutamina y
la toxicidad clínica inducida por asparaginasa (véase Spiers,
A. D. S., y col.,
L-glutaminase/L-asparaginase: human
pharmacology, toxicology, and activity in acute leukemia, 63
Cancer Treat. Resp. 1019 (1979). Se han evaluado los efectos
hepatotóxicos de las diferentes asparaginasas y los resultados
respaldan el concepto de que la depleción específica de asparagina
no es significativamente hepatotóxica (véase Distasio, J. A.,
y col., Glutaminase-free asparaginase from
Vibrio succionogenes: an antilymphoma enzyme lacking
hepatotoxicity, 30 Int. J. Cancer 343 (1982)). En un estudio
posterior, se estudiaron los efectos hepatotóxicos del tratamiento
prolongado con asparaginasas de E. coli y E.
carotovora y las toxicidades observadas se compararon con las de
la asparaginasa de W. Succinogenes. Los resultados sugieren
que la depleción fisiológica combinada de asparagina y glutamina
tras la administración de las asparaginasas de E. coli o de
E. carotovora puede dar como resultado una hepatotoxicidad
pronunciada, mientras que la asparaginasa de W. Succionogenes
no es hepatotóxica, incluso tras el tratamiento prolongado
(véase Durden, D. L., y col., Kinetics analysis of
hepatotoxicity associated with antineoplastic asparaginases, 43
Cancer Res. 1602 (1983)).
La importancia relativa de
L-glutamina en el metabolismo intermedio de
mamíferos ha servido para estimular la realización de más
investigaciones acerca del posible papel de la privación de
glutamina en la inmunosupresión inducida por asparaginasa. Se ha
mostrado que el tejido linfoide tiene niveles relativamente bajos de
actividad glutamina sintetasa (véase
El-Asmar, F. A. & Greenberg, D. H., Studies
on the mechanism of inhibition of tumor growth by glutaminase, 26
Cancer Res. 116 (1966); Hersh, E. M.,
L-glutaminase: suppression of lymphocyte blastogenic
responses in vitro, 172 Science 139 (1971)), lo que
sugiere que estos tejidos pueden ser particularmente sensibles a la
depleción de glutamina exógena. Por el contrario, algunos
investigadores han propuesto que la privación de asparagina sola
puede ser responsable de la inmunosupresión inducida por asparagina
(véase Baechtel, F. S., y col., The influence of
glutamine, its decomposition products and glutaminase on the
transformation of human lymphocytes, 421 Biochem. Biophys.
Acta 33 (1976)).
Aunque el efecto inmunosupresor de las
asparaginasas de E. coli y de E. carotovora está bien
documentado (véase, Crowther, D., (1971) supra;
Schwartz, R. S., Immunosuppression by
L-asparaginase, 224 Nature 276 (1969)), las
bases biológicas moleculares de estas funciones todavía no se han
aclarado. La inhibición de la blastogénesis de los linfocitos por
varios antagonistas de L-glutamina (véase
Hersh, E. M. & Brown, B. W., Inhibition of immune response by
glutamine antagonism: effect of azotomycin on lymphocyte
blastogenesis, 31 Cancer Res. 834 (1980))y la glutaminasa de
Escherichia coli (véase Hersh, E. M., (1971)
supra) tiende a ser ilustrativa de un posible papel de la
depleción de glutamina en la inmunosupresión. También se ha
demostrado que la inhibición de la respuesta blastogénica linfoide a
fitohemaglutinina (PHA) producida por la asparaginasa de E.
coli puede invertirse mediante la adición de
L-glutamina pero no con la adición de
L-asparagina. Véase Simberkoff, M. S. &
Thomas, L., Reversal by L-glutamine of the
inhibition of lymphocyte mitosis caused by E. coli
asparaginase, 133 Proc. Soc. Exp. Biol. (N. Y.) 642 (1970).
Además, mediante la observación de que la E. asparaginasa es
más eficaz que la asparaginasa de E. coli en la supresión de
la respuesta de leucocitos de conejo a PHA (véase Ashworth,
L- A. E. & MacLennan, A. P., Comparison of
L-asparaginases from Escherichia coli and
Erwinia carotovora as immunosuppressant, 34 Cancer
Res. 1353 (1974)) se ha sugerido la existencia de una
correlación entre la inmunosupresión y la cantidad relativa de la
actividad glutaminasa. Sin embargo, la significación de estos
estudios in vitro es algo limitada porque los destinos in
vivo de las asparaginasas y el control homeostásico de
asparagina y glutamina puede dar como resultado una modificación de
los efectos inmunosupresores de las asparaginasas antineoplásicas.
En un estudio más reciente se investigaron los efectos
inmunosupresores de las asparaginasas de E. coli y W.
succinogenes sobre la respuesta tumoral de ratones durante la
inmunización con hematíes de carnero (HC). Se han obtenido pruebas
de la asparaginasa sin glutaminasa de W. succinogenes no
suprime la respuesta inmunitaria in vivo de ratones a los HC
frente a los pronunciados efectos inmunosupresores observados en
ratones tratados con la asparaginasa de E. coli (véase
Durden, D. L. y Distasio J.A., Comparison of the immunosuppressive
effects of asparaginase from Escherichia coli and Vibrio
succinogenes, 40 Cancer Res. 1125 (1980)).
Otro problema significativo asociado con el uso
de asparaginasas microbianas es que los pacientes tratados con E.
coli y E. carotovora con frecuencia desarrollan
anticuerpos neutralizantes de las clases IgG e IgM de
inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Cheung, N. & Chau,
K., Antibody response to Escherichia coli
L-asparaginase: Prognostic significance and clinical
utility of antibody measurement, 8 Am. J. Pediatric Hematol.
Oncol. 99 (1986); Howard, J. B. & Carpenter F. H. (1972)
supra, que permite un rebote inmediato de los niveles de
asparagina y glutamina en suero. En un intento de mitigar los
efectos tóxicos y la inmunosensibilidad asociada con el uso
terapéutico de asparaginasa de E. coli y E.
carotovora, inicialmente se desarrolló una asparaginasa de E.
coli covalentemente modificada
(PEG-asparaginasa) para usar en pacientes que han
desarrollado una hipersensibilidad retardada a las preparaciones de
asparaginasa "nativa" de E. coli (véase Cao, S.
& Zhao, G., Chemical modification of enzyme molecules to improve
their characteristics, 613 Ann. NY Acad. Sci. 460 (1990)).Se
ha establecido que la asparaginasa de E. coli y de V.
succinogenes modificada con polietilenglicol tiene, entre otras
propiedades, un aumento de las semividas plasmáticas y, por tanto,
un mayor efecto antitumoral en comparación con las enzimas nativas
(véase A. Abuchowski y col., Cancer therapy with
chemically modified enzymes I. Antitumor properties of polyethylene
glycol-asparaginase conjugates, 7 Cancer Biochem.
Biophys. 175 (1984)).
Sin embargo, en estudios posteriores se ha
establecido que el desarrollo inicial de una respuesta inmunitaria
frente a la asparaginasa de E. coli dio como resultado un 80%
de reactividad cruzada contra la PEG-asparaginasa,
con efectos farmacocinéticos adversos concomitantes, neutralización
de la actividad PEG-asparaginasa y normalización de
los niveles plasmáticos de L-asparagina y
L-glutamina (véase Avramis, V. &
Periclou, L., Pharmodynamic studies of
PEG-asparaginase (PEG-ASNase) in
pediatric ALL leukemia patients, Seventh International Congress
on Anti-Cancer Treatment, Paris, Francia
(1997)).
El desarrollo de anticuerpos dirigidos contra la
asparaginasa de E. coli (EC) y la
PEG-asparaginasa modificada en pacientes está
asociado con la neutralización de la actividad enzimática de las
asparaginasas de EC y PEG in vivo, por tanto, potencialmente
dando como resultado un pronóstico clínico adverso.
En el documento LU 59710A se ha descrito un
procedimiento para acilar L-asparaginasas, en
particular asparaginasas de origen bacteriano. Se ha observado que
las L-asparaginasas aciladas de este modo tienen una
mayor semivida y una menor tendencia a coagular.
Es objeto de esta invención resolver los
problemas anteriores proporcionando una forma alternativa de
asparaginasa terapéuticamente eficaz e inmunológicamente separada,
es decir, asparaginasa acilada de W. succinogenes o un
análogo del mismo. Tales asparaginasas y su preparación se describen
con detalle más adelante y pueden usarse para tratar pacientes que
sufren enfermedades que responden a la privación de asparagina como
tratamiento de primera línea o, como alternativa, para tratar
pacientes que previamente habían desarrollado hipersensibilidad a
otras asparaginasas microbianas, por ejemplo la derivada de E.
coli, y/o formas modificadas de asparaginasas que no sean de
W. succinogenes, por ejemplo asparaginasa pegilada de E.
coli o de E. carotovora.
A menos que expresamente se defina otra cosa, los
términos usados en la presente memoria descriptiva se entenderán
según su significado habitual en la técnica, aunque se entenderá que
los siguientes términos tienen los siguientes significados, a menos
que se indique otra cosa.
Un "análogo" de una proteína, por ejemplo
asparaginasa, se refiere a un polipéptido que difiere de algún modo
de su forma o formas naturales. Por ejemplo, un análogo de
asparaginasa se referirá a una enzima en la que se han producido
deleciones en uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
natural. Por otro lado, uno o más residuos aminoacídicos pueden
estar sustituidos con un aminoácido diferente. Otros análogos
incluyen aquellos en los que se han añadido aminoácidos adicionales
a la secuencia nativa. Por ejemplo, se pueden añadir uno o más
aminoácidos al extremo amino y/o al extremo carboxi de la enzima, o
insertarse entre residuos de aminoácidos internos. Tales análogos se
pueden preparar mediante cualquier técnica adecuada, aunque
normalmente se usará la modificación de un gen recombinante para que
codifique el o los cambios deseados. Las enzimas de la presente
invención tienen uno o más residuos aminoacídicos derivados, es
decir acilados.
Una "secuencia de aminoácidos contigua
única" significa una secuencia de aminoácidos que no se encuentre
en una proteína o un polipéptido natural. Por tanto, una
"secuencia de aminoácidos contigua única de Wolinella
succinogenes" se refiere a una secuencia que contiene una o
más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en
comparación con la región correspondiente de la enzima nativa.
Una "enfermedad que responde a la depleción de
asparagina" se refiere a una afección en la que las células
responsables de la enfermedad carecen o tienen una capacidad
reducida para sintetizar asparagina. La depleción o privación de
asparagina en tales células puede ser parcial o sustancialmente
completa, siempre que se alcance el beneficio terapéutico deseado.
En ciertas formas de realización, se produce una depleción de más de
aproximadamente el 50% de asparagina en suero, preferentemente mayor
de aproximadamente el 75%, siendo lo más preferido una depleción de
más del 95%. Entre los ejemplos representativos de enfermedades que
responden a la depleción o privación de asparagina se incluyen
ciertas enfermedades malignas, particularmente enfermedades
hematológicas malignas, incluidos linfomas, leucemias y mielomas.
Entre los ejemplos concretos de leucemias tratables según la
invención se incluyen leucemia linfoblástica aguda (LLA) leucemias
no linfoblásticas agudas, leucemias de células B y células T,
leucemias crónicas y leucemia indiferenciada aguda. Entre las
enfermedades hematológicas no malignas representativas que responden
a la depleción de asparagina se incluyen enfermedades de la sangre
mediadas por el sistema inmunológico, por ejemplo enfermedades
infecciosas tales como las producidas por la infección por VIH (es
decir, SIDA). Las enfermedades no hematológicas asociadas con
dependencia de asparagina incluyen enfermedades autoinmunitarias,
por ejemplo artritis reumatoide, LES autoinmunitario, enfermedades
vasculares del colágeno, SIDA, etc. Otras enfermedades
autoinmunitarias incluyen osteoartritis, síndrome de Issac,
psoriasis, diabetes mellitus insulinodependiente, esclerosis
múltiple, panencefalitis esclerosante, lupus eritematoso sistémico,
fiebre reumática, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo,
colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), cirrosis biliar primaria,
hepatitis crónica activa, glomerulonefritis, miastenia gravis,
pénfigo vulgar y enfermedad de Graves. A pesar de lo anterior, las
células responsables de cualquier enfermedad que responden, por
ejemplo detienen su proliferación, se vuelven senescentes, sufren
apoptosis y mueren, etc., a la depleción de asparagina pueden
tratarse según los presentes procedimientos. Como los expertos en la
técnica apreciarán, las células que se piensa que producen
enfermedad pueden someterse a pruebas para determinar la dependencia
de asparagina en cualquier ensayo in vitro o in vivo,
por ejemplo un ensayo in vitro en el medio de crecimiento
carece de asparagina.
Un "paciente" se refiere a un animal
afectado por una enfermedad que responde a la depleción de
asparagina. Normalmente, los pacientes tratados según los presentes
procedimientos son mamíferos, por ejemplo, animales bovinos,
caninos, equinos, felinos, ovinos, porcinos y primates,
particularmente seres humanos.
Un "vector de expresión" se refiere a un
ácido nucleico, normalmente un plásmido, en el que se pueden clonar,
y posteriormente expresar, genes heterólogos de interés. Para la
expresión, tales vectores generalmente se introducen mediante
cualquier técnica adecuada. Entre las técnicas preferidas se
incluyen transformación, electroporación, transfección e
introducción balística (por ejemplo, "disparo génico").
Dependiendo del vector usado, entre las células huésped adecuadas
para la expresión del gen o los genes heterólogos deseados se
incluyen célula procarióticas y eucarióticas. Las células
procarióticas preferidas son células bacterianas competentes para la
transformación, tales como cepa de E. coli y DH5\alpha y JM
109. Entre las células huésped eucarióticas preferidas se incluyen
líneas de células de mamíferos y levaduras. Como aquellos expertos
en la técnica apreciarán, el sistema celular de expresión
vector/huésped seleccionado para la expresión del gen heterólogo
deseado depende de muchos factores, y se deja al experto en la
técnica determinarlos en circunstancias particulares. De igual
forma, las condiciones requeridas para la expresión del gen deseado
a partir de un vector de expresión que lo lleva depende de muchos
factores, incluyendo el tipo de célula huésped, el promotor o
promotores y otros elementos de la regulación de la transcripción
empleados, los medios (o el medio) usados, etc. De nuevo, la
selección realizada en una determinada circunstancia está a
discreción del experto en la técnica implicado, y el concreto
empleado está fácilmente dentro de las habilidades de tal persona,
dada la descripción en la presente memoria descriptiva.
Una proteína que es "biológicamente activa"
es una que tiene al menos una de las actividades biológicas de la
correspondiente proteína nativa, aunque el grado de la actividad
exhibida puede diferir del de la proteína nativa. Por ejemplo, un
análogo de W. succinogenes según la invención puede tener una
actividad específica mayor, una semivida en suero más larga, etc.,
que la forma nativa de la proteína.
Una proteína que comprende un "marcador
epítopo" se refiere a una que tiene uno o más, preferentemente
dos o más, aminoácidos adicionales covalentemente unidos en ella,
cuyo marcador tiene un epítopo separado que puede ser reconocido por
otra proteína, por ejemplo, un anticuerpo que se une a ese epítopo,
preferentemente con una afinidad elevada, una proteasa que actúa
dentro o alrededor de la secuencia de aminoácidos específica (por
ejemplo, DAPI, catepsina-C) etc. Por ejemplo, como
se usa en la presente memoria descriptiva un "marcador de epítopo
N terminal" se puede referir a un péptido unido al extremo N de
una proteína, en el que el péptido tiene una conformación reconocida
por un anticuerpo concreto. Tal péptido y su correspondiente
anticuerpo o anticuerpos se pueden usar para purificar con rapidez
el polipéptido al cual el péptido está unido mediante técnicas
estándar de cromatografía de afinidad. Tales anticuerpos, y
cualquier otro usado en la práctica de esta invención (por ejemplo,
para dirigirlos hacia vehículos de liberación génica) pueden
prepararse usando técnicas ampliamente conocidas en la técnica. Por
ejemplo, véase Harlow y Lane en Antibodies, a Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. También se pueden
incluir marcadores de epítopo en el extremo C de la proteína y en
regiones internas en las que la inserción de tal marcador no afecta
de forma sustancial y adversa a la actividad biológica o a las
propiedades farmacocinéticas de la enzima.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de
una proteína (por ejemplo, una asparaginasa o un análogo de la
misma) significa la cantidad requerida para producir el efecto
terapéutico deseado. Por supuesto, la cantidad real requerida
depende de muchos factores, tales como la enfermedad que se va a
tratar, la progresión de la enfermedad, la edad, el tamaño y el
estado físico del paciente, como se comenta con más detalle más
adelante.
Con la expresión "alterar una propiedad
farmacocinética de una proteína" se quiere decir que una
propiedad de un fármaco varía a medida que actúa en el organismo en
un periodo de tiempo, por ejemplo, semivida en suero, tasa de
aclaramiento, biodistribución, inmunogenicidad, etc. Tal alteración
puede ser un aumento o una disminución de la propiedad que se está
investigando.
En un aspecto, la invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende asparaginasa acilada de
Wolinella succinogenes y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. La asparaginasa acilada recombinante y nativa de W.
succinogenes se puede purificar y formular en una composición
farmacéutica. La purificación se puede llevar a cabo mediante
cualquier procedimiento adecuado. Tales procedimientos normalmente
implican procedimientos de purificación por afinidad y/o técnicas de
separación por tamaño. Tras la purificación, el polipéptido acilado
se puede formular en una composición farmacéutica que comprende la
enzima y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales
composiciones según la invención pueden administrarse a un paciente
de forma tal que libere una cantidad terapéuticamente eficaz de la
enzima. En ciertas formas de realización, tales composiciones
permiten la liberación oral, mientras que otras formas de
realización permiten la liberación transdérmica o transmucosa. Entre
las formas de realización preferidas se incluyen aquellas
pretendidas para inyección parenteral, por ejemplo, por vía
intramuscular, intravenosa o subcutánea.
La invención se refiere a asparaginasa de W.
succinogenes (derivada de una fuente natural o recombinante) y
análogos de la misma, y a procedimientos para producirla, que se ha
modificado covalentemente para incluir una fracción química acilo
que no se encuentra en la enzima natural.
Las formas recombinantes de asparaginasa de W.
succinogenes puede prepararse como se ha descrito anteriormente,
aunque cuando se usa una forma no análoga para derivar, el ácido
nucleico que codifica la proteína codificará una forma madura de la
enzima nativa.
La invención se refiere a una modificación
covalente, es decir acilación de formas nativas y/o recombinantes de
asparaginasa de W. succinogenes. Ciertas formas de
realización de este aspecto se refieren a una o más modificaciones
covalentes para facilitar el aislamiento/purificación de formas
recombinantes de la enzima. Otras formas de realización tratan de
modificaciones covalentes que alteran la especificidad del sustrato,
la inmunorreactividad, la biodistribución, la semivida en suero,
etc.
Otro aspecto de la presente invención está
dirigido al uso terapéutico de formas nativas y/o recombinantes de
asparaginasa acilada de W. succinogenes en la fabricación de
medicamentos para el tratamiento de enfermedades que responden a la
depleción de asparagina, incluyendo ciertas neoplasias (por ejemplo,
leucemia linfoblástica aguda (LLA) y leucemia indiferenciada aguda),
así como en el tratamiento de varias enfermedades hematológicas no
malignas y autoinmunitarias que responden a la depleción de
asparagina. Entre las enfermedades malignas representativas que
pueden tratarse de este modo usando composiciones farmacéuticas de
la presente invención se incluyen ciertas enfermedades
hematológicas, por ejemplo, linfomas, leucemias y mielomas,
incluyendo las fases crónicas y agudas. Entre las enfermedades no
malignas representativas que pueden tratarse de acuerdo con la
presente invención se incluyen enfermedades autoinmunitarias, por
ejemplo, artritis (por ejemplo artritis reumatoide), LES y SIDA.
Normalmente, las composiciones se aplicarán a seres humanos
afectados por una enfermedad que responde a la depleción de
asparagina, aunque otras clases de pacientes, particularmente
mamíferos (por ejemplo, animales bovinos, caninos, equinos, felinos,
ovinos, porcinos y primates que sufren una enfermedad que responde a
la depleción de asparagina se pueden tratar de igual forma.
Para la expresión de asparaginasa de W.
succinogenes y análogos de la misma se prefieren los sistemas de
producción microbianos, en particular sistemas de células
bacterianas, levaduras y de mamíferos. Otro aspecto se refiere a
procedimientos de derivación de polipéptidos usando acilación. Las
formas de realización preferidas de este aspecto se refieren a la
acilación de asparaginasas purificadas, particularmente
asparaginasas de W. succinogenes (derivados de fuentes
naturales y recombinantes) y análogos de las mismas. Se han descrito
procedimientos para alterar una propiedad farmacocinética de una
proteína (por ejemplo, asparaginasa, en particular asparaginasa de
W. succinogenes o un análogo de la misma) mediante la
acilación de la proteína.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de los siguientes figuras, descripción
detallada, ejemplos y reivindicaciones.
La presente invención puede entenderse mejor y
sus ventajas apreciarse por aquellos expertos en la técnica
relevante haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las
que:
Figura 1: Ilustra las secuencias de nucleótidos
de los cebadores de PCR directos [SEC ID Nº 1] e inversos [SEC ID Nº
2] usados en la amplificación de las secuencias genómicas de
L-asparaginasa de W. succinogenes.
Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa de ADN
genómico de W. succinogenes marcado con yoduro de propidio
(carriles 1 y 2) y un fragmento de ADN de 1,0 kb derivado de la
amplificación por PCR. Los carriles 3 y 4 son los marcadores de peso
molecular del ADN. El carril 5 es el fragmento de PCR específico de
W. succinogenes de 1,0 kb amplificado usando los dos
cebadores de PCR que se muestran en la figura 1. El carril 6
contiene un marcador de peso molecular de ADN \PhiX174.
Figura 3: Análisis por enzimas de restricción de
4 colonias que se aislaron tras la inserción del fragmento de PCR de
1,0 kb específico de W. succionogenes en el vector PCR II. El
ADN de 1,0 kb se digirió con BamHI (carriles 2-5);
EcoRI (carriles 6-9) y BamHI y EcoRI (carriles
10-13). El carril 14 representa una escalera de
pesos moleculares de ADN. El fragmento de ADN de 1,0 kb específico
de W. succinogenes se representa con una flecha.
Figura 4: Electroforesis en gel de agarosa de los
fragmentos de ADN amplificados de los clones "positivos"
seleccionados usando cebadores específicos de asparaginasa de W.
succinogenes. Los carriles 1 y 7 son marcadores de peso
molecular. Los carriles 2 y 4 representan ADN extraído de las
colonias bacterianas nº 1 y nº 3 de los carriles 2 y 4 de la Figura
3. El carril 6 representa una muestra del producto de la
amplificación por PCR de las asparaginasa de W. succinogenes
(amplificado a partir del ADN genómico de W. succinogenes de
la Figura 2, carril 5) usado en la reacción de ligación inicial.
Debe observarse que se ha mostrado que el fragmento clonado en el
vector PCR II es de exactamente el mismo tamaño (es decir, 1,0 b)
que el producto de amplificación de PCR inicial.
Figura 5: Ilustra los resultados de una
determinación de la actividad antitumoral de las asparaginasas de
W. succinogenes (WS), E. coli (EC) y E.
carotovora (Erw) frente a tumores generados por la inyección
subcutánea de 6C3HED células Gardner de linfosarcoma en ratones C3H.
La actividad antitumoral se midió como una función del volumen del
tumor medido con compás (cm^{3}). El control negativo consistió en
inyecciones de tampón fosfato 0,01 M (pH 7,0= en ratones C3H usando
el mismo programa de inyección que para las asparaginasas.
Figura 6: Ilustra la secuencia de ADN [SEC ID Nº
3] del inserto de ADN modificado específico de la asparaginasa de
W. succinogenes. Esta secuencia contiene, no sólo la
secuencia codificadora de la asparaginasa de W. succinogenes
nativa (comenzando con el codón 40 de la figura 6 y no incluyendo
los 23 últimos nucleótidos del extremo 3' de la figura 6), sino
también 39 codones del "marcador" del epítopo en el extremo N
que se muestra en la figura 6.
Figura 7: Es una representación esquemática de
una modificación química para una proteína, por ejemplo,
asparaginasa de W. succinogenes.
Figura 8: Ilustra la ausencia de reactividad
cruzada entre diferentes diluciones del plasma de un paciente del
que se sabe que contiene títulos elevados de anticuerpos
neutralizantes frente a la asparaginasa de E. coli y la
enzima de W. succinogenes.
Figura 9: Ilustra la ausencia de reactividad
cruzada entre diferentes diluciones de títulos elevados de
anticuerpos neutralizantes policlonales frente a la asparaginasa de
E. coli y la asparaginasa derivada de W.
succinogenes.
Esta invención se basa en el descubrimiento de
que la asparaginasa acilada de W. succinogenes se puede usar
como una forma alternativa de tratamiento con asparaginasa en
pacientes con enfermedades que responden a la depleción de
asparagina, en particular aquellos que se han sensibilizado a otras
enzimas microbianas por un tratamiento previo. Además, si es
necesario, es muy probable que los pacientes tratados inicialmente
con asparaginasa de W. succinogenes que posteriormente
desarrollan hipersensibilidad a esta enzima sean capaces de recibir
un análogo inmunológicamente distinto de la asparaginasa de W.
succinogenes.
Como se ha comentado anteriormente, se ha
mostrado que el uso clínico de las asparaginasas aisladas de E.
coli, E. carotovora y asparaginasa de E. coli modificada
con PEG en el tratamiento de la leucemia da como resultado un amplio
intervalo de toxicidad para el huésped (por ejemplo, disfunción
hepática, renal, esplénica, pancreática y coagulación sanguínea),
inmunosupresión pronunciada y que da lugar a una reacción
inmunológica de tipo alérgica con la formación simultánea de
anticuerpos neutralizantes, todo lo cual sirve para reducir de forma
marcada la eficacia terapéutica de estas asparaginasas microbianas
mencionadas anteriormente.
Por tanto, la asparaginasa acilada de W.
succinogenes, particularmente la asparaginasa acilada
recombinante de W. succinogenes o un análogo de las misma,
proporcionará a los pacientes una asparaginasa alternativa
inmunológicamente distinta, y permitirá a la mayoría de los
pacientes completar todo el curso del tratamiento con asparaginasa,
que es de suma importancia para la posible "cura" de su
enfermedad, por ejemplo, leucemia. Además, los datos experimentales
proporcionados en la presente memoria descriptiva establece que la
forma recombinante de la asparaginasa de W. succinogenes
exhibe propiedades bioquímicas, farmacológicas e inmunológicas
sustancialmente similares, y quizá idénticas, a las de la forma
homotetramérica nativa de la enzima.
Como se ha comentado previamente, a pesar de su
utilidad terapéutica, el tratamiento con asparaginasa microbiana
usando asparaginasas de E. coli, E. coli modificada
con PEG o de E. carotovora tiene numerosas limitaciones
clínicas distintas, incluyendo: (1) toxicidad hepática, renal,
pancreática, del SNC y de la coagulación sanguínea; (2) la causa de
una marcada inmunosupresión; y (3) provocan una reacción alérgica y
la producción de anticuerpos neutralizantes de asparaginasa. Por el
contrario, en el tratamiento con asparaginasa acilada de W.
succinogenes estas limitaciones están muy atenuadas o no
existen, lo que convierte a esta enzima en altamente eficaz en, por
ejemplo, el tratamiento de enfermedades hematológicas malignas y
otros trastornos asociados con dependencia de asparagina.
En la presente memoria descriptiva se describen
metodologías para aislar la asparaginasa homotetramérica
"nativa" de W. succinogenes que posee potentes
actividades antineoplásicas y para la producción (usando vectores de
expresión recombinantes) de rWS y sus análogos, es decir, aquellas
que se han acilado y aquellas que se han modificado para que
incluyan aminoácidos adicionales o alternativos que se han acilado.
En ciertas formas de realización preferidas, la enzima rWS es una
forma recombinante de la asparagina homotetramérica nativa de W.
succinogenes (anteriormente V. succinogenes; véase
Durden, D. L., A glutaminase-free asparaginase from
Vibrio succinogenes lacking immunosuppression and toxicity,
Ph. D. Dissertation, University of Miami Medical
School (1983); Durden, D. L. & Distasio, J. A., Characterization
of the effects of asparaginase from E. coli and a
asparaginase from Vibrio succinogenes, 40 Cancer Res. 1125
(1980)).
La secuencia de nucleótidos que codifica el gen
de W. succinogenes se determinó en 1995, además de varios
cientos de bases de las regiones adyacentes 5' y 3' (véase
número de acceso GenBank X89215). También se han descrito la
secuencia de aminoácidos y la estructura tridimensional de la
enzima. Véase Lubkowski, y col., Eur. J. Biochem.,
vol. 241: 201-207 (1996).
Como se ha comentado anteriormente, se ha
mostrado que la asparaginasa de W. succinogenes es
inmunológicamente distinta de la enzima de E. coli
(véase Distasio, J. A. & Niederman, T. (1976),
supra). Además, los resultados previos han establecido que la
asparaginasa de W. succinogenes no suprime la respuesta
inmunológica humoral o mediada por células al antígeno dependiente
de células T, HC, incluso cuando se administra a dosis 5 veces
mayores que los niveles de la enzima de E. coli que son
capaces de anular estas respuestas (véase Durden. D. L. &
Distasio, J. A., Characterization of the effects of asparaginases
from Escherichia coli and a asparaginase from Vibrio
succinogenes on specific cell-mediated
cytotoxicity, 27 Int. J. Cancer 59 (1981); Durden, D. L.
& Distasio, J. A. (1980), supra).
Las siguientes secciones elaboran algunos de los
diversos efectos bioquímicos y fisiológicos del uso clínico de la
terapia con asparaginasa en el tratamiento de enfermedades malignas
asociadas con dependencia de asparagina, en particular, enfermedad
hematológica.
El estudio de los efectos del tratamiento con
asparaginasa de E. coli sobre la histología del bazo y las
poblaciones de linfocitos ha mostrado que causa una reducción
marcada del tamaño y la reactividad de los centros germinales
esplénicos, cuyos cambios se asocian de forma concomitante con una
marcada reducción de las células que contienen inmunoglobulinas
citoplásmicas (inmunoblastos de células B; véase Distasio, J.
A., y col. (1982), supra). Además, se sabe que las
subpoblaciones linfocitarias en el bazo muestran una reducción de
hasta un 40% del porcentaje de células que expresan inmunoglobulinas
en la superficie (células B) acompañado con un aumento de la
proporción de células que expresan Thy-1.2 (células
T), mientras que la proporción de Lyt-2 y
Lyt-1 permanece invariable. Por el contrario, la
privación de asparagina sola, causada por la administración de
asparaginasa de W. succinogenes, no tiene ningún efecto
demostrable sobre la histología del bazo o la distribución del
marcador linfocitario.
De igual modo, el examen histológico del timo
tras la administración de asparaginasa de E. coli reveló una
depleción pronunciada de timocitos corticales, mientras que no se
observaron cambios en la histología o celularidad del timo tras la
administración de asparaginasa de W. succinogenes. Por tanto,
una comparación de los efectos de la administración a largo plazo
sobre la histología, celularidad y peso del bazo y del timo indicó
que el tratamiento con asparaginasa de E. coli estaba
asociado con una reducción marcada y sostenida de estos parámetros
en el bazo y en el timo.
La hepatotoxicidad es la principal toxicidad
clínica asociada con la administración terapéutica de las
asparaginasas de E. coli y de E. carotovora (véase
Broome, J. D., Factors which may influence the effectiveness of
L-asparaginase as tumor inhibitors, 22 Br. J.
Cancer. 595 (1969)).Los efectos hepatotóxicos de estas dos
enzimas microbianas se comparó con los asociados con la
administración de asparaginasa de W. succinogenes
(véase Durden, D. L. y col. Kinetic analysis of
hepatotoxicity associated with anti-neoplastic
asparaginases, 43 Cancer Res. 1602 (1983); Distasio, J. A.,
y col., Glutaminase-free asparaginase from
Vibrio succinogenes: an anti-lymphoma enzyme
lacking hepatotoxicity, 30 Int. J. Cancer 343 (1982)).
La administración de 50 UI de asparaginasa de
E. coli a ratones Balb/c durante 4 días dio como resultado
una infiltración difusa de micrograsa en los hepatocitos en todo el
hígado. Por el contrario, el estudio microscópico de secciones
transversales de ratones Balb/c tratados con asparaginasa de W.
succinogenes mostró una histología hepática idéntica a la que
presentó el grupo de animales control. La cuantificación de la
cantidad total de lípidos extraíbles del hígado de ratones Balb/c
tratados con asparaginasa de E. coli indicó un aumento del
45% y del 127% de la concentración de lípidos, en comparación con el
grupo de animales control tras 4 y 5 días de tratamiento,
respectivamente. La administración de asparaginasa de W.
succinogenes no produjo ningún cambio cuantitativo en la
cantidad total de lípidos hepáticos extraíbles en comparación con el
grupo de animales control. Además, se mostró que la concentración
plasmática de albúmina, triglicéridos y colesterol, así como la
actividad de antitrombina III disminuyeron en ratones Balb/c como
resultado de la administración de asparaginasa de E. coli, lo
que confirma la hepatotoxicidad. Se encontró que los niveles
plasmáticos de antitrombina III no variaban al administrar
asparaginasa de W. succinogenes y, mientras que se encontró
que las concentraciones plasmáticas de lípidos disminuían
mínimamente, sólo los niveles de colesterol se vieron alterados de
forma estadísticamente significativa en comparación con los niveles
exhibidos por los animales control.
Además, los efectos hepatotóxicos observados de
la administración a largo plazo de asparaginasas de E. coli y
de E. carotovora se compararon con los de la asparaginasa de
W. succinogenes. Los resultados obtenidos del modelo murino
Balb/c demostraron que la hepatotoxicidad asociada con la
administración de asparaginasa de E. coli era paralela a la
hepatotoxicidad observada en seres humanos, con un aumento rápido de
los niveles totales de lípidos hepáticos extraíbles y una
disminución concomitante de los niveles plasmáticos de albúmina,
triglicéridos y colesterol, así cono la actividad de antitrombina
III en la primera y segunda semanas de tratamiento, seguido por la
vuelta a la función hepática normal durante las semanas 3 y 4. La
administración de asparaginasa de E. carotovora se asoció con
un nivel intermedio de hepatotoxicidad, con un aumento de la
concentración de lípidos totales hepáticos extraíbles que se produce
durante la segunda y la cuarta semana de tratamiento. Por el
contrario, no se encontró una asociación entre el tratamiento
prolongado de ratones Balb/c con asparaginasa de W.
succinogenes y ninguna hepatotoxicidad demostrable. Estos
resultados procedentes de la administración a largo plazo sugieren
que la hepatotoxicidad observada puede ser un resultado directo de
la depleción fisiológica combinada de asparagina y glutamina.
Se determinó la actividad antineoplásica relativa
(antilinfoma) de las asparaginasas nativas homotetraméricas de E.
coli, E. carovotora y W. succinogenes frente a
linfosarcoma de Gardner 6C3HED, que se habían implantado previamente
en ratones C3H. Los resultados de este estudio se ilustran en la
figura 5.Todos los animales del grupo control que sólo reciben
tampón fosfato 0,01M murieron en los 20 días posteriores a la
implantación inicial del tumor.
La administración de asparaginasa de E. coli
o de W. succinogenes dio como resultado una remisión
completa del linfosarcoma en el 100% de los animales. Los animales
se sometieron a análisis durante 60 a 90 días tras la implantación
inicial del tumor sin que se observaran signos de tumor. De igual
forma, se demostró que los animales seguidos por periodos de tiempo
más largos tenían una longevidad normal sin recurrencias del tumor.
Sin embargo, como se ha comentado anteriormente, el uso de
asparaginasa de E. coli está asociado con toxicidad e
inmunosupresión que limita de forma marcada su capacidad para usarse
en el tratamiento de la enfermedad neoplásica.
La administración de asparaginasa de E.
carotovora dio como resultado una regresión inicial, seguida por
una fase de proliferación rápida del tumor. Todos los animales
murieron (mortalidad del 100%) a causa del desarrollo del
linfosarcoma en los 30 días posteriores a la implantación tumoral.
Usando el tumor linfosarcoma P1798 en ratones Balb/c se obtuvieron
resultados similares.
Como se ha comentado anteriormente, los pacientes
tratados con asparaginasas de E. coli y de E.
carotovora con frecuencia desarrollan reacciones inmunológicas
de hipersensibilidad de tipo retardado con la producción
concomitante de anticuerpos neutralizantes dirigidos frente a la
enzima asparaginasa específica. Además, con el uso de asparaginasa
de E. coli en el tratamiento de la leucemia linfoblástica
aguda (LLA) de la infancia, este fenómeno mencionado ha dado lugar a
una pérdida de la eficacia del fármaco/ enzima y, en algunos casos,
a una recurrencia de la leucemia. Esta inmunorreactividad ha llevado
a buscar procedimientos para disminuir la inmunogenicidad de las
asparaginasas y para desarrollar otras formas sin reactividad
cruzada de esta enzima, para su uso clínico.
Se ha demostrado en estudios que la forma
homotetramérica nativa de asparaginasa de W. succinogenes no
presenta reacciones cruzadas inmunológicas con las asparaginasas de
E. coli (EC) o de E. carotovora (Erw)(véase
Distasio, J. & Niedennan, A., Purification and characterization
of L-asparaginasa with anti-lynphoma
activity from Vibrio succinogenes, 251 J. Biol. Chem.
6929 (1976). En la presente memoria descriptiva, se describen
experimentos para evaluar la reactividad cruzada inmunológica de las
formas nativas homotetramérica (WS) y formas recombinantes (rWS) de
asparaginasa de W. succinogenes usando el suero o el plasma
de los pacientes de los que se sabe que tienen anticuerpos
neutralizantes frente a las asparaginasas de EC o de Erw. Además, se
ha valorado la capacidad del suero o plasma de los pacientes (que
antes se había demostrado que eran alérgicos a la asparaginasa EC)
parra que sufran reacciones cruzadas con EC, Erw, WS y rWS, usando
un sistema de ensayo de inmunodifusión doble. En estudios reciente
se sugiere que la detección subclínica de anticuerpos
antiasparaginasa EC en pacientes tratados con enzima derivada de EC
está asociada con una pérdida de eficacia de las asparaginasas EC y
PEG in vivo (véase Avramis, V. & Periclou, I (1997),
supra).
Los resultados experimentales descritos en la
presente memoria descriptiva demuestras que es muy probable que los
anticuerpos fabricados en respuesta a la xenoinmunización en seres
humanos y conejos frente a asparaginasas de EC y Erw no sufran
reacciones cruzadas con la asparaginasa de WS o de rWS, ni
neutralizarán la actividad enzimática de cualquier forma de la
enzima in vivo o in vitro. De igual modo, estos
resultados también sirven para establecer que los anticuerpos
dirigidos contra la asparaginasa de EC o PEG en seres humanos no
sufrirá reacciones cruzadas o neutralizará la asparaginasa de WS o
de rWS. En conjunto, estos datos han sido útiles para desarrollar
los fundamentos para una aplicación clínica eficaz de la
asparaginasa de WS o de rWS (o análogos de la misma) en pacientes
que han desarrollado previamente una hipersensibilidad con base
inmunológica a las asparaginasas de EC y/o PEG.
Además, debido a las actividades inmunosupresoras
intrínsecas y antimetabólicas, la asparaginasa acilada de WS y/o de
rWS de la invención (o sus análogos) también se pueden usar en el
tratamiento terapéutico de varias enfermedades autoinmunitarias tal
como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, SIDA, etc.
Aunque la asparaginasa de WS tiene menos actividad inmunosupresora
que la asparaginasa de EC, el nivel inferior de la toxicidad
asociada para el huésped la convierte en ideal para uso clínico en
enfermedades no malignas que responden a la depleción de
asparagina.
Muchas de las proteínas que se usan en la
actualidad para tratar enfermedades humanas tienen semividas en la
circulación extremadamente cortas que limitan su eficacia. Además,
la administración de muchas proteínas extrañas (incluyendo ciertas
proteínas recombinantes) está asociada con respuestas de
hipersensibilidad alérgica, que también puede conducir a la
producción de anticuerpos neutralizantes que aceleran la rápida
eliminación del plasma de estas proteínas terapéuticas. Para superar
estos y otros problemas, se usa un procedimiento de modificación
covalente para acilar la asparaginasa de W. succinogenes, con
el fin de extender su semivida, reducir su inmunogenicidad y
aumentar su eficacia. Este régimen de modificación química implica
la alteración sistemática de la estructura proteica mediante la
conjugación de una cadena de hidrocarburo alifático (saturado,
parcialmente saturado, o insaturado, una cadena lineal, una cadena
ramificada y/o una cadena aromática) de un agente acilante con
grupos polares dentro de la estructura proteica (véase la figura 7).
Más adelante se describen las condiciones para modificar
covalentemente la asparaginasa de E. coli y de W.
succinogenes usando un cloruro ácido.
Como se ha descrito anteriormente, la
asparaginasa acilada de W. succinogenes (y sus análogos) se
puede usar para tratar las enfermedades que responden a la depleción
de asparagina. Asimismo, se puede usar para tratar tales
enfermedades profilácticamente o para tratar a los pacientes
previamente diagnosticados y tratados para tal enfermedad. Por
ejemplo, un paciente con un diagnóstico previo y tratado con éxito
de leucemia, o cuya enfermedad está en remisión, puede sufrir
recaídas. Tales pacientes también pueden tratarse con un medicamento
según la invención.
La asparaginasa acilada de W.
succinogenes, y sus análogos biológicamente activos, puede
administrarse a un paciente usando técnicas estándar. Por lo
general, las técnicas y formulaciones pueden encontrarse en
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing
Co., Easton, PA, 1990.
Las formas de dosificación adecuadas dependen, en
parte, del uso o de la vía de entrada, por ejemplo oral,
transdérmica, transmucosa o mediante inyección (parenteral). Tales
formas de dosificación deberían permitir al agente terapéutico
alcanzar una célula blanco o, de otro modo, tener el efecto
terapéutico deseado. Por ejemplo, preferentemente, las composiciones
farmacéuticas inyectadas en la circulación sanguínea son
solubles.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención pueden formularse en forma de sales farmacéuticamente
aceptables y complejos de las mismas. Las sales farmacéuticamente
aceptables son sales inocuas presentes en las cantidades y
concentraciones a las que se administran. La preparación de tales
sales puede facilitar el uso farmacéutico mediante la alteración las
características físicas del compuesto sin impedirle ejercer su
efecto fisiológico. Entre las alteraciones útiles de las propiedades
físicas se incluyen la reducción del punto de fusión para facilitar
la administración transmucosa y el aumento de la solubilidad para
facilitar la administración de concentraciones más elevadas del
fármaco. La sal farmacéuticamente aceptable de una asparaginasa
puede presentarse como un complejo, como apreciarán los expertos en
la técnica.
Entre las sales farmacéuticamente aceptables se
incluyen sales de adición de ácido tales como las que contienen
sulfato, clorhidrato, fumarato, maleato, fosfato, sulfamato,
acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato,
etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato,
ciclohexilsulfamato y quinato. Las sales farmacéuticamente
aceptables pueden obtenerse a partir de ácidos, incluyendo ácido
clorhídrico, ácido maleico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido
sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido
tartárico, ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido
etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido
p-toluenosulfónico, ácido ciclohexilsulfámico, ácido fumárico
y ácido quínico.
Entre las sales farmacéuticamente aceptables
también se incluyen sales de adición de bases tales como las que
contienen benzatina, cloroprocaína, colina, dietanolamina,
etilendiamina, meglumina, procaína, aluminio, calcio, litio,
magnesio, potasio, sodio, amoniaco, alquilamina y zinc, cuando están
presentes grupos funcionales ácidos, tales como ácido carboxílico o
fenol. Por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences,
supra. Tales sales pueden prepararse usando las bases adecuadas
correspondientes.
En la composición farmacéutica según la invención
también pueden incorporarse vehículos y/o excipientes
farmacéuticamente aceptables para facilitar la administración de la
asparaginasa concreta. Ejemplos de vehículos adecuados para usar en
la práctica de la invención incluyen carbonato cálcico, fosfato
cálcico, varios azúcares tales como lactosa, glucosa o sacarosa, o
tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites
vegetales, polietilenglicoles y disolventes fisiológicamente
compatibles. Ejemplos de disolventes fisiológicamente compatibles
incluyen soluciones estériles de agua para inyectar (API), solución
salina y dextrosa.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención pueden administrarse por diferentes vías, incluyendo la
administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea,
intramuscular, oral, tópica (transdérmica) o transmucosa. Para la
administración sistémica, se prefiere la administración oral. Para
la administración oral, por ejemplo, los compuestos pueden
formularse en formas de dosificación oral convencionales, tales como
cápsulas, comprimidos y preparaciones líquidas como jarabes,
elixires y gotas concentradas.
Por otro lado, se puede usar la inyección
(administración parenteral), por ejemplo inyección intramuscular,
intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, las
composiciones farmacéuticas se formulan en soluciones líquidas,
preferentemente en tampones o soluciones fisiológicamente
compatibles tales como solución salina, solución de Hank o solución
de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse en forma sólida
y volverse a disolver o suspender justo antes de su uso. Por
ejemplo, se pueden producir formas liofilizadas de la
asparaginasa.
Asimismo, la administración sistémica se puede
conseguir por medios transmucoso o transdérmicos. Para la
administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan
penetrantes adecuados para permeabilizar la barrera. Tales
penetrantes se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo,
para la administración transmucosa, sales biliares y derivados de
ácido fusídico. Además, se pueden usar detergentes para facilitar la
permeación. Por ejemplo, la administración transmucosa puede
realizarse mediante pulverizadores nasales, inhaladores (para
liberación pulmonar), supositorios rectales o supositorios
vaginales. Para la administración tópica, los compuestos pueden
formularse en ungüentos, pomadas, geles o cremas, como se conoce
bien en la técnica.
Las cantidades del agente terapéutico activo que
se va a administrar dependerá de muchos factores, incluyendo el
agente terapéutico concreto, por ejemplo, asparaginasa acilada de
W. succinogenes, las CI_{50} y CE_{50} del agente, la
semivida biológica del compuesto, la edad, el tamaño, el peso y el
estado físico del paciente, y la enfermedad o trastorno que se va a
tratar. La importancia de estos y otros factores que se deben
considerar es bien conocida para los expertos habituales en la
técnica. Generalmente, la cantidad de asparaginasa que se va a
administrar variará de aproximadamente 10 unidades internacionales
por metro cuadrado de superficie del cuerpo del paciente
(UI/m^{2}) a 50.000 UI/m^{2}, prefiriéndose un intervalo de
dosificación de aproximadamente 1.000 UI/m^{2} a aproximadamente
15.000 UI/m^{2} y, prefiriéndose particularmente un intervalo de
aproximadamente 6.000 UI/m^{2} a aproximadamente 10.000
UI/m^{2}, para tratar una enfermedad hematológica maligna, por
ejemplo leucemia. Normalmente, estas dosis se administran mediante
inyección intramuscular o intravenosa tres veces a la semana, por
ejemplo lunes, miércoles y viernes, durante el curso del
tratamiento. Por supuesto, pueden usarse otras dosis y/o regímenes
de tratamiento, según determine el médico que está tratando al
paciente.
Se cultivó W. succinogenes en
10-15 litros de medio de cultivo líquido con un 0,4%
de extracto de levadura, formiato amónico 100 mM y fumarato sódico
120 mM. El medio se ajustó a un pH de 7,2 antes de introducir en la
autoclave. Tras la esterilización en la autoclave, al medio de
cultivo a temperatura ambiente se añadió una solución de
tioglicolato esterilizada con filtro de 0,2 \mum, dando una
concentración final de 0,05%. Los cultivos se incubaron en agitación
continua en una plataforma de agitación en una habitación a una
temperatura de 37ºC. Para los cultivos a gran escala, se usó un
precultivo de 500 ml para inocular 10-15 litros de
medio de cultivo completo.
Las bacterias se recogieron después de que los
cultivos habían alcanzado una densidad óptica de aproximadamente 1,1
a 650 nm de longitud de onda, mediante centrifugación usando un
rotor de flujo continuo de alta velocidad Sorvall. Tras la
centrifugación, las células se lavaron en tampón con cloruro sódico
0,15M, cloruro magnésico 0,1M y mercaptoetanol 0,01M. Después, las
células se resuspendieron en tampón borato 0,1M (pH 9,0) a una
concentración final de 0,5 g de peso celular húmedo/ml de tampón
borato y se almacenaron congeladas hasta el posterior procesamiento
para la purificación enzimática.
Los modelos animales murinos usados en estos
experimentos fueron ratones Balb/C o C3H de 9 a 12 semanas de edad
(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
La actividad terapéutica de las
L-asparaginasas se determinó usando las líneas
celulares (ATCC)de linfosarcoma de Gardner 6C3HED (Gardner,
W. U., Cancer Res., vol. 4: 73 (1944)) y de linfosarcoma P
1798, como tumores ascíticos en ratones C3H y Balb/cc,
respectivamente. Por otro lado, las dos líneas celulares de
linfosarcoma se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con 10%
de suero bovino fetal. El linfosarcoma de Gardner 6C3HED se originó
en el timo de ratones C3H a los que se había administrado
inicialmente dosis elevadas de estradiol. Posteriormente, se
perpetuó el linfosarcoma mediante transplante seriado en los ratones
C3H.
El ADN genómico de W. succinogenes se
extrajo de bacterias cultivadas en medio basal. Normalmente, las
células bacterianas de un cultivo de 50 ml se recogieron por
centrifugación y se resuspendieron mediante agitación suave en un
vórtex en 1,5 ml de tampón TE (pH 7,0). A la suspensión celular se
añadieron 15 \mul de SDS al 10%, para dar una concentración final
de 0,1% y 3 \mul de una solución de reserva de 20 mg/ml de
proteinasa K. Después, la mezcla se incubó a 37ºC durante
aproximadamente 60 minutos, seguido por varias extracciones con
fenol/cloroformo. El ADN genómico se precipitó con etanol y se
recogió por centrifugación. El ADN genómico de W.
succinogenes aislado de este modo era lo bastante puro como para
usar en la amplificación por PCR en condiciones estrictas.
La secuencia de nucleótidos de un fragmento
HindIII de 2,5 kb que contiene la región codificadora de 993
nucleótidos de la asparaginasa de W. succinogenes se publicó
en 1995. Véase GenBank accession number X89215. La deducción
de esta secuencia facilitó la síntesis de cebadores específicos para
la amplificación por PCR del gen codificador de la enzima de W.
succinogenes. Como se ilustra en la Figura 1, los cebadores de
la PCR directos e inversos específicos de la asparaginasa de W.
succinogenes tenían las siguientes secuencias:
5'-TCCGGATCCAGCGCCTCTGTTTTGATGGCT-3'
Cebador OCR directo [SEC ID Nº 1] (BamHI Sitio de
restric-{}\hskip7.8cm ción
subrayado)
5'-TGGGAATTCGGTGGAGAAGATCTTTTGGAT-3'
Cebador PCR inverso [SEC ID Nº 2] (EcoRI Sitio de
restric-{}\hskip7.9cm ción
subrayado)
Debe observarse que la secuencia genómica
codificadora de la asparaginasa de W. succinogenes no
contiene de forma natural ni el sitio de restricción BamHI ni el
EcoRI. Sin embargo, la amplificación por PCR usando estos cebadores
mencionados introdujo un sitio de restricción BamHI y otro EcoRI en
los extremos 5' y 3', respectivamente, para facilitar la clonación
direccional de esta secuencia genómica amplificada en el interior de
vectores de secuenciación y/ de expresión.
En cuanto a la amplificación por PCR, el ADN
genómico de W. succinogenes (purificado como en el Ejemplo 3)
se sometió a 30 ciclos de amplificación por PCR en las siguientes
condiciones de reacción: 10 \mul de tampón de reacción de PCR II;
6 \mul de cloruro magnésico de 25 mg/ml; 8 \mul de soluciones
almacenadas 10 mM de dNTP, 1 \mul de ADN polimerasa Taq
(Stratagene Corp.); 1 \mul (aproximadamente 50 ng) de cada uno de
los cebadores para PCR directos e inversos específicos de
asparaginasa de W. succinogenes; 1 \mul de ADN genómico de
W. succinogenes y agua de grado PCR sin nucleasas para llevar
la mezcla de reacción hasta un volumen total de 100 \mul. Tras la
amplificación, 2 \mul de los productos de la PCR se sometieron a
electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se marcaron con yoduro
de propidio para valorar la especificidad de la reacción de
amplificación y el peso molecular de los fragmentos de ADN
resultantes. La amplificación dio como resultado la producción de un
fragmento de ADN homogéneo de 1,0 kb específico de asparaginasa de
W. succinogenes.
Posteriormente, el fragmento de ADN amplificado
específico de la asparaginasa de W. succinogenes se subclonó
en los sitios BamHI y EcoRI del vector de clonación PCRII
(Stratagene, La Jolla, CA) usando las siguientes condiciones de
reacción: 2 \mul de los productos de reacción amplificados por
PCR, 2 \mul del vector de clonación PCRII; 1 \mul de tampón de
ligación 10X, 4 \mul de ADN ligasa T_{4} (Stratagene, La Jolla,
CA) y agua destilada/desionizada para alcanzar un volumen de
reacción total de 10 \mul. La reacción de ligación se incubó a
16ºC durante toda la noche y 2 \mul de esta reacción se usaron
para transformar las cepas de E. coli competentes
DH-5\alpha y M15.
Se usó selección colorimétrica inducida por IPTG
(mediada por la expresión de \beta-galactosidasa
en presencia de X-GAL) para identificar las colonias
bacterianas recombinantes. Se escogieron tres colonias blancas
(recombinantes positivas putativas) y una colonia azul
(recombinantes negativas putativas), se inocularon en un cultivo de
5 ml de medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y se
incubaron durante toda la noche a 37ºC en una plataforma de
agitación. De estos cultivos se aisló el ADN plasmídico mediante una
metodología estándar de ADN "mini-prep" y el
ADN se disolvió en 30 \mul de tampón TE y se digirió con 3
endonucleasas de restricción diferentes: BamH1, EcoRI y BamHI/EcoR1,
para asegurar que el ADN plasmídico aislado contenía el inserto
esperado de 1,0 kb específico de la asparaginasa de W.
succinogenes.
Los resultados de la electroforesis, como se
ilustra en la figura 3, carriles 2 y 4, demostraron que las colonias
nº 1 y nº 3 contenían el inserto de 1,0 kb esperado. Para confirmar
que estos clones contenían el gen de la asparaginasa de W.
succinogenes se usaron los cebadores de PCR específicos de la
asparaginasa de W. succinogenes para amplificar los
fragmentos específicos de asparaginasa de W. succinogenes
aislados de los clones mencionados anteriormente (figura 3, carriles
2 y 4). Estos cebadores no mediaban la amplificación del ADN
bacteriano que no contenía el inserto (figura 3, carril 3). Los
resultados de esta segunda amplificación por PCR demostraron que las
colonias nº 1 y nº 3 contenían el inserto de ADN específico de la
asparaginasa de W. succinogenes en el vector de clonación
PCRII, dando como resultado la generación de un producto de
amplificación de 1,0 kb (véase la figura 3, carriles 2 y
4).
A continuación, el inserto de ADN específico de
la asparaginasa de W. succinogenes en el vector de clonación
PCRII se eliminó mediante digestión con BamHI y EcoRI de 10 g de ADN
plasmídico derivado de la colonia nº 1, se purificó en gel mediante
el uso de Gene Clean Kit® (Stratagene, La Jolla, CA). El inserto de
ADN se eluyó del gel con 10 \mul de agua destilada/desionizada y
después se ligó durante toda la noche a 16ºC en los vectores
restringidos de forma parecida pGEX-2T (Amersham
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) u pET-28ª
(Novagen, Inc., Madiso, WI) en las siguientes condiciones de
reacción: 3 \mul de inserto de ADN; 3 \mul de ADN vector; 4
\mul de tampón de reacción de ligación 5X; 2 \mul de ADN ligasa
T_{4} y 9 \mul de agua destilada/desionizada para dar un volumen
de reacción final de 20 \mul. Se usaron 10 \mul de cada mezcla
de reacción de ligación para transformar 50 \mul de células E.
coli DH-5\alpha competentes. Los
transformantes se sembraron en placas con agar LB que contienen 100
mg/ml de ampicilina. Los transformantes positivos (es decir,
transformantes que contienen el inserto de ADN específico de la
asparagina de W. succinogenes, pGEX-2T WSA y
pET-28-WSA), respectivamente, se
obtuvieron después de aproximadamente 18 horas de incubación a 37ºC.
Para confirmar que los transformantes contenías el inserto de ADN
específico de asparaginasa de W. succinogenes, se realizó la
digestión con endonucleasas de restricción usando BamHI y EcoRI, así
como amplificación por PCR y análisis de la secuencia de ADN. Los
resultados de estos análisis demostraron que cada uno de los
transformantes "positivos" seleccionados contenían el inserto
de ADN específico de la asparaginasa de W. succionogenes. La
secuencia nucleotídica del inserto de ADN específico de la
asparaginasa de W. succinogenes se muestra en la Figura 6
[SEC ID Nº 3], secuencia que contiene 117 nucleótidos en dirección
5'a los codones iniciales del gen de Wolinella y 23 nucleótidos en
dirección 3' al codón de terminación del gen.
Para facilitar el aislamiento de la proteína
asparaginasa recombinante de W. succinogenes (rWS), se han
construido varios tipos de análogos de asparaginasa con epítopo
mar4cado. Estos marcadores de epítopo incluían: hemaglutinina de
influenza (HA);
glutatión-S-transferasa (GST); DYLD
(FLAG) y polihistidina (p-His). En cada caso, el
marcador se coloca en el extremo N de la enzima.
Las siguientes metodologías se usan para aislar
estas diversas proteínas asparaginasa rWS con epítopo marcado:
- (1)
- Para purificar la enzima asparaginasa rWS GST-marcada expresada en el vector pGEX-2T-WSA se usa cromatografía en columna en sefarosa-GST (Pharmacia AB, Upsala, Suecia), seguido por fragmentación por trombina.
- (2)
- Para purificar por afinidad la enzima asparaginasa rWS marcada con HA, o FLAG, se usan anticuerpos antiHA y antiFLAG (Pharmacia AB, Upsala, Suecia)inmovilizados en proteína G-sefarosa.
- (3)
- Para purificar por afinidad la enzima asparaginasa rWS marcada con p-His se usa resina níquel (Ni-NTA [resina de nitrilo-ácido triacético]; Novagen, Inc., Chatsworth, CA).
Más específicamente, por ejemplo, la producción
de asparaginasa
rWS-glutatión-S-transferasa
(GST) marcada con polihistidina (p-His) requiere la
inducción de E. coli transformada positivamente con IPTG,
seguido por la recogida de las bacterias (véase Hochuli, E.,
& Dobell, N, New metal chelate absorbents selective for protein
and peptide containing neighboring histidine residues, 411, J.
Chromatography 177 (1987)). En tales sistemas de expresión, se
pueden usar vectores de expresión como pGEX-2T y
pET-28 a, para facilitar la expresión de una forma
sin epítopo marcado de la asparaginasa rWS tras la inducción con
IPTG. Estos constructos marcados con p-His,
localizados en el extremo N de la asparaginasa rWS, pueden
subclonarse en el sitio BamH1 a EcoRI del vector
pET-28A (Novagen, Inc. Chatsworth, CA para la
expresión de la enzima rWS marcada con p-His.
La forma homotetramérica nativa de la
asparaginasa de W. succinogenes se purificó según la
siguiente metodología. Se prepararon lisados celulares de W.
succinogenes sometiendo las bacterias cultivadas y congeladas
según los Ejemplos 1 a 3 a 4 ciclos de congelación/descongelación
con ultrasonidos, seguido por centrifugación de alta velocidad para
eliminar los desechos celulares. Tras la centrifugación, el
sobrenadante se llevó a una concentración 0,1M de sulfato amónico a
una temperatura de 4ºC. Después, la mezcla se llevó hasta un volumen
final de 120% mediante la adición de una solución de protamina al
2%, seguida por centrifugación durante 30 minutos a 21.000 x g. Los
sobrenadantes se recuperaron, se acumularon y se llevaron a una
saturación de sulfato amónico del 50% y se equilibraron durante 30
minutos en hielo con agitación continua. La solución resultante se
sometió a diálisis frente a tampón fosfato potásico 0,01M (pH 8,0) y
se aplicó a una columna de hidroxiapatita de 3 cm \times 20 cm
(preparada por: Pharmacia, Inc.) equilibrada con tampón fosfato
potásico 0,1M a pH 8,0.
La asparaginasa de W. succinogenes se
eluyó de la columna de hidroxiapatita usando concentraciones
escalonadas de tampón fosfato (es decir, tampón fosfato 0,10, 0,20,
0,25, 0,30, 0,35 M, pH 8,0). Las fracciones eluidas (10 ml/fracción)
se recogieron, se sometieron a análisis para determinar la actividad
enzimática de asparaginasa y se acumularon. Las fracciones
enzimáticamente activas se sometieron a diálisis frente a tampón
borato sódico 0,1M (pH 7,0) y se aplicaron a una columna de
DEAE-Sephadex de 3 cm \times 20 cm (preparada por
Pharmacia, Inc.) equilibrada en tampón borato sódico 0,1M, pH 7,0:
La enzima se eluyó mediante el uso de un gradiente lineal de cloruro
sódico (0 a 1,0M) en tampón borato sódico 0,1 M (pH 7,0). Se
retuvieron 60 ml de las fracciones que contienen asparaginasa.
Mediante electroforesis en SDS-PAGE y tinción de
plata se ha mostrado que la L-asparaginasa de W.
succinogenes preparada usando esta metodología es homogénea.
La asparaginasa EC-2 de E.
coli (MercK, Sharp & Dohme, West Point, PA) se purificó
posteriormente mediante filtración en gel sobre
Ultragel®AcA-44 (LKV Instrumentes, Inc., Rockville,
NM).La rama Pharmaceutical Resources del Instituto Nacional del
Cáncer proporcionó la asparaginasa de Erwinia carotovora
(Microbiological Research Establishment, Salisbury, Reino
Unido).
Se han aclarado las estructuras cristalográficas
por rayos X de varias asparaginasas microbianas (véase
Lubkowski, J. & Palm, N. (1996), supra). La asparaginasa
recombinante de W. succinogenes, que posee propiedades
clínicas aceptables, tiene las siguientes características:
(1) actividad catalítica in vitro, (2)
preferentemente una estructura homotetramérica de tipo proteína
nativa requerida para la catálisis enzimática funcional, y (3) en
relación con la forma recombinante de asparaginasa de W.
succinogenes, similar a la de la forma homotetramérica nativa de
la asparaginasa de W. succinogenes, mayor especificidad de
sustrato para L-asparaginasa y no catalizadora de la
desamidación de L-glutamina a ningún grado
fisiológicamente significativo.
Para cuantificar las características bioquímicas
de las dos enzimas asparaginasas recombinante y nativa
homotetramérica, se pueden determinar los parámetros de cinética
enzimática K_{m} y V_{max}, la especificidad de sustrato, el pH
óptimo y la temperatura óptima. Además, se pueden usar
SDS-PAGE en condiciones tanto reductoras como no
reductoras, seguido por tinción de plata y azul de Coomassie de los
geles, para establecer la homogeneidad de la enzima, evaluar la
composición de subunidades y determinar el peso molecular de la
enzima (véase Park, R. & Liu, K., A role for Shc, grb2 y
raf-1 in FcR1 signal relay, 271 J. Biol.
Chem. 13342 (1996).
La actividad enzimática de la
L-asparaginasa puede determinarse cuantitativamente
mediante la cantidad de amoniaco producido tras la hidrólisis de
L-asparaginasa 0,08M usando tampón fosfato sódico
0,01M (pH 7,0) como tampón de reacción (véase Durden, D. L.
& Distasio, J. A. (1980), supra). La mezcla de ensayo
puede estar formada por 10 a 40 UI de una solución homogénea de
enzima L-asparaginasa diluida a 2,0 ml con tampón
fosfato sódico 0,01M (pH 7,0). Brevemente, este sistema de ensayo
mide indirectamente la desamidación de L-asparagina
mediante la cuantificación de la liberación de NH_{3} detectada
por colorimetría con reactivo de Nessler. Para derivar inicialmente
un coeficiente de extinción de NH_{3} se puede preparar una curva
estándar de NH_{4}OH, en función de la absorbancia a 420 nm. La
reacción enzimática puede iniciarse mediante la adición de sustrato
L-asparagina (0,04 M). Para determinar los
parámetros de cinética enzimática K_{m} y V_{max} se puede usar
un sistema de ensayo más sensible de L-asparaginasa
dependiente de NADPH (véase Distasio, J. A. & Niederman,
T. (1976), supra).
Las formas recombinante y nativa de asparaginasa
de W. succinogenes puede ajustarse entre 5 y 50 UI por
inyección y los ratones pueden recibir hasta 3 inyecciones
intraperitoneales (I.P.) diarias a cada dosis. Se pueden realizar
estudios toxicológicos y farmacológicos de las enzimas nativas y
recombinantes mediante la determinación de la actividad enzimática
en suero (es decir, la semivida de la enzima en suero) como se ha
descrito anteriormente.
Se pueden realizar determinaciones de la semivida
en suero en ratones Balb/c a los que se han inyectado 5 ó 10 UI por
vía intraperitoneal de asparaginasa de Wolinella succinogenes
nativa (WS) o recombinante (rWS). Las mediciones de la semivida de
la enzima pueden efectuarse mediante una ligera modificación de un
procedimiento previamente publicado (véase Durden, D. L., y col.,
kinetic analysis of hepatotoxicity associated with
anti-neoplastic asparaginases, 43 Cancer res. 1602
(1983)). Específicamente, las mediciones de la semivida de la enzima
se pueden llevar a cabo obteniéndose una muestra de sangre de 5
\mul de la vena de la cola de ratones Balb/c a intervalos
específicos tras la inyección I.P. de asparaginasa WS o rWS.
Después, las muestras de sangre se guardan en hielo hasta que se han
recogido todas las muestras. Una vez que se ha completado la
obtención de muestras, cada una de las muestras de sangre de 5
\mul pueden introducirse de inmediato con una pipeta en 0,5 ml de
cloruro sódico al 1,19% frío en tampón fosfato sódico 0,1M (pH 7,0)
y se pueden mezclar mediante agitación enérgica en vórtex.
Para determinar la actividad asparaginasa en
suero (y por tanto la semivida en suero), dos alícuotas de 0,2 ml de
cada punto de tiempo se pueden equilibrar en un baño de agua a 37ºC.
Posteriormente se inicia la reacción enzimática mediante la adición
de 0,03 ml de L-asparagina 0,04 M, equilibrada
previamente a 37ºC, antes de la adición, en una de las muestras de
0,2 ml. La otra alícuota de 0,2 ml recibe sólo 0,3 ml de agua
destilada y servirá como "blanco" control. El tubo de reacción
que contiene el sustrato puede incubarse a 37ºC durante 1 hora, tras
la cual la reacción se detiene mediante la adición de 0,2 ml de TCA
al 5%. Además, al "blanco" control también se añade una
alícuota de 0,2 ml de TCA al 5%. Después, los tubos se centrifugan a
5000 x g para eliminar el precipitado resultante producido por TCA.
La actividad enzimática se puede determinar por colorimetría
mediante la adición de una alícuota de 0,2 ml de la muestra que
contiene el sustrato a 0,2 ml de agua destilada y 0,2 ml de Reactivo
de Nessler recién preparado y se lee la absorbancia a 420 nm usando
un espectrofotómetro (Gilford Instrument Laboratories, Oberlin,
OH).
La actividad antineoplásica (antilinfoma) de una
preparación homogénea de asparaginasa de W. succinogenes
nativa (WS) y recombinante (rWS), así como la de las asparaginasas
de E. coli (EC) y de E. carotovora (Erw) puede
determinarse usando la línea de células de linfosarcoma Gardner
6C3HED implantada en ratones C3H. Este tumor linfoide se originó en
el timo de ratones C3H a los que se han administrado dosis elevadas
de estradiol y se perpetuó por trasplante seriado en los ratones
C3H. En estos estudios, el tumor se mantiene como un tumor ascítico
mediante inyección I.P. de 2 \times 10^{8} células viables de
linfosarcoma en 0,1 ml de PBS (pH 7,0).
Para determinar la actividad antitumoral de la
asparaginasa se inyectan 2,5 x 10^{6} células viables de
linfosarcoma 6C3HED de un tumor ascítico en un volumen de 0,05 ml de
PBS (pH 7,0) por vía subcutánea en la región inguinal ventral
izquierda de ratones C3H de 9 a 12 semanas de edad. De igual modo,
en otra serie de experimentos, se inyectan 2,5 x 10^{6} células
viables de linfosarcoma P1798 de un tumor ascítico en un volumen de
0,05 ml de PBS (pH 7,0) por vía subcutánea en la región inguinal
ventral izquierda de ratones Balb/c de 9 a 12 semanas de edad
(véase Jack, G. W., y col., The effect of histidine
ammonia-lyase on some murine tumors, 7 Leukemia
Res. 421 (1983)). Generalmente, el crecimiento palpable del
tumor sólido se produjo dentro de los 4 a 7 días posteriores a la
inyección de las células de linfosarcoma. Después, se miden los
cambios en el volumen del tumor sólido por medio de medición diaria
con compás de las dimensiones del tumor en tres ejes. Cuando el
volumen medio del tumor alcanza 1 cm^{3} se puede efectuar la
inyección intraperitoneal de asparaginasa. Puede administrarse una
dosis total de 3 ó 6 UI de asparaginasa en un total de seis
inyecciones I.P. de 0,5 ó 1,0 UI asparagina/inyección,
respectivamente. Las inyecciones pueden administrarse dos veces a
día durante tres días consecutivos.
El grupo de animales control negativo recibe
inyecciones I.P. de tampón fosfato 0,01 M (pH 7,0) usando un
programa de inyección similar. Las asparaginasas de E. coli y
E. carotovora sirven como controles positivos para
comparación de la actividad antitumoral en esta serie de
experimentos. Para el análisis estadísticos de los datos se usará
una prueba de t de Student.
Este ejemplo describe cómo se determinó si los
anticuerpos de pacientes que se sabe que neutralizan la asparaginasa
de E. coli reaccionan con W. succinogenes.
Específicamente, se realizó un ensayo ELISA para efectuar esta
determinación, como se describe a continuación.
El ensayo ELISA se realizó en placas de
microtitulación de 96 pocillos, del siguiente modo:
la asparaginasa (EC en una placa, WS en la otra)
se diluyó en tampón carbonato (preparado disolviendo 1,59 g de
Na_{2}CO_{3}, 2,93 g de NaHCO_{3} y 0,2 g de NaN_{3} en 1 l
de agua purificada; el pH se ajustó a 9,0-9,5 usando
HCl 1N o NaOH 1N; el tampón se almacenó a 4ºC durante no más de dos
semanas antes de usar) hasta una concentración final de 0,10 UI/ml.
De cada placa, 54 pocillos se recubrieron con 100 \mul de la
solución respectiva de asparaginasa diluida y se incubaron durante
toda la noche a 4ºC después de envolverse en papel de aluminio para
permitir que la enzima se asocie con las placas.
A la mañana siguiente, se retiraron las placas y
se eliminó la solución de cada uno de los pocillos. A continuación
se bloquearon estos pocillos con 300 \mul de una solución de 1
mg/ml de tampón bloqueante BSA-PBS, a pH 7,0
(preparado fresco añadiendo la cantidad adecuada de seroalbúmina
bovina a tampón PBS, fosfato sódico 0,010 M, pH
7,0-7,2, suero salino al 0,9%). Después, las placas
se lavaron con 300 ml de tampón Tween-suero salino
(NaCl 0,145M, Tween 20 0,05%) por pocillo usando un lavador de
placas Dynatech Ultrawash.
Los anticuerpos usados para la selección en las
dos placas se diluyeron del siguiente modo: 1:100, 1:1.000;1:2.000;
1:4.000; 1:8.000; 1:16.000 y 1:32.000. Como control se usó el suero
de un paciente humano normal. El suero del paciente, el suero
antiasparaginasa de EC de conejo y el suero de ser humano normal se
diluyeron en PBS-Tween (PBS con Tween 20 0,05%) y
100 \mul de cada dilución se colocaron en cada placa por
triplicado según el siguiente esquema:
Después de añadir las diluciones anteriores, las
placas se incubaron durante al menos 1,5 horas a temperatura
ambiente, seguido por tres lavados de cada placa con suero
salino-Tween, como se ha descrito antes. A la
dilución de 1:1.000 se preparó inmunoglobulina antihumana de cabra
conjugada con peroxidasa de rábano (BioSource International) en
PBS-Tween. A continuación se añadió a cada pocillo
100 \mul de la Ig antihumana conjugada -PR. Después, se cubrieron
las placas y se las dejó incubar a temperatura ambiente durante 1
hora.
Después de 1 hora de incubación, cada placa se
lavó de nuevo tres veces con suero salino-Tween,
como antes. Para detectar la unión del anticuerpo, a cada pocillo se
añadieron 100 \mul de sustrato OPD
(o-fenilendiamindiclorhidrato)(40 mg de OPD en 100
ml de tampón fosfato cítrico (0,1M, pH 6,0, preparado combinando una
solución que contiene 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O (dibásico) en 500 ml
de agua destilada con una cantidad de una solución que contiene 9,60
g de ácido cítrico (anhidro) en 500 ml de agua destilada suficiente
para ajustar el pH a 6,0) con 334 \mul de H2O2 al 3% preparada
justo antes de usar y guardada a temperatura ambiente en oscuridad)
y se dejó incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante
aproximadamente 40 minutos. La reacción en cada pocillo se detuvo
añadiendo 100 \mul de ácido fosfórico 1M. Después se midió la
absorbancia en cada pocillo a 40 nm.
Como se muestra en la figura 8, títulos elevados
de anticuerpos neutralizantes frente a la enzima de E. coli
presente e el plasma del paciente no se unieron a la asparaginasa de
Wolinella. Este figura muestra uno de 6 muestras de plasma
recogidas de pacientes de los que se conoce que son alérgicos a la
enzima de E. coli, así como antisuero de conejo producido
frente a la asparaginasa de E. coli. Ninguno de estos
antisueros reactivos antiE. coli se une o neutraliza la
actividad asparaginasa de Wolinella (figuras 8 y 9). A partir
de estos datos se concluyó que la enzima de W. succinogenes
es inmunológicamente distinta de la de E. coli y que la
enzima de Wolinella se puede usar en pacientes alérgicos a la
enzima de E. coli (como se pone como ejemplo mediante
titulación del plasma del paciente que se muestra en la figura 8 y
del antisuero anti E. coli de conejo que se muestra en la
figura 9).
También se ha preparado un antisuero altamente
específico frente a la enzima de W. succinogenes que no
muestra reacción cruzada con la asparaginasa de E. coli en
los análisis Western blot. Este reactivo es útil para realizar
caracterizaciones inmunológicas de las formas nativa, recombinante y
diversos análogos de la enzima de Wolinella. El análisis de
las formas nativa, recombinante y análogas de la asparaginasa de
W. succinogenes para este tipo de reactividad cruzada será
útil para caracterizar proteínas modificadas genéticamente y
químicamente. Un hecho importante es que estos análisis se aplicarán
para analizar las muestras clínicas durante las fases I y II de los
ensayos clínicos de las diferentes formas de la enzima de W.
succinogenes.
La acilación de proteínas se lleva a cabo usando
diferentes agentes acilantes, tales como haluros de acilo (por
ejemplo, cloruro de acilo), compuestos de carbodiimida o anhídridos
ácidos, cada uno con un número distinto de átomos de carbono que
comprende una cadena alifática lineal o ramificada unida al átomo de
carbono del carbonilo o del carbonilo modificado En el caso de las
carbodiimidas). Los agentes acilantes cuyo uso se contempla en la
práctica de esta invención tienen la capacidad para reaccionar con
un grupo polar contenido en la secuencia peptídica de una proteína
para formar una cadena lateral amida. El grupo polar es la cadena
lateral de cualquiera de los aminoácidos de la secuencia primaria,
por ejemplo, el grupo amino de lisina o arginina, el grupo hidroxi
de treonina, serina o tirosina, o el grupo tiol de cisteína.
Preferentemente, la reacción se lleva a cabo en condiciones que no
reducen sustancialmente (es decir, reducen en más del 90%,
preferentemente menos del 50% y, más preferentemente menos del 25%)
la actividad catalítica de la enzima.
Brevemente, la reacción química comenzó a tiempo
cero con la adición, gota a gota, de cloruro de acetilo a 5.000 UI
de asparaginasa derivada de W. succinogenes en un volumen de
10 ml de tampón borato 0,1 M a pH 8,5. La concentración final de
cada cloruro ácido es 0,1M. La reacción química implica un ataque
nucleófilo del grupo polar, por ejemplo el grupo amino libre, en la
secuencia peptídica de la molécula de asparaginasa (que se mantiene
en una forma sin protonar en el tampón borato, pH 8,5) con el agente
acilante reactivo. El grupo polar reacciona con el agente acilante,
proporcionando una cadena lateral aminoacídica de hidrocarburo
alifático modificado. Si el agente acilante es un haluro de acilo,
se produce un equivalente del ácido hidrohálico respectivo. Por
tanto, si el agente acilante es cloruro de acilo y el aminoácido que
se va a modificar es lisina, después la reacción da un grupo amino
acilado y 1 equivalente de HCl (véase la figura 7). Para
impedir que las condiciones ácidas destruyan la estructura de la
molécula proteica (disminuyendo el rendimiento de la enzima, Tabla
1, a continuación), a la mezcla de reacción se añade, gota a gota,
una solución de NaOH 1N cada 5-10 segundos. Se
extrajeron alícuotas de 2 ml a los tiempos de reacción indicados
(véase la Tabla 1, a continuación) e inmediatamente se
sometieron a diálisis frente a tampón fosfato 0,01M a pH 7,0. La
concentración de proteínas se mide mediante el método Bradford. La
actividad enzimática se determina por la cantidad de amoniaco
producido tras la hidrólisis de L-asparagina
(L-asparagina 0,08M) con un reactivo de Nessler
(véase Durden, D. L. y col., Cancer Res. 40: 1125,
(1980)). Los grupos amino libres se miden mediante el método de
Habeeb (véase Habeeb, A. F. S. A., Analytical
Biochemistry, 14: 328, 1966).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) \+ \begin{minipage}[t]{135mm} La reacción se inicia al
tiempo 0 con la adición de cloruro de acetilo a 5.000 UI de
asparaginasa de W. succinogenes en 10 ml de tampón borato 0,1
M, pH 8,5. Se extraen alícuotas de 2,0 ml a los tiempos indicados y
se someten a diálisis frente a tampón fosfato 0,01M, pH
7,0.\end{minipage} \cr b) \+ \begin{minipage}[t]{135mm}
La Proteína se mide por triplicado mediante el método de
Bradford.\end{minipage} \cr c) \+
\begin{minipage}[t]{135mm} La actividad enzimática se mide
determinando la cantidad de amoniaco producido tras la hidrólisis de
L-asparagina con reactivo de
Nessler.\end{minipage} \cr d) \+ Los grupos amino libres se
miden mediante el método de
Habeeeb.\cr}
La modificación de acilo se lleva a cabo con
agentes acilantes de cadenas alifáticas de diferentes longitudes,
por ejemplo una cadena alifática de 2 carbonos (C2), una cadena
alifática de 4 carbono (C4), una cadena alifática de 6 carbonos (C6)
etc. Un hecho importante es que, cada proteína específica (por
ejemplo, asparaginasa) tiene un número diferente de grupos polares
libres en distintas posiciones en la molécula proteica y, por tanto,
cada proteína se modifica óptimamente con un agente acilante de
longitud diferente, que conjuga una cadena de carbonos alifática
distinta con los grupos amino libres. Estos incluyen, por ejemplo,
cloruro de acetilo (C2), cloruro de butirilo (C4), cloruro de
hexanoílo (C6), cloruro de decanoílo (C10), así como el uso de
cloruros ácidos de cadena ramificada incluyendo cloruro de
trimetilacilo. Asimismo, se pueden usar agentes acilantes distintos
para proteínas diferentes. Por ejemplo, con algunas proteínas se
puede usar cloruro de acetilo, mientras que para otras proteínas el
mejor agente acilante puede ser anhídrido acético. Con propósitos de
ilustración, en la Tabla 1 se presenta la modificación covalente de
la asparaginasa de W. succinogenes con cloruro de
acetilo.
Una serie de problemas se han asociado con el uso
de enzimas con fines terapéuticos. Muchas de estas enzimas tienen
semividas extremadamente cortas, que limitan su eficacia in
vivo. La modificación con C2 de la asparaginasa de W.
succinogenes da como resultado una enzima que tiene una semivida
de 8,2 horas en ratones, en comparación con la semivida de 1,8 horas
de la enzima nativa. El aumento de la semivida es consistente con el
curso del tiempo de la reacción de acetilación (dando como resultado
una disminución del 20-40% de la actividad
enzimática, mientras que la actividad de la asparaginasa de W.
succinogenes disminuye al aumentar el tiempo de reacción). Se
observó una recuperación de aproximadamente el 80% de la actividad
enzimática después de 30 minutos de tiempo de reacción, un tiempo de
alteración máxima de la prolongación farmacocinética de la semivida
hasta 8,0 horas. Otros procedimientos de modificación que implican
polimerización (por ejemplo, modificación con polietilenglicol) dan
como resultado grupos heterogéneos de productos de reacción
modificados que pueden no ser adecuados para la administración a
seres humanos. El procedimiento de modificación con cloruro ácido es
un abordaje sistémico que no proporciona tal heterogeneidad en los
productos de reacción (véase la figura 7). La mayor reproducibilidad
y la naturaleza más restringida de los productos de reacción dan
lugar a una modificación bien controlada de la proteína y a un
producto más fiable, con una prolongación predecible de la semivida
que disminuye la inmunogenicidad, y con la ventaja de ser capaz de
controlar cuidadosamente el grado de modificación de los grupos
polares presentes en la molécula proteica específica. Los datos
actuales sobre la modificación de la asparaginasa de W.
succinogenes demuestran que la enzima está modificada con una
reacción de acilación C2 que produce el aumento de la semivida de
aproximadamente el cuádruple. La modificación de los grupos amino
libres de la molécula de asparaginasa es responsable de la
prolongación de la semivida. Se ha sugerido que la prolongación de
la semivida se correlacionará con una disminución de la carga
electrostática, un aumento de la hidrofobicidad y una reducción de
la inmunogenicidad de la enzima de Wolinella. La prolongación
de la semivida y la disminución de la inmunogenicidad aumentarán la
eficacia de la enzima de W. succinogenes, cuando este
fármaco se usa en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda,
enfermedad autoinmunitaria o SIDA, por ejemplo en seres humanos.
Mediante este procedimiento de modificación somos capaces de generar
proteínas extrañas que tienen una inmunogenicidad inferior, una
semivida prolongada y una mayor eficacia.
Aunque las formas de realización y las
aplicaciones de la presente invención se han descrito con algún
detalle como ilustración y ejemplos con fines de claridad y
comprensión, será evidente para los expertos en la técnica relevante
que serían posibles muchas modificaciones adicionales sin separarse
de los conceptos inventivos contenidos en la presente memoria
descriptiva. Por tanto, la invención no debe restringirse de ninguna
manera, a excepción de las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se usa anteriormente, el término
"incluyendo" significa "incluir sin limitación", y los
términos usados en singular deberán incluir el plural y viceversa, a
menos que el contexto dicte otra cosa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Donald L Durden
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: USO DE LA ASPARAGINASA DE WOLINELLA SUCCINOGENES EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES HEMATOLÓGICAS Y AUTOINMUNITARIAS HUMANAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Lyon & Lyon
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 633 West Fifth Street suite 4700
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Los Ángeles
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 90071-2066
\vskip0.800000\baselineskip
- (V)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5'', 1,44 Mb de memoria
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: IBM PC DOS 5.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: En espera de asignación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DATOS DE PRESENTACIÓN: Presentado con la presente
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60/049.085
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 9 de junio de 1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN ABOGADO/ AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Warburg, Richard J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.327
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ EXPEDIENTE: 234/274
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (213)489-1600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (213) 955-0440
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 67-3510
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGGATCCA GCGCCTCTGT TTTGATGGCT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGAATTCG GTGGAGAAGA TCTTTTGGAT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1133 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
Claims (17)
1. Una composición farmacéutica que comprende la
asparaginasa acilada de Wolinella succinogenes y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
2. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que la asparaginasa es una enzima
nativa.
3. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que la asparaginasa es una enzima
recombinante.
4. Una composición farmacéutica según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la asparaginasa se produce
haciendo reaccionar la asparaginasa de Wolinella succinogenes
con uno o más haluros de acilo.
5. El uso de una asparaginasa de Wolinella
succinogenes en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo compuesto por
enfermedades hematológicas y autoinmunitarias malignas y no
malignas, en el que dicha enzima es un análogo de la asparaginasa
que comprende al menos una modificación covalente y en el que dicha
modificación covalente es acilación.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que la
asparaginasa es una enzima nativa.
7. El uso según la reivindicación 5, en el que la
asparaginasa es una enzima recombinante.
8. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, en el que la enfermedad hematológica maligna
se selecciona del grupo formado por un linfoma, una leucemia y un
mieloma.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que la
enfermedad hematológica maligna es una enfermedad crónica.
10. El uso según la reivindicación 9, en el que
la enfermedad hematológica maligna crónica está en una fase
aguda.
11. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, en el que la enfermedad autoinmunitaria se
selecciona del grupo formado por artritis reumatoide, lupus
eritematoso sistémico y SIDA.
12. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 11, en el que el paciente es un mamífero
seleccionado del grupo formado por animales bovinos, caninos,
equinos, felinos, porcinos y primates.
13. El uso según la reivindicación 12, en el que
el paciente es un ser humano.
14. El uso según las reivindicaciones 12 ó 13, en
el que el paciente se ha sensibilizado a otras enzimas microbianas
por un tratamiento previo.
15. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 14, en el que dicha acilación se lleva a cabo
usando uno o más haluros de acilo.
16. El uso según la reivindicación 15, en el que
dicho uno o más haluros de acilo son uno o más cloruros de
acilo.
17. El uso según la reivindicación 16, en el que
dicho uno o más cloruros de acilo se seleccionan del grupo formado
por cloruro de acetilo, cloruro de butirilo, cloruro de hexanoílo y
cloruro de decanoílo.
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