ES2220530T3

ES2220530T3 - Materiales de implantes reabsorbibles.

Info

Publication number: ES2220530T3
Application number: ES00960099T
Authority: ES
Inventors: Ralph T. Francis; Qing Hong Zhao; Amy Desmith; B. Nicholas Oray
Original assignee: Synovis Life Technologies Inc
Current assignee: Synovis Life Technologies Inc
Priority date: 1999-09-15
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2020-09-14
Also published as: US6312474B1; AU772182B2; ATE265241T1; US6652594B2; EP1212105B1; DE60010287D1; AU7131400A; US20020138152A1; JP2012040415A; CA2384961C; WO2001019423A1; EP1212105A1; CA2384961A1; JP5362937B2; DE60010287T2; JP2003509129A; US20040107006A1

Abstract

Material de implante reabsorbible, remodelable, que comprende un tejido de mamífero esteril, no reticulado, descelularizado y purificado, que tiene un porcentaje importante de sus grupos amina disponibles alquilado.

Description

Materiales de implantes reabsorbibles.

La invención se refiere a materiales que se utilizan como implantes dentro del cuerpo, y en particular a materiales reabsorbibles y remodelables para dicho uso.

Existen en la actualidad diversos materiales reabsorbibles (que suelen designarse con el nombre de absorbibles o "remodelables"), que se utilizan en aplicaciones protésicas, como por ejemplo parches, implantes y/o componentes de dispositivos protésicos.

Se utilizan en diversos campos de la medicina materiales sintéticos reabsorbibles a base, por ejemplo, de poliesteres, poliláctidos y poliglucólidos (Véase por ejemplo Ashammaki, N.A. J. Biomed. Mater. Res., 33:297-303; 1996). Existen versiones comerciales de estos materiales, con las marcas Vicryl® (Ethicon, Inc) y Dexon® (Davis & Geck, Inc). La gradual descomposición de estos polímeros es facilitada por la hidrólisis, y catalizada por la acción química de los tejidos anfitriones (Hanbrough, J.F., et al., J. Burn Care Rehab., 14: 485-494; 1993). Estos materiales se pueden fabricar como membranas o malla tejida en el caso de fabricación de sutura reabsorbible.

Si bien los materiales sintéticos reabsorbibles son fenómenos más bien recientes, se han utilizado durante muchos años materiales colágenos como injertos protésicos, como en el caso de dura madre humana liofilizada, que data de 1954. La práctica común durante muchos años ha sido la reticulación de estos materiales colágenos con un agente como glutaraldehido, con el fin de disminuir la antigenia de un xenoinjerto, aumentando su resistencia a la degradación enzimática producida por las respuestas del tejido anfitrión (Gratzer, P.F., et al., J. Biomed. Mater. Res., 31: 533-543; 1996). También se han utilizado para estos fines compuestos poliepoxi, que son sin embargo más estables con respecto las aminas alquiladas resultantes en el colágeno (Sung, H-W., et al., J. Biomater. Sci. Polymer Edn; 8: 587-600; 1997). Si bien los tejidos reticulados funcionan bien como injertos a largo plazo, no son reabsorbibles y por lo tanto no promueven la remodelación del tejido o, a su vez, la eventual sustitución de un injerto por el cuerpo mismo.

Aesculap AG & Co. (B. Braun Surgical) ofrece productos con la marca comercial de Lyoplant®, en forma de implantación reabsorbible a base de pericardio bovino para dura mater. El producto Lyoplant®, se fabrica en un proceso que implica la eliminación mecánica de tejido conjuntivo y graso adherente, el tratamiento químico para inactivar las enzimas y los patógenos potenciales, la liofilización, el corte a diversos tamaños, el envasado y la esterilización terminal con óxido de etileno. El producto está indicado en las utilizaciones para la profilaxis de defectos durales cerebrales y del cerebelo, para la duraplastia descompresora en caso de aumento de la presión intracraneal, para la profilaxis de los defectos medulares durales y para la duraplastia medular descompresora. Se ha comprobado que este material se ha remodelado totalmente un año después de la implantación.

Tutogen Medical, Inc vende productos de pericardio procesados con la marca comercial Tutoplast®, en forma de pericardio humano preservado gamma-irradiado, deshidratado por disolvente. El procesamiento del tejido Tutoplast® supone la limpieza concienzuda, el procesamiento, 1 deshidratación y L conservación. Al parecer, el proceso no deja ningún residuo dañino y reduce al mínimo el potencial antígeno. El tejido conjuntivo colágeno con fibras multidireccionales mantiene la resistencia mecánica y la elasticidad del pericardio originario y proporciona la estructura de formación básica para soportar la implantación mediante nuevo tejido endógeno. Este tejido resulta indicado para su utilización en toda una variedad de aplicaciones quirúrgicas, que incluyen la duraplastia (como sustituto de la dura madre humana) y en la cirugía abdominal, urológica, oftalmológica y vascular. El proceso de absorción y la nueva formación de tejido endógeno comienza de uno a dos días después de la implantación y sigue durante semanas, meses o años, según el tamaño del injerto y el grado de respuesta del lugar del injerto. Mentor Corporation ha pactado una alianza estratégica con Tutugen Medical, Inc., para utilizar la tecnología Tutoplast® para fabricar asas reabsorbibles para los casos de incontinencia urinaria (Suspend^{TM})

En la literatura de patentes, se describe toda una variedad de otros usos de materiales reabsorbibles. Véase por ejemplo la patente US n°. 5.895.420 (Mirsch, II, et al., "Bioresorbable Heart Valve Support") (soporte de válvula cardiaca bioreabsorbible), que se refiere a bioprótesis endovasculares de válvula cardiaca formadas con materiales reabsorbibles. Estas endoprótesis vasculares pueden estar configuradas como vaina o armazones con el contorno en la forma de un injerto valvular. Las endoprótesis vasculares son reabsorbidas con el tiempo por el paciente, dejando una válvula "sin endoprótesis vascular" funcional, con características hemodinámicas mejoradas, si se compara con los implantes de válvulas con endoprótesis vascular.

Se ha sugerido o propuesto otros muchos materiales reabsorbibles para su utilización con implantes vasculares o no vasculares. Por ejemplo, Goldberg et al., patente US 5.085.629 describe una endoprótesis vascular biodegradable de infusión, que se utiliza en el tratamiento de obstrucciones ureterales. Stack, et al., patente US 5.306.286 describe una endoprótesis absorbible, que se coloca dentro de un vaso sanguíneo durante la angioplastia coronaria. Duran, patente US 5.376.112 describe un anillo de anuloplastia, que se implanta en el corazón para funcionar junto con la válvula cardiaca original.

En otro aspecto, la patente US 5.837.278 (Geistlich, et al., "Resorbable Collagen Membrane for Use in Guided Tissue Regeneration") (Membrana colágena reabsorbible que se utiliza en la regeneración guiada del tejido) describe la utilización de una membrana que contiene colágeno en la regeneración guiada de tejido. La patente ofrece una membrana colágena reabsorbible, que se utiliza en la regeneración guiada de tejido, donde una cara de la membrana es fibrosa, y permite por lo tanto el crecimiento celular en la misma y la cara opuesta de la membrana es lisa, por lo que inhibe la adherencia de las células sobre la misma.

Finalmente, véase la patente US n°. 5.413.798 (Scholl, et al.), que describe un proceso para el tratamiento del tejido pericardial bovino para aumentar la resistencia a la degradación biológica mediante un proceso químico de vía húmeda. La utilización del tejido se ejemplifica en la forma de un implante que, a las 3 y 6 semanas después de la implantación estaba bien integrado, de forma que ya no se podía distinguir de la dura madre autóctona (revitalizada por fibrocitos y atravesada por vasos sanguíneos en las zonas marginales). El lado interno del implante está revestido con el mismo tipo de célula que la autodura madre.

En relación con otro tema, algunos artículos describen la investigación básica destinada a estudiar el efecto de los agentes de alquilación en materiales como el colágeno. Véase por ejemplo, Sung, H.W., et al., J. Biomed. Mater. Res. 37:376-383 (1997) y Tu, R., et al., J. Biomed. Mater. Res., 28:677-684 (1994). No obstante, según tiene entendido el solicitante, ninguna de estas referencias sugiere la forma en que dichos materiales se pueden utilizar in vivo ni tampoco abordan la cuestión de si estos materiales pueden ser tolerados y no hablemos de reabsorbidos y remodelados por el cuerpo.

El presente cesionario es reconocido como líder en el desarrollo y la fabricación de materiales a base de pericardio. Véase por ejemplo las patentes US 5.752.965, 5.575. 803, 5.549.628, 5.503.638, y 4.915.113 así como la solicitud internacional US98/25674, cuyas revelaciones se incorporan aquí a modo de referencia. En general, los materiales de pericardio son reticulados, utilizando por ejemplo glutaraldehido y por consiguiente se suelen considerar no reabsorbibles. Dichos materiales se han utilizado en toda una serie de aplicaciones, como parches, suturas y elementos de soporte de grapas y compresas.

La presente invención ofrece un tejido de mamífero purificado, descelularizado, no reticulado (por ejemplo pericardio de bovino), que tiene una utilización particular como material implantable, de forma que resulta reabsorbible y remodelable. El material se prepara mediante la alquilación de los grupos amino primarios de tejido natural, de forma suficiente para reducir la antigenia del tejido, y, a su vez, de forma que permita utilizar in vivo el tejido tratado y sin reticulación, permitiéndole que se pueda reabsorber.

El material se puede utilizar por ejemplo, en la reparación quirúrgica de deficiencias de partes blandas durante un período de tiempo, mientras el implante mismo es remodelado o absorbido gradualmente por el anfitrión. En un aspecto relacionado con lo anterior, la invención ofrece un método de preparación de un material de este tipo, así como un método de utilización de dicho material para la reparación quirúrgica. Tal como se utiliza aquí, en relación con un material de la presente invención, la palabra "reabsorber" y las inflexiones de la misma se refieren a un material que, una vez implantado in vivo, es absorbido por el cuerpo con el paso del tiempo y sin efectos nocivos excesivos sobre o dentro del cuerpo mismo. La palabra "remodelar" y las inflexiones de la misma, tal como se utiliza con respecto a un material de la presente invención, se referirá a un material reabsorbible adaptado, por ejemplo, debido a su ubicación y al método de implantación dentro del cuerpo, para favorecer y/o permitir que el cuerpo sustituya parte o la totalidad de la estructura y/o el funcionamiento del implante con tejido natural formado recientemente. Si bien no se pretende una subordinación a la teoría, por lo menos en algunas realizaciones de la presente invención, la remodelación parece producirse por procesos corporales graduales, en los cuales se reabsorben gradualmente partes sustanciales del material del implante mientras se mantiene in situ una red fibrosa inherente del implante. La red, a su vez, es utilizada por el cuerpo prácticamente como andamiaje para la generación de nuevo tejido o componentes de tejido.

En una realización preferida, la invención presenta un material implantable, reabsorbible, que comprende un tejido de mamífero no reticulado, descelularizado y purificado, con la mayoría de sus grupos amino libres sometidos a alquilación. En una realización particularmente preferida, el tejido se elige dentro del grupo formado por pericardio, peritoneo, fascia dentada, dura madre, dermis y submucosa del intestino delgado y el material ha sido sometido a alquilación por medio de un agente alquilante elegido dentro del grupo formado por compuestos de 1,2-epoxi-R, donde R es un grupo alquilo de hasta 6 átomos de carbono. Este material se puede proporcionar en cualquier forma adecuada, por ejemplo como hojas o cintas planas o texturadas y se puede adaptar para utilizarlo en una variedad de aplicaciones quirúrgicas, que incluyen las elegidas dentro del grupo formado por duraplastia, cirugía torácica, abdominal, urológica, oftalmológica, cardiaca y vascular.

Se puede obtener un tejido de la presente invención a partir de cualquier fuente adecuada, inclusive de mamíferos, por ejemplo en forma de tejido conjuntivo colágeno con fibras entrelazadas tridimensionalmente. Estos tejidos comprenden por lo general membranas serosas y fibroserosas. En una realización particularmente preferida, la procedencia del tejido se elige entre: pericardio bovino, peritoneo, fascia dentada, dura madre, dermis y submucosa del intestino delgado. En otra realización preferida, el tejido es pericardio bovino y se trata utilizando un método como el descrito aquí para proporcionar al tejido tratado una combinación óptima de biocompatibilidad, grosor y otras propiedades físicas y fisiológicas.

Los tejidos de la presente invención se pueden obtener a partir de dura madre, por ejemplo, para utilizarlos en aplicaciones neuroquirúrgicas. El tejido conjuntivo colágeno con fibras entrelazadas tridimensionales, una vez tratado en la forma descrita aquí, mantiene la resistencia multidireccional y mecánica de la dura madre originaria y proporciona la estructura formativa básica para soportar la sustitución por nuevo tejido endógeno.

Si bien es deseable reducir o eliminar propiedades antígenas de material basado en tejido xenográfico e incluso alográfico, que se va a implantar en un cuerpo, si se desea que el cuerpo absorba y/o remodele el material, no se puede realizar la reticulación. Para realizar de forma específica esta modificación de un material a base de colágeno, se utiliza por lo tanto un reactivo monofuncional. El reactivo es "monofuncional" en el sentido en el que está adaptado para reaccionar con, y por consiguiente terminar o "rematar" las funcionalidades amino disponibles de proteínas del tejido, aunque no seguirá reaccionando con grupos adyacentes. Un reactivo óptimo de la presente invención es preferentemente, por lo tanto, un compuesto relativamente pequeño y estructuralmente sencillo que, al reaccionar con grupos proteínicos tales como aminas, se unirá a estos grupos, aunque no alterará de otro modo las propiedades biológicas de la matriz colágena, en la medida en que el tejido resulte inadecuado para la utilización prevista.

En una realización particularmente prevista, se trata un tejido de la presente invención mediante un proceso que incluye la alquilación de un porcentaje considerable de sus grupos amino disponibles, en la medida suficiente para permitir la implantación y la utilización in vivo del tejido. De preferencia, se procesa un tejido mediante la alquilación de sus aminas de forma suficiente para que reaccione el 80% o más, de preferencia el 90% o más, y, todavía mejor el 95% o más de los grupos amino, presentes inicialmente. La eficacia y la magnitud de la alquilación se puede determinar de muy diversas formas, tal como se describe aquí, inclusive utilizando un ensayo a base de ninhidrina ("índice amina") para determinar un nivel comparativo de grupos aminos, antes y después del tratamiento (véase por ejemplo, Sung H-W, et al. Art. Org., 21:50-58; 1997. Sung, H-W, et al., J. Biomed. Mater. Res. 33:177-186. 1996). De preferencia, la eficacia y la magnitud del proceso de alquilación se evalúa también determinando las cantidades que no han reaccionado en la incubación por lote del agente de alquilación utilizado.

Se pueden utilizar agentes de alquilación preferidos, por ejemplo, con un pH comprendido entre 9 y 11 aproximadamente y una concentración comprendida ente 2% (v/v) y 5% (v/v) aproximadamente, exponiendo el tejido a una solución que contiene el agente como mínimo durante 48 horas.

Entre los agentes de alquilación preferidos, se encuentran pequeños agentes reactivos de alquilación de amina tales como formaldehído, y compuestos 1,2-epoxi. Los agentes epoxi ofrecen una ventaja sobre el formaldehído, debido a que tienden a producir aductos más estables en sus reacciones con aminas (Sung, H-W., et al., Biomater., 17:2357-2365; 1996). Los agentes 1,2-epoxi pueden reaccionar con una amina primaria con un pH alcalino, para producir una amina secundaria 2-hidroxi, extremadamente estable. Sin embargo, un aldehído tal como el formaldehído reacciona con una amina primaria para producir una aldimina de doble enlace reversible, marginalmente inestable (Giradot, J-M. and Giradot, M-N., J. Heart Valve Dis., 5:518-525; 1996).

Entre los diversos agentes 1,2-epoxi monofuncionales, se prefiere particularmente el óxido de propileno ("PO"), ya que posee propiedades que simplifican y vuelven eficaz su inclusión en un proceso material. Se ha utilizado durante muchos años óxido de propileno (epoxipropano) como esterilante, particularmente en estado gaseoso, aunque a temperatura ambiente existe en forma de líquido (Hart, A. and Brown, W., Appl. Microbiol., 28:1069-1070; 1975). Hace muchos años que se comprobó que el PO modifica directamente, en ciertas condiciones, los grupos de proteínas, carboxílicos, tiólicos, fenólicos y amino (Fraenkal-Conrat, H., J. Biol.. Chem., 154: 227-238; 1944). Como se ha demostrado con otros epóxidos, el óxido de propileno reacciona predominantemente con aminas con un pH alcalino. El colágeno se hincha con un pH alcalino, haciendo más accesible su alquilación con un agente soluble en agua tal como el óxido de propileno.

Otro reactivo epoxi monofunciónal preferido, que se utiliza en la presente invención es el metil glicidil éter, fabricado por Nagase Corp. De Osaka, Japón y que se vende con el nombre de Denacol® EX 131. Este producto tiene un peso molecular bajo, es soluble en agua y se ha comprobado que es un alquilador más potente de pericardio porcino que el formaldehído (Sung, H-W., et al., J. Biomed. Mater. Res., 35:147-155; 1997).

Además del "índice amina" se puede utilizar otro test para confirmar la modificación del tejido por un agente de alquilación de amina. La temperatura de desnaturalización (T_{d}) se utiliza frecuentemente para verificar la retículación de colágeno por un agente como glutaraldehido. Se suele observar que una vez realizada la reticulación química, el T_{d} aumenta notablemente, debido al parecer a una mayor estabilización de los enlaces de hidrógeno presentes en el colágeno. En cambio, tras la alquilación con un agente monofuncional, tal como óxido de propileno, el T_{d} disminuye notablemente. Este fenómeno se debe, al parecer, a la ramificación del polímero colágeno bajo la acción del agente de alquilación y la subsiguiente alteración de la matriz de colágeno (Tu, R., et al., J. Biomed. Mater. Res., 28:677-684; 1994).

En una realización preferida, se trata también un tejido de la presente invención con una base como hidróxido sódico (NaOH), con el objeto de disminuir la posibilidad ya mínima de transmisión de la Encefalopatía Bovina Espongiforme (BSE).

Los análisis histológicos de tejido no tratado con NaOH (pericardio, por ejemplo) revelan una descelularización virtualmente completa, debida a este tratamiento. Debido a que se sabe que el componente celular del tejido contiene la gran mayoría de la carga antígena (Courtman, D.W., et al., J. Biomed. Mater. Res., 28:655-666; 1994), el tratamiento de descelularización con NaOH puede complementar la utilización de un agente de alquilación en la reducción de la antigenia.

Se puede utilizar un tejido de la presente invención para fabricar un artículo protésico con una forma o configuración adecuada y unas dimensiones cualesquiera adecuadas para el uso previsto. Por ejemplo, el tejido se puede presentar y envasar en una configuración plana (por ejemplo hoja o en forma de cinta), con una de las dos superficies mayores o ambas, óptimamente texturadas o modificadas (por ejemplo por vínculo covalente, oclusión y/o absorción de factores biológicamente activos, agentes lubricosos, agentes antimicrobianos y similares).

En una realización preferida, un proceso de la presente invención incluye las etapas de:

a): obtención de pericardio de una fuente adecuada (por ejemplo, aprobada por USDA),

b): limpieza del tejido y opcionalmente, de preferencia, tratamiento del tejido, por ejemplo con el fin de descelularizarlo y/o reducir/eliminar el potencial grado de infección de BSE.

c): la alquilación del tejido (por ejemplo hidroxipropilación utilizando óxido de propileno) para obturar, un porcentaje considerable de grupos aminos disponibles (por ej., potencialmente reactivos) y, opcionalmen- te

d): procesamiento final, que incluye una o varias de las siguientes etapas: lavado, secado, esterilizado y envasado del tejido.

Los tejidos naturales que se pueden utilizar en el proceso de la presente invención cumplen, de preferencia, especificaciones rigurosas durante la exploración del donante y la prueba de laboratorio para reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas. El procesamiento del tejido incluye un procedimiento estricto, con control de calidad, una limpieza a fondo, procesamiento, deshidratación y conservación. El proceso no deja ningún residuo nocivo y reduce al mínimo el potencial antígeno. La esterilización se consigue de preferencia utilizando radiación de haces de electrones o gamma (por lo general 2,5 Mrad) o gas de óxido de etileno.

Un tejido tratado de la presente invención resulta indicado para su implantación con un espectro de indicaciones. El tejido conjuntivo colágeno de este tipo, que tiene fibras multidireccionales, puede conservar una cantidad importante de la resistencia mecánica y la elasticidad del pericardio originario, proporcionando al mismo tiempo la estructura básica de formación in situ para soportar la sustitución por nuevo tejido endógeno. Este tejido resulta indicado para su utilización en diversas aplicaciones quirúrgicas, inclusive la duraplastia (como sustituto de dura madre humana) así como en la cirugía torácica, abdominal, urológica, oftalmológica, cardiaca y vascular.

Deberá evitarse la implantación en zonas con infección activa o latente o síntomas de necrosis hística, así como en zonas con circulación deteriorada o cualquier trastorno que pueda suponer un riesgo inaceptable de complicaciones post-operatorias.

El tejido se puede empaquetar utilizando medios convencionales, de modo que el tejido y el contenido del envase permanezcan estériles y no pirógeno mientras no se abre y/o daña el envase. El injerto se tiene que utilizar antes de la fecha de caducidad. Las personas versadas en el arte se darán cuenta de la forma en que la colocación y fijación adecuada del tejido in situ pueden constituir factores críticos para evitar efectos potencialmente negativos sobre la vida útil del injerto. Un tejido de la presente invención se puede preparar y envasar con diversos tamaños (por ejemplo grosor, longitud y anchura). Las dimensiones del tejido utilizado deberán corresponder a la dimensión del defecto correspondiente.

Una vez implantado, el proceso de absorción ,y reformación de tejido endógeno comienza de uno a dos días después de la implantación y sigue durante semanas, meses o años, en función del tamaño del injerto y de la sensibilidad del lugar en que está el injerto. Se recomienda, en el caso de que se haya envasado en estado seco o deshidratado, volver a hidratar el tejido antes de utilizarlo, durante aproximadamente 2 a 30 minutos, según la consistencia deseada, utilizando una técnica aséptica/estéril. El cirujano deberá también controlar y seguir el efecto de la re-hidratación mediante inspección visual, tanto durante la rehidratación como durante el corte y la configuración del injerto. La implantación deberá realizarse de forma que los bordes libres del implante no se extiendan a zonas en las que la posibilidad de adhesión puede suponer un problema.

Se puede utilizar material de sutura absorbible o no absorbible, cola, etc. para mantener el tejido en su sitio. Para una sutura continua, se recomienda material de sutura absorbible y agujas redondas atraumáticas, mientras el diámetro de la sutura depende de la indicación quirúrgica. La sutura deberá colocarse a dos o tres milímetros del borde del injerto. Se obtienen mejores resultados doblando la sección de las zonas de sutura que se encuentran bajo presión moderada a alta.

Los tejidos de la presente invención presentan toda una diversidad de características y ventajas, inclusive el hecho de que se encuentran disponibles de inmediato para la cirugía y pueden ahorrar mucho tiempo de quirófano. Además, no existe ningún lugar secundario de intervención, lo cual supone menos estrés para el paciente, con el resultado de menor tiempo bajo anestesia, ni dolor o morbilidad para el donante y menos costes. Como se puede disponer de los tejidos en una amplia gama de tamaños, el cirujano puede elegir el tamaño que necesita, lo cual supone unos desperdicios mínimos. Al igual que ocurre con todos los productos biológicos, no es posible ofrecer una garantía absoluta de ausencia de enfermedades infecciosas contaminantes, tales como la hepatitis, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) o la Encefalopatía Bovina Espongiforme (BSE). Se ha comprobado que los tratamientos de preparación, tales como la utilización de NaOH en los casos de CJD y BSE son capaces de reducir el riesgo de transmisión y resultan particularmente útiles en combinación con un reconocimiento del donante y unas pruebas de laboratorio estrictos. Los tejidos tratados de la presente invención se pueden almacenar en un entorno limpio y seco y a temperaturas controladas entre 4º y 30°C (59° a 86°F).

Pruebas de colagenasa

La clase de enzima que recibe el nombre de colagenasa se ha utilizado durante muchos años para estudiar sus efectos en los biomateriales colágenos. La colagenasa bacteriana, por ejemplo de Clostridium histolyticum, se puede utilizar para predecir de forma exacta la propensión y la tasa de reabsorción de un material por un anfitrión mamífero (Yannas, I. V., et al., J. Biomed. Mater. Res., 9: 623-628; 1975). Como la modificación de colágeno por medio de un agente de reticulación se traduce en una susceptibilidad considerablemente reducida a la acción de la colagenasa, es importante que esta modificación no se realice en tejido que se va a reabsorber. No se comprende del todo el mecanismo mediante el cual la reticulación impide la actividad de la colagenasa. Los solicitantes han observado, sorprendentemente, que la colagenasa bacteriana puede, de hecho, degradar tejidos tratados (alquilados) de la presente invención. Por consiguiente, un tejido alquilado por un agente como PO posee propiedades pertinentes y funcionales y la prueba de colagenasa sigue siendo una herramienta útil para confirmar la utilidad de este tejido
tratado.

La prueba de colagenasa es una prueba basada en ninhidrina para la indicación de péptidos de colágenos solubles, producidos por la acción de la enzima colagenosa y se puede realizar del siguiente modo:

1. Pesar tejido del orden de 25-30 mg.

2. Añadir 3,0 ml de solución de colagenasa [0,01 mg/ml enzima colagenaza (Sigma, tipo 1A) en 50 mM de ácido N-tris [hidroximetil]metil-2 aminoetano sulfónico ("TES") tampón con 25 mM de cloruro cálcico, pH 7,4-
7,5].

3. Incubar a 37°C durante 24 a 96 horas.

4. En momentos señalados, incubar 100 \mul de solución de colagenasa y 1,0 ml de solución de ninhidrina [una parte 4% (w/v) de ninhidrina en etilen glicol monoetil éter con una parte de ácido cítrico 200 mM, 0,16% (w/v) de cloruro de estaño, pH 5,0] a 95-100°C durante 30 minutos.

5. Enfriar los tubos a temperatura ambiente.

6. Añadir 250 \mul de muestra de colagenasa a 1,0 ml de isopropanol 50%.

7. Agitadora vorticial y lectura de la absorbencia a 570nm.

8. La absorbencia 570 nm se divide por el peso del fragmento de tejido para obtener OD/mg. OD/mg es el valor de la cantidad de péptidos de colágeno que han sido degradados por la acción de la enzima colagenasa.

Los resultados de la prueba de colagenasa se determinan comparando la muestra con las muestras de control positivas (no tratadas) y negativas (reticuladas con glutaraldehido).

Índice de amina

El índice de amina se puede definir como el porcentaje de las aminas disponibles inicialmente que han sido modificadas (y convertidas prácticamente en no reactivas in vivo) por reacción con reactivos amina. Esta modificación hará que la amina sea incapaz de producir "morado de Ruhemann" cuando se introduce en ninhidrina, y la prueba correspondiente se puede realizar del siguiente modo:

1. Se añadieron 200 \mul de agua DI a 25-30 mg de tejido.

2. Añadir 1 ml de solución de ninhidrina a cada tubo.

3. Incubar los tubos 95-100°C durante 30-35 minutos.

4. Enfriar los tubos a temperatura ambiente.

5. Añadir 250 \mul de muestra a 1 ml de solución de isopropanol 50%.

6. Agitadora vorticial y lectura de absorbencia a 570 nm.

7. Se calcula el índice de amina.

Para calcular el porcentaje de las aminas originales modificadas, se utiliza la siguiente fórmula:

Indice \ de \ amina \ (%) = \frac{[* \ Control \ (OD/mg) \ - \ Muestra \ (OD/mg)]}{Control \ (OD/mg) \ \times \ 100}

Se calcula OD/mg dividiendo OD @ 570 por el peso del fragmento de tejido.

* El control es tejido no modificado.

Prueba de la determinación cuantitativa de agente de alquilación que no ha reaccionado

El objeto de la presente prueba es confirmar que, si bien no se suele alcanzar el 100% de la alquilación de amina, esto no es debido a la falta de un agente de alquilación adecuado. En realidad, la presente prueba se utiliza para confirmar que permanecen niveles detectables de agente de alquilación en la solución de incubación tras una exposición exhaustiva al tejido. Tras exponer el tejido a un agente de alquilación, se puede tomar muestra de la solución agente para determinar cuantitativamente el porcentaje restante. Esta prueba se realiza en parte con el objeto de evaluar la eficacia de la alquilación.

La determinación cuantitativa se evalúa utilizando una curva standard.

1. Se prepara 10 mM de solución de glicina añadiendo 0,0375 gramos de glicina a 50 ml de 0,2 M tampón de carbonato (Na^{+2}).

2. Se preparan patrones de óxido de propileno (PO) (por ejemplo que oscilan entre 0,5% PO a 5% PO). Los patrones se preparan añadiendo la cantidad correcta de PO al carbonato tampón hasta un total de cinco ml.

3. Añadir 1 ml de solución de glicina a los tubos de prueba etiquetados.

4. Añadir 1 ml de cada uno de los patrones PO al tubo de prueba etiquetado.

5. Agitación vorticial para mezclar y dejar que reaccione durante 24 horas a temperatura ambiente.

6. A las 24 horas, se añadieron 50 \mul de cada patrón a un ml de solución de ninhidrina.

7. Incubar tubos a 95-100°C durante 30 minutos.

8. Enfriar tubos a temperatura ambiente.

9. Añadir 250 \mul de patrón a un ml de solución al 50% de isopropanol.

10. Agitación vorticial y lectura de absorbencia a 570 nm.

Se evalúan, utilizando el método anterior, las muestras que contienen concentraciones desconocidas de óxido de propileno. Una vez trazada la curva standard de óxido de propileno, se pueden estimar las muestras que contienen concentraciones desconocidas de óxido de propileno utilizando la curva standard.

Contenido de humedad

El contenido de humedad se analizó en un Analizador de Humedad Halógeno Mettler-Toledo HG53. Se utilizó un ajuste de temperatura de 200°C. Los resultados se registran en % de contenido de humedad.

Temperatura de desnaturalización (contracción)

La temperatura de desnaturalización es la temperatura a la cual el colágeno se desnaturaliza. La prueba se realizó en el sistema de prueba tensil ChemDyne MC1000. La temperatura de desnaturalización se midió utilizando una carga previa de 30 gr. en un baño de agua, a una temperatura que crecía constantemente. Los resultados se expresan en °C.

Se seguirá describiendo la invención con referencia a los siguientes ejemplos, que no constituyen ninguna limitación. Las personas versadas en el arte podrán apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones descritas sin apartarse del ámbito de la presente invención. Por consiguiente, el ámbito de la presente invención no se limitará a las realizaciones descritas en esta solicitud, sino únicamente por las realizaciones descritas por el lenguaje de las reivindicaciones y los equivalentes de dichas realizaciones.

Ejemplo 1

Se recogieron pericardios bovinos de vacas sanas inspeccionadas por USDA, con una edad mínima de 12 meses. Se obtuvo pericardio fresco, que se sometió a una serie de lavados, seguidos de un lavado final en agua glacial. El tejido se limpió de tejidos extraños y se utilizó fresco o se almacenó a -20°C. Se utilizaron los siguientes procedimientos generales para preparar tejido tratado según la presente invención. Todas las etapas de la prueba se realizaron a 20-25°C.

NaOH y neutralización

1. Pesar 40-45 gr. de pericardio bovino.

2. Colocar el pericardio dentro de 1 l de 1,0 M NaOH (40 gr. de NaOH en 1 litro de agua DI) durante 60-65 minutos. Tomar una muestra para la medida del pH al final de la humectación.

3. Decantar el NaOH; exprimir suavemente el tejido y colocarlo en dos litros de agua filtrada DI durante 15-20 minutos.

4. Decantar el agua DI y colocar el tejido en dos litros de tampón de citrato (28 gr. de citrato sódico y 2,0 gr. de ácido cítrico en dos litros de agua DI) durante 60-65 minutos. Tomar una muestra para la medida del pH al final de la humectación.

5. Decantar el citrato tampón, exprimir suavemente el tejido y colocarlo en otros dos litros de agua DI durante 30-35 minutos.

Alquilación de tejido

1. Preparar una solución al 5% de óxido de propileno (50 ml de óxido de propileno en 950 ml de 0,2 M carbonato tampón, pH 10,5-10,6).

2. Colocar el tejido tratado con NaOH en una solución de óxido de propileno.

3. Mezclar sobre agitador de plataforma durante 72-96 h.

4. Quitar el tejido de la solución y colocarlo en 1,5 litros de agua DI durante 24 horas.

Tras la hidroxipropilación del tejido, se realiza las pruebas de índice de amina y la determinación cuantitativa del agente de alquilación que no ha reaccionado, para verificar si la alquilación es suficiente así como el PO. El tejido se trasladó a unos bastidores de tela metálica y se secó en un secador de vacío Virtis Genesis a 1155 mtorr.

Resultados TABLA 1 Actividad de la colagenasa

La tabla siguiente ofrece los resultados de una prueba de colagenaza, en la que se incubó tejido reabsorbible, preparado en la forma descrita aquí, en 0,01 mg/ml de colagenasa durante 24-96 horas.

TABLA 1

Tejido	24 h OD/mg	48 h OD/mg	72 h OD/mg	96 h OD/mg
No tratado	0,319	0,423	0,459	0,481
NaOH	0,502	0,689	0,784	0,874
NaOH/PO	0,674	0,684	0,822	0,973

OD/mg es el valor relativo de la cantidad de colágeno que ha sido degradada por la acción de la enzima colágenasa. Se puede ver que cada uno de los tejidos, inclusive el tejido sometido a alquilación, de la presente invención, es susceptible de digestión de colagenaza, lo cual indica la probabilidad de que sea reabsorbido dentro del cuerpo.

TABLA 2 Dependencia del pH

La tabla siguiente ofrece los resultados del índice de amina de tejido tratado con NaOH/PO, incubado en una solución al 5% de PO a dos pH diferentes.

	Tejido	Indice amina @ pH 9,5	Indice amina @ pH 10,5
	NaOH/PO	84,76%	96,29%

Se puede ver, que en las circunstancias experimentales en cuestión, se podría incrementar el grado de alquilación con un pH superior.

TABLA 3 Dependencia respecto del tiempo

La tabla siguiente presenta los resultados del índice de amina de tejido tratado con NaOH/PO, incubado en una solución al 5% de PO durante cierto período de tiempo, con un pH de 10,5.

	Tejido	72 horas incubación PO	96 horas incubación PO
	NaOH/PO	93,95%	96,29%

Se puede ver que existe un ligero incremento en la alquilación, incluso en el período de incubación de 72 a 96 horas.

TABLA 4 Prueba para determinar cuantitativamente el agente de alquilación que no ha reaccionado

La tabla siguiente es un ejemplo de una curva standard procedente del ensayo para determinar el agente de alquilación que no ha reaccionado.

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Si se lleva a un gráfico los datos anteriores, se obtiene una curva standard, y en una preparación típica, se puede estimar que, en las condiciones experimentales de este ejemplo, permanecen sin reaccionar de 0,4 a 0,5% de óxido de propileno, en la solución de alquilación.

TABLA 5 Contenido de humedad

La tabla siguiente muestra cómo el contenido de humedad tiende a aumentar al pasar el tejido por el proceso de alquilación (entre 72-96 horas).

	Tejido	Contenido de humedad (%)
	No tratado	78,35
	NaOH	87,33
	NaOH/PO	89,28

TABLA 6 Temperatura de desnaturalización

La tabla siguiente indica la forma en que la temperatura de desnaturalización (contracción) tiende a decrecer al ir pasando el tejido por el proceso de alquilación.

	Tejido	Temperatura de desnaturalización
	No tratado	61,1°C
	NaOH	62,4°C
	NaOH/PO	49,2°C

Ejemplo 2

Estudio de biocompatibilidad in vivo y bioestabilidad de pericardio bovino con obturación (capped) PO.

En este estudio, se comparó pericardio bovino no reticulado, obturado con óxido de propileno (PO), con pericardio bovino reticulado de glutaraldehido (GA) en un modelo animal subcutáneo, en términos de inflamación, cambios en las propiedades físicas y remodelación de la matriz del implante con el tejido anfitrión.

Preparación de tejido tratado con PO

Se trataron parches (aproximadamente 4 cm \times 6 cm) de pericardio bovino fresco, primero en NaOH 1N durante 1 hora, seguido de inmersión 2-3 veces en 4L de 50 mM de citrato tampón durante 1 hora. El tejido tratado con NaOH se colocó entonces en grandes tubos de prueba que contenían 100 ml de 0,2 M NaHCO_{3} tampón a un pH de 10,5 y 2% de óxido de propileno. Los tubos se agitaron suavemente sobre un agitador automático durante 48 horas a temperatura ambiente.

El tejido se lavó a fondo con solución salina hasta un nivel de pH de 6,5-7,5 y luego se guardó en etanol 70%.

Preparación de tejido reticulado GA

Se pueden conseguir en el comercio parches de pericardio bovino reticulado de glutaraldehido (GA), con el nombre comercial de "Peri-Guard", que incluye Suple Peri-Guard^{TM}, y se adquirieron en Bio-Vascular., St. Paul, MN.

Esterilización

Los parches de tejido húmedo se cortaron a un tamaño de muestra de 1 cm \times 2 cm. Las muestras se colocaron planas sobre un envoltorio de plástico (cuatro en cada uno) y se cerraron plegando el envoltorio de plástico alrededor. Las muestras envueltas se colocaron en el interior de bolsas de hoja de plástico/aluminio y se purgaron ulteriormente con gas argón y se sellaron en caliente. Se esterilizaron las bolsas por radiación de haz electrónico a 25 \pm
2,5 KGy.

Implantación

Los animales eran 344 ratas macho Fisher, de 3 meses de edad. Cada animal recibió dos implantes materiales diferentes. Al realizar los tratamientos quirúrgicos, los animales fueron anestesiados con pentobarbital (5 mg/100g), y se afeitaron y lavaron las partes superiores del dorso con una solución de butadieno. Se realizó una incisión de 2 cm por la línea central sobre el dorso del animal. Se diseccionaron lateralmente los planos de tejido subcutáneo para formar una bolsa en los lados izquierdo y derecho del dorso. Se insertó una muestra y se espació plana en cada bolsa. Se cerraron las heridas con suturas quirúrgicas y se lavaron con butadieno. Se llevaron nuevamente los animales a sus jaulas en cuanto se recuperaron de la anestesia.

Explantación

A las 4 y 6 semanas después de la implantación, se sacrificaron los animales por inhalación de dióxido de carbono. Se recuperaron las muestras junto con el tejido adherente circundante. Las muestras recuperadas se cortaron en tres fragmentos. Uno de ellos se almacenó en solución salina con 0,3% de azida sódica y se utilizó para la prueba de retención de sutura, el segundo se fijó en fijadores Bouin y se envió para su incrustación, seccionado y coloración de la hematoxilina y eosina ("H&E"), y el tercer fragmento se almacenó congelado y se utilizó para pruebas de digestión enzimática.

Medida de retención de la sutura

Una prueba de retención de la sutura que determina la fuerza necesaria para sacar un lazo de sutura de la prótesis se realizó en el sistema de prueba tensil ChemDyne MC 1000 (Columbia Labs, Inc.). Se hizo pasar una sutura de proleno 5-0 a través del tejido, con una profundidad de penetración de 2 mm por debajo del borde del tejido. El bucle de sutura se tiró a una velocidad de 100 mm/min, con una velocidad de muestreo de 20 Hz.

Pruebas de digestión enzimática

Las muestras de tejido se sumergieron en 1,0 ml de 40 U/ml colagenasa (Worthington, Biochem Corp.) y 1,0 ml de una solución al 0,05% de tripsina/EDTA, respectivamente. Las muestras se incubaron durante 12 horas a 37°C y se evaluó visualmente la integridad del tejido.

Resultados Retención de sutura

Mientras el pericardio bovino reticulado con GA mantuvo prácticamente su propiedad de retención de sutura durante el período de implantación (hasta 12 semanas después de la esterilización por haz E), se produjeron cambios sustanciales en el tejido tapado (obturado) con PO tras la esterilización con haz E así como la implantación (Tabla 7). Parece ser que la radiación de haz E redujo la retención de sutura del tejido obturado con PO, aproximadamente un 60%. La retención de sutura se redujo además durante el período de implantación. Sin embargo, resulta interesante que la retención de sutura de tejido obturado con PO pareció aumentar con el tiempo después de alcanzar el nivel más bajo cuatro semanas después de la implantación.

TABLA 7 Fuerza de retención de sutura (g) de muestras de tejido antes y después de la esterilización con haz E e implantación en ratas

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Digestión enzimática

La reticulación con GA volvió el pericardio bovino resistente a la colagenasa y/o a la tripsina antes y después de la implantación (hasta 12 semanas). Sin embargo, el pericardio bovino obturado con PO fue digerido fácilmente por colagenasa así como por tripsina antes de la implantación. Como el pericardio bovino es en gran medida a base de colágeno, que, en su estado natural, (es decir no retículado) puede ser digerido por colagenasa aunque no por tripsina, es interesante que el tejido se volviera susceptible a la tripsina tras la obturación con PO. Tras la implantación, las muestras obturadas con PO eran totalmente digeribles por tripsina a las 4 semanas, aunque parcialmente a las 12 semanas. Es posible que se formara nuevo colágeno en las muestras, en etapas ulteriores de la
implantación.

Evaluación histológica

Los cortes histológicos (coloración H&E) fueron evaluados bajo un microscopio óptico y puntuados según una escala de 1 a 4 (Tabla 7). A las 4 semanas de la implantación, las muestras reticuladas con GA indujeron un nivel ligero a moderado de respuesta inflamatoria, caracterizada por cantidades considerables de leucocitos polimorfonucleares (PMN), macrófagos y células gigantes de cuerpo extraño así como linfocitos, que se encontraron principalmente en las superficies exteriores del implante. En cambio, no se encontró ninguna reacción o una reacción muy suave en las muestras obturadas con PO, que presentaban un aspecto limpio con presencia de muy pocas células inflamatorias. El encapsulado fibroso era evidente en torno a los implantes de tejido reticulado con GA, aunque casi no se podían apreciar en las muestras obturadas con PO. La estructura de la fibra colágena en la matriz del tejido reticulado con GA no había cambiado, mientras que la matriz del tejido de implantes obturados con PO tenía un aspecto exfoliado y no consistente.

A las 12 semanas de la implantación, si bien la respuesta inflamatoria al tejido reticulado con GA era similar a la de las 4 semanas, con pocos cambios en la integridad física, se observaron cambios notables en las muestras tratadas con PO. Aparecían más infiltrados celulares (especialmente fibroblastos) alrededor, así como dentro del tejido tratado con PO. La matriz de tejido obturado con PO se volvió uniforme y anisótropa sin estructura fibrosa ondulada como la observada en pericardio bovino regular. En algunas regiones debajo de una cápsula fibrosa fina la matriz hística presentaba las características de tejido de granulación en desarrollo con fibroblastos, neo colágeno y
macrófagos.

TABLA 7 Evaluación microscópica (escala de 1 a 4) de explantes a las 4 y a las 12 semanas

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En conclusión, comparado con el pericardio bovino reticulado con GA, el pericardio bovino no reticulado, obturado con PO indujo menos inflamación, tal como indica el menor número de células inflamatorias (tales como PMN y macrófagos) presente a las 4 y a las 12 semanas de la implantación. Mientras el tejido reticulado con GA mantenía la mayoría de su integridad física y estructural durante el período de implantación, el tejido obturado con PO pareció experimentar cambios notables durante la implantación. Tras la implantación, el tejido obturado con PO se degradó parcialmente dentro de las pocas semanas, siendo el resultado una menor retención de la sutura. Es interesante sin embargo que en lugar de ser totalmente absorbido en el cuerpo, el material pareció remodelarse con el tiempo con nuevo tejido anfitrión y se volvió más fuerte, con una mayor retención de sutura. La formación de nuevo colágeno probablemente se produjo en el proceso de remodelación, como indica la proliferación de fibroblasto y la mayor resistencia de los explantes a la digestión de tripsina a las 12 semanas. El examen histológico reveló que en etapas ulteriores (por ejemplo 12 semanas) de implantación, la matriz de pericardio bovino obturado con PO empezó a parecerse al tejido de granulación, que es el tipo especializado de tejido indicativo de un proceso de curación normal.

Claims

1. Material de implante reabsorbible, remodelable, que comprende un tejido de mamífero esteril, no reticulado, descelularizado y purificado, que tiene un porcentaje importante de sus grupos amina disponibles alquilado.

2. Material según la reivindicación 1, en el que el tejido se elige dentro del grupo formado por membranas serosas y fibro-serosas.

3. Material según la reivindicación 2, en el que el tejido se elige dentro del grupo formado por pericardio, peritoneo, fascia dentada, dura madre, dermis y submucosa del intestino delgado.

4. Material según la reivindicación 3, en el que el tejido comprende pericardio bovino.

5. Material según la reivindicación 1, en el que el material ha sido sometido a alquilación, por medio un agente alquilante elegido dentro del grupo formado por compuestos de 1,2-epoxi-R, donde R es un grupo alquilo de hasta 6 átomos de carbono.

6. Material según la reivindicación 5, en el que el agente de alquilación es óxido de propileno.

7. Material según la reivindicación 1, en el que el agente de alquilación es metil glicidil éter.

8. Material según reivindicación 1, en el que éste se proporciona en forma de hojas o cintas planas o texturadas.

9. Material según la reivindicación 1, en el que el material está adaptado para su utilización en aplicaciones quirúrgicas, elegidas dentro del grupo formado por: duraplastia, cirugía torácica, abdominal, urológica, oftalmológica, cardiaca y vascular.

10. Proceso de preparación de un material de implante reabsorbible, remodelable, según la reivindicación 1, el método que comprende la etapa de tratar un tejido biológico con un agente de alquilación en condiciones adecuadas para alquilar un porcentaje importante de grupos amina disponibles en el tejido, y esterilizar el tejido tratado para su utilización in vivo.

11. Proceso según la reivindicación 10, en el que el material limpiado se trata con una base antes de la etapa de alquilación.

12. Proceso según la reivindicación 10, en el que el agente de alquilación se utiliza con un pH comprendido entre 9 y 11 aproximadamente.

13. Proceso según la reivindicación 10, en el que la concentración del agente de alquilación está comprendida entre 2% (v/v) y 5% (v/v) aproximadamente.

14. Proceso según la reivindicación 10, en el que el tejido se expone al agente de alquilación durante por lo menos 48 horas.