ES2220907T3 - Plasmido termosensible. - Google Patents
Plasmido termosensible.Info
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Abstract
EL PRESENTE INVENTO SE REFIERE A UN PLASMIDO VECTOR BACTERIANO DEL TIPO QUE COMPRENDE UN ORIGEN DE REPLICACION EFICAZ EN LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS, CARACTERIZADO PORQUE COMPRENDE AL MENOS: UN GEN MARCADOR QUE SE EXPRESA EN UNA CEPA HUESPED BACTERIANA, UN SISTEMA DE REPLICACION EFICAZ QUE ES TERMOSENSIBLE A PARTIR DE UNA TEMPERATURA COMPATIBLE CON LA VIABILIDAD DE LA CEPA HUESPED Y PORQUE LA TEMPERATURA DE INHIBICION DE REPLICACION ES INFERIOR O IGUAL A ALREDEDOR DE 37 (GRADOS) C. EL INVENTO SE REFIERE TAMBIEN A UNA BACTERIA QUE CONTIENE DICHO PLASMIDO Y A UN PROCEDIMIENTO DE INACTIVACION DE UN GEN EN EL CROMOSOMA DE UNA BACTERIA.
Description
Plásmido termosensible.
La presente invención se refiere a un plásmido
que se puede utilizar para la modificación genética de las
bacterias con coloración Gram positivas, en particular de las
bacterias lácticas que presentan un interés industrial o
médico.
La misma se refiere asimismo a las bacterias que
contienen un plásmido de este tipo. Por último, se refiere a los
procedimientos de modificaciones genéticas que utilizan un plásmido
de este tipo, para desactivar un gen normalmente presente en el
cromosoma bacteriano, o bien para introducir y expresar un gen de
interés.
Numerosas bacterias con coloración Gram positivas
son el objeto de estudio como modelo biológico (por ejemplo, las
bacterias del tipo Bacillus), como cepa de fermentación de
interés industrial (bacterias del ácido láctico) o como patógeno
(tal como, por ejemplo, Clostridia, Listeria,
Staphylococcus, Streptococcus). Muchas de estas cepas
están caracterizadas desde un punto de vista fisiológico, pero pocas
han sido estudiadas o modificadas genéticamente. El estudio o la
modificación de las cepas se puede facilitar mediante la
utilización de vectores que permiten inserciones dirigidas o no
específicas en el cromosoma bacteriano. Los sistemas de suministro
que se basan en vectores no replicativos se limitan a las bacterias
que se pueden transformar con una alta frecuencia y los que utilizan
replicones activos únicamente bajo algunas condiciones se limitan
frecuentemente a su espectro de huéspedes. Por lo que la
construcción de cepas recombinantes requiere un esfuerzo importante
y se puede aplicar con eficacia sólo a algunos microorganismos
específicos.
La adición, la pérdida o la modificación de genes
pueden transformar el papel de un organismo en un proceso
industrial tal como la fermentación.
La biotecnología busca facilitar el uso
industrial de microorganismos. Por ejemplo, las bacterias lácticas
se utilizan en la industria agroalimentaria, mayoritariamente para
la fabricación de productos lácteos fermentados, pero también en
otros campos distintos del de la leche, para la fabricación de vino,
sidra, en charcutería y en ensilaje.
Por tanto, es particularmente deseable disponer
de medios eficaces para introducir o modificar específica y
definitivamente algunos genes en estos organismos.
Actualmente, la modificación del cromosoma en las
bacterias lácticas se efectúa mediante un sistema por
transformación de un plásmido no replicativo. En una sola etapa, se
necesita tener dos acontecimientos de baja frecuencia, la
transformación mediante un plásmido, y una recombinación en el
cromosoma. La probabilidad de obtener estos dos acontecimientos en
una sola etapa es el producto de las probabilidades de cada uno;
por lo tanto, una probabilidad muy baja de obtener la
modificación.
El plásmido pWV01 es un plásmido críptico
inicialmente aislado en Lactococcus lactis subsp.
cremoris; se trata de un plásmido con amplia especificidad de
huésped, replicativo en bacterias gram positivas y gram negativas,
especialmente en E. coli, Bacillus subtilis,
Lactococcus lactis, Streptococcus y
LactoBacillus. Se ha caracterizado, y su secuencia
nucleotídica ha sido publicada por Leenhouts et al.
(1991).
En la solicitud WO 85/03495 se utilizan amplios
fragmentos de este plásmido para construir un plásmido recombinante
pGK12, marcado por el gen de resistencia a la eritromicina, y/o el
gen de resistencia al cloranfenicol (la
cloranfenicol-acetil-transferasa
(CAT)). Este plásmido pGK12 no se puede utilizar para efectuar
integraciones en el cromosoma bacteriano.
Los plásmidos no replicativos utilizados hasta
ahora permiten paliar este problema, pero este sistema requiere
porcentajes de transformación elevados para permitir la detección de
acontecimientos de baja frecuencia, tales como la transposición o
la recombinación en el cromosoma; ahora bien, la mayor parte de las
bacterias lácticas resultan escasamente transformables.
El conjunto de estas dificultades se podría
superar gracias a la obtención de un replicón termosensible, que se
puede utilizar como vector de suministro en las bacterias, lácticas
u otras.
Los plásmidos pE194 y pSH71 se han descrito como
naturalmente termosensibles, por encima de 51ºC (J. Bacteriol.,
1990, 172, 4543-4548).
Por esta razón, la presente invención tiene por
objeto un plásmido vector bacteriano del tipo que comprende un
origen de replicación eficaz en las bacterias gram+, caracterizado
porque comprende por lo menos:
- -
- un gen marcador que se expresa en una cepa huésped bacteriana,
- -
- un sistema de replicación eficaz termosensible (Ts) a partir de una temperatura compatible con la viabilidad de la cepa huésped,
y porque la temperatura de inhibición de la
replicación es menor o igual a 37ºC.
El hecho de que el plásmido según la invención
sea no replicativo a 37ºC le hace particularmente apropiado en el
caso en el que las bacterias presentan una temperatura de
crecimiento relativamente baja, o cuando no se desee un choque
térmico importante. El plásmido según la invención se puede utilizar
solo, y no necesita estar asociado a otro plásmido. La inhibición
de la replicación mediante temperaturas superiores a
aproximadamente 37ºC no depende de la cepa. El plásmido posee un
amplio espectro de huéspedes, y se puede establecer en particular
en las cepas clásicas que pertenecen al grupo que comprende:
Bacillus, Enterococcus, LactoBacillus, Lactococcus,
Streptococcus, Listeria, Pediococcus, Staphylococcus, Clostridia,
Leuconostoc, E. coli. Entre éstas, se pueden citar a título de
ejemplo las siguientes especies: B. subtilis, E. faecalis, L.
fermentum, L. helveticus, L. bulgaricus, L. lactis, S. pyogenes, S.
thermophilus, S. sanguis, L. monocytogenes.
El plásmido según la invención contiene por lo
menos un gen que codifica para un marcador de selección, así como
los elementos necesarios para su expresión, tales como un promotor,
un sitio de fijación de los ribosomas, un terminador, etc. Los
genes de selección son, por ejemplo, genes con resistencia a los
antibióticos (eritromicina, cloranfenicol), o que permiten el
crecimiento en un medio desprovisto de algunos elementos, etc.
El gen marcador se integra en el cromosoma en
caso de recombinación.
Por sistema de replicación, se entiende un
sistema que comprende un origen de replicación así como la proteína
que induce su funcionamiento; dicha proteína se desactiva por
encima de una temperatura que inhibe el sistema de replicación.
Un plásmido de este tipo se replica normalmente a
28ºC, en numerosas bacterias. A una temperatura superior a
aproximadamente 35ºC, se inhibe la replicación de este plásmido;
esta temperatura inhibidora de la replicación del plásmido es
relativamente baja y permite la multiplicación y el crecimiento
normal de la mayor parte de las bacterias, en particular de las
bacterias lácticas. La temperatura recomendada para la
desactivación eficaz de este plásmido es de 37ºC.
Según uno de sus aspectos, la presente invención
tiene por objeto un plásmido vector, caracterizado porque contiene
el fragmento Cla 1 más grande del plásmido pWV01, que presenta por
lo menos una mutación en la región Thal-Rsal.
Más particularmente, un plásmido vector con
replicación termosensible según la invención presenta por lo menos
una mutación en la región correspondiente a RepA del plásmido
pWV01. La proteína RepA es codificada mediante uno de los 4 marcos
abiertos de lectura (ORF) identificados en pWV01, el ORF A, y es
necesario para la replicación.
Las mutaciones preferidas de este plásmido se
encuentran en las posiciones 972, 977, 980 y 987 de la secuencia
nucleotídica de pWV01.
La proteína RepA codificada por el plásmido según
la invención presenta, con respecto al tipo salvaje, las
modificaciones representadas en la figura 3, a saber, la
sustitución de:
- Ser por Asn,
- Asp por Asn,
- Val por Ile,
- Arg por Gln.
Un plásmido de este tipo constituye un vector
suicida con amplia especificidad de huésped, de tipo único hasta
ahora en el campo de las bacterias lácticas.
En efecto, dicho plásmido permite disociar en dos
etapas la integración en el cromosoma. En la primera etapa de
transformación, el plásmido se establece en la célula. En la
segunda etapa, el acontecimiento de integración en el cromosoma se
selecciona por elevación de la temperatura. Se puede modificar así
genéticamente bacterias con fama de ser poco transformables.
Más particularmente, los plásmidos según la
invención comprenden una de las secuencias representadas en una de
las figuras 9, 10 u 11, o una secuencia que representa por lo menos
80% de homología con estas secuencias.
Las herramientas genéticas así desarrolladas
permiten introducir y estabilizar genes en el cromosoma
bacteriano.
Por ejemplo, se elige aplicar un procedimiento
mediante recombinación homóloga.
Para ello, se utiliza un replicón termosensible
según la invención, que comprende además por lo menos un fragmento
de ADN homólogo al ADN cromosómico de la bacteria que se quiere
modificar.
Según uno de sus aspectos, la presente invención
tiene por objeto un procedimiento de inactivación de un gen presente
en el cromosoma de una bacteria, caracterizado porque:
- a)
- se introduce en la bacteria, mediante transformación, el plásmido según la invención,
- b)
- se cultiva la bacteria sobre un medio selectivo a una temperatura menor que la temperatura de inhibición del origen de replicación,
- c)
- se eleva la temperatura de cultivo hasta una temperatura mayor que dicha temperatura de inhibición,
- d)
- se recuperan las bacterias supervivientes después de varios ciclos de multiplicación, a temperatura de inhibición de la replicación plasmídica.
La etapa d) permite seleccionar las bacterias que
contienen el marcador plasmídico.
El fragmento cromosómico clonado en el plásmido
puede corresponder a un gen definido, específicamente inactivado
mediante integración del plásmido a nivel de la copia cromosómica
del gen. En la población bacteriana, solamente se encontrará este
sitio de integración.
En otro modo de realización, el ADN bacteriano
presente en el plásmido se podrá seleccionar de entre un banco de
fragmentos cromosómicos para la clonación, y se producirá una
integración al azar; el sitio de integración del plásmido es
diferente de una bacteria a otra, y se realiza así la
mutagénesis.
El procedimiento se puede aplicar asimismo a un
replicón termosensible portador de un transposón. Se dispone de
diferentes transposones para provocar la mutagénesis del
cromosoma.
El plásmido Ts se utiliza como portador de uno de
estos transposones eventualmente modificado para ser activo en L.
lactis. Cada transposón contiene un gen marcador (por ejemplo,
gen de resistencia). Aplicando el protocolo descrito anteriormente
(a hasta c), se obtienen células que han integrado el transposón en
sus cromosomas. Estas células se seleccionan por medio del marcador
del transposón. En el caso de la transposición, el plásmido no se
integra en el cromosoma.
Como variante, el plásmido vector según la
invención comprende asimismo un locus de movilización que permite la
conjugación. Preferentemente, este locus de movilización es el
locus ori T, extraído de un plásmido de bacteria gram positiva,
pudiendo preferentemente ser extraído de un plásmido de
Streptococcus. El plásmido vector que contiene este locus se
puede movilizar y transferir mediante conjugación en especies
bacterianas no transformables.
El procedimiento de desactivación de un gen en
una bacteria utiliza entonces las etapas siguientes:
- a)
- se introduce en la bacteria, mediante conjugación, un plásmido según la invención, que contiene un locus de movilización y un fragmento homólogo al cromosoma y/o un transposón,
- b)
- se cultiva la bacteria sobre un medio selectivo a una temperatura menor que la temperatura de inhibición del origen de replicación,
- c)
- se eleva la temperatura de cultivo hasta una temperatura mayor que dicha temperatura de inhibición,
- d)
- se recuperan las bacterias supervivientes después de varios ciclos de multiplicación, a la temperatura de inhibición de la replicación plasmídica.
Las bacterias obtenidas tras la etapa d) han
sufrido un acontecimiento de recombinación o de transposición, y
contienen el marcador del transposón o del plásmido.
Como variante, el plásmido vector según la
invención, comprende asimismo un replicón activo en E. coli.
El plásmido vector que contiene este locus, y sus derivados, se
puede propagar en E. coli. Las construcciones preparadas y
propagadas en E. coli a 37ºC (gracias al segundo replicón) se
pueden transferir a continuación a las bacterias lácticas en las
que sólo el replicón Ts estará activo.
En los procedimientos descritos más arriba,
después de la introducción del plásmido vector en la bacteria
mediante transformación o conjugación en la etapa a), se deja que
el plásmido se establezca en la población bacteriana, mediante
replicación, a 28-30ºC.
El carácter de selección se expresa en el
conjunto de las bacterias. Cuando la temperatura sube por encima de
35ºC, el plásmido en forma libre se vuelve incapaz de replicarse y
se encuentra por lo tanto perdido durante las divisiones celulares.
Solamente las bacterias para las cuales este plásmido se integra
mediante recombinación en el cromosoma, o para las cuales el
transposón se integra en el cromosoma, conservan y transmiten la
información genética contenida por el plásmido o el transposón, y
les permiten crecer en medio selectivo. Se seleccionan así los
acontecimientos de integración, de baja frecuencia, recuperando las
bacterias que se multiplican a 35-37ºC en medio
selectivo.
Cuando el plásmido se integra en el cromosoma,
presenta una excelente estabilidad, que puede ser del orden de 99%,
tras 75 generaciones a 37,5ºC.
El esquema seguido para la integración del
plásmido mediante recombinación homóloga se ilustra en la figura
6.
La cepa L. lactis VE 6002, que contiene el
plásmido pVE6002 según la invención, se ha depositado en la
colección nacional del Institut Pasteur, 25-28 rue
du Docteur Roux, París, bajo el número 1-1179.
Según otro de sus aspectos, la invención tiene
por objeto un procedimiento que permite la introducción de un gen
heterólogo en una bacteria. Para su realización, se utiliza un
plásmido vector termosensible, tal como se ha definido
anteriormente, y que comprende además un gen que codifica para una
proteína de interés, bajo el control de los elementos necesarios
para su expresión, y que son conocidos por el experto en la
técnica. Llegado el caso, este gen podrá ser llevado por el
transposón. Se siguen entonces las etapas indicadas a
continuación.
- a)
- se introduce en la bacteria, mediante transformación o conjugación, un plásmido según la invención,
- b)
- se cultiva la bacteria sobre un medio selectivo a una temperatura menor que la temperatura de inhibición del origen de replicación,
- c)
- se eleva la temperatura de cultivo hasta una temperatura mayor que dicha temperatura de inhibición,
- d)
- se recuperan las bacterias supervivientes después de varios ciclos de multiplicación, a temperatura de inhibición de la replicación plasmídica.
La etapa d) permite seleccionar las bacterias que
contienen el marcador del plásmido o del transposón.
La invención tiene también por objeto unas
bacterias que contienen un plásmido según la invención, en forma
libre o integrada en el cromosoma.
Tales bacterias encuentran especialmente
aplicaciones en el campo de la industria agroalimentaria, en
particular la láctea o quesera.
En algunos de los casos descritos anteriormente,
se desea poder eliminar todo o una parte del material genético
introducido en el cromosoma bacteriano mediante el procedimiento
según la invención.
El procedimiento de recombinación homóloga
permite dos etapas: la primera consiste en seleccionar el
acontecimiento de integración del plásmido, y la segunda etapa -que
es facultativa- consiste en escindir del cromosoma el replicón y
los marcadores que no corresponden a las normas alimentarias.
Escisión del replicón: la integración mediante
recombinación homóloga crea duplicaciones de cada lado del plásmido
Ts (Fig. 7a). Se ha demostrado que un plásmido de círculo rodante
replicativo, integrado en el cromosoma, estimula fuertemente la
recombinación homóloga entre las secuencias adyacentes. Cuando el
fragmento cromosómico portado por el plásmido Ts contiene un
marcador, las duplicaciones creadas mediante la integración
permiten escindir el replicón dejando un gen cromosómico inactivo
(Fig. 7a). Experimentalmente, se trata de cultivar a 28ºC la cepa
que contiene el plásmido integrado (previamente seleccionado a
37ºC). A la temperatura permisiva, la replicación retoma y estimula
la recombinación entre las secuencias repetidas que termina con la
deleción del replicón (Fig. 7a).
La presente invención también tiene por objeto un
plásmido vector de replicación termosensible que presenta una o
varias de las características ya expuestas, y en el que se duplica
una región interna. Las dos secuencias idénticas están dispuestas
de manera que enmarquen la región que se desea eliminar. Dicho
plásmido se utiliza por lo tanto en un procedimiento de
inactivación de un gen, o de introducción de un gen heterólogo
mediante recombinación en el cromosoma bacteriano, tales como los
descritos más arriba.
Al final de la etapa d), las bacterias
supervivientes se colocan nuevamente en cultivo a una temperatura
menor que la temperatura de inhibición, por ejemplo a
28-30ºC, sobre un medio no selectivo. En efecto, un
plásmido replicativo estimula fuertemente la recombinación homóloga
entre las secuencias contiguas. La cepa que contiene el plásmido
integrado, previamente seleccionado a 35-37ºC, se
cultiva a temperatura permisiva: se reanuda la replicación
plasmídica, estimulando la recombinación entre las secuencias
repetidas. El replicón y los marcadores incompatibles con, por
ejemplo, una utilización agroalimentaria de este sistema, se
escinden, con retención eventual del gen modificado. La selección
de las bacterias que han escindido a los marcadores indeseables se
realiza después de la exposición a temperatura no permisiva. Este
mecanismo se ilustra en la figura 7b.
Los ejemplos siguientes están destinados a
ilustrar la invención sin limitar en modo alguno su alcance.
Se hará referencia a las figuras siguientes:
Figura 1: cinética de pérdida y análisis del
número de copias de pVE6002 según la invención y de pVE6001 no Ts.
Se cultivan IL 1403 de L. lactis subsp. lactis que
contiene el plásmido pGK12, pVE6001 o pVE6002 a 28ºC o 37,5ºC.
Después de tiempos diferentes de cultivo, se recogen muestras para
ser cultivadas a 28ºC sobre medios selectivos y no selectivos. Se
replican 100 colonias a partir del medio no selectivo sobre el
medio selectivo (Em 5 \mug/ml) para evaluar la proporción de
células que contienen un plásmido en la población. Las extracciones
de ADN total se realizan sobre los cultivos a 28ºC o 37,5ºC, sin
selección, durante 5 horas y 30 minutos.
Figura 2: Plásmido híbrido de pGK12 y pVE6002. El
pVE6043 está constituido por el fragmento Sacl-Thal,
de 994 pb, de pGK12, unido al fragmento Thal-Sacl
de 3384 pb de pVE6002. El pVE6044 contiene el par recíproco, el
fragmento Sacl-Tahl de 994 pb de pVE6002, unido al
fragmento Thal-Sacl de 3384 pb de pGK12. Los trazos
finos corresponden al ADN de pGK12; los trazos gruesos punteados,
al ADN de pVE6002.
Figura 3: Localización de la mutación Ts en el
gen RepA de pVE6002. El fragmento Tahl-Rsal de
pVE6002, que contiene el gen RepA, se ha secuenciado sobre los dos
filamentos. La secuencia muestra cuatro mutaciones en las
posiciones 972, 977, 980, 987, mientras que el resto de la secuencia
no difiere de la secuencia publicada por el replicón parental
pWV01.
Figura 4: Descripción de los derivados
termosensibles. El pVE6006 se construye mediante la inserción del
fragmento Pvull de 445 pb de pBluescript SK+ en el sitio Clal de
pVE6002. El pVE6007 proviene de una deleción Sacl de pVE6006, que
conduce a la pérdida del gen de resistencia a la eritromicina. El
pVE6004 se construye mediante la inserción del fragmento Pvull de
445 pb de pBluescript SK+ en el fragmento
Clal-Hpall de pVE6002 desprovisto del gen de
resistencia al cloranfenicol.
Figura 5: Comparación de las proteínas análogas
al Rep de PE.194.
Figura 6: Esquema del procedimiento de
inactivación de un gen.
Figura 7a: Esquema de un ejemplo de escisión del
replicón Ts en dos etapas.
Figura 7b: Esquema de la escisión del replicón
por medio de duplicaciones plasmídicas.
Figura 8: Construcción de los plásmidos
pG^{+}host5 y pG^{+}host6 a partir del plásmido pG^{+}host4
(o pVE6004): el plásmido pG^{+}host5 se construye mediante la
inserción del fragmento Ava I - Alw NI de pBR 322 (que contiene el
origen de replicación de pBR 322) en el pG^{+}host4 linealizado
mediante Nsi I.
El pG^{+}host6 se construye mediante la
inserción del fragmento Ava I – Eco RI de pBR 322 (que contiene el
origen de replicación de pBR 322 y el gen de resistencia a la
ampicilina) en el pG^{+}host4 linealizado mediante Nsi I.
Figura 9: Secuencia nucleotídica de
pG^{+}host4.
Figura 10: Secuencia nucleotídica de
pG^{+}host5.
Figura 11: Secuencia nucleotídica de
pG^{+}host6.
Los estudios se han realizado en el Laboratorio
de Genética Microbiana, Instituto de Biotecnología, INRA, 78352
Jouy-en-Josas cedex, Francia.
Los plásmidos y las cepas bacterianas utilizadas
se indican en la tabla 1. Las construcciones de pVE6043 y pVE6044
se describen en la figura 2; los plásmidos pVE6004, pVE6006 y
pVE6007 se presentan en la figura 4. El pVE6004 (o pG^{+}host4)
se construye mediante la inserción de un fragmento de ADN Pvull de
445 pb en el fragmento Clal-Hpall de 3340 pb en el
extremo libre del aislado Ts original, desprovisto del gen de
resistencia Cm. El fragmento Pvull de 445 pb comprende un sitio de
multiclonación, los promotores T7 y T3, y los sitios para M13 - 20,
T7, T3 y unos cebadores inversos que permiten la secuenciación
directa a partir del vector. Este plásmido es termosensible en
todos los huéspedes ensayados, incluso en E. coli, y se debe
mantener a 28ºC.
Se cultivaron E. coli y Bacillus
subtilis en medio LB. Se cultiva L. lactis subsp.
lactis (L. lactis) en medio M17, en el que se ha
sustituido la lactosa por glucosa. Se ha utilizado, respectivamente,
cloranfenicol (Cm) a 5 \mug/ml para L. lactis y B.
Subtilis, y eritromicina (Em) a 5 \mug/ml y 0,5 \mug/ml
respectivamente. El Cm, la azaeritromicina y la eritromicina se han
utilizado en concentraciones finales respectivas de 15 \mug/ml,
100 \mug/ml y 150 \mug/ml para E. coli.
Se han utilizado enzimas comerciales según lo
indicado por los proveedores. Se han preparado
mini-lisados de células enteras y ADN plasmídico
como se describe en la bibliografía. Se ha efectuado la inducción
de la competencia y la transformación de E. coli y de B.
subtilis mediante procedimientos estándares (Hanahan, 1985, o
Niaudet et al, 1979). Las cepas de L. lactis se han
electrotransformado como ha sido descrito por Langella y Chopin,
1989a, y se han modificado según el procedimiento de Holo y Nes,
1989.
La mutagénesis mediante hidroxilamina se ha
efectuado sobre el ADN del plásmido pGK12 en las condiciones
descritas por Thomas, 1987. Tras 110 y 120 minutos de tratamiento a
70ºC, la hidroxilamina se elimina mediante precipitación del ADN
con isopropanol.
Para la secuenciación del ADN, se ha clonado el
fragmento Thal (756 pb)-Rsal (1620 pb) de pVE6002
en el plásmido pBluescript. Se genera una serie de clones que se
recubren mediante la utilización de exonucleasa III y nucleasa de
judías mung (Stratagàne). El fragmento Thal (756
pb)-Ndel (1140 pb) de la preparación del plásmido
pGK12 utilizado para la mutagénesis se secuencia igualmente
mediante el mismo procedimiento.
Se realiza la secuenciación del ADN mediante el
método de terminación de cadenas didesoxi sobre unos ADN de doble
filamento con el kit de secuenciación Taq Dye Primer Cycle (Applied
Biosystem) utilizando un aparato de PCR Perkin Elmer. Las
reacciones de secuenciación se inician con oligonucleótidos
fluorescentes (Applied Biosystem), y se analizan sobre un
secuenciador automático (secuenciador 370 A DNA, Applied
Biosystem). Las secuencias obtenidas se han determinado sobre los
dos filamentos.
El plásmido utilizado en estos ensayos, el pGK12,
es un plásmido derivado de pWV01 que contiene dos marcadores de
resistencia a los antibióticos (Kok et al., 1984). Se somete
a mutagénesis 10 \mug de ADN plasmídico in vitro mediante
hidroxilamina, y se introducen mediante electroporación en la cepa
del lactococcus IL 1403, tras la eliminación del agente
mutágeno. La eficacia de la mutagénesis se evalúa por la
disminución de la viabilidad del plásmido, y mediante la aparición
de mutantes sensibles a la eritromicina o al cloranfenicol. Tras
110 a 120 minutos de tratamiento, la viabilidad del plásmido
desciende a menos de 0,1%, y aproximadamente 10% de los
transformantes contienen plásmidos sensibles a uno de los
antibióticos. Estas condiciones de mutagénesis se eligen para
buscar plásmidos termosensibles, identificados mediante la réplica
de los transformantes obtenidos a 28ºC en un medio que contiene
eritromicina incubados a 37,5ºC. Se obtienen dos candidatos
termosensibles, denominados pVE6001 y pVE6002, mediante cribado de
aproximadamente 5000 clones. Se comparan sus números de copias
plasmídicas, y se determina la pérdida a
37,5ºC.
37,5ºC.
El plásmido pVE6001 es más inestable que pGK12 a
28ºC, y esta deficiencia es más pronunciada a 37,5ºC. Sin embargo,
el 7% de las bacterias contienen todavía el plásmido tras 8 horas
de crecimiento no selectivo a 37,5ºC, lo que sugiere que ha tenido
lugar una replicación en condiciones restrictivas (figura 1A,
izquierda).
Con relación a pGK12, el número de copias de
pVE6001 parece disminuir a 28ºC y 37,5ºC, con o sin selección
(figura 1A), lo que podría explicar su menor estabilidad. Es posible
que la pérdida del plásmido a temperaturas elevadas se deba a
cambios fisiológicos en el huésped a temperaturas superiores, y no a
la termosensibilidad del plásmido.
Las mediciones de la estabilidad del plásmido
durante el crecimiento sin antibiótico revelan que el pVE6002 es
tan estable como el pGK12 a 28ºC, pero se pierde de manera drástica
a 37,5ºC (figura 1B). La pérdida rápida de pVE6002 a 37,5ºC sugiere
que la replicación se bloquea inmediatamente después del cambio de
temperatura. Tras 8 horas de crecimiento, solamente quedan
aproximadamente 0,1% de células resistentes a la eritromicina. Los
números de copias de pGK12 y de pVE6002 son similares a 28ºC, con y
sin selección; sin embargo, tras 5 horas a 37,5ºC, el pVE6002 es
indetectable, mientras que el número de copias de pGK12 sigue
siendo más o menos el mismo (figura 1B). Se puede concluir a partir
de estos ensayos que la mutación sobre pVE6002 constituye realmente
una deficiencia termosensible de replicación.
Se ha determinado la temperatura mínima que
permite la pérdida de pVE6002. La cepa IL 1403 que contiene pVE6002
se ha ensayado para determinar la pérdida plasmídica durante 8
horas de crecimiento no selectivo a 28ºC, 30ºC, 33ºC, 35ºC y 37,5ºC
(tabla 2).
Un cultivo de una noche, en M17 con Em, de IL1403
que contiene pVE6002 se diluye en un medio selectivo nuevo y se pone
a crecer 3 horas a 28ºC. Entonces, el cultivo se diluye 10.000
veces en un medio no selectivo y se incuba a diferentes
temperaturas. A intervalos de tiempos variables, se toman muestras y
se disponen sobre M17 a 28ºC. Para cada punto de temperatura y de
tiempo, se evalúa la pérdida del plásmido repicando un centenar de
colonias sobre cajas de medio selectivo (Em) a 28ºC.
Se ha encontrado que la pérdida plasmídica que
equivale a 37ºC y a 35ºC. Ya se observa una pérdida parcial del
plásmido a 33ºC, mientras que el plásmido era estable a 28ºC y
30ºC. De este modo, las células que contienen pVE6002 pueden perder
este plásmido mediante elevación de la temperatura a 35ºC o más.
Se ha introducido también pVE6002 en otra cepa de
Lactoccoccus, MG 1363 (Gasson, 1983), que es distinta del
IL1403 por comparación de los perfiles de electroforesis en campo
pulsado. El análisis de las secuencias indica que la MG1363 es
probablemente una cepa L. lactis subsp. cremoris
(Godon et al, 1992). El pVE6002 muestra la misma
termosensibilidad en este ambiente, demostrando que el fenotipo del
mutante plasmídico no está unido a la cepa.
Un plásmido Ts puede ser un vehículo de clonación
útil en otros organismos. De este modo, se ha examinado el
comportamiento termosensible de pVE6002 en B. subtilis y
E. coli. Estas cepas se han elegido como representativas del
amplio espectro de huésped del replicón original pWV01. El ADN
plasmídico se ha introducido en las dos especies mediante
transformación y selección a 28ºC. Dado que B. subtilis y
E. coli tienen temperaturas de crecimiento máximas
superiores a las de L. lactis subsp., se ha ensayado la
replicación de pVE6002 a 28ºC, 37ºC y 42ºC. Los resultados muestran
que pVE6002 es termosensible en los dos huéspedes. Es probable que
pVE6002 conserva sus propiedades de termosensibilidad en el amplio
espectro de huéspedes en el que se puede establecer.
La secuencia de ADN de pWV01 muestra la presencia
de un origen adicional y de cuatro ORF. Leenhouts deduce por su
similitud con ADN plasmídicos mejor caracterizados, que el ORF A
codifica para la proteína de replicación (RepA) responsable del
corte de un filamento de ADN con el origen adicional. Homologías
suplementarias sugieren que el ORF C podría regular la expresión de
RepA. No se han atribuido claramente todavía funciones al ORF B y
ORF D, aunque se sabe que esta última no es necesaria para la
replicación.
A fin de localizar la mutación que confiere la
termosensibilidad al pVE6002, se han construido plásmidos híbridos
que asocian partes del replicón termosensible y partes no mutadas.
El pVE6043 está constituido por un fragmento de pGK12 que contiene
el origen adicional, ORF B y ORF C, y por un fragmento pVE6002 (Ts)
que contiene la ORF A (RepA) desprovista de su promotor, el ORF D y
los marcadores de resistencia a Em y Cm (se utilizan los sitios de
restricción Sacl y Thal, figura 2). Este híbrido se pierde a
37,5ºC, en el mismo porcentaje que pVE6002, mientras que el híbrido
recíproco (pVE6044) se mantiene con la misma estabilidad que el
pGK12 (figura 2). Así, la mutación que confiere la
termosensibilidad al pVE6002 se encuentra en el fragmento de ADN que
codifica para RepA, ORF D y los marcadores a los antibióticos. Dado
que el ORF D no es indispensable, y que los marcadores a los
antibióticos no son candidatos, se puede concluir que la función
termosensible es la proteína RepA.
A fin de localizar la mutación Ts, se ha
secuenciado el fragmento de 864 pb que codifica para la proteína
RepA de pVE6002. Se han identificado cuatro mutaciones, en las
posiciones 972, 977, 980 y 987 (figura 3). Se ha confirmado que la
región correspondiente del plásmido parental pGK12 que se ha
utilizado para la mutagénesis es idéntica a la secuencia publicada
para pWV01 (Leenhouts et al, 1991). Las cuatro mutaciones
son transiciones de G a A, correspondientes al efecto mutágeno
conocido de la hidroxilamina. Cada cambio de base tiene como
resultado una alteración de un aminoácido (figura 3), una de las
cuales, Val en Ile, es conservativa. La contribución de una o varias
de estas alteraciones puede estar implicada en el fenotipo Ts.
Con el objetivo de clonación, se han desarrollado
derivados del plásmido Ts inicial pVE6002 (figura 4). Estos
derivados se modifican para que contengan las dos resistencias a
los antibióticos (Em y Cm), o bien solamente una (Em o Cm), y todos
presentan una secuencia multisitio derivada del plásmido
pBluescript SK+.
Se han podido obtener acontecimientos de doble
intercambio recíproco a partir de un plásmido derivado del pVE6002
que presenta una región de homología con el cromosoma bacteriano
interrumpida por un gen de resistencia a un antibiótico (Ab^{r}),
como se ilustra en la figura 7a. Después de la introducción del
plásmido en la bacteria a 28ºC, una primera etapa consiste en
seleccionar los integrantes en el cromosoma mediante cultivo a 37ºC
sobre medio que contiene el antibiótico. La región de homología se
duplica tras la integración (Figura 7a). Durante una segunda etapa,
se obtiene la escisión del replicón mediante incubación a 28ºC para
permitir que la replicación plasmídica retome y estimule un segundo
acontecimiento de recombinación. Los acontecimientos de escisión se
seleccionan mediante cultivo a 37ºC; el gen cromosómico se inactiva
mediante el gen Ab^{r}.
Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados
en este estudio se presentan en la tabla 3. Las cepas de
Escherichia coli se cultivan en un caldo LB. Se cultiva
L. lactis, y se extiende sobre un caldo M17^{+} glucosa, o
sobre un medio mínimo cuando se ensaya para el fenotipo ilv. La
eritromicina (Em) se añade a una concentración de 5 microgramos/ml
para L. lactis subsp. lactis, y 150 microgramos/ml
para E. coli, la tetraciclina se utiliza a una concentración
de 12,5 microgramos/ml para L. lactis. La electroporación de
L. lactis subsp. lactis (Appl. Env. Microbiol. 55,
3119-3123, 1989) proporciona entre 10^{5} y
10^{6} transformantes por microgramo de ADN plasmídico para
IL1403, y aproximadamente 10^{2} transformantes por microgramo de
ADN plasmídico con NCDO2118, la cepa ilv+ utilizada para los
ensayos de sustitución del gen. Se transforma E. coli
mediante el método descrito por Hanahan (1985, DNA cloning: A
practical approach Vol 1: 109-135, IRL Press Ed
Glover).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El plásmido pG^{+}host4 (o pVE6004) es un
derivado Ts de pWV01 preparado según el ejemplo 1. Para facilitar
la clonación en E. coli, el fragmento de 1,4 Kb que contiene
el origen de pBR322 se inserta en pG^{+}host4. El plásmido
pG^{+}host5 se construye mediante la inserción del fragmento Ava
1-Alw N 1 de pBR322 (que contiene el origen de
replicación de pBR322) en el pG^{+}host4 linealizado cortado por
Nsi 1. Su estructura se representa en la figura 8. El plásmido
obtenido, denominado pG^{+}host5 (Appligène, Illkirch, Francia),
se utiliza para todas las clonaciones. La actividad del origen de
pBR322 permite su mantenimiento a 37ºC en E. coli, y el
origen Ts mantiene pG^{-}host5 a 28ºC en la bacterias gram
positivas.
El ADN cromosómico de la cepa IL1403 es digerido
por EcoRV e HindIII. Se purifican fragmentos cromosómicos de un
tamaño comprendido entre 0,8 Kb y 1,4 Kb a partir de geles de
agarosa y se unen con pG^{+}host5 tratado mediante
Smal-HindIII. Los plásmidos recombinantes se
establecen en E. coli, y después se les hace penetrar
mediante electroporación en L. lactis. Esta última se
utiliza para verificar las estructuras de los plásmidos y los
tamaños de los injertos. Los resultados se presentan en la tabla 4
siguiente. Se utilizan enzimas de restricción Hpal (sitio único en
la parte del vector) e HindIII (sitio único entre el injerto y el
vector) para analizar los integrantes.
Se clona un fragmento EcoRI de 3949 bp del operón
ilv de IL1403 (J. Bacteriol. 174, 6580-6589 (1992))
en una u otra orientación en el sitio EcoRI de pG^{+}host5 (para
dar pVE7009 y pVE7009R).
Se cultivan cepas de Lactococcus que
contienen los plásmidos ensayados una noche a 28ºC en presencia de
eritromicina, y después se diluyen 100 veces en el mismo medio y se
cultivan a 28ºC durante 2 horas a 2 horas y media (fase
exponencial). Los cultivos se disponen a 37,5ºC durante 3 horas a
fin de disminuir el número de copias de plásmidos por célula. Las
muestras se diluyen a continuación y se dispersan a 37ºC sobre un
medio M17 Em a fin de detectar los acontecimientos de integración,
y a 28ºC sobre medio no selectivo para determinar el número de
células viables. La frecuencia de integración por célula (ipc) se
estima como la relación de las células Em^{r} a 37ºC, con respecto
al número de células viables a 28ºC. Los integrantes aislados a
37ºC se mantienen en un medio M17 que contiene Em, a 37,5ºC, para
un uso ulterior.
Los plásmidos pIL1263 y pIL1202 están compuestos
por el vector Ts (pG^{+}host4, Em^{r}) y, respectivamente, por
las regiones cromosómicas de 2,3 Kb o 3,6 Kb, interrumpidas por el
gen Tet de Tn1545 (Nucl. Acids Res., 14, 7047-7058,
1986). Se cultiva una cepa, que contiene pIL1202 o pIL1263 una noche
a 37,5ºC en M17 con Tet o Em para obtener una población de
integrantes. El cultivo se diluye a continuación a 1/10^{5} en un
medio M17 sin antibióticos, y se lleva a 28ºC para estimular la
recombinación mediante replicación plasmídica. Un cultivo de 12
horas o más a 28ºC proporciona unas frecuencias máximas de
sustitución del gen. Se extiende un cultivo de una noche a 28ºC a
diferentes concentraciones celulares a 37ºC con o sin selección por
Tet. Las colonias en las que se ha producido la sustitución del gen
presentan un fenotipo Tet^{r} y Em sensible (Em^{s}). El ADN
cromosómico se prepara según métodos conocidos (Grüss et
al., 1988).
El ADN purificado se trata mediante enzimas de
restricción, se separa por electroforesis en gel de agarosa, y se
analiza mediante hibridación de Southern con sondas de ADN para
detectar las recombinaciones homólogas (Sambrook et al.,
1989).
La clonación de los fragmentos cromosómicos de
L. lactis en pG^{+}host5 en E. coli permite aislar
14 plásmidos diferentes que contienen cada uno una inserción
cromosómica distinta, de 0,9 Kb a 1,4 Kb. Estos plásmidos
establecidos en IL1403 a 28ºC sirven para medir las frecuencias de
integración en el cromosoma de L. lactis. La frecuencia de
integración por célula está comprendida entre 10^{-2} y
10^{-7}. La ipc de un vector pG^{+}host5 sin injerto
cromosómico está comprendida entre 10^{-6} y 10^{-7}. Los
plásmidos que contienen los injertos cromosómicos se pueden
clasificar en dos grupos, en función de su frecuencia de
integración. En el grupo 1, la ipc varía entre 3x10^{-2} y
4x10^{-4}. Estas variaciones se deben a la localización o la
naturaleza del injerto más que a su tamaño. En el grupo II, la ipc
del plásmido está comprendida entre 10^{-5} y 3x10^{-7}. Esto
se debe probablemente a la interrupción de un gen cromosómico
esencial, que permite observar sólo las integraciones no homólogas.
Solamente dos de estos plásmidos (pVE7028 y pVE7034) producen
moléculas de alto peso molecular (HMW). El análisis del ADN
cromosómico obtenido a partir de las cepas integrantes mantenidas a
37ºC, mediante restricción enzimática e hibridación de Southern
utilizando el plásmido pG^{+}host5 como sonda, indica una
integración simple y multitándems en el caso de ocho plásmidos, y
una integración por copias múltiples en el caso de dos plásmidos.
La digestión mediante HindIII del ADN de los integrantes confirma
que la integración se produce mediante entrecruzamiento simple.
Cada plásmido contiene un solo sitio HindIII en la unión
vector-injerto, y la digestión debe liberar una
banda única de ADN de tamaño plasmídico. La hibridación de Southern
del ADN total no digerido no revela ningún plásmido libre en
ninguno de los plásmidos del grupo I, lo que indica que la copia del
plásmido está integrada. Un análisis similar de los plásmidos
pVE7028 y pVE7034 confirma que estos plásmidos son igualmente
integrados mediante entrecruzamiento simple. La utilización de
Hpal, que reconoce un sitio único en el interior del vector,
permite determinar que cada plásmido está integrado en una posición
distinta.
Los cuatro plásmidos del grupo II (baja
frecuencia de integración) parecen estar integrados al azar, puesto
que la digestión mediante HindIII no libera una banda monomérica de
plásmido, y la digestión mediante Hpal de tres integrantes del
mismo plásmido no da el mismo perfil sobre el gel. El mapa de
restricción del cromosoma de L. lactis desarrollado para
Smal y Apal permite localizar los sitios de integración de los
plásmidos por entrecruzamiento simple sobre el mapa cromosómico.
Cada integrante está presente sobre un segmento diferente. El
conjunto de estos resultados indica que las inserciones cromosómicas
se sitúan de manera aleatoria sobre el cromosoma, excluyendo así
cualquier desviación en el procedimiento.
La frecuencia de integración depende de la
longitud de la homología.
Se clona en pG^{+}host5 un segmento de 3,9 Kb
del operón ilv de IL1493 secuenciado, y se genera un conjunto de
deleciones del fragmento sobre el mismo vector. Mientras que unos
plásmidos que contienen el injerto total de 3,9 Kb en una de las
dos orientaciones (pVE7009 y pVE7009R) presentan cierta
inestabilidad estructural en L. lactis, los ocho derivados
mediante deleción de pVE7009R son estables. Estos clones se
utilizan para estudiar la relación entre la longitud de la
homología y la frecuencia de integración. Existe una relación
logarítmica entre la frecuencia de integración y la longitud de
homología para longitudes comprendidas entre 0,35 y 2,5 Kb. Para
fragmentos de más de 2,5 Kb, las frecuencias de recombinación
parecen alcanzar un tope, puesto que las ipc de los segmentos
homólogos de 2,5, 3,3 y 3,9 Kb no son significativamente
diferentes. Los factores distintos de la longitud parecen también
ser importantes. El análisis mediante enzimas de restricción que
reconocen un sitio único en el vector, o bien en el injerto, o bien
en la unión vector-injerto, confirma que la
integración se produce mediante recombinación homóloga por
entrecruzamiento simple. Para cada plásmido utilizado, se producen
unas integraciones multicopias del plásmido. Estos resultados
muestran que pG^{+}host suministra un medio de integración eficaz
por entrecruzamiento simple si contiene segmentos homólogos tan
pequeños como 330 pares de bases.
En el sistema de entrecruzamiento simple (sco)
descrito más arriba, el plásmido integrado está flanqueado de
secuencias repetidas. Por lo tanto, cuando las cepas integrantes,
generadas a 37ºC, se encuentran a 28ºC, la replicación del plásmido
estimula fuertemente un segundo acontecimiento de recombinación.
Este acontecimiento tiene como consecuencia una alta frecuencia de
escisión del replicón, conduciendo o bien a la estructura parental,
o bien a la estructura cromosómica dco (entrecruzamiento
doble).
Se utiliza una cepa poco transformable de L.
lactis, NCDO2118, que es protótrofa para los aminoácidos
ramificados (Ilv, Leu, Val) y en la que no era posible ninguna
modificación genética hasta ahora. Se utilizan dos derivados de
pG^{+}host4 que contienen un segmento cromosómico contiguo, o no
contiguo. El pIL1263 contiene un fragmento cromosómico de 2,3 Kb,
corriente arriba del operón ilv, interrumpido por un segmento de
ADN de 4 Kb que contiene un marcador de resistencia a la
tetraciclina (Tet^{r}). La sustitución del gen debe conducir a la
inserción del marcador Tet^{r} en el cromosoma y dejar al operón
ilv^{+} intacto. El plásmido pIL1202 contiene segmentos no
contiguos de 1,1 Kb y 2,5 Kb, que corresponden a los extremos de
una región de 18,5 Kb, incluyendo el operón ilv, unido mediante el
marcador Tet^{r} de 4 Kb. La sustitución del gen debe conducir a
una deleción del cromosoma de 14,9 Kb incluyendo el operón ilv y
dando un fenotipo ilv^{-}.
\newpage
Selección del gen de sustitución: se cultiva una
cepa que contiene pIL1202 o bien pIL1263 en las condiciones
indicadas anteriormente, utilizando Tet como marcador de selección.
En ensayos independientes con pIL1263, el 69% y 98% de las colonias
Tet^{r} eran Em^{s}; con pIL1202, el 50% y 91% de las colonias
Tet^{r} son Em^{s}. En los cultivos del control mantenidos a
37ºC durante el mismo tiempo, todas las colonias Tet^{r} son
igualmente Em^{r}. Este resultado indica que la replicación en
los plásmidos rc (rolling circle o círculo rodante) estimula la
escisión a partir del cromosoma. Se cultivan cinco colonias
Em^{s} obtenidas mediante la integración de pIL11202 sobre un
medio mínimo desprovisto de aminoácidos ramificados y son
ilv^{-}, lo que confirma que ha tenido lugar la recombinación. La
estructura de la región cromosómica correspondiente de los cinco
aislados Tet^{r} Em^{s} se estudia mediante la hibridación de
Southern, que confirma la sustitución del gen en todos los
casos.
Sin selección: se ha utilizado un protocolo
idéntico sin selección por Tet a fin de ponerse en el caso en el
que el fragmento cromosómico contenido en el plásmido no presenta
ningún marcador de selección. En tres ensayos que utilizan pIL1263
(inserción de gen), entre 10% y 40% de las colonias obtenidas a
37ºC sin selección son Tet^{r} Em^{s}, lo que indica que ha
tenido lugar un acontecimiento de sustitución del gen. Para pIL1202
(deleción del cromosoma), entre 1% y 7% de las colonias son
Tet^{r} Em^{s}, lo que indica una sustitución del gen; entre
las cuatros colonias Tet^{r} Em^{s} ensayadas, todas son
ilv^{-}. El análisis de la estructura cromosómica de los cuatros
integrantes mediante dco de cada tipo confirma que la sustitución se
produce sin selección de un nuevo fragmento insertado. Estos
resultados demuestran la factibilidad de la sustitución del gen sin
dejar un marcador antibiótico en el cromosoma. Por lo tanto, este
protocolo se adapta para la modificación cromosómica sin utilización
de marcadores de selección.
Se ha determinado la eficacia de la recombinación
intermolecular en doce localizaciones diferentes del cromosoma de
B. subtilis, transformando células competentes por un
plásmido no replicativo (J. Bacteriol. 174,
5593-5587, 1992). En estos ensayos, el segmento
homólogo es invariable (inserción de un fragmento de pBR322). Las
eficacias varían aproximadamente tres veces en función de la
posición de la integración. Utilizando el sistema pG^{+}host sco
en lugar del vector no replicativo, se pueden efectuar ensayos de
recombinación idéntica sobre las dos cepas de B. subtilis con
diferencias de un orden de tres en las frecuencias de integración.
Se introduce el pG^{+}host5 que contiene el fragmento de 1,4 Kb
de pBR322 en las cepas de B. subtilis de interés. Utilizando
el procedimiento sco descrito anteriormente, la frecuencia de
integración varía entre 1,8 \pm 0,6x10^{-3} y 6,1 \pm
0,9x10^{-4}. Se observan iguales variaciones de tres veces entre
las dos diferentes localizaciones que las obtenidas con el sistema
no replicativo. Este resultado demuestra la eficacia del
sistema.
Organismos de interés industrial, tales como
algunos lactobacilos, no se pueden transformar actualmente, y sin
embargo es posible introducir en ellos plásmidos mediante
conjugación. Se ha caracterizado el locus de movilización oriT del
plásmido pIP501. El pIP501 es autotransferible en algunos de estos
lactobacilos.
Este fragmento oriT se ha clonado en el plásmido
Ts (plásmido Ts:oriT); se ha ensayado su capacidad para ser
movilizado en presencia de un plásmido "helper" (derivado del
pIP501) que suministra las proteínas de transferencia en trans. Se
han realizado con éxito varios cruzamientos intra- o
inter-especies (Tabla 5); con los exconjugantes que
contienen sólo el plásmido Ts:oriT, se puede aplicar el siguiente
procedimiento de integración mediante recombinación. Por lo tanto,
se pueden introducir informaciones genéticas en el cromosoma de
LactoBacillus bulgaricus, especie no transformable cada vez
más utilizada por la industria láctea.
La finalidad del procedimiento de integración
mediante recombinación es la modificación de los caracteres
genéticos de cepas bacterianas; esto supone que las propiedades a
modificar sean caracterizadas a nivel molecular. El desarrollo de
un sistema de transposición funcional (combinación del plásmido Ts
de un transposón) constituiría un aporte apreciable como
herramienta genética para el análisis de L. lactis.
Se utiliza un casete de transposición Tn10,
clonado en un derivado de pVE6004, para un ensayo de transposición.
Aproximadamente el 1% de las células son Em^{r} a 37ºC, lo que
indica que el transposón o el plásmido está integrado en el
cromosoma. La integración no específica del plásmido sin el casete
de transposición se produce a unas frecuencias inferiores a
10^{-7}. La transposición se estima mediante análisis del ADN
digerido por HindIII a partir de ocho colonias. El HindIII tiene
dos sitios de restricción en el plásmido, pero ninguno en la unidad
transposable. El ADN cromosómico se extrae de ocho clones
termorresistentes Em^{r} y se digiere con HindIII; el ADN tratado
se separa a continuación mediante electroforesis en gel de agarosa y
se hibrida con un fragmento de ADN que contiene el transposón
Em^{r} como sonda. En estas condiciones, la integración del
vector entero (es decir, sin transposición) conduciría a una banda
de hibridación de 1,3 Kb, que no se observa en este caso. Cada
muestra cromosómica muestra un perfil único cuando el fragmento de
ADN que contiene el transposón se utiliza como sonda. Ninguna de
las bandas hibridadas presenta un tamaño de 1,3 Kb, lo que sería de
esperar si el plásmido entero estuviera integrado en un sitio del
vector. Además, no se observa hibridación cuando el plásmido vector
Ts se utiliza como sonda. Estos resultados indican que la
transposición tiene lugar en diferentes sitios, y que el ADN
plasmídico no se integra en el cromosoma con el transposón. Por lo
tanto, el plásmido termosensible se puede utilizar como vector de
suministro.
Sitios únicos:
| Accl | Kpnl |
| BamHl | Nofl |
| BstXl | Pstl |
| Drall | Sall |
| Eagl | Sacll |
| EcoRl | Smal |
| EcoRV | Spel |
| Hindlll | Xbal |
| Xhol |
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practical approach. IRL Press EDS Hardy.
Claims (22)
1. Plásmido vector bacteriano que presenta un
origen de replicación eficaz en E. coli y en las bacterias
gram positivas seleccionadas de entre el grupo que comprende:
Bacillus, Enterococcus, LactoBacillus, Lactococcus,
Estreptococcus, Listeria, Pediococcus, Staphylococcus, Clostridia,
Leuconostoc, que comprende por lo menos:
- -
- un gen marcador que se expresa en una cepa huésped bacteriana,
- -
- un sistema de replicación eficaz que es termosensible a partir de una temperatura compatible con la viabilidad de la cepa huésped,
cuya temperatura de inhibición de la replicación
es menor o igual a aproximadamente 37ºC, y cuyo sistema de
replicación por círculo rodante es el contenido por el fragmento
Cla1 más grande del plásmido pWV01, que presenta por lo menos una
mutación en la región Tha1-Rsa1.
2. Plásmido vector según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende además por lo menos una
secuencia de ADN homóloga con una secuencia de ADN cromosómico, a
fin de permitir una recombinación.
3. Plásmido vector según la reivindicación 2,
caracterizado porque el gen marcador está situado de manera
que se integre en el cromosoma en caso de recombinación.
4. Plásmido vector según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el gen marcador
asegura una resistencia a un compuesto químico o es un gen que
permite la complementación de una auxotrofia.
5. Plásmido vector según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el sistema de
replicación termosensible se inhibe por encima de 35ºC.
6. Plásmido vector según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el plásmido
comprende un locus de movilización que permite la conjugación.
7. Plásmido vector según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende dos
secuencias idénticas repetidas, que enmarcan una secuencia del
plásmido.
8. Plásmido según una de las reivindicaciones 1 a
7, caracterizado porque presenta por lo menos una mutación
en la región correspondiente a Rep A del plásmido pWV01.
9. Plásmido según la reivindicación 8,
caracterizado porque, con respecto a la secuencia de pWV01,
presenta por lo menos una mutación en una de las posiciones
siguientes: 972, 977, 980, 987.
10. Plásmido según una de las reivindicaciones 8
y 9, caracterizado porque el fragmento que corresponde al
sistema de replicación codifica para una proteína que presenta las
mutaciones representadas en la figura 3.
11. Plásmido según una de las reivindicaciones 1
a 10, caracterizado porque comprende una de las secuencias
representadas en la figura 9, 10 u 11, o una secuencia que presenta
por lo menos 80% de homología con estas secuencias.
12. Plásmido según una de las reivindicaciones 8
a 11, caracterizado porque es replicativo a 28ºC, y no
replicativo a una temperatura mayor que aproximadamente 35ºC.
13. Plásmido según una de las reivindicaciones 6
a 12, caracterizado porque el locus de movilización es el
locus ori T, extraído de un plásmido de bacteria gram positiva.
14. Plásmido según una de las reivindicaciones 6
a 13, caracterizado porque comprende además un replicón
activo en E. coli, que le convierte en un plásmido vehículo
gram-negativo, gram-positivo.
15. Plásmido según una de las reivindicaciones 1
a 14, caracterizado porque comprende un transposón.
16. Plásmido según una de las reivindicaciones 1
a 15, caracterizado porque comprende además un gen que
codifica para una proteína de interés, bajo el control de los
elementos necesarios para su expresión.
17. Bacteria caracterizada porque contiene
un plásmido según una de las reivindicaciones 1 a 16, en forma
libre o integrada en su cromosoma.
18. Procedimiento de inactivación de un gen
presente en el cromosoma de una bacteria, caracterizado
porque:
- a)
- se introduce en la bacteria, mediante transformación, el plásmido según una de las reivindicaciones 1 a 5, 7 a 12, 14, 15 ó 16,
- b)
- se cultiva la bacteria sobre un medio selectivo a una temperatura menor que la temperatura de inhibición del origen de la replicación,
- c)
- se eleva la temperatura de cultivo hasta una temperatura mayor que dicha temperatura de inhibición,
- d)
- se recuperan las bacterias supervivientes tras varios ciclos de multiplicación.
19. Procedimiento de inactivación de un gen en
una bacteria, caracterizado porque:
- a)
- se introduce en la bacteria, mediante conjugación, un plásmido según una de las reivindicaciones 6 a 16,
- b)
- se cultiva la bacteria sobre medio selectivo a una temperatura menor que la temperatura de inhibición del origen de replicación,
- c)
- se eleva la temperatura de cultivo hasta una temperatura mayor que dicha temperatura de inhibición,
- d)
- se recuperan las bacterias supervivientes tras varios ciclos de multiplicación.
20. Procedimiento de introducción de un gen
heterólogo en una bacteria, caracterizado porque:
- a)
- se introduce en la bacteria, mediante transformación o conjugación, un plásmido según la reivindicación 16,
- b)
- se cultiva la bacteria sobre medio selectivo a una temperatura menor que la temperatura de inhibición del origen de replicación,
- c)
- se eleva la temperatura de cultivo hasta una temperatura mayor que dicha temperatura de inhibición,
- d)
- se recuperan las bacterias supervivientes tras varios ciclos de multiplicación.
21. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque las bacterias
supervivientes obtenidas tras la etapa d), se colocan nuevamente
en cultivo a una temperatura menor que la temperatura de inhibición
del origen de replicación, sobre medio no selectivo.
22. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque la etapa b)
se realiza a una temperatura de aproximadamente 28ºC.
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