ES2218579T3 - Linea de celulas y procedimiento para la replicacion de virus de la rabia y su deteccion cuantitativa. - Google Patents
Linea de celulas y procedimiento para la replicacion de virus de la rabia y su deteccion cuantitativa.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UNA LINEA CELULAR CONTINUA QUE DERIVA DE UNA LINEA CELULAR VERO-M. ESTA LINEA CELULAR PERMITE TANTO LA MULTIPLICACION DE LOS VIRUS DE LA RABIA CON EFECTO CITOPATOGENICO (CPE), COMO SU DETECCION SENSIBLE MEDIANTE EL CPE. ADEMAS DEL PROCEDIMIENTO PARA LA MULTIPLICACION Y PARA LA DETECCION DE LOS VIRUS DE LA RABIA UTILIZANDO ESTA LINEA CELULAR, LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION DE INHIBIDORES DE LA MULTIPLICACION DE LOS VIRUS DE LA RABIA, COMO POR EJEMPLO, ANTICUERPOS O LIGANDOS NEUTRALIZANTES CONTRA LOS RECEPTORES DE LOS VIRUS.
Description
Línea de células y procedimiento para la
replicación de virus de la rabia y su detección cuantitativa.
El invento se refiere a una línea permanente de
células y a procedimientos para la reproducción de virus infecciosos
de la rabia y para su detección cuantitativa mediante el efecto
citopatógeno (CPE) con utilización de esta línea de células,
así como a un procedimiento para la detección de inhibidores de la
reproducción de virus de la rabia.
Para la producción de proteínas y antígenos de
virus se necesitan células vivas. En el estado de la técnica se
utilizan para ello cepas de células diploides o líneas permanentes
de células, siempre y cuando éstas sean apropiadas para la
producción de las proteínas o de los antígenos de virus, que se
desean. Las líneas permanentes de células tienen, frente a las cepas
de células diploides, la ventaja de que poseen un crecimiento
ilimitado, es decir que están inmortalizadas. En amplios intervalos
de pasadas, tales líneas permanentes de células tienen unas
propiedades constantes en lo que se refiere a la reproducción de
células y antígenos, puesto que en el caso de ellas no tiene lugar
ninguna diferenciación celular, como en el caso de cepas de células
diploides. Junto con el limitado período de tiempo de vida (número
de pasadas) de las cepas de células diploides constituye otra
desventaja grave el hecho de que los órganos, los tejidos, así como
los embriones de pollos que se necesitan como partida para cepas de
células diploides, no están a disposición en cantidad suficiente ni
en todo momento. Además, el material de partida puede estar
contaminado de modo latente y/o no evidente (virus, micoplasmas,
bacterias), con lo cual no se garantiza una producción de antígenos
que sea óptimamente reproducible.
En lo que se refiere al virus de la rabia, es
ciertamente sabido que éste se puede reproducir en cultivos
celulares de un gran número de especies, pero en la bibliografía
existen sólo algunas pocas menciones a que en tales casos aparezca
un efecto citopatógeno (Egert et al., Acta Virol. 33 (1989)
353-358, Consales et al., J. Virol. Meth. 27 (1990),
227-286, Campbell y Charlton, en: Development in
veterinary virology: Rabies Kluwer Academic Publishers, Boston,
Dordrecht, Londres, 1988). En lo que se refiere al efecto
citopatógeno (CPE) se trata de una destrucción de células
(lisis) específica, condicionada por los virus, que se puede
detectar fácilmente mediante un microscopio óptico.
En general, la reproducción del virus de la rabia
transcurre en cultivos de tejidos, pero sin CPE (Campbell y
Charlton (1988)) o las alteraciones citopatógenas causadas por
los virus son solamente irregulares (Kaplan y Koprowski,
Laboratory techniques in rabies, III. Edición Wld. Hlth. Org.
Monografía serie 23, Ginebra (1973)) o aparecen sólo de manera
transitoria (Smith et al., Intervirol. 8 (1977),
92-99) de manera tal que no es posible una
detección fiable de los virus de la rabia mediante la evaluación del
CPE con estas líneas de células.
El presente invento se basó por consiguiente en
el problema técnico de poner a punto una línea permanente de
células, o procedimientos que no tengan estas desventajas, es decir
que permitan de un modo general la reproducción de virus infecciosos
de la rabia con rendimiento mejorado y mediando aparición del efecto
citopatógeno (CPE), lo cual posibilita su detección
cuantitativa sensible.
La resolución de este problema técnico se efectúa
mediante la puesta a punto de las formas de realización
caracterizadas en las reivindicaciones.
Se descubrió con sorpresa que en la línea
permanente de células PH-2 conforme al
invento se pueden reproducir bien virus de la rabia con efecto
citopatógeno (CPE). Otras especies de virus de diferentes
familias de virus tales como picornavirus, virus herpes,
paramixovirus, reovirus y togavirus se pueden reproducir también en
esta línea de células. Esta línea de células es apropiada tanto para
la producción de antígenos de virus como también para la detección
de virus y anticuerpos. Resulta especialmente sorprendente que en
esta línea de células se pueda reproducir, siempre con efecto
citopatógeno (CPE), el virus de la rabia que pertenece a los
rabdovirus, con lo cual esta línea de células se adecua
especialmente para la detección sencilla y para la determinación
cuantitativa de anticuerpos de virus de la rabia y anticuerpos
(neutralizantes) de virus de la rabia.
Por consiguiente, el invento concierne a la línea
permanente de células PH-2 y a las líneas de células
derivadas de ella. La línea de células PH-2 ha sido
depositada en la DSM Deutsche Sammlung für Mikroorganismen
(Colección Alemana de Microorganismos) en Braunschweig con el
número DSM ACC 2165.
En una forma preferida de realización, el
presente invento concierne a un procedimiento para la reproducción
de virus de la rabia con efecto citopatógeno, el cual está
caracterizado porque la línea de células conforme al invento se
infecta con el virus que ha de ser reproducido y se incuba bajo
condiciones apropiadas, y después de alcanzarse un título
suficientemente alto de partículas de virus, éstas se recuperan y
purifican.
A partir de las partículas de virus así
obtenidas, según procedimientos conocidos en el estado de la
técnica, p. ej. mediante ultracentrifugación, ultrafiltración,
cromatografía y otros similares, se pueden obtener y purificar
antígenos de virus, a partir de partículas de virus desintegradas de
modo químico o físico. Estos antígenos obtenidos de tal manera se
pueden utilizar, entre otras cosas, para la producción de una vacuna
o para finalidades de diagnóstico. En otra forma preferida de
realización, el presente invento concierne, por consiguiente, a un
procedimiento para la obtención de partículas de virus de la rabia,
el cual está caracterizado porque después de haberse obtenido las
partículas de virus, a partir de éstas se obtienen y purifican
antígenos de virus.
El hecho de que mediante la línea de células
conforme al invento se puedan reproducir virus de la rabia, no
solamente de una manera más eficaz que con las líneas de células
conocidas en el estado de la técnica sino también con un efecto
citopatógeno que aparece simultáneamente, permite la detección
sensible y sencilla de virus de la rabia en muestras y la
determinación cuantitativa de éstos.
Otra forma preferida de realización concierne,
por consiguiente, a un procedimiento para la detección de virus de
la rabia con ayuda del efecto citopatógeno, el cual está
caracterizado porque la línea de células conforme al invento se pone
en contacto con una muestra que presumiblemente contiene el virus de
la rabia que se ha de detectar, las células se incuban y el virus
que se está reproduciendo se detecta mediante determinación con
microscopio del CPE. Para la realización de este procedimiento, la
muestra de virus se añade a un cultivo celular sembrado en placas de
microtitulación o en otros recipientes de cultivo celular conocidos
para un experto en la materia y o bien se mantiene allí hasta el
final del experimento o se retira después de un período de tiempo de
adsorción preestablecido con el medio de cultivo celular y se
reemplaza por medio de cultivo celular de nueva aportación. Los
cultivos celulares se investigan regularmente, por ejemplo hasta los
días 5º a 7º después de la inoculación, mediante un microscopio
óptico, en lo que se refiere al CPE.
En una forma especialmente preferida de
realización, el procedimiento de detección conforme al invento está
caracterizado porque la sensibilidad de detección está situada
aproximadamente en una escala de logaritmo de 10 (log_{10}) más
alta en comparación con el estado de la técnica (técnica de
anticuerpos con fluorescencia (FITC)).
Mediante la línea de células conforme al invento
se pueden determinar, además de ello, también inhibidores de la
reproducción de los virus. Estos inhibidores pueden hacerse activos
en todas las etapas de la replicación de virus –
adsorción/penetración, desrevestimiento (uncoating) del ácido
nucleico de los virus, transcripción y traducción así como
modificación de las proteínas posterior a la traducción, ensamblado
(assembly) de los virus y retirada (gemación
(budding)) de éstos. En tal caso puede tratarse por ejemplo
de anticuerpos neutralizantes, ligandos químicos o biológicos contra
receptores de virus o células, agentes quimioterapéuticos,
interferón u otras citoquinas. La inhibición de la reproducción de
los virus se puede detectar de manera sencilla en la línea
reivindicada de células mediante la falta de un CPE. La realización
del experimento para la detección de una inhibición es conocida para
un experto en la materia.
Por consiguiente, el presente invento concierne
también a un procedimiento para la detección de inhibidores para la
reproducción del virus de la rabia, el cual está caracterizado
porque la inhibición de la reproducción de los virus en la línea de
células conforme al invento en presencia del inhibidor se detecta
por la falta del CPE.
Los siguientes Ejemplos explican el invento.
Para el desarrollo de la línea permanente de
células PH-2 se mezclaron células primarias de piel
de caballo con pocas células permanentes de riñón de mono
(Vero-M), reproducidas simultáneamente en el
laboratorio. En tal caso se puso de manifiesto, sorprendentemente,
que unas células diferenciables morfológicamente con respecto de las
células Vero recubrieron a los fibroblastos de piel de caballo.
Estas células fueron aisladas y designadas como células
PH-2.
La cariotipación de la célula
PH-2, en comparación con la célula
Vero-M, se representa en la Tabla 1. La célula
PH-2 tiene un grupo de cromosomas distinto del que
posee la célula Vero-M, así como un diferente cuadro
de distribución de cromosomas.
En la línea de células PH-2 el
virus de la rabia se reproduce con CPE, en contraposición con la
línea de células de partida (Vero).
El virus reproducido en cultivos de fibroblastos
de pollo se obtuvo a partir de la producción de la entidad
Behringwerke AG.
Las células de fibroblastos de pollo se
sembraron, correspondientemente a la prescripción, 24 horas antes de
la aplicación para titulación en placas de microtitulación. El
cubrimiento de las placas de microtitulación con células
PH-2 se efectuó inmediatamente antes del comienzo de
la titulación. Como medio para la siembra de células se utilizó en
el caso de los fibroblastos de pollo el Medio 3 con 1% de suero de
ternero fetal (FKS) y NSP; para las células
PH-2 el Medio EME y 2% de FKS y NSP.
El virus de la rabia se diluyó en escalas de
log_{10} en el Medio 3. Partiendo en cada caso de una dilución, se
inocularon 8 pocillos por cada escala de dilución del
correspondiente tipo de cultivo con 200 \mul por pocillo. A
continuación, se efectuó la incubación de los cultivos en un armario
de incubación con CO_{2} a 37ºC.
La lectura del título se efectuó en los cultivos
de fibroblastos de pollo después de haber coloreado las células con
anticuerpos marcados con FITC (método de fluorescencia) a los 3
hasta 5 días después del establecimiento del ensayo; en el caso de
los cultivos de PH-2 se efectuó por medio de un
microscopio mediante el CPE causado por el virus de la rabia en los
días 5º hasta 7º después del comienzo del ensayo. El cálculo del
título se efectuó de acuerdo con el método de Kärber.
Los resultados de las titulaciones comparativas
se exponen seguidamente en la Tabla 2.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Tal como se desprende de las investigaciones
comparativas, los títulos, determinados en células
PH-2 mediante detección con microscopio, están
situados en promedio más altos en una escala de log_{10} que los
títulos encontrados en fibroblastos de pollo. Con ello se pone de
manifiesto que junto a la considerable simplificación del
procedimiento para la detección del virus de la rabia, este método
es también esencialmente más sensible en comparación con el
procedimiento de detección disponible en el estado de la
técnica.
Células PH-2 de sarcomas de Roux
que habían crecido densamente se infectaron después de haber
cambiado de medio, en un Medio EME sin suero, con virus de la rabia
(MOI (del inglés multiplicity of
infection = multiplicidad de infección: 0,01) y se
incubaron a 37ºC. Después de los intervalos de tiempo indicados en
la Tabla 3 se sacaron muestras a partir del sarcoma de Roux
infectado y se determinó el contenido en partículas de virus
infecciosas. Los valores hallados se exponen seguidamente en la
Tabla 3.
| 0 | 1 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| Título/ml en log_{10} | 4,5 | 4,5 | 7,4 | 7,5 | 8,0 | 8,3 | 7,4 |
Tal como se desprende de los valores de la Tabla
3, el virus de la rabia se puede reproducir con elevados títulos en
la línea de células PH-2. Por consiguiente, esta
línea de células es muy bien idónea para la producción de antígenos
del virus de la rabia.
Partiendo de la misma preparación de virus de la
rabia, de la cepa Flury LEP, se determinó el título en las pasadas
36ª, 85ª y 100ª de las células PH-2.
La siguiente Tabla 4 contiene los resultados de
las series de experimentos.
Tal como se deduce de los resultados de esta
Tabla, la línea de células de PH-2 presenta en los
intervalos ensayados de pasadas, entre las pasadas 36ª y 100ª, una
sensibilidad inalterada con respecto al virus de la rabia.
Claims (6)
1. Línea permanente de células con la
denominación PH-2 (nº de depósito en la DSM ACC2165)
o línea de células derivadas de ella, que reproducen virus de la
rabia con efecto citopatógeno (CPE).
2. Procedimiento para la reproducción de virus de
la rabia con efecto citopatógeno, caracterizado porque la
línea de células según la reivindicación 1
- a)
- se infecta con el virus que se ha de reproducir;
- b)
- las células se incuban; y
- c)
- después de conseguirse un título suficientemente alto en partículas de virus, éstas se recuperan y purifican.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado además porque después de la etapa c) los
antígenos de virus se obtienen a partir de las partículas de virus y
se purifican.
4. Procedimiento para la detección de virus de la
rabia con ayuda del efecto citopatógeno, causado por la reproducción
de virus en la línea de células según la reivindicación 1,
caracterizado porque
- a)
- la línea de células se pone en contacto con una muestra que contiene presumiblemente el virus de la rabia que se ha de detectar;
- b)
- las células se incuban; y
- c)
- el virus, después del comienzo de la incubación, se detecta por determinación en microscopio del CPE condicionado por la infección con el virus.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque la sensibilidad de detección es mayor
aproximadamente en una escala de log_{10} en comparación con la
técnica de anticuerpos con fluorescencia (FITC).
6. Procedimiento para la detección de inhibidores
de la reproducción de virus de la rabia, caracterizado porque
la inhibición de la reproducción de virus en la línea de células
según la reivindicación 1 se detecta en presencia del inhibidor por
falta del CPE.
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