ES2220400T3

ES2220400T3 - Procedimiento para la deteccion de analitos en una muestra de medicion, asi como soportes de medicion para ello.

Info

Publication number: ES2220400T3
Application number: ES00905017T
Authority: ES
Inventors: Peter Becker; Heinrich Horber
Original assignee: European Molecular Biology Laboratory
Current assignee: European Molecular Biology Laboratory
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2020-02-03
Also published as: EP1145009A2; DE50006325D1; WO2000046600A2; DK1145009T3; AU2669600A; WO2000046600A3; AU762899B2; CA2384337A1; CA2361700A1; EP1145009B1; ATE266200T1

Abstract

Procedimiento para la detección de analitos en una muestra de medición, en el que, sobre un substrato en forma de disco (3), se inmovilizan en un gran número de campos de detección (5, 7) sobre una de sus caras planas unos elementos de fijación (15), específicos para ciertos analitos, seguidamente la muestra de medición se pone en contacto con los campos de detección (5, 7), y a continuación, se determina la presencia o/y la cantidad de los analitos (17) que se han de detectar mediante una evaluación óptica de los campos de detección (5, 7), utilizándose un substrato (3) producido a base de un material ópticamente transparente, y los campos de detección (5, 7) se disponen, distribuidos sobre el substrato (3), a lo largo de por lo menos una línea en espiral (27) o/y a lo largo de un gran número de líneas circulares concéntricas, caracterizado porque después de una puesta en contacto de la muestra de medición con los campos de detección (5, 7), se aplica por encima de los campos de detección(5, 7) una capa reflectora óptica (21) sobre la cara plana del substrato (3), que es portadora de los campos de detección (5, 7).

Description

Procedimiento para la detección de analitos en una muestra de medición, así como soportes de medición para ello.

El invento se ocupa de la detección de analitos en una muestra de medición. Como analitos entran en cuestión, por ejemplo, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y sus derivados, así como moléculas que se pueden fijar a éstos.

Como muestra de medición entra en cuestión cualquier tipo de muestra, de la que se suponga que ella contenga por lo menos una parte de los analitos buscados. En este caso, se puede tratar, p.ej. de una muestra de sangre, de una muestra de suero o/y de una muestra de orina, o, por lo general, de cualquier solución que contenga el analito buscado.

Para la detección de analitos en una muestra de medición es conocido el empleo de los denominados ensayos de fijación. En tales ensayos de fijación se detectan, por regla general, analitos por medio de su interacción específica con receptores. Ejemplos de tales interacciones son las interacciones entre una proteína y otra proteína, que aparecen, por ejemplo, durante la expresión de genes, las interacciones entre una enzima y un substrato o las interacciones entre una enzima y un efector, que aparecen en el metabolismo, o las interacciones entre una proteína y un ADN o entre una proteína y un ARN durante la expresión de genes. Una comprensión sistemática de estas interacciones moleculares constituye una premisa fundamental para la comprensión de todos los procesos biológicos, tanto en células normales como también en células enfermas.

Además, con los ensayos de fijación se pueden detectar también ácidos nucleicos. Las interacciones entre un ADN y otro ADN desempeñan un cometido primordial en la biología molecular, en particular en el caso de la identificación de genes y en el caso de estrategias para cartografiar los ADN, en el caso de la detección y de la cuantificación de la expresión de genes, así como en el caso de la diagnosis molecular o la terapia de enfermedades. Por supuesto que también entran en cuestión las interacciones entre un ADN y un ARN y entre un ARN y otro ARN.

A causa del gran número de genes, proteínas, efectores químicos o aptámeros de ARN, una comprensión o una intervención en procesos bioquímicos requiere con frecuencia el reconocimiento, la cuantificación o la clasificación de un gran número de interacciones moleculares, o la identificación de partícipes eficaces en interacciones a partir de un gran número de combinaciones posibles. El escrutinio y el análisis de un gran número de interacciones moleculares está limitado, sin embargo, con frecuencia en los casos de los procedimientos conocidos a partir del estado de la técnica.

Las muestras de medición deben ser investigadas con frecuencia en cuanto a un gran número de analitos. En este caso, se plantea el problema de que al realizar la evaluación resultan grandes cantidades de datos. Para subsistir con éxito en la práctica, la evaluación tiene que ser posible, no obstante, en un período de tiempo justificable. Los sistemas de análisis conocidos se han manifestado en este contexto sólo como condicionadamente satisfactorios.

A partir de un artículo "Metal Nano Clusters as Transducers for Bioaffinity Interactions" (Nano-racimos metálicos como transductores para interacciones de bioafinidad) de Thomas Schalkhammer en la obra Monatshefte für Chemie 000, 1-26, editorial Springer 1998, páginas 1-26, se conoce una estructura de sensor para procesos de fijación biorrecognitivos (para reconocimiento biológico) y para procesos catalítico-enzimáticos, en la que sobre un substrato hecho de un policarbonato se dispone una capa especular a base de plata y, sobre ésta, una capa distanciadora a base de un material polimérico. La capa distanciadora sirve, por su parte, como soporte para los elementos de fijación que están inmovilizados sobre ella. La evaluación se efectúa con ayuda de racimos metálicos, con los que se marcan los analitos que se han de detectar, y que pasan a tomar parte de una interacción electromagnética con la capa especular metálica. En las zonas del sensor que presentan un intenso cubrimiento con racimos metálicos, la luz, que es irradiada desde la cara de la capa especular, que está apartada del substrato de policarbonato, se absorbe más intensamente que en las zonas del sensor que están sin cubrimiento o están más débilmente cubiertas, lo que hace posible la lectura óptica del sensor por medio de mediciones de absorción.

Para la función de este conocido sensor, el espesor de la capa distanciadora constituye un parámetro decisivo. Éste se debe de seleccionar dentro un intervalo preestablecido, que depende de la longitud de onda de la luz irradiada al realizar la evaluación posterior. En particular, tiene que estar asegurado que la capa distanciadora posea un espesor uniforme por toda su extensión. Para esto se ha de dedicar un gran esfuerzo técnico de producción.

En el artículo abordado se proponen para la evaluación óptica de este sensor ya unos aparatos de lectura que permiten dominar también grandes cantidades de datos, entre otras cosas aparatos de lectura en CD-ROM.

A partir del documento de solicitud de patente internacional WO 96/09.548 se conoce un soporte de medición en forma de disco circular, sobre cuya superficie está inmovilizado un elemento de fijación específico para ciertos analitos. En el soporte de medición está incorporada una capa reflectora; por lo demás, él consta de un material óptico transparente. Para la detección de analitos, que están adheridos a los elementos de fijación, sirve un aparato óptico de lectura, que explora en forma de espiral con un rayo láser la superficie del soporte de medición, que está provista de los elementos de fijación.

A partir del documento WO 98/12.559 se conoce asimismo un soporte de medición en forma de disco circular, sobre cuya superficie unos elementos de fijación específicos para ciertos analitos están inmovilizados en un gran número de campos de detección, que están distribuidos a lo largo de pistas circulares o en espiral. Los campos de detección están dispuestos sobre una capa de substrato del soporte de medición, sobre cuya cara enfrentada a ellos se encuentra una capa reflectora. Para la lectura de los campos de detección sirve, de nuevo, un rayo láser que explora, como en el caso de una unidad de discos del CD-ROM, la cara que es portadora de los campos de detección del soporte de medición.

A partir del documento WO 98/01533 se conocen, además, los recursos de marcar moléculas de fijación, que se encuentran en los campos de detección sobre un soporte de medición en forma de discos circulares, con marcadores magnéticos, y evaluar los campos de detección por medio de un procedimiento magnético de lectura.

Es misión del invento mostrar una vía de cómo se pueda investigar una muestra de medición en cuanto a una muy abundante cantidad de analitos, con un pequeño esfuerzo, no sólo en lo que se refiere a la evaluación técnica de los datos, sino también en lo que respecta a la puesta a disposición del sensor.

Para la solución del problema planteado por esta misión se ha previsto conforme al invento un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1.

En el caso del invento, los campos de detección pueden estructurarse directamente sobre el substrato. En este caso, se puede recomendar el recurso de tratar previamente en primer término por vía química la superficie del substrato, o de producir una modificación de la superficie mediante un tratamiento previo con un plasma de oxígeno. Esta modificación puede facilitar la aplicación de los elementos de fijación para la estructuración de los campos de detección específicos para ciertos analitos. Por consiguiente, por debajo de los elementos de fijación no se tiene que aplicar sobre el substrato, en el caso del invento, ninguna capa distanciadora con un espesor que se tenga que respetar exactamente, tal como es obligatoriamente necesario en el caso del sensor conocido a través de la cita de Schalkhammer. Por consiguiente, se establece un reducido esfuerzo técnico de fabricación.

La capa reflectora se necesita para la evaluación óptica del ensayo. Ésta, después de haber completado las etapas biológicas moleculares del procedimiento, se aplica sobre el substrato, por encima de los campos de detección. Debido a su buena capacidad reflectora, se recomiendan ciertos materiales metálicos. Fundamentalmente, también son concebibles otros materiales, por ejemplo materiales dieléctricos. De manera preferida, la capa reflectora se forma a base de aluminio. También se puede concebir la plata como material para la capa reflectora. La capa reflectora se puede formar mediante una aplicación química desde una fase de vapor. No obstante, también es posible pegar una lámina reflectora prefabricada sobre el substrato.

La transparencia óptica del substrato hace posible, en común con la capa reflectora dispuesta sobre la cara de los campos de detección que está alejada del substrato, recurrir al hardware (soporte físico) de los aparatos de lectura de CD (discos compactos) usuales en el comercio para la evaluación óptica de este sensor biológico molecular de acuerdo con el invento. En particular, en el caso de una disposición en espiral de los campos de detección, tales aparatos de lectura de CD usuales en el comercio pueden ser modificados con un esfuerzo comparativamente pequeño, de tal manera que, a partir de la luz retornante del rayo láser que explora los campos de detección, se puedan filtrar y seleccionar las informaciones deseadas. También se puede concebir que para ello sean necesarias solamente ciertas modificaciones al nivel del software (soporte lógico). Incluso en el caso de una disposición en forma circular de los campos de detección, la tecnología de tales aparatos de lectura de CD se puede aplicar fundamentalmente, siempre y cuando que se creen las premisas constructivas y a nivel del software para un salto del rayo láser, que explora los campos de detección, desde una línea circular a otra línea circular.

Se adecua especialmente un aparato de lectura de CD-ROM que, en el caso de su incorporación en una arquitectura de ordenador, ofrezca al usuario la posibilidad de definir por sí mismo el software de evaluación.

La evaluación de los campos de detección puede proporcionar, en dependencia del algoritmo de evaluación seleccionado, afirmaciones e informaciones tanto cuantitativas como también cualitativas. Mediante unos marcadores apropiados, se pueden hacer diferenciables las propiedades ópticas, en particular el comportamiento de absorción, de los campos de detección, en los que ciertos analitos se han adherido a receptores, con respecto de los campos de detección, a cuyos receptores no se ha fijado ningún analito. De esta manera es posible, por ejemplo, a través de mediciones de absorción, reconocer los campos de detección que son portadores de analitos, después de haberse terminado las etapas biológicas moleculares del procedimiento. En principio, esto constituiría solamente una afirmación o información puramente cualitativa. Si, además de esto, se quieren realizar afirmaciones o informaciones cuantitativas, entonces se puede concebir el recurso de explorar varias veces los campos de detección y modificar escalonadamente de una pasada de exploración a otra pasada de exploración un umbral, que se toma, en el caso de la evaluación, como límite de decisión entre la presencia o la ausencia de analitos, De esta manera, se pueden realizar afirmaciones e informaciones acerca de la cantidad de los analitos que han quedado adheridos en los campos de detección individuales.

Cuando se lee el ensayo con una unidad de discos del CD-ROM adaptado eventualmente de manera apropiada, entonces, un ordenador conectado hace posible al usuario el tratamiento ulterior de la cantidad de datos proporcionada por la unidad de discos, pudiendo aquél guardar el resultado de este tratamiento ulterior en medios externos de almacenamiento de datos, por ejemplo con el fin de establecer bancos de datos acerca de pacientes. Para el almacenamiento de datos se pueden utilizar medios clásicos de almacenamiento, tales como ilustrativamente discos duros o disquetes. Con la ayuda de un ordenador es posible una evaluación rápida del torrente de datos procedente de la unidad de discos. Por regla general, la capacidad de los ordenadores y sistemas de almacenamiento convencionales es tan suficiente, que en ellos se pueden llevar a cabo también complejos análisis de genes.

Por regla general, se deseará obtener unos campos de detección definidos de una manera nítida, que adicionalmente deben ser muy pequeños, con el fin de alojar un número suficiente de campos de detección sobre el disco de substrato, que posee convenientemente el tamaño de un CD (disco compacto) convencional. Cuando se parte del hecho de que la distancia radial entre dos espiras consecutivas es de manera conveniente aproximadamente 1,6 \mum, se recomienda aplicar los elementos de fijación en unos campos, que en dirección radial tienen una anchura no mayor que 1 \mum, para que entre los campos de detección contiguos en dirección radial, referido al eje del disco, exista una distancia suficiente, y que cada campo de detección individual pueda ser localmente resuelto como tal. De manera preferida, los campos de detección son incluso más estrechos que 1 \mum en dirección radial, pudiendo ser conveniente estructurarlos con una anchura radial, que corresponda esencialmente a la anchura de las cavidades con datos (las denominadas en inglés "pits") grabadas en los CD's convencionales, a saber, aproximadamente de 0,5 \mum. De igual modo, se recomienda disponer los campos de detección contiguos a lo largo de la línea en espiral, o bien de una línea circular, con una distancia entre sí, tal que se haga posible su resolución individual mediante el sistema de evaluación. Los campos de detección se pueden estructurar en forma de superficies esencialmente cuadradas o circulares. También se puede concebir estructurarlos en forma alargada, por ejemplo, ovalada o rectangular, de manera correspondiente a la forma de las cavidades de datos de los CD's convencionales en su dirección circunferencial, por lo tanto en la dirección de las líneas en espiral o circulares.

Para aplicar sobre el substrato los elementos de fijación en las condiciones marginales (límites) de dimensiones esbozadas anteriormente para los campos de detección, se adecuan en particular las técnicas de microimpresión, las técnicas de impresión con chorros de tinta o las técnicas de proyección eléctrica (en inglés electrospray). Para la consulta, en lo que se refiere a las técnicas de microimpresión, se remite a modo de ejemplo a la cita bibliográfica: "Microfabrication, Microstructures and Microsystems" (Microfabricación, microestructuras y microsistemas) de Dong Qin y colaboradores, en la obra "Topics In Current Chemistry", tomo 194, 1998, páginas 6 y siguientes, editorial Springer. En lo referente a las técnicas de impresión con chorros de tinta se remite, por ejemplo, a la cita bibliográfica: "A new device for multifunctional dosage of liquids by a free jet" (Un nuevo dispositivo para la dosificación multifuncional de líquidos por medio de un chorro libre) de N. Hey y colaboradores, Proceedings IEEE-Mems 1998 CH 36176. En lo que se refiere a las técnicas de proyección eléctrica, en particular a las técnicas de nanoproyección eléctrica, se puede consultar, por ejemplo, el artículo "Analytical Properties of the Nanoelectrospray Ion Source" (Propiedades analíticas de la fuente de iones de nanoproyección eléctrica) de M. Wilm y M. Mann en la cita bibliográfica Analytical Chemistry, tomo 68, nº 1, 1 de enero de 1996, páginas 1-8, así como en el artículo "Electrospray and Taylor-Cone-theory, Dole's beam of macromolecules at last?" (La proyección eléctrica y la teoría del Cono de Taylor, )Por fin el haz de macromoléculas de Dole's) de M. Wilm, M. Mann en la cita bibliográfica International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 136 (1994), páginas 167-180. Estas técnicas hacen posible, el recurso de proveer a los campos de detección, de una manera planificada, de elementos de fijación previamente determinados, con una alta resolución local. Los elementos de fijación se pueden aplicar sobre la superficie externa del disco de substrato. También se puede concebir el recurso de introducir, de una manera análoga a las cavidades de datos de los CD's convencionales, unas pequeñas cavidades en la superficie externa del substrato, e inmovilizar allí los elementos de fijación específicos para ciertos analitos. En caso de que se prevean tales cavidades para los elementos de fijación, será conveniente estructurar a éstas con una anchura radial de aproximadamente 0,5 \mum, correspondientemente a la anchura de las cavidades de datos de los CD's convencionales.

Para poder investigar interacciones biológicas en el plano molecular, entran en consideración como analitos en particular ciertos ácidos nucleicos o/y ciertas proteínas. Así, el procedimiento de acuerdo con el invento se puede utilizar con el fin de detectar interacciones entre una proteína y otra proteína, tal como las que se presentan, por ejemplo, durante la expresión de genes o como señales de células, interacciones entre una enzima y un substrato, o interacciones entre una enzima y un efector durante el metabolismo, o interacciones entre una proteína y un ADN, o interacciones entre una proteína y un ARN durante la expresión de genes.

Mediante una selección apropiada de los elementos de fijación en los campos de detección, se pueden detectar también interacciones entre un ADN y otro ADN, tal como es importante en particular para la identificación de genes y para el cartografiado de genes, al investigar y cuantificar la expresión de genes, así como en el caso de la diagnosis molecular y/o la terapia de enfermedades.

Las interacciones moleculares y las actividades enzimáticas se pueden influenciar por medio de la fijación de aptámeros de ARN o de compuestos químicos pequeños a macromoléculas. Las moléculas de efectores naturales y sintéticos permiten, por lo tanto, con frecuencia manipular procedimientos bioquímicos mediante una modulación de interacciones macromoleculares o una intervención en interacciones macromoleculares.

De manera preferida, en el caso del material de substrato se trata de un material no poroso. La utilización de un soporte no poroso hace posible la aplicación definida incluso de campos de detección pequeños, por lo que es posible una miniaturización del formato de ensayo o bien la aplicación de un gran número de campos de detección. Materiales apropiados para el substrato en forma de disco son p.ej. materiales sintéticos y vidrio. Para las aplicaciones con unidades de discos de CD-ROM, se trata de manera preferida de un material enfocador, en particular de un policarbonato.

La inmovilización de los elementos de fijación a los campos de detección se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos en sí conocidos. La estrategia de inmovilización depende del tipo de la molécula que se ha de inmovilizar y del respectivo substrato. Por lo general, los elementos de fijación se pueden fijar directamente a una matriz a través de una reacción química, por ejemplo a través de un aminoácido especial en una proteína (en particular cisteína o lisina) o través de la cadena principal de fosfatos de un ADN. La inmovilización se puede llevar a cabo también con agentes reticuladores químicos bifuncionales o a través de una interacción específica muy afín, tal como, ilustrativamente, la interacción entre biotina y estreptavidina. Los elementos de fijación específicos para ciertos analitos pueden ser adsorbidos también sobre la superficie, prefiriéndose, no obstante, un enlace covalente. Como elementos de fijación se aplican sobre la superficie del substrato unas sustancias o/y moléculas, que están en situación de fijar al analito deseado de una manera específica, en particular con una alta afinidad.

Después de haber puesto en contacto la muestra de medición con los campos de detección, se determinan la presencia o/y la cantidad de los analitos que se han de detectar, mediante una evaluación óptica de los campos de detección. En este contexto, se pueden aprovechar todos los métodos conocidos por un experto en la especialidad. Un procedimiento usual, con el fin de analizar interacciones moleculares, consta de varias etapas: Un primer partícipe en la interacción, p.ej. un elemento de fijación o receptor, específico para ciertos analitos, se une con un soporte sólido por enlaces covalentes o de por adsorción. Al poner en contacto la muestra de medición con los campos de detección, un segundo partícipe en la interacción, p.ej. el analito, puede interactuar con el receptor. A continuación, se detecta la presencia del analito (o la ausencia en formatos de ensayo competitivos) en el sitio, junto al que está inmovilizado el receptor. La interacción entre los dos partícipes en la fijación se lleva a cabo en unas condiciones, en las que los dos reactivos se presentan en una configuración activa natural, de manera preferida en una reacción líquida. Se prefiere especialmente la puesta en contacto a un valor del pH aproximadamente fisiológico y en unas condiciones iónicas.

La detección se efectúa, en el caso del procedimiento de acuerdo con el invento, mediante detección de una modificación de las propiedades ópticas de los campos de detección. La modificación óptica de los campos de detección puede ser ocasionada, p.ej. por isótopos, enzimas, fluorocromos, colorantes, coloides metálicos, perlas o sustancias similares. Para la detección, uno de los partícipes en la interacción, es decir el receptor o el analito, se marca directa o indirectamente. De manera preferida, para la detección, se derivatizan proteínas o ácidos nucleicos con una unidad de biotina, después de lo cual es posible un reconocimiento por medio de conjugados con estreptavidina.

De manera preferida, el procedimiento de detección da como resultado la precipitación de un colorante o la localización de un fluorocromo en el sitio de la interacción molecular, o la reacción por adición de racimos metálicos con una fuerte interacción electromagnética. Asimismo, se pueden fijar adosadamente perlas de un látex o perlas de un material sintético. A causa de su comportamiento de refracción y de su superficie curvada (esférica), éstas producen una dispersión de la luz de lectura incidente, que se puede detectar como una disminución de la intensidad. En el caso de un dimensionamiento apropiado de las perlas, se pueden conseguir unos efectos de la interferencia destructiva.

Las moléculas que interactúan, a saber el receptor y el analito, pueden ser detectadas o bien directamente, a través de sus sitios específicos de fijación, o bien indirectamente, al ser provistas de un marcador, que contiene un conocido sitio específico de fijación. Ejemplos de marcadores de este tipo son los epítopos, para los que se conocen anticuerpos monoclonales, o un grupo de biotina, que es capaz de fijarse con estreptavidina. Junto a ello, también es posible la fijación específica directa de un anticuerpo al analito. El anticuerpo y la estreptavidina se conjugan de manera preferida con una enzima, con el fin de hacer posible una evaluación de los campos de detección. Ejemplos de enzimas preferidas son la peroxidasa de rábano rusticano, la fosfatasa alcalina y la \beta-galactosidasa. En el caso de añadirse substratos apropiados, tiene lugar una reacción enzimática cromógena, formándose unos productos coloreados, que precipitan en los sitios a los que están fijadas las enzimas, y que, por consiguiente, indican la presencia del analito. Substratos apropiados de las enzimas anteriormente citadas, que hacen posible una evaluación óptica, son, para la peroxidasa de rábano rusticano, por ejemplo, la diaminobencidina (DAB), que proporciona un producto de color pardo, insoluble en agua y etanol, DAB + un metal, que en presencia de cobalto o níquel proporciona un producto insoluble, de color desde gris a negro, el cloronaftol, que proporciona una coloración soluble en agua, de color negro azulado, y el amino-etil-carbazol, que proporciona un producto insoluble en agua, de color rojo. Los substratos preferidos para la fosfatasa alcalina son una mezcla de naftol-AS-BI-fosfato y neo-fucsina, que proporciona un producto insoluble, de color rojo, una mezcla de bromo-cloro-indolil-fosfato y nitro-tetrazolio, que proporciona un precipitado de color violeta negruzco, y para la \beta-galactosidasa, la bromo-cloro-indolil-b-D-galacto-piranosita (BCIG), que proporciona un producto insoluble, de color azul. La detección de los analitos se puede efectuar en este caso fácilmente mediante una detección óptica de la zona coloreada.

Una posibilidad adicional para la detección de los sitios de interacción consiste en la técnica de coloración con coloides de oro, pudiéndose utilizar también otros tipos de racimos metálicos o de perlas metálicas. En este contexto son ventajosas, en particular, las partículas de plata, que pueden aumentar la sensibilidad de un sistema óptico de detección por causa de efectos ópticos no lineales cerca de una superficie metálica de la capa reflectora. Además, se prefiere la utilización de colorantes, en particular de partículas coloreadas de látex, como marcadores. También se pueden utilizar perlas de vidrio a base de óxido de silicio, que están llenas con un colorante en una alta concentración.

Junto a la medición de la absorción, en el caso de una selección de marcadores apropiados, por ejemplo sustancias fluorescentes, también es posible una medición de la fluorescencia, siendo la longitud de onda de detección en este caso una que es distinta de la longitud de onda irradiada. Si se debe recurrir a unidades de discos de CD usuales en el comercio, en particular unidades de discos de CD-ROM, al realizar la evaluación, en el caso de mediciones de la fluorescencia pueden ser necesarias ciertas modificaciones constructivas de las unidades de discos, junto a una correspondiente adaptación del software. En particular, puede ser necesario incorporar un detector adaptado a la longitud de onda de la fluorescencia.

El invento hace posible inscribir informaciones adicionales sobre la cara plana del substrato, portadora de los campos de detección, que se pueden leer y evaluar al mismo tiempo con los campos de detección. Conforme a ello, se propone que sobre la cara plana del substrato, portadora de los campos de detección, a lo largo de la línea en espiral o bien de por lo menos una línea circular, se estructuren adicionalmente unos campos de datos, que contengan informaciones referidas a una muestra de medición o/y referidas a un campo de detección o/y referidas a una evaluación. En el caso de las informaciones referidas a una muestra de medición, se puede tratar, por ejemplo, de informaciones acerca del sitio y del momento de la obtención de la muestra de medición, acerca del tipo de la muestra de medición o acerca de la persona, desde la que se extrajo la muestra de medición. Las informaciones referidas a los campos de detección pueden contener datos biológicos moleculares o bioquímicos acerca de los campos de detección, en particular acerca del tipo de elemento de fijación de los campos de detección individuales. Las informaciones referidas a una evaluación pueden contener datos acerca del principio de detección, aplicado para la detección del analito, por ejemplo una detección enzimática, una detección a través de colorantes, una detección a través de racimos metálicos o similares. Además, éstas pueden contener datos acerca de qué principio de exploración física debe aplicar un aparato de lectura, por ejemplo, una medición de la absorción o una medición de la fluorescencia. Además de esto, las informaciones referidas a una evaluación pueden indicar al aparato de lectura la posición y la localización de los campos de detección en el substrato y señalizarle con ello, cuándo deba de conmutarse el aparato de lectura desde un software para leer los campos de datos a un software para leer los campos de detección. En particular se puede concebir, que las informaciones referidas a una evaluación, contengan ya por lo menos partes de un software de evaluación, que sea tratado por el aparato de lectura al realizar la evaluación de los campos de detección. De esta manera, el usuario puede ser aliviado con respecto de penosas y complicadas misiones de programación para la adaptación del software de su sitio de trabajo con ordenador. El software de evaluación entero puede ser inscrito en el sensor ya por parte del fabricante, siempre y cuando que existan unos patrones de software apropiados.

Fundamentalmente, se puede concebir el recurso de disponer por separado los campos de detección y los campos de datos a lo largo de la línea en espiral. Sin embargo, también puede ser conveniente, disponer los campos de detección y los campos de datos alternativamente a lo largo de la línea en espiral, por ejemplo de una manera tal que a un campo de detección individual, o a un grupo de campos de detección, se le asocie un campo de datos, que preceda al campo de detección o bien al grupo de campos de detección a lo largo de la línea en espiral, y que proporcione al sistema de evaluación informaciones acerca de este campo de detección o de este grupo de campos de detección.

Si los campos de detección se disponen a lo largo de líneas circulares concéntricas, se pueden disponer asimismo los campos de detección y los campos de datos de una manera alternativa a lo largo de por lo menos una línea circular. No obstante, se puede concebir también que los campos de detección y los campos de datos se estructuren en cada caso en líneas circulares separadas.

Los campos de datos deben poder ser leídos convenientemente desde la misma cara del disco de substrato que la que es portadora de los campos de detección. En este caso, una posibilidad consiste en incorporar cavidades en la cara plana del substrato, que es portadora de los campos de detección, para la formación de los campos de datos, estando colocada la capa reflectora de tal manera que ella se extienda dentro de la cavidad. Convenientemente, la codificación de los datos y la disposición de las cavidades se efectúan según la premisa de un formato de CD corriente, en particular del formato de CD-ROM, de modo que los campos de datos pueden ser leídos por medio de habituales unidades de discos de CD sin modificaciones al nivel del software.

También se puede concebir incluso el hecho de prescindir de las cavidades para la formación de los campos de datos. Mediante una fijación de sustancias ópticamente absorbentes o dispersantes adosadamente al substrato, se puede asimismo ejercer una influencia sobre la reflexión del rayo de luz dirigido hacia los campos de detección y de datos con el fin de realizar una lectura. Así, se puede concebir, en el caso de una selección apropiada de perlas metálicas o de materiales sintéticos, el hecho de conseguir unos efectos de interferencia destructiva, parecidos a los que se consiguen por medio de cavidades en la superficie del substrato. Por lo tanto, para la formación de los campos de datos, puede estar previsto que sobre la cara plana del substrato, que es portadora los campos de detección, se aplique una sustancia que influya sobre la luz de lectura incidente.

Puesto que la capa reflectora se aplica tan sólo después de haberse terminado todas las etapas de análisis bioquímicos o biológicos moleculares, no son posibles unas mediciones precedentes y posteriores de los campos de detección, es decir unas mediciones antes y después de una puesta en contacto de la muestra de medición con los campos de detección. Para poder obtener de todas formas, a partir de las señales de medición, unas afirmaciones e informaciones seguras acerca de si están ocupados con analitos ciertos campos de detección, y de qué campos de detección están ocupados, puede ser ventajoso, estructurar sobre la cara plana del substrato, que es portadora de los campos de detección, a lo largo de la línea en espiral o bien de por lo menos una línea circular, adicionalmente por lo menos un campo de referencia, cuyas propiedades ópticas se utilizan como referencia al realizar la evaluación de los campos de detección. Por ejemplo, estos campos de referencia pueden poseer un grado de absorción de referencia para la luz del rayo de luz explorador, que es típico para campos de detección libres de analitos, que se puede diferenciar con respecto del grado de absorción que poseen típicamente campos de detección con analitos adheridos. Junto a esto, también pueden estar estructurados unos campos de referencia, que contienen el analito o/y un marcador y que, en el caso de una realización correcta del procedimiento, sirven como un testigo positivo. Los campos de referencia se pueden utilizar además para la calibración y la cuantificación de las mediciones.

En la zona de los campos de detección se puede ajustar una adherencia disminuida de la capa reflectora, cuando ésta es aplicada directamente sobre el plano biológico molecular o bioquímico que está situado debajo de ésta. En este caso, puede ser favorable, después de haber puesto en contacto la muestra de medición con los campos de detección, aplicar sobre los campos de detección en primer lugar una capa de cubrimiento a base de un material ópticamente transparente, antes de que se aplique la capa reflectora. La capa de cubrimiento puede servir también para la fijación de los reactivos en los campos de detección. El material y el espesor de la capa de cubrimiento se adaptarán entre sí de tal manera que no se efectúe ninguna influencia sobre las propiedades ópticas del sensor por medio de la capa de cubrimiento, por ejemplo por efectos de enfoque o de absorción, o que ésta se efectúe de una manera dominable y controlable. Un material a base de un polímero se ha manifestado como apropiado para la capa de cubrimiento. Éste se puede aplicar p.ej. en forma de una lámina o mediante un procedimiento de proyección. Si el sensor tiene también cavidades en campos de datos, se tendrá que asegurarse de que las cavidades no sean llenadas de nuevo por el material de la capa de cubrimiento, con el fin de impedir una pérdida de las informaciones de datos representadas por las cavidades. Para la aplicación local de la capa de cubrimiento se pueden concebir procedimientos de proyección. También se puede concebir el recurso de subdividir idealmente la superficie del disco de substrato en segmentos, por ejemplo, en sectores circulares, de los que una parte se reserva exclusivamente para campos de detección y la otra parte se reserva exclusivamente para campos de datos. Los segmentos con campos de datos se pueden mantener entonces, de manera muy fácil, libres de la capa de cubrimiento.

El substrato con los elementos de fijación inmovilizados sobre él se puede envasar en forma de una unidad comercializable y expedir a los usuarios. Se puede concebir que el fabricante recopile un conjunto de elementos de fijación que sea específico para los clientes y lo aplique sobre el substrato. También se puede imaginar el recurso de aplicar, sobre un substrato de una manera inespecífica para los clientes, pero específica para una aplicación, por ejemplo, para determinados análisis de genes, un conjunto de elementos de fijación, y ofrecerlo como un soporte de medición preparado previamente. Se recomienda secar este soporte de medición antes de envasarlo y expedirlo. La muestra de medición que se ha de investigar es aplicada entonces por el usuario, es decir por el comprador del soporte de medición. Lo mismo puede servir también para reactivos que contienen marcadores. La aplicación de la capa reflectora y eventualmente de la capa de cubrimiento, después de haberse terminado el procedimiento de detección biológica molecular o bioquímica, que también puede abarcar unas etapas de lavado, puede ser efectuada por el usuario, siempre y cuando que estén a disposición de éste aparatos apropiados para ello. También se puede concebir que el usuario envíe el soporte de medición con analitos adheridos, de retorno al fabricante o a otro laboratorio, donde se aplican estas capas.

Sobre la capa reflectora se puede aplicar superficialmente todavía una capa protectora, siendo apropiado para ello, a causa de su resistencia a los golpes y a los arañazos, un material sobre una base acrílica. El soporte de medición protegido de esta manera se puede almacenar durante largos períodos de tiempo y se puede leer de nuevo en cualquier momento.

El invento se refiere además a un soporte de medición de acuerdo con la reivindicación 18, que está destinado a su utilización en el procedimiento anteriormente explicado.

Según otro aspecto, se prevé un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23.

La distribución en forma de círculos o en espiral de los campos de detección sobre el substrato hace posible la utilización de los aparatos lectores de placas magnéticas corrientes en el mercado, las denominadas unidades de discos de los discos duros. Eventualmente será necesaria una adaptación a nivel del software del sistema de control de la unidad de discos. La lectura magnética de los campos de detección hace posible incluso estructurar campos de detección sobre las dos caras planas del substrato, por lo que se puede aumentar aún más la densidad de empaquetamiento de los sensores con campos de detección. En lo que se refiere a las distancias recíprocas, al tamaño y a la disposición de los campos de detección, así como de los eventuales campos de datos y de referencia sobre el substrato, son válidos esencialmente los datos que se han proporcionado anteriormente para el sensor legible por vía óptica.

Con el fin de impedir que los marcadores sean arrancados con respecto del substrato por un contacto con una cabeza de lectura del aparato de evaluación, después de haberse puesto en contacto la muestra de medición con los campos de detección, se puede aplicar una capa de fijación sobre los campos de detección. Ésta se aplicará, de manera conveniente, superficialmente sobre cada cara plana del substrato, que es portadora de campos de detección. Para la capa de fijación se ha acreditado como apropiado un material sobre la base de un polímero.

Antes de la estructuración de los campos de detección o después de una puesta en contacto de la muestra de medición con los campos de detección se aplica una capa magnética que contiene partículas magnéticas o/y magnetizables de manera superficial por encima de cada cara plana del substrato que es portadora de campos de detección. La capa magnética hace posible inscribir en el sensor adicionalmente datos, que se pueden leer en común con los campos de detección. Las propiedades magnéticas de la capa magnética se seleccionan de tal manera que las oscilaciones locales, provocadas por los marcadores, de la intensidad del campo magnético o de la densidad del flujo magnético, no se "desvanezcan" debido a la capa magnética y se vuelvan indetectables. Ciertamente se puede concebir fundamentalmente, que la capa magnética sea aplicada debajo de la capa biológica molecular o bioquímica del sensor, directamente sobre el substrato. No obstante, es conveniente aplicarla tan sólo después de haberse terminado las etapas biológicas moleculares o bioquímicas del procedimiento, puesto que ella puede servir al mismo tiempo como una capa de fijación.

Un estuche de ensayo para la realización del procedimiento de acuerdo con el primer o segundo aspecto que se ha descrito anteriormente comprende un soporte de medición preparado previamente con elementos de fijación inmovilizados, reactivos para la realización del procedimiento de detección, en particular reactivos de detección detectables óptica o/y magnéticamente, así como eventualmente soluciones de lavado o/y tamponadoras. El soporte de medición se presenta de manera preferida en una forma seca.

Finalmente, el invento se refiere a la utilización de un soporte de medición del tipo anteriormente descrito en un inmunoensayo o/y en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos o/y en un ensayo de lectinas y azúcares o/y en un ensayo de proteínas y ácidos nucleicos.

El invento se ilustra a continuación más detalladamente con ayuda de los dibujos anejos. Representan en ellos:

La Figura 1 una representación esquemática en corte de un sensor biológico molecular o bioquímico de acuerdo con el invento ("biosensor") con campos de detección y de datos, y

la Figura 2 esquemáticamente la distribución de los campos de detección y de datos sobre el biosensor.

En la Figura 1, que no reproduce con exactitud fielmente las relaciones de tamaños reales, el biosensor se designa por regla general con 1. Él posee la forma de un disco circular. Su tamaño corresponde convenientemente al de un disco compacto (CD) convencional, cuyo diámetro es de manera usual de aproximadamente 12 cm. El biosensor 1 comprende un substrato de soporte 3, que está fabricado a base de un material ópticamente transparente, de manera preferida a base de un policarbonato. Sobre la cara plana superior, representada en la Figura 1, del substrato 3 están estructurados unos campos de detección 5 y 7, así como unos campos de datos 9. En los campos de datos 9 se han depositado informaciones acerca de la muestra de medición o/y acerca de los campos de detección o/y acerca de la evaluación. Al igual que en los CD's habituales, las informaciones en los campos de datos 9 están representadas por unas zonas rebajadas 11 y unos zonas no rebajadas 13, que se alternan, del substrato 3.

En los campos de detección 5, 7 están inmovilizados unos elementos de fijación o receptores, que son específicos para ciertos analitos. Estos elementos de fijación se simbolizan en la Figura 1 esquemáticamente por medio de unos cortos trazos 15. Cada campo de detección 5, 7 lleva un gran número de elementos de fijación 15 del mismo tipo o de tipos diferentes. El campo de detección 7 representa en la Figura 1 un campo de detección, al que, después de una puesta en contacto de la muestra de medición con los campos de detección 5,7, no han quedado adheridos analitos. Por el contrario, el campo de detección 5 representa un campo de detección, al que han quedado adheridos analitos. Estos analitos se representan esquemáticamente en la Figura1 por medio de pequeños círculos 17, que simbolizan al mismo tiempo a los marcadores, con ayuda de los cuales es posible la detección óptica de la presencia de los analitos.

Los campos de detección 5,7 están empotrados en un capa de cubrimiento 19, que sólo se ha aplicado en las zonas del substrato 3, que son portadoras de los campos de detección 5, 7, pero no en las zonas del substrato 3, que son portadoras de los campos de datos 9. La capa de cubrimiento 19 se compone asimismo de un material ópticamente transparente, de manera preferida de un material polimérico. Ésta fija al marcador sobre el substrato 3 y sirve, al mismo tiempo, como inductor de adherencia entre el substrato 3, y una capa reflectora 21, que está aplicada superficialmente sobre el substrato 3, se extiende a lo largo de todos los campos de detección 5, 7 y se extiende dentro de todos los campos de datos 9, y penetra en las cavidades 11 de los campos de datos 9. La capa reflectora 21 se compone, de manera preferida, de aluminio, pero también se puede componer, por ejemplo, de plata y es producida convenientemente por medio de una aplicación química desde fase de vapor. La capa reflectora 21 sirve como reflector para la luz de un rayo láser 23, que está dirigido hacia el biosensor 1 desde la parte inferior del substrato 3 para la lectura de los campos de detección 5, 7 y de los campos de datos 9. La luz reflejada se evalúa mediante métodos corrientes. Por ejemplo, ella es separada por medio de un filtro de polarización con respecto de la luz irradiada, y es evaluada seguidamente en cuanto a su intensidad. El material del substrato 3 tiene ventajosamente un índice de refracción tal que el rayo láser 23 es enfocado en el substrato en su camino de ida, de manera que se pueda mantener a un nivel muy pequeño la mancha de luz que incide sobre los campos de detección 5, 7 y los campos de datos 9.

Hacia la cara superior, el biosensor 1 está cerrado por una capa de cubrimiento 25 aplicada superficialmente, que protege al biosensor 1 con respecto de influencias químicas o mecánicas perjudiciales. De manera preferida, ésta se compone de un material acrílico.

Los campos de detección 5, 7 y los campos de datos 9 están dispuestos sobre el substrato 3 en un orden de sucesión alternativo a lo largo de una línea en espiral. La Figura 2 muestra una sección de detalle de dos espiras consecutivas de la línea en espiral. Esta última se representa en la Figura 2 como una línea de trazos y es designada con 27. Con d se designa además la distancia radial entre las dos espiras, es decir la pendiente de la espiral. Por ejemplo, ésta es de aproximadamente 1,6 \mum. Las cavidades 11, que en el caso de la utilización de la codificación habitual para CD's, en particular para CD-ROM's, pueden poseer una longitud circunferencial variable de manera escalonada, tienen por ejemplo una anchura de aproximadamente 0,5 \mum en la dirección radial. Para evitar solapamientos radiales con los campos de detección o de datos de las espiras contiguas de la espiral, los campos de detección 5,7 están estructurados, asimismo en dirección radial, tan estrechos que existe una distancia suficiente con respecto de los campos de las espiras contiguas de la espiral. En particular, los campos de detección 5,7 pueden tener asimismo una anchura de 0,5 \mum. En el caso de un dimensionamiento de este tipo, se puede aceptar sin problemas también el "deshilachamiento", que se observa con frecuencia en el caso de una detección por vía enzimática de los analitos adheridos a los campos de detección 5. En la dirección circunferencial, los campos de detección 5, 7 pueden ser alargados, de tal manera que se pueden estructurar con un área de superficie total suficientemente grande. Los campos de detección 5, 7 tendrán también en la dirección circunferencial una distancia suficientemente grande entre ellos y con respecto de los campos de datos 9.

Los datos de mediciones anteriormente citados se recomiendan, en particular, cuando para la lectura de los campos de datos y de detección se utilizan unidades de discos de los CDs con un diámetro de la mancha del rayo láser 23 de aproximadamente 2 \mum.

A continuación, se ilustran todavía algunos ejemplos de aplicación biológicos moleculares o bioquímicos del invento.

Ejemplo 1 Aplicaciones

Las aplicaciones se pueden clasificar de acuerdo con la naturaleza del partícipe (A) en la fijación, inmovilizado, del elemento de fijación específico para ciertos analitos, y con la naturaleza de su "ligando", es decir del analito (B). Como partícipes en la interacción se utilizan preferiblemente ácidos nucleicos y/o proteínas, pero se pueden emplear también otros pares específicos de fijación, tales como ilustrativamente lectinas o azúcares.

De manera preferida, los receptores o los analitos, en particular las proteínas y los ácidos nucleicos, se derivatizan con un grupo de biotina, siendo detectado entonces el grupo de biotina ventajosamente con un conjugado de estreptavidina y una enzima, tal como ilustrativamente la peroxidasa de rábano rusticano. El substrato de la reacción enzimática se elige de tal manera que junto al sitio de la interacción molecular se forme un precipitado intenso, de color oscuro, que extingue al láser de detección. Junto a esto, la detección se puede efectuar también mediante una derivatización directa de un partícipe en la interacción con un fluorocromo, en combinación con un láser apropiado.

Ejemplo 1.1

El receptor (A) es un aptámero de ARN, un péptido o una molécula efectora natural o sintética y el analito (B) es una proteína.

Las propiedades de una enzima o de un factor de regulación en la expresión de genes, se modulan con frecuencia por medio de la asociación de pequeñas moléculas de efectores o ligandos. Un ejemplo de ello son los receptores de hormonas, que, después de haberse fijado a la hormona, se transforman en una conformación activa. La función de la proteína se puede modular por medio de la interacción de un compuesto análogo a un substrato o mediante efectores alostéricos. Para poder identificar agentes químicos pequeños apropiados se llevan a cabo procedimientos de escrutinio en cuanto a ligandos, investigándose un gran número de agentes químicos diferentes.

Con el procedimiento de acuerdo con el invento es posible ensayar exhaustivamente bibliotecas químicas. En este caso se inmoviliza un gran número de pequeños agentes químicos diferentes en un orden definido sobre el soporte de medición, poniéndose en contacto con ellos la proteína en cuestión en diversas condiciones rigurosas. Una proteína fijada, cuando está marcada con un fluorocromo apropiado, por ejemplo una partícula de látex, se detecta directa o indirectamente mediando utilización de una cascada de amplificación de enzimas. De manera correspondiente, grandes bibliotecas de aptámeros de ARN o de péptidos, o bien en un estado aislado o incorporados en una proteína de fusión, se pueden escrutar en lo que se refiere a interacciones con una proteína que esté en cuestión.

Ejemplo 1.2

El receptor (A) es una proteína y el analito (B) es un ácido nucleico o ligando.

Se pueden escrutar bibliotecas de proteínas en lo que se refiere a determinadas propiedades de fijación, p.ej. la interacción con una secuencia definida de ADN. Unos soportes de medición multiplicados, que contienen sectores definidos de proteínas, y que representan en común los productos de una biblioteca de expresión de ADNc, pueden ser caracterizados con ligandos específicos o con sitios de fijación a ADN. Las proteínas dispuestas pueden ser en la forma en que se encuentran en la biblioteca, desconocidas y tal sólo pueden ser asociadas mediante el procedimiento de acuerdo con el invento. Alternativamente, se pueden investigar sectores de proteínas conocidas o derivados de una proteína definida, tal como ilustrativamente el producto de una mutagénesis casual.

Ejemplo 1.3

El receptor (A) es un ADN o ARN y el analito (B) es una proteína.

Se puede aplicar sobre los campos de detección un gran número de diferentes fragmentos de ADN bicatenarios. En este caso se puede tratar o bien de pequeños fragmentos, por ejemplo, de oligonucleótidos, o bien de fragmentos más grandes de ADN, hasta de segmentos muy grandes de ADN, que constituyen una biblioteca ordenada de fragmentos de ADN genómicos. Las aplicaciones abarcan la búsqueda sistemática de posibles sitios genómicos de fijación para proteínas de fijación a ADN, pero también se pueden detectar otras moléculas de fijación a ADN, tales como ilustrativamente intercaladores, pequeñas moléculas con una predilección para determinadas secuencias, PNA's y secuencias, que forman una triple hélice. Asimismo, como moléculas de receptores se pueden aplicar en los campos de detección moléculas de ARN, tales como ilustrativamente los transcritos de una biblioteca de ADNc o los derivados de un ARN definido, tales como ilustrativamente el producto de una mutagénesis casual.

Ejemplo 2 Investigaciones de ácidos nucleicos

El receptor (A) es un ADN monocatenario y el analito (B) es un ADN o ARN monocatenario.

Ejemplo 2.1 Cartografiado del ADN

Entretanto, ya se ha hecho posible secuenciar genomas enteros, y los genomas de eucariotas superiores, tales como ilustrativamente los de seres humanos, ratones y moscas, son cartografiados y cubiertos por clones ordenados (tales como ilustrativamente los clones de fagos P1), partiéndose en este caso de que las secuencias de todos los genomas son obtenibles en un período de tiempo previsible. En este contexto, se pueden producir unos soportes de medición de acuerdo con el invento, que contienen genomas enteros en conjuntos o sectores ordenados. Con ello, es posible asociar un fragmento de ADN clonado, en una única etapa de hibridación, a su localización genómica, y en dependencia de la resolución del conjunto (que es una función de la longitud media de la secuencia y del número de las moléculas individuales de ADN), es incluso posible identificar el gen propiamente dicho. Un ejemplo de una aplicación de este tipo son los conjuntos de P1 de la entidad Genome Systems, que hasta ahora sólo se pueden escrutar de mala manera, puesto que éstos sólo se pueden obtener sobre membranas. La aplicación de estos conjuntos de P1 sobre los soportes de medición de acuerdo con el invento hace posible una aplicación sencilla y nada complicada. Las translocaciones y otras reordenaciones genómicas, que constituyen con frecuencia una causa de enfermedades genéticas, pueden ser cartografiadas asimismo de una manera sencilla, inclusive las deleciones (supresiones) del genoma mitocondrial. Además de esto, se pueden cartografiar fácilmente inserciones de transgénes, cuando el ADN insertado se detecta en común con una pequeña cantidad de un ADN genómico flanqueador.

Ejemplo 2.2 Identificación de genes y/o clones de genes

Los conjuntos o sectores de oligonucleótidos diagnósticos, que representan todos los genes conocidos de una especie determinada, hacen posible la identificación directa de un gen que esté en cuestión. Para esto, se pueden mejorar p.ej. conjuntos de ADNc de la entidad Klontech o chips de ADN de la entidad Affimetrix, sobre los cuales se han aplicado todos los genes de levaduras, mediante su transferencia a los soportes de medición de acuerdo con el invento.

Ejemplo 2.3 Investigaciones del perfil de expresión

Mediante aplicación de un ADN sobre soportes de medición de acuerdo con el invento, que muestran todos los genes de un organismo, se puede investigar el perfil de expresión. Sobre el soporte de medición se aplica una mezcla compleja de ARN, que representa el estado de la expresión de una célula determinada o de una población de ADNc derivada de ésta. El estado de expresión, que se ha comprobado sobre el soporte de medición, se puede comparar fácilmente con el estado de expresión de otras células, que proceden de otros tejidos, de otros estadios de desarrollo o de otros estadios de metabolismo. Alternativamente, se pueden investigar muestras de ADN, que representan determinados estados de ADN seleccionados, tales como ilustrativamente genes del ciclo celular, componentes de transmisores de señales, etc. Puesto que los soportes de medición de acuerdo con el invento se pueden almacenar durante un largo período de tiempo, se pueden establecer perfiles de expresión, que se pueden archivar y aprovechar con finalidades de comparación.

Ejemplo 2.4 Diagnosis molecular de polimorfismos de un ADN

El procedimiento de acuerdo con el invento se puede utilizar para la diagnosis de polimorfismos usuales y raros de ADN, inclusive el cartografiado de mutaciones en proto-oncogenes, que provocan los tumores usuales. Un soporte de medición apropiado contiene oligonucleótidos superpuestos, que abarcan en común un gen entero (p.ej. la secuencia de tipo silvestre), en común con oligonucleótidos, que contienen todas las mutaciones, posibles o que aparecen con frecuencia, de esta secuencia. El correspondiente fragmento de ADN se aísla desde los pacientes mediante una PCR (reacción en cadena de polimerasa), y se hibrida con el relevante soporte de medición de genes en unas condiciones, en lasque la hibridación sólo tiene lugar en el caso de una coincidencia perfecta de las secuencias. Una comparación de la hibridación del ADN experimental en oligonucleótidos de tipo silvestre o mutantes hace posible comprobar exactamente qué tipo de mutación se presenta en una secuencia.

Ejemplo 3

Junto a las aplicaciones anteriormente descritas, en las que se detecta un sencillo proceso de fijación, que produce señales, que pueden ser reforzadas eventualmente por una cascada de enzimas, a fin de aumentar la sensibilidad de la detección, el procedimiento de acuerdo con el invento se puede utilizar también en unas aplicaciones, que requieren unos tratamientos más extensos del soporte de medición, tales como ilustrativamente una amplificación por PCR, que se lleva a cabo de manera análoga a las amplificaciones por PCR in situ. De esta manera se pueden detectar también agentes infectantes.

Claims

1. Procedimiento para la detección de analitos en una muestra de medición, en el que, sobre un substrato en forma de disco (3), se inmovilizan en un gran número de campos de detección (5, 7) sobre una de sus caras planas unos elementos de fijación (15), específicos para ciertos analitos, seguidamente la muestra de medición se pone en contacto con los campos de detección (5, 7), y a continuación, se determina la presencia o/y la cantidad de los analitos (17) que se han de detectar mediante una evaluación óptica de los campos de detección (5, 7), utilizándose un substrato (3) producido a base de un material ópticamente transparente, y los campos de detección (5, 7) se disponen, distribuidos sobre el substrato (3), a lo largo de por lo menos una línea en espiral (27) o/y a lo largo de un gran número de líneas circulares concéntricas,

caracterizado porque después de una puesta en contacto de la muestra de medición con los campos de detección (5, 7), se aplica por encima de los campos de detección (5, 7) una capa reflectora óptica (21) sobre la cara plana del substrato (3), que es portadora de los campos de detección (5, 7).

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque la capa reflectora (21) se forma a base de aluminio.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2,

caracterizado porque, referido al eje del disco, se disponen unos campos de detección (5, 7) contiguos en dirección radial, con una distancia radial entre sí.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3,

caracterizado porque a lo largo de la línea en espiral (27) o bien de una línea circular se disponen unos campos de detección (5, 7) contiguos con una distancia entre sí.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4,

caracterizado porque sobre la cara plana del substrato (3), que es portadora de los campos de detección (5, 7), a lo largo de la línea en espiral (27) o bien de por lo menos una línea circular, se estructuran adicionalmente unos campos de datos (9), que contienen informaciones referidas a una muestra de medición o/y referidas a un campo de detección o/y referidas a una evaluación.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5,

caracterizado porque los campos de detección (5, 7) y los campos de datos (9) se disponen de manera alternativa a lo largo de la línea en espiral (27) o bien de por lo menos una línea circular.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5,

caracterizado porque los campos de detección y los campos de datos se estructuran en cada caso sobre líneas circulares separadas.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7,

caracterizado porque para la formación de los campos de datos (9) se incorporan unas cavidades (11) en la cara plana del substrato (3), que es portadora de los campos de detección (5, 7), y porque la capa reflectora (21) se aplica de tal manera, que ella se extienda dentro de las cavidades (11).

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7,

caracterizado porque para la formación de los campos de datos sobre la cara plana del substrato, que es portadora de los campos de detección, se aplica una sustancia que influye sobre la luz de lectura incidente.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9,

caracterizado porque sobre la cara plana del substrato (3), que es portadora de los campos de detección (5, 7), se estructura a lo largo de la línea en espiral (27) o bien de por lo menos una línea circular adicionalmente por lo menos un campo de referencia, cuyas propiedades ópticas se utilizan como referencia al realizar la evaluación de los campos de detección (5, 7).

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10,

caracterizado porque, después de una puesta en contacto de la muestra de medición con los campos de detección (5, 7), antes de la aplicación de la capa reflectora, se aplica sobre los campos de detección (5, 7) una capa de cubrimiento (19) a base de un material ópticamente transparente.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11,

caracterizado porque para la capa de cubrimiento (19) se utiliza un material sobre la base de un polímero.

13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12,

caracterizado porque se utiliza un substrato (3) a base de un policarbonato.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13,

caracterizado porque el substrato (3) es provisto en un sitio de producción de los elementos de fijación (15), es secado y envasado, y porque el substrato (3) preparado de esta manera se lleva a un sitio de aplicación alejado del sitio de su fabricación, en el que, por parte de un usuario, la muestra de medición se pone en contacto con los campos de detección (5, 7).

15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores,

caracterizado porque la detección de los analitos se efectúa por medio de una detección de una modificación de las propiedades ópticas de los campos de detección.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15,

caracterizado porque la modificación óptica de los campos de detección es ocasionada por isótopos, enzimas, fluorocromos, colorantes, coloides metálicos o/y perlas.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16,

caracterizado porque se utilizan perlas de látex, perlas de materiales sintéticos, perlas de vidrio o/y perlas metálicas.

18. Soporte de medición para su utilización en el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17,

que comprende un substrato (3) en forma de disco, fabricado a base de un material ópticamente transparente, sobre el que, en una de sus caras planas, unos elementos de fijación (15) específicos para ciertos analitos, están inmovilizados en un gran número de campos de detección (5, 7), estando dispuestos los campos de detección (5, 7) distribuidos sobre el substrato (3) a lo largo de por lo menos una línea en espiral (27) o/y de un gran número de líneas circulares concéntricas,

caracterizado por una capa reflectora (21) que se ha de aplicar superficialmente sobre la cara plana del substrato, que es portadora de los campos de detección, encima de los campos de detección (5, 7), después de haberse puesto en contacto la muestra de medición con los campos de detección.

19. Soporte de medición de acuerdo con la reivindicación 18,

caracterizado porque sobre la capa reflectora (21) se aplica superficialmente una capa protectora (25).

20. Soporte de medición de acuerdo con la reivindicación 19,

caracterizado porque la capa protectora (25) se fabrica a base de un material constituido sobre una base acrílica.

21. Soporte de medición de acuerdo con una de las reivindicaciones 18 a 20,

caracterizado porque él se pone a disposición en forma de una unidad comercial envasada, antes de la aplicación de la capa reflectora.

22. Soporte de medición de acuerdo con la reivindicación 21,

caracterizado porque él se envasa en estado seco.

23. Procedimiento para la detección de analitos en una muestra de medición, en la que sobre un substrato en forma de disco, por lo menos sobre una de sus caras planas, se inmovilizan unos elementos de fijación específicos para ciertos analitos, en un gran número de campos de detección, seguidamente se pone en contacto la muestra de medición con los campos de detección, y a continuación se determina la presencia o/y la cantidad de los analitos que se han de detectar mediante una evaluación de los campos de detección,

evaluándose los campos de detección por vía magnética y, para ello, unos elementos de fijación o los analitos que se han de detectar se marcan con marcadores magnéticos o/y magnetizables, y los campos de detección se disponen a lo largo de un gran número de líneas circulares concéntricas o/y a lo largo de por lo menos una línea en espiral, distribuidos sobre el substrato,

caracterizado porque, antes de la estructuración de los campos de detección o después de haber puesto en contacto la muestra de medición con los campos de detección, se aplica una capa magnética, que contiene partículas magnéticas o magnetizables, superficialmente sobre cada cara plana del substrato, que es portadora de campos de detección.

24. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23,

caracterizado porque, después de la puesta en contacto la muestra de medición con los campos de detección, se aplica una capa de fijación sobre los campos de detección.

25. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24,

caracterizado porque la capa de fijación se aplica superficialmente sobre cada cara plana del substrato, que es portadora de los campos de detección.

26. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25,

caracterizado porque para la capa de fijación se utiliza un material sobre la base de un polímero.

27. Utilización de un soporte de medición de acuerdo con una de las reivindicaciones 18 a 22 en un inmunoensayo o/y en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos o/y en un ensayo de lectinas y azúcares o en un ensayo de proteínas y ácidos nucleicos.