ES2220451T3 - Tratamiento de una infeccion intracelular. - Google Patents

Abstract

Un agente para producir la lisis de un microorganismo que reside en una célula diana, que comprende un resto dirigible a diana capaz de unirse a la célula diana, y un micobacteriófago asociado con el resto dirigible a diana, en el que después de la unión del resto dirigible a diana a la célula, el micobacteriófago penetra en la célula diana y efectúa la lisis de un microorganismo que reside dentro de la célula diana.

Description

Tratamiento de una infección intracelular.

La presente invención se refiere a un agente para producir la lisis de un microorganismo que reside dentro de una célula, a un método para preparar dicho agente, a composiciones que contienen dicho agente, y a la utilización de dicho agente. En particular, el agente de la presente invención es adecuado para el tratamiento de una infección intracelular por un microorganismo.

Muchos microorganismos son capaces de producir infecciones intracelulares. Estos incluyen: infecciones causadas por las especies de Salmonella, Yersinia, Shigella, Campylobacter y Chlamydia. La Salmonella y la Yersinia pueden sobrevivir dentro de las células de la mucosa del tracto gastrointestinal y en los fibrobalstos, proporcionan continuamente material antigénico a la circulación sanguínea, estimulan la inflamación crónica y producen artritis; las infecciones causadas por la supervivencia de la Legionella pneumophile dentro de los macrófagos alveolares y las células epiteliales; infecciones causadas por la supervivencia de la Listeria monocytogenes dentro del citosol de las células; las infecciones causadas por el protozoo intracelular Toxoplasma gondii; y las infecciones causadas por la supervivencia intracelular de las especies de Bordetella (macrófagos), Staphylococcus aureus (células epiteliales), y estreptococos del Grupo B (macrófagos). Algunas de estas infecciones son exclusivamente intracelulares, y otras contienen tanto componentes intracelulares como extracelulares. Sin embargo, se sospecha que el ciclo de supervivencia intracelular de la infección bacteriana es el factor principal de apoyo para la progresión de la enfermedad.

Generalmente, estos microorganismos no circulan libremente en el organismo, por ejemplo, en el torrente sanguíneo. Según esto, los microorganismos intracelulares frecuentemente no son susceptibles a regímenes de tratamiento con fármacos. Aunque los fármacos están disponibles, este problema se ha exacerbado por el desarrollo de microorganismos resistentes a múltiples fármacos. Por razones similares, las terapias con vacunas no son eficaces contra dichos microroganismos intracelulares. También, el aumento de concentración de antibióticos para mejorar su biodisponibilidad dentro de las células, puede producir como resultado efectos secundarios graves.

Como ejemplo de microorganismo que produce enfermedad intracelular, se hace referencia al Mycobacterium tuberculosis. Esta bacteria es responsable de causar la enfermedad tuberculosis, que es responsable de más de tres millones de muertes al año en todo el mundo. El M. tuberculosis infecta las células macrofágicas en todo el organismo. Pronto después de la infección de los macrófagos, la mayoría de las bacterias M. tuberculosis entran, persisten y se replican dentro de las vesículas fagosomas de las células, donde las bacterias son secuestradas de las defensas del hospedante y de factores extracelulares.

Se han propuesto un número de regímenes de fármacos como terapia para combatir las infecciones por M. tuberculosis, y el mejor resultado hasta el momento se ha conseguido con el fármaco isoniazida. Como alternativa, la terapia con bacteriófagos se sugirió al principio de los años 1980, basada en los resultados del tratamiento de la tuberculosis experimental en conejos infectados con BCG de M. Bovis y M. microtri, y en cobayas infectados con la cepa patógena humana H37Rv de M. tuberculosis. Sin embargo, el mayor efecto terapéutico obtenido con bacteriófagos no era mayor que el obtenido con isoniazida.

Los fagos, en particular los bacteriófagos, se conocen desde hace muchos años, y se han empleado como vehículos de liberación en regímenes de tratamiento convencionales, para aliviar enfermedades asociadas con células defectuosas o aberrantes.

Por ejemplo, el Documento WO 98/05344 enseña la utilización de bacteriófagos para liberar un gen exógeno, tal como un polinucleótido terapéutico, a una célula de un mamífero. El que el bacteriófago haga diana en una célula pre-seleccionada, se consigue mediante la utilización de un resto de unión ligado al bacteriófago, dicho resto de unión efectuando la unión e iniciando la internalización del bacteriófago dentro de la célula pre-seleccionada. Una vez liberada en la célula diana de mamífero preseleccionada, el material genético exógeno puede ser transcrito y traducido, aumentado así la concentración de la molécula terapéutica codificada por el polinucleótido en la célula diana.

Los regímenes de tratamiento de células aberrantes tales como los descritos en el Documento WO 98/05344 se conocen convencionalmente como métodos de terapia génica. Tales regímenes, sin embargo, no resuelven el problema y/o la persistencia de infecciones intracelulares por microorganismos.

El Documento WO 97/29185 enseña la preparación de fagos recombinantes, y su utilización en el tratamiento o profilaxis de las infecciones bacterianas. Según el Documento WO 97/29185, un anticuerpo anti-bacteriano es presentado desde una superficie expuesta a un bacteriófago, permitiendo así al bacteriófago ser capaz de unirse a, y de inhibir el crecimiento de la célula bacteriana diana. El Documento WO 97/29185 sin embargo, no enseña como combatir las infecciones intracelulares por microorganismos.

Antecedentes adicionales en la técnica relacionada se proporcionan en:

Documento WO 99/10485, que enseña un sistema de bacteriófago para identificar ligandos susceptibles para la internalización celular. Dichos ligandos pueden proporcionar dianas adecuadas como vehículos de liberación de genes por bacteriófagos; y

Documento WO 94/24959, que enseña un método para detectar compuestos, mediante la utilización de un bacteriófago lambdoide modificado químicamente. En más detalle, un bacteriófago se modifica para formar un complejo fago/molécula diana, siendo dicho complejo no infectivo. Tras el estímulo con una molécula de interés, la molécula diana se escinde y el bacteriófago se vuelve infectivo. Así, la presencia de una molécula de interés puede detectarse por la presencia de bacteriófagos infectivos.

Ni el Documento WO 99/10485 ni el 94/24959 resuelven los problemas asociados con las infecciones microbianas, y todavía menos el problema de combatir las infecciones microbianas intracelulares.

Por lo tanto hay una necesidad de combatir las infecciones intracelulares por microorganismos. En particular, hay una necesidad de un sistema para combatir las infecciones intracelulares por micobacterias.

El problema anterior se alivia mediante la presente invención, que, según su primer aspecto, proporciona un agente para ocasionar la lisis de un microorganismo que reside dentro de una célula diana, que comprende un resto de unión capaz de unirse a una célula diana, y un bacteriófago asociado con el resto de unión, donde después de la unión del resto de unión a la célula diana, el bacteriófago penetra en la célula diana y provoca la lisis del microorganismo que reside dentro de la célula diana.

La expresión "resto de unión" significa cualquier estructura que es capaz de unirse a la célula de interés. Ejemplos incluyen un anticuerpo o uno de sus fragmentos, un receptor capaz de unirse a un ligando sobre la célula de interés, y un ligando capaz de unirse a un receptor sobre la célula de interés. Preferiblemente, el resto de unión es un ligando para un receptor de la superficie celular. Se han obtenido buenos resultados en una realización específica de la invención utilizando una molécula de transferrina como resto de unión. El resto de unión no necesita demostrar el 100% de especificidad para la célula de interés, aunque naturalmente es deseable un grado de especificidad para obtener un sistema altamente eficiente. El resto de unión debe ser capaz de unirse y de internalizarse, en cuyo caso el fago y el resto de unión pueden ser liberados como un complejo (es decir, asociados) en la célula diana. La identificación de restos de unión potenciales susceptibles de internalización puede conseguirse mediante, por ejemplo, métodos convencionales tales como los descritos en el Documento WO 99/10485, o sobre la base de ensayo y error. Alternativamente, el resto de unión puede ser capaz de unirse pero no de internalizarse, en cuyo caso puede liberarse solo el fago en el interior de la célula diana.

El término "unión" incluye cualquier interacción entre el resto de unión y la célula de interés, que permita al fago ser liberado en el interior de la célula. Esta proceso de liberación es uno el que el fago completo penetra en la célula de interés. El resto de unión puede llegar a separarse del fago durante este proceso de liberación. Sin estar unido a ninguna teoría, se cree que la unión incluye la formación de un complejo entre el agente y un receptor presente sobre la célula diana. Se cree que la formación de un complejo induce la internalización del agente a través de un mecanismo de liberación mediado por el receptor, tal como el utilizado por los virus eucarióticos naturales (por ejemplo los adenovirus).

El término "asociado" significa cualquier interacción entre el resto de unión y el fago, de tal forma que el resto de unión es capaz de dirigir el fago a la célula de interés, y cuando es así dirigido, el fago puede ser liberado dentro de la célula. Cualquier otro fago puede asociarse con uno o más restos de unión. Cuando un fago determinado se asocia con más de un resto de unión, cada uno de esos restos puede unirse a un tipo celular diferente. Alternativamente, cada resto de unión preferiblemente se une al mismo tipo de células, aunque cada uno puede reconocer un lugar diferente sobre el mismo tipo de célula.

El término "lisis" se utiliza en esta especificación para incluir la destrucción del microorganismo a través del daño o de la ruptura de la pared de la célula del microorganismo. Sin embargo, también se pretende incluir cualquier acción del fago que produzca detención del crecimiento y/o multiplicación del microorganismo intracelular. En contraste con los fagos de la presente invención, que se emplean para combatir infecciones microbianas intracelulares, produciendo la lisis del microorganismo en cuestión, los vectores bacteriófagos empleados por la técnica anterior en los regímenes de terapia génica no son líticos frente a los microorganismos. Los vectores bacteriófagos convencionales en terapia génica, son no-líticos frente a los microorganismos, para asegurar que la flora bacteriana natural de un hospedante mamífero no se afecta por el bacteriófago durante los regímenes de tratamiento de transferencia genética. A este respecto, los bacteriófagos de la terapia génica convencional se convierten frecuentemente en abortadores del crecimiento lítico, antes de su utilización en regímenes de terapia génica. Esto puede conseguirse, por ejemplo, modificando proteínas de la cola del bacteriófago que se requieren para la transducción natural del fago, de tal forma que el fago no es funcional en un hospedante procariótico, o haciendo incapaz al bacteriófago, de otra forma, de mediar la inyección de material genético en una célula hospedante eucariótica. En contraste, los fagos de la presente invención son capaces de realizar transducción natural de fago, y de efectuar la lisis de un microorganismo.

La referencia a los fagos a lo largo de esta especificación incluye fagos recombinantes y sus derivados, que son capaces de producir lisis de un microorganismo.

En relación a una realización específica de la invención, descrita más adelante en mayor detalle, el resto dirigible a diana es un ligando para un receptor de superficie celular y está físicamente o químicamente asociado con el fago. Esta combinación resto dirigible a diana-fago se administra a células infectadas por un microorganismo intracelular, y el fago penetra en las células y lisa el microorganismo dentro de esas células. En el caso de que el microorganismo esté localizado dentro de un compartimiento intracelular o una vesícula, el fago puede también penetrar en el compartimiento interno o en la vesícula. Se prefiere además que el resto dirigible a diana se una a un compartimiento interno o una vesícula en la célula, donde le microorganismo pueda residir. Así, el resto dirigible a diana puede ser un ligando para un receptor sobre la superficie de un compartimiento interno o una vesícula. Después de la internalización del fago dentro de una célula diana, la presencia de un resto dirigible a diana para un receptor sobre la superficie de un compartimiento interno o una vesícula, facilita la entrada del fago en el compartimiento interno o una vesícula donde, una vez dentro, puede ejercer un efecto lítico sobre el microorganismo que reside dentro del compartimiento interno o la vesícula.

El resto dirigible a diana para un receptor de superficie celular y el resto dirigible a diana para un receptor sobre la superficie de un compartimiento interno o una vesícula puede ser el mismo o diferente. En la última realización, los agentes de la presente invención pueden ser modificados de tal forma que el resto dirigible a diana para el receptor del compartimiento interno o la vesícula, sea solo funcional después de la entrada del fago en la célula diana. Esto puede conseguirse, por ejemplo, empleando un promotor específico de célula, para asegurar que el resto dirigible a diana para el receptor sobre la superficie celular del compartimiento interno o la vesícula se exprese solo después de que el fago se ha liberado al tipo celular específico. Alternativamente, el resto dirigible a diana para el receptor sobre la superficie del compartimiento interno o la vesícula puede anularse (por ejemplo, mediante impedimento estérico) sobre la superficie del fago, antes de su utilización según la presente invención. Sin embargo, el resto dirigible a diana para el receptor sobre la superficie del compartimiento interno o la vesícula, puede hacerse accesible (por ejemplo mediante escisión u otra modificación del resto dirigible a diana para el receptor de superficie celular), durante el proceso de internalización, después de la unión del agente a la célula diana.

En una realización de la presente invención, una vez que el fago de la presente invención se ha liberado a la célula diana de interés, permanece como una entidad separada y no se integra (ni ninguna de sus partes) en el genoma de la célula diana.

En otra realización, el fago no contiene sustancialmente ácido nucleico exógeno (es decir, no de fago). En una realización más, el fago no contiene sustancialmente ácido nucleico exógeno excepto que el que codifica el resto dirigible a diana.

En una realización, el fago no contiene sustancialmente polinucleótidos terapéuticos exógenos capaces de mediar un beneficio terapéutico, en un recipiente del polinucleótido o sus productos. Un "producto polinucleótido terapéutico" se refiere a una molécula producida como resultado de la trascripción o la traducción del polinucleótido terapéutico. Los productos polinucleótidos terapéuticos incluyen productos de trascripción (por ejemplo, mRNA anti-sentido o RNA catalítico), y productos de traducción (por ejemplo proteínas o péptidos) del polinucleótido terapéutico.

El resto dirigible a diana puede estar químicamente ligado al fago. Esto puede conseguirse, por ejemplo, a través de una molécula de unión (por ejemplo un péptido corto), o mediante otros medios covalentes, por ejemplo a través de un puente disulfuro. El resto dirigible a diana puede unirse a cualquier parte del fago. La fusión entre un resto dirigible a diana y un fago no debería impedir la unión del resto dirigible a diana al receptor de membrana celular, ni la unión del fago a su receptor bacteriano. En relación al resto dirigible a diana, el procedimiento de unión química no debería alterar el lugar de unión al receptor de la célula, por ejemplo, alterando su conformación o imponiendo una rigidez estructural. La unión química de la transferrina ilustrada en la presente solicitud no previene su unión a su receptor. El resto dirigible a diana seleccionado preferiblemente demuestra estabilidad conformacional. La construcción de unión química preferiblemente coloca al resto dirigible a diana a una distancia del cuerpo del fago suficiente para proporcionar al resto dirigible a diana un grado de flexibilidad de rotación, de tal forma que se preserve la interacción máxima del resto dirigible a diana con su receptor. El medio preferido de unión química es el entrecruzamiento heterofuncional a través de un puente disulfuro.

Alternativamente, el resto dirigible a diana puede mezclarse físicamente con el fago. En este caso, el resto dirigible a diana puede absorberse físicamente en el fago mediante, por ejemplo, puentes de hidrógeno, puentes hidrófobos/hidrófilos, fuerzas de van der Waal, fuerzas electrostáticas y otras asociaciones cargadas. Por ejemplo, el fago puede llevar una carga de superficie negativa, y el resto dirigible a diana, y entonces el resto dirigible a diana debería llevar preferiblemente una carga de superficie positiva. Alternativamente, al pH seleccionado (por ejemplo pH 7-8, preferiblemente pH aproximado de 7,5), el fago lleva una carga positiva suficiente para unirse a un resto dirigible a diana cargado más negativamente.

Hay varias formas de unión química del resto dirigible a diana al fago a través de un puente disulfuro, ejemplos de las cuales se exponen más adelante. Mientras que la transferrina (Tf) se ilustra más adelante como el resto dirigible a diana, los mismos medios de unión son igualmente aplicables a otros tipos de restos diana.

Una realización es primero introducir grupos sulfidrilos libres (-SH) en la molécula de transferrina, que no tiene tales grupos en su estado nativo. Esto puede hacerse, por ejemplo, mediante tiolación de uno o más grupos amino libres de la molécula de transferrina con un reactivo (por ejemplo, 2-iminotiolano), que modifica estos grupos e introduce grupos -SH en estas posiciones (esto lleva a Tf-SH). Cambiando la relación de transferrina a 2-iminotiolano, la temperatura y el pH de la reacción, pueden conseguirse modificaciones que no impedirán la unión de la transferrina a su receptor. Preferiblemente se modifican así 5-10 grupos SH por molécula de Tf. Después, la transferrina modificada se purifica del reactivo de bajo peso molecular mediante filtración en gel, por ejemplo, con una columna de Sephadex G-50, y se concentra hasta alrededor de 1-3 mg/ml sobre una membrana de microfiltración con una precisión d 30 kDa.

El fago se trata primero mezclándolo con un agente de entrecruzamiento hetero-bifuncional (por ejemplo Sulfo-SMCC, carboxilato de sulfosuccinilmidil 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1), que se une covalentemente a grupos NH_{2} libres sobre el fago, dejando en la solución fagos que tienen grupos maleimido activos que son capaces de reaccionar con un grupo -SH de la transferrina tiolada. El grado de modificación del fago puede controlarse mediante la razón entre el agente de entrecruzamiento y el fago. Esta reacción debería tener lugar preferiblemente a una temperatura en el intervalo entre 4 y 15ºC, para preservar la estabilidad del fago, y para proporcionar una buena tasa de modificación. Al final de la reacción, el fago modificado se aísla de la mezcla de reacción mediante filtración en gel sobre una columna de Sepharose 6B y se concentra mediante filtración de membrana.

En la siguiente etapa, la Tf-SH se mezcla con un fago activado y el producto (Tf-S-S-ligador-Fago) se aísla de nuevo de la Tf-SH mediante filtración en gel en la misma columna. Puede conseguirse presencia de fago que no ha reaccionado, ya que éste solo puede aumentar la actividad biológica de la preparación final.

Otra estrategia de desarrollo de producto Tf-S-S-ligador-Fago, puede incluir la activación de grupos NH_{2} libres de Tf, y entrecruzar la trasnferrina activada con grupos SH sobre la superficie del fago. El resultado de este proceso depende de la disponibilidad y la accesibilidad de los grupos -SH sobre la superficie del fago.

La formación de agregados físicos Tf-fago, depende principalmente de la carga electrostática al pH de la mezcla (este se toma preferiblemente como el pH fisiológico).

La presente invención tiene aplicación en el tratamiento de cualquier microorganismo dentro de una célula. Al utilizar la invención, un fago capaz de lisar el microorganismo es identificado y asociado con un resto dirigible a diana capaz de dirigir al fago a la célula infectada, preferiblemente al compartimiento específico de la célula infectada que contiene un agente infeccioso. Así, el agente de la presente invención puede emplearse para tratar una infección intracelular por un virus o por una bacteria. En una realización, esto puede conseguirse mediante selección de un resto dirigible a diana que es el mismo que el receptor empleado por el agente infeccioso de interés. El agente de la presente invención seguiría por lo tanto la misma ruta intracelular que el agente infeccioso. Como ejemplo, los receptores de complemento CR1 y CR3 son conocidos por ser la puerta de entrada de la infección por M. tuberculosis, y de esta forma, componentes de complemento tales como C2a y C3b son candidatos a ser restos diana para modificación de fagos. Otro candidato que puede ser internalizado a través de CR3 es la hemaglutinina de Bordetella pertussis. Otro grupo de restos diana comprende los utilizados por agentes infecciosos durante su persistencia intracelular y/o que se requieren para su replicación. La transferrina es un ejemplo de dicho resto dirigible a diana. Esta proteína se requiere para proporcionar hierro a la M. tuberculosis, que es crítico para la supervivencia bacteriana intracelular.

La presente invención es adecuada para tratar un número de infecciones intracelulares. Estos incluyen infecciones causadas por Salmonella, Yersinia, Shigella, Campylobacter y Chlamidia. La Salmonella y la Yersinia pueden sobrevivir dentro de las células de la mucosa del tracto gastrointestinal y en los fibroblastos, proporcionando material antigénico continuamente a la circulación sanguínea, y estimulando la inflamación crónica, lo que lleva al desarrollo de artritis. También las infecciones causadas por la supervivencia de la Legionella pneumophila dentro de los macrófagos alveolares y las células epiteliales; las infecciones causadas por la supervivencia de la Listeria monocytogenes dentro del citosol celular; las infecciones causadas por un protozoo intracelular como Toxoplasma gondii; y las infecciones causadas por la supervivencia intracelular de las especies de Bordetella (macrófagos), Staphylococcus aureus (células epiteliales), y los estreptococos del grupo B (macrófagos). Algunas de estas infecciones son exclusivamente intracelulares, y otras tienen componente tanto intracelular como extracelular. Sin embargo, es el ciclo de supervivencia intracelular de la infección bacteriana lo que se sospecha que es el principal factor de apoyo para la progresión de la enfermedad.

La presente invención también es aplicable para la supresión de la persistencia intracelular, por ejemplo, dentro de los macrófagos de otras bacterias tales como Leishmania donovani, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis y otras especies de bordetellas, estreptococos del grupo B, especies de Salmonella, Chlamydia y Borrelia burdogferi. Esto puede conseguirse mediante la utilización del resto de liberación específico de macrófagos y un bacteriófago específico para el microorganismo.

La presente invención puede utilizarse contra virus intracelulares. Puede haber una ventaja en la utilización de un resto dirigible a diana ligado, por ejemplo a un anticuerpo contra una proteína viral específica o contra un fragmento corto de DNA anti-sentido. Dicha construcción de fusión puede liberarse en el interior de una célula diana como se ha descrito previamente.

Cuando el microorganismo es una bacteria, el fago para utilizar en el agente de la presente invención es un bacteriófago. Los bacteriófagos son fagos que parasitan bacterias. Típicamente comprenden una cabeza que contiene material genético (generalmente DNA, aunque ocasionalmente es RNA), encerrado por una pared de proteínas que generalmente se prolonga en el hueco de la cola. Un bacteriófago inicia la infección pegándose a sí mismo por su cola a la pared de la célula bacteriana. A través de una acción enzimática, la pared es perforada y el material genético del bacteriófago penetra a través de la pared en el interior de la célula bacteriana. El material genético del bacteriófago entonces organiza a la bacteria para producir más material genético de bacteriófagos, que se ensambla con la cabeza y la cola del bacteriófago para formar partículas ensambladas. Estas partículas ensambladas se liberan después por lisis de la célula bacteriana hospedante. Los bacteriófagos son típicamente altamente específicos, e infectan solo una cepa o especie bacteriana.

En una realización, el bacteriófago es preferiblemente un bacteriófago lítico.

El bacteriófago es preferiblemente un micobacteriófago. El micobacteriófago es preferiblemente específico para una especie particular de micobacteria. Más preferiblemente, el micobacteriófago se selecciona de un grupo que consiste en los micobacteriófagos líticos L29, D34, DS-6A.

Durante la infección por micobacterias, las bacterias penetran en los macrófagos a través de la fagocitosis mediada por receptor, que puede incluir varios receptores específicos de micobacterias sobre la membrana del macrófago. Después de la interacción inicial con los receptores, las micobacterias entran en el fagosoma precoz, detienen su maduración y lo secuestran de las organelas fagocítica terminales, por ejemplo, los lisosomas. Esto previene la fusión del fagosoma infectado con el lisosoma y la lisis posterior de la micobacteria dirigida por el lisosoma. A través de este mecanismo es como la micobacteria produce una infección intracelular dentro de una vesícula del macrófago y evita el sistema inmune del hospedante.

Las micobacterias infectan monolitos y macrófagos. Así, cuando se selecciona un resto dirigible a diana para utilizar en un agente para tratar una infección celular por micobacterias, el resto dirigible a diana se unirá a un monolito y/o a un macrófago.

Restos diana adecuados incluyen hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis, que se une al receptor de complemento CR3, y puede internalizarse a través de un mecanismo de endocitosis mediado por receptor; componente C3 del complemento; anticuerpo anti C3 que puede formar un agente capaz de unirse a C3 en sueros humanos, y de dirigir la internalización del fago a través del receptor CR3; y ligandos de receptores de macrófagos específicos para micobacterias (por ejemplo, receptor de manosa, receptor de proteína surfactante, CD14 etc), que pueden unirse a receptores y ser internalizados. Una molécula de transferrina o una de sus partes o uno de sus mutantes o derivados es un resto dirigible a diana preferido. Para detalles de la secuencia de la transferrina, se hace referencia a Uzan, G., Frain, M., Park, I., Besmond, C., Maessen, G., Trepat, G.S., Zakin, M.M., y Kahn, A. (1984) Molecular cloning and sequence análisis of cDNA for human transferrin, Biochem. Biophys. Res. Común. 119, 1; 273-281; y Welch, S. (1990). A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species, Comp. Biochem. Physiol. -B 97(3); 417-27.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar el agente según las definiciones anteriores, que comprende poner en contacto el resto dirigible a diana y el fago, de tal forma que el resto dirigible a diana se convierte en asociado al fago.

Puede fácilmente producirse una gran cantidad de fago. Ahora se hace referencia a la producción de micobacteriófagos, aunque serían aplicables procedimientos de escala similares igualmente para otros fagos.

El stock de fago puede producirse mediante la infección de un cultivo líquido de M. tuberculosis u otra cepa auxiliar de micobacteria, eliminando los detritus celulares mediante centrifugación, concentración de fago (por ejemplo mediante filtración de membrana, precipitación con PEG, centrifugación etc.,) seguido de purificación del fago (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, sales, etc.,), que pueden interferir con su modificación química. Este proceso puede escalarse fácilmente, utilizando instrumentos de filtración y cromatografía, con los apoyos requeridos.

El stock del fago puede después mezclarse con el resto dirigible a diana de interés.

La transferrina se ilustra ahora simplemente como un ejemplo de resto dirigible a diana. La formación de puentes mediante absorción física requiere solamente una mezcla de fago y resto dirigible a diana que tengan puntos isoeléctricos suficientemente diferentes (por ejemplo transferrina, cuya molécula tiene un pI = 5,5, y un fago con pI superior a 7). El complejo Tf-fago aparece estable bajo condiciones fisiológicas y puede separarse fácilmente de la Tf libre. La presencia de fago libre puede conseguirse ya que solo aumentará la actividad biológica de la preparación.

Según un tercer aspecto de la presente invención, el agente se prepara mediante formación de puentes desde un resto dirigible a diana hasta un fago. Los ejemplos de procedimientos preferidos para la formación de puentes se ha discutido previamente.

Según un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un micobacteriófago quimérico capaz de producir lisis de un microorganismo dentro de una célula, que comprende un resto dirigible a diana capaz de unirse a la célula como parte de una proteína de cola o de cubierta del fago.

Según un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar el fago quimérico descrito anteriormente. Los micobacteriófagos se ilustran como un ejemplo de este aspecto de la presente invención. Utilizando micobacteriófagos cuyos genomas han sido completamente secuenciados y caracterizados (por ejemplo los fagos L5 o d29), pueden generarse cebadores para identificar dominios de DNA que codifican proteínas de superficie de membrana "funcionalmente silentes", dentro del fago de interés. Estas pueden escindirse y reemplazarse con un dominio de DNA que codifica el resto de unión al receptor (por ejemplo el dominio de unión a la transferrina). Según esto, pueden producirse fagos quiméricos nuevos "diseñados", que combinan la función de replicación y la función de unión al receptor. Los fagos pueden acumularse como se discutió anteriormente, y utilizados como agentes terapéuticos contra patógenos intracelulares.

Según un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un agente de la presente invención o un fago quimérico de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición es preferiblemente una mezcla líquida de agente o fago quimérico y un estabilizador, que estabilizará el fago durante el almacenamiento en un nebulizador. La mezcla también puede contener otro agente que prevendrá la agregación del fago.

Muchas infecciones intracelulares causadas por microorganismos se contraen por inhalación. Muchas de tales infecciones intracelulares están concentradas por lo tanto en el tejido pulmonar y alrededores. En particular, la tuberculosis (causada por el M. tuberculosis) se contrae de esta forma. Según una realización preferida, la composición según la presente invención se proporciona en forma de aerosol.

A continuación se hace referencia al siguiente ejemplo.

Ejemplo 1. Fago anti-M. tuberculosis lítico, modificado, como agente para el tratamiento de la tuberculosis

Este ejemplo describe la preparación de un fago lítico anti-M. tuberculosis (fago D34), que ha sido modificado mediante absorción o químicamente, para llevar un polipéptido de superficie que proporciona unión del fago, internalización y liberación en el fagosoma en el interior de los monocitos/macrófagos infectados. Una vez dentro del fagosoma, el fago muestra sus características líticas y daña o lisa las micobacterias, intrafagosómicas.

Cuando células humanas monocito/macrofágicas U937 infectadas con M. phlei se trataron con una muestra de fago modificado (columnas 3 y 4 en la Tabla 1), el número de micobacterias intracelulares vivas recogidas de lisados de macrófagos, era menor comparado con el de lisados no tratados con fago, o tratados con un fago no modificado (columnas 5 y 2 en la Tabla 1). El mayor efecto se consiguió cuando el resto dirigible a diana (transferrina) se añadió al fago mediante absorción física. Como resultado de una modificación física, el fago era dos veces más efectivo, comparado con el fago no modificado. El último nivel se sabe que es al menos igual al mejor resultado conseguido con antibióticos, por ejemplo, isoniazida.

Estos datos in vitro demuestran que la modificación del fago con un resto dirigible a diana específico de liberación, aumenta la capacidad del fago para reducir la carga bacteriana dentro de los macrófagos infectados. La terapia con fagos modificados puede ser eficaz contra la infección por M. tuberculosis, y ayudará al sistema inmune a neutralizar y controlar la infección y, eventualmente, la tuberculosis.

TABLA 1 El efecto del fago modificado con transferrina (Trf) y no modificado, sobre la infección de células U937 con Mycobacterium phlei

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Se utilizaron células U937 diferenciadas (4,8 x 10^{5} células/ml, 98% vivas).

Los monocitos/macrófagos infectados con M. phlei anteriores en el ejemplo 1, se suspendieron durante 1 hora en medio RPMI, que contenía 4 mg/ml de gentamicina, se lavaron 3 veces con PBS y se resuspendieron en RPMI antes del tratamiento con el fago modificado. Esto se hizo para asegurar que las bacterias M. phlei unidas a la superficie o libres (es decir, las micobacteria no localizadas intracelularmente), no enmascararan los resultados de del ejemplo.

Claims (16)

1. Un agente para producir la lisis de un microorganismo que reside en una célula diana, que comprende un resto dirigible a diana capaz de unirse a la célula diana, y un micobacteriófago asociado con el resto dirigible a diana, en el que después de la unión del resto dirigible a diana a la célula, el micobacteriófago penetra en la célula diana y efectúa la lisis de un microorganismo que reside dentro de la célula diana.

2. Un agente según la reivindicación 1, en el que el resto dirigible a diana es un ligando para un receptor situado sobre la superficie de la célula.

3. Un agente según la reivindicación 2, en el que el resto dirigible a diana es una molécula de transferrina, o una de sus partes o uno de sus mutantes o de sus derivados, capaz de unirse al receptor de la transferrina sobre la célula.

4. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el que el microorganismo es una bacteria.

5. Un agente según la reivindicación 4, en el que la bacteria es Mycobacterium tuberculosis.

6. Un agente según la reivindicación 1, en el que el micobacteriófago se selecciona de un grupo que consiste en L29, D34 y DS-6A.

7. Un método para preparar un agente según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende poner en contacto un resto dirigible a diana y un micobacteriófago de tal forma que el resto dirigible a diana se asocie con el micobacteriófago.

8. Un método para preparar un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende formar un puente entre el resto dirigible a diana y el micobacteriófago.

9. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el agente es un micobacteriófago quimérico, y el resto dirigible a diana es parte de una proteína de cola o de cubierta de dicho micobacteriófago.

10. Un método para preparar un agente según la reivindicación 9, que comprende la expresión de una secuencia de ácido nucleico del micobacteriófago, ligada operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica el resto dirigible a diana, y el ensamblaje del agente.

11. Una construcción de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de la reivindicación 9.

12. Una composición que comprende el agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la reivindicación 9, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición según la reivindicación 12, para administración por aerosol.

14. La utilización de un agente en la fabricación de un medicamento para tratar una infección intracelular por un microorganismo, en la que dicho agente comprende un resto dirigible a diana capaz de unirse a la célula diana, y un fago asociado con el resto dirigible a diana, y en la que después de la unión del resto dirigible a diana a la célula, el fago penetra en la célula diana y efectúa la lisis de un microorganismo que reside dentro de la célula diana.

15. La utilización de un resto dirigible a diana capaz de unirse a una célula, en la fabricación de un medicamento para liberar un fago lítico contra un microorganismo en el interior de la célula.

16. La utilización de un fago lítico en la fabricación de un medicamento para tratamiento y/o alivio de una infección intracelular, en la que dicho medicamento incluye un resto dirigible a diana capaz de unirse a una célula, y que está asociado con dicho fago lítico.