ES2218525T3 - Metodo y preparaciones farmaceuticas para el tratamiento de trastornos neurologicos. - Google Patents

Metodo y preparaciones farmaceuticas para el tratamiento de trastornos neurologicos.

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ES2218525T3 ES94918217T ES94918217T ES2218525T3 ES 2218525 T3 ES2218525 T3 ES 2218525T3 ES 94918217 T ES94918217 T ES 94918217T ES 94918217 T ES94918217 T ES 94918217T ES 2218525 T3 ES2218525 T3 ES 2218525T3
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Abstract

UN METODO PARA TRATAR UN TRASTORNO NEUROLOGICO CONSISTE EN ADMINISTRAR A UNA PERSONA AFECTADA POR TAL TRASTORNO UN ACEITE MICROBIANO QUE COMPRENDE DHA, UN ACEITE MICROBIANO QUE COMPRENDE UNA COMBINACION DE ACEITE DHA Y UNA CANTIDAD SUFICIENTE PARA ELEVAR LOS NIVELES DE DHA Y/O EN LA SANGRE DE UNA PERSONA O AL MENOS NIVELES NORMALES.

Description

Método y preparaciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos neurológicos.
Campo de la invención
Esta invención se relaciona con usos terapéuticos para el tratamiento de trastornos neurológicos, incluyendo ciertas enfermedades neurodegenerativas y trastornos psiquiátricos, según se define en las reivindicaciones, mediante administración de una composición consistente en una cantidad terapéuticamente efectiva de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contienen ácido docosahexanoico ("DHA") y/o un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contienen ácido araquidónico ("ARA") a una persona que necesite dicho tratamiento. Los aceites pueden ser administrados como una composición farmacéutica, como un suplemento dietético o en forma de un producto alimenticio substituyendo una porción del aceite vegetal o grasa del mismo.
Antecedentes de la invención
El cerebro humano y otros tejidos neurales están altamente enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga que se piensa tienen un papel importante en la modulación de la estructura, la fluidez y la función de las membranas celulares de estos tejidos. El ácido araquidónico (al que en adelante se hará aquí referencia como ARA) es un ácido graso poliinsaturado de cadena larga de la clase \omega-6 (ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico, 20:4\omega-6) y es el ácido graso poliinsaturado C_{20} más abundante en el cuerpo humano. Además de su función primaria como lípido estructural, el ARA es también el precursor directo para una serie de eicosenoides circulantes, tales como la prostaglandina E_{2} (PGE_{2}), la prostaciclina I_{2} (PGI_{2}), el tromboxano A_{2} (T_{x}A_{2}) y los leucotrienos B_{4} (LTB_{4}) y C_{4} (LTC_{4}). Estos eicosenoides exhiben efectos reguladores sobre el metabolismo de las lipoproteínas, la reología de la sangre, el tono vascular, la función de los leucocitos y la activación plaquetaria. En humanos, el ARA no se sintetiza de novo, sino que puede ser sintetizado por alargamiento y saturación del ácido linoleico, un ácido graso esencial que se ha de obtener de la dieta.
El ácido docosahexanoico (ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexanoico 22:6\omega-3) (al que en adelante se hará referencia como el DHA) es el más abundante de los ácidos grasos de los componentes estructurales de la materia gris del cerebro humano y de otros tejidos neurales. El DHA no puede ser sintetizado de novo en humanos, pero hay alguna evidencia de que este ácido graso \omega-3 puede ser sintetizado por algunos tipos celulares, tales como los astrocitos, si se proporcionan en la dieta los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga apropiados. S. Moore y col., Journ. Of Neurochemistry 56 (1991), pp. 518 a 524. Se cree que la mayor parte del DHA que se encuentra en las membranas de las células del cerebro y de la retina se obtiene de fuentes dietéticas.
Es bien conocida en la técnica la importancia de la aportación de ácidos grasos poliinsaturados durante un período de rápido desarrollo del cerebro para evitar daños irreparables en las células cerebrales. Los niños humanos parecen tener una capacidad particularmente pobre para sintetizar DHA, pero se puede compensar cualquier deficiencia alimentando a los niños con leche humana, que es una fuente rica de ácidos grasos esenciales, particularmente de DHA y de ARA. Sanders y col., Am. J. Clin. Nutr., 31 (1978), pp. 805-813. Estudios recientes que comparan el rendimiento en las pruebas de inteligencia estándar de niños a los que se alimentó con leche humana de bebés con niños a los que se alimentó con fórmulas para niños comerciales de bebés han sugerido una relación dosis-respuesta entre la proporción de la leche materna en la dieta y el posterior CI. A Lucas, R. Morley, T.J. Cole, G. Lister y C. Leeson-Payne, Lancet 339 (1992), pp. 261-264. Estos estudios sugieren que la terapia de intervención de la dieta puede afectar a los niveles de DHA disponible para el desarrollo estructural del sistema nervioso.
Se ha observado que los niveles de DHA en dos clases principales de fosfolípidos, la fosfatidiletanoamina y la fosfatidilcolina, se reducen significativamente en los tejidos cerebrales de pacientes en enfermedad de Alzheimer. Las muestras de control tomadas de pacientes de edad avanzada que no tenían manifestaciones clínicas de demencia o de otros trastornos mentales no mostraron cambios significativos en la composición de ácidos grasos de estas dos clases de fosfolípidos. Estos resultados sugieren que las alteraciones en las concentraciones de DHA en el tejido cerebral de pacientes de Alzheimer no son el resultado del envejecimiento normal, sino que son específicas de los mecanismos patológicos implicados en esta enfermedad neurodegenerativa. M. Soderberg, C. Edlund, K. Kristensson y G. Daliner, Lipids 26 (1991), pp. 421-425.
Los trastornos peroxisómicos son un grupo de trastornos neurológicos degenerativos caracterizados por mayores niveles de ácidos grasos de cadena muy larga, resultantes de una alteración en la capacidad de los individuos afectados para degradar estos ácidos grasos. Estos trastornos se relacionan en el sentido de que parecen resultar de algún defecto localizado en las organelas subcelulares conocidas como peroxisomas. N. Gordon, "Peroxisomal Disorders", Brain Development 9 (1987), pp. 571-575. Estos trastornos peroxisómicos han sido clasificados en tres grupos en base al grado de pérdida de las funciones peroxisómicas encontrado en una enfermedad concreta. A.C. Theil, European Journal of Pediatrics, 151 (1992), pp. 117-120.
Los trastornos peroxisómicos del grupo 1 se caracterizan por una pérdida virtualmente completa de los peroxisomas y de las funciones de los peroxisomas. Estos trastornos incluyen el síndrome de Zellweger, la adrenoleucodistrofia neonatal, la enfermedad de Refsum infantil y la acidemia hiperpepecólica. Los trastornos del grupo 2 se caracterizan por la pérdida de múltiples funciones peroxisómicas e incluyen la condrodisplasia punctata Rizomélica y el síndrome de tipo Zellweger. Los trastornos del grupo 3 se caracterizan por la pérdida de sólo una única función peroxisómica e incluyen la adrenoleucodistrofia, la adrenomieloneuropatía, la deficiencia en acil-CoA oxidasa, la deficiencia en proteínas bifuncionales, la deficiencia en tiolasa, la hiperoxaluria de tipo I, la acatalasemia y la enfermedad de Refsum del adulto. La presentación clínica de los pacientes con trastornos peroxisómicos muestra una amplia divergencia en la expresión fenotípica, que varía significativamente dependiendo de la edad del paciente. Sin embargo, en todos los pacientes las funciones neurológicas se alteran progresivamente, lo que con frecuencia da lugar a deterioro de las funciones autonómicas y a muerte a una edad temprana.
Estudios recientes de la composición de ácidos grasos poliinsaturados de los tejidos en pacientes con trastornos peroxisómicos han mostrado que, incluso aunque la cantidad total de ácidos grasos en estos tejidos sea normal, hay cambios significativos en la composición de ácidos grasos de los tejidos del paciente. Estos pacientes tienen una reducción significativa en la cantidad total de DHA y ARA en las composiciones de lípidos del suero. También disminuyen los niveles de plasmalógeno del suero.
El síndrome de Usher es un trastorno genético recesivo autosómico asociado a la degeneración de las células visuales, provocando retinitis pigmentosa. Las células visuales contienen cantidades extremadamente grandes de DHA esterificado en los fosfolípidos de las membranas fotorreceptoras que constituyen los segmentos externos de las células visuales. Bazan y colaboradores han visto recientemente que los fosfolípidos plasmáticos de los pacientes de Usher contienen significativamente menos DHA y ARA que los fosfolípidos plasmáticos de individuos no afectados. N.G. Bazan, B.L. Scott, T.S. Reddy y M.Z. Pelias, Biochem. Biophys. Res. Comm. 141 (1986), pp. 600-604.
Además, los investigadores han visto que los pacientes que sufren de otras condiciones clínicas, tales como la demencia senil, la neuropatía inducida por diabetes, la esclerosis múltiple, la esquizofrenia y las neuropatías asociadas a altas dosis de metales pesados, tales como plomo, aluminio y mercurio, también tienen frecuentemente niveles de DHA y/o ARA en sus lípidos séricos que están significativamente disminuidos en comparación con los niveles encontrados en personas sanas. Por ejemplo, se ha establecido mediante estudios recientes una correlación entre las alteraciones en los niveles de esterificación del ARA en los fosfolípidos de las plaquetas y la presencia de trastornos esquizoafectivos en los pacientes. L. Demisch y col., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 46 (1992), pp. 47-52. Se ha descrito evidencia de una bioquímica anormal de los ácidos grasos esenciales en los fosfolípidos plasmáticos de pacientes con esquizofrenia. D.F. Horrobin, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 46 (1992) pp. 71-77.
Aunque los investigadores han hecho algunos progresos en la comprensión de los trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Alzheimer y diversos trastornos peroxisómicos, los medios efectivos de tratamiento de estos trastornos han permanecido esquivos.
US-A-5.130.242 y WO89/00606 describen la producción microbiana de ácidos grasos insaturados, pero no ofrecen ninguna sugerencia en cuanto al uso de aceites microbianos en el tratamiento de enfermedades neurológicas.
EP-A-0404058 muestra el beneficio de disponer de una mezcla de ácidos grasos insaturados en las dietas de niños normales.
EP-A-0622463 sugiere la obtención de DHA cultivando microalgas marinas, pero la única enseñanza de cualquier uso específico para el DHA obtenida de este modo es una referencia cruzada a EP-A-0342795, que se discute a continuación.
Martínez y col., en New Developments in Fatty Acid Oxidation, P. Coates ed., Vol. 375, 1992, páginas 389-397, y en World Review of Nutrition and Dietetics, Vol. 66, 1991, páginas 87-102, midieron las cantidades relativas de diversos ácidos grasos en tejidos de una población de pacientes y de una población control. Martínez observó que la deficiencia en DHA en los tejidos guardaba correlación con los trastornos peroxisómicos, pero Martínez no pudo concluir por estos datos qué causaba la deficiencia en DHA observada en la población de pacientes.
JP-A-02730081 sugiere la obtención de ARA cultivando hongos de Entomophthora sp., pero no se enseña ningún uso específico para el ARA obtenido de esta forma aparte de una declaración general de que se podría disponer del ARA para productos farmacéuticos, alimentos para la salud y cosméticos.
EP-A-0342795 describe estudios sobre el aprendizaje y la memoria en ratas alimentadas con diversos derivados de ácidos grasos. Todas las dietas descritas en la referencia contienen EPA y ARA además de DHA.
EP-A-0234733 se dirige al tratamiento de la senilidad con mezclas de metabolitos del ácido gamma-linolénico ("GLA").
Bates y col., en Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, Vol. 52, 1989, páginas 18-22, describen estudios en los que se administró aceite de pescado de alto contenido en EPA, que también contiene una cantidad menor de DHA, a múltiples pacientes de esclerosis.
EP-A-0218460 se dirige al tratamiento de la senilidad con mezclas de metabolitos del ácido gamma-linolénico (GLA).
WO92/13086 muestra métodos de suplementación de la dieta de un individuo con ARA y que dicha suplementación sería beneficiosa para individuos conocidos como deficientes en ARA.
US-A-5198468, EP-A-0599576, EP-A-0454102 y EP-A-0347056 se relacionan con el tratamiento de la esquizofrenia usando composiciones de ácidos grasos.
Es un objeto de la presente invención facilitar un uso terapéutico para el tratamiento de trastornos neurológicos en los que los niveles en suero, tejidos o membranas de los ácidos grasos esenciales DHA y ARA están afectados.
La presente invención facilita el uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA) para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en DHA, donde dicho trastorno es la retinitis pigmentosa y donde dicha composición es adaptada para administración oral, nasal o tópica.
La presente invención facilita además el uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA) para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en ARA, cuyo trastorno es seleccionado entre el grupo consistente en esclerosis múltiple y retinitis pigmentosa.
La presente invención facilita además el uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA) y un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA) para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en DHA y en ARA, cuyo trastorno es seleccionado entre el grupo consistente en esclerosis múltiple y retinitis pigmentosa, donde dicha composición está adaptada para administración oral, nasal o tópica.
La presente invención proporciona el uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA), cuyo aceite tiene una proporción de DHA a EPA de al menos 10:1, para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en DHA, cuyo trastorno es seleccionado entre el grupo consistente en neuropatía diabética y esclerosis múltiple.
La presente invención proporciona además el uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA), cuyo aceite tiene una proporción de ARA a EPA de al menos 10:1, para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en ARA, donde dicho trastorno es la neuropatía diabética.
La presente invención proporciona también el uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA), cuyo aceite tiene una proporción de DHA a EPA de al menos 10:1, y un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA), cuyo aceite tiene una proporción de ARA a EPA de al menos 10:1, para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en DHA y en ARA, donde dicho trastorno es la neuropatía diabética.
El DHA y el ARA están en forma de lípidos complejos naturales seleccionados entre triglicéridos, fosfolípidos y sus mezclas. Preferiblemente, el DHA y el ARA están en forma de triglicéridos, aunque pueden estar también en forma de fosfolípidos. Se obtienen como aceites microbianos de una sola célula por cultivo de microorganismos productores de DHA u organismos productores de ARA en condiciones de producción de aceite.
Según realizaciones preferidas de la presente invención, los microorganismos capaces de producir un aceite microbiano de una sola célula que contiene DHA o ARA son cultivados en un fermentador en una solución nutriente capaz de soportar el crecimiento de dichos organismos. Preferiblemente, el aceite microbiano producido está enriquecido en los ácidos grasos de interés, lo que significa que contendrá al menos aproximadamente un 20% de DHA o un 10% de ARA en peso.
Se puede usar cualquier microorganismo capaz de producir un aceite microbiano que contenga DHA o ARA en la presente invención. Estos microorganismos pueden ser identificados determinando si hay presencia de aceites DHA o ARA en los perfiles de ácidos grasos de la biomasa cosechada de un cultivo de los microorganismos. Estos perfiles son típicamente obtenidos por cromatografía gaseosa de los derivados éster metílico de los ácidos grasos presentes en una muestra.
Tal como se muestra aquí, el término microorganismo, o cualquier tipo específico de microorganismo, incluye cepas de tipo salvaje, cepas mutantes o cepas recombinantes. Se pueden usar microorganismos de tipo salvaje y recombinantes diseñados para producir aceite de células microbianas que contiene DHA o ARA para producir los aceites microbianos que contienen DHA y que contienen ARA. Dichas cepas recombinantes incluirían las diseñadas para producir mayores cantidades de DHA o de ARA en el aceite de una sola célula, mayores cantidades de aceite total o ambos, en comparación con las cantidades producidas por el mismo microorganismo de tipo salvaje, cuando se les provee de los mismos substratos. Los microorganismos seleccionados o diseñados para usar eficientemente más substratos efectivos en cuanto a coste, produciendo al mismo tiempo la misma cantidad de aceite de una sola célula que contiene DHA o ARA, como microorganismo de tipo salvaje, son particularmente útiles para las realizaciones preferidas de la presente invención.
Para la producción de aceites microbianos que contienen DHA, se pueden usar especies de algas fotosintéticas tales como Chattonella, Skeletonema, Thalassiosira, Isochrysis, Hymenomonas o Cryptomonas. Son microorganismos preferidos las especies heterotróficas de algas que incluyen, aunque sin limitación, las Dinophyceae, por ejemplo Crypthecodinium, u hongos tales como Chytridiomycetes, por ejemplo Thraustochytrium o Schizochytrium, u Oomycetes, por ejemplo Mortierella, Saprolegnia o Mucor.
Son microorganismos preferidos para producir DHA los dinoflagelados, incluyendo Crypthecodinium. Es especialmente preferido Crypthecodinium cohnii, un heterótrofo obligado, que se describe en la Solicitud EE.UU. Nº de Serie 479.135, presentada el 13 de Febrero de 1990. Se prefiere C. cohnii porque produce ácidos grasos en los que el DHA es el único ácido graso poliinsaturado presente en cantidades mayores de aproximadamente un 1% de la cantidad total de ácidos grasos poliinsaturados, una cantidad que es significativa para llevar a cabo los métodos de la presente invención. Se han depositado muestras de una cepa de C. cohnii, que produce abundantes niveles de DHA, en la American Type Culture Collection de Rockville, Maryland, y se les ha asignado el número de acceso ATCC 40750.
Los microorganismos útiles para producir ARA incluyen especies de algas tales como Porphyridium, Ochromonas y Euglena y hongos tales como Pythium y Mortierella. Muchas de esas especies que producen ARA producen también cantidades significativas de ácido eicosapentaenoico (EPA). Inesperadamente, se ha visto que P. insidiosum y M. alpina producen ARA, pero están substancialmente libres de EPA. "Substancialmente libre" significa que la proporción entre ARA y EPA es de al menos 5:1. Preferiblemente, la proporción es de al menos 10:1. Más deseablemente, no más de un 1% del contenido en ácidos grasos del aceite es EPA. Como con los aceites de pescado, altos niveles de EPA en los suplementos dietéticos dan lugar a una disminución de la capacidad para formar ARA a partir del ácido linoleico de la dieta. Más aún, la administración de aceites de pescado que contienen EPA a pacientes, especialmente pacientes de avanzada edad, hipertensos o gestantes que pueden tener tiempos de protrombina aumentados, no es deseable debido a los efectos fluidificantes de la sangre del EPA. En consecuencia, aunque se pueden utilizar esas especies fúngicas productoras tanto de ARA como de EPA en el procedimiento de esta invención, es preferible usar especies que no produzcan cantidades significativas de EPA. Como especies preferidas se incluyen Pythium insidiosum y Mortierella alpina. Ambas especies pueden ser adquiridas comercialmente y las cepas están depositadas en la American Type Culture Collection de Rockville, Maryland, tales como las que tienen los números de acceso ATCC 28251 y 42430, respectivamente.
De igual modo, aunque se pueden utilizar especies microbianas productoras tanto de DHA como de EPA como fuente del aceite DHA usado en esta invención, es preferible usar especies que estén al menos substancialmente libres de EPA. Preferiblemente, la proporción es de al menos 10:1. Más deseablemente, no más del 1% del contenido en ácidos grasos del aceite es EPA.
Producción de aceite que contiene DHA
Los microorganismos productores de DHA pueden ser cultivados en un medio simple que contenga una fuente de carbono tal como glucosa y una fuente de carbono tal como extracto de levadura o peptona. El uso de estos componentes en una solución tal como agua de mar proporciona velocidades de crecimiento y densidades celulares económicamente significativas. En el transcurso de 3 a 5 días de fermentación, por ejemplo, se pueden alcanzar densidades celulares de C. cohnii de al menos 10 gramos de biomasa por litro de solución y preferiblemente de 20 a aproximadamente 40 gramos por litro.
Aunque se puede llevar a cabo el cultivo en cualquier fermentador adecuado, el organismo es preferiblemente cultivado en un fermentador de tanque agitado o en un fermentador con elevación de aire. Cuando se selecciona un fermentador de tanque agitado, se consigue la agitación usando turbinas de alta eficacia de tipo Rushton o propulsores de palas inclinadas o marinos. La agitación y el burbujeo renuevan el suministro de oxígeno a los microorganismos. La velocidad de agitación aumenta normalmente al aumentar la biomasa, debido a la mayor demanda de oxígeno. Es deseable mantener la velocidad de rotación a no más de aproximadamente 300 cm por segundo. La selección de las cepas de microorganismos que son capaces de soportar velocidades de rotación mayores sin sufrir daños por corte está dentro del alcance de los expertos en la técnica.
Los organismos usados para la producción de aceite que contiene DHA pueden ser cultivados en cualquier solución nutritiva adecuada. Tal como se ha indicado anteriormente, el agua de mar es un medio aceptable para la solución nutritiva para muchos organismos. El agua de mar puede ser natural, filtrada o una mezcla artificial, cada una de las cuales puede ser diluida con agua para reducir las salinidades, tal como 1/2 a 1/4 de la concentración normal, o concentrada a 2 veces la concentración normal. Un medio preferido es el agua de mar artificial de la marca Instant Ocean®, o alternativamente una mezcla de 4,5 a 20 g por litro de NaCl, 1,23 g por litro de MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O y 90 mg por litro de CaCl_{2} en agua. Se pueden añadir micronutrientes y pueden ser necesarios al usar medios definidos. Sin embargo, dichos micronutrientes son conocidos para los expertos en la técnica y están generalmente presentes en el agua de mar o en el agua corriente. Si el organismo seleccionado es heterotrófico, tal como Crypthecodinium y Thraustochytrium, entonces se añade una fuente de carbono reducida. Crypthecodinium y Thraustochytrium requieren una fuente reducida de carbono para su crecimiento.
Preferiblemente, tras la adición del medio de agua de mar al fermentador, se esteriliza y se enfría el fermentador que contiene el medio antes de añadir los nutrientes y un cultivo semilla del microorganismo que se ha de cultivar. Aunque es aceptable esterilizar los nutrientes junto con el agua de mar, la esterilización de esta forma puede dar lugar a una pérdida de la glucosa disponible. Los nutrientes y el microorganismo pueden ser añadidos simultánea o secuencialmente.
Los expertos en la técnica pueden determinar una concentración de siembra efectiva. Cuando se usa un fermentador de tanque agitado, se prefiere la adición de una población de aproximadamente 0,05 a 1,0 gramos de peso equivalente por litro al comienzo de la fermentación. Por ejemplo, serían adecuadas al menos aproximadamente 1 a 5 x 10^{6} células de C. conhii por ml. Así, para un fermentador de 30 litros, se añadirían de 1 a 3 litros de medio de siembra, que contuviera células viables a una densidad de 10 a 20 gramos de peso seco por litro.
Los niveles de oxígeno se mantienen preferiblemente a un oxígeno disuelto de al menos aproximadamente un 10% del nivel de saturación del aire. La biosíntesis de DHA requiere oxígeno y, en consecuencia, mayores rendimientos de DHA requieren niveles de oxígeno disuelto de aproximadamente un 10% a un 50% de los niveles de saturación del aire. Por ejemplo, velocidades de rotación de agitación de 150 a 200 cm por seg en combinación con una velocidad de aireación de 1 volumen de aire por volumen de fermentador por minuto (VVM) proporcionan niveles de oxígeno disuelto de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 30% a densidades de biomasa de aproximadamente 25 gramos de peso seco por litro de cultivo para C. cohnii. Densidades celulares mayores pueden requerir niveles de oxígeno disuelto mayores, que pueden ser obtenidos mediante velocidades mayores de aireación por burbujeo de O_{2} o aumentando la presión del aire en el fermentador.
Las fuentes de carbono aceptables son conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede proveer de carbono en forma de mono- o disacáridos, tales como sacarosa, lactosa, fructosa o glucosa. Los autótrofos utilizan dióxido de carbono como fuente de carbono. Muchos organismos crecerán también con otras fuentes de carbono reducidas más complejas, tales como melazas, jarabe de maíz de alto contenido en fructosa y almidón hidrolizado. Típicamente, se inicia una fermentación con aproximadamente 20 a 50 gramos por litro de glucosa. Se añade más glucosa durante la fermentación según sea necesario. Alternativamente, se pueden añadir de aproximadamente 50 a 150 gramos de glucosa por litro inicialmente, minimizando así la frecuencia de futuras adiciones. La cantidad de fuente de carbono suministrada a otros organismos puede ser fácilmente determinada por los expertos en la técnica.
Además de una fuente reducida de carbono, se provee de una fuente de nitrógeno, tal como extracto de levadura o peptona, al medio. Por ejemplo, se puede usar extracto de levadura de la marca Difco o Marcor y peptona de la marca Sheftone. El extracto de levadura y la peptona son fuentes de nitrógeno orgánico que también contienen micronutrientes. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente otras fuentes de nitrógeno. Sin embargo, dichos compuestos son generalmente más caros que el extracto de levadura. Se puede usar en esta invención cualquier variante de cepas de algas productoras de DHA o de ARA capaz de usar urea, amoníaco o nitratos como fuente de nitrógeno.
Típicamente, la fermentación se inicia con aproximadamente 6 a 12 gramos de extracto de levadura por litro. Se puede añadir más extracto de levadura según sea necesario. Un ciclo típico de fermentación requiere de aproximadamente 8 a 15 gramos de extracto de levadura por litro a lo largo del ciclo. En consecuencia, se puede añadir esa cantidad de extracto de levadura inicialmente con una necesidad reducida de más adiciones. La cantidad precisa puede ser determinada por los expertos en la técnica. En general, la razón de glucosa a extracto de levadura es de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 25:1.
Se puede llevar a cabo el cultivo a cualquier temperatura que pueda mantener la vida. En general, microorganismos tales como Crypthecodinium o Thraustochytrium crecerán a temperaturas de aproximadamente 15ºC a 34ºC. Algunos hongos crecen con eficacia a temperaturas de aproximadamente 10ºC a 80ºC. Preferiblemente, la temperatura se mantiene a aproximadamente 20ºC a 30ºC. Se prefieren cepas que crecen a temperaturas mayores, ya que tienen un tiempo de duplicación más rápido, reduciendo así el tiempo total de fermentación. Los márgenes de temperatura apropiados para otros microorganismos son fácilmente determinados por los expertos en la técnica.
Se puede realizar el cultivo en un amplio margen de pH, típicamente a un pH de aproximadamente 5,0 a 9,0. Preferiblemente, se usa un margen de pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0 para la fase de crecimiento. Se usa una base, tal como KOH o NaOH, para ajustar el pH del medio antes de la inoculación. Durante las últimas etapas de la fermentación, el pH del medio de cultivo puede aumentar o disminuir a medida que se utilizan los nutrientes. Si se desea, se puede ajustar el pH durante la fermentación para corregir la alcalinidad o la acidez durante la fase de crecimiento añadiendo un ácido o una base apropiada.
La producción del aceite de células microbianas es inducida en los microorganismos por inducción de una fase estacionaria dejando que el cultivo alcance una fase de depleción de nitrógeno o de depleción de fosfato o dejando que suba el pH del cultivo. Se pueden producir deficiencias en el extracto de levadura aportando sólo una cantidad limitada de extracto de levadura, de tal manera que se haya agotado la fuente de nitrógeno del medio, mientras que los niveles disponibles de glucosa permanecen adecuados para el crecimiento. Es la proporción entre fuente de carbono y fuente de nitrógeno la que promueve la producción eficiente del aceite de una sola célula. Usando glucosa y extracto de levadura como ejemplos, una razón preferida de fuente de carbono a fuente de nitrógeno en el momento de la inoculación es de aproximadamente 10 a 15 partes de glucosa por parte de extracto de levadura. Los expertos en la técnica pueden calcular razones similares para las otras fuentes de carbono y de nitrógeno.
Tras la inducción de la producción de aceite, se deja crecer al cultivo durante aproximadamente 24 horas más. Durante este período, se está sintetizando el aceite de una sola célula que contiene DHA y las gotitas de aceite son visibles dentro de las células cuando se las observa usando un microscopio. Los expertos en la técnica pueden calcular fácilmente el tiempo de fermentación requerido para alcanzar la cantidad esperada de biomasa celular en base a la cantidad añadida de extracto de levadura. Cuando ha pasado ese tiempo, el cultivo crece durante 24 horas más y se recoge. En general, por ejemplo, las células de Crypthecodinium o Thraustochytrium son cultivadas durante aproximadamente 60 a aproximadamente 90 horas, aunque este tiempo está sujeto a variación.
Usando la cepa de Crypthecodinium designada como número de acceso ATCC 40750, como ejemplo, un 15 a un 30% de la biomasa resultante consiste en aceite extraíble. La selección de la cepa puede aumentar este porcentaje. Preferiblemente, el aceite consiste en más de aproximadamente un 70% de triglicéridos que tienen, en general, la siguiente composición de ácidos grasos:
15-20% de ácido mirístico (C_{14:0}),
15-25% de ácido palmítico (C_{16:0}),
5-15% de ácido oleico (C_{18:1}) y
30-50% de DHA (C_{22:6}).
El aceite bruto se caracteriza por un color amarillo-naranja y es líquido a temperatura ambiente. Deseablemente, el aceite contiene al menos aproximadamente un 20% de DHA en peso, preferiblemente aproximadamente un 40% de DHA en peso y más preferiblemente al menos aproximadamente un 50% de DHA en peso.
Los organismos son recogidos por medios convencionales, conocidos para los expertos en la técnica, tales como centrifugación, floculación o filtración, y pueden ser procesados inmediatamente o deseados para futuro procesado. En cualquier caso, el aceite puede ser extraído fácilmente con una cantidad efectiva de solvente. Los solventes adecuados pueden ser determinados por los expertos en la técnica. Sin embargo, como solventes preferidos se incluyen hexano puro y fluidos supercríticos, tales como CO_{2} supercrítico. Se pueden añadir determinados antioxidantes lipófilos, tales como \beta-caroteno, \alpha-tocoferol, palmitato de ascorbilo y BHT, antes de la extracción. Estos compuestos ayudan a proteger el aceite frente a la oxidación durante los procesos de extracción y refinado.
Se han desarrollado técnicas generales de extracción que utilizan fluidos supercríticos para la extracción de aceite de semillas de plantas ricas en aceite (McHugh y col., Supercritical Fluid Extraction, Butterworth, 1986). Sin embargo, estos métodos estándar no son aplicables, en general, a la extracción de microorganismos. Por ejemplo, las células de algas deshidratadas por aspersión tienen la consistencia de la harina y el flujo de CO_{2} supercrítico se restringe al comprimirse la biomasa de microorganismos. Además, las paredes celulares de microalgas y hongos son químicamente diferentes a las de la mayoría del material de aceite de semillas. Con objeto de prevenir la compresión y permitir un flujo y una extracción eficientes, se puede mezclar la biomasa de algas con 0,1 a 5,0 partes de agente estructural libre de lípidos, tal como Celita o tierra de diatomeas. En un recipiente de extracción de 50 ml a 450 atm. y 100ºC, se extrajo un 86% del aceite de C. cohnii en 25 minutos y se extrajo un 100% en 85 minutos.
Si el solvente de extracción es hexano, una proporción adecuada entre el hexano y la biomasa seca es de aproximadamente 4 litros de hexano por kilogramo de biomasa seca. El hexano es preferiblemente mezclado con la biomasa en un recipiente de reacción agitado a una temperatura de aproximadamente 20 a 50ºC durante aproximadamente 2 horas. Después de la mezcla, se filtra la biomasa y se separa del hexano que contiene el aceite. Alternativamente, se puede extraer una pasta de biomasa húmeda que tiene un 30 a un 35% de sólidos directamente con solventes más polares, tales como etanol, isopropanol o mezclas de hexano e isopropanol.
Se extrae el solvente del aceite por técnicas de destilación conocidas para los expertos en este campo. Un equipo de procesado de aceite de semillas convencional es adecuado para llevar a cabo la filtración, separación y destilación. Se pueden realizar etapas de procesado adicionales, conocidas para los expertos en la técnica, si es necesario o deseable para una aplicación particular. Estas etapas serán también similares a las implicadas en el procesado del aceite vegetal convencional y permiten la separación de fracciones lipídicas polares enriquecidas en DHA.
Producción de aceite que contiene ARA
Se cultivan hongos o algas productores de ARA en condiciones de cultivo productoras de aceite que contiene ARA adecuadas. Si se desea, se puede cultivar el microorganismo en un matraz con agitación inicialmente y luego transferirlo a un fermentador. La composición del medio de crecimiento puede variar, pero siempre contiene fuentes de carbono y de nitrógeno. Una fuente de carbono preferida es la glucosa, cuyas cantidades pueden variar entre aproximadamente 10 y 200 gramos de glucosa por litro de medio de crecimiento. Típicamente, se utilizan aproximadamente 50 gramos por litro para el cultivo en matraces con agitación. La cantidad puede variar dependiendo de la densidad deseada del cultivo final. Otras fuentes de carbono que se pueden utilizar incluyen melazas, jarabe de maíz de alto contenido en fructosa, almidón hidrolizado o cualquier otra fuente de carbono convencional de bajo coste usada en procesos de fermentación. Adicionalmente, se puede aportar lactosa como fuente de carbono. Así, se puede usar permeado de suero, que tiene un alto contenido en lactosa y es una fuente de carbono de muy bajo coste, como substrato. Las cantidades adecuadas de estas fuentes de carbono pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica. Normalmente, se necesita añadir cantidades adicionales de la fuente de carbono en el curso de la fermentación.
El nitrógeno es típicamente aportado en forma de extracto de levadura a una concentración de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 gramos por litro de medio de crecimiento. Preferiblemente, se aportan aproximadamente 8 a 10 gramos por litro. Se pueden usar otras fuentes de nitrógeno, incluyendo peptona, triptona, licor de maíz macerado, etc. La cantidad a añadir de estas fuentes puede ser fácilmente determinada por los expertos en la técnica. Se puede añadir nitrógeno a lo largo del cultivo o a modo de lotes, es decir, todo de una vez antes del cultivo.
Después de cultivar durante 3 a 4 días a una temperatura adecuada, típicamente aproximadamente 25 a 30ºC, ha crecido una cantidad de hongos o de algas que es suficiente para su uso como inóculo en un fermentador de tanque agitado convencional o un fermentador con elevación de aire. Se puede llevar a cabo la fermentación a modo de fermentación de lotes, de carga intermitente o continua. El fermentador de tanque agitado está equipado con una rueda móvil de turbina de tipo Rushton o, preferiblemente, una rueda móvil axial de tipo marino.
Se prepara el fermentador añadiendo las fuentes deseadas de carbono y de nitrógeno. Por ejemplo, se puede preparar un fermentador de 1,5 litros mezclando aproximadamente 50 gramos de glucosa y aproximadamente 6 gramos de extracto de levadura por litro de agua. Como se ha dicho previamente, se pueden usar otras fuentes de carbono o de nitrógeno o mezclas de las mismas.
El reactor que contiene la solución nutriente debe ser esterilizado, por ejemplo, calentando antes de la inoculación como se ha descrito antes en la discusión del cultivo de microorganismos para la producción de DHA. Después de enfriar a aproximadamente 30ºC, se puede añadir el inóculo e iniciar el cultivo. Se provee de intercambio gaseoso por burbujeo de aire. La velocidad de burbujeo de aire puede variar, pero se ajusta preferiblemente a aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2,0 volúmenes de aire por volumen de fermentador por minuto. Preferiblemente, se mantiene el nivel de oxígeno disuelto a aproximadamente un 10% hasta aproximadamente un 50% del valor de saturación del aire de la solución. En consecuencia, pueden ser necesarios ajustes en la velocidad de burbujeo durante el cultivo.
La agitación es deseable durante la fermentación. La agitación se provee mediante la rueda móvil. La velocidad de rotación de agitación es preferiblemente fijada en el margen de aproximadamente 50 cm por seg a aproximadamente 500 cm por seg, preferiblemente de aproximadamente 100 a 200 cm por seg.
En general, la cantidad de inóculo usado en una fermentación puede variar. Típicamente, se puede usar un cultivo de crecimiento logarítmico que sea de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 10% del volumen total del medio en el fermentador como inóculo.
Se deben controlar los niveles de nutrientes. Cuando los niveles de glucosa caen por debajo de 5 gramos por litro, se ha de añadir glucosa adicional. Un ciclo de cultivo típico utiliza aproximadamente 100 gramos de glucosa y aproximadamente 15 gramos de extracto de levadura por litro. Es deseable agotar el nitrógeno en el curso del cultivo, ya que esto aumenta la producción de aceite por los hongos o las algas. Esto es especialmente cierto cuando se usa M. alpina como organismo productor.
Ocasionalmente, el cultivo producirá una cantidad excesiva de espuma. Eventualmente, se puede añadir un agente antiespumante tal como los conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo Mazu 310®, para evitar la formación de espuma.
La temperatura de cultivo puede variar. Sin embargo, aquellos microorganismos que producen tanto ARA como EPA tienden a producir menos EPA y más ARA cuando se cultivan a temperaturas superiores. Por ejemplo, cuando se cultiva Mortierella alpina a menos de 18ºC, ésta comienza a producir EPA. Así, es preferible mantener la temperatura a un nivel que induzca la producción preferente de ARA. Las temperaturas adecuadas son típicamente de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 30ºC.
Preferiblemente, el cultivo continúa hasta alcanzar una densidad de biomasa deseada. Una biomasa deseada es aproximadamente 15-40 gramos por litro del organismo. Dicha biomasa es típicamente alcanzada en 48 a 72 horas de la inoculación. En este momento, los organismos contienen típicamente aproximadamente un 5 a un 40% de lípidos complejos, de los cuales aproximadamente un 10 a un 50% es ARA, y pueden ser recogidos.
Se puede efectuar la recogida por cualquier método adecuado, tal como filtración, centrifugación o floculación. Por su menor coste, puede preferirse la filtración.
Después de la recogida, se puede extraer la biomasa sin desecación. Eventualmente, se puede eliminar cualquier agua residual de la biomasa, tal como por desecación a vacío, desecación en lecho fluido o liofilización, antes de la extracción. Si se elimina el agua, es preferible usar solventes no polares para extraer el aceite que contiene ARA. Aunque es adecuado cualquier solvente no polar, se prefiere el hexano. Se pueden usar también fluidos supercríticos tales como CO_{2} o NO, según se ha discutido anteriormente, para la extracción de aceites enriquecidos en ARA de algas y de hongos. Aunque los hongos tales como M. alpina son inesperadamente difíciles de extraer con CO_{2}, se puede recuperar hasta un 89% del aceite de una biomasa fúngica a temperaturas superiores a 90ºC y presiones de 400 atm. Alternativamente, la biomasa húmeda, que típicamente contiene aproximadamente un 30 a un 50% de sólidos, puede ser desmenuzada y extraída directamente usando solventes polares, tales como etanol, alcohol isopropílico o una mezcla de hexano y alcohol isopropílico.
Un método preferido de extracción acuosa conlleva la mezcla de la biomasa con el solvente polar alcohol isopropílico en una olla de reacción adecuada. Dichas ollas son conocidas. Se desea el uso de tres a seis partes de solvente por parte de biomasa. Más preferiblemente, se hace la mezcla bajo nitrógeno o con la adición de antioxidantes, tales como \beta-caroteno, \alpha-tocoferol, palmitato de ascorbilo o BHT, para prevenir la oxidación del ARA en el extracto lipídico.
Se separa el solvente del aceite tal como se ha discutido en la sección anterior en cuanto a la producción de un aceite que contiene DHA. También se pueden realizar etapas adicionales para purificar aún más el aceite.
Los rendimientos pueden variar entre aproximadamente 5 y 50 gramos de aceite que contiene ARA por 100 gramos de biomasa desecada. En el caso de M. alpina, se pueden obtener 10 a 50 gramos de triglicérido por 100 gramos de biomasa desecada. En el caso de Ochromonas, se pueden obtener 5 a 20 gramos de triglicérido por 100 gramos de biomasa.
Preferiblemente, el aceite de M. alpina contiene más de aproximadamente un 70% de triglicéridos que tienen, en general, la siguiente composición de ácidos grasos:
5-15% de ácido palmítico,
15-20% de ácido esteárico,
5-10% de ácido oleico,
6-10% de ácido linoleico,
2-10% de ácido linolénico,
2-10% de ácido dihomo-gamma-linolénico y
40-50% de ácido araquidónico.
Administración de aceites que contienen DHA y ARA
Según esta invención, se administran los aceites microbianos que contienen DHA, los aceites microbianos que contienen ARA o combinaciones adecuadas de estos aceites a pacientes afectados de un trastorno neurológico caracterizado por una disminución de los niveles de DHA y/o ARA en la sangre o los tejidos en comparación con los niveles encontrados en individuos sanos. El curso específico de tratamiento administrado será determinado en base a la normalización de los niveles de DHA y ARA en el suero y en los eritrocitos. Se piensa que estos niveles en suero de DHA y ARA reflejan las composiciones de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga de las membranas neurológicas. En algunos casos, puede ser necesario aumentar los niveles séricos de ARA y DHA a 4 a 5 veces los niveles que se consideran normales en la población general para ver un efecto terapéutico. Los pacientes que sufren de trastornos que implican condiciones tales como la retinitis pigmentosa o la demencia senil pueden responder a la administración de aceite que contiene DHA solo, mientras que los pacientes que sufren de condiciones tales como la adrenoleucodistrofia, la neuropatía inducida por diabetes o la esquizofrenia pueden responder más favorablemente a la administración de una combinación de un aceite que contiene DHA y un aceite que contiene ARA. Todavía otros pacientes pueden beneficiarse de la administración de un aceite microbiano que contiene ARA solo.
El curso de tratamiento puede ser seguido midiendo los niveles del(de los) ácido(s) graso(s) de interés en el suero de los pacientes tratados. Para algunos pacientes, será posible seguir la normalización de los niveles de DHA o de ARA en el tejido neural midiendo los niveles de DHA y ARA en eritrocitos o en los lípidos séricos durante el tratamiento.
Aunque los aceites que contienen DHA y/o ARA pueden ser administrados a los pacientes directamente, más comúnmente serán combinados con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, eventualmente, otros ingredientes terapéuticos. Los vehículos aceptables son vehículos que son compatibles con los otros componentes de la formulación y no son perjudiciales para el paciente.
Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, nasal, tópica o parenteral (incluyendo la subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Se apreciará que la formulación preferida puede variar con la condición y la edad del paciente. Las formulaciones pueden ser convenientemente presentadas en forma de dosificación unitaria, por ejemplo emulsiones, tabletas y cápsulas de liberación mantenida, y pueden ser preparadas por cualquier método farmacéutico adecuado.
Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden ser presentadas como unidades discretas, tales como cápsulas o tabletas, cada una de las cuales contiene una cantidad predeterminada de aceite DHA o ARA o una cantidad predeterminada de una combinación adecuada de aceites DHA y ARA. Estas formulaciones orales pueden también consistir en una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso. La solución puede ser una emulsión, tal como una emulsión líquida de aceite-en-agua o una emulsión líquida de agua-en-aceite. Los aceites pueden ser administrados añadiendo los líquidos purificados y esterilizados a una fórmula entérica preparada que es luego colocada en la sonda de alimentación de un paciente que es incapaz de tragar.
En una realización preferida, se incorpora el aceite microbiano DHA o ARA en cápsulas de gel como las descritas en el Ejemplo 6. Sin embargo, se reconocerá que se puede usar cualquier medio conocido de producción de cápsulas de gel según la presente invención.
Se pueden preparar tabletas comprimidas comprimiendo o moldeando el(los) aceite(s) microbiano(s) en una máquina adecuada. Se puede mezclar el(los) aceite(s) con ingredientes accesorios inertes secos, tales como carboximetilcelulosa. Se pueden revestir o rayar las tabletas eventualmente y se pueden formular para obtener una liberación lenta o controlada del ingrediente activo de las mismas.
Otras formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen grageas que contienen el aceite DHA, el aceite ARA o una combinación de éstos en una base saborizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto.
Las formulaciones adecuadas para administración tópica a la piel pueden presentarse como ungüentos, cremas y geles que contienen el(los) aceite(s) de DHA y/o ARA en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un sistema de administración tópica preferido es un parche transdérmico que contiene el aceite que se ha de administrar.
En formulaciones adecuadas para administración nasal, el vehículo es un líquido, tal como los usados en un aerosol nasal convencional o en gotas nasales.
Las formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden eventualmente contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del pretendido receptor, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis. Una realización preferida de la presente invención incluye la incorporación del(de los) aceite(s) DHA y/o ARA en una formulación para proporcionar nutrición parenteral a un paciente.
Las composiciones de aceite microbiano de la presente invención no necesitan ser administradas como una composición farmacéutica. También pueden ser formuladas como un suplemento dietético, tal como una cápsula de vitaminas, o como un substituto del alimento en la dieta normal. Los aceites microbianos pueden ser administrados como un substituto del aceite de cocinar formulado de tal forma que, en el uso normal, el paciente recibiría cantidades de DHA y/o de ARA suficientes para elevar las concentraciones de estos ácidos grasos en el suero y en las membranas de los tejidos neurales afectados hasta niveles normales o casi normales. Se podría formular también una emulsión especial de tipo margarina para substituir a la mantequilla o a la margarina ordinaria de la dieta. Los aceites microbianos de una sola célula podrían ser añadidos a alimentos procesados para proporcionar una fuente mejorada de ácidos grasos insaturados \omega-3 y \omega-6- El aceite puede ser microencapsulado usando gelatina, caseína u otras proteínas adecuadas usando métodos conocidos en la técnica, proporcionando así una forma de ingrediente seco del aceite para el procesado de alimentos. Dichos métodos de administración pueden ser preferidos en el caso de una persona que se sabe tiene una predisposición genética a un trastorno asociado a una deficiencia metabólica del DHA o del ARA, tal como una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo la enfermedad de Huntington o la enfermedad de Alzheimer. El dar a dicho individuo un substituto dietético puede proporcionar un efecto profiláctico significativo, retrasando la aparición de los síntomas de un trastorno particular. La administración de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga DHA y ARA ofrece una ventaja significativa sobre la mera obtención de ácido linoleico y linolénico, los precursores de estos ácidos grasos, de alimentos estándar o de aceites de especialidad tales como el aceite de primavera o de borraja. El DHA y el ARA administrados ya están presentes en sus formas activas, de tal forma que no es necesario que el paciente metabolice los precursores dietéticos. Esto da como resultado dosis efectivas que son significativamente menores que las de los precursores que serían necesarios para producir el efecto terapéutico.
Habría que entender que, además de los ingredientes particularmente mencionados con anterioridad, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes adecuados, tales como agentes saborizantes, conservantes y antioxidantes. En particular, es deseable mezclar los aceites microbianos con un antioxidante para prevenir la oxidación del DHA o del ARA. Dichos antioxidantes serían aceptables para el alimento y podrían incluir vitamina E, caroteno, BHT u otros antioxidantes conocidos para los expertos en la técnica.
La dosis diaria de las composiciones de la presente invención que se ha de dar a un paciente dependerá del grado de déficit de DHA y/o ARA identificado por el análisis de los lípidos séricos antes de la introducción de la terapia. Típicamente, la dosis inicial proporcionada a un paciente de más de 50 libras estará en el margen de aproximadamente 50 mg de DHA a 5.000 mg de DHA al día. Una dosis de mantenimiento preferida es aproximadamente 500 mg de DHA al día. Por ejemplo, si el aceite DHA que se ha de usar está enriquecido en un 50% en DHA, dicha dosis correspondería a la adición de aproximadamente 1.000 mg de aceite al día.
La dosis diaria de ARA proporcionada al paciente de más de 50 libras será de 50 mg de ARA a 5.000 mg al día. Una dosis de mantenimiento preferida sería de 500-1.000 mg al día. Si el aceite ARA que se ha de usar está enriquecido en un 50% en ARA, dicha dosis correspondería a la adición de aproximadamente 1.000-2.000 mg de aceite ARA al día. Las dosis de una combinación adecuada de los aceites que contienen DHA y ARA serán 1.000 mg de DHA y 1.000 mg de ARA al día.
Deseablemente, los perfiles de ácidos grasos en el suero del paciente son revisados después de aproximadamente cuatro semanas de esta terapia diaria. Se pueden modificar entonces las dosis siguientes en respuesta al nivel observado de DHA y ARA en los lípidos plasmáticos o en los glóbulos rojos en respuesta a las respuestas clínicas a esta terapia observadas. Los pacientes con trastornos peroxisómicos pueden tener niveles en los glóbulos rojos de DHA de sólo 1-3 \mug de DHA por ml de plasma. Los valores normales buscados varían entre aproximadamente 10 y 30 \mug de DHA por ml de plasma. Los valores normales buscados de ARA circulante varían entre aproximadamente 75 y aproximadamente 120 \mug de ARA por ml de plasma. Una vez se ha(n) alcanzado nivel(es) normalizado(s) del(de los) ácido(s) graso(s) circulante(s) de interés, se puede modificar la dosis de aceite(s) para mantener el DHA y/o el ARA circulantes a un nivel deseado.
Como se ha indicado anteriormente, para tratar determinados trastornos neurológicos puede ser deseable elevar el nivel de DHA y/o ARA circulantes en la sangre a 4 a 5 veces los niveles normales. Los niveles de DHA y ARA circulantes, por lo tanto, pueden elevarse a aproximadamente 120-150 \mug/ml y aproximadamente 480-600 \mug/ml, respectivamente.
Aunque no desea inclinarse por ninguna teoría específica, el inventor cree que la administración de DHA es efectiva para el tratamiento de trastornos neurológicos por su capacidad para regular la captación del calcio por las células neuronales. Una depolarización de la célula neuronal da lugar a una elevación en los niveles de calcio intracelular, causando la activación de una fosfolipasa y dando lugar a la liberación de DHA libre por la membrana celular. Este DHA libre actúa como bloqueante de los canales de calcio, limitando así la entrada del calcio en la célula. Por lo tanto, el nivel de DHA presente en la membrana de la célula neuronal y por lo tanto disponible para la liberación inducida por activación de estos ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga puede controlar los niveles intracelulares de calcio. Si existe una deficiencia de DHA, los niveles intracelulares de calcio se elevan y se estimula la producción de la proteína de la placa amiloide. Más aún, un elevado calcio intracelular estimula la fosforilación de la proteína tau asociada a los microtúbulos, dando como resultado el desarrollo de marañas neurofibrilares.
Los lípidos séricos son la fuente más probable del DHA y del ARA incorporados a las células neuronales, ya que los lípidos séricos actúan como el sistema de transporte o de vehículo para los ácidos grasos en general. Estudios en animales y en humanos han mostrado que altos niveles de DHA y ARA en el suero guardan correlación con altos niveles de DHA y ARA en el cerebro. Por lo tanto, la elevación de las concentraciones de DHA y ARA en la composición de los lípidos séricos totales mediante aportación de aceites microbianos dietéticos suplementarios enriquecidos en estos componentes, tendría que elevar la administración de DHA y ARA a los tejidos neuronales de interés.
El papel del ARA en la función neuronal está menos claro, aunque es también un componente mayor de las membranas neurológicas. Muchos trastornos neurológicos exhiben una deficiencia tanto de DHA como de ARA. El objeto de esta invención es suplementar los niveles de estos dos componentes usando DHA y ARA de aceite microbiano para normalizar estos dos importantes ácidos grasos. La suplementación de DHA y de ARA sin ninguna cantidad significativa de EPA es un aspecto importante de esta invención, ya que los niveles de EPA en los tejidos neurológicos son generalmente bajos y la suplementación con EPA deprimiría los niveles de ARA y puede estar contraindicada en ciertos casos. La administración terapéutica del aceite DHA en combinación con el aceite ARA puede ser beneficiosa para mantener o establecer una proporción de ácido graso poliinsaturado de cadena larga \omega-3 a \omega-6 en el organismo comparable a la de los individuos sanos normales.
Habiendo descrito la presente invención en general, se hace referencia a los siguientes ejemplos específicos no limitativos.
Ejemplo 1
Se cargó un medio de agua de mar artificial de media concentración preparado combinando 4,3 kg de Instant Ocean® con 230 litros de agua corriente en un fermentador de tanque agitado de 350 litros. Se esterilizó el fermentador que contenía el medio y se enfrió a 28ºC. Se añadieron al medio 6,8 litros de extracto de levadura concentrado a una concentración de 400 gramos por litro, 12,5 litros de jarabe de glucosa a una concentración de 400 gramos por litro y 30 litros de inóculo de C. cohnii de un fermentador de siembra a una concentración de 10^{6} células por ml o una densidad de biomasa de aproximadamente 1,3 gramos por litro. Se fijó la agitación a una velocidad de rotación de 73 cm por seg y se fijó la aireación a 1 VVM, que es equivalente a 280 litros por minuto. Se añadieron 12 litros adicionales de jarabe de glucosa después de aproximadamente 44 horas y se añadieron otros 43 litros a lo largo de las siguientes 32 horas. Así, se añadieron en total 67,5 litros de jarabe de glucosa.
Para mantener el oxígeno disuelto a más del 20%, se aumentó la velocidad de rotación de la agitación a 175 cm por segundo a las 44 horas y a 225 cm por seg a las 55 horas. A las 76 horas, se redujo la velocidad de rotación a 150 cm por segundo. Se hizo crecer al cultivo durante un tiempo adicional suficiente para convertir la carga final de glucosa en aceite celular y se recogió después. Se secaron las células recogidas a aproximadamente un 4% de contenido de humedad. Se añadió hexano a la biomasa deshidratada y se agitó en una olla de vidrio durante 2 horas a 25ºC. Se usó un evaporador rotatorio para eliminar el hexano, produciendo aproximadamente 700 gramos de aceite bruto que contenía DHA.
Ejemplo 2
Se cargaron 60 kg de extracto de levadura, 45 kg de NaCl, 12,3 kg de MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O y 0,9 kg de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O en 7.000 litros de agua en un fermentador de 15.000 litros. Después de esterilizar esta solución, se añadieron 3.000 litros de una solución de glucosa esterilizada a una concentración de 650 kg de glucosa por 3.000 litros de volumen. El pH inicial del medio era de 6,3, la temperatura era de 28ºC, la aireación era de 0,5 a 1,0 VVM, la contrapresión del recipiente fue fijada en 0,2 bares y la velocidad de rotación de la agitación fue fijada en 120 cm por segundo antes de inocular el recipiente con 300 litros de un cultivo inóculo de C. cohnii que había alcanzado una densidad celular de aproximadamente 60 x 10^{6} células por ml, que es equivalente a 4 a 5 gramos de peso seco de biomasa por litro de cultivo en el tanque del inóculo. En el curso de la fermentación, se añadió un antiespumante de grado alimenticio, tal como Dow 1520, según fuera necesario y se mantuvo el pH a 6,3 usando H_{2}SO_{4} 8 N o NaOH 4 N según fuera necesario. Se mantuvo el nivel de oxígeno disuelto en más del 20% de saturación del aire aumentando la contrapresión del recipiente y agitando. Se necesitaron adiciones adicionales de glucosa a las 93 horas y a las 111 horas para mantener los niveles de glucosa por encima de 5 gramos por litro. A las 119 horas, se enfrió el fermentador a 17ºC y se procesó el caldo de fermentación a través de una centrífuga. Se recuperaron 608 kg de suspensión que contenía un 25% de sólidos. Se deshidrató la suspensión por aspersión, produciendo aproximadament 150 kg de polvo de algas seco que contenían aproximadamente 30 a 40 kg de aceite con un contenido en DHA del 40 al 45%.
Se extrajo el polvo seco de algas con hexano usando equipo y métodos de extracción de aceites vegetales estándar. Después de la eliminación del solvente, se desgomó el aceite bruto añadiendo agua a 50ºC. Se recogió el aceite desgomado por centrifugación y se refinó mezclando con base cáustica y ácido fosfórico a 55ºC durante una hora. Se recogió entonces el aceite refinado y desgomado por centrifugación y se decoloró suavemente a 90ºC por adición de ácido cítrico y de arcilla decolorante. La filtración de la arcilla decolorante produjo el aceite decolorado refinado (aceite RB) con un valor de peróxido de menos de 5 mEq por kg. Se desodorizó el aceite RB por destilación de trayecto corto a un elevado vacío y el aceite RB desodorizado resultante (aceite RBD) estuvo entonces listo para su encapsulación, formulación en tabletas o envío a granel. El aceite resultante tenía un valor de peróxido de menos de 1 mEq por kg, un contenido en ácidos grasos libres de menos del 0,05%, un contenido en DHA del 45 al 47% y un número de yodo de aproximadamente 200.
Ejemplo 3 Preparación de lípido de Thraustochytrium aurum
Se cargaron 2,5 gramos de NaCl, 5 gramos de MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O, 1 gramo de KCl, 0,1 gramos de KH_{2}PO_{4}, 0,2 gramos de CaCO_{3}, 0,2 gramos de
(NH_{4})_{2}SO_{4} y 2,0 gramos de glutamato de sodio en 1 litro de agua en un fermentador de tanque agitado de 1,7 litros. Después de esterilizar el tanque, se añadió tiamina-B_{12} a una solución estéril que contenía 10 \mugramos de tiamina-HCl, 0,1 gramos de NaHCO_{3} y 10 \mugramos de vitamina B_{12}, seguido de adición de 150 ml de glucosa al 30% estéril y de 50 ml de extracto de levadura al 10% estéril. Se ajustó el pH a 6,0, se ajustó el burbujeo a 1,0 VVM y se ajustó la agitación a 300 rpm antes de la inoculación con 100 ml de un cultivo en matraz con agitación de 5 días de Thraustochytrium aurum cultivado en el mismo medio. Se recogió el cultivo después de 9 días para obtener aproximadamente 4 gramos de peso seco de biomasa. El contenido en DHA del lípido en la biomasa es del 10 al 15%.
Ejemplo 4 Preparación de lípido de Pythium insidiosum
En un fermentador de 80 litros (volumen total), se combinaron 51 litros de agua corriente, 1,2 kg de glucosa, 240 gramos de extracto de levadura y 15 ml de antiespumante MAZU 210S®. Se esterilizó el fermentador a 121ºC durante 45 minutos. Se añadieron 5 litros adicionales de agua condensada durante el proceso de esterilización. Se ajustó el pH a 6,2 y se añadió entonces aproximadamente 1 litro de inóculo a una densidad celular de 5 a 10 gramos por litro de Pythium insidiosum (ATCC #28251). Se ajustó la velocidad de agitación a 125 rpm, correspondientes a una velocidad de rotación de 250 cm por segundo, y se ajustó la velocidad de aireación a 1 "SCFM" (pies cúbicos estándar por minuto). A las 24 horas de la operación, se aumentó la velocidad de aireación a 3 SCFM. A las 28 horas, se añadieron 2 litros adicionales de un jarabe de glucosa al 50% en peso. A las 50 horas, se recogió el fermentador, dando como resultado un rendimiento de aproximadamente 2,2 kg de peso húmedo de biomasa, que correspondía a aproximadamente 15 gramos de peso seco por litro de cultivo. Se exprimió la biomasa recogida hasta obtener una torta de alto contenido en sólidos, consistente en aproximadamente un 50% en sólidos, en un filtro de succión antes de liofilizarla. Se trituró la biomasa desecada con un mortero y su mano y se extrajo con 1 litro de hexano por 200 gramos de biomasa seca a temperatura ambiente bajo agitación continua durante 2 horas. Se filtró entones la mezcla y se evaporó el filtrado, obteniéndose aproximadamente 5 a 6 gramos de aceite bruto por 100 gramos de biomasa seca. Se volvió a extraer la biomasa con 1 litro de etanol por 20 gramos de biomasa seca durante 1 hora a temperatura ambiente, se filtró y se evaporó el solvente, obteniéndose 22 gramos adicionales de aceite bruto por 100 gramos de biomasa seca. La segunda fracción era predominantemente de fosfolípidos, mientras que la primera fracción contenía una mezcla de fosfolípidos y triglicéridos. Las fracciones combinadas produjeron un aceite que contenía aproximadamente un 30 a un 35% de ácido araquidónico y nada de EPA detectable.
Ejemplo 5 Preparación de lípido de Mortierella alpina
Se llenó un fermentador de 7.500 litros con 4.500 litros de agua y se cargó con 225 kg de dextrosa, 27 kg de extracto de levadura y 450 gramos de antiespumante (Dow 1520). Se ajustó el pH a 5,0 y se esterilizó el medio durante 60 minutos a 121ºC. Después de esterilizar y de enfriar a 28ºC, se ajustó el pH a 5,5 con NaOH, se ajustó la aireación a 0,25 VVM, se fijó la contrapresión a 0,2 bares y se fijó la agitación de las ruedas móviles A315 a una velocidad de 80 cm por segundo. Se inoculó el cultivo con 180 litros de un cultivo de siembra de 20 horas de Mortierella alpina a 2,2 gramos por litro. Se dejó que el pH fluctuara hasta las 37 horas del ciclo, en cuyo momento se controló a 6,5. Se aumentó la agitación a 110 cm por segundo a las 26 horas durante el pico de demanda de oxígeno, pero se devolvió a 80 cm por segundo a las 32 horas. A las 123 horas, se recogió el tanque usando una centrífuga de cesta Bock equipada con una bolsa de 40 micras. Se secó entonces el material usando un desecador de lecho fluido y se extrajo con hexano como en el Ejemplo 2. La fermentación dio 17 kilogramos de un aceite bruto con un contenido en ARA del 45%.
Ejemplo 6
Se preparó aceite enriquecido en DHA preparado según el Ejemplo 1 ó 2 para uso oral por encapsulación o formulación en tabletas. Se prepararon cápsulas de gelatina selladas transparentes de 1 gramo por cápsula por métodos convencionales de fabricación. Se prepararon cápsulas de gel acanaladas que contenían un aceite o una mezcla de aceites distribuyendo 250 \mul de aceite en los fondos de las cápsulas de gel usando un pipeteador múltiple de desplazamiento positivo. Con este método, se consiguió una precisión de peso de \pm 3-5%. Se pusieron entonces las partes superiores sobre las cápsulas de gel y se ligaron con gelatina teñida usando una máquina para ligar cápsulas. Alternativamente, se llenaron los fondos de las cápsulas de gel con carboximetilceluloa y se pipetearon 120 \mul de aceite directamente sobre este ligante, en el cual se absorbieron, evitando cualquier fuga. Se pusieron las partes superiores sobre las cápsulas de gel y se ligaron con gelatina teñida usando una máquina para ligar cápsulas. Alternativamente, se podía mezclar la carboximetilcelulosa con aceite en una razón de tres partes de carboximetilcelulosa por una parte de aceite en un recipiente aparte y prensarlos luego en tabletas usando una prensa de tabletas.
Se repitió el proceso usando aceite enriquecido en ARA producido según los Ejemplos 4 y 5.
Ejemplo 7
Se procesaron aceites microbianos brutos producidos por microorganismos tales como los descritos en los Ejemplos 1, 2, 3, 4 y 5 usando métodos de procesamiento de aceites vegetales convencionales. Se desgomó el aceite para eliminar los fosfátidos mezclando con agua a 50ºC, eliminando luego el agua y la mezcla de goma por centrifugación. Se refinó el aceite para eliminar los ácidos grasos libres mezclando con base cáustica, seguido de ácido fosfórico, a 55ºC, eliminando luego el agua y la mezcla de ácidos grasos por centrifugación. Se decoloró el aceite microbiano procesado mezclándolo con ácido cítrico y arcilla decolorante estándar a 90ºC antes de filtrar para eliminar la arcilla gastada y cualquier resto de partículas polares en el aceite. En algunos casos, se desodorizó el aceite usando una destilación a elevado vacío o un desodorizador de purificación por vapor a contracorriente, dando como resultado la producción del aceite refinado, decolorado y desodorizado final (aceite RBD). Las especificaciones de los aceites que fluyeron a través de este proceso dieron típicamente un valor de peróxido menor de 2 mEq por kilogramo y un nivel de ácidos grasos libres menor del 0,05%. Estas especificaciones son típicas para los aceites vegetales estándar y los aceites microbianos son usados en este estado en lugar de aceite vegetal en la preparación de margarina, mantecas para mezclar con la masa, salsas que pueden ser manipuladas con cuchara o salsas líquidas o como componente oleoso de otros productos alimenticios fabricados. Los aceites microbianos están altamente enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, en particular DHA y ARA, y se diluyen en al menos una parte por diez partes de un aceite convencional seleccionado para el producto particular que esté siendo preparado. Para incorporación en productos de chocolate, se diluye el aceite con manteca de cacao. Para uso como manteca de pastelería o producto de panadería, se diluye el aceite con aceites de coco o de palma. Para uso como salsa para ensaladas, se diluye el aceite con aceites de ensalada estándar, tales como aceite de canola, de soja, de cártamo o de maíz.

Claims (21)

1. Uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA) para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en DHA, donde dicho trastorno es la retinitis pigmentosa y donde dicha composición está adaptada para administración oral, nasal o tópica.
2. Uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA) para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en ARA, donde dicho trastorno es seleccionado entre el grupo consistente en esclerosis múltiple y retinitis pigmentosa.
3. Uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA) y de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA) para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a la deficiencia en DHA y ARA, donde dicho trastorno es seleccionado entre el grupo consistente en esclerosis múltiple y retinitis pigmentosa y donde dicha composición está adaptada para administración oral, nasal o tópica.
4. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, donde dicha composición está adaptada para la administración oral.
5. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, donde el aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA) consiste en aceite de pescado.
6. Uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA), cuyo aceite tiene una proporción de DHA a EPA (ácido eicosapentaenoico) de al menos 10:1, para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a una deficiencia en DHA, cuyo trastorno es seleccionado entre el grupo consistente en neuropatía diabética y esclerosis múltiple.
7. Uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA), cuyo aceite tiene una proporción de ARA a EPA (ácido eicosapentaenoico) de al menos 10:1, para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a una deficiencia en ARA, donde dicho trastorno es la neuropatía diabética.
8. Uso de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA), cuyo aceite tiene una proporción de DHA a EPA (ácido eicosapentaenoico) de al menos 10:1, y de un aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA), cuyo aceite tiene una proporción de ARA a EPA de al menos 10:1, para la preparación de una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado a una patología asociada a una deficiencia en DHA y ARA, donde dicho trastorno es la neuropatía 
\hbox{diabética.}
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA) tiene una proporción de DHA a EPA (ácido eicosapentaenoico) de al menos 10:1, o donde el aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA) tiene una proporción de ARA a EPA de al menos 10:1.
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el aceite consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido docosahexanoico (DHA) y/o el ácido consistente en triglicéridos y/o fosfolípidos que contiene ácido araquidónico (ARA) consiste en un aceite microbiano.
11. El uso según la reivindicación 10, donde dicho aceite microbiano que contiene DHA contiene al menos un 20% de DHA.
12. El uso según la reivindicación 10, donde dicho aceite microbiano que contiene ARA contiene al menos un 10% de ARA.
13. El uso según la reivindicación 10, donde dicho aceite microbiano que contiene DHA o ARA contiene al menos un 40% de DHA o ARA.
14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición para el tratamiento de un trastorno neurológico es capaz, tras su administración, de aumentar los niveles en el suero sanguíneo de DHA y/o ARA en un paciente o de aumentar los niveles de DHA y/o ARA en los eritrocitos de un paciente.
15. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición para el tratamiento de un trastorno neurológico es capaz, tras su administración, de mantener o de establecer una proporción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga \omega-3 a \omega-6 en el organismo comparable a la de los individuos sanos normales.
16. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el DHA y/o el ARA están en forma de triglicéridos.
17. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho aceite DHA se obtiene cultivando al menos un alga o un hongo que puede producir un aceite que contiene DHA en condiciones de producción de aceite DHA y/o dicho aceite ARA se obtiene cultivando al menos un alga o un hongo que puede producir un aceite que contiene ARA en condiciones de producción de ARA y recuperando 
\hbox{el(los)}
aceite(s) producido(s).
18. El uso según la reivindicación 17, donde dicho aceite DHA se obtiene cultivando un alga dinoflagelada o un Chytridiomycete o un Oomycete.
19. El uso según la reivindicación 17, donde dicho alga u hongo es una especie de Crypthecodinium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Mortierella, Saprolegnia o Mucor.
20. El uso según la reivindicación 17, donde dicho microorganismo productor de ARA es un hongo consistente en una especie de Pythium o Mortierella o un alga consistente en una especie de Ochromonas, Euglena o Porphyridium.
21. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha composición está en forma de cápsula, de tableta, de emulsión o de un producto alimenticio preparado.
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