ES2217739T3

ES2217739T3 - Prueba de coagulacion de sangre mejorada.

Info

Publication number: ES2217739T3
Application number: ES99903537T
Authority: ES
Inventors: Thomas Exner
Original assignee: Gradipore Ltd
Current assignee: Life Therapeutics Ltd
Priority date: 1998-02-02
Filing date: 1999-02-01
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2019-02-01
Also published as: EP1068536A4; ATE265685T1; WO1999039212A1; JP2002502040A; CA2318250A1; AUPP159698A0; JP4331891B2; DE69916816D1; EP1068536B1; DE69916816T2; EP1068536A1; US6838251B1

Abstract

Procedimiento para determinar el potencial de coagulación de una muestra de plasma, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: (a) incubar previamente la muestra de plasma con un reactivo de todo el veneno de serpiente sustancialmente diluido, de tal modo que: (i) la proteína endógena C en el plasma se convierte por lo menos parcialmente en proteína C activada por el reactivo, y (ii) añadir el factor Xa que está progresivamente inactivado por el antitrombina III/ heparina cofactor 2 durante la incubación previa; (b) añadir a la muestra de plasma incubada previamente (a) reactivos para iniciar la coagulación que comprenden: (i) un reactivo exógeno que activa el factor X a Xa o protrombina a trombina en una forma dependiente del factor V, y (ii) componentes, tales como iones de calcio y fosfolípidos, que son necesarios para la coagulación eficaz de la muestra de plasma; (c) monitorizar una reacción indicativa de la velocidad de coagulación de la muestra de plasma; (d) comparar la velocidad de coagulación detectada en la etapa (c) con la velocidad equivalente determinada para un paciente normal, o comparar la velocidad de coagulación detectada en la etapa (c) con la velocidad equivalente determinada para la muestra de plasma en ausencia del activador de proteína C; y (e) determinar el potencial de coagulación de la muestra de plasma a partir de una u otra de las comparaciones realizadas en la etapa (d).

Description

Prueba de coagulación de sangre mejorada.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una prueba mejorada para medir el potencial de coagulación de la sangre en el plasma de pacientes con el objetivo de predecir el riesgo de trombosis.

Antecedentes de la técnica

Los mecanismos de coagulación de la sangre, trombosis y homeóstasis están bien descritos en la publicación de patente internacional WO 91/01382.

Es conocido, por la publicación de la patente internacional WO 93/01261 y las publicaciones de Bertina et al. (1994) y Dahlback et al. (1995), que el riesgo de trombosis en pacientes con una molécula de un factor V mutante conocida como la variante Leiden, o con un deterioro de la proteína C activada por alguna otra razón, se puede determinar por la activación del sistema de coagulación en una muestra de plasma e incubar la muestra con una proteína C activada en lo que se ha llegado a conocer como un deterioro de la proteína C activada, prueba de impedancia o resistencia. Existen precedentes para esta prueba en la que el deterioro de la proteína C activada se ha detectado en pacientes con trombofília adquirida (Mitchell et al, 1986; Amer et al, 1988).

Se han propuesto recientemente nuevas pruebas para seleccionar la mayoría de los defectos en la ruta de la proteína C (PCP) para de ese modo racionalizar el enfoque a los ensayos individuales de proteína C, S y factor V (Leiden) que actualmente se piden juntos en todos los casos de investigación de trombofília, con una proporción muy baja de resultados anormales. Estas pruebas de coagulación de 2 etapas generalmente implican la activación de la proteína C del plasma del propio paciente con el complejo de trombina/trombomodulina o el activador de veneno de Agkistrodon Contortrix, comúnmente referido como PROTAC™ de Pentapharm, Basilea. Esta proteína C activada (APC) inactiva a continuación el factor Va del propio paciente en una forma dependiente de la proteína S durante una prueba de coagulación posterior, proporcionando tiempos de coagulación más largos que si la proteína C no hubiera sido activada. Los tiempos de coagulación más cortos que los normales se obtienen cuando ocurren defectos en la proteína C y en la proteína S además de cuando está presente el factor V (Leiden) de resistencia APC. Se han descrito tales pruebas basándose en los Tiempos de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) p.ej., documentos AU 28416/95, EP718628 "Method for diagnosis of blood coagulation disorders", pruebas de tiempo de protrombina diluidas (PT) y en el documento WO 96/42018 "Thrombosis risk test".

Se puede determinar una velocidad de reacción de conversión del sustrato por el tiempo de coagulación o por el tiempo requerido para la conversión de un sustrato cromogénico a un producto coloreado. La velocidad de conversión obtenida se compara con valores obtenidos en ausencia del activador de proteína C o PCA y asimismo con resultados en muestras de plasma normal. Si el tiempo de coagulación no se prolonga suficientemente por el activador de la proteína C, indica que el individuo del cual se deriva la muestra puede estar en un riesgo de trombosis más alto del normal.

Es bien conocido que la activación de la proteína C endógena en el plasma por el activador de veneno de A. Contortrix prolonga tiempos de coagulación posteriores a un grado relacionado con el contenido de proteína C. Otros factores diversos, sin embargo, influyen o interfieren con esta prueba. Estos factores incluyen la proteína S, el factor V (Leiden) que se reconocen ahora como factores de riesgo trombótico en su propio derecho.

El presente inventor ha desarrollado recientemente una prueba mejorada de resistencia a APC que se describe en el documento WO 96/04560. Esta prueba requiere la adición de reactivos exógenos que activan el factor V y activan la ruta común del mecanismo de coagulación de la sangre a través del factor X o mediante la inducción de la formación de trombina en una forma dependiente del factor V junto con APC exógeno en una muestra de plasma. Se encontró que si el factor V se activa específicamente por un reactivo exógeno además de la activación de la ruta común a través del factor X, la prueba para la resistencia a APC se puede hacer más sensible y específica que las pruebas conocidas anteriormente. El presente inventor ha encontrado asimismo que la especificidad mejorada se obtiene cuando se utiliza un complejo del activador del factor X junto con el activador del factor V. Esta prueba, a causa de que el veneno de víbora Russells contiene activadores de tanto del factor X como del factor V, se ha referido como la prueba basada en veneno de víbora Russells (RVV). Se consigue un resultado similar si la protrombina se activa a trombina mediante el activador dependiente del factor V en presencia de un activador del factor V tal como el de los venenos de elápido australiano.

La ruta de la proteína C es una de un número de mecanismos antitrombóticos que operan dentro de los vasos sanguíneos normales para controlar la coagulación y evitar la trombosis. Probablemente el más importante de estos mecanismos es la ruta del glucosaminoglucano (GAG) que requiere antitrombina III como un cofactor y cofactor 2 de heparina. La trombina y el factor Xa se controlan por estos dos inhibidores de plasma que se modulan por glucosaminoglucanos tales como los sulfatos de heparina normalmente en células endoteliales de revestimiento de los vasos sanguíneos sanos.

El presente inventor ha realizado el descubrimiento sorprendente de que tales pruebas se pueden modificar adicionalmente para permitir la discriminación entre los individuos sanos y los pacientes con mecanismos antitrombóticos de sangre deteriorados o aberrantes.

Exposición de la invención

En un primer aspecto, la presente invención consiste en un procedimiento de determinación del potencial de coagulación de una muestra de plasma, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

(a): incubar previamente la muestra de plasma con un reactivo de todo el veneno de serpiente sustancialmente diluido tal que

(i): la proteína endógena C en el plasma por lo menos se convierta parcialmente en la proteína C activada por el reactivo, y

(ii): adición de un factor Xa que se inactiva progresivamente mediante antitrombina III/heparina cofactor 2 durante la incubación previa;

(b): añadir a la muestra de plasma incubada previamente (a) reactivos para iniciar la coagulación que comprenden:

(i): un reactivo exógeno que activa el factor X a Xa o protrombina a trombina en una forma dependiente del factor V, y

(ii): componentes, tales como fosfolípido e iones de calcio, que son necesarios para la coagulación eficaz de la muestra de plasma;

(c): monitorizar un indicativo de reacción de la velocidad de coagulación de la muestra de plasma;

(d): comparar la velocidad de coagulación detectada en la etapa (c) con la velocidad equivalente determinada para un paciente normal, o comparar la velocidad de la coagulación detectada en la etapa (c) con la velocidad equivalente determinada en la muestra de plasma en ausencia del activador de la proteína C; y

(e): determinar el potencial de coagulación de la muestra de plasma de una a otra de las comparativas de la etapa (d).

El reactivo utilizado en la etapa (a) contiene preferentemente asimismo niveles bajos de glucosaminoglucanos tales como heparinas de peso molecular bajo o regular, sulfatos de dermatán o de dextrán además del factor Xa. La inclusión de estos componentes al reactivo hace la prueba más sensible a la antritrombina III.

El reactivo utilizado en la etapa (a), que transforma la proteína C en proteína C activada es preferentemente veneno diluido de serpiente Agkistrodon Contortrix, o especies similares tales como A. Piscovorus, A. Bilineatus, A.C. Laticinctus, A. C. Moccason. Se ha encontrado que mediante la selección de una concentración apropiada del veneno de serpiente, es posible obtener mediante una prueba un diagnóstico de anticoagulación deteriorado. Una proporción de la ruta de la proteína C (PCP) inferior a un valor determinado previamente puede ser indicativa del control de la coagulación deteriorada en el plasma del paciente. Cuando se utiliza todo el veneno de A. Contortrix diluido a una concentración de aproximadamente 0,002%, es posible diferenciar entre plasma de normales, si estos provienen de individuos positivos sanos, embarazados o de anticoagulante de lupus y plasma de individuos con factores de riesgo trombótico tales como factor V (Leiden) resistente a APC y deficiencia de proteína C. Una proporción de PCP en este caso inferior a aproximadamente 2 sería positivo en la prueba presente. Similarmente para una concentración de 0,003%, sería positivo un valor inferior a 2,5 (ver figura 1).

Preferentemente, la incubación en la etapa (a) se lleva a cabo en condiciones neutras o ligeramente básicas, más preferentemente a aproximadamente pH 7,5. La incubación se lleva a cabo durante tiempo suficiente para la activación de la proteína C en el plasma. Se ha encontrado que eran suficientes los tiempos de incubación típicamente de aproximadamente 5 minutos como de costumbre para el intervalo de incubación previa en la mayoría de procedimientos de prueba APTT automatizados.

El presente inventor ha realizado el sorprendente descubrimiento que el activador de proteína C purificado de veneno de A. Contortrix (un producto comercial "Protac™" disponible de Pentapharm AB (Suiza)) no funciona muy bien en la presente invención (ver Figura 2). El presente inventor ha encontrado que es particularmente adecuado el veneno diluido de A. Contortrix. Es posible que el procedimiento de purificación utilizado para producir este activador de proteína C comercial elimine un activador adicional o agente que está presente en todo el veneno que se requiere preferentemente para la presente invención. La naturaleza precisa del ingrediente no está clara todavía, sin embargo, parecería ser un coagulante previo que no se afecta por la deficiencia de los factores dependientes de la vitamina K o del tratamiento con warfarina. Se apreciará que este activador o agente adicional se podría purificar asimismo a partir de todo el veneno y combinarse con cualquier activador de proteína C purificado disponible comercialmente para utilizar en la presente invención. Las fracciones activas individuales se pueden asimismo purificar y recombinar para producir un reactivo adecuado para la presente invención.

El factor Xa de origen animal o humano se puede incluir e incubar con el reactivo de activador de proteína C. Este factor se puede formar a partir de factor X endógeno mediante los activadores del veneno. El factor Xa tiende a acortar el tiempo de coagulación. De este modo el nivel de veneno de víbora Russells, que necesita estar presente en el segundo reactivo (con el calcio y el fosfolípido) se puede reducir proporcionalmente para proporcionar tiempos de coagulación de 80-120 segundos en el plasma normal, similar al de las pruebas de la ruta de proteína C regulares. Asimismo, se pueden incluir la heparina o glucosaminoglucanos en el reactivo de incubación previa para aumentar la interacción entre antitrombina III y el factor Xa para aumentar la sensibilidad para niveles bajos de antitrombina III.

En una forma preferida de la presente invención, la muestra de plasma del paciente se incuba con un activador exógeno para la proteína C y el factor X. El activador exógeno de la proteína C es preferentemente veneno altamente diluido sin fraccionar de Agkistrodon Contortrix. El activador de factor X se deriva preferentemente del veneno de víbora Russell (Vipera Russelli) y de otras especies inmunológicamente reactivas cruzadas. Los venenos de serpiente se pueden utilizar en forma diluida pero sin fraccionar lo que contribuye a la simplicidad de la prueba, o preferentemente, se pueden utilizar en una forma fraccionada utilizando componentes de veneno aislados.

Más que activar directamente el factor X con un reactivo exógeno en la segunda etapa de tales pruebas uno puede asimismo obtener una mejora sobre la conocida prueba de la proteína C activada mediante la utilización de un reactivo exógeno que induce en el plasma la presencia de trombina en una forma dependiente del factor V. En este aspecto de la presente invención se pueden utilizar los activadores de protrombina dependientes del factor V tales como los de ciertos venenos australianos de Notechis y Pseudonaja, tales como Pseudonaja Textilis, Notechis Scutatus y Oxyuranus Scutellatus. La utilización de este sistema evita el factor X y todos los factores anteriores a éste de ese modo hacen la prueba más específica que la basada solo en el veneno de víbora Russell. La utilización de activadores adicionales de factor V derivados de veneno se desea exactamente como se describe anteriormente para el sistema de veneno de víbora Russell activada que implica la activación del factor X.

En una forma de realización de la presente invención, se combinan en una mezcla única los componentes de la etapa (b) con los que se va a mezclar el plasma del paciente y sus incubantes previos. Tal mezcla única preferentemente contiene asimismo componentes suplementarios tales como reguladores y conservantes adecuados. Además la mezcla preferentemente contiene polybrene u otro agente similar para invertir el efecto de cualquier heparina que pueda estar presente en las muestras de prueba o que se pueda añadir en el reactivo de incubación previa (i).

La mezcla de incubación preferentemente contiene asimismo niveles relativamente elevados de fosfolípidos a una fuerza iónica elevada para superar los inhibidores no específicos tales como los anticoagulantes de lupus que pueden estar presentes en la muestra de plasma.

Otra característica desventajosa en las muestras de plasma de prueba puede ser el defecto causado por anticoagulantes orales. Muchos de tales pacientes trombóticos pueden estar ya con un tratamiento anticoagulante oral y esto afecta las pruebas de coagulación actualmente utilizadas para evaluar la resistencia a la proteína C activada. El procedimiento convencional para minimizar tal interferencia es por la mezcla de plasma de prueba con plasma deficiente en factor V. La presente invención, sin embargo, no requiere necesariamente tal manipulación tal como los agentes antitrombóticos que no necesariamente afectan adversamente la prueba si se utilizan dentro de su intervalo terapéutico. La razón fundamental de esto es evidente en la Figura 1.

En otra forma de realización de la presente invención, el factor Xa se puede utilizar en el reactivo de incubación previa a tal nivel elevado que no se pueda requerir veneno de víbora Russells adicional en el segundo reactivo de mezcla (comprendiendo a continuación solo fosfolípido y calcio) para proporcionar un tiempo de coagulación ideal de 100 segundos con plasma normal (intervalo pretendido de 50-200 segundos). En este caso, el tiempo de coagulación se afectaría principalmente por niveles de antitrombina III (ATIII) y cofactor 2 de heparina (HCF2) y no por proteína C o S ni por la presencia de factor V (Leiden). En este escenario, el procedimiento se podría referir como una prueba para la ruta de glucosaminoglucano o una prueba "GAG". La prueba GAG se utiliza como un rol complementario a las pruebas de PCP como una prueba de selección preliminar para defectos probables en ATIII y HCF2, aunque en la práctica, aparece pobremente sensible a HCF2 (ver Figura 4). Esto puede no ser un problema, sin embargo, ya que HCF2 de hecho es de importancia dudosa como factor de riesgo antitrombótico en comparación a ATIII.

Muchas pruebas actualmente utilizadas para ATIII y HCF2 requieren preliminarmente una dilución elevada del plasma de prueba que se va a llevar a cabo. Esto es por lo general en un regulador que contiene niveles elevados de heparina o GAGs para facilitar la interacción completa de trombina o factor Xa con ATIII o HCF2. La pérdida cuantitativa en la trombina o en las actividades de la enzima de factor Xa se convierte a continuación a ATIII funcional o HCF2 presente en el plasma de prueba. Sin embargo, si una prueba de selección de trombofília única demuestra ser suficientemente sensible a todos los factores de riesgo trombótico conocidos en la práctica de diagnóstico, a continuación sería preferible una mezcla apropiada de ACCV/PCA y factor Xa en el reactivo de incubación previo y veneno de víbora Russells diluido/ fosfolípido/ reactivo recalcificante para proporcionar igual sensibilidad a todos los factores de riesgo antitrombótico conocidos.

El sistema de detección para monitorizar las velocidades potenciales de cambio dentro del sistema de coagulación puede ser un ensayo de tiempo de coagulación o un ensayo cromométrico o fluorométrico utilizando un sustrato sintético apropiado. Tales sistemas de detección son bien conocidos y se describen en las especificaciones de la patente referidas a las porciones introductorias de la presente memoria.

Tales plasmas de paciente pueden dar resultados dudosos cuando se ensayan por el procedimiento según la presente invención tal que no es posibble determinar inequívocamente entre muestras de plasma "normal" y deficientes en factor V (Leiden). El presente inventor ha realizado el sorprendente descubrimiento de que diluyendo estas muestras "dudosas" con soluciones de fuerza iónica baja incluyendo agua y llevando a cabo el procedimiento según el primer aspecto de la presente invención se pueden diferenciar entre muestras normales y de factor V (Leiden). El procedimiento según el primer aspecto de la presente invención proporciona asimismo discriminación mejorada de heterozigotos FVL de individuos homozigotos.

En un segundo aspecto, la presente invención consiste en un procedimiento para diferenciar entre pacientes con factor V (Leiden) de individuos normales, comprendiendo dicho procedimiento diluir el plasma de los pacientes y de los individuos normales con soluciones de fuerza iónica baja que incluye agua y repetir el procedimiento según el primer aspecto de la presente invención.

Preferentemente, el plasma se diluye 1:1 con agua, preferentemente agua destilada o filtrada, antes de la repetición del ensayo de coagulación. El plasma de factor V (Leiden) tendrá por lo general proporciones iguales o menores que las proporciones obtenidas cuando no se diluyen. Además, las proporciones obtenidas para el plasma de factor V (Leiden) serán por lo general menores que las proporciones obtenidas de plasma normal ensayado con las mismas condiciones de prueba. Antes de la presente invención, habría sido necesario añadir el plasma deficiente en factor V a todas las muestras de prueba de plasma y a continuación ensayar de nuevo las anormalidades de coagulación.

La utilización de soluciones de fuerza iónica baja, y particularmente de agua destilada es significativamente más barata que el plasma deficiente en factor V que se requiere en las pruebas actualmente utilizadas. Además, las soluciones de fuerza iónica baja, y particularmente el agua destilada, son mucho más fáciles de suministrar que el plasma deficiente en factor V. La presente invención por tanto ofrece una ventaja real en coste y en disponibilidad frente a otras pruebas que actualmente requieren utilizar plasma deficiente en factor V.

En un tercer aspecto, la presente invención consiste en un procedimiento para probar la deficiencia de antritrombina III en una muestra de plasma, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

(a): incubación previa de una primera muestra de un plasma de muestra con el factor Xa;

(b): añadir al primer plasma de muestra incubado previamente un reactivo para iniciar la coagulación y medir el tiempo de coagulación del plasma de prueba incubado previamente;

(c): añadir a una segunda muestra del plasma de prueba un reactivo para iniciar la coagulación y medir el tiempo de coagulación de la segunda muestra de prueba; y

(d): comparar los tiempos de coagulación de la primera y segunda muestras de prueba, en las que un tiempo de coagulación más corto en la primera muestra de prueba es indicativo de la deficiencia de antitrombina III en la muestra de plasma.

Preferentemente, en la etapa (a) el primer plasma de prueba está incubado previamente con un volumen igual de factor Xa en un regulador durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Más preferentemente, en la etapa (a) el plasma de muestra (0,1 ml) está incubado previamente con un volumen igual de factor Xa (óptimamente 0,002 \mu/ml o superior si se añaden GAGs) en tampón HEPES 0,02 M a pH 7,2 durante 5 minutos a 37ºC.

Preferentemente en la etapa (b) se añade un volumen igual adicional de cloruro de calcio que contiene lecitina de soja para iniciar la coagulación de la muestra incubada previamente y se determina el tiempo para coagular. Más preferentemente en la etapa (b) se añade un volumen igual adicional (0,1 ml) de cloruro de calcio 0,02M que contiene 0,1% lecitina de soja para iniciar la coagulación de la muestra previa. Se ha encontrado para los normales un intervalo objetivo de aproximadamente 80-120 seg.

El resultado anterior se compara con el que se obtiene cuando el mismo plasma de prueba se coagula con una mezcla de dos reactivos (es decir, el reactivo FXa y el reactivo de cloruro de calcio/fosfolípido). Preferentemente el mismo plasma de prueba (0,1 ml) se coagula con 0,2 ml de una mezcla 1:1 de 2 reactivos (es decir, el reactivo FXa y el reactivo de cloruro de calcio/fosfolípido). Se ha encontrado para los normales un intervalo objetivo de aproximadamente 30-35 seg.

En toda la presente memoria, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprenden", o variaciones de tal como "comprende" o "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un elemento establecido o entero o grupo de elementos o enteros pero no la exclusión de cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

Para que la naturaleza de la presente invención se pueda entender más claramente, se describirá una forma preferida con referencia al siguiente ejemplo y a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el efecto de variar el nivel de ACCV en las pruebas PCP/FVL sobre diversos plasmas de prueba. Los plasmas de prueba se incubaron previamente durante 5 minutos con variación de niveles de ACCV y a continuación se coagularon con RVV/fosfolípido/reactivo de calcio (LA-confirmación) en ACL300 en el modo APTT. Se muestran las velocidades de tiempos de coagulación RVV (velocidades PCP) trazadas como función de la concentración de ACCV (%).

La Figura 2 muestra el Protac™ o todo el veneno diluido de Agkistrodon Contortrix C (ACCV). Las diluciones de veneno (ACCV) se incubaron previamente con plasma normal de reserva durante 5 minutos y a continuación se coagularon con reactivo de veneno de víbora Russells rico en fosfolípidos (LA-confirmación). Los resultados muestran los tiempos de coagulación de RVV obtenidos en una máquina de coagulación ACL300 trazados como función de la concentración utilizada de Protac™ (\mu/ml/20) o ACCV (\mug/ml). (Observe que las velocidades PCP se calculan como los tiempos de coagulación RVV con cualquier ACCV o nivel de Protac™ dado dividido por el tiempo de coagulación sin activador presente).

La Figura 3 muestra el efecto de factores de riesgo trombótico individual sobre el PCP llevado a cabo con todo el veneno de ACC diluido. Las proporciones de PCP se muestran (tiempos de coagulación RVV con y sin activación de proteína C) trazadas como función del nivel de cada factor mostrado. De arriba abajo; HCF2; ATIII; Prot. S, Prot.C, Factor V (Leiden). Las mezclas preparadas a partir de plasmas deficientes en factor individual o (heterozigoto) positivo en factor V (Leiden) y de plasma normal de reserva, representan asimismo el 100%.

La Figura 4 muestra el efecto de factores de riesgo trombóticos individuales en un sistema de prueba mezclado de GAG/PCP. El reactivo de incubación previa contenía todo el ACCV diluido y 0,002 \mu/ml de factor Xa. El reactivo se mezcló con cada plasma de prueba durante 5 minutos a 37ºC antes de ser coagulado con un reactivo de veneno de víbora Russells reducido/fosfolípido/reactivo de calcio. Los resultados muestran que las proporciones de tiempos de coagulación con y sin incubación previa trazadas como función del nivel del factor. En orden descendente sobre el eje de la izquierda; HCF2, Prot.S, ATIII, Prot.C, Factor V (Leiden).

La Figura 5 muestra los resultados dudosos de PCP/FVL. Los resultados muestran el gráfico de dispersión de las proporciones de PCP/FVL obtenidas en diversos pacientes seleccionados de warfarina con plasmas puros y diluidos en agua. Ocho (8) plasmas puros proporcionaron todas las proporciones anormales dudosas (1,2 - 1,8), pero después de la dilución con agua, se consiguió mejorar la discriminación de los casos de FVL de los normales.

Modos de poner en práctica la presente invención Procedimiento

Se describe un procedimiento para una prueba de coagulación en la que es más específica para la detección de resistencia a la proteína C activada debido a la mutación del factor V (Leiden) que el sistema original descrito por Dahlback. El procedimiento implica 2 etapas. En la primera etapa, el plasma de muestra se incuba con todo el veneno diluido de Agkistrodon Contortrix a 0,002 - 0,004% y pH 7,5 durante 5 minutos. En la segunda etapa, se añade el veneno de víbora Russell rico en fosfolípidos y se determina el tiempo requerido para formar un coágulo de fibrina.

Se puede llevar a cabo una prueba de "control" o en blanco para detectar las anormalidades de coagulación en la línea de base exactamente de la misma manera, excepto que el veneno de Agkistrodon Contortrix debería estar presente en la primera etapa de incubación previa. Los sustratos cromogénicos se podrían utilizar como una alternativa para la formación del coágulo para detectar la formación de trombina, pero estos son más caros.

Mecanismo

Se sabe que el veneno de Agkistrodon Contortrix contiene un activador de proteína C. El componente activo se ha aislado y comercializado bajo la denominación comercial de "Protac™" por Pentapharm AB (Suiza). Protac™ se ha patentado para utilizar en pruebas para la cuantificación de proteína C y más recientemente en pruebas para evaluar la función de la ruta de la proteína C (PCP) como se ha descrito anteriormente. Durante el curso de la primera incubación (anteriormente) la proteína C en el plasma de muestra se convierte en una forma enzimáticamente activa (proteína C activada o APC). Este es un poderoso anticoagulante que destruye los factores Va y VIIIa, de ese modo interfiere con el mecanismo de coagulación y prolonga ciertas pruebas de coagulación. En individuos que son deficientes en proteínas C o S, se reduce el efecto anticoagulante del activador de proteína C del veneno relativo al normal y los tiempos de coagulación son más cortos que los normales. Asimismo, si el plasma del paciente contiene una mutación que ocurre comúnmente en el factor V denominada variante FV (Leiden), los tiempos de coagulación se prolongan menos mediante la proteína C activada o el activador de proteína C de veneno que con el plasma normal. FV (Leiden) carece de un sitio específico de escisión sensible a APC implicado en la inactivación del factor normal V y por tanto persiste en tales sistemas de pruebas y acorta los tiempos de coagulación.

Todos estos defectos interfieren en el funcionamiento normal de PCP y están asociados con la trombosis clínica. Los tres defectos se detectan por lo general mediante un resultado de la prueba de coagulación más corto que el normal en presencia de un activador de proteína C. Los pacientes que toman anticoagulantes orales han reducido los niveles de factores de coagulación dependientes de la vitamina K además de la proteína C y S y no se pueden generalmente seleccionar para el factor V (Leiden) con tal prueba. Se ha convertido en convencional mezclar tales plasmas de pacientes con plasmas deficientes en factor V para "corregir" todos los defectos del factor de coagulación y de los niveles de proteína C y S antes de llevar a cabo una prueba de resistencia a APC para factor V (Leiden).

El presente inventor ha encontrado que es preferible la utilización de todo el veneno diluido de Agkistrodon Contortrix (ACCV) a la utilización del activador de proteína C aislado en la prueba de PCP basada en RVV en el documento WO 96/04560 por las razones siguientes. La prueba llega a ser más insensible a la deficiencia en proteína S (que es un factor de riesgo trombótico menos importante que el FVL o proteína C), menos afectado por los niveles bajos de proteína C y más sensible al factor V (Leiden). El efecto de niveles relativamente elevados de ACCV sobre el RVVT de plasma normal parece ser similar al de los niveles más bajos, a diferencia del activador aislado que prolonga el RVVT a un grado incrementado con la concentración. Se pueden utilizar niveles elevados de ACCV para activar las concentraciones pequeñas de proteína C encontradas en pacientes con anticoagulantes orales para un mayor efecto en la prueba y para superar la resistencia al APC adquirida en pacientes que toman anticonceptivos orales o que están embarazadas. De este modo mediante la utilización de niveles elevados de todo el ACCV es posible seleccionar para la deficiencia en el factor V (Leiden) en plasma de pacientes de warfarina, plasma de embarazo y otras condiciones que previamente requieren mezclar con el factor V deficiente u otros factores normalizadores.

Ventajas

1. No hay necesidad de mezclar el plasma de prueba con el plasma deficiente en factor V para la detección del factor V (Leiden) entre los pacientes complejos.

2. Las deficiencias de la curva de la concentración significan que se pueden añadir niveles elevados de ACCV con tiempo de coagulación normal menos prolongado.

Procedimiento

La prueba mejorada está basada en la prueba de selección PCP específica-factor V (Leiden) que utiliza un reactivo RVV rico en fosfolípido. La composición del reactivo se ha modificado para hacerla menos sensible que lo normal a las variaciones en los niveles de Proteína C y en Proteína S en presencia de un activador de proteína C. Esta prueba es más confiable que las basadas en APTTs y PTs ya que este reactivo RVV ya está designado para ser resistente a la heparina y al anticoagulante de lupus y debido a que este mecanismo es a través de una ruta común.

Reactivos 1. Activador de proteína C (PCA)

Preparación

-: reconstituir en volumen de agua destilada como se indica en el vial

-: invertir suavemente para mezclar. NO AGITAR

-: dejar reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de utilizarlo.

2. Reactivo PRVV (reactivo de veneno de víbora Russell rico en fosfolípido)

Preparación

-: reconstituir en volumen de agua destilada como se indica en el vial

-: invertir suavemente para mezclar. NO AGITAR

Estabilidad reconstituida

Producto	Condiciones	Tiempo
PCA	2-8ºC	48 horas
	37ºC	12 horas
PRVV	2-8ºC	48 horas
	37ºC	12 horas
	-20ºC
	(congelar, descongelar solo una vez)	1 mes

Espécimen

Mezclar nueve partes de sangre recién recogida con una parte de citrato de trisodio al 3,5% (0,12 M). Centrifugar tan pronto como sea posible después de la recogida a \geq1500 g durante 15 minutos. Separar el plasma y guardar a 2-8ºC. Probar al cabo de 4 horas de la recogida. El plasma se puede almacenar congelado a -30ºC o más durante hasta seis meses.

Especímenes con ictericia, lipémicos y hemolisados pueden dar falsos resultados de tiempos de coagulación. Estos resultados pueden asimismo ocurrir en pacientes con hematocrito anormales, puesto que el plasma a la concentración del citrato en estas muestras no es óptima.

Procedimiento de prueba Procedimiento

La Prueba PCP no se afecta por niveles de heparina de hasta 0,5 IU/ml.

Se recomienda que se utilice una mezcla 1:1 de un plasma de paciente a un plasma deficiente en factor V para examinar pacientes con anticoagulantes orales. Esto corregirá las deficiencias de factor más que comprometer la prueba.

Prueba con activador PC

1.: Calentar previamente un ligero exceso de reactivo PRVV, dejando 0,1 ml para examinar, a 37ºC \pm 1ºC en un reactivo de reserva.

2.: Poner 0,1 ml de plasma de prueba en un tubo de ensayo.

3.: Añadir 0,1 ml de activador al plasma de ensayo y calentar a 37ºC durante 5 minutos.

4.: Añadir 0,1 ml de reactivo PRVV calentado previamente y controlar el tiempo desde el momento de adición del reactivo al punto final de coagulación utilizando la técnica del tubo inclinado.

5.: Repetir para valores de ensayo duplicados e informar del promedio de éstos como resultado.

Prueba sin activador PC

2.: Poner 0,1 ml de plasma de prueba en un tubo de ensayo.

3.: Añadir 0,1 ml de agua destilada al plasma de ensayo y calentar a 37ºC durante 5 minutos.

Los resultados de las pruebas PCP de diversos niveles de veneno de A. Contortrix complejo en diversas pruebas de plasma se muestran en la Figura 1. La utilización de niveles de entre 0,002 a 0,004% de ACCV en la prueba permiten la diferenciación entre sueros de individuos normales (PNP1, PNP2 y PNP3), reserva de anticoagulante oral (reserva O/A) y sueros de reserva de individuos embarazados (PREG de RESERVA), de pacientes con función de coagulación deteriorada (FV(L) y FV(L) + O/A). Los valores de PCP por debajo de 2 y 2,5, respectivamente para pruebas utilizando 0,002 y 0,004% de ACCV se ven como indicativos de coagulación deteriorada.

La Figura 1 muestra las proporciones de tiempo de coagulación (PCP) de la ruta de la proteína C (tiempos de coagulación con activador de proteína C presente/ los de sin activador) obtenidas en una serie de pacientes y normales utilizando niveles de veneno de Agkistrodon Contortrix Contortrix (ACCV). Los plasmas normales muestran el efecto mayor inicialmente, pero parecen bajar a niveles de ACCV superiores a 0,002%. Plasmas tratados con anticoagulantes orales, plasmas deficitarios en factor (parcialmente absorbido en alúmina) y plasmas de embarazadas mostraron un incremento más gradual sin evidencia de un descenso. Los plasmas positivos con Factor V (Leiden) permanecieron todos inferiores. De este modo, mediante la selección de un nivel de ACCV apropiado de aproximadamente 0,003% es posible acomodar los casos negativos de FVL dentro de un intervalo ajustado de proporción de PCP, representando el intervalo normal o de referencia, a pasar de otros factores complicados. (Obsérvese que este sistema basado en RVV ya es insensible a niveles terapéuticos de heparina y a cualquiera de las anormalidades que implican los factores superiores al factor X en la ruta de coagulación).

La Figura 2 muestra una comparación directa de Protac™ con veneno de Agkistrodon Contortrix (ACCV) en la prueba PCP. Se añadieron niveles incrementados de ambos activadores de proteína C al plasma normal de reserva antes de ensayar con el reactivo RVV diluido rico en fosfolípido. Ambos activadores resultaron en tiempos de coagulación prolongados similarmente a niveles inferiores a 10 \mug/ml para ACCV o 0,5 \mu/ml para Protac. Sin embargo, por encima de esta concentración de Protac™ proporcionaron una prolongación adicional, mientras que el ACCV proporcionó tiempos de coagulación más cortos. Esta es la razón para los descensos inesperados en las proporciones PCP para plasma normal en la Figura 1 a niveles de ACCV superiores a 0,002%. Es ésta la proporción de PCP "descendente" con normales que permite comparaciones válidas frente a mediciones similares de resistencia a APC y defectos PCP en plasmas con defectos tales como los debidos a los anticoagulantes orales según se muestra en la Figura 1.

Ensayo de confirmación de Factor V (Leiden)

Para diferenciar entre muestras normales y de factor V (Leiden) que dieron resultados "dudosos" en el ensayo de coagulación de sangre según la presente invención, las muestras se ensayaron de nuevo después de ser primero diluidas a 1:1 en agua destilada. Los resultados se muestran en la Figura 5. Las tres muestras de factor V (Leiden) ensayadas produjeron proporciones inferiores a las de las muestras normales ensayadas de nuevo después de la dilución con agua. Este descubrimiento permite el ensayo de muestras sin la necesidad de añadir el plasma deficiente en factor V a las muestras que se van a ensayar.

Ensayo GAG

Esta prueba básica se lleva a cabo en dos partes: en primer lugar, un procedimiento de dos etapas que implica una incubación previa, similar a APTT y en segundo lugar, un ensayo de una etapa sin incubaciones previas, justo similar a la prueba PT.

En el procedimiento de 2 etapas, el plasma de prueba (p.ej., 0,1 ml) se incuba previamente con un volumen igual de factor Xa (óptimamente 0,002 \mu/ml o superior si se añaden GAGs) en tampón HEPES 0,02M a pH 7,2 durante 5 minutos a 37ºC. A continuación se añade un volumen adicional igual (0,1 ml) de cloruro de calcio 0,02 M que contiene 0,1% de lecitina de soja y se determina el tiempo de coagulación. El intervalo objetivo es 80-120 seg. para los normales.

El resultado anterior se compara con el obtenido cuando el mismo plasma de prueba (0,1ml) se coagula con 0,2 ml de una mezcla 1:1 de los 2 reactivos (es decir, el reactivo Fxa y el reactivo de cloruro de calcio/fosfolípido). El intervalo objetivo es 30-35 seg.

Se apreciará por los expertos en la técnica que se pueden hacer numerosas variaciones y/o modificaciones a la presente invención según se muestra en las formas de realización específicas sin salir del espíritu o del alcance de la presente invención como se ha descrito ampliamente. Las presentes formas de realización se van a considerar, por tanto, en todos los aspectos como ilustrativos y no restrictivos.

Referencias

Bertina RM, Keulemans BPC, Koster T, et al. - Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 369; 64-67, 1994.

Dahlback B - Inherited Thrombophilia: Resistance to activated protein C as a pathogenic factor of venous thromboembolism. Blood 85; 607-614, 1995.

Mitchell CA, Rowell JA, Hau L, et al. - Fatal thrombotic disorder associated with an acquired inhibitor of protein C. N. England J. Med. 317; 1638-16, 1987

Amer L, Kisiel W, Searles RP, Williams JRC - Impairment of the protein C anticoagulant pathway in a patient with systemic lupus erythematosus, anticardiolipin antibodies and thrombosis. Thromb. Res. 57, 247-1990

Claims

1. Procedimiento para determinar el potencial de coagulación de una muestra de plasma, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

(a): incubar previamente la muestra de plasma con un reactivo de todo el veneno de serpiente sustancialmente diluido, de tal modo que:

(i): la proteína endógena C en el plasma se convierte por lo menos parcialmente en proteína C activada por el reactivo, y

(ii): añadir el factor Xa que está progresivamente inactivado por el antitrombina III/ heparina cofactor 2 durante la incubación previa;

(ii): componentes, tales como iones de calcio y fosfolípidos, que son necesarios para la coagulación eficaz de la muestra de plasma;

(c): monitorizar una reacción indicativa de la velocidad de coagulación de la muestra de plasma;

(d): comparar la velocidad de coagulación detectada en la etapa (c) con la velocidad equivalente determinada para un paciente normal, o comparar la velocidad de coagulación detectada en la etapa (c) con la velocidad equivalente determinada para la muestra de plasma en ausencia del activador de proteína C; y

(e): determinar el potencial de coagulación de la muestra de plasma a partir de una u otra de las comparaciones realizadas en la etapa (d).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el reactivo utilizado en la etapa (a) contiene adicionalmente niveles bajos de glucosaminoglucanos.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que los glucosaminoglucanos se seleccionan de entre el grupo que consiste en heparinas de peso molecular bajo o regular, y sulfatos de dermatán o de dextrán.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el veneno de serpiente diluido se deriva de Agkistrodon Contortrix, o de especies relacionadas que incluyen A. Piscovorus, A. Bilineatus, A.C. Laticinctus, A.C. Moccason.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el veneno de serpiente es todo el veneno diluido de A. Contortrix a una concentración de 0,002%.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa de incubación previa en la etapa (a) se lleva a cabo en condiciones neutras o ligeramente básicas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la etapa de incubación previa se lleva a cabo a pH 7,5.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la incubación previa se lleva a cabo durante tiempo suficiente para la activación de proteína C en el plasma.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el tiempo de incubación previo es de 5 minutos.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el factor Xa es de origen animal o humano.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el reactivo exógeno que activa el factor X a Xa se deriva del veneno de víbora Russells (Vipera Russelli) o de otras especies inmunológicamente reactivas-cruzadas.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el reactivo exógeno que activa la protrombina a trombina en una forma dependiente del factor V se deriva de venenos de serpiente australianos Notechis o Pseudonaja.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el veneno de serpiente se obtiene a partir de las especies seleccionadas de entre el grupo que consiste en Pseudonaja Textilis, Notecis Scutatus y Oxyuranus Scutellatus.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que los reactivos en la etapa (b) se combinan en una mezcla única mediante la utilización de tensioactivos.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que los tensioactivos son detergentes no iónicos.

16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, en el que la mezcla única contiene adicionalmente componentes suplementarios seleccionados de entre el grupo que consiste en reguladores, conservantes, polibreno u otros agentes para invertir el efecto de cualquier heparina que pueda estar presente en las muestras de ensayo o que se pueda añadir al reactivo de incubación previa (i), y fosfolípido a una fuerza iónica elevada para superar inhibidores no específicos tales como anticoagulantes de lupus que puedan estar presentes en la muestra de plasma.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la monitorización de una reacción indicativa de la velocidad de coagulación de la muestra de plasma es un ensayo de tiempo de coagulación o un ensayo cromométrico o fluorométrico utilizando un sustrato detectable.

18. Procedimiento para diferenciar entre un paciente con factor V (Leiden) y un individuo normal, comprendiendo dicho procedimiento la dilución de una muestra de plasma del paciente y el individuo normal con una solución de fuerza iónica baja seguida de la determinación del potencial de coagulación de las muestras mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el plasma de factor V (Leiden) poseerá una velocidad de coagulación igual a o menor que la velocidad obtenida cuando no está diluida y menor que la velocidad del plasma normal.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que las muestras de plasma se diluyen con agua en una relación 1:1.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el agua es agua destilada o agua filtrada.