ES2219660T3

ES2219660T3 - Metodos de preparacion de tejidos para implantacion.

Info

Publication number: ES2219660T3
Application number: ES95911929T
Authority: ES
Inventors: Steven Goldstein
Original assignee: Cryolife Inc
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1995-02-27
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2015-02-27
Also published as: CA2185447A1; EP0871414B1; PT871414E; KR100365573B1; US5613982A; CA2185447C; EP0871414A1; WO1995024873A1; EP0871414A4; AU1931495A; DE69532976D1; US5632778A; EP1452153A1; DE69532976T2; DK0871414T3; US5899936A; ATE265191T1; US5843182A; JPH09510108A

Abstract

ESTA MEMORIA DESCRIPTIVA INCLUYE UN PROCEDIMIENTO PARA GENERAR UNA BIOPROTESIS HIBRIDA FUNCIONAL. SE TRATA TEJIDO FORMADO DE MANERA NATURAL A PARTIR DE COLAGENOS INTERSTICIALES PARA DESTRUIR LAS CELULAS NATIVAS, Y PARA ELIMINAR LAS MOLECULAS SOLUBLES POTENCIALMENTE ACTIVAS DESDE EL PUNTO DE VISTA INMUNOLOGICO. ENTONCES PUEDE TRATARSE SECUENCIALMENTE CON UN FACTOR DE ADHESION DE MATRIZ EXTRACELULAR, EL GLUCOSAMINOGLUCANO DE MATRIZ EXTRACELULAR, Y UN FACTOR DE CRECIMIENTO APROPIADO AL TIPO CELULAR QUE RESULTA NECESARIO QUE FUNCIONE DENTRO DE LA MATRIZ, E INCUBARSE LA MATRIZ DEL TEJIDO DE TRANSPLANTE CON CELULAS QUE SON ALOGENICAS O AUTOLOGAS PARA EL RECEPTOR, IMPARTIENDO CON ELLO A LA MATRIZ LAS CARACTERISTICAS DEL TIPO CELULAR Y DEL TEJIDO SELECCIONADOS. POR TANTO PUEDEN FORMARSE IN VITRO TEJIDOS CON UNA DIVERSIDAD DE BIOACTIVIDADES FUNCIONALES, ANTES DEL IMPLANTE O EL TRANSPLANTE DE UN INJERTO, QUE MOSTRARAN UNA ESTIMULACION REDUCIDA O NO MOSTRARAN ESTIMULACION DE LAS RESPUESTAS INMUNOLOGICAS EN EL RECEPTOR.

Description

Métodos de preparación de tejidos para implantación.

Fundamentos

La implantación quirúrgica de una válvula cardíaca puede implicar la implantación de uno de tres tipos distintos de prótesis: mecánica (sintética), bioprótesis (válvula porcina o pericardio seroso bovino, fijado por enlaces químicos) o aloinjerto humano. Estas prótesis proporcionan una mejora hemodinámica eficaz para la implantación de válvulas aórticas naturales que bien son deformidades congénitas o se han dañado por cambios o enfermedad, degenerativos, dando como resultado bien insuficiencia aórtica o estenosis valvular aórtica. De los aproximadamente 55.000 implantes de válvula aórtica anuales en los EE.UU., 75% son válvulas mecánicas. El resto de las implantaciones son de tejidos trasplantados. De éstos, más del 80% son bioprótesis porcinas, el número relativamente pequeño de aloinjertos (2.500 al año) se debe principalmente a su limitada disponibilidad.

Los criterios para una prótesis ideal incluirían: hemodinámica natural, durabilidad a largo plazo, baja frecuencia de complicaciones tromboembólicas, libre de calcificación, ausencia demostrada de capacidad inmunógena y sin respuestas hiperplásicas inapropiadas siguiendo a la implantación. Incluso en situaciones de autotrasplante, la manipulación quirúrgica del tejido, tales como injertos de vena, puede ser por sí misma un estímulo para la hiperplasia del tejido y posterior fracaso del injerto.

De acuerdo con esta invención, se pueden preparar válvulas cardíacas, pulmonares y aórticas, con propiedades ventajosas con respecto a desgaste, tendencia a calcificarse, estimulación de respuestas inmunitarias y dificultad reducida en la adquisición. También es aplicable a otras formas de tejidos, en particular los que constan de colágenos intersticiales estructurales.

Se han desarrollado diversos injertos sintéticos y órganos mecánicos y están en uso en la actualidad. Sin embargo, se sabe que estas implantaciones sintéticas están sujetas a complicaciones embólicas o disminuciones de la resistencia del material durante periodos prolongados de implantación. Aunque se han mejorado las modificaciones estructurales en prótesis mecánicas tales como válvulas cardíacas, con respecto a sus características de desgaste, permanecen sujetas a disfunción valvular, que puede tener lugar de pronto y sin aviso, dando como resultado situaciones de emergencia que requieren intervención quirúrgica e implantación del dispositivo protésico artificial. Debido a las propiedades superficiales de las prótesis sintéticas/mecánicas usadas en el sistema vascular, la adherencia plaquetaria aumenta la probabilidad de formación de trombo y se tiene que proporcionar terapia anticoagulante para la vida del implante y se hacen no deseables tales implantes para ciertos grupos de receptores potenciales (por ejemplo, mujeres en años de cría).

Se prepara una alternativa, válvulas cardíacas bioprotésicas, a partir de tejidos valvulares de origen porcino o bovino. Debido a que éstas son especies inmunológicamente discordantes del hombre, se rechazan rápidamente por el receptor del implante a pesar del uso de tratamiento farmacológico de inmunodepresión que de otro modo mantendría un aloinjerto. Significativamente, estos tejidos están sujetos a rechazo hiperagudo por el receptor debido a la presencia en el receptor de anticuerpos naturales formados previamente, que reconocen antígenos en la superficie de células extrañas, en particular las del recubrimiento endotelial de las válvulas cardíacas y los vasos sanguíneos. Aunque los tejidos valvulares bovinos o porcinos son apropiados estructuralmente y biomecánicamente para uso en seres humanos, el potencial de tal tejido extraño para estimular el rechazo inmunitario en el receptor ha dictado en el pasado tratamientos con agentes de reticulación química tales como glutaraldehído. Tal tratamiento del tejido reduce la estimulación de una respuesta inmunológica por el receptor al tejido extraño y también estabiliza la proteína de colágeno del tejido valvular no viable, resultante, haciéndolo más resistente a la degradación por peptidasas. Sin embargo, debido a que estos injertos de tejido no son viables, no hay mecanismo biosintético para reparar las proteínas estructurales descompuestas durante la operación del tejido en el receptor. Tales injertos de tejido tienden a calcificarse con el tiempo, aumentando el riesgo de daño estructural y del consiguiente fracaso. Aunque tiene lugar con menos frecuencia en relación con injertos mecánicos, la tromboembolia también es una cuestión de tratamiento del paciente para los receptores de estos injertos.

Similarmente, se han trasplantado alogénicamente órganos tales como riñones de un hermano a otro, en un esfuerzo por minimizar reacciones que intervienen de manera inmunológica en el receptor del trasplante, que daría como resultado un rechazo del órgano. A estos pacientes, así como a los pacientes que reciben órganos para trasplante de donadores distintos de un hermano, con frecuencia se les administra fármacos para suprimir su sistema inmunitario. Aunque se puede suprimir la respuesta inmunológica a tejido u órganos trasplantados por el uso de fármacos inmunodepresores para minimizar el rechazo, la terapia inmunodepresora es general por naturaleza. Por lo tanto, los fármacos inmunodepresores también tienden a suprimir la respuesta inmunitaria en general, que reduce la capacidad del receptor del trasplante para combatir la infección.

Se han descrito procedimientos más recientemente para generar bioprótesis mejorada para implante en el ser humano o en mamífero, por tratamiento de tejido no humano. Véase, Orton, E. Christopher, patente de EE.UU. 5.192.312. Orton describe la generación de tejido para implante por eliminación de células naturales del tejido de, por ejemplo, origen porcino; y después, repoblar el tejido con células nuevas en presencia de factor de crecimiento. Las células de repoblación son inmunológicamente compatibles con el receptor del implante deseado. Los bioinjertos producidos por este procedimiento no presentan muchas de las desventajas de otras bioprótesis de la técnica anterior.

Sumario de esta invención

Esta invención proporciona procedimientos nuevos y ventajosos para generar tejido para implante, adecuado para implante en seres humanos o en otros mamíferos. El procedimiento de esta invención se refiere, en general, a tratamiento de tejido xenogénico o alogénico para generar una bioprótesis viable que no produzca una respuesta inmunitaria adversa por el receptor en el implante y posea las capacidades regeneradoras de los aloinjertos, al tiempo que exhiba sólo propensión limitada a calcificarse y poca estimulación de tromboembolia.

De acuerdo con lo anterior, el procedimiento de esta invención incluye las etapas de: preparar una matriz de tejido xenogénico (o alogénico) para tratamiento adicional por eliminación de células naturales y otros antígenos y partículas celulares de la matriz de tejido, descelularizada, y tratar la matriz para inhibir la generación de nuevos sitios inmunológicos. Esta matriz de tejido se trata después con los factores de adherencia celular descritos a continuación, para exaltar la unión de células a la matriz durante el procedimiento de repoblación de la matriz de tejido con tales células nuevas.

Dependiendo de las células usadas para repoblar las matrices de tejido natural, se pueden obtener diferentes propiedades de las bioprótesis de especies híbridas, tales como la capacidad para sintetizar proteínas de otro modo atípicas para el tejido natural en el sitio de implantación o únicas para ciertos grupos de edad. Estos injertos híbridos combinarían las ventajas estructurales de injertos bioprotésicos con las capacidades funcionales y regeneradoras de los aloinjertos así como indicarían una respuesta atenuada o no inmunitaria, propensión limitada a calcificarse y poca estimulación de tromboembolia. Como con todos los injertos bioprotésicos en uso en la actualidad, estos tejidos modificados no se suministrarían limitados y permitirían la funcionalidad del injerto a más receptores. Además, estos injertos no se alterarían necesariamente por enlaces químicos para hacerlos estables al sistema inmunitario del receptor; por lo tanto, tales materiales indicarían propiedades biomecánicas más parecidas a las del tejido que se está usando para sustituir.

La invención descrita en la presente memoria es útil para generar xenoinjertos bioprotésicos adecuados para implantación en seres humanos. Es particularmente muy adecuada para generar xenoinjertos en que el componente estructural principal es matriz de tejido conjuntivo, tales como válvulas cardíacas, en particular válvulas cardíacas de origen porcino o bovino. Ejemplos de otros tejidos adecuados para uso en esta invención pueden ser, pero no se limitan a, válvulas cardíacas aórticas, válvulas cardíacas pulmonares, fascia lata, duramadre, pericardio seroso, menisco, piel, ligamento, tendón y otras estructuras de tejido conjuntivo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Fotomicrografía de una hoja de válvula aórtica fresca.

Figura 2a. Fotomicrografía que muestra conducto de válvula pulmonar después de descelularización.

Figura 2b. Fotomicrografía que muestra miocardio después de descelularización.

Figura 3a. Fotomicrografía de hoja de válvula aórtica descelularizada.

Figura 3b. Fotomicrografía de hoja de válvula aórtica repoblada.

Figura 4. Síntesis de Proteína de Colágeno y No Colágeno en Hojas de Válvula Cardíaca Aórtica Porcina.

Figura 5. Reactividad de Antisueros de Conejo Producida en Extractos de Hojas de Válvula Cardíaca, Porcina, Crioconservada o Despoblada - Captura de Anticuerpos.

Figura 6a. Fotomicrografía que muestra la respuesta celular mínima provocada por descelularización de hojas de válvulas cardíacas porcinas después de implantación.

Figura 6b. Fotomicrografía que muestra respuesta celular provocada por hoja de válvula aórtica, porcina, crioconservada, después de implantación.

Figura 7a. Fotomicrografía de hoja de válvula aórtica, porcina, fresca, en que se ensaya antígeno asociado con célula de cerdo.

Figura 7b. Fotomicrografía de hoja de válvula aórtica, porcina, descelularizada, en que se ensaya antígeno asociado con célula de cerdo.

Figura 8. Relaciones Tensión-Deformación de Hojas de Válvula Aórtica, Porcina.

Figura 9. Curvas de Relajación de Tensión de Hojas Aórticas, Porcinas, Después de Preacondicionamiento.

Figura 10. Datos de Falta de Tracción para Hojas de Válvulas Aórticas, Porcinas.

Descripción detallada de la invención

Dependiendo del tipo de trasplante deseado, si el receptor es un ser humano, el tejido u órgano para trasplante inicial puede ser de origen no humano. Estos tejidos u órganos se pueden obtener en mataderos homologados de animales proveídos para consumo humano o de manadas de animales domesticados mantenidos por el propósito de proporcionar estos tejidos u órganos. Los tejidos u órganos se manipulan de una manera estéril y cualquier disección adicional del tejido u órganos se lleva a cabo en condiciones asépticas.

El tejido para trasplante que se origina a partir de fuentes no humanas y deseado para uso en un receptor humano, se puede tratar para generar un xenoinjerto híbrido o tejido para implante xenogénico, que se forma a partir de una matriz de tejido no humano, sin células naturales y otros componentes antigénicos y que está poblada con células humanas viables. Las etapas del procedimiento para generar tales implantes inmunológicamente tolerables, se describen a continuación.

Después de la recogida y disección, se puede esterilizar el tejido para trasplante por su incubación en una solución nutritiva, amortiguada, estéril, que contenga agentes antimicrobianos, por ejemplo un agente antibacteriano, un agente antifúngico o un agente de esterilización compatible con el tejido para trasplante.

El tejido para trasplante, esterilizado, se puede crioconservar después para tratamiento adicional un tiempo más tarde o se puede tratar adicionalmente, inmediatamente, de acuerdo con las siguientes etapas de este procedimiento, que incluyen una crioconservación posterior de la matriz de tejido u otros productos de tejido del procedimiento.

Descelularización

Una etapa preliminar de esta invención requiere la eliminación de células viables naturales, así como otras estructuras o componentes celulares y acelulares que pueden provocar una respuesta inmunitaria adversa por el receptor del implante.

Se conocen diversos medios de reducción de la viabilidad de células naturales en tejidos y órganos, incluyendo métodos físicos, químicos y bioquímicos. Véase, p.e., la patente de EE.UU. Nº 5.192.312. Tales métodos se pueden emplear de acuerdo con el procedimiento descrito en la presente memoria. Sin embargo, la técnica de descelularización empleada no debería dar como resultado rotura molecular intolerable de la anatomía del tejido para trasplante o alterar sustancialmente las propiedades biomecánicas de sus elementos estructurales. El tratamiento del tejido para producir una matriz de tejido descelularizada tampoco debería dejar un entorno citotóxico que mitigue la repoblación posterior de la matriz con células alogénicas o autógenas con respecto al receptor. Las células y tejidos que son alogénicos para el receptor son los que se originan con o proceden de, un donador de la misma especie que el receptor. Las células o tejidos autógenos son los que se originan con o proceden del receptor.

Se pueden usar fuerzas físicas, por ejemplo, la formación de hielo intracelular, para descelularizar tejidos para trasplante. Por ejemplo, la congelación en fase vapor (velocidad lenta de descenso de temperatura) de válvulas cardíacas intactas puede reducir la celularidad de las hojas de válvulas cardíacas cuando se compara con la congelación en fase líquida (rápida). Sin embargo, los procedimientos de congelación lenta, en ausencia de sustancia crioprotectora, puede dar como resultado la ruptura del tejido, tal como el agrietamiento de conductos de la válvula cardíaca. Se pueden añadir materiales formadores de coloides durante los ciclos de congelación-descongelación para alterar los patrones de formación de hielo en el tejido. Se puede añadir polivinilpirrolidona (10% p/v) e hidroxietilalmidón dializado (10% p/v), a soluciones de crioconservación clásicas (DMEM, DMSO al 10%, suero bovino fetal al 10%) para reducir la formación de hielo extracelular al tiempo que se permite la formación de hielo intracelular. Esto permite una medición de la descelularización al tiempo que se permite alguna protección a la matriz de tejido de colagenasa frente al daño por hielo. Adicionalmente, se observa que los tejidos, en particular los conductos de válvulas cardíacas, se agrietarán si se congelan rápidamente con independencia de la presencia de sustancia crioprotectora.

Alternativamente, se pueden usar diversos tratamientos enzimáticos u otros químicos para eliminar células naturales viables de tejidos u órganos para implante. Por ejemplo, la exposición prolongada de células a proteasas tales como tripsina, da como resultado muerte celular. Sin embargo, debido a que al menos una porción de la molécula de colágeno de tipo I, es sensible a una variedad de proteasas, incluyendo tripsina, esto no puede ser el criterio de elección para injertos de colágeno deseados para implante en posiciones de alta tensión mecánica.

Las combinaciones de diferentes clases de detergentes, por ejemplo, un detergente no iónico, Tritón X-100, y un detergente aniónico, dodecilsulfato de sodio, pueden romper las membranas celulares y ayudar en la eliminación de partículas celulares del tejido. Sin embargo, se deberían tomar etapas para eliminar cualquier nivel de detergente residual en la matriz de tejido, de manera que se evite interferencia con la posterior repoblación de la matriz de tejido con células viables.

La descelularización del tejido para trasplante se lleva a cabo preferiblemente por la administración de una solución eficaz para producir la lisis de células naturales en el tejido para trasplante. Preferiblemente, la solución puede ser una solución hipotónica o de fuerza iónica baja, acuosa, formulada para producir eficazmente la lisis de las células de tejido natural. Tal solución hipotónica, acuosa, puede ser agua desionizada o un amortiguador hipotónico, acuoso. Preferiblemente, el amortiguador hipotónico, acuoso, puede contener aditivos que proporcionen condiciones subóptimas para la actividad de proteasas seleccionadas, por ejemplo colagenasa, que se puede liberar como resultado de lisis celular. Aditivos tales como quelantes de iones metálicos, por ejemplo, 1,10-fenantrolina y ácido etilendiaminotetracético (AEDT), crean un entorno desfavorable para muchas peptidasas. Proporcionar condiciones subóptimas para proteasas tales como colagenasa, puede favorecer la protección de la matriz de tejido de la degradación durante la etapa de lisis. En particular, se pueden conseguir condiciones subóptimas para proteasas por la formulación de la solución para producir la lisis, hipotónica, para eliminar o limitar la cantidad de iones calcio y cinc disponibles en solución. Muchas proteasas son activas en presencia de iones calcio y cinc y pierden mucho de su actividad en entornos sin iones calcio y cinc.

Preferiblemente, la solución para producir la lisis, hipotónica, se preparará seleccionando condiciones de: pH, disponibilidad reducida de iones calcio y cinc, presencia de quelantes de iones metálicos y el uso de inhibidores proteolíticos específicos para colagenasa, tal como \beta_{1}-anticolagenasa, de manera que la solución producirá la lisis, de manera óptima, de las células naturales al tiempo que protegerá la matriz de tejido subyacente de degradación proteolítica adversa. Por ejemplo, una solución para producir la lisis, hipotónica, puede incluir una solución amortiguada de agua, pH 5,5 a 8, preferiblemente pH 7 a 8, sin iones calcio y cinc e incluyendo un agente quelante de iones metálicos tal como AEDT. Adicionalmente, también se puede emplear control de los parámetros temperatura y tiempo durante el tratamiento de la matriz de tejido con la solución para producir la lisis, hipotónica, para limitar la actividad de las proteasas.

Se prefiere que el tratamiento de descelularización de la matriz de tejido también limite la generación de nuevos sitios inmunológicos. Aunque el colágeno no es típicamente sustancialmente inmunógeno, la degradación enzimática parcial de colágeno puede conducir a capacidad inmunógena fortalecida. De acuerdo con esto, una etapa preferible de este procedimiento incluye el tratamiento del tejido con enzimas, tales como nucleasas, eficaces para inhibir el metabolismo celular, la producción de proteínas y la división celular sin degradación de la matriz de colágeno subyacente. Las nucleasas que se pueden usar para digestión de ADN y ARN celular, natural, incluyen tanto exonucleasas como endonucleasas. Una amplia variedad de las cuales son adecuadas para uso en esta etapa del procedimiento y están comercialmente disponibles. Por ejemplo, las exonucleasas que inhiben eficazmente la actividad celular incluyen ADNasa I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO.) y ARNasa A (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO) y las endonucleasas que inhiben eficazmente la actividad celular incluyen EcoR I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO) y Hind III (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO).

Es preferible que se apliquen las nucleasas seleccionadas en una solución amortiguadora fisiológica que contenga iones que sean óptimos para la actividad de la nucleasa, tales iones incluyen sales de magnesio y de calcio. También se prefiere que se seleccionen: la concentración iónica de la solución amortiguada, la temperatura de tratamiento y la extensión del tratamiento, para asegurar el nivel deseado de actividad eficaz de la nucleasa. El amortiguador es preferiblemente hipotónico para fomentar el acceso de las nucleasas a los interiores de las células. Para tratamiento de células endoteliales endógenas de tejido valvular cardíaco, no humano, en particular válvulas de origen porcino o bovino, el tejido se trata preferiblemente con un medio amortiguado fisiológicamente constituido por nucleasas ADNasa I y ARNasa A. Preferiblemente, la solución de degradación de nucleasa contiene aproximadamente 0,1 \mug/ml a 50 \mug/ml, preferiblemente 10 \mug/ml de la nucleasa ADNasa I y 0,1 \mug/ml a 10 \mug/ml, preferiblemente 1,0 \mug/ml de ARNasa A. El tejido se puede descelularizar por aplicación de lo anterior, a una temperatura de aproximadamente 20ºC a 38ºC, preferiblemente a aproximadamente 37ºC, durante aproximadamente 30 minutos a 6 horas, mientras que al mismo tiempo se limita la generación de nuevos sitios inmunológicos como resultado de la degradación de colágeno.

Pueden ser adecuadas otras digestiones enzimáticas para uso en la presente memoria, por ejemplo, se pueden usar enzimas que romperán la función de las células naturales en un tejido para trasplante. Por ejemplo, se puede usar fosfolipasa, en particular fosfolipasas A o C, en una solución amortiguada, para inhibir la función celular por ruptura de membranas celulares de células endógenas. Preferiblemente, la enzima empleada no debería tener un efecto perjudicial sobre la proteína de la matriz del tejido. También se pueden seleccionar las enzimas adecuadas para uso con respecto a la inhibición de la integridad celular y también incluyen enzimas que pueden interferir con la producción de proteína celular. También se ajustará el pH del vehículo, así como la composición del vehículo, con respecto al perfil de actividad del pH de la enzima elegida para uso. Por otra parte, se debería ajustar la temperatura aplicada durante la aplicación de la enzima al tejido, para optimizar la actividad enzimática.

Con posterioridad al tratamiento de descelularización elegido, se lava la matriz de tejido para trasplante, resultante, para asegurar la eliminación de las partículas celulares que pueden incluir: proteína celular, lípidos celulares y ácido nucleico celular así como cualquier partícula extracelular tales como proteínas solubles extracelulares, lípidos y proteoglucanos. La eliminación de estas partículas celulares y extracelulares reduce la probabilidad de que la matriz de tejido para trasplante provoque una respuesta inmunitaria adversa del receptor en el implante. Por ejemplo, se puede incubar el tejido en una solución de sal equilibrada tal como Solución de Sal Equilibrada de Hanks (SSEH). Se puede seleccionar la composición del lavado con solución de sal equilibrada y las condiciones bajo las que se aplica a la matriz de tejido para trasplante, para disminuir o eliminar la actividad de la nucleasa u otra enzima utilizada durante el procedimiento de descelularización. Tal solución de lavado de sal equilibrada no contendría preferiblemente sales de magnesio o de calcio y el procedimiento de lavado puede incluir incubación a una temperatura de, entre aproximadamente 2ºC y 42ºC, lo más preferible con 4ºC. Se puede incubar la matriz de tejido para trasplante en la solución de lavado de sal equilibrada durante, hasta 10 a 12 días, con cambios en la solución de lavado cada segundo o tercer día. Opcionalmente, se puede incluir un agente antibacteriano, un agente antifúngico o un agente de esterilización o una combinación de los mismos, en la solución de lavado de sal equilibrada para proteger la matriz de tejido para trasplante de contaminación con patógenos del entorno.

La matriz de tejido preparada de acuerdo con lo anterior, está sin sus células naturales y adicionalmente se han lavado componentes de antígenos celulares y extracelulares de la matriz de tejido. Preferiblemente, la matriz de tejido se ha tratado de una manera que limita la generación de los nuevos sitios inmunológicos en la matriz de colágeno. La matriz de tejido, sin embargo, conserva la resistencia biomecánica esencial necesaria para proporcionar la estructura para tratamiento adicional de la matriz.

La matriz de tejido tratada de acuerdo con esta invención, se puede crioconservar para uso posterior. La crioconservación de tejido para trasplante descelularizado aseguraría un suministro o repertorio de matrices de tejido sustancialmente no inmunógenas que, en la descongelación, estarían listas para tratamiento adicional de acuerdo con las etapas posteriores de esta invención o tratamiento adicional como se desee, para proporcionar un tejido producto para implante. Por ejemplo, se pueden inventariar matrices de tejido hasta el tiempo en que estén identificadas las células particulares que se tienen que emplear durante la repoblación. Esto puede ser de utilidad particular cuando se tiene que repoblar la matriz de tejido con células procedentes del receptor u otras células seleccionadas para uso basadas en su compatibilidad inmunológica con un receptor específico.

También se prevé que se pueda crioconservar el tejido para trasplante natural previamente a la experimentación de cualquiera de los procedimientos de esta invención. Los tejidos que no se descelularizan conservan sus células naturales junto con la matriz de tejido conjuntivo. En la descongelación, estos tejidos se pueden tratar además. Beneficiosamente, la crioconservación de tejido para trasplante intacto también puede ayudar en la despoblación del tejido como resultado de muerte celular causada por la crioconservación.

Las técnicas de crioconservación de tejido se conocen bien en la técnica. Brockbank, K. G. M. Basic Principles of Viable Tissue Preservation. En: Transplantation Techniques and Use of Cryopreserved Allograft Cardiac Valves and Vasular Tissue. D. R. Clarke (ed.) Adams Publishing Group, Ltd., Boston, págs. 9-23, se discute la crioconservación de tejidos y órganos.

La matriz de tejido, se haya crioconservado o no, se puede tratar a continuación para exaltar la adherencia y la migración hacia el interior de las células alogénicas o autógenas, in vitro, que se usarán para repoblar el tejido para trasplante.

Adherencia celular

Aunque no se desee estar limitados por la teoría, se cree que hay diversos factores que efectúan la unión de células al tejido. Por ejemplo, la adherencia de fibroblastos a superficies del tejido implica interacciones entre los componentes de la membrana celular y la matriz extracelular de tejido natural tal como colágeno fibrilar y formador de láminas, proteoglucanos y glucoproteínas. In vitro, los fibroblastos dérmicos cultivados sin suero se unen rápidamente e igualmente a colágeno de los tipos I y IV. La extensión de la unión se aumenta por la adición de suero (humano o bovino fetal, unión máxima con suero al 1%) y por fibronectina purificada al medio de cultivo. Cada una de las dos subunidades homólogas de fibronectina tiene dos regiones de reconocimiento celular, la más importante de las cuales tiene la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD). Un segundo sitio, que une glucosaminoglucanos, actúa sinérgicamente y parece que estabiliza las interacciones fibronectina-célula en que interviene la secuencia RGD. El sulfato de heparina junto con sulfato de condroitina son los dos glucosaiminoglucanos identificados sobre superficies celulares. El sulfato de heparina está unido a proteínas del núcleo (sindecán o hialuronectina) que pueden ser de expansión bien integral o de membrana. Los sitios de unión celular para glucoproteínas de matriz extracelular se denominan integrinas y éstas intervienen en la unión estrecha de las células a los factores de adherencia. Cada factor de adherencia parece que tiene una integrina especializada aunque se puede unir una única integrina a diversos factores de matriz extracelular. Los fibroblastos, cuando se adhieren a fibronectina intacta (dominios de unión de célula y heparina) indican una morfología contraída con adherencias focales. Sin el dominio de unión de heparina, los fibroblastos se esparcirán pero fracasarán en el desarrollo de adherencias focales.

Por lo tanto, una combinación de factores puede determinar la velocidad a la que las células se pueden unir a una superficie de tejido. Muchos de éstos son productos de tipo fibroblasto, aunque algunos como fibronectina pueden proceder de enriquecimiento de suero también. La velocidad a la que se expresan estos factores y se segregan por las células afectará a la unión de las células a superficies y citocinas tales como factor de crecimiento de fibroblastos y

\hbox{factor- \beta }

de crecimiento transformante son reguladores positivos de la producción de colágeno de fibroblastos y fibronectina.

Se cree que se fomenta la unión eficaz de células a la matriz de tejido, por la interacción entre la membrana celular y los componentes extracelulares asociados con el correspondiente tejido para implante. De acuerdo con esto, para un tipo de célula dado y tipo de tejido elegido para uso, los tratamientos apropiados que fomentan la unión celular a la matriz de tejido, descelularizada, incluyen el tratamiento con componentes de tejido extracelular y, en particular, proteínas extracelulares tales como glucoproteínas y/o proteoglucanos o glucosaminoglucanos que sean eficaces para fomentar la unión de las células a la matriz de tejido descelularizada. La técnica para repoblar la matriz de tejido con células se lleva a cabo tratando primero la matriz de tejido, descelularizada, con factor de unión celular eficaz para fomentar la unión de las células de repoblación a la matriz descelularizada.

Por ejemplo, se puede incubar la matriz de tejido, descelularizada, en solución nutritiva que contenga proteína de matriz extracelular, tal como fibronectina y un glucosaminoglucano, durante un periodo eficaz para la unión de la fibronectina a superficies de la matriz de tejido para trasplante que se tiene que repoblar. Los amortiguadores preferidos para uso con fibronectina/glucosaminoglucano incluyen fosfato de sodio/glicerina/albúmina de suero bovino (Suero Bovino Fetal, BIO-WHITTAKER) y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés), (GIBCO). Estos amortiguadores se usan típicamente para proporcionar un pH fisiológicamente aceptable de aproximadamente 7,0 a 7,6. La presencia de las proteínas de matriz extracelulares establece una superficie en la matriz del tejido a la que se unen las células que se han elegido para repoblar la matriz. El estímulo de la proteína de la matriz extracelular fomenta la repoblación celular en el injerto.

La proteína de matriz extracelular, preferida para uso en la presente memoria, es la forma molecular intacta de fibronectina (Fibronectina de Plasma Humano, UPSTATE Biotechnology, Inc.). Esta glucoproteína heterofuncional tiene afinidad por proteínas de matriz extracelulares, proteoglucanos y ciertos tipos de células. La solución de tratamiento de fibronectina también contiene preferiblemente un proteoglucano que puede ser que puede ser uno de los glucosaminoglucanos: heparina, sulfato de heparina, condroitina, sulfato de condroitina, dermatina o sulfato de dermatina. Se cree que el glucosaminoglucano fomenta y estabiliza la unión entre fibronectina y la matriz de tejido asociada a colágeno. La matriz es capaz ventajosamente de interacción con fibronectina debido a que no está reticulada por enlaces químicos.

Una fuente de fibronectina es a partir de sangre humana, tratada para limitar la contaminación con virus. El glucosaminoglucano preferido es heparina. La concentración de glucoproteina usada como el factor de adherencia para tratar la matriz de tejido puede oscilar de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 \mug/ml, siendo preferida con una concentración de fibronectina de 10 \mug/ml. La relación en peso preferida de fibronectina a heparina es aproximadamente 10 partes de fibronectina a aproximadamente 1 parte de glucosaminoglucano, p.e. heparina. Esto es óptimo para la repoblación de hojas de válvulas cardíacas porcinas, pero puede oscilar de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 10:0,1 dependiendo del tejido usado.

Preferiblemente los componentes de la solución nutritiva que contiene los factores de adherencia se seleccionan de manera que la solución sea compatible con factores de crecimiento que se añaden posteriormente al medio nutritivo en que se está incubando la matriz de tejido para trasplante. Estos factores de crecimiento se emplean para facilitar el crecimiento celular y la repoblación de la matriz de tejido.

Repoblación celular

Un aspecto importante de esta invención es que se repobla la matriz de tejido para trasplante, descelularizada, con células in vitro. Las células empleadas para repoblar la matriz descelularizada pueden ser células alogénicas, cultivadas a partir de la misma especie que el receptor del implante deseado o pueden ser células autógenas, cultivadas a partir del receptor del implante. En cualquier caso, las células autógenas o alogénicas en la matriz de tejido repoblada, conocidas como xenoinjerto o injerto quimérico provocarán menos de una respuesta inmunitaria adversa que un tejido para trasplante xenogénico no tratado.

También se prevé que las células empleadas para repoblar la matriz descelularizada puedan ser células que se hayan manipulado genéticamente para exaltar la producción de proteínas específicas. Se conocen numerosas tecnologías de ADN recombinante, en la técnica, para alterar, exaltar y modificar el metabolismo celular.

La repoblación se puede llevar a cabo por incubación de la matriz de tejido, tratada con factores de adherencia celular, en un medio nutritivo que contenga las células y factores de crecimiento activos para fomentar la proliferación celular y, por lo tanto, la repoblación de la matriz de tejido. Un tipo de célula preferido para uso en la presente memoria son células de tipo fibroblasto.

Se puede emplear una variedad de sustancias para exaltar la quimiotaxia celular, aumentando la velocidad de movimiento direccional a lo largo de un gradiente de concentración de la sustancia en solución. Con respecto a células de tipo fibroblasto, factor de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor-\beta de crecimiento transformante y las moléculas de adherencia al substrato, colágenos fibrilares, fragmentos de colágeno y fibronectina, son quimiotácticos para fibroblastos. A diferencia de la adherencia celular, la migración de fibroblastos requiere síntesis de novo de proteínas; se estimula la síntesis de proteínas en células fibroblásticas normales por la adherencia de células a fibronectina, de manera que se cree que están interrelacionados los procedimientos de adherencia celular y migración celular durante la repoblación.

La migración celular también permite que las células se muevan por la matriz de tejido que está repoblando los espacios intersticiales interiores así como las superficies de la matriz para trasplante de tejido.

El número de células requerido para repoblar totalmente matrices de tejido para trasplante, particulares, depende del volumen de tejido usado y de los tipos de células proporcionadas. Sin embargo, las concentraciones de 20.000 a 125.000 fibroblastos por mililitro pueden proporcionar revestimiento adecuado de la hoja de válvula cardíaca y del tejido del conducto aórtico.

Proliferación celular

Las etapas de repoblación celular de la matriz de tejido se conducen preferiblemente en presencia de factores de crecimiento eficaces para fomentar la proliferación de las células cultivadas empleadas para repoblar la matriz. Por ejemplo, cuando se emplean células de tipo fibroblasto, un factor de crecimiento para uso en la presente memoria puede ser factor de crecimiento de fibroblastos (FCF), lo más preferiblemente factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFCF) (bFCF Recombinante Humano, UPSTATE Biotechnology, Inc.).

Los factores de crecimiento de fibroblastos (unión de heparina) son una familia de mitógenos activos en células mesenquimatosas. No se detectan FCFs libres en medio condicionado, en su lugar los FCFs se encuentran en la matriz extracelular conjuntamente con sulfato de heparina, localizándose en la capa fibronectina-heparina unida previamente a la matriz de tejido para trasplante. Los glucosaminoglucanos estabilizan la actividad de los FCF y se requieren para la unión de FCF a receptores de la superficie celular en que estimulan el crecimiento autocrino/paracrino.

La matriz y las células se exponen preferiblemente a bFCF de manera continua, durante la etapa de repoblación, para proporcionar estimulación de la replicación celular y la expresión de síntesis de proteína de colágeno, según se requiere para la función de la válvula normal. Los tiempos de cultivo de la matriz con factor de crecimiento oscilan de 10 a 21 días. La concentración de factor de crecimiento usada para tratar la matriz de tejido puede oscilar de 100 ng/ml a 10 \mug/ml, siendo preferido con una concentración de factor de crecimiento para bFCF de 2,5 \mug/ml.

Cuando se usan fibroblastos como células de repoblación del injerto, el medio de cultivo puede incluir Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (GIBCO) con 5-15% añadido de suero. Se prefiere suero de receptor autógeno pero la experiencia con implantación de válvulas cardíacas de aloinjertos sugiere que se puede utilizar suero bovino en el medio de crecimiento sin consecuencias inmunológicas adversas para el receptor del implante. La estimulación continua de las células con suero y medio condicionados por la repoblación de células, puede provocar una repoblación celular más rápida de la matriz de tejido. La matriz, las células y los factores de crecimiento se pueden incubar en una atmósfera humidificada, a 37ºC, provista de una mezcla de aire al 95% y CO_{2} al 5% durante todo el periodo de cultivo.

La matriz de tejido para trasplante se cultiva durante un tiempo suficiente para producir un injerto repoblado con histología intersticial similar a la del tejido fresco. En la conclusión del procedimiento de repoblación celular, el tejido también indicará preferiblemente parámetros metabólicos similares a los del tejido fresco.

Viabilidad celular

Un aspecto importante de esta invención es que los tejidos para trasplante repoblados están funcionando y son viables previamente a la implantación además de ser inmunológicamente aceptables para el receptor del implante o sustancialmente no inmunógenos. Existen diversos ensayos para medir la actividad celular y la aplicación de estos ensayos a los tejidos para implante de este procedimiento proporciona un método para controlar y cuantificar la viabilidad de las células que repoblan el tejido para implante.

Es preferible que se seleccione un ensayo que mida una actividad celular que soporte una relación con la función deseada del tejido para trasplante. Por ejemplo, la producción de colágeno es importante para mantener una válvula cardíaca en funcionamiento. En hojas de válvula cardiaca, 5 a 15% de la proteína total producida es colágeno. De eso, al menos 75% será colágeno de tipo I. Por lo tanto, en el ensayo de una válvula cardíaca repoblada, es preferible ensayar colágeno total producido por las células de repoblación como una medición precisa de viabilidad celular. El ensayo de la actividad celular por medición de la producción de colágeno se conoce bien en la técnica. Son ejemplos de referencias que discuten ensayos para la producción de colágeno celular: Buckley, A. et al., 1.980 Collagen Metabolism, Methods of Enzymology, 163:674-69 y Hayashi, T. y Nagal, Y. 1.979. Separation of the \alpha Chains of Type I and III Collagens by SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis, Journal of Biochemistry, 86:453-459.

Se prevén otros ensayos que pueden medir la viabilidad celular para uso en esta invención. La síntesis de proteína total cuando se mide por la incorporación de [^{3}H]prolina es uno de tales ensayos. Ensayos adicionales que pueden ser útiles en la medición de la viabilidad celular incluyen ensayos para la metabolización de glucosa y una variedad de ensayos dirigidos hacia la actividad mitocondrial.

Se prevé que se pueda usar cualquier ensayo que mida cuantificablemente una función celular indicativa de células viables.

Funciones diferenciadas

Las células de tipo fibroblasto son responsables de la producción de la mayoría de los componentes de tejido conjuntivo. Sintetizan diferentes tipos de colágeno y parece que el fenotipo está impuesto por entornos de tejido específicos; es decir, los fibroblastos cultivados sintetizan tipos de colágeno de acuerdo con su sitio de origen. Los fibroblastos también producen diversos glucosaminoglucanos y fibronectina y factores de crecimiento. Es la capacidad de los fibroblastos dérmicos para sintetizar colágenos de los tipos I, III y V en la proporción presente en la matriz de la hoja de válvula cardíaca, que las hace células apropiadas para repoblar la matriz de tejido para trasplante y formar el injerto híbrido descrito en la presente memoria.

Las células que se usan para repoblar el injerto particular se pueden variar dentro de límites amplios y se pueden usar diferentes tipos de células en diferentes circunstancias, dependiendo de la función del trasplante, la naturaleza del tejido que se está reemplazando o aumentando, la sensibilidad alérgica del receptor además de otros factores.

Una realización preferida de la invención usa células autógenas en el procedimiento descrito en la presente memoria. Se toma una muestra de tejido del receptor previamente al tratamiento quirúrgico de trasplante o implante. El tejido se trata, de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria a continuación, para producir fibroblastos u otras células que se usan después para repoblar la matriz de tejido, alogénica o xenogénica, de acuerdo con este procedimiento. Por la repoblación de la matriz de tejido para trasplante, descelularizada y tratada, preparada previamente, con células procedentes del tejido resecado tomado del receptor, se puede minimizar o evitar la probabilidad de una respuesta adversa del sistema inmunitario y rechazo del injerto por último.

La fuente celular se puede seleccionar para que sea compatible con el tejido que se tiene que trasplantar. Por ejemplo, si se tiene que trasplantar un vaso sanguíneo, se pueden tomar células de un vaso sanguíneo sano del receptor y usarlo como fuente de células para la repoblación del injerto. De esta manera, el injerto sano puede estar muy cerca de ser compatible con el tejido enfermo del receptor.

Este aspecto de la invención es particularmente útil cuando el receptor del trasplante es altamente alérgico o si el tejido es altamente inmunógeno, tal como con respecto a los vasos sanguíneos trasplantables.

Alternativamente, se pueden usar estirpes celulares alogénicas que no es probable que causen una respuesta inmunitaria inaceptable en el implante, para repoblar la matriz de tejido. Se pueden usar células con no más que una respuesta alérgica débil o tolerable, para repoblar la matriz de tejido para proporcionar un implante sustancialmente no inmunógeno. Estas células pueden ser por naturaleza débilmente inmunógenas o diseñarse en virtud de la tecnología celular recombinante para que sean débilmente inmunógenas.

Método para aislar fibroblastos

El tejido usado para proporcionar la unión de células de tipo fibroblasto, por ejemplo, piel (nalgas, muslo o dorso) u hojas de válvulas cardíacas, se recupera de manera estéril y se proporciona a un tratador en medio nutritivo amortiguado. El tejido se corta en trozos de 1 mm^{3} usando una técnica de disección estéril. Se ponen después grupos de 10 trozos en placas de cultivo de tejido, de 35 mm, con una cantidad limitada de medio de cultivo (DMEM además de suero bovino fetal al 10%) suficiente para humedecer el tejido pero que no floten los trozos. Se incuban durante una semana, a 37ºC, en una incubadora de cultivo humidificado, en una atmósfera de CO_{2} al 5%, en aire. Después de una semana de incubación, cada trozo de tejido está rodeado por una excrecencia densa de fibroblastos. También pueden estar presentes células epiteliales pero se pierden durante el cultivo celular posterior. Los fibroblastos se eliminan por digestión de tripsina, clásica, después de enjuagar las células con una solución de sal amortiguada, estéril, sin calcio y magnesio y se ponen en recipientes de cultivo celular más grandes con medio de cultivo fresco. Los cultivos celulares se pueden extender de esta manera. El contenido de un matraz se puede dividir y poner en tres recipientes más grandes y este procedimiento se puede repetir aproximadamente una vez a la semana. Las células recuperadas de estos matraces se usan como fuente de células de repoblación. Las células obtenidas de esta manera son preferibles a estirpes celulares comercialmente disponibles, debido a que la mayoría de las estirpes celulares se alteran fenotípicamente y ya no son sensibles de una manera normal a reguladores de crecimiento (tal como bFCF). Adicionalmente, la mayoría de las estirpes celulares comercialmente disponibles, no producen cantidades y proporciones naturales de proteínas producto, importantes (tal como colágeno).

Una realización preferida de la invención incluye un xenoinjerto tratado para eliminar células naturales y proteínas solubles, las condiciones se eligen para que no sean tóxicas para las células usadas para repoblar el xenoinjerto y se eligen para hacer la matriz de tejido de xenoinjerto, final, biomecánicamente adecuada e intacta. La matriz de tejido de xenoinjerto, despoblada, se trata después con factor de glucoproteína de matriz extracelular y glucosaminoglucano. El xenoinjerto se trata después con un factor de crecimiento y glucosaminoglucano y se incuba con células exógenas que se adhieren al injerto. Estas células exógenas migran en el injerto, proliferan dentro del injerto y expresan proteínas esenciales y otros factores críticos para la función del injerto. El xenoinjerto repoblado se hace biológicamente funcional por las células de repoblación e indica capacidad inmunógena reducida o mínima cuando se compara bien con xenoinjerto no tratado o con xenoinjerto fijado por enlaces químicos. La antigenicidad reducida es una consecuencia de la eliminación de xenoantígenos o aloantígenos durante la despoblación inicial del tejido y por la presencia de células de repoblación que no se reconocen como extrañas por el receptor. Estos injertos quiméricos también indicarían una tendencia reducida a la calcificación debido a que las partículas celulares, que se forman bien como resultado de muerte celular durante la obtención de tejido o durante la descelularización del tejido, se eliminan por el tratamiento de lavado. Debido a que estos injertos quiméricos conservan una capa de revestimiento de células como resultado del procedimiento descrito anteriormente, la tendencia a que se formen trombos y microémbolos también se debería reducir cuando se compara con estructuras mecánicas, estructuras hechas de moléculas biológicas purificadas y tejidos bioprotésicos fijados por enlaces químicos.

Ejemplos Ejemplo 1 Despoblación de hojas de válvulas aórticas porcinas, conducto aórtico y miocardio asociado de acuerdo con el procedimiento de lisis hipotónica/digestión de nucleasa

Se obtuvieron corazones de cerdo dentro de dos horas del sacrificio, para limitar los efectos de degradación celular no controlada en estructura de tejido y se devolvieron al centro de tratamiento, a 4ºC, en una solución estéril de DMEM. Se tomaron por excisión válvulas cardíacas aórticas, en condiciones estériles, se incubaron en mezcla de antibiótico, durante 16 h, a 37ºC, en medio nutritivo, en atmósfera de CO_{2} al 5% y se crioconservaron (velocidad de enfriamiento = -1ºC/min.) en DMEM que contenía DMSO al 10% y suero bovino fetal al 10%. Después de almacenamiento a -179ºC, las válvulas se descongelaron rápidamente a 37ºC. Se cortaron las hojas, el conducto aórtico y el miocardio a partir de la válvula y bien se pusieron porciones divididas de cada tipo de tejido directamente en formalina amortiguada al 10%, para análisis histológico posterior o se trataron para despoblación. Después de lavado en solución de dextrosa al 5%-Ringers de lactato, tres veces, durante 15 min. cada una, a temperatura ambiente, se incubaron los tejidos en agua de 18 M\Omega, durante 2 h, a temperatura ambiente, seguido por digestión en 10 \mug/ml de ADNasa I y 1 \mug/ml de ARNasa A en Tris-Cl 10 Mm, pH 7,6, que contenía sales de magnesio 3 mM y de calcio 1 mM, a 37ºC, durante 120 min.

Después de los tratamientos líticos, se incubaron los tejidos, durante 8 días, en DMEM-FBS al 5%. En este momento, los tejidos tratados se fijaron en formalina. Todos los tejidos fijados se montaron en parafina, se seccionaron y se mancharon con hematoxilina y eosina para visualizar las células. Una micrografía representativa en la Figura 1 muestra el modelo de celularidad de una hoja de válvula aórtica fresca con una capa endotelial sobre las superficies tanto fibrosa como ventricular y fibroblastos por todo el espesor completo del tejido. Las Figuras 2a y 2b muestran micrografías de conducto de válvula pulmonar y miocardio, respectivamente, después de la despoblación, con aspecto esencialmente acelular.

Ejemplo 2 Repoblación de hojas de válvulas aórticas porcinas, despobladas, con fibroblastos dérmicos bovinos

Se recuperaron hojas aórticas porcinas y se despoblaron según se define en el EJEMPLO 1. Las hojas se incubaron en 5 ml de aH_{2}PO_{4}/glicerina/amortiguador BSA (por sus siglas en inglés), a 37ºC. Se añadió fibronectina de plasma humano al amortiguador a una concentración de 10 \mug/ml junto con 1 \mug/ml de heparina, durante 16 h, seguido por la adición de bFCF recombinante humano a una concentración de 2,5 \mug/ml junto con 0,83 \mug/ml de heparina, durante 6 h adicionales. Después de esta incubación, se añadieron fibroblastos dérmicos bovinos, previamente aislados por técnicas de cultivo de explante clásicas, a las hojas de válvulas cardíacas, a 2x10^{4} células/ml. Las hojas y las células se incubaron durante 11 días. Siguiendo a la incubación, se pusieron secciones valvulares en formal para análisis histológico. La Figura 3a es una micrografía representativa de una hoja de válvula aórtica descelularizada. La Figura 3b es una micrografía representativa de una hoja aórtica descelularizada tratada con, tanto fibronectina como bFCF, que mostraba repoblación con fibroblastos exógenos.

Ejemplo 3 Actividad bioquímica de fibroblastos en tejidos repoblados cuando se compara con frescos y despoblados

Se despoblaron hojas de válvulas cardíacas, aórticas, porcinas, como en el Ejemplo 1 y se repoblaron con dos cepas clínicas diferentes de fibroblastos dérmicos de oveja, de acuerdo con la técnica en el Ejemplo 2. Después de 10 días de repoblación, las hojas se trasladaron a recipientes frescos y se incubaron, durante 48 h, en 1,0 \muCi/ml de [^{3}H]prolina en DMEM que contenía gentamicina y 50 \mug/ml de ácido ascórbico, 50 \mug/ml de \beta-aminopropionitrilo. Se determinaron proteínas totales sintetizadas por radioactividad precipitada de ácido tricloroacético al 10%, recuperada del medio y extractos de tejido hechos 10 mM en N-etilmaleimida, 25 mM en AEDT y 10 mM en fluoruro de fenilmetilsulfonilo para evitar la proteolisis; se analizó adicionalmente proteína precipitada por digestión con colagenasa Clostridial sin actividad de proteasa no específica para definir el contenido en colágeno. Como se muestra en la Figura 4, la actividad sintética de proteína de tejido despoblado fue cero. Siguiendo a la repoblación, se detectó síntesis de proteína significativa por incorporación de [^{3}H]prolina que se sintetizó a la misma velocidad que se determinó en tejido porcino fresco; el colágeno representaba 3,6% de la síntesis de proteína total y la mayoría de esto se segregó en el medio. Estos resultados indican que las hojas porcinas hechas tratadas por los procedimientos de despoblación descritos en la realización preferida de la invención, no indican capacidad sintética de proteínas en general ni síntesis de colágeno en particular. La aplicación con éxito de procedimientos de repoblación se indica por la capacidad para impartir la función celular de síntesis de proteínas a la hoja despoblada por el suministro de fibroblastos exógenos durante el procedimiento de repoblación.

Ejemplo 4 Demostración de respuesta inmunitaria humoral reducida para extractos de hoja porcina despoblada injectados en conejos

Se consiguió la eliminación de células y proteínas solubles por procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Se investigaron las consecuencias inmunológicas de la despoblación de hojas por comparación con hojas viables crioconservadas. Los resultados de estudios sobre la respuesta inmunitaria humoral se presentan en la Figura 5. La respuesta inmunitaria humoral se evaluó usando una técnica de captura de anticuerpos en que se usaron extractos de antígeno en NaCl 0,1 M de hojas crioconservadas no modificadas, para investigar sueros de conejos inmunizados con extractos de NaCl de, bien hojas despobladas de células modificadas u hojas de control. Las emulsiones de tales extractos se hicieron en adyuvante completo de Freund al 50% (v/v); se pusieron porciones de 0,1 ml de estas emulsiones en diez sitios intradérmicos a lo largo de los dorsos de conejos macho, blancos, de Nueva Zelanda, separados. Después de dos semanas, se volvió a exponer a los animales a extractos adicionales de hojas crioconservadas o despobladas, emulsionadas en adyuvante incompleto de Freund. Después de 1,5 meses, los animales se sangraron. Se prepararon sueros inmunitarios y se investigaron anticuerpos tanto IgG como IgM usando antisueros de IgG anticonejo de cabra e IgM anticonejo de cabra, conjugados a fosfatasa alcalina. En la Figura 5, el suero de receptores de tejido despoblado mostró -50% de respuesta de IgG y <5% de la respuesta de IgM observada en conejos inmunizados con extractos de hoja crioconservada. Estas observaciones indican atenuación de la respuesta inmunitaria humoral a tejido despoblado por las técnicas descritas en la realización preferida de la invención.

Ejemplo 5 Demostración de respuestas inmunitarias e inflamatorias, celulares, reducidas, para hojas porcinas despobladas implantadas en conejos

Se consiguió la eliminación de células y proteínas solubles por procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Se insertaron trozos divididos de hojas de válvulas aórticas, porcinas, despobladas (acelulares) y crioconservadas (celulares), en bolsas formadas en los subcúbitos dorsales de conejos macho, blancos, de Nueva Zelanda. Las bolsas se cerraron y después de dos semanas, se recuperaron quirúrgicamente los implantes y tejidos circundantes (piel a músculo) y se fijaron en formalina para análisis histopatológico después de manchar secciones embebidas en parafina con hematoxilina y eosina. La Figura 6 muestra que las hojas despobladas motivaron respuestas celulares mínimas en comparación con controles crioconservados. El tejido crioconservado que contenía tanto una capa celular endotelial así como fibroblastos estimuló respuesta celular inmunitaria e inflamatoria, significativa, con gran número de heterófilos y linfocitos y células del plasma en el área del implante así como dentro de los implantes mismos. En implantes de tejido despoblado, eran pocas células tanto inflamatorias como inmunitarias, en número y más limitadas en distribución.

Ejemplo 6 Demostración de eliminación de antígenos responsables de rechazo hiperagudo de tejidos porcinos en un receptor humano

La eliminación de células y proteínas solubles de hojas de válvulas cardíacas aórticas, porcinas y conducto aórtico, se consiguió por procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Trozos divididos de estos tejidos y sus contrapartidas de válvulas cardíacas aórticas, porcinas, frescas y crioconservadas, se congelaron frescas en nitrógeno líquido, en medio de montaje en criosección, se cortaron en secciones de 8-10 \mum, se montaron en portaobjetos de vidrio de carga modificada. Después de fijación en acetona, a 4ºC, se investigaron los tejidos con una lectina-I Bandeiraea simplicifolia conjugada con biotina que se une a proteínas modificadas de galactosa-\alpha-1,3-galactosa, específicas, encontradas en las membranas de células porcinas. Estas proteínas modificadas son los sitios de unión de anticuerpos anti-porcino, naturales, formados previamente, que inician respuestas de rechazo hiperagudo de tejidos porcinos en primates (incluyendo el hombre). Se detectaron proteínas que se unen a esta lectina haciendo reaccionar después las secciones con mezcla de peroxidasa de rábano conjugada a biotina-avidina, peróxido de hidrógeno y 3,3'-diaminobencidina. La presencia de antígenos porcinos se detectó por desarrollo de color. En la Figura 7a, el análisis microscópico de secciones mostró antígeno asociado a células en hoja aórtica crioconservada. La Figura 7b demuestra unión de antígeno fuertemente disminuida después de la descelularización de la hoja aórtica. Este estudio muestra que el procedimiento de despoblación como se presenta en la realización preferida de la invención, reduce los antígenos críticos que probablemente causan rechazo de un injerto porcino por un receptor humano.

Ejemplo 7 Propiedades biomecánicas de hojas de válvulas cardíacas aórticas, porcinas, despobladas- análisis de tensión-deformación

Se esterilizaron válvulas cardíacas, aórticas, porcinas, recién obtenidas, con mezcla antibiótica y se crioconservaron en condiciones que mantenían la viabilidad celular. Para la despoblación, se descongelaron válvulas aórticas rápidamente, a 37ºC, después se trataron con solución de hipotonicidad baja, nucleasas y solución de sal equilibrada, durante 10 días. Para ensayo biomecánico, se cortaron hojas en tiras circunferenciales o radiales, montadas sobre un Máquina para Ensayos de Materiales, Modelo 1.011 de Instron, bajo presión de cierre calibrada. El tejido se bañó en solución de sal equilibrada de Hanks, a 37ºC o 4ºC, durante el ensayo. Después de la determinación de la longitud entre puntos y 20 ciclos de preacondicionamiento (carga de 100 g para tiras circunferenciales y 180 g para tiras radiales), cada muestra se ensayó como sigue:

: 1) Una única carga frente a ensayo de elongación, cuyos resultados se muestran en la Figura 8. Las tiras radiales eran más ensanchables que las circunferenciales en todas las condiciones. El módulo del tejido no se vio afectado por ningún tratamiento, pero las tiras radiales despobladas eran significativamente más ensanchables que el tejido fresco (113 \pm 11,8 frente a 85,9 \pm 8,6 mm/mm);

: 2) Un ensayo de relajación de tensión, cuyos resultados se muestran en la Figura 9. Para tiras circunferenciales y radiales, se disipó aproximadamente 10% de la tensión original en los primeros 10 s. En conjunto, la velocidad de pérdida de tensión pareció mayor en tiras radiales en general y fue más rápida en tiras radiales crioconservadas. A la terminación del ensayo, la tensión restante en tiras circunferenciales, despobladas, a 37ºC, fue significativamente mayor que en tejido fresco; no había diferencias significativas en las tiras radiales; y

: 3) Un ensayo de falta de tracción, cuyos resultados se muestran en la Figura 10. Para cada condición, las tiras circunferenciales fueron más fuertes, más rígidas y más tenaces que las tiras radiales. La crioconservación y la despoblación no afectó a estos parámetros medidos en la dirección circunferencial. Las tiras radiales cortadas, de tejido despoblado, a cualquier temperatura, mostraron mayor tenacidad cuando se compara con frescas.

La descripción contenida en la presente memoria contiene las realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo, se contemplan numerosas realizaciones alternativas como que están incluidas dentro del alcance de la invención. Por las explicaciones y por ejemplo, se demuestran las características importantes de la invención: 1) eliminación de células xenogénicas y membranas celulares de un tejido potencialmente útil como injerto implantable o trasplantable en seres humanos (mostrado por análisis histológico y bioquímico); 2) bajo la influencia de glucoproteína de matriz extracelular, glucosaminoglucano y factor de crecimiento, el tejido acelular se puede repoblar con células exógenas, potencialmente procedentes del receptor de los injertos; 3) mantenimiento de propiedades biomecánicas similares a las de tejidos crioconservados que se utilizan ellos mismos como materiales de injerto estables; y 4) como un resultado del procedimiento de despoblación, se reduce la propensión de tejido despoblado a estimular una respuesta inmunitaria inflamatoria y celular y humoral en el receptor.

Claims

1. Un procedimiento para generar tejido o injertos para implante, para un receptor de implante en el que el tejido o los injertos para implante tiene(n) compatibilidad mejorada con el sistema inmunitario del receptor del implante, que comprende:

A.: eliminar células naturales y otros componentes extracelulares de un tejido del donador para proporcionar una matriz de tejido descelularizada;

B.: tratar la matriz de tejido, descelularizada, con un factor de adherencia celular para fomentar la unión posterior de células alogénicas o autógenas cultivadas, dentro de la matriz de tejido, siendo dichas células alogénicas o autógenas al receptor; y

C.: repoblar la matriz de tejido con las células alogénicas o autógenas, cultivadas.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tejido para implante se genera a partir de: tejido de colágeno natural, tejido valvular cardíaco, tejido conjuntivo o vasos sanguíneos.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que el tejido cardíaco es tejido valvular cardíaco pulmonar o aórtico.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el implante se genera por tratamiento de tejido de origen no humano.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células usadas para repoblar la matriz de tejido son de origen humano.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tejido generado es sustancialmente no inmunógeno en el implante.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el implante se genera por tratamiento de tejido de origen no humano, en el que las células usadas para repoblar la matriz de tejido son de origen humano y en el que el tejido generado es sustancialmente no inmunógeno en el implante.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que el tejido se repobla por incubación de la matriz de tejido en presencia de células de tipo fibroblasto y factor de crecimiento de fibroblasto.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células de tipo fibroblasto son células alogénicas.

10. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células de tipo fibroblasto proceden de estirpes celulares estables.

11. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células de tipo fibroblasto se modifican genéticamente por técnicas de transfección estable con material genético exógeno.

12. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se modifican para que sean sustancialmente no inmunógenas al receptor del implante de tejido.

13. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se modifican para expresar proteínas específicas.

14. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células naturales se eliminan por tratamiento del tejido con una solución eficaz para producir la lisis de las células.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, que además comprende: tratamiento del tejido con enzima nucleasa eficaz para descelularizar la matriz de tejido y proporcionar una matriz de tejido de capacidad inmunógena limitada.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que el tejido se trata con una nucleasa, seleccionada del grupo que comprende: ARNasa A, ADNasa I, EcoR I y Hind III.

17. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (A) comprende: tratar el tejido con solución de fuerza iónica baja y ADNasa I y ARNasa A, eficaz para eliminar células naturales y proporcionar una matriz de tejido de capacidad inmunógena limitada y en el que se eliminan partículas celulares, proteína soluble y otra materia, por lavado del tejido para proporcionar una matriz de tejido sustancialmente sin componentes de tejido, naturales, antigénicos, con respecto al receptor del implante.

18. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la matriz de tejido se trata con un factor de adherencia celular constituido por una glucoproteína y un glucosaminoglucano eficaz para fomentar la unión de las células a la matriz de tejido durante la etapa de repoblación celular.

19. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que el glucosaminoglucano es: heparina, sulfato de heparina, condroitina, sulfato de condroitina, dermatina o sulfato de dermatina.

20. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que la glucoproteína es fibronectina.

21. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que durante la etapa (B), la matriz de tejido se trata con factor de adherencia celular constituido por una o más proteínas extracelulares ordinariamente asociadas con el tejido natural eficaz para fomentar la unión celular a la matriz de tejido durante la etapa (C) de repoblación.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que el tejido natural es tejido valvular cardíaco de origen porcino.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que la matriz de tejido valvular se repobla por incubación de la matriz de tejido, tratada de acuerdo con la etapa (B), en presencia de células de tipo fibroblasto, alogénicas o autógenas, y factor de crecimiento de fibroblastos, para proporcionar un implante valvular xenogénico, repoblado y revitalizado por dichas células de tipo fibroblasto y que es sustancialmente no inmunógeno en la implantación.

24. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que la matriz de tejido valvular se prepara por eliminación de células de tejido naturales y por tratamiento con enzimas o nucleasas para proporcionar la matriz de tejido.

25. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que la nucleasa es ADNasa I.

26. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que la nucleasa es ARNasa A.

27. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tejido para implante es tejido para implante alogénico o xenogénico.

28. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tejido xenogénico se trata para mejorar su compatibilidad con el sistema inmunitario de un receptor del implante de una especie diferente de la especie de la fuente del tejido natural; en el que el tejido se descelulariza durante la etapa (A) y en el que el factor de unión celular de la etapa (B) comprende una o más proteínas extracelulares ordinariamente asociadas con el tejido natural en un vehículo líquido y en el que la matriz de tejido se repobla después en la etapa (C), con células autógenas o alogénicas al receptor del implante, para proporcionar un implante o injerto sustancialmente no inmunógeno y biomecánicamente aceptable que se vitaliza por la repoblación celular y es histológicamente y bioquímicamente similar al tejido natural correspondiente.

29. El procedimiento según la reivindicación 28, en el que el tejido natural tratado es: tejido cardíaco, tejido vascular, tejido conjuntivo o tejido de colágeno.

30. El procedimiento según la reivindicación 29, en el que los factores de adherencia incluyen una glucoproteína y un glucosaminoglucano.

31. El procedimiento según la reivindicación 30, en el que la matriz de tejido se repobla con células de tipo fibroblasto inmunológicamente compatibles con el receptor del implante.

32. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células de tipo fibroblasto se modifican genéticamente por técnicas de transfección estable con material genético exógeno.

33. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se modifican para que sean sustancialmente no inmunógenas en la implantación.

34. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se modifican para expresar proteínas específicas.

35. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que el factor de adherencia está constituido por fibronectina y un glucosaminoglucano seleccionado del grupo que consta de: dermatina, sulfato de dermatina, condroitina, sulfato de condroitina, sulfato de heparina y heparina.

36. El procedimiento según la reivindicación 35, en el que el tejido natural es tejido valvular cardíaco, porcino, y en el que la etapa de repoblación celular se conduce por incubación de la matriz de tejido en un entorno nutritivo y en presencia de células de tipo fibroblasto y una cantidad eficaz de factor de crecimiento de fibroblastos.

37. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que los implantes o injertos de tejido de colágeno, conjuntivo o vascular que son xenogénicos a un receptor humano se generan in vitro por descelularización y lavando el tejido natural en la etapa (A), para eliminar antígenos celulares o antígenos extracelulares, o ambos, seguido por tratamiento de la matriz de tejido en la etapa (B), con factores de adherencia constituidos por fibronectina y heparina, eficaz para fomentar la unión a la misma de células de tipo fibroblasto inmunológicamente aceptables al receptor del implante o injerto, en el que la matriz de tejido tratada con factor de adherencia se repobla en la etapa (C), por incubación de la matriz en presencia de las células de tipo fibroblasto y factor de crecimiento de fibroblastos hasta que tal repoblación celular proporciona un tejido vitalizado histológicamente similar al correspondiente tejido natural y en el que el tejido para implante generado es mecánicamente, bioquímicamente e inmunológicamente adecuado para implantación.

38. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que la fibronectina comprende fibronectina de plasma humano o fibronectina de tejido humano.

39. El procedimiento según la reivindicación 38, en el que el tejido es tejido de colágeno.

40. El procedimiento según la reivindicación 38, en el que el tejido es tejido conjuntivo.

41. El procedimiento según la reivindicación 39, en el que las células de tipo fibroblasto son células de tipo fibroblasto, humanas, cultivadas.

42. El procedimiento según la reivindicación 41, en el que el tejido natural es tejido valvular cardíaco y en el que las células de repoblación son células de tipo fibroblasto, humanas.

43. El procedimiento según la reivindicación 37, que además comprende la etapa de crioconservación de la matriz de tejido en una fase previa a la etapa de repoblación celular.

44. El procedimiento según la reivindicación 40, en el que el tejido natural se descelulariza por tratamientos que incluyen tratamiento con nucleasas de manera que se limite la generación de nuevos sitios inmunológicos.

45. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que la heparina adhiere fibronectina a porciones de la matriz de tejido y en el que se emplea factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano, básico.

46. El procedimiento según la reivindicación 45, en el que la matriz de tejido es tejido valvular cardíaco aórtico o pulmonar.

47. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que las células de tipo fibroblasto son células autógenas.

48. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que la célula de tipo fibroblasto son células alogénicas.

49. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que la célula de tipo fibroblasto procede de estirpes celulares estables.

50. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que la célula de tipo fibroblasto se modifica genéticamente por técnicas de transfección estable con material genético exógeno.

51. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se modifican para que sean sustancialmente no inmunógenas en la implantación.

52. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se modifican para expresar proteínas específicas.

53. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que el tejido es de origen porcino o bovino, el factor de matriz de adherencia comprende fibronectina y heparina purificadas y en el que las células de repoblación son células de tipo fibroblasto, humanas, en presencia de cantidades eficaces de factor de crecimiento de fibroblastos, básico o ácido, y el tejido para implante producido es un implante xenogénico sustancialmente sin respuesta inmunitaria adversa en la implantación en un ser humano.

54. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que la etapa de descelularización comprende tratar los tejidos con una solución de fuerza iónica baja y nucleasas.

55. El procedimiento según la reivindicación 54, en el que la solución de fuerza iónica baja, de nucleasas, incluye al menos un miembro seleccionado del grupo que consta de: ARNasa A, ADNasa I, EcoR I y Hind III.

56. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que el tejido natural es tejido de colágeno; el tejido se descelulariza en la etapa (A) y se trata con una solución de fuerza iónica baja y ADNasa I y ARNasa A, eficaz para eliminar células naturales y proporcionar una matriz de tejido de capacidad inmunógena limitada; y la matriz de tejido se trata en la etapa (B), con una cantidad de una solución amortiguada que contiene fibronectina y sulfato de heparina, eficaz para proporcionar sitios asociados con la matriz de tejido que faciliten la unión de células de tipo fibroblasto a la misma; y en el que la matriz de tejido se repobla en la etapa (C) por su incubación junto con células de tipo fibroblasto, de origen humano, en presencia de una cantidad de factor de crecimiento de fibroblastos, eficaz para facilitar crecimiento celular y la repoblación de la matriz de tejido con células de tipo fibroblasto.

57. El procedimiento según la reivindicación 56, en el que el tejido para trasplante es tejido valvular cardíaco, porcino.

58. El procedimiento según la reivindicación 56, en el que las células de tipo fibroblasto son autógenas.

59. El procedimiento según la reivindicación 56, en el que las células de tipo fibroblasto son alogénicas.

60. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que durante la etapa (A), se genera matriz de tejido sustancialmente no inmunógena, que es adecuada para tratamiento posterior en un tejido para implante, en el que las células naturales se eliminan por tratamiento del tejido con componentes seleccionados del grupo que consta de enzimas y nucleasas eficaces para inhibir crecimiento celular natural posterior, en el tejido tratado y eficaz para limitar la generación de nuevos sitios inmunológicos en el tejido.

61. El procedimiento según la reivindicación 60, en el que el tejido se trata con una solución de fuerza iónica baja, de nucleasas, eficaz para descelularizar la matriz de tejido y proporcionar una matriz de tejido de capacidad inmunógena limitada.

62. El procedimiento según la reivindicación 61, en el que la solución de fuerza iónica baja, de nucleasas, incluye al menos un miembro del grupo de: ARNasa A, ADNasa I, EcoR I y Hind III.

63. El procedimiento según la reivindicación 61, en el que la nucleasa empleada es ribonucleasa A y desoxirribonucleasa I.

64. El procedimiento según la reivindicación 60, que además comprende crioconservación de la matriz de tejido después de la etapa (A) y previamente a tratamiento adicional.

65. El procedimiento según la reivindicación 61, que además comprende crioconservar la matriz de tejido después de la etapa (A) y previamente a tratamiento adicional.

66. El procedimiento según la reivindicación 64, que además comprende esterilizar el tejido o la matriz de tejido o ambos.

67. El procedimiento según la reivindicación 60, en el que el procedimiento comprende crioconservar tejido de un donador mamífero natural y después eliminar el tejido de crioconservación, previamente a tratamiento de acuerdo con la reivindicación 53.

68. El procedimiento según la reivindicación 67, en el que la matriz de tejido es de origen valvular cardíaco, porcino.

69. El procedimiento según la reivindicación 68, en el que la válvula cardíaca es una válvula cardíaca pulmonar o una aórtica.

70. El procedimiento según la reivindicación 60, en el que dicha descelularización comprende tratamiento con una solución acuosa hipotónica.

71. El procedimiento según la reivindicación 70, en el que dicha solución acuosa, hipotónica, es una solución acuosa amortiguada eficaz para causar lisis celular.

72. El procedimiento según la reivindicación 71, en el que el tejido es tejido valvular cardíaco, porcino.

73. El procedimiento según la reivindicación 72, en el que la válvula cardíaca es una válvula cardíaca pulmonar o una aórtica.

74. El procedimiento según la reivindicación 73, que además comprende la etapa de crioconservar la matriz valvular cardíaca, porcina, producida.

75. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que se genera la válvula cardíaca xenogénica a partir de tejido valvular, porcino o bovino, que es histológicamente e inmunológicamente adecuado para implantación de válvula cardíaca en un ser humano o receptor mamífero; en el que el tejido valvular, natural, se descelulariza en la etapa (A), para proporcionar una matriz de tejido valvular cardíaco, descelularizada, sustancialmente sin antígenos celulares naturales y tratada para limitar la generación de nuevos sitios inmunológicos; y se aplican factores de unión durante la etapa (B), a la matriz de tejido valvular, constituida por una o más proteínas extracelulares ordinariamente asociadas con el tejido natural, eficaz para fomentar la unión de células de tipo fibroblasto a la matriz; y se repobla la matriz de tejido valvular durante la etapa (C), con células de tipo fibroblasto, alogénicas o autógenas, en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos inmunológicamente aceptable para el receptor del implante, para proporcionar un tejido valvular vitalizado.

76. El procedimiento según la reivindicación 75, en el que la válvula cardíaca es una válvula cardíaca pulmonar o una aórtica.

77. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que se genera un injerto o un implante valvular cardíaco, porcino, adecuado para uso en un receptor humano por descelularización del tejido natural durante la etapa (A), en el que es eficaz tratar el tejido con enzimas o nucleasas para descelularizar la matriz de tejido y proporcionar una matriz de tejido de capacidad inmunógena limitada; y aplicar una cantidad eficaz de fibronectina de plasma humano y heparina, durante la etapa (B), a la matriz de tejido valvular para fomentar la unión celular de células de tipo fibroblasto, alogénicas o autógenas, y repoblar la matriz de tejido valvular en la etapa (C), con células de tipo fibroblasto, por incubación de la matriz valvular en un medio nutritivo constituido por células de tipo fibroblasto, humanas, cultivadas, y factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano.

78. El procedimiento según la reivindicación 77, en el que la válvula cardíaca es una válvula cardíaca pulmonar o una aórtica.

79. El procedimiento según la reivindicación 77, en el que la etapa (A) comprende las etapas de: producir la lisis del tejido natural y tratamiento con ARNasa A y ADNasa I.

80. El procedimiento según la reivindicación 79, en el que las células de tipo fibroblasto son células autógenas.

81. El procedimiento según la reivindicación 79, en el que se aplican los factores de adherencia poniendo la matriz de tejido en un medio nutritivo que contiene factores de adherencia y en el que se emplean después las células de tipo fibroblasto y factor de crecimiento de fibroblastos, para repoblar la matriz añadiéndolos en cantidades eficaces al medio nutritivo que contiene la matriz de tejido.

82. El procedimiento según la reivindicación 79, en el que las células de tipo fibroblasto son alogénicas.

83. El procedimiento según la reivindicación 79, en el que las células de tipo fibroblasto son autógenas.

84. El procedimiento según la reivindicación 79, que además comprende la etapa de crioconservar la matriz de tejido previamente a tratamiento adicional.

85. El procedimiento según la reivindicación 77, en el que las células de tipo fibroblasto proceden de estirpes celulares estables.

86. El procedimiento según la reivindicación 77, en el que las células de tipo fibroblasto se modifican genéticamente por técnicas de transfección estable con material genético exógeno.

87. El procedimiento según la reivindicación 77, en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se modifican para que sean sustancialmente no inmunógenas en la implantación.

88. El procedimiento según la reivindicación 77, en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se modifican para expresar proteínas específicas.

89. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que el tejido valvular son hojas de válvula cardíaca, tejido de miocardio asociado con la válvula, conducto aórtico ensanchándose sobre el lado del ventrículo derecho de la válvula o el pedículo de la válvula ensanchándose a la aurícula.