ES2218221T3 - Metodo de poracion de membranas biologicas. - Google Patents

Abstract

Un método para introducir o extraer biopartículas en/de estructuras envueltas con membrana biológica in vitro, que comprende: aplicar un campo magnético alterno a una muestra que comprende estructuras envueltas con membrana biológica y partículas magnéticamente susceptibles, por lo que un incremento de la energía térmica o cinética de dichas partículas magnéticamente susceptibles causa la formación de poros en dichas estructuras envueltas con membrana biológica, cuyos poros permiten la introducción o extracción de biopartículas en/de dichas estructuras envueltas con membrana biológica.

Description

Método de poración de membranas biológicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para usar, entre otros, en trabajos de biología molecular.

Técnica antecedente

En los campos de la investigación en biotecnología y medicina, a menudo es necesario introducir una gran molécula o una biopartícula en una estructura biológica, como una célula bacteriana. Células y también virus tienen una barrera externa para proteger frente al entorno y también un sistema de transporte selectivo para sustancias nutritivas. Para forzar los mecanismos de protección naturales e introducir una sustancia que no sea deseable para el organismo diana, es necesario algún tipo de tratamiento químico o físico de la célula diana. Ejemplos de técnicas de forzamiento de la membrana celular externa de las células y, donde sea apropiado, también, de la pared celular, están disponibles en los campos de la investigación en ingeniería genética y biología molecular.

Cuando se transfiere un nuevo código genético a una célula huésped especialmente seleccionada, la técnica se denomina transformación o transfección. No hay un método general que tenga que usarse para todo tipo de células, pero para cada tipo de célula y uso se dispone de una técnica. Además, no es posible transformar todos los tipos de células usando las técnicas que están actualmente disponibles. En 1970, Mandel e Higa (J. Mol. Bio. 53: 159-162) informaron que las células de E. coli que habían sido previamente tratadas con CaCl_{2} podía hacerse que tomaran ADN extraño cuando se somete a choque térmico. Después de eso el método se ha desarrollado de forma continua (véase, por ejemplo, el documento WO 9728248. Exponiendo las células, durante una fracción de segundo, a un pulso eléctrico de alto voltaje, los poros en las membranas celulares se abren, denominado como electroporación (Zimmerman et al., J. Membr. Biol. 67: 165-82 (1983)), lo que es frecuentemente usado como transformación técnica. Las bacterias, levadura y en algunos casos también las células mamarias y las células vegetales pueden, en condiciones específicas, ser transformadas por medio de electroporación. También en este caso, está en curso un desarrollo continuo de la técnica (véanse los documentos WO 981231 y WO 9906101). En los dos métodos descritos anteriormente, la envuelta celular se abre suficientemente larga para que la molécula de ADN entre en la célula. El tercer y último método desarrollado para transformación es llamado lipofección (Old y Primrose, en Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Gene Manipulation, Blackwell Science (1995)) donde el ADN extraño se encierra en/se enlaza a un liposoma catiónico que se fusiona con la membrana externa de la célula diana. Hay una técnica más comercial para la transformación de las células vegetales, donde una parte vegetal seleccionada con este propósito se bombardea con pequeños granos de oro que se preparan con el gen extraño (Boynton J. E. et al., Science 240, 1534-1538, 1988). Tal transferencia de genes ha sido desarrollada para la transformación de otros tejidos, tales como bacterias, hongos, células de insecto y de mamífero (Johnston S.A., Nature 346, 776-777, 1990). Un método adicional para crear poros transitorios en membranas biológicas describes descrito por T.E. Vaughan y J.C. Weaver (véanse Biophys. J. (1996) 71, 616-622 y Bioelectrochem. Bioenerg. (1998) 46, 121-128) que se basa en la aplicación a las células o tejidos biológicos de un campo magnético de impulsos que comprende partículas magnéticas que aparecen de forma natural.

Especialmente en las aplicaciones descritas anteriormente es en donde puede usarse la presente invención. Sin embargo, es bastante posible usar el dispositivo de la invención para introducir otros materiales exógenos en aplicaciones como la transferencia directa de proteínas, moléculas de ARN, ácidos grasos, péptidos, preparaciones médicas, etc., para estudiar la respuesta de células y virus específicos. Además, el dispositivo según la invención es particularmente adecuado para la lisis de células con el propósito de llevar a cabo lisis así como la identificación y aislamiento de componentes celulares específicos en uno e igual método.

Sumario de la invención

Así, la presente invención se refiere a un método para la introducción y/o extracción de partículas en/de estructuras envueltas con membrana biológica definidas en las reivindicaciones adjuntas. El dispositivo usado se caracteriza porque comprende al menos una bobina en la que puede generarse un campo magnético alterno y en la que puede insertarse una muestra, donde dicho campo magnético causa un incremento de la energía térmica y/o cinética de partículas magnéticamente susceptibles en dicha muestra, causando la energía térmica y/o cinética incrementada de dichas partículas la formación de poros en estructuras envueltas con membrana biológica que han de ser encontradas en dicha muestra, permitiendo dichos poros la introducción o extracción de biopartículas en/de dichas estructuras envueltas con membrana biológica.

El método según la invención se usa para lisis específica de células, o para modificar el código genético y/o metabolismo de una célula huésped.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un croquis de principio del dispositivo según la presente invención.

La Fig. 2 es un Ejemplo de un circuito electrónico de suministro de corriente.

La Fig. 3 es un Ejemplo de la conexión de una bobina.

La Fig. 4 muestra un Ejemplo de una partícula magnéticamente susceptible.

La Fig. 5 muestra un dispositivo que puede generar un campo gradiente.

Descripción detallada de la invención

Según un aspecto de la invención, el método se caracteriza porque dicho campo magnético tiene una dirección de campo alterno de una frecuencia en el intervalo de 1-5 MHz.

Según otro aspecto, el método se caracteriza porque dicho campo magnético tiene una intensidad de campo de al menos 1 mT.

Según un aspecto más, la invención se caracteriza porque dicho campo magnético no es homogéneo y tiene una dirección de campo gradiente alterno, siendo la dirección de dicho campo gradiente alterno generada por dos bobinas, y dicha muestra se inserta entre las bobinas.

Según un aspecto más, el método según la invención se caracteriza porque dichas bobinas se suministran con corriente alterna de diferentes frecuencias.

Según todavía otro aspecto, el método se caracteriza porque dichas bobinas se suministran con la parte positiva o con la parte negativa de la corriente alterna suministrada.

Según otro aspecto, el método implica el uso de un termostato para asegurar el control de temperatura de dicha bobina o bobinas y/o de dicha muestra.

Según un aspecto adicional, el método requiere un cronometraje variable para asegurar el control del tiempo durante el que dicha corriente alterna está funcionando y durante el que dicha muestra está expuesta a dicho campo magnético aplicado.

Según otro aspecto, el método implica el uso de un sistema de control para asegurar la regulación de intensidad y frecuencia de dicha corriente alterna.

Las estructuras envueltas con membrana biológica consisten, entre otros, en tejidos corporales, células, bacterias, partículas víricas, orgánulos a nivel subcelular, liposomas o proteínas.

Las biopartículas que son adecuadas para la introducción en/extracción de estructuras envueltas con membranas son, entre otras, moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteínas, otros biopolímeros, péptidos, preparaciones químicas, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos o polímeros sintéticos o combinaciones de los mismos.

La técnica sobre la que se basa parcialmente la invención es una combinación de nanotecnología magnética y química de péptidos. En la técnica se usa como reactivo una partícula magnéticamente susceptible que tenga un tamaño de entre algunas décimas de micrometros y un nanometro. Cuando una partícula de este tipo se expone a un cierto campo magnético, se hace vibrar y genera calor. La Fig. 1 es un croquis de principio de la presente invención. La muestra biológica se mezcla con un reactivo proyectado con este propósito y luego se coloca en un portamuestras (a). La intensidad y frecuencia deseadas de la fuente magnética (b) se ajustan, después de lo cual se ajusta la deseada temperatura del elemento refrigerante (c). La fuente magnética es una bobina o dos bobinas, siendo la muestra colocada entre ellas según la Fig. 5. La fuente magnética y el portamuestras se encierran en una unidad aislada, en la cual la temperatura se determina por el elemento refrigerante. Para asegurar la temperatura correcta en el portamuestras, puede conectarse al sistema un sensor de temperatura (d) al sistema. Las variables temperatura, intensidad y frecuencia del campo magnético y los intervalos de tratamiento son controlados y pueden seguirse en una pantalla digital (e).

La Fig. 2 ilustra un ejemplo de un circuito electrónico de suministro de corriente que comprende un oscilador (1) basado en el circuito XR2206, cuya señal de salida (2) es amplificada por una etapa de amplificación de potencia (3), que se basa en el circuito PBD 3548/1, cuya señal de salida (4) puede funcionar con una corriente alterna (1 MHz, 2A) a través de una o más bobinas. Un ejemplo de la conexión de dicha bobina se muestra en la Fig. 3, con un circuito oscilante que consiste en una resistencia (6) de 2 \Omega, un condensador (7) de 0,50 nF y una bobina (8) de 50 \muH, siendo dicho circuito suministrado con corriente alterna (5). Para una persona experta en la técnica es obvio que el ejemplo anteriormente descrito ilustrado en las Figs. 2 y 3 puede ser modificado fácilmente y que puede obtenerse el mismo resultado con la ayuda de conexiones y bobinas alternativas.

Ejemplos de materiales magnéticos que se usan en el método según la invención se describen en la literatura de patentes, por ejemplo el documento US 4.323.056 (Borelli et al.). La partícula magnéticamente susceptible y una posible configuración se ilustran también en la Fig. 4. El núcleo magnéticamente susceptible (9) de la partícula consiste esencialmente en magnetita (óxido de hierro). Adicionalmente, la partícula es revestida con una capa externa (10) que consiste en un polímero derivatizado (Dextrano), o una monocapa o, alternativamente, una bicapa de ácidos grasos derivatizados. La elección del tipo (número de aminoácidos o unidades de hidratos de carbono y secuencia) de ligando 11 que se usa para la derivatización se adapta individualmente a cada aplicación de la partícula magnéticamente susceptible, cuyo efecto puede ser amplificado todavía más por su superficie que es, además, modificada con una o más moléculas de efector 12.

Al añadir dichas partículas a una suspensión de células y exponer luego la célula a un campo magnético con la dirección del campo alterna, se obtiene el calentamiento instantáneo del medio que rodea cada partícula magnéticamente susceptible. El calor induce un choque térmico en la célula y en la membrana celular, que causa aperturas temporales en la membrana celular. El calor es inducido rápidamente y de forma homogénea en toda la muestra, lo que hace posible exponer la célula y las muestras a tratamiento durante un corto tiempo, lo que incrementa la frecuencia de supervivencia de las células expuestas. El Ejemplo 1 describe la transformación de Escherichia coli.

En un método de transformación convencional que implica un choque térmico, el tubo de ensayo que contiene la suspensión de célula se expone a una temperatura ambiente superior (42ºC), por lo que un gradiente de temperatura aparece en la pared del tubo de ensayo y en la muestra, cuya composición requiere más tiempo que el método según la presente invención y que implica además que las células que están situadas más cerca de la pared celular están expuestas a mayor temperatura durante más tiempo que aquellas en el centro del tubo. Así, alguna de la células se destruirán debido al aumento de temperatura mientras una fracción de las células permanece sin tratar. El método según la invención elimina este problema por el calentamiento instantáneo alrededor de cada partícula en el portamuestras. El efecto es amplificado si la partícula se dirige además inmediatamente a las envueltas celulares mediante las moléculas ligando sobre la superficie de la partícula. Esto es una gran ventaja comparado con métodos de transformación convencionales en los que el equilibrio entre el choque térmico y la muerte de las células es importante para el resultado final.

Además, la intensidad de campo del campo magnético puede variarse en el espacio, un llamado campo gradiente que en combinación con la dirección del campo alterno causa vibraciones mecánicas (incrementos de energía cinética) en las partículas, que en combinación con la radiación térmica (energía térmica) amplifica el efecto de las partículas sobre la membrana celular que rodea a todas las células (y a la pared celular, cuando sea apropiado). La presente invención describe un método completamente nuevo que implica la inducción de calor o la introducción potente de fuerzas de corte, o su combinación. Las fuerzas de corte inician dislocaciones en la membrana celular debido a fatiga mecánica, que da como resultado roturas en las membranas celulares (y en las paredes celulares en los casos en que la célula diana sea, por ejemplo, una bacteria). El método se basa en el uso de un campo magnético de gradiente alterno aplicado externamente. Un campo gradiente está provisto de al menos dos bobinas, que son suministradas con la parte positiva o con la parte negativa de la corriente alterna suministrada, o alternativamente dichas bobinas son suministradas con corrientes alternas de diferentes frecuencias. Un dispositivo que puede generar un campo gradiente se describe en la Fig. 5. El principio funcional se basa en dos bobinas (A) y (B) (con o sin núcleo de ferrita) estando dispuestos opuestos entre sí según la Fig. 5. Una unidad de control (C) controla la corriente a través de las bobinas, de manera que las bobinas sólo una cada vez tienen un paso de corriente a través de sus bobinados. Esta alternancia de la corriente, cuya frecuencia es controlada por medio del oscilador (OSC), da como resultado las bobinas que generan de forma alternante los campos magnéticos gradientes (D) y (E) con direcciones de gradiente diferentes. Una partícula (P) magnéticamente susceptible situada entre las bobinas experimentará un campo magnético gradiente con dirección periódicamente alterna, que inducirá una vibración mecánica. Alternativamente, un campo gradiente puede ser generado cuando las dos bobinas se suministren con corrientes de dos diferentes frecuencias. La diferencia en frecuencia entre la corriente en las dos bobinas controla la frecuencia de la alternancia del gradiente.

Al dejar que tenga lugar el tratamiento magnético durante un corto período de tiempo, se crean las condiciones para un gran número de células supervivientes después del tratamiento. Mientras la envuelta celular se abre, la molécula que ha de ser transformada debe ser introducida en la célula. Para optimizar este procedimiento, la molécula puede ser dirigida también a la envuelta celular. Ambos procesos son efectuados conectando moléculas de reconocimiento para enlazar por una parte a la superficie celular y por otra parte a dicha molécula de una e igual partícula ferromagnética. Moléculas, que sobre una base bioquímica pueden reconocer y enlazar con estructuras biológicas de diferentes tipos pueden ser, por ejemplo, pequeños péptidos sintéticos, partes de un anticuerpo o de una enzima.

Al conectar una molécula de reconocimiento de una proteína diana, como una proteína recombinante, a las partículas magnéticamente susceptibles, el dispositivo según la invención puede usarse para lisis y purificación específica de dicha proteína diana en uno e igual método. Comparada con técnicas alternativas de lisis (principalmente lisis enzimática y mecánica), en combinación con una o más etapas de purificación, el uso del dispositivo según la invención ahorra sobre todo tiempo, pero también material.

El dispositivo inventivo puede usarse ventajosamente, por una parte, para un método de transformación y, por otra parte, para la purificación de componentes celulares específicos, lo que hace único el dispositivo. Sin tener en cuenta el propósito, el método debería tener lugar mientras las bobinas se mantienen a una temperatura constante, lo que significa que un elemento refrigerante y un control de temperatura deberían ser incorporados en el equipo magnético controlable. Además, es ventajoso para los diversos campos de potencial de aplicación del dispositivo que sean variables la intensidad y frecuencia del campo magnético, así como también el tiempo durante el que la muestra está expuesta al tratamiento.

Ejemplo 1

El siguiente Ejemplo describe un método para la transformación de Escherichia coli (E. coli) con plásmido pUC18:

100 \mul de células competentes de E. coli se mezclan a 0ºC con 500 \mug de pUC18 disueltos en 30 \mul de CaCl_{2} 0,05 M. La muestra es introducida en el recipiente de muestra en el dispositivo según la invención y es incubada durante 30 min a 0ºC en la bobina. Luego, la muestra es tratada durante 30 s a 1 MHz y 2A. Después, se añade a la muestra 1ml de caldo LB estéril, que se incuba después al baño maría durante 1 h a 37ºC. Posteriormente, las células se derraman sobre placas con agar que contienen presión de selección, 50 \mug/\mul de ampicilina, para que se obtengan sólo las bacterias transformadas. El experimento debería incluir una muestra de referencia que no contenga pUC18 para evaluar la frecuencia de supervivencia y de transformación.

Claims (10)

1. Un método para introducir o extraer biopartículas en/de estructuras envueltas con membrana biológica in vitro, que comprende:

aplicar un campo magnético alterno a una muestra que comprende estructuras envueltas con membrana biológica y partículas magnéticamente susceptibles, por lo que un incremento de la energía térmica o cinética de dichas partículas magnéticamente susceptibles causa la formación de poros en dichas estructuras envueltas con membrana biológica,

cuyos poros permiten la introducción o extracción de biopartículas en/de dichas estructuras envueltas con membrana biológica.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho campo magnético tiene una dirección del campo alterno de una frecuencia en el intervalo de 1-5 MHz.

3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho campo magnético tiene una intensidad de campo de 1 mT.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho campo magnético es no homogéneo y tiene una dirección del campo gradiente alterno, siendo generada la dirección de dicho campo gradiente alterno por dos bobinas, y dicha muestra está insertada entre las bobinas.

5. Un método según la reivindicación 4, en el que dichas bobinas son suministradas con corrientes alternas de diferentes frecuencias.

6. Un método según la reivindicación 4, en el que dichas bobinas son suministradas o con la parte positiva o con la parte negativa de corriente alterna suministrada.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dichas biopartículas se seleccionan del grupo que comprende moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteínas, otros biopolímeros, péptidos, preparaciones químicas, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos o polímeros sintéticos o combinaciones de los mismos.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dichas estructuras envueltas con membrana biológica se seleccionan del grupo que comprende tejidos corporales, células, bacterias, partículas víricas, orgánulos a un nivel subcelular, liposomas o proteínas.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para uso para lisis específica de células.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para uso para modificar el código genético de una célula huésped y/o el metabolismo.