ES2218937T3 - Procedimiento y dispositivo para mezclar liquidos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para detectar luz procedente de un medio líquido sometido a fotoactivación, comprendiendo dicho procedimiento los pasos de: (a) aplicar dicho medio líquido a un soporte transparente sustancialmente plano y sustancialmente inelástico (12), estando dicho medio líquido en una contención sin contenedores en él, siendo dicho soporte sustancialmente impermeable a y no reactivo con dicho medio líquido, (b) colocar dicho soporte (12) de tal manera que dicho medio líquido y dicho soporte estén entre dos superficies reflejantes (44) que rodean sustancialmente dicho medio líquido, teniendo al menos una de dichas superficies una apertura para que la luz emitida a partir de dicho medio líquido incida sobre un fotodetector, que comprende un tubo fotomultiplicador (40) que tiene un obturador (41), (c) someter dicho medio líquido a fotoactivación con dicho obturador (41) cerrado, y (d) abrir dicho obturador (41) y detectar, por medio de dicho tubo fotomultiplicador (40), la luz emitida por dicho medio líquido.

Description

Procedimiento y dispositivo para mezclar líquidos.

La presente invención se refiere a procedimientos y aparatos para detectar luz procedente de un medio líquido sometido a fotoactivación. Tal como se usa aquí, y a lo largo de la descripción y reivindicaciones orientadas a esta invención, el término "líquido" abarca líquidos solos y líquidos que contienen materia de cualquier tipo en forma de partículas.

El aparato y procedimiento de la presente invención tienen aplicación concreta en situaciones en las que se utilizan y procesan volúmenes de líquido pequeños. Uno de tales ejemplos es el laboratorio clínico, en el que se usan analizadores químicos con muestras líquidas, las cuales se añaden a reactivos y se mezclan en vasos de reacción separados. Estos vasos de reacción típicamente se moldean en plástico con el tamaño y forma aproximados de un dedal de costura. A veces tienen una forma especial para incluir múltiples compartimentos, ventanas de observación para medios ópticos, o están adaptados para su centrifugación. Usualmente se cargan a mano en alguno forma de mecanismo automático, aunque también se han construido cargadores automáticos. Se han construido mecanismos complicados para mover los vasos entre diferentes ubicaciones, de forma que puedan realizarse varias operaciones según requiera el procedimiento de análisis. Al final del análisis, deben retirarse cuidadosamente para evitar las salpicaduras de materiales que pudieran constituir un riesgo biológico. Los volúmenes de los vasos son usualmente bastante grandes, consistiendo en cientos de microlitros. La mezclas de la muestra y reactivos puede hacerse de varias formas: uso de fuerzas centrífugas, turbulencia debida a descarga hidráulica, barras de agitación magnéticas, o cuchillas o palas de mezcla que requieren su limpieza entre muestras sucesivas. Los vasos de plástico separados tienen paredes moderadamente gruesas y una conductividad térmica pobre, haciendo difícil el equilibrio rápido de temperaturas, incluso con baños de agua. Adicionalmente, los vasos separados pueden ser relativamente caros, costando desde uno a varios céntimos cada uno.

Tal como se describe más detalladamente más abajo, se han desarrollado varias estrategias para evitar el uso de los contenedores antes descritos. Uno de los problemas más difíciles que se ha encontrado para evitar tales contenedores es proporcionar una mezcla adecuada cuando se combinan los fluidos. En una estrategia, se colocan pequeños volúmenes de fluido sobre un soporte deformable, el cual puede deformarse en una cavidad, consiguiéndose de ese modo la mezcla de los líquidos contenidos en el pequeño volumen. En otra estrategia, los líquidos se aplican en "charcos" pequeños sobre un soporte para formar una mezcla, la cual se agita dirigiendo un gas hacia el líquido.

Tal como se observará más completamente a partir de la descripción de la invención que sigue, la presente invención permite un sistema de manipulación de líquidos que minimiza, obvia, o supera totalmente los problemas presentados por los aparatos de la técnica previa. Por ejemplo, es posible manipular volúmenes muy pequeños de líquido, incluso volúmenes de muestras inferiores a los 50 microlitros. El aparato promueve la mezcla de la muestra líquida consigo misma o, si está mezclada, con uno o más reactivos, sin usar mezclador externo alguno que esté en contacto con la mezcla de reacción. Adicionalmente, el sistema proporciona un aparato que promueve una buena conductividad térmica, de tal forma que se minimizan los gradientes de temperatura a lo largo del sistema de mezcla. El sistema presenta adicionalmente una recogida sencilla y segura de materiales usados, y facilita los costes inferiores a través del uso de desechables, y de costes laborales o costes de maquinaria reducidos, debido a la ausencia de vasos de reacción separados.

La instrumentación clínica actual típicamente requiere numerosos componentes desechables, cantidades de reactivos relativamente grandes, múltiples pasos para asegurar que se lavan todos los componentes reutilizables y cantidades relativamente grandes de muestra. El propósito de la presente invención es minimizar el uso de reactivos y muestras, eliminar los tampones, las soluciones de lavado, y la mayoría de los desechables; disminuir el tamaño, la complejidad y el coste de la instrumentación; y reducir el volumen de desechos sin interferir con las prestaciones del ensayo. Todo esto se consigue sin evaporación de los líquidos o el uso de un soporte deformable.

2. Descripción de la técnica relacionada

La patente estadounidense nº 3.854.73 (Gibbs et al.) descubre un procedimiento para, y un aparato para, promover un reacción entre un espécimen líquido y un reactivo líquido. Tal reacción se promueve aplicando los líquidos a la superficie impermeable a líquidos de un soporte, para formar una mezcla de los mismos. La mezcla de líquidos se agita dirigiendo un chorro de fluido gaseoso, desde la salida de un conducto de suministro, para que afecte la misma, proporcionando un movimiento relativo entre la salida y la superficie del soporte.

En la patente estadounidense nº 4.676.656 (Cook et al.) se describe un sistema de manipulación de fluidos. Se coloca un pequeño volumen de fluido sobre un soporte deformable reversible, el cual se deforma para formar una cavidad. Puesto que el fluido se adhiere a la superficie del soporte, es físicamente agitado y mezclado a medida que el soporte se deforma. El soporte deformable puede utilizarse para proporcionar contenedores de fluidos de diferentes tamaños, para acomodar diferentes volúmenes de fluido, y como mecanismo de transporte para mover el fluido desde una ubicación hasta otra.

La patente estadounidense nº 3.479.141 (Smythe et al.) descubre un sistema de transporte para un aparato de análisis automático, para una serie de muestras líquidas acuosas procesadas como una corriente que fluye, sin o con contaminación mínima entre muestras. Se emplean un conducto de hidrocarburo fluorado y segmentos entre muestras de silicona. La silicona humedece y se adhiere al conducto de hidrocarburo fluorado, mientras que las muestras acuosas no lo hacen. Allí donde se requiere el contacto entre el conducto y las muestras, y en la diálisis, se usan vidrio o celofán, que son humedecidos por las muestras acuosas, y no por la silicona.

En la patente estadounidense nº 4.121.466 (Reichler et al.) se describe una aparato de medición. El aparato es adaptable bien como dispensador o como muestreador, estando recubierta la superficie de la sonda de aspiración con una delgada película de líquido inmiscible con los líquidos a aspirar. El delgada película inmiscible impide la contaminación entre segmentos de líquidos aspirados sucesivamente y, también, sus fuentes respectivas. Además, los segmentos de líquido inmiscible pueden aspirarse entre segmentos de líquido sucesivos para mantener tales segmentos líquidos separados.

Smith et al., discuten "Una tecnología innovadora para el muestreo ``con acceso aleatorio''", en Clin. Chem. 28(9):1867-1872 (1982). Un fluido inmiscible, que no reacciona, se usa como una barrera positiva entre la muestra líquida y el reactivo, y las superficies interior y exterior de sus sondas respectivas, proporcionando una superficie inerte y deformable que, tanto impide el arrastre, como asegura un suministro preciso.

La patente estadounidense nº 3.526.480 discute un analizador químico automático, en donde se transfieren porciones medidas de material de muestra desde un portador de muestra hasta sitio discretos que contienen reactivos sobre una cinta analítica. El aparato está particularmente adaptado para la transferencia de una diversidad de sitios discretos diferentes conteniendo reactivos. Las cintas analíticas con aberturas se descubren también como sitios que contienen reactivos, que tienen los reactivos quimiosorbidos en ellas.

La patente estadounidense nº 4.575.485 (Sizto et al.) describe inmunoreacciones mejoradas ultrasónicas. Las velocidades de unión entre miembros de un par de unión específico, por ejemplo, ligando-receptor, se mejoran enormemente mediante la ultrasonicación breve de un medio acuoso que contiene el par de unión específico. Las velocidades mejoradas hallan un uso concreto en los ensayos de unión específica de proteína.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar luz emitida a partir de un medio líquido sometido a fotoactivación de acuerdo con la reivindicación 1 en ésta.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo para detectar luz emitida desde un medio líquido sometido a fotoactivación de acuerdo con la reivindicación 5 en ésta.

La Figura 1 es una vista superior de una realización de la presente invención.

La Figura 2 es una vista lateral de la realización de la Figura 1, en la que está ausente el anillo serpentino que contiene las cubetas de muestras.

La Figura 3 es una vista superior de otra realización de la presente invención.

La Figura 4 es una ilustración de gotas creadas durante un ensayo para digoxina usando una realización de la presente invención.

La invención es una aplicación concreta en aparato de análisis automático, tal como los usados para realizar ensayos automatizados. En esta aspecto, la invención proporciona acceso aleatorio a muestras líquidas y reactivos, para llevar a cabo tales ensayos y para transportar tales muestras y reactivos a través del aparato, y para proporcionar la detección de una señal. Todo lo anterior se consigue usando técnicas no evaporativas, y sin necesidad de un contenedor o soporte deformable. Preferiblemente, la presente invención implica formar una gota de líquido sobre una superficie sustancialmente plana, y hacer que la gota se deforme en un entorno con flujo de aire esencialmente cero sin deformar la superficie. Las estrategias particularmente preferidas para deformar la gota son la aplicación a la gota de energía electrostática o energía acústica. La presente invención permite minimizar el uso de reactivos y muestra, eliminar tampones, soluciones de lavado, y la mayoría de los desechables, disminuir el tamaño, la complejidad y el coste de la instrumentación, y reducir el volumen de residuos sin interferir con las prestaciones del ensayo.

A continuación se describen en detalle realizaciones específicas de la presente invención, con referencia a los dibujos anexos, a modo de ilustración y no de limitación. Una realización particular de la invención se ilustra en la Figura 1 y Figura 2. El aparato para la manipulación de fluidos 10 comprende un primer soporte 12 para depositar las gotas de líquido 14 sobre el mismo. El soporte 12 es esencialmente plano, y generalmente impermeable a los líquidos depositados. El término "sustancialmente plano" indica que el plano de la superficie 12 es tal que las gotas de líquido colocadas sobre la misma no se moverán por gravedad, en ningún grado sustancial, del punto de depósito.

Más aún, el soporte 12 está sustancialmente libre de miembros de unión, es decir, un miembro de un par de unión específico que tiene un área sobre la superficie o en una cavidad que se une específicamente a, y por tanto se define como complementario de, una organización espacial o polar del otro miembro del par. Los miembros del par de unión específica se denominan ligando y receptor (antiligando). Estos podrían ser miembros de un par inmunológico, tal como un antígeno-anticuerpo, o podrían ser miembros de tales pares como operador- represor, nucleasa-nucleótido, biotina-avidina, hormonas-receptores de hormonas, dúplexes de ácido nucleico, IgG-proteína A, y similares.

El soporte 12 se fabrica a partir de un material que es relativamente inelástico y sustancialmente impermeable a y no reactivo con los líquidos depositados. El soporte se construye de forma que no es fácilmente estirado o deformado hasta un grado mayor del requerido para enrollarlo sobre un carrete en una realización en la que el soporte se alberga dentro de un cassette. Más aún, el soporte 12 no proporciona ninguna interacción química específica, tal como interacciones antígeno-anticuerpo, de tal superficie con los componentes de la muestra líquida o reactivos líquidos, y podría ser o no humedecido por los líquidos. Los materiales apropiados para el soporte 12 son, a modo de ilustración y no de limitación, poliestireno, poliuretano, nilón, poliésteres, polimetacrilato, polietileno, polipropileno, polifluorocarburos, nitrocelulosa, acetato de celulosa, etc. Preferiblemente, el material es transparente e incoloro, y podría ser opaco, en cuyo caso es usualmente negro o blanco. Para ciertos procedimientos es deseable usar un soporte que está recubierto, por ejemplo, metalizado en uno o ambos lados. Tal recubrimiento podría usarse para controlar la reflexibilidad, los fenómenos electrostáticos, etc., o pueden proporcionarse patrones que resultan en contactos eléctricos con la muestra que permiten un proceso electrolítico, o una medición fotoacústica, o la producción de patrones de difracción.

El grosor del soporte 12 es usualmente de cerca de 0,05 a 1 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm. El grosor concreto dependerá de la resistencia del material escogido, y podría depender también de la capacidad del material para conducir calor y energía electrostática o acústica. Es evidente que el grosor del soporte debería ser tal que permitiera al soporte retener su integridad durante su uso en la presente invención. El ancho del soporte está determinado generalmente por la aplicación concreta en la que se usa la invención, tal como en un aparato de análisis automatizado. En esta última situación, el soporte puede proporcionarse como una fibra, banda flexible, lámina o cinta que podría enrollarse en un rollo o proporcionarse como un cassette para una dispensación fácil. En esta estrategia el soporte 12 puede ser captado por un rollo a la salida del aparato. El ancho de la cinta en tal circunstancia es de 0,1 a 250 mm, preferiblemente de 10 a 125 mm. En general, es preferible que el grosor y anchura de la cinta sea relativamente uniforme.

Podría ser importante en algunas circunstancias asegurar que el soporte 12 está sustancialmente libre de carga electrostática. Con esta finalidad, la superficie podría recubrirse con detergentes iónicos o metalizarse, o la carga puede controlarse a través de tomas de tierra, limpiarse con un material conductor, o someterse a irradiación con partículas alfa.

En la Figura 1, el soporte 12 está en forma de una banda flexible, que está en un cassette 16, y es captada por el cassette 18. La banda proporciona el transporte a través del aparato 10. Pueden emplearse mecanismos convencionales para mover la banda, tales como el uso de engranajes y perforaciones en la banda, mecanismos de fricción, rotación del carrete de captación en el cassette, y demás. Adicionalmente, puede aplicarse el control de tales mecanismos de tracción usando técnicas y unidades de microprocesadores para proporcionar sistemas automatizados. De esta forma se mantiene el movimiento suave del soporte a través del aparato. Este realización concreta permite que la totalidad del líquido sobre la superficie del soporte, así como las porciones de soporte usadas, sea captada en el cassette de un manera segura para la eventual recogida de desechos. Debería ser evidente que en la realización anterior el único objeto desechable es el cassette que contiene el soporte usado y los líquidos. No hay necesidad de soluciones de lavado especiales para limpiar ninguno de los componentes del presente dispositivo. Cualquier muestra o reactivos que pudieran adherirse a la pipeta son expulsados usando una minúscula cantidad de líquido inmiscible y, tal como se ha mencionado más arriba, todos los líquidos son captados en el cassette. Por supuesto, se halla dentro del ámbito de la presente invención mover el soporte 12 a través de una estación de recogida para retirar el líquido del soporte, mediante succión o de otro modo. Si se desea, la porción del soporte que se ha usado puede cortarse a continuación y depositarse en un contenedor apropiado para una recogida segura.

Por simplicidad, en la Figura 1 sólo se muestra un soporte; debería entenderse que una pluralidad de soportes podrían estar presentes en un aparato analítico de acuerdo con la presente invención. El soporte 12 está opcionalmente soportado por un soporte rígido 20 (mostrado de forma imaginaria en la Figura 1, y completamente en la Figura 2), el cual podría fabricarse a partir de cualquier material que proporcione rigidez, tal como un plástico rígido, metal, cerámica o similar. El soporte rígido 20 podría tener el mismo ancho que el soporte 12, o podría ser más ancho o más estrecho que el soporte 12, usualmente no más del 50% más grande o más pequeño. Alternativamente, el soporte rígido 20 se proporciona con bordes enrollados, cuentas, costillas o secciones engrosadas, para proporcionar rigidez al soporte 12 cuando el soporte 12 no está construido con un material rígido. Debe tenerse en cuenta que la rigidez del soporte 12, bien por sí mismo o a través del uso de un soporte 20 rígido, debe acomoda el tipo de mecanismo de alimentación. La cubierta 15 podría usarse para proteger el soporte 12 y su contenido durante el uso. La abertura 17 permite el acceso de las pipetas 22 y 24 al soporte 12. La cubierta 15 podría construirse con cualquier material apropiado, consistente con su uso, tal como el plástico, un metal tal como el aluminio, y demás.

Se halla también dentro del alcance de la presente invención que el soporte 12 no sea movible, aunque es menos preferido. Los diversos dispositivos que deben interaccionar con el soporte son entonces movibles. Alternativamente, el soporte 12 podría ser un disco o placa desechables, que podrían montarse sobre un sistema de transporte tal como un carrusel. En otra realización, el soporte 12 podría ser una placa discreta, lo bastante larga como para acomodar gotas de fluido para unos pocos ensayos, por ejemplo, de uno a tres. En un aspecto de esta última realización, la placa de soporte se inserta en un mecanismo de transporte asociado con el soporte rígido 20, e incluye un contenedor integral para una única muestra en lugar de las cubetas 28.

El aparato 10 comprende además medios para dispensar líquidos, tales como las pipetas 22 y 24, para dispensar la muestra líquida y reactivos sobre la superficie del soporte 12 en forma de gotas 14. Las bombas 23 y 25, las cuales podrían ser, por ejemplo, bombas de suministro peristálticas o jeringas, cooperan respectivamente, por medio de los conductos 46 y 47, con las pipetas 22 y 24 para permitir la aspiración y dispensación de líquido sobre el soporte 12. Los ejemplos de otras bombas que podrían usarse en la presente invención son las capilares, piezoeléctricas, de compresión, y similares. El volumen total de líquido en las gotas 14 procedentes de la muestra y en los reactivos es usualmente de 1 a 100 microlitros, preferiblemente menos de 50 microlitros, usualmente aproximadamente de 15 a 40 microlitros. Las pipetas, incluyendo sus extremos, son usualmente no desechables. Tales pipetas son convencionales en la técnica. La pipeta 22 se comunica con los dispensadores de muestra líquida o las cubetas 28, que contienen las muestras a ensayar, las cuales se transportan más allá de la pipeta 22 sobre la cinta serpenteante en movimiento 26. El movimiento de la cinta 26 está indexado para presentar cada muestra con un intervalo predeterminado. El índice de la cinta en movimiento está coordinado con el índice del soporte 12, el cual podría estar indexado con una velocidad predeterminada de forma que permitiera períodos de incubación apropiados, en base a un protocolo concreto, para un ensayo. Las diversas partes del aparato 10 podrían estar indexada, individual o conjuntamente, de tal forma que la dispensación de líquido responda a la posición del soporte 12, tal y como es indicada por los medios de indexado. Por ejemplo, para ensayos típicos, el movimiento del soporte 12 podría estar indexado a una velocidad de 1 a 10 veces por minuto.

Las pipetas 22 y 24 se mueven horizontal y verticalmente mediante brazos actuantes (no se muestran) de acuerdo con una práctica bien conocida.

El aparato 10 tiene también cassettes de reacción 30 y 32 que contienen reactivos líquidos para llevar a cabo un ensayo. Normalmente, los reactivos líquidos se diluyen previamente hasta una cierta concentración predeterminada. Los cassettes 30 y 32 están sobre la plataforma 33, la cual oscila hacia adelante y atrás, de forma que las pipetas 22 y 24 puedan comunicarse con los cassettes 30 y 32 para añadir reactivos líquidos a las gotas 14. El movimiento de la plataforma 33 esa indexado, de forma que está coordinado con el movimiento del soporte 12 para garantizar que los ensayos progresan de una forma deseada.

Las pipetas 22 y 24 se tratan usualmente de forma tal que la parte interior y exterior de los extremos de entrada o puntas 19 y 21, respectivamente, de tales pipetas se mantenga húmedo con un líquido que es inmiscible con el líquido a dispensar. El líquido inmiscible se contiene en el depósito 27. La comunicación entre las pipetas 22 y 24 con el depósito 27 se consigue respectivamente mediante los conductos 29 y 31. Reichler (ver más arriba) discute una forma de mantener las pipetas húmedas con el líquido inmiscible. Con este objetivo, se proporciona una delgada película de líquido, que se caracteriza por ser inmiscible con los líquidos a dispensar, sobre las superficies periférica e interna de las pipetas 22 y 24. La película delgada tiene usualmente de aproximadamente 0,001 a 1 mm de grosor, preferiblemente de 0,01 a 0,1 mm de grosor. La película delgada preferiblemente humedece las superficies interna y periférica para la exclusión de los líquidos a ser dispensados. Con objeto de conseguir este efecto, el líquido inmiscible puede hacerse fluir más allá de la superficie interna, hasta donde la superficie periférica puede ser humedecida por la atracción entre superficie, o hacerse fluir sobre las superficies periféricas, y el exceso puede ser aspirado por la pipeta, o la pipeta puede sumergirse en un depósito de tal líquido inmiscible. El líquido inmiscible podría suministrarse a la punta de una pipeta a partir de una entrada distinta de aquélla a través de la cual se suministran la muestra y/o reactivos a la pipeta. Sin embargo, el líquido inmiscible podría suministrarse a través de la misma entrada. La densidad específica del líquido inmiscible podría ser mayor o menor que la de los líquidos a dispensar.

La naturaleza del líquido inmiscible depende del material que forma las superficies de las pipetas 22 y 24. El líquido debe ser capaz de humedecer el material, el cual usualmente será relativamente hidrofóbico, es decir, será preferiblemente humedecido más fácilmente por el líquido que por las muestras normalmente acuosas. Los líquidos inmiscibles podrían incluir aceites de silicona, aceites minerales o vegetales, aceites de fluorocarburos, etc., siendo el requisito principal que sean relativamente insolubles en agua y que tengan una volatilidad baja por debajo de 55ºC. Puesto que es preferible que los componentes de la solución de ensayo tengan baja afinidad por el aceite, usualmente se prefieren los aceites de fluorocarburos y de silicona. Preferiblemente, el líquido inmiscible tiene una viscosidad de 0,1-500 centistokes, preferiblemente, 1- 100 centistokes, en donde la viscosidad usada dependerá del líquido inmiscible concreto, por ejemplo, podría usarse un fluorocarburo de viscosidad inferior en relación a la viscosidad del aceite de silicona. Los líquidos inmiscibles que tengan una viscosidad en el extremo inferior del rango anterior podrían requerir más limpieza de la puntas que aquéllos en el extremo superior del rango anterior. Pueden hallarse más detalles sobre este tema en la patente estadounidense nº 4.121.466 (Reichler). En ningún caso debe haber una interacción química del líquido inmiscible sobre la punta de la pipeta, con la muestra líquida o reactivos líquidos. Las gotas 14 usualmente contienen no sólo muestra líquida y reactivos líquidos sino también algo de líquido inmiscible.

Las gotas 14 están sobre la superficie del soporte 12 en una contención sin contenedores. El término "contención sin contenedores" significa que las gotas 14 no están encerradas en contenedores discretos que tienen paredes o barreras físicas que confinan el líquido. Las gotas 14 se mantienen principalmente sobre la superficie del soporte 12 por medios distintos de la gravedad, tales como las interacciones electrostáticas y la tensión superficial. El área adyacente a los sitios de suministro de líquidos preferiblemente no tendrá barreras mecánicas que hagan contacto con la gota. Cuando se usa una barrera tal, su principal función es impedir que la gota resbale a lo largo de la superficie. Con este propósito, la superficie se proporciona con depresiones poco profundas o elementos ligeramente elevados, y, por tanto, las gotas están en contacto con la superficie en menos del 50% de su altura, normalmente en menos del 10% de su altura. Se halla dentro del ámbito de la presente invención usar una superficie que tiene una afinidad diferente por los líquidos que la porción de la superficie sobre la cual se aplican las gotas 14, para ayudar a mantener las gotas como entidades discretas. Otros medios serían la aplicación de un anillo de material (capa muy delgada) que impide que la mojen el aceite o agua, forzando de ese modo a la gotas a permanecer donde son colocadas.

El mezclado podría emplear la interacción de una fuerza deformadora impuesta externamente y las fuerzas cohesivas restauradoras (tensión superficial) de la gota. La fuerza externa se pulsa de forma que ocurre una deformación rápida y oscilante de la gota. Son posibles muchos modos de deformación oscilante, y se distinguen por los patrones de movimiento relativo de las diversas regiones de la superficie de la gota. La frecuencia, forma de onda, y la amplitud de la fuerza externa pulsada determinan el modo de deformación oscilante. El mezclado rápido y eficiente requiere la elección apropiada de estos parámetros de control de la fuerza externa.

La fuerza externa podría ser electrostática o mecánica. Una fuerza electrostática pulsada o campo eléctrico oscilante podría aplicarse cargando y descargando alternativamente electrodos dispuestos ordenadamente en la proximidad de la gota. Una fuerza mecánica pulsada podría aplicarse desplazando la cinta de soporte con un actuador dirigido por un bobina acústica, una membrana piezoeléctrica, u otro transductor electromecánico oscilatorio.

La muestra líquida y los reactivos líquidos se mezclan en un entorno esencialmente con un flujo de aire cero para evitar la evaporación y otros movimientos de las gotas. Por el término "entorno esencialmente con un flujo de aire cero" se quiere indicar que el movimiento del aire en el dispositivo 10 en el área en la cual han de mezclarse los líquidos es insuficiente para causar el movimiento o deformación de las gotas 14. Además, para evitar la evaporación, la superficie 12 está usualmente encerrada para proporcionar un espacio de aire mínimo por encima de las gotas, mientras que todavía se proporciona acceso para aplicar la muestra y reactivos.

El dispositivo 10 también comprende los medios 36 y 38 para el mezclado de la muestra líquida y de los reactivos líquidos en las gotas 14. Generalmente, los líquidos se mezclan deformando las gotas 14, y esto se consigue usualmente sin ningún estiramiento sustancial del soporte 12. De acuerdo con esto, aunque el soporte 12 podría ser delgado y, en algunas circunstancias, flexible, el soporte 12 debería permanecer sustancialmente no deformado, de tal forma que las dimensiones de cualquier segmento del soporte 12 permanecen sustancialmente inalteradas, usualmente menos del 10%, preferiblemente menos del 1% de cambio, en cualquier dimensión durante el mezclado de la muestra.

Son ejemplo de los medios 36 los medios para aplicar energía electrostática o energía acústica a las gotas 14. La energía electrostática podría aplicarse sometiendo las gotas 14 a un campo eléctrico variable, el cual induce la polarización de, y resulta en la deformación de, las gotas 14. El campo eléctrico variable puede producirse cambiando alternativamente la polaridad de un condensador. La deformación de las gotas 14 resulta en el mezclado de la muestra líquida y los reactivos líquidos. No se requiere contacto físico con las gotas 14. La frecuencia y la fuerza de campo del campo eléctrico dependen del tamaño, viscosidad y tensión superficial de la gota, de la cantidad de líquido inmiscible en contacto con la gota, de las características de la superficie 12, y similares, y usualmente se determina empíricamente. Normalmente, la frecuencia del campo eléctrico es aproximadamente de 5 a 50.000 Hz, preferiblemente de 15 a 1000 Hz, más preferiblemente, aproximadamente de 20 a 500 Hz. La fuerza de campo del campo eléctrico es usualmente de aproximadamente 500 a 20.000 voltios por centímetro, preferiblemente, aproximadamente 1000-10.000 voltios por centímetro. El tiempo de aplicación de la energía del campo eléctrico podría variar, dependiendo de la frecuencia y fuerza del campo, desde aproximadamente 1 hasta 60 segundos, preferiblemente, desde aproximadamente 5 hasta 20 segundos. La frecuencia, la fuerza del campo, y el tiempo se escogen para que no tengan un efecto perjudicial sobre la muestra, los reactivos, o la precisión de un ensayo.

Cuando se aplica energía acústica a las gotas para mezclar los líquidos, los factores enumerados más arriba, en relación al uso de un campo eléctrico, son también aplicables. Normalmente, la vibración necesaria para el mezclado puede conseguirse mediante el uso de energía sónica o subsónica. Con esta finalidad, las gotas 14 pueden someterse a una frecuencia de aproximadamente 20-20.000 Hz, preferiblemente, 20-2000 Hz. La potencia depende generalmente de varios factores, incluyendo cómo la potencia se acopla con la gota y el soporte. En consecuencia, la potencia se determinará para cada aplicación particular usando los parámetros y directrices anteriores. El tiempo de aplicación de la energía acústica podría variar, dependiendo de la frecuencia y potencia, desde aproximadamente 0,5 hasta 30 segundos, preferiblemente, desde aproximadamente 1 hasta 10 segundos. La potencia, frecuencia y tiempo se eligen de forma que no tengan efectos perjudiciales sobre la muestra, los reactivos, o la precisión del ensayo. LA energía acústica se aplica a las gotas 14 en el aparato 10 por medio de un generador de ondas acústicas, de un altavoz, o similares.

Otro procedimiento para mezclar los líquidos en las gotas 14 implica fuerzas de corte producidas mediante la aspiración de cada gota hacia dentro y hacia fuera de la pinta de una pipeta, tal como la pipeta 22, o a través de un dispositivo de mezclado dentro de la punta de tal pipeta. Esto podría conseguirse mediante el uso de la bomba 23 en cooperación con la pipeta, y operada de forma intermitente.

El aparato 10 también incluye medios para medir una señal producida en la gota 14 durante el curso de un ensayo. La señal es o se produce mediante radiación electromagnética, y resulta de la absorbancia y dispersión de la luz, de la fluorescencia, de la quimioluminiscencia, de la resonancia Raman, de la electroluminiscencia, y de similares. Uno de tales medios para medir una señal es el cabezal de lectura 34 ubicado en el aparato 10, de tal forma que el cabezal de lectura puede examinar las gotas 26 en busca de la presencia de una señal. El cabezal de lectura 34 comprende un fotodetector.

En las Figuras 1 y 2, el cabezal de lectura 34 comprende una porción superior o reflector parabólico 35, que se ubica directamente por encima de una porción del soporte 12, y comprende una superficie reflectora 44. Un láser 42 se comunica con la porción superior 35 mediante una fibra óptica 43. El cabezal de lectura 34 también comprende un tubo fotomultiplicador 40 que tiene un obturador 41. El movimiento de la porción superior 35 verticalmente hacia y desde la superficie 12 está controlado por el brazo 37, el cual, a su vez, es controlado por, por ejemplo, un solenoide (no se muestra).

Preferiblemente, la señal se lee sin contacto ulterior con las gotas 14. No obstante, la medición de la señal podría conseguirse aspirando una porción de la gota 14 dentro de una cámara de lectura que está recubierta con un líquido inmiscible tal como el descrito más arriba. Podría incluirse una lente apropiada o un sistema de conducción de la luz para recoger con elevada eficiencia la luz emitida desde una gota.

Las muestras frecuentemente serán, pero no se limitan a, muestras de origen biológico, e incluyen los fluidos corporales, obtenidos usualmente a partir del cuerpo de un sujeto mamífero. Los fluidos corporales son generalmente líquidos o material semisólido, y podrían ser estériles o no estériles, y podrían contener células. El fluido corporal podría emplearse sin más tratamiento, o podría tratarse para suprimir las células, restos, y similares. Son ejemplo de fluidos corporales, la sangre completa, el fluido linfático, el suero, el plasma, la saliva, el semen, y fluido cerebroespinal. El fluido corporal podría obtenerse a partir de un sujeto, por ejemplo, mediante una jeringa o aguja, o mediante expulsión natural. Otras muestras líquidas podrían obtenerse a partir de material semisólido o sólido mediante extracción de acuerdo con procedimientos conocidos.

Las muestras a analizar mediante los procedimientos de la presente invención podrían tratarse previamente para separar o lisar las células; precipitar, hidrolizar, o desnaturalizar las proteínas; hidrolizar los lípidos; solubilizar el analito; o similares. Tales tratamientos previos podrían incluir, sin limitación, la centrifugación; el tratamiento de la muestra con un solvente orgánico, por ejemplo, un alcohol, preferiblemente un alcohol que tenga menos de aproximadamente 7 átomos de carbono, tal como el metanol; y el tratamiento con detergentes, agentes caotrópicos, hidróxido sódico, etc. En consecuencia, el término "muestra líquida" incluye los anteriores conjuntamente con cualquier medio líquido, producido como el resultado de tal tratamiento previo, y sospechoso de contener un analito o componente de interés. Tales analitos o componentes de interés incluyen drogas de adicción, drogas terapéuticas, pesticidas, proteínas, tales como las inmunoglobulinas, ácidos nucleicos, y demás. Los analitos se describen con más detalle en la patente estadounidense nº 5.248.619, en la columna 6, línea 27, hasta la columna 8, línea 6.

Los reactivos en las cubetas 30 y 32 se seleccionan en base al tipo de ensayo a realizar. Las descripción de sólo dos reactivos es sólo a modo de ejemplo y no pretender ser una limitación. El número de reactivos puede ser mayor o menor dependiendo del formato concreto de ensayo utilizado. Los dispositivos de la presente invención podrían adaptarse a la mayoría de los ensayos que requieren radiación electromagnética para la detección, incluyendo los ensayos que implican miembros de pares de unión específica (sbp). Los ensayos podrían ser competitivos o en sandwich, pero no requerirán separaciones que deban llevarse a cabo en el aparato 10. La reacción inmunológica para un ensayo del tipo en sandwich usualmente implica un miembro de un sbp que está unido a una marca y la muestra. En un protocolo competitivo, la muestra podría estar asociada con un miembro de un sbp que es análogo al analito a determinarse en la muestra. El reactivo que contiene la marca, por ejemplo, el miembro del sbp unido a una marca, de denomina como reactivo marcado. La marca podría no estar unida a un miembro del sbp que es complementario de un analito. En cambio, el reactivo podría tener un miembro del sbp que permitirá que la marca pase a estar unida al miembro del sbp unido a un analito, y, de ese modo, es capaz de ser marcado.

Frecuentemente, en un ensayo que emplee la presente invención se emplearán varios materiales auxiliares. En consecuencia, los reactivos líquidos podrían incluir tampones, así como estabilizantes, para el medio de ensayo y los componentes del ensayo, y para los pasos de lavado, según se requiera. Frecuentemente, además de estos aditivos, podrían incluirse proteínas adicionales, tales como albúminas, o tensioactivos, particularmente tensioactivos no iónicos, potenciadores de la unión, por ejemplo, polialquilenglicoles, o similares.

Una vez se han combinado la muestra y los reactivos, estos pueden incubarse, si se desea. Los miembros del sbp se activan entonces, y se mide la señal resultante. Por ejemplo, si los miembros del sbp son un enzima marcador y su sustrato, se añade el sustrato y la señal producida se relaciona con la cantidad de analito en la muestra ensayada.

Para una discusión más detallada de las técnicas de inmunoensayo, consultar "Enzyme-Immunoassay," por Edward T. Maggie, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Consultar también, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 3.690.834; 3.791.932; 3.817.837; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; y 4.098.876, listado que no se pretende que sea exhaustivo.

La señal procedente de la marca podría ser directamente detectable. Por otra parte, la marca podría ser parte de un sistema productor de señal ("sps"), el cual podría tener uno o más componentes, siendo al menos un componente la marca. El sps genera una señal detectable que está relacionada con la cantidad de marca unida y/o no unida, es decir, la cantidad de marca unida o no unida al analito que se está detectando, o a un anticuerpo contra el analito. De esta forma, la cantidad de señal se relaciona con la presencia o cantidad de analito en la muestra. Los calibradores o controles que contienen cantidades predeterminadas de analito pueden emplearse para ayudar a relacionar la cantidad de señal con la presencia o cantidad de analito. El "sps" incluye todos los reactivos requeridos para producir una señal detectable. Hay numerosos procedimientos mediante los cuales la marca puede producir una señal detectable, por ejemplo, mediante radiación electromagnética, calor, reactivos químicos, y similares.

La marca puede producir directamente una señal, es decir, no se requieren reactivos adicionales para producir una señal. Por ejemplo, numerosas moléculas orgánicas son capaces de absorber luz ultravioleta y visible, en donde la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitado. Esta energía absorbida se disipa a continuación mediante la emisión de luz a una segunda longitud de onda. Por ejemplo, las moléculas fluorescentes son capaces de absorber luz a uno longitud de onda y emitir luz a una segunda longitud de onda. Las moléculas fluorescentes apropiadas incluyen la fluoresceína, el isotiocianato, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el o- ftaldehído, y la fluorescamina. En Litman et al., patente estadounidense nº 4.275.149, columnas 30 y 31, se indican un gran número de compuestos fluorescentes ilustrativos. Otros ejemplos de marcas que pueden producir directamente una señal son los isótopos radiactivos, tales como el ^{125}I, ^{131}I, ^{14}C, ^{3}H, ^{57}Co, ^{75}Se, ^{32}P, ^{35}S y similares; y los colorantes, tales como los bien conocidos en la técnica.

Alternativamente, la marca podría requerir también otros reactivos con objeto de producir una señal. Por tanto, el sistema productor de señal incluye la totalidad de los reactivos requeridos para producir una señal medible. Otros componentes del sistema productor de señal incluyen los sustratos, coenzimas, potenciadores, segundos enzimas, activadores, cofactores, inhibidores, limpiadores (scavengers), iones metálicos, sustancias de unión específica requeridas para la unión de las sustancias generadoras de señal, y similares. Algunos de los reactivos químicos, tales como coenzimas, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, otros enzimas y catalizadores, y similares, pueden unirse a otras moléculas o a un soporte.

En Ullman et al., patente estadounidense nº 4.160.645, se hallan una amplia variedad de catalizadores no enzimáticos que podrían emplearse.

Podría emplearse un enzima o coenzima que proporciona la amplificación deseada produciendo un producto, el cual absorbe luz, por ejemplo, un colorante, o emite luz a partir de su irradiación, por ejemplo, un compuesto fluorescente. Alternativamente, la reacción catalítica puede conducir a la emisión directa de luz, por ejemplo, la quimioluminiscencia. En Litman et al., patente estadounidense nº 4.275.149, abarcando las columnas 19 a 23, y en Boguslaski et al., patente estadounidense nº 4.318.980, columnas 10 a 14, se indican un número elevado de enzimas y coenzimas para proporcionar tales productos.

Los compuestos quimioluminiscentes son también apropiados como marcas, tales como, a modo de ilustración y no de limitación, el luminol, el isoluminol, los ésteres aromáticos de acridinio, el imidazolio, la sal de acridinio, el éster de oxalato, y similares. En Litman et al., patente estadounidense nº 4.275.149, columna 31, se detallan numerosos quimioluminiscentes. Los compuestos quimioluminiscentes pueden usarse también conjuntamente con fotosensibilizadores, tales como los descritos en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/704.569, registrada el 22 de mayo de 1991, y titulada "Assay Method Utilizing Induced Luminiscence".

Un procedimiento particular para generar una señal en ensayos realizados de acuerdo con la presente invención se describe en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/704.569, registrada el 22 de mayo de 1991 (Ullman et al.).

El procedimiento comprende tratar una mezcla de reacción, sospechosa de contener el analito, en condiciones tales que el analito, si está presente, causa que un fotosensibilizador y un compuesto quimioluminiscente pasen a estar en estrecha proximidad. El fotosensibilizador genera oxígeno singlete, y activa el compuesto quimioluminiscente cuando está en estrecha proximidad. El compuesto quimioluminiscente activado subsiguientemente produce luz. La cantidad de luz producida está relacionada con la cantidad de analito en el medio. Más concretamente, tal como se aplica en la presente invención, una realización del procedimiento incluye, como primer paso, proporcionar una combinación que comprende el medio antes mencionado, y sospechoso de contener el analito unido a una partícula, el cual también tiene un compuesto quimioluminiscente asociado con la partícula, y un fotosensibilizador asociado con un miembro de un par de unión específica (sbp) capaz de unirse al analito. Se trata la combinación, usualmente mediante irradiación con luz, para excitar el fotosensibilizador, el cual es capaz en su estado excitado de activar oxígeno a un estado de singlete. La combinación se examina a continuación por la cantidad de luminiscencia o luz emitida. La cantidad de luminiscencia se relaciona con la cantidad de analito en el medio. Alternativamente, el compuesto quimioluminiscente se asocia con un miembro de sbp capaz de unir el analito, y la partícula a la cual el analito está unido se asocia con un fotosensibilizador.

Después de las incubaciones apropiadas, las gotas 14 pasan a través del cabezal de lectura 34, en donde se determina la señal generada.

El aparato de la presente invención puede encerrarse en una caja para protegerlo durante su uso y almacenamiento. Tales cajas son bien conocidas en la técnica, y podrían adoptar cualquier diseño consistente con la función y uso del presente aparato. Además, las partes activas del aparato están generalmente controladas por varios programas para proporcionar las funciones necesarias, tales como indexar el soporte 12, la aspiración y dispensación de líquidos, la coordinación de otras partes del aparato 10, y similares. El presente aparato puede incluir medios para controlar la temperatura interior, de forma que se obtengan las temperaturas de incubación apropiadas y similares. Tales medios pueden incluir varios mecanismos de calentamiento y enfriamiento, los cuales son convencionales en la técnica.

En un protocolo preferido para ensayos realizados de acuerdo con la presente invención, y empleando un volumen total de líquido de menos de 50 microlitros, la punta de la pipeta 22 se humedece primero forzando unos pocos microlitros de un líquido inmiscible a través de la punta. El líquido inmiscible se mantiene en un depósito 27, y se suministra a la pipeta 22 por medio de una válvula en el conducto 29. Cualquier exceso de líquido inmiscible puede suministrarse a la superficie del soporte 12. A continuación, el líquido inmiscible se rellena para humedecer la punta de la pipeta, y se aspiran varios microlitros de un reactivo líquido procedente de la cubeta 32, seguidos, si se desea, por la aspiración de unos pocos microlitros de una muestra líquida procedente de la cubeta 28 o de un segundo reactivo líquido de la cubeta 32. Usualmente, cuando se aspira un segundo reactivo o muestra, se introduce un pequeño hueco de aire entre los dos líquidos mediante la aspiración de una pequeña cantidad de aire. Los dos líquidos se suministran a continuación sobre la superficie del soporte 12. Alternativamente, el menor volumen de líquido a usarse se suministra directamente sobre la superficie, y el segundo líquido se aspira subsiguientemente y se deposita encima de la gota del primer líquido. Generalmente, las puntas de las pipetas 22 y 24 se humedecen con el líquido inmiscible, antes de cada aspiración y dispensación de líquido, tomando el líquido inmiscible del depósito 27. Las gotas podrían colocarse sobre el soporte 12 en cualquier ubicación a condición de que los bordes del soporte no interfieran con el contención sin contenedores de las gotas tanto antes, durante como después del mezclado de los líquidos de acuerdo con la invención. A veces podría preferirse ubicar las gotas sobre el soporte para maximizar la consistencia de los resultados de un ensayo y evitar resultados anómalos.

A continuación, se aplica un campo eléctrico para mezclar los líquidos en la gota 14. A continuación del mezclado de los líquidos, se deja incubar la mezcla de ensayo durante 0,5 a 30 minutos. Durante este tiempo podrían añadirse otros reactivos líquidos, o podría aspirarse una alícuota de la mezcla mediante una punta de pipeta, y suministrarse a otra porción de la superficie. A continuación puede suministrarse otro reactivo encima de esta nueva gota y la combinación mezclarse se nuevo tal como se ha descrito más arriba. Durante la totalidad de este intervalo, el soporte 12 se está moviendo paso a paso desde un extremo adyacente al cassette 16 hasta el otro extremo adyacente al cassette 18. Todos los pasos anteriores están indexados de una manera apropiada. A continuación de todos los pasos de mezcla e incubación, se lee una señal, producida durante el ensayo a resultas de la presencia o ausencia de un analito en la muestra líquida, mediante el cabezal de lectura 34. En la presente invención, cuando la señal es electromagnética, tal como con una marca fluorescente o quimioluminiscente, generalmente se irradia la muestra de ensayo y se mide la cantidad de luz emitida. Para este propósito a veces será útil que la superficie del soporte tenga un recubrimiento reflejante para ayudar en la recogida de la luz. Tales recubrimiento reflejantes puede ser, por ejemplo, el Mylar aluminizado disponibles comercialmente.

El soporte 12 continua moviéndose de forma que es introducido en el cassette 18 para su eliminación. Tal como se ha mencionado más arriba, se halla dentro del ámbito de la presente invención usar un soporte que puede cortarse, retenerse, o dispensarse de forma segura. Mientras que se han descrito medios para dispensar muestras líquidas separadas, medios para dispensar reactivos, y medios para la retirada de líquidos, esas funciones pueden ser combinadas diversamente en modos convencionales dependiendo de la aplicación concreta. Por ejemplo, podría utilizarse un mecanismo de pipeta única para dispensar muestra líquida y reactivos según fuera necesario, y también para retirar el líquido del soporte 12 al final de un ensayo, si se desea. Varias modificaciones de este sistema ilustrativo serán evidentes para aplicaciones e instrumentación concretas, las cuales pueden incluir una variedad de sistemas de detección de sustancias para la detección y/o medición de materiales en líquidos.

En la Figura 3 se muestra otro dispositivo acorde con la presente invención. El aparato 50 comprende un soporte 52 para depositar gotas de líquido 54 sobre el mismo. El soporte 52 es sustancialmente plano y generalmente impermeable a los líquidos depositados. En la Figura 3 el soporte 52 está en forma de un banda flexible que está en el cassette 56 y es recogida por el cassette 58, la cual proporciona el transporte a través del aparato. El aparato 50 comprende además medios para dispensar el líquido, tales como las pipetas 62 y 64 para dispensar muestras y reactivos líquidos sobre la superficie del soporte 52 en forma de gotas 54. Al igual que con el aparato descrito en la Figura 1, es deseable mantener las puntas de las pipetas 62 y 64 humedecidas con un líquido que es inmiscible con el líquido a dispensar. Las pipetas 62 y 64 se comunican con el depósito 67 por medio de los conductos 82 y 84, y están asistidas por las bombas 63 y 65. El depósito 67 contiene un líquido que es inmiscible con el líquido a dispensar. La pipeta 62 se comunica con las cubetas 68, que contienen las muestras a ensayarse, las cuales se transportan más allá de la pipeta 62. Las cubetas 68 están sobre el carrusel 66, el cual podría girarse intermitentemente, o indexarse, para presentar cada muestra con un intervalo predeterminado. La indexación del carrusel 66 está coordinada con la indexación del soporte 52, el cual podría estar indexado como se describió más arriba para la Figura 1. El aparato 50 también tiene contenedores desechables 70 y 72 para reactivos, que contienen reactivos para realizar un ensayo. La pipeta 62 se comunica con el contenedor 70 por medio del conducto 69 y la bomba 78. La pipeta 64 se comunica con el contenedor 72 por medio del conducto 71 y la bomba 80. La comunicación está indexada para coordinarse con la indexación del movimiento del soporte 52.

Los números 1-4 dentro de las gotas 54 en la Figura 3 identifican gotas que contienen el reactivo 1 (gota número 1), el reactivo 2 (gota número 3), la muestra y el reactivo (gota número 2), y una combinación de reactivos 1 y 2 con la muestra (gota número 4). En la Figura 3, las pipetas 62 y 64 no sólo dispensan muestra y reactivos como gotas 54, tal como se menciona más arriba, sino que también toman alícuotas precisas de cada una de las gotas 1-3 y dispensan esas alícuotas para formar la gota 4. Alternativamente, las pipetas 62 y 64 pueden dispensar alícuotas precisas de reactivos y muestra directamente para formar la gota 4 (no se muestra la realización). En un aparato típico acorde con la presente invención, los contenedores 70 y 72 son dos de una pluralidad de tales contenedores, pluralidad que está en forma de, por ejemplo, una rueda, una placa con movimiento recíproco, o similares, para proporcionar la totalidad de los reactivos necesarios para realizar ensayos para una multitud de analitos.

Por supuesto, se halla dentro del alcance de la presente invención tener contenedores 70 y 72 que directamente depositan los reactivos sobre el soporte 52 respectivamente como gotas número 1 y 3. En esta estrategia, cada contenedor 70 y 72 está equipado con medios de pipeteo para dispensar sus respectivos contenidos como gotas sobre el soporte 52.

El aparato 50 también comprende los medios 76 para el mezclado de la muestra líquida y de los reactivos líquidos en las gotas 54 (gotas número 4) de acuerdo con la presente invención. En esta realización el medio 76 es un generador de onda acústica, para la aplicación de energía acústica a las gotas 54. El cabeza del lectura 74 se ubica en el aparato 50 de forma el cabezal de lectura 74 puede examinar las gotas 54 (gotas número 4) en busca de la presencia de una señal.

Ejemplos

La invención se demuestra aún más mediante el siguiente ejemplo ilustrativo, el cual no debería considerarse como una limitación del ámbito de la presente invención. Las partes y porcentajes son en peso a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1 Ensayo de la digoxina

En el presente ejemplo, el procedimiento es un inmunoensayo homogéneo de suero de sangre humana en busca de la presencia de la droga digoxina. El procedimiento que se automatizó fue similar al descrito en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/156.181, registrada el 22 de noviembre de 1993 (Singh, et al.).

En referencia a las Figuras 1 y 2, se cargaron previamente dos reactivos en un par de receptáculos en el cassette 30, el cual se colocó sobre la plataforma 33 de tal forma que la pipeta 22 tenía acceso a los reactivos en esos receptáculos. El reactivo A consistía en un tampón a pH 8,2 (TRIS-HCl 0,1 M, NaCl 0,3 M, etilendiaminatetraacetato (EDTA) 25 mM, 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,1% de Dextrano T-500 (R), 0,12% de Kathon (R) (un conservante vendido por Rohm y Haas), y una dilución 1/320 del Reactivo 1 Bloqueador Heterofílico (fabricado por Scantibodies Laboratory, Santee, California) con 120 \mug/ml de partículas de látex suspendidas en él. Estas partículas contenían un compuesto quimioluminiscente (thioxene C-26 de Singh, et al., ver más arriba), y un quelato de europio, a saber, Eu(TTA)_{3} de Singh et al., ver más arriba, y tenía anticuerpos contra la digoxina unidos a su superficie por medio de una unión biotina- estreptoavidina. El reactivo B consistía en un tampón (el mismo que para el reactivo A) con 24 \mug/ml de partículas de látex suspendidas en él. Estas últimas partículas se prepararon de forma similar a la descrita en Singh et al., ver más arriba, y contenían el fotosensibilizador tetradecilesquarato (TDS) (preparado de forma similar a la descrita en la patente estadounidense nº 4.830.786) y tenía moléculas de digoxina unidas sobre su superficie. La muestra de suero estaba contenida en el receptáculo 28, también accesible para la pipeta 22.

El soporte rígido 20 y su cubierta 15 (ver la Figura 2), así como los reactivos en el cassette 30, se mantuvieron a 32ºC. Las puntas de las pipetas 19 y 21 se rellenaron con aceite de silicona, procedente del depósito 27, con una viscosidad de 50 centistokes. Las puntas eran esencialmente cilindros de polipropileno, con un diámetro interno de 1 mm, un diámetro externo de 2 mm, y una longitud de 50 mm. La pared de las puntas de las pipetas se afiló hasta un diámetro externo de 1,5 mm a lo largo de los últimos 4,5 mm de su longitud. La punta de la pipeta se preparó para la transferencia de fluidos mediante el suministro de uno o dos microlitros de aceite de silicona sobre el soporte 12, el cual estaba en forma de una cinta. Este paso sólo fue necesario al inicio de un ciclo automatizado. El aceite de silicona fue aspirado del exterior de la pipeta por fuerzas capilares hasta una altura de al menos 3 mm por encima del extremo abierto de la punta.

La secuencia de operaciones en el ensayo fue como sigue: Se operó la pipeta 22 para aspirar 2 \mul de aire en su punta, la cual se colocó a continuación 2 mm por debajo de la superficie del líquido en el receptáculo del cassette que contenía el reactivo A, y se aspiraron 20 \mug de ése líquido. A continuación, la punta de la pipeta se retiró del líquido y se colocó sobre la ubicación 101 (ver Figura 4) sobre el soporte 12, en línea con el cassette de reactivos 30 y el receptáculo de muestra 28. Se hizo descender la punta de la pipeta hasta una altura de 1,5 mm por encima del soporte 12 y el líquido, hueco de aire, y una pequeña cantidad de aceite de silicona se depositaron en la ubicación 101 sobre la superficie del soporte 12. El volumen total extraído de la pipeta fue de 23 \mul. A continuación, la pipeta llevó a cabo las misma secuencia de pasos para depositar una gota de reactivo B en la ubicación 102. El soporte 12 era una película de Mylar D transparente, con 0,127 mm (0,005 pulgadas) de grosor y 49,8 mm (1,96 pulgadas) de anchura.

La pipeta aspiró 2 \mul de aire, y a continuación se colocó la pipeta de tal forma que su extremo abierto penetró en la gota en la ubicación 101, y estaba a una altura de 0,5 mm por encima del soporte 12. La pipeta aspiró 15 \mul del líquido en la gota. Se retiró la punta de la gota y se aspiraron 0,2 \mul de aire. A continuación se movió la pipeta hasta el receptáculo de muestra 28 y se sumergió 2 mm por debajo de la superficie del líquido, y se aspiraron 3 \mul de suero. A continuación se movió la pipeta hasta la posición 103 y se colocó 1,5 mm por encima de la superficie del soporte y se dispensó un volumen de 23 \mul. Los dos volúmenes de líquido se mezclaron en una gota a medida que se depositaban sobre el soporte, se expulsaron los espacios de aire, y se dispensó 1 \mul de aceite de silicona en exceso sobre la gota. Se ubicó un actuador de mezcla justo por debajo y en contacto con el soporte 12 en la posición 103. Se hizo oscilar el actuador aproximadamente 0,25 mm verticalmente, con un patrón de onda cuadrada, a 800 Hz. La oscilación se mantuvo durante 6 segundos, de forma que los contenidos de las gotas fueron mezclados a conciencia por el movimiento oscilatorio de la superficie de la gota. La reacción entre la digoxina del suero y las partículas del reactivo A se inició en este punto.

A continuación se hizo avanzar el soporte, así como la cadena de muestras, y se preparó una segunda reacción. Cuando la primera mezcla de reacción alcanzó la ubicación de la pipeta 24, se inició la segunda parte de la reacción inmunológica. En una secuencia de pasos similar los que iniciaron el primer paso, y usando la pipeta 24 y sólo los líquidos ya presentes en las gotas sobre el soporte 12, se depositaron 3 \mul de la mezcla de suero y reactivo A (procedentes de la ubicación 103) y 15 \mul del reactivo B, procedentes de la gota inicialmente depositada en la posición 102, en la ubicación 104 respecto a las tres gotas originales. Un segundo actuador de mezcla mezcló la gota de forma que pudo iniciarse la reacción entre las partículas del reactivo B y las partículas del reactivo A.

A medida que el soporte avanzaba en un ciclo precisamente cronometrado, la mezcla en la ubicación 104 alcanzó el cabezal de lectura 34. El proceso de lectura de la señal se inició con un brazo actuador 37 con un solenoide y haciendo descender sobre la gota un recinto reflejante 35, cuyos extremos se pusieron en contacto con el soporte formando un precinto sustancialmente a prueba de luz. Por debajo de la gota y del soporte había un cilindro reflejante, hueco, un obturador electromecánico 41, un tubo fotomultiplicador 40. El obturador estaba inicialmente cerrado. En el extremo superior del recinto reflejante había la cara final de una fibra óptica 43, la cual suministraba luz procedente de un láser de diodos 42. El láser de diodos se encendía mediante control por ordenador a través de una fuente de alimentación modulada externa (no se muestra en las Figuras 1, 2 ó 4). El láser se encendió durante un segundo. Diez milisegundos más tarde se apagó el láser, se abrió el obturador durante un segundo, y se midió la luz procedente de la mezcla de reacción. Diez milisegundos después de cerrar el obturador, se encendió de nuevo el láser y se repitió el proceso.

La luz total medida a lo largo de seis ciclos de iluminación y detección constituyó la señal para esa muestra. La señal se comparó con la obtenida usando controles que tenían cantidades predeterminadas de digoxina. De esta forma se determinó la cantidad de digoxina en muestras desconocidas.

La Figura 4 muestra las ubicaciones relativas de las cuatro gotas creadas en el análisis de cada muestra, en un ejemplo de uso del procedimiento. Estas ubicaciones están sobre el soporte móvil 12, y cambian de posición en relación al soporte fijo 20 a medida que se hace avanzar el soporte 12.

Claims (6)

1. Procedimiento para detectar luz procedente de un medio líquido sometido a fotoactivación, comprendiendo dicho procedimiento los pasos de:

(a)

aplicar dicho medio líquido a un soporte transparente sustancialmente plano y sustancialmente inelástico (12), estando dicho medio líquido en una contención sin contenedores en él, siendo dicho soporte sustancialmente impermeable a y no reactivo con dicho medio líquido,

(b)

colocar dicho soporte (12) de tal manera que dicho medio líquido y dicho soporte estén entre dos superficies reflejantes (44) que rodean sustancialmente dicho medio líquido, teniendo al menos una de dichas superficies una apertura para que la luz emitida a partir de dicho medio líquido incida sobre un fotodetector, que comprende un tubo fotomultiplicador (40) que tiene un obturador (41),

(c)

someter dicho medio líquido a fotoactivación con dicho obturador (41) cerrado, y

(d)

abrir dicho obturador (41) y detectar, por medio de dicho tubo fotomultiplicador (40), la luz emitida por dicho medio líquido.

2. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicha fotoemisión es quimioluminiscencia.

3. Procedimiento de la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en donde dicho medio está en forma de una gota (14) sobre dicho soporte trans-
parente.

4. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho soporte (12) es una banda.

5. Dispositivo para detectar luz procedente de un medio líquido sometido a fotoactivación, comprendiendo dicho dispositivo:

(a)

un soporte transparente, sustancialmente plano y sustancialmente inelástico (12), que es sustancialmente impermeable a y no reactivo con dicho medio líquido,

(b)

un fotodetector, que comprende un tubo fotomultiplicador (40) que tiene un obturador (41), y

(c)

dos superficies reflejantes (44) ubicadas con respecto a dicho soporte (12) de tal manera que un medio (14) aplicado a dicho soporte se halla entre dichas superficies, teniendo al menos una de dichas superficies un agujero para que la luz emitida a partir de dicho medio incida sobre dicho fotodetector, estando dicho medio en una contención sin contenedores sobre dicho soporte.

6. Dispositivo de la reivindicación 5, en donde dicho soporte (12) es una banda.