ES2220948T3 - Composicion para inhibir la hiperplasia de la intima utilizando antagonistas de pdgf y heparina. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS PARA INHIBIR LA HIPERPLASIA DE LA INTIMA EN LA VASCULATURA DE MAMIFEROS, INCLUIDOS PRIMATES. LOS METODOS INCLUYEN LA ADMINISTRACION COORDINADA AL MAMIFERO DE UN ANTAGONISTA DE PDGF Y DE HEPARINA. EL ANTAGONISTA PUEDE SER UN ANTAGONISTA NO PEPTIDICO O UN ANTICUERPO ANTI-RECEPTOR DE PDGF, COMO UN ANTICUERPO ANTI-RECEPTOR DE PDGF ALFA O UN ANTICUERPO ANTI-RECEPTOR DE PDGF BETA. LOS METODOS SON UTILES PARA REDUCIR LA HIPERPLASIA DE LA INTIMA DEBIDO, POR EJEMPLO, A LESIONES VASCULARES RESULTADO DE ANGIOPLASTIA, ENDARTERECTOMIA, ATERECTOMIA DE REDUCCION O ANASTOMOSIS DE UN INJERTO VASCULAR.

Description

Composición para inhibir la hiperplasia de la íntima utilizando antagonistas de PDGF y heparina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a procedimientos para inhibir la hiperplasia de la íntima, incluyendo la restenosis, en un mamífero después de una lesión vascular, y a las composiciones útiles en estos procedimientos.

Antecedentes de la invención

La proliferación de las células del músculo liso (SMC) en la pared de los vasos es un hecho importante en la formación de las lesiones vasculares en la aterosclerosis, después de la reconstrucción vascular o en respuesta a otras lesiones vasculares. Por ejemplo, el tratamiento de la aterosclerosis incluye con frecuencia la desobstrución de los vasos bloqueados por angioplastia, endoarteriectomía o aterectomía de reducción, o mediante injerto con derivación, procedimientos quirúrgicos en los que las placas ateroscleróticas se comprimen o eliminan mediante cateterización (angioplastia), se extraen de la pared arterial mediante una incisión (endoarteriectomía) o se hacen derivaciones con injertos naturales o sintéticos. Estos procedimientos eliminan el endotelio vascular, destruyen la capa de la íntima subyacente y producen la muerte de las SMC internas. Esta lesión es seguida de proliferación de SMC internas y de migración en la íntima, acompañada por excesiva deposición de la matriz extracelular. Esta evolución de la lesión tiene lugar de forma característica en las primeras semanas y hasta los seis meses después de la lesión y se interrumpe cuando se restablece la capa endotelial sobrepuesta. En los seres humanos, estas lesiones se componen de aproximadamente el 20% de células y del 80% de matriz extracelular.

Aproximadamente en el 30% o más de los pacientes tratados de angioplastia, endoarteriectomía o injertos con derivación, trombosis y/o proliferación de SMC en la íntima produce la reoclusión del vaso y el consiguiente fallo de la cirugía reconstructiva. Este cierre del vaso posterior a la intervención quirúrgica es conocido como restenosis.

Un proceso similar de proliferación de SMC se ha observado también en los transplantes de órganos, y puede contribuir a la aterosclerosis del transplante y al fallo del órgano. El engrosamiento de la íntima en este proceso implica únicamente al órgano transplantado.

Se ha pretendido que los mitógenos de las plaquetas, tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), desempeña un papel en la evolución de las placas ateroscleróticas (véase Ross et al., Cell 46 155-169, 1986; Harker, Am. J. Cardiol. 60: 20B-28B, 1987). Un mecanismo propuesto para la formación de la placa es la liberación de plaquetas, en los puntos de desolladura endotelial, de los factores de crecimiento que estimulan el crecimiento de SMC (Ross y Glomset, N. Eng. J. Med. 295: 369-377, 420-425, 1976; Ross, Arteriosclerosis 1: 293-311, 1981). Moore et al. (Thrombos. Haemostas. (Stuttg.) 35: 70,1976) y Friedman et al. (J. Clin. Invest. 60: 1191-1201, 1977), utilizando un modelo de lesión con sonda permanente, describió una inhibición de la formación de la lesión de la íntima provocada experimentalmente en las arterias del conejo mediante trombocitopenia prolongada provocada por la administración de suero con anti-plaquetas. Se ha pretendido también que las SMC pueden producir ellas mismas PDGF que estimula la evolución de la lesión mediante un mecanismo autocrino (Ross et al., ibid; Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7311-7315, 1986). Fingerle et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8412-8416, 1989) investigaron la formación de la lesión de la íntima en ratas trombocitopénicas y llegaron a la conclusión de que las plaquetas no desempeñan un papel en la proliferación inicial de las SMC después de la lesión con globo pero puede regular la migración de SMC dentro de la íntima. Se conocen actualmente plaquetas que liberan numerosos factores de crecimiento, incluyendo el PDGF, el factor del crecimiento epidérmico (EGF), los factores alfa y beta transformantes del crecimiento (TGF\alpha y TGF\beta), el factor I de crecimiento del tipo de la insulina (IGF-I) y las plaquetas procedentes del factor de crecimiento de células endoteliales, así como diversas moléculas quimioatrayentes. Aunque determinados estudios implican a PDGF en los procesos asociados a la evolución de la lesión, ningún estudio ha demostrado la participación del PDGF en estos procesos en los primates.

La eliminación de las capas ateroscleróticas por angioplastia o endoarteriectomía ha limitado la eficacia y no se han desarrollado ningún tratamiento eficaz para la restenosis de los vasos tratados o para la estenosis de injertos con desviación. Se necesitan por lo tanto en la técnica procedimientos de reducción o prevención de la evolución de lesiones abundantes en SMC en las paredes vasculares, incluyendo la estenosis de los vasos sanguíneos después de lesión vascular, tal como la lesión debida a la cateterización con globo, la endoarteriectomía o la aterectomía de reducción, así como en los injertos vasculares, transplantes de órganos y colocaciones de catéteres.

La solicitud de patente internacional WO94/19016 da a conocer procedimientos para inhibir la hiperplasia de la íntima en el sistema vascular de un mamífero que comprende la administración al mamífero de un anticuerpo del receptor anti-PDGF. Los Ejemplos 1 a 13 y las Figuras 1 a 9 son comunes entre el documento WO94/19016 y la presente solicitud.

Exposición de la invención.

La presente invención proporciona la utilización de un antagonista del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y de heparina para la preparación de un medicamento para inhibir la hiperplasia de la íntima en el sistema vascular de un mamífero. La presente invención también proporciona la utilización de un antagonista de PDGF para la preparación de un medicamento que se ha de administrar junto con la heparina para el tratamiento de enfermedades hiperproliferantes. Ejemplos de hiperplasia de la íntima incluyen la restenosis que sigue a la angioplastia, a la endoarteroctomía o a otros procedimientos mediante los cuales se eliminan las placas ateroscleróticas de los vasos sanguíneos. Los medicamentos según la invención pueden comprender una cantidad eficaz de anticuerpo receptor de PDGF para inhibir la hiperplasia de la íntima.

En la presente invención es preferible utilizar un anticuerpo receptor del factor de crecimiento derivado de anti-plaquetas (PDGF) en una cantidad suficiente para inhibir la mitogenia y/o la migración de las células del músculo liso. Un anticuerpo receptor de anti-PDGF se puede administrar simultánea o alternativamente, sucesivamente con una heparina.

Según la invención, los medicamentos pueden comprender una cantidad eficaz de un anticuerpo receptor anti-PDGF, tal como un anticuerpo receptor de anti-PDGF-alfa, un anticuerpo receptor de anti-PDGF-beta, o un panel de anticuerpos receptores de anti-PDGF. En una forma de realización, el panel de anticuerpos es capaz de inhibir la fijación de las isoformas AA, AB y BB de PDGF a los receptores de PDGF.

Los medicamentos según la invención pueden comprender un anticuerpo receptor de anti-PDGF que se puede administrar a un mamífero simultáneamente con o en un periodo de tiempo anti-hiperplásicamente eficaz antes de, una aparición de una lesión vascular aguda en el mamífero. Ejemplos de lesiones vasculares agudas incluyen los procedimientos de reconstrucción vascular tales como la angioplastia, endoarteriectomía, aterectomía de reducción y anastomosis de un injerto vascular. En un aspecto relacionado, el anticuerpo se administra simultáneamente con o durante un periodo de tiempo anti-hiperplásticamente eficaz antes de la colocación de un injerto vascular o de un transplante de órgano. En otras formas de realización, el anticuerpo se administra durante un periodo de tiempo anti-hiperplásticamente eficaz después de la aparición de una lesión vascular aguda o la colocación de un transplante vascular o de un transplante de órgano.

Los medicamentos según la invención que comprenden los anticuerpos pueden ser utilizados para inhibir la hiperplasia de la íntima que tiene lugar en un injerto vascular o en un transplante de órgano.

Los medicamentos según la invención que comprenden un antagonista de PDGF y heparina se pueden administrar de forma coordinada en cantidades respectivas de anticuerpo y heparina suficientes para inhibir de forma combinada la hiperplasia. El antagonista y la heparina se pueden administrar simultánea o, alternativamente, sucesivamente con el antagonista o la heparina administrada en primer lugar, y el resto no administrado de antagonista y heparina se administra a continuación durante un periodo de tiempo eficaz. En una forma de realización, el antagonista de PDGF es un antagonista no peptídico de PDGF. En otra forma de realización, el antagonista de PDGF es un anticuerpo receptor del factor de anti-crecimiento, tal como un anticuerpo del receptor anti-PDGF.

En las formas de realización relacionadas, el anticuerpo administrado de forma coordinada u otro antagonista de PDGF y la heparina inhiben de forma combinada uno o más de los procesos hiperplásicos de la íntima de la proliferación de las células del músculo liso vascular, la migración de las células del músculo liso vascular y/o la deposición de la neoíntima de la matriz extracelular. En otras formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo receptor de anti-PDGF-alfa, un anticuerpo receptor de anti-PDGF-beta o un panel de anticuerpos receptores de anti-PDGF. En las formas de realización adicionales, el anticuerpo u otro antagonista de PDGF inhibe una función del receptor del receptor del factor de crecimiento, como por ejemplo la fijación del receptor a un ligando del receptor o la dimerización del receptor del factor de crecimiento. En otras formas de realización, se administra un anticuerpo anti-PDGF u otro antagonista de PDGF el cual inhibe la fijación de uno o más de las isoformas AA, AB y BB de PDGF a los receptores de PDGF. En otras formas de realización, la heparina comprende un sulfato de heparán o una heparina de bajo peso molecular caracterizada por tener una actividad anti-trombótica reducida.

Los medicamentos según la invención, que comprenden un anticuerpo receptor de anti-PDGF u otro antagonista de PDGF y heparina se pueden administrar de forma coordinada a un mamífero simultáneamente con o en un periodo de tiempo eficaz antes de la aparición de una lesión vascular aguda en el mamífero. Las lesiones vasculares agudas incluyen lesiones vasculares que aparecen en la reconstrucción vascular, incluyendo las lesiones debidas a la angioplastia, endoprótesis vascular, endoarteriectomía, ablación endovascular con láser, aterectomía de reducción o anastomosis de un injerto vascular. En los aspectos relacionados, se puede administrar un antagonista de PDGF y heparina simultáneamente con o durante un periodo de tiempo terapéuticamente eficaz antes de la colocación de un injerto vascular o de un transplante de órgano. En otras formas de realización, se administran un antagonista de PDGF y heparina en un periodo de tiempo antihiperplásicamente eficaz después de la aparición de una lesión vascular aguda o la colocación de un injerto vascular o de un transplante de órgano.

La invención también proporciona productos que contienen heparina y un antagonista de PDGF como preparación combinada para la utilización simultánea, independiente o sucesiva para el tratamiento de enfermedades hiperproliferantes vasculares.

Preferentemente los productos de la invención incluyen anticuerpos y heparina en una relación anticuerpo:heparina en peso comprendida aproximadamente entre 0,01:1 y 100:1, con preferencia aproximadamente entre 0,05:1 y 20:1. En una forma de realización dicha heparina comprende una heparina de bajo peso molecular que tiene actividad antitrombótica reducida, o que comprende un sulfato de heparina.

Todavía en otro aspecto de la invención, se proporcionan kits farmacéuticos para el tratamiento de la hiperplasia de la íntima en un mamífero, kits que incluyen un antagonista de PDGF, tal como un anticuerpo receptor anti-PDGF o un antagonista no peptídico de PDGF y heparina en un excipiente farmacológicamente adecuado. En una forma de realización, el antagonista y la heparina se combinan previamente en un solo excipiente. En otra forma de realización, el antagonista y la heparina se administran mediante administración simultánea, independiente o
sucesiva.

Los anticuerpos útiles en la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales y anticuerpos modificados genéticamente, estos últimos incluyen anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos híbridos, anticuerpos bifuncionales e inmunoconjugados.

Las preparaciones de heparina útiles en la presente invención incluyen heparinas no fraccionadas o fraccionadas y glucosaminoglucanos de tipo heparina, incluyendo los sulfatos de heparán. Son también útiles las heparinas de bajo peso molecular, incluyendo los fragmentos anticoagulantes y no coagulantes y los derivados de heparina y de glucosaminoglucano de tipo heparina.

Estos y otros aspectos de la invención se pondrán de manifiesto haciendo referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la fijación de anticuerpos monoclonales del receptor de anti-PDGF a las células que expresa el receptor PDGF-beta recombinante. Los resultados se expresan como cpm media unido a IgG anti-ratón de ^{125}I-conejo para determinaciones por triplicado. Las barras indican la desviación estándar.

La Figura 2 ilustra la fijación de anticuerpos monoclonales del receptor de anti-PDGF a las células que expresa el receptor PDGF-alfa recombinante. Los resultados se expresan como cpm media unido a IgG anti-ratón de ^{125}I-conejo para determinaciones por triplicado. Las barras indican la desviación estándar.

Las Figuras 3A a 3C ilustran la inhibición de la actividad mitógena de PDGF en los fibroblastos dérmicos humanos por los anticuerpos monoclonales del receptor de anti-PDGF. Los resultados se presentan como el nivel medio de incorporación de [^{3}H]timidina para cada una de las condiciones de la prueba con ligando de PDGF. La desviación estándar se muestra mediante la T en la parte superior de cada barra. Cada panel muestra también una curva patrón para el ligando de PDGF solo. A) Estimulación de PDGF-AA, B) Estimulación de PDGF-AB, C) Estimulación de PDGF-BB.

La Figura 4 ilustra la inhibición de la actividad mitógena de PDGF-AA en las células del músculo liso de mandril por los anticuerpos monoclonales del receptor de PDGF. A la izquierda se presenta una curva patrón para el ligando solo. Los resultados se presentan como el nivel medio de la incorporación de [^{3}H]timidina. La desviación estándar se presenta por la T en la parte superior de cada barra.

La Figura 5 ilustra la inhibición de la actividad mitógena de PDGF-AB en las células del músculo liso de mandril por los anticuerpos monoclonales del receptor de PDGF. A la izquierda se presenta una curva patrón para el ligando solo. Los resultados se presentan como en la Figura 4.

La Figura 6 ilustra la inhibición de la actividad mitógena de PDGF-BB en las células del músculo liso de mandril por los anticuerpos monoclonales del receptor de PDGF. A la izquierda se presenta una curva patrón para el ligando solo. Los resultados se presentan como en la Figura 4.

Las Figuras 7A y 7B ilustran la valoración de los anticuerpos monoclonales representativos para inhibir la actividad mitógena de PDGF-AA en las células del músculo liso del mandril. Los resultados se presentan como el nivel medio de la incorporación de [^{3}H]timidina para cada una de las condiciones de la prueba con PDGF-AA. La desviación estándar se presenta por la T para cada una de las muestras de la curva patrón de PDGF-AA. (A) Curva patrón de actividad mitógena de PDGF-AA. (B) Potencia inhibidora de Mabs 169.14 y 169.31 para la actividad mitógena de PDGF-AA como se demuestra por una disminución en el nivel de la incorporación de [^{3}H]timidina.

La Figura 8 ilustra la inhibición de la actividad mitógena del suero de mandril en las células del músculo liso de mandril por los anticuerpos monoclonales del receptor de anti-PDGF. A la izquierda se presenta una curva patrón para el suero solo. Los resultados se presentan como el nivel medio de incorporación de [^{3}H]timidina. La desviación estándar se presenta por la T en la parte superior de cada barra.

La Figura 9 ilustra la actividad mitógena del suero de mandril, en presencia del anticuerpo 169.31 monoclonal del receptor anti-PDGF alfa, en las células del músculo liso de mandril.

Descripción detallada de la invención

Como se indicó anteriormente, la restenosis de los vasos sanguíneos es un problema corriente en los pacientes que han experimentado angioplastia, endoarteriectomía o injerto en derivación. La restenosis es un ejemplo de hiperplasia de la íntima, que se cree que procede a través de un proceso que incluye tanto la proliferación (mitosis) como la migración de las células vasculares del músculo liso en el área dañada por el procedimiento quirúrgico, así como por la producción (deposición) de la matriz extracelular. Véase, en general, (Harker, Am. J. Cardiol. 60: 20B-28B, 1987; DeFeudis, Drug News and Perspectives 5: 49-51, 1992). Este proceso proliferante se manifiesta también en la oclusión de los injertos vasculares (tanto naturales, incluyendo los autólogos y alógenos como sintéticos), y en los órganos transplantados. Este proceso proliferante produce el desarrollo de lesiones ricas en células del músculo liso y en la presente memoria se denomina hiperplasia de la íntima.

Se pueden utilizar medicamentos según la invención para inhibir el desarrollo de lesiones ricas en SMC mediante la utilización de anticuerpos contra receptores de PDGF y mediante la utilización de otros antagonistas de PDGF, en particular antagonistas de PDGF no peptídicos. El término "no peptídico" se refiere a otros compuestos aparte de las proteínas o a otros multímeros unidos a péptidos. Dichas lesiones producen el bloqueo parcial o completo de un vaso sanguíneo mediante engrosamiento de la íntima (hiperplasia). La inhibición de la hiperplasia de la íntima debe entenderse que incluye interferir con el proceso proliferante al reducir o impedir uno o más procesos hiperplásicos, incluyendo la migración celular, la proliferación celular y la formación de la matriz extracelular. Al bloquear la proliferación y/o migración interfiriendo con la interacción de PDGF y sus receptores, se puede reducir la proliferación de SMC y posterior deposición de la matriz. Una reducción en la hiperplasia de la íntima se manifiesta clínicamente como una disminución significativa de pérdida de volumen del lumen después de una lesión vascular aguda. Dicha reducción producirá generalmente un aumento de necesidad de procedimientos de revascularización (p. ej. angioplastia repetida) en la zona de la lesión inicial.

Los medicamentos de la presente invención pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de la hiperplasia de la íntima debido a la lesión vascular aguda. Las lesiones vasculares agudas son aquellas que tienen lugar rápidamente (es decir en días a meses), en contraste con las lesiones vasculares crónicas (p. ej. aterosclerosis) que se desarrollan durante el periodo de una vida. Las lesiones vasculares agudas proceden con frecuencia de procedimientos quirúrgicos tales como la reconstrucción vascular, en la que se emplean técnicas de angioplastia, endoarteriectomía, aterectomía, colocación del injerto vascular o similares. La hiperplasia puede tener lugar también como respuesta retardada en respuesta, p. ej., a la colocación del injerto o el transplante del órgano.

La presente invención utiliza antagonistas de PDGF para inhibir la hiperplasia de la íntima en el sistema vascular de un mamífero. Los antagonistas de PDGF se utilizan de forma ventajosa en combinación con la heparina. Los antagonistas de PDGF útiles en la presente invención incluyen los antagonistas no peptídicos de PDGF y los antagonistas peptídicos de PDGF, tal como los anticuerpos del receptor anti-PDGF.

Un grupo particularmente preferido de antagonistas no peptídicos de PDGF incluye Brefeldin A (1,6,7,8,9,11a,12,
13,14, 14a-decahidro-1,13-dihidroxi-6-metil-4H-ciclo-pent[f]-oxaciclotridecin-4-ona) y sus derivados. Brefeldin A tiene la estructura:

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Se ha descubierto que Brefeldin A inhibe la actividad mitógena de PDGF en las células del músculo liso de mandril, cuya actividad aumenta en presencia de heparina.

En la presente invención se pueden producir anticuerpos útiles mediante procedimientos convencionales de inmunización y purificación. En resumen, se administra un receptor de PDGF, un fragmento del receptor o una proteína de fusión que comprende un polipéptido del receptor, preferentemente purificado, a un animal, como por ejemplo un ratón, rata, conejo o cabra en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmunitaria. Se prefiere administrar el receptor del factor de crecimiento en combinación con un adyuvante, como, por ejemplo, un adyuvante de Freund, para aumentar la respuesta inmunitaria. Aunque una sola inyección de antígeno puede ser suficiente para provocar la producción de anticuerpos en el animal, se prefiere generalmente administrar una inyección inicial mayor seguida de una o más inyecciones de refuerzo durante un periodo de varias semanas a varios meses. Véase, p. ej., Hurrell, J.G.R., ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boca Ratón, FL, 1982, que se incorpora a la presente memoria como referencia. A continuación se extrae sangre del animal y se coagula, y se aíslan los anticuerpos del suero utilizando técnicas convencionales, tales como la precipitación con sal, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía por afinidad o la cromatografía de líquidos de alto rendimiento.

En una forma de realización de la invención, se utilizan anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales proporcionan las ventajas de la facilidad de producción y dosis terapéuticas más bajas en comparación con los anti-sueros policlonales, ya que solamente se utilizan los anticuerpos de la especificidad deseada. Los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica y están expuestos, por ejemplo, por Kohler y Milstein (Nature 256: 495, 1975; Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976). Véase también Hurrell, J.G.R., ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boca Ratón, FL, 1982 y Hart, patente U.S. nº 5.094.941. Como apreciarán los expertos en la técnica, se pueden utilizar también fragmentos de anticuerpo, tales como los fragmentos de Fab.

En general se prefiere utilizar anticuerpos que sean singenésicos con el paciente o que contengan zonas singenésicas constantes. Por esta razón, en el tratamiento de seres humanos se utilizarán generalmente anticuerpos modificados genéticamente que contengan estructuras humanas con soporte. Los procedimientos para producir anticuerpos humanos recombinantes o anticuerpos no humanos humanizados (es decir, híbridos), están expuestos por Cabilly et al. (patente U.S. nº 4.816.567), Robinson et al. (WO 87/02671) y Neumaier (WO 90/00616). En resumen, los genes humanos de la zona constante se unen a los genes humanos o no humanos de la zona variable apropiados. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que representan las zonas de fijación al antígeno (CDR; o las zonas determinantes de complementariedad) del anticuerpo monoclonal murino del progenitor se injertan en el nivel del ADN en las secuencias con soporte de la zona variable humana. Este procedimiento es conocido como "humanización". Los procedimientos para esta técnica son conocidos en la materia y están expuestos, por ejemplo, por Jones et al. (Nature 326: 522-525, 1986), Riechmann et al. (Nature 322: 323-327, 1988) y Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989).

Los genes unidos se transfieren a continuación a las células del huésped, que se cultivan según los procedimientos convencionales. En la alternativa, las células que producen anticuerpos monoclonales se transfieren con los genes clonados de la zona constante humana y se generan genes híbridos del anticuerpo por recombinación homóloga. De este modo es posible reunir anticuerpos monoclonales con una parte significativa de estructura que es humana, proporcionando de este modo anticuerpos que son más adecuados para las administraciones múltiples a pacientes humanos.

Por lo tanto, se puede desarrollar un anticuerpo de una sola cadena mediante la expresión de un polipéptido recombinante que se compone generalmente de una secuencia de cadena ligera variable unida, típicamente mediante un polipéptido conectador, a una secuencia variable de cadena pesada. Los procedimientos para producir anticuerpos de una sola cadena son conocidos en la técnica y están expuestos, por ejemplo, por Davis et al. (Biotechnology 9: 165-169, 1991).

Se han descrito dos polipéptidos receptores de PDGF. Éstos se denominan "receptor alfa" (Kelly et al., documento WO 90/14425; Kelly et al., Patente U.S. nº 5.371.205; Claesson-Welsh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4917-4921, 1989) y "receptor beta" (Claesson-Welsh et al., Mol. Cell. Biol. 8:3476-3486, 1988; Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435-3439, 1988). En presencia del ligando del PDGF, se dimerizan los polipéptidos del receptor. Por lo tanto son posibles tres subtipos de receptor: \alpha\alpha, \alpha\beta y \beta\beta. El receptor \beta es específico de la cadena B de PDGF, mientras que el receptor \alpha se une a la cadena A y a la cadena B. Por consiguiente, la sensibilidad reguladora del crecimiento de las células a PDGF depende no solamente de la disponibilidad de las isoformas de los ligandos AA, AB y BB de PDGF, sino también de la expresión y disponibilidad de diferentes subtipos de receptor de PDGF (Heldin et al., Cell Regul. 1: 555-566, 1990). Las células del músculo liso del hombre expresan tanto los subtipos de receptor alfa como beta (Heldin et al., Cell Regul. 1: 555-566, 1990), pero se conocen otros tipos de células que expresan únicamente un solo subtipo de receptor (Gronwald et al., J. Biol. Chem. 264: 8120-8125, 1989).

Los anticuerpos del receptor anti-PDGF utilizados en la presente invención serán preferentemente un panel de anticuerpos capaces de inhibir las tres isoformas del receptor de PDGF (\alpha\alpha, \beta\beta y \alpha\beta). Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "panel" indica una combinación de dos o más anticuerpos con diferentes especificidades. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes o para epítopos diferentes en un solo antígeno. Se prefieren los anticuerpos monoclonales (MAb).

Como se indicó anteriormente, los anticuerpos utilizados en la presente invención interfieren con la interacción de PDGF y de sus receptores. En las formas de realización preferidas de la invención, se emplean anticuerpos del receptor anti-PDGF que inhiben la fijación de un ligando de PDGF a un receptor de PDGF, si bien los expertos en la técnica reconocerán que también se pueden realizar las ventajas de la invención utilizando anticuerpos que inhiben otras interacciones receptor-ligando tal como la dimerización del receptor.

Se pueden utilizar también anticuerpos monoclonales anti-receptor como agentes de direccionamiento para administración de compuestos de interés terapéutico. Dichos compuestos incluyen, pero no se limitan a, toxinas, compuestos citoestáticos, o proenzimas cuya función potencial puede ser activar proenzimas endógenas, activar proenzimas añadidas de fuentes exógenas o activar zonas de escisión del enzima en profármacos. Los anticuerpos de anti-receptor se pueden también marcar con radionucleótidos, colorantes, compuestos fluorescentes o similares para su utilización como agentes de detección por imagen. Ejemplos de éstos incluyen las zonas de detección por imagen de trombosis, o las zonas de lesión vascular en las que existe una exposición, por ejemplo, de las células del músculo liso vasculares que expresan a receptores de la superficie celular.

Se pueden también utilizar anticuerpos monoclonales para desarrollar anticuerpos bifuncionales en los que existen dos zonas de fijación antigénicas independientes en cada molécula de inmunoglobulina. Esta tecnología es conocida en la técnica y se ha descrito en la bibliografía (Thromb. Res. Suppl. X: 83, 1990). Además, se pueden construir también anticuerpos biespecíficos a partir de anticuerpos de una sola cadena. Esta tecnología es conocida en la técnica y ha sido descrita, por ejemplo, por A. George (The Second Annual IBC International Conference on Antibody Engineering, Dec. 16-18, 1991, San Diego, CA).

Los anticuerpos utilizados en la presente invención serán capaces de bloquear una cantidad significativa de la actividad biológica de un antígeno en un sistema de ensayo in vitro, p. ej. la capacidad para bloquear la interacción de uno o más ligandos de PDGF con el/los receptor(es) de PDGF. Los sistemas adecuados de la prueba in vitro incluyen, entre otros, los ensayos de mitogenia y los ensayos de fijación al receptor. Por ejemplo, 25 \mug/ml de un receptor MAb de anti-PDGF-alfa monoclonal descrito en la presente memoria es capaz de bloquear la actividad mitógena de 10 ng/ml de PDGF-AA. Como comprenderán los expertos en la técnica, la cantidad de anticuerpo necesaria para inhibir la actividad de una cantidad dada de antígeno dependerá de factores, tales como la especificidad y afinidad del anticuerpo. Es preferible no bloquear el 100% de la actividad mitógena del suero de modo que no se suprima toda la respuesta a la cicatrización de la herida. Las dosis de anticuerpo se calculan tal como se describió anteriormente, teniendo en cuenta la afinidad y la actividad específica.

Una "cantidad antihiperplásicamente eficaz" de un anticuerpo del receptor de anti-PDGF o de otro antagonista de PDGF se define como una cantidad suficiente para reducir de forma mensurable o impedir la hiperplasia de la capa íntima en un vaso sanguíneo, en un injerto de vasos o en un componente vascular de un órgano trasplantado. De forma más específica, "inhibición de la hiperplasia de la capa íntima" en la presente memoria se define para incluir cualquier inhibición mensurable de uno o más de los procesos hiperplásicos de la capa íntima descritos en la técnica, tales como la migración de las células vasculares del músculo liso (VSMC), la proliferación de VSMC y la deposición neoíntima de la matriz extracelular. En este contexto, la reducción o prevención de la hiperplasia de la capa íntima o de un proceso hiperplásico implicado en la hiperplasia de la capa íntima, se puede evaluar fácilmente utilizando sistemas de análisis in vitro, in vivo y ex vivo conocidos en la técnica, en particularsistemas de análisis basados en primates (p. ej. cultivos de VSMC de primates humanos o no humanos o explantes de tejido vascular, o pruebas in vivo en primate no humano). Al interpretar los datos de la dosis in vitro, se apreciará que diferentes células y tejidos de ensayo pueden expresar diferentes niveles y/o tipos de receptores de PDGF. Además, el número de pasos en el cultivo celular (es decir número de generaciones celulares transcurridas después de la disociación o de la excrecencia de las VSMC de una fuente de tejido vascular) se reconocerá que tienen potencialmente un impacto importante en las actividades mitógenas y otras relacionadas con el crecimiento observadas en los sistemas experimentales. Igualmente, se deben considerar numerosas variables en la extrapolación de los datos in vivo procedentes de sistemas no humanos para estimar la efectividad anti-hiperplásica de los anticuerpos en seres humanos. En particular, es importante considerar cualquier diferencia en la naturaleza y gravedad de la lesión del vaso sanguíneo entre los sistemas experimentales y clínicos para utilizar mejor los datos del modelo para determinar los protocolos del tratamiento existente para seres humanos. Asimismo, se pueden sopesar las diferencias de interespecies en la anatomía e histología vascular y las diferencias intrínsecas en los procesos hiperplásicos desencadenados por diferentes tipos de lesiones vasculares, cuando se extrapolan entre las aplicaciones del modelo y clínicas. No obstante, los ensayos y procedimientos descritos en la presente memoria, incluyendo los estudios in vitro e in vivo que utilizan sistemas de modelo de primate no humano y humano, proporcionan todas las directrices necesarias, acopladas con conocidas técnicas que incluyen el procedimiento de ensayo clínico normalizado, para determinar con éxito los protocolos de tratamiento para la hiperplasia de la íntima en pacientes mamíferos, incluyendo seres humanos.

Se prefiere que la cantidad antihiperplásicamente eficaz de anticuerpo o de otro antagonista inhiba significativamente la proliferación (p. ej., como se determina en un ensayo de mitogenia in vitro) y/o la migración de las células vasculares del músculo liso. Una reducción "significativa" es una reducción de mitogenia o la migración del 50% o más en un ensayo in vitro. Mientras la cantidad real depende en parte de factores tales como la especificidad y afinidad de fijación de un anticuerpo determinado, se puede determinar empíricamente una cantidad eficaz mediante procedimientos in vitro y ex vivo conocidos en la técnica y dados a conocer en la presente memoria. En general, las cantidades de antagonista de PDGF para su utilización terapéutica serán suficientes para proporcionar una concentración en el torrente sanguíneo o en el punto de acción al menos igual a la que demuestra ser eficaz in vitro o ex vivo. Se prefiere, sin embargo, utilizar cantidades mayores in vivo, hasta o superando un aumento de orden de magnitud. De este modo, en los sistemas del modelo, se selecciona la dosis de anticuerpo de receptor anti-PDGF con el objetivo de proporcionar concentraciones de anticuerpo temporales o persistentes, locales o generalizadas en el mamífero tratado que corresponden a concentraciones de anticuerpo que demuestran ser antihiperplásicamente eficaces en pruebas adecuadas in vitro.

De particular interés para las pruebas in vivo es un modelo de lesión vascular de mandril descrito con mayor detalle en la presente memoria. Este modelo se ha diseñado para simular la respuesta a la lesión que tiene lugar en seres humanos a continuación de varios tipos de tratamientos agudos para abrir arterias ocluidas. La utilización de la angioplastia con globo para la generación de una lesión vascular simula un procedimiento que se utiliza habitualmente para restablecer la circulación sanguínea en las arterias coronarias estrechadas y que conduce a la restenosis en el 30 al 40% de los individuos tratados. Este modelo es por consiguiente particularmente muy aconsejable para probar la utilización de anticuerpos del receptor anti-PDGF o de otros antagonistas de PDGF, solos o junto con heparina.

Otro modelo adecuado para probar la eficacia de la terapia con antagonista de PDGF es un modelo de endoarterectomía de la carótida de mandril. En este modelo se hace una lesión aguda en el área media de la arteria, que conduce posteriormente al desarrollo de una lesión de la íntima (Hanson et al., Hypertension 18: I170-I176, 1991). Este modelo simula la utilización de la endoarterectomía de la carótida para abrir las arterias carótidas en los seres humanos en que ha disminuido la circulación de la sangre debido a la ateroesclerosis avanzada. Un tercer modelo para probar la utilización de la terapia con antagonista de PDGF es un modelo de colocación del injerto vascular del mandril. Se ha demostrado que la colocación de injertos vasculares conduce a la generación de lesiones hiperplásicas en la zona del injerto (Kraiss et al., J. Clin. Invest. 92: 338-348, 1993). Estas lesiones presentan características similares a las de las lesiones hiperplásicas en seres humanos en las zonas de las lesiones vasculares.

Para analizar la eficacia de la terapia del antagonista de PDGF en seres humanos, se pueden utilizar varios tipos de análisis. Éstos incluyen el control de la pérdida de diámetro medio del lumen (MLD) por angiografía en el periodo de 3 a 6 meses después del tratamiento vascular. Los procedimientos alternativos para controlar la eficacia incluyen ultrasonidos intravasculares, ultrasonidos en modo B y detección por imagen por resonancia magnética. Se pueden también utilizar correlaciones clínicas para controlar la eficacia del tratamiento con anticuerpo del receptor anti-PDGF. Éstos incluyen una disminución de los infartos de miocardio y de la recaída en la angina de pecho y la necesidad de repetir la revascularización.

Las concentraciones de la dosis de anticuerpo se calculan a partir de los datos de inhibición después de determinar la eliminación de anticuerpos en la sangre. En general, la dosis se selecciona con el objetivo de mantener los niveles de circulación de los anticuerpos suficientes para inhibir más del 10%, preferentemente al menos del 20 al 50% de la actividad de PDGF en circulación (por ejemplo, la fijación receptor-ligando, la mitogenia estimulada por PDGF o por el suero y/o la migración de VSMC, u otra actividad biológica correlacionada con la función del receptor del PDGF y/o con la regulación de un proceso hiperplásico de la íntima). En general, las dosis estarán comprendidas en el intervalo de aproximadamente 0,1 \mug a 500 mg o más de anticuerpo por kg de peso corporal del paciente al día, preferentemente aproximadamente de 20 \mug a 20 mg/kg/día, más preferentemente aproximadamente de 1 mg a 10 mg/kg/día. Como se indicó anteriormente, la dosis real dependerá en parte de la afinidad y de la actividad del anticuerpo. Se pueden necesitar dosis algo más altas si se administran dos o más anticuerpos en combinación que si se utiliza solo un anticuerpo. Para minimizar los costes de producción del anticuerpo y limitar la inmunotolerancia de los anticuerpos administrados por el paciente, se prefiere utilizar anticuerpos con afinidad elevada que tengan una elevada actividad inhibidora específica, permitiendo la utilización de dosis de aproximadamente 1 mg/kg/día o menos. Se pueden determinar las dosis de antagonistas de PDGF de no-anticuerpo utilizando criterios similares.

En los seres humanos tratados con terapia con anticuerpo del receptor de anti-PDGF, en combinación con heparina, se puede administrar el anticuerpo en un amplio intervalo de condiciones. Se puede administrar el anticuerpo mediante inyecciones rápidas, tanto antes del procedimiento de revascularización así como varias veces después del procedimiento. El anticuerpo se puede administrar como inyección rápida (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea), antes del procedimiento (generalmente 24 horas antes de la intervención quirúrgica) y una infusión continua después del procedimiento (incluyendo la infusión mediante bombas implantadas). En muchos casos será preferible administrar dosis diarias (incluyendo la administración por infusión) durante la estancia en el hospital, seguida de inyecciones rápidas menos frecuentes durante un periodo de tratamiento externo del paciente de una a dos semanas o más. El tratamiento se puede continuar durante más de seis meses después de la lesión inicial. El anticuerpo se puede administrar por múltiples vías incluyendo las inyecciones intravenosa, intramuscular o subcutánea. Además el anticuerpo se puede administrar localmente en la zona de la lesión vascular utilizando catéteres de perfusión con balón, recubrimientos en endoprótesis vasculares o colocación en globos recubiertos de gel. En estos últimos casos sería de esperar que las dosis de anticuerpo fueran sustancialmente menores que las requeridas cuando se administran de forma generalizada. Los anticuerpos se pueden administrar también mediante sistemas de administración de liberación lenta, incluyendo dichos sistemas incorporados en injertos vasculares o en endoprótesis, o mediante perfusión o catéteres dobles con globo. Para la inhibición de estenosis en trasplantes vasculares, los anticuerpos del receptor anti-PDGF se pueden unir covalentemente al trasplante mediante sus zonas constantes o incorporarse al injerto en formulaciones de liberación lenta. Se pueden emplear también bombas u otros sistemas de administración. En cualquier caso, la administración está diseñada para proporcionar la dosis diaria deseada (p. ej., una embolada de 25 mg/kg cinco veces al día para proporcionar 5 mg/kg/día). El modo y ritmo de administración de otros antagonistas de PDGF se puede determinar a partir de las propiedades químicas y físicas del antagonista específico y de los datos farmacocinéticos según los principios aceptados.

Para su utilización en la presente invención, se formulan anticuerpos del receptor anti-PDGF en composiciones inyectables según los procedimientos convencionales y se envasan en recipientes esterilizados. Los anticuerpos se pueden combinar con un diluyente adecuado, tal como con una solución salina esterilizada o agua esterilizada. Las composiciones del anticuerpo pueden contener además vehículos, estabilizantes y excipientes tales como azúcares (p. ej., manitol) o albúmina. Como alternativa se pueden proporcionar anticuerpos en forma liofilizada y redisolver en un diluyente adecuado antes de su utilización. Estas composiciones se pueden envasar en forma de dosificación única o múltiple, por ejemplo en ampollas o viales sellados. Los antagonistas de PDGF no peptídicos se pueden administrar por vía parenteral o enteral (p. ej., por vía oral).

Los medicamentos de la invención, que comprenden un anticuerpo del receptor anti-PDGF o un antagonista de PDGF no anticuerpo se pueden administrar a un mamífero de forma coordinada con heparina, en respectivas dosis unitarias de anticuerpo/antagonista y heparina suficientes para inhibir de forma combinada la hiperplasia de la íntima en el sistema vascular del mamífero. En este contexto, "administración coordinada" se destina a incluir la administración simultánea, independiente o sucesiva del anticuerpo/antagonista y heparina, en la que tanto el anticuerpo/antagonista como la heparina se administran en un periodo de tiempo eficaz de forma combinada, limitada en comparación con otra. Un "periodo de tiempo eficaz de forma combinada" se define como un periodo de tiempo que interviene el máximo entre la administración del anticuerpo/antagonista y la administración de la heparina en el que los dos agentes son eficaces de forma combinada para inhibir la hiperplasia. El término "eficaz de forma combinada" se define a su vez como el que produce una inhibición que se puede medir del espesamiento de la íntima o de la formación de la lesión, o de un proceso hiperplásico, que supera un nivel máximo de inhibición proporcionado independientemente por el anticuerpo/antagonista o por la heparina administrada sola, en condiciones y dosis por lo demás comparables.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "heparina" se refiere a cualquier elemento de una familia de glucosaminoglucanos sulfatados estructuralmente complejos caracterizados en general por una estructura de restos repetitivos de glucosamina y azúcar de ácido glucurónico (Casu, Adv. Carbohyd. Chem. and Biochem. 47:578-583, 1985). La heparina más ampliamente conocida es la heparina "no fraccionada" o "comercial" preparada a partir de pulmón bovino o intestino porcino, que comprende una mezcla heterogénea de moléculas de heparina que oscilan aproximadamente entre 8.000 y 20.000 daltons de peso molecular (Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475-481, 1990). Sin embargo, el término heparina también abarca un amplio intervalo de más preparaciones homogéneas de heparina, así como moléculas similares a la heparina, incluyendo los sulfatos de heparán. Entre estos ejemplos particulares de heparina, son también conocidos los subtipos de heparina más específicos. Por ejemplo, se han aislado grupos de sulfato de heparán producidos por las células endoteliales (Castellot et al., J. Cell. Biol. 90: 372-379, 1981) y por las células de músculo liso (Fritze et al.; J. Cell. Biol. 100: 1041-1049, 1985) los cuales son de forma notoria hasta 40 veces más activos que la heparina no fraccionada para inhibir la proliferación de las células del músculo liso. Además, entre las variantes de tamaño de heparina natural, se ha aislado la especie de heparina fraccionada que presenta de manera predominante actividad anticoagulante o antiproliferante (Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475-481, 1990). Esta última actividad tiende a estar presente en la especie de heparina de bajo peso molecular, tales como las heparinas en el intervalo de penta- a decasacáridos, que se ha descrito que también proporcionan mayor biodisponibilidad y una vida media más prolongada (Id., Bacher et al., Thrombosis Res. 70: 295-306, 1993), y por lo tanto pueden ser particularmente útiles en las formas de realización específicas de la invención. Con objeto de describir la invención, están incluidas asimismo en la definición de heparina, las heparinas sintéticas y los derivados de heparina, una variedad de los cuales se ha producido utilizando técnicas modificadoras y degradadoras de síntesis química convencional, (véase por ejemplo, Roden, L. The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W.J., ed.) págs. 267-371, Plenum Publishing Corp., Nueva York, 1980, incorporada a esta memoria como referencia). El término "heparina de bajo peso molecular con actividad antitrombocítica reducida" se utiliza para indicar las formas de bajo peso molecular con actividad antitrombocítica reducida (determinadas por análisis estándar) en comparación con la heparina no fraccionada.

Para determinar las dosis eficaces de forma combinada de anticuerpo/antagonista y heparina y/o evaluar los periodos de tiempo eficaces de forma combinada para administrar independiente o sucesivamente un antagonista de PDGF y heparina, se utilizan los mismos procedimientos generales descritos anteriormente para determinar la actividad antihiperplásica de los anticuerpos del receptor anti-PDGF y para extrapolar entre las aplicaciones experimentales y clínicas. Estos procedimientos incluyen los ensayos de mitogenia y migración que utilizan cultivos celulares de VSMC o explantes de tejido vascular, así como una variedad de ensayos in vivo que miden la incidencia o el grado de hiperplasia de la íntima en un paciente vivo, entre otros. A partir de estos procedimientos, está demostrado o es de esperar que el nivel de inhibición combinada conseguido de forma coordinada administrando anticuerpo u otro antagonista y heparina varíe dependiendo de los tipos y dosis respectivos de antagonista y heparina utilizados, del ritmo y modo de administración del antagonista y heparina y de otras variables experimental y clínicamente importantes, tales como el tipo de células o tejidos tratados, o la naturaleza y gravedad de la lesión del vaso sanguíneo. Ajustando el régimen de administración coordinado (p. ej., los tipos de heparina y de antagonista, las dosis y los modos o ritmo de administración) a los procedimientos de la invención, se puede optimizar la inhibición combinada de hiperplasia de la íntima para facilitar un amplio intervalo de aplicaciones de la invención. Por ejemplo, se pueden desear diferentes tipos y dosis de anticuerpo y heparina para distintas aplicaciones clínicas. Para pacientes con alto riesgo de complicaciones relacionadas con la trombosis, pueden ser clínicamente deseables formas anticoagulantes de heparina. Otros pacientes pueden ser particularmente vulnerables a las complicaciones de la hemorragia relacionadas con la utilización de formas anticoagulantes de la heparina, en cuyo caso se puede indicar una heparina de bajo peso molecular con actividad antitrombótica reducida. Estas y otras consideraciones clínicas se pondrán de manifiesto para los expertos en la técnica.

Para adaptar la selección de un determinado tipo o dosis de heparina, los procedimientos de la invención permiten la variación conjunta de la forma, ritmo o dosis de anticuerpo o de otro antagonista que se administre de forma coordinada, de modo que el régimen de administración para el anticuerpo u otro antagonista se puede ajustar de forma coordinada para mantener un nivel elevado de inhibición combinada. En otras circunstancias, la forma de dosificación del antagonista, o el ritmo o modo de administración del antagonista se puede imponer por circunstancias extrínsecas, en cuyo caso el régimen de administración de heparina puede necesitar ser ajustado de forma coordinada. Por ejemplo, en circunstancias en las que se desee un régimen de tratamiento del anticuerpo prolongado, se pueden utilizar dosis más bajas de anticuerpo o formas de anticuerpo menos inmunógenas (p. ej., anticuerpos híbridos de ratón/humano) para optimizar los resultados. En tales casos, se puede realizar un ajuste coordinado con respecto al tipo, dosis o ritmo de administrar la heparina para conseguir un efecto potente combinatorio antihiperplásico.

Según la invención, se pueden variar de forma coordinada las dosis de anticuerpo o de otro antagonista y heparina en particular a través de un amplio espectro mientras se mantenga un alto nivel de inhibición combinatoria de hiperplasia de la íntima. Esta característica de la invención es especialmente útil para acomodar las aplicaciones clínicas en las que se desea una dosis de uno u otro agente antihiperplásico (es decir el antagonista o la heparina), tal como en los casos en los que están presentes las toxicidades que limitan la dosis, alergias u otras aplicaciones. En los procedimientos de la invención, se ha observado que los anticuerpos del receptor anti-PDGF administrados de forma coordinada y heparina son eficaces de forma combinatoria en las relaciones de dosis de anticuerpo:heparina (es decir, relación de dosis unitaria de anticuerpo a dosis unitaria de heparina, en peso) que oscila entre 0,001:1 y 1.000;1, y más amplias. En otras palabras, una dosis unitaria de anticuerpo tan baja como 1/1.000 de una dosis de heparina administrada de forma coordinada da un efecto inhibidor combinatorio, en el que las dosis de anticuerpo de 1.000 veces mayores que una dosis de heparina administrada de forma coordinada también da un efecto combinatorio. Esta variabilidad conjunta en general inversamente proporcional de las dosis de anticuerpo y heparina proporciona flexibilidad extrema para llevar a cabo los regímenes de administración coordinada, alternativos que utilizan los dos agentes antihiperplásicos. Al mismo tiempo, la variación conjunta menos extrema de las dosis de anticuerpo y heparina, materializadas en las relaciones de la dosis anticuerpo: heparina entre 0,01:1 y 100:1 y entre 0,05:1 y 20:1, también se ha demostrado que son combinatoriamente eficaces y se seleccionan preferentemente en circunstancias en las que se desean clínicamente las dosis moderadas a extremadamente bajas tanto del anticuerpo como de la heparina.

En general, las dosis de anticuerpo que se han de administrar con heparina de forma coordinada para tratar la hiperplasia de la íntima en mamíferos serán del orden de entre aproximadamente 0,1 \mug a 100 mg de anticuerpo por kilogramo de período de peso corporal de mamífero al día. Preferentemente, las dosis estarán comprendidas entre aproximadamente 50 \mug y 20 mg del anticuerpo por kilogramo al día y más preferentemente menos de 1 mg/kg/día, para conservar los costosos almacenamientos de anticuerpo y limitar los efectos secundarios mientras producen niveles de inhibición satisfactorios. En general, las dosis de heparina estarán comprendidas entre aproximadamente 1 \mug y 100 mg/kg/día. Preferentemente, las dosis de heparina estarán comprendidas entre 20 \mug y 10 mg/kg/día y más preferentemente menos de aproximadamente 1 mg/kg/día. Más específicamente, las dosis de anticuerpo y heparina administradas de forma coordinada de entre aproximadamente 0,5 \mug a 10 mg/kg/día y entre aproximadamente 1 \mug a 10 mg/kg/día, respectivamente, producen resultados eficaces combinatoriamente fuertes a dosis relativamente bajas de ambos agentes antihiperplásicos. Cuando se deseen dosis aún más bajas de anticuerpo y heparina, se prefieren cantidades de anticuerpo y heparina administradas de forma coordinada entre aproximadamente 5 \mug a 2 mg/kg/día y entre aproximadamente 50 \mug a 1 mg/kg/día, respectivamente. Los expertos en la técnica reconocerán que las dosis existentes se determinarán considerando las circunstancias específicas, incluyendo los parámetros del paciente y las características de el/los anticuerpo(s) (p. ej., especificidad, actividad específica, vida media en circulación) y heparina (p. ej., actividad antitrombocítica) administrado(s).

Los anticuerpos del receptor anti-PDGF y la heparina se administran preferentemente por vía parenteral, como por ejemplo mediante inyección rápida o infusión (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea) antes de la intervención quirúrgica (generalmente 24 horas antes de la intervención quirúrgica) y continuando opcionalmente después de la intervención quirúrgica a intervalos de varias horas a varios días durante el transcurso de una a dos semanas o más. En una forma de realización, el anticuerpo se administra como inyección rápida o infusión el primer día del tratamiento en una cantidad suficiente para proporcionar un nivel mínimo en circulación de anticuerpo durante todo el periodo inicial de tratamiento de tres días de entre aproximadamente 20 \mug y 1 mg/kg de peso corporal. A este respecto, se prefiere utilizar anticuerpos que tengan una vida media en circulación de al menos 12 horas, preferentemente al menos de 4 días, más preferentemente hasta 14 a 21 días. Es de esperar que los anticuerpos híbridos y humanizados tengan vidas medias en circulación de hasta cuatro y hasta 14 a 21 días, respectivamente. En muchos casos será preferible administrar diariamente dosis durante la estancia en el hospital, seguida de inyecciones rápidas menos frecuentes durante un periodo de tratamiento del paciente fuera del hospital. Los anticuerpos y la heparina se pueden también administrar en sistemas de liberación lenta, incluyendo dichos sistemas incorporados en injertos o endoprótesis vascular, o por vía de perfusión o catéteres dobles con globo. Se pueden también emplear bombas u otros sistemas de administración conocidos para la infusión continua. Los regímenes de dosificación pueden variar para proporcionar las concentraciones de anticuerpo y de heparina en circulación deseados basados en la farmacocinética de estos agentes. Por lo tanto, las dosis se calcularán de modo que se mantengan los niveles en circulación deseados de agentes terapéuticos. Las dosis diarias referidas a las anteriores se pueden administrar como administraciones en embolada mayores, menos frecuentes para proporcionar la dosis promediada referida al término de la administración. Se pueden administrar por vía enteral antagonistas de PDGF no peptídicos.

Para su utilización en la presente invención, se combinan o se formulan independientemente anticuerpos del receptor anti-PDGF, otros antagonistas de PDGF y la heparina en composiciones adecuadas para administración parenteral (p. ej., intravascular, perivascular o transdérmica), oral o rectal según los procedimientos convencionales y se envasan en recipientes esterilizados. Los antagonistas y la heparina se pueden combinar conjunta o independientemente con un diluyente adecuado, tal como solución salina esterilizada o agua esterilizada. El antagonista, la heparina y las composiciones antagonista/heparina pueden contener además vehículos, estabilizantes y excipientes, como por ejemplo azúcares (p. ej., manitol) o albúmina. Como alternativa, se pueden proporcionar antagonistas y heparina en forma liofilizada u otra estable, anhidra y redisuelta en un diluyente adecuado (que puede estar incluido con el antagonista y la heparina) antes de su utilización. Estas composiciones se pueden envasar en forma de dosificación individual o múltiple, por ejemplo en ampollas o viales sellados. Para otros modos de administración, tal como para administración endovascular para inhibir la estenosis en injertos vasculares, se pueden incorporar antagonistas de PDGF y/o heparina en el injerto en formulaciones de liberación lenta. Los anticuerpos del receptor anti-PDGF se pueden unir covalentemente al injerto a través de sus zonas constantes.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a título de ilustración, no a título de limitación.

Ejemplos

El Ejemplo 1 describe la preparación de anticuerpos monoclonales que producen hibridomas contra los polipéptidos del receptor alfa y beta de PDGF. Los Ejemplos 2, 3 y 4 describen la identificación y caracterización de anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF-beta. El Ejemplo 5 describe la identificación y caracterización de anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF-alfa. El Ejemplo 6 describe la determinación de las especificidades de fijación de determinados anticuerpos monoclonales representativos. El Ejemplo 7 demuestra la inhibición de la actividad mitógena de PDGF en ibroblastos dérmicos humanos utilizando anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF. El Ejemplo 8 demuestra la inhibición de la actividad mitógena de PDGF en las células del músculo liso del mandril utilizando anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF. Los Ejemplos 9 y 10 describen la utilización de los anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF para inhibir la actividad mitógena del suero de mandril. El Ejemplo 11 demuestra la inhibición de la migración celular del músculo liso de la aorta del mandril por los anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF. El Ejemplo 12 demuestra la capacidad de los MAb del receptor anti-PDGF para inhibir la actividad de PDGF hasta ocho horas después de que el ligando se ha unido a los receptores. El Ejemplo 13 describe el desplazamiento del PDGF unido al receptor de las células de osteosarcoma humano por los MAb del receptor anti-PDGF. El Ejemplo 14 demuestra la inhibición de PDGF y la actividad mitógena del suero de mandril sobre las células vasculares del músculo liso utilizando anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF administradas solas o administradas de forma coordinada con heparina. El Ejemplo 15 describe la utilización de heparina, administrada sola o de forma coordinada con anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF, para inhibir la actividad mitógena del suero en las células vasculares del músculo liso de mandril. El Ejemplo 16 describe además los estudios que demuestran la inhibición de la actividad mitógena del suero en las células del músculo liso de mandril utilizando anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF administrando de forma coordinada con heparina. Los Ejemplos 17 y 18 describen estudios que comparan las actividades antimitóticas de anticuerpos del receptor anti-PDGF-alfa y beta murinos y de ratón humano paternos administrados de forma coordinada con heparina. El Ejemplo 19 describe además la actividad inhibidora de la heparina y de los anticuerpos del receptor PDGF administrados de forma coordinada frente a la actividad mitógena del suero. El Ejemplo 20 demuestra la inhibición de la migración externa de las células del músculo liso de explantes aórticos de mandril por anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF administrados de forma coordinada con heparina. Los Ejemplos 21 a 23 describen los estudios de fijación de PDGF y de los anticuerpos del receptor anti-PDGF, en combinación y en presencia y ausencia de heparina, para determinar la fijación potencial o las interacciones de actividad entre PDGF y heparina, y los anticuerpos del receptor anti-PDGF y heparina. El Ejemplo 24 describe los estudios para controlar las concentraciones en circulación de los anticuerpos del receptor anti-PDGF después de la infusión continua de los anticuerpos en el mandril y para medir los anticuerpos de mandril generados contra los anticuerpos del receptor anti-PDGF. El Ejemplo 25 describe estudios para determinar la vida media in vivo de un anticuerpo del receptor anti-PDGF híbrido en un modelo de primate. El Ejemplo 26 describe un modelo de lesión arterial secuencial en mandriles para probar los agentes antihiperplásicos y los tratamientos después de la lesión vascular. El Ejemplo 27 describe un modelo del mandril útil para caracterizar el papel de los anticuerpos del receptor anti-PDGF y heparina para inhibir la hiperplasia de la íntima en los primates después de la lesión vascular aguda.

Se produjeron PDGF AA y BB recombinantes en levadura esencialmente como se describe en las patentes U.S. nº 4.889.919; nº 4.845.075 y nº 5.037.743 y se purificaron hasta homegeneidad a partir del medio del cultivo celular concentrado mediante una combinación de cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía en fase inversa, filtración en gel y fraccionamiento en (NH_{4})_{2}SO_{4}. Se preparó PDGF AB en plaquetas humanas caducadas como describe Hart et al., (Biochemistry 29: 166-172, 1991). Se marcaron PDGF-AA, AB y BB con ^{125}I mediante la utilización de Iodobeads™ (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) como se describió anteriormente (Hart et al., ibid). Se utilizó una forma mutante de la cadena B denominada BB_{tyr}, que tiene un resto de tirosina en la posición 23 de la secuencia de codificación madura en lugar de fenilalanina, para yodación de PDGF-BB. IgG anti-ratón de conejo y MAb 163.31 se radiomarcaron igualente con ^{125}I utilizando Iodobeads™.

Las proteínas de fusión que comprenden una cadena pesada o ligera de IgG humana para el dominio extracelular del receptor PDGF-alfa o el receptor PDGF-beta se prepararon esencialmente como se describe en la patente U.S. nº 5.155.027 y EP 325.224. En un caso las células de mieloma de ratón se transfectaron con los ADNc para las proteínas de fusión con dominio extracelular del receptor de PDGF tanto de cadena pesada como de cadena ligera. Estas células segregan en su medio de cultivo una molécula que es análoga a la IgG humana en la que se compone de proteínas de fusión con dos cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas. Este compuesto se denomina IgG/PDGFr tetramérico. En otro caso, un ADNc para la proteína de fusión con dominio extracelular del receptor PDGF de cadena ligera se transfectó en las células solo. Estas células segregan proteínas de fusión de cadena ligera monomérica en su medio de cultivo, denominadas IgG/PDGFr monoméricas. Las proteínas de fusión del receptor alfa y beta se denominaron IgG/PDGFr-alfa (tetramérica) e IgG/PDGFr-beta (monomérica y tetramérica), respectivamente. Las proteínas de fusión se purificaron por purificación de inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF o por cromatografía en proteína A-Sepharose™.

Ejemplo 1

(no de la invención)

Preparación de anticuerpos monoclonales del receptor de PDGF

Se prepararon proteínas de fusión que comprenden una zona constante de IgG unida al domino extracelular del receptor de PDGF-alfa (PDGFr-alfa) o al receptor de PDGF-beta (PDGFr-beta), esencialmente como se describe en la patente U.S. nº 5.155.027. Las fusiones del receptor alfa y beta se denominaron IgG/PDGFr-alfa e IgG/PDGFr-beta, respectivamente. La IgG/PDGFr-beta monomérica se expresó como una fusión de una zona constante de la cadena kappa ligera humana y del dominio extracelular del receptor de PDGF-beta. La IgG/PDGFr-beta tetramérica se preparó por expresión conjunta de la construcción monomérica con una zona constante con cadena pesada de IgG humana más la secuencia bisagra fusionada al dominio extracelular. Las fusiones del receptor alfa se prepararon por medios similares.

Se inmunizaron ratones Balb/c de ocho semanas con IgG/PDGFr-beta monomérico o tetramérico purificado o IgG/PDGFr-alfa tetramérico purificado. Se administró a los ratones inyecciones intraperitoneales (ip) de aproximadamente 10 \mug de IgG/PDGFr purificada mezclada con adyuvante completo de Freund. Aproximadamente en intervalos de 2 semanas se administró a los ratones inyecciones ip adicionales de IgG/PDGFr-beta o IgG/PDGFr-alfa mezcladas con adyuvante incompleto de Freund.

Se prepararon hibridomas procedentes de los ratones inmunizados en esencia como se describe en la patente U.S. nº 5.094.941. En resumen, se aislaron células de bazo de los ratones y se lavaron. Se eliminaron los glóbulos rojos contaminantes lisándolos con agua destilada y se lavaron las células de bazo. Se eliminó por centrifugación cualquier material de tejido contaminante restante.

Para las fusiones se utilizó la línea celular del mieloma de ratón NS-1 (ATCC TIB 18). Para optimizar la eficacia de la fusión, se determinó la eficacia de la fusión en las células y se seleccionó un clon con una eficacia de fusión elevada. Se cultivaron células NS-1 en medio NS-1 (Tabla 1) a 37ºC, 7% de CO_{2}.

Se utilizaron timocitos obtenidos de ratones pequeños como una capa de alimentación para acondicionar el medio de cultivo para las fusiones celulares. Se obtuvieron glándulas de timo de ratones Balc/c de tres a cuatro semanas, y se aislaron los timocitos como se describe en la patente U.S. nº 5.094.941.

Se añadieron células NS-1 a las células de bazo de ratón inmunizadas preparadas y se realizó la fusión esencialmente como se describe en la patente U.S. nº 5.094.941. Se cultivaron las células en medio NS-1 que contiene 1 x HAT (Tabla 1) y 2,5 x 10^{6} timocitos por ml. Se probó la producción de anticuerpos específicos en hibridomas entre los días 9 y 14. Las fusiones celulares se designaron por números (p. ej. 162, 163).

TABLA 1 Medio NS-1

Para una solución de 500 ml:
5 ml	aminoácidos no esenciales MEM 10 mM (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)
5 ml	piruvato sódico 100 mM (Irvine, Santa Ana, CA)
5 ml	L-glutamina 200 mM (GIBCO BRL)
5 ml	100 x penicilina/estreptomicina/neomicina (GIBCO BRL)
75 ml	suero de ternero fetal inactivado (BioCell, Carson, CA)
1 gm	NaHCO_{3}

Se añade RPMI 1640 (GIBCO BRL) a un volumen total de 500 ml. Se esteriliza por filtración a través de un filtro de 0,22 lm.

Solución madre 100x HT

38,5 mg	timidina
136,10 mg	hipoxantina

Se disuelve la timidina y la hipoxantina en H_{2}O destilada y se lleva hasta un volumen de 100 ml. Se calienta la solución a 60-70ºC para disolver los sólidos. Después que se han disuelto los sólidos, se reajusta el volumen a 100 ml. Se esteriliza por filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. Se almacena congelado a -20ºC.

Solución madre 1000x A

17,6 ng

aminopterina

Se añade agua destilada esterilizada a la aminopterina y se lleva el volumen a 50 ml. Se añade gota a gota NaOH 1 N hasta que se disuelve la aminopterina. Se lleva el volumen final a 100 ml con H_{2}O destilada. Se esteriliza por filtración a través de un filtro 0,22 lm. Se almacena congelado a -20ºC.

50x HAT

50 ml	100x HT
5 ml	1000x solución madre A
45 ml	H_{2}O destilada

Se esteriliza la solución por filtración a través de un filtro 0,22 lm. se almacena congelado a -20ºC.

Tampón ELISA A

Na_{2}HCO_{3} 0,1 M, pH 9,6

NaN_{3} 0,02%

Tampón ELISA B

Este tampón se puede preparar con albúmina de suero bovino al 1% o 2% (BSA, disponible en Sigma Chemical, Co., St. Louis, MO) 5 ó 10 \mug BSA (para BSA al 1% ó 2%, respectivamente)

250 \mul	Tween 20 (Sigma)
100 mg	NaN_{3}

Se añade solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 (PBS, Sigma) hasta un volumen final de 500 ml.

Por otra parte, se puede preparar el tampón como BSA hasta 1% o 2% en tampón ELISA C.

Tampón ELISA C

500 \muL	Twenn 20®(Sigma)
200 mg	NaN_{3}

Se añade PBS hasta un volumen final de 1 litro.

Tampón de reacción

10 ml	citrato de sodio 0,1 M, pH 5,0
5 mg	dihidrocloruro de o-fenilenediamina (Sigma)
5 \mul	H_{2}O_{2} (Sigma)

Tampón de extracción

100 ml	PBS
1,0 ml	Detergente Nonidet P-40 (NP-40) (Sigma) (concentración final 1%)

Medio de fijación

500 ml	F-12 de Ham (GIBCO BRL)
12 ml	Hepes 1 M pH 7,4
5 ml	100x penicilina/estreptomicina/neomicina (GIBCO BRL)
1 gm	albúmina de suero de conejo (Sigma)

TABLA 1 (continuación) Medio Mito

Para una solución de 500 ml:
250 ml	DMEM (GIBCO BRL)
250 ml	F-12 de Ham (GIBCO BRL)
0,25 ml	10 mg/ml de solución madre de insulina (GIBCO BRL) para dar una concentración final de 5 \mug/ml
1 ml	\begin{minipage}[t]{140mm}10 mg/ml de solución madre de transferrina (Collaborative Research, Bedford, MA) para dar una concentración final de 20 \mug/ml\end{minipage}
2 ml	\begin{minipage}[t]{140mm}4 \mug/ml de solución madre de selenio (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) para dar una concentración final de 5 nM\end{minipage}
5 ml	\begin{minipage}[t]{140mm}solución madre al 10% de albúmina de suero bovino (GIBCO BRL) para dar una concentración final del 0,1%.\end{minipage}

Ejemplo 2

(no de la invención)

Identificación y caracterización de hibridomas que producen anticuerpos contra el receptor Beta de PDGF

Se determinó la producción de anticuerpos en hibridomas procedentes de la fusión celular 162 contra el receptor de PDGF-beta. Los ensayos utilizados para la identificación de hibridomas positivos incluían el ensayo de inmunosorbente con enzima ligado (ELISA), la inhibición de la fijación ^{125}I-PDGF-BB a IgG/PDGFr-beta y la inhibición de la fijación ^{125}I-PDGF-BB a los fibroblastos dérmicos humanos.

Se realizaron ensayos ELISA en placas de microvaloración de 96 pocillos que habían sido recubiertas con
IgG/PDGFr-beta monomérico. Para recubrir los pocillos, se diluyó IgG/PDGFr-beta a 200 ng/ml en tampón ELISA A (Tabla 1) y se añadió 100 \mul de la solución a cada pocillo. Se incubaron las placas a 37ºC durante 2 horas. Después de la incubación, se lavaron las placas con tampón ELISA C (Tabla 1). Se incubaron a continuación las placas con 150 \mul/pocillo de tampón ELISA B (Tabla 1) a 37ºC para bloquear las zonas de fijación no específica. Se eliminó el tampón y se lavaron los pocillos con tampón ELISA C.

Se agruparon en grupos de dos los sobrenadantes de la prueba de hibridoma y se añadió 100 \mul de las muestras conjuntas a cada uno de los pocillos de microvaloración. Se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC. Se lavaron las placas con tampón ELISA C, a continuación se incubaron durante 1,5 horas a 37ºC con IgG anti-ratón de conejo conjugado con biotina (Vector Labs, Burlingame, CA). Se lavaron los pocillos con tampón ELISA C, a continuación se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con 100 \mul/pocillo de peroxidasa de rábano picante con estrepavidina (Amersham International, Amersham, R.U.). Se lavaron otra vez los pocillos con tampón ELISA C, a continuación se incubaron con tampón de la reacción (Tabla 1). Se detuvo la reacción por adición de H_{2}SO_{4} 1 N, y se leyeron las placas en un lector de placas ELISA de Dynatech (Dynatech Laboratories, Inc. Alexandria, VA) utilizando un filtro para controlar la absorbancia a 490 nm. Los pocillos con lecturas de A_{490} mayores de 0,2 se consideraron positivos. Las placas experimentales positivas se volvieron a ensayar por ELISA, tal como se describió anteriormente para determinar cada uno de los pocillos de cultivo que contenían células de hibridoma que producen anticuerpo contra IgG/PDGFr-beta.

Se identificó también la inhibición de la fijación de ^{125}I-PDGF-BB a IgG/PDGFr-beta en hibridomas procedentes de la fusión celular 162. Se diluyó IgG anti-humana de cabra (Cappel Labs, Malvern, PA) con tampón ELISA A hasta una concentración final de 2 \mug/ml. Se añadió a continuación esta mezcla a placas de microvaloración de 96 pocillos, 100 \mul/pocillo, y se incubaron las placas durante 1,5 horas a 37ºC. Se lavaron los pocillos con tampón ELISA C, a continuación se incubaron con 200 \mul por pocillo de tampón ELISA B para bloquear las zonas de fijación no específicas. Se lavaron las placas con tampón ELISA C, se incubaron a continuación durante 1,5 horas con IgG/PDGFr-beta tetramérico y se diluyeron con tampón ELISA B hasta una concentración final de 25 ng/ml. Se lavaron los pocillos con tampón ELISA C para eliminar IgG/PDGFr- beta no unida.

Se agruparon en grupos de dos los sobrenadantes de hibridoma y se añadió 100 \mul de las muestras conjuntas a cada uno de los pocillos de microvaloración. Se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC. A continuación se añadió a cada pocillo 50 \mul de ^{125}I-PDGF-BB (aproximadamente 50.000 cpm por pocillo). Después de 1 hora de incubación a 37ºC se lavaron los pocillos tres veces con medio de fijación (Tabla 1). Se añadió 100 \mul de citrato de sodio 0,1 M, pH 2,5, a los pocillos durante 5 minutos a temperatura ambiente, se recogió la solución y se transfirió a tubos de 12x75 mm y se hizo el recuento de los tubos en un contador gamma para determinar el nivel de fijación de ^{125}I- PDGF-BB. Se detectaron los anticuerpos que se unen a IgG/PDGFr-beta y bloquean la fijación a ^{125}I-PDGF-BB por una disminución en el nivel de la fijación ^{125}I-PDGF-BB, comparado con el medio de cultivo solo.

Los grupos del medio que se determinó que eran positivos a anticuerpos que neutralizan a IgG/PDGFr-beta se volvieron a identificar utilizando un formato de análisis similar al descrito anteriormente para identificar cada uno de los pocillos que contenían hibridomas que producen el anticuerpo neutralizante.

Se analizó posteriormente la capacidad para reconocer el receptor de PDGF- beta en fibroblastos dérmicos humanos en un formato de ensayo de regulación por disminución (Hart et al., J. Biol. Chem. 262: 10780-10785, 1987) en las muestras del medio de los pocillos de cultivo que eran positivos a ELISA o a la inhibición de la fijación a ^{125}I-PDGF-BB. La fijación de PDGF-BB al receptor PDGF-beta a 37ºC conduce a la interiorización de los receptores procedentes de la superficie celular y a una disminución subsiguiente en el número de receptores de la superficie celular, fenómeno denominado regulación por disminución. Se colocaron los fibroblastos en placas de cultivo de 96 pocillos a razón de 10.000 células por pocillo y se mantuvieron en el medio de cultivo durante 1 a 2 días antes de su utilización. Se añadió PDGF-BB a un conjunto de pocillos a una concentración final de 100 ng/ml en las células. Se incubaron las células durante 1,5 horas a 37ºC. Se separó el medio de cultivo de las células y se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se lavó a continuación el medio de cultivo de la prueba procedente de las células de hibridoma para duplicar los pocillos de células que habían recibido el tratamiento con PDGF-BB o de las células que se habían dejado sin tratar. Se incubaron posteriormente las células durante 2 horas a 4ºC, se lavaron a continuación con PBS. Se añadió a los pocillos 100 \mul/pocillo de IgG anti-ratón de ^{125}I-conejo (100.000 cpm/pocillo) y se incubaron las células durante 1,5 horas más a 4ºC. Se lavaron las células con PBS, se incubaron a continuación durante 5 minutos a temperatura ambiente con 100 \mul/pocillo de tampón de extracción (Tabla 1). Se recogieron los extractos, se transfirieron a tubos de 12x75 mm y se hizo el recuento en un contador gamma para determinar el nivel de fijación a IgG anti-ratón de conejo con ^{125}I. Si existen anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo de hibridoma capaces de reconocer al receptor de PDGF-beta de la superficie celular, entonces existiría una disminución en el nivel de fijación de IgG anti-ratón de conejo con ^{125}I a las células que se trataron con PDGF-BB para regular por disminución los receptores.

Se identificaron varios hibridomas procedentes de la fusión 162 que hacían de anticuerpos contra el receptor de PDGF-beta. Los hibridomas identificados se clonaron dos veces por dilución limitativa para obtener clones individuales que hacen de anticuerpos monoclonales. Se identificó la producción de anticuerpos en los clones mediante los ensayos descritos anteriormente. Se seleccionó un hibridoma denominado 162.62 para su caracterización posterior.

Ejemplo 3

(no de la invención)

Identificación y caracterización de hibridomas que producen anticuerpos del receptor anti-PDGF Beta

Se determinó la producción de anticuerpos en hibridomas procedentes de la fusión celular 163 contra el receptor de PDGF-beta mediante una combinación del ensayo por competencia de fijación ELISA/PDGF. Estos ensayos se realizaron en placas de microvaloración de 96 pocillos. Las placas se recubrieron inicialmente con 2 \mug/ml de IgG anti-humana de cabra, en tampón ELISA A, durante 2 horas 37ºC. Se lavaron las placas con tampón ELISA C, a continuación se incubaron durante 1 ½ horas a 37ºC con tampón ELISA B para bloquear las zonas de fijación no específicas. Se lavaron las placas con tampón ELISA C, a continuación se utilizaron inmediatamente o se dejaron durante 1 a 4 días a 4ºC hasta su utilización. En el momento del ensayo se lavaron las placas una vez con tampón ELISA C, se incubaron durante 1 ½ horas a 37ºC con IgG/PDGFr-beta tetramérico diluido con 25 ng/ml en el medio de fijación. Se lavaron las placas a continuación con tampón ELISA C para eliminar la IgG/PDGFr-beta no unida.

Se agruparon en grupos de dos los sobrenadantes de la prueba de hibridoma y se añadió 100 \mul de las muestras conjuntas a cada uno de los pocillos de microvaloración. Se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC, a continuación se lavaron las placas con medio de fijación. Se añadió a los pocillos IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Tago, Burlingame, CA) diluida con 1:1000 con medio de fijación. Se incubaron los pocillos durante 1 hora a 37ºC, se lavaron a continuación con medio de fijación para separar la IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP no unido. Se añadió a continuación a los pocillos ^{125}I-PDGF-BB, aproximadamente 26.000 cpm/pocillo, durante 1 hora más a 37ºC. Se lavaron los pocillos con medio de fijación, a continuación se incubaron con tampón de reacción durante el desarrollo de ELISA. Se detuvo la reacción mediante la adición de 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 1 N, y se leyeron las placas en un lector de placas ELISA de Dynatech utilizando un filtro para controlar la absorbancia a 90 nm.

Los contenidos de los pocillos se transfirieron a continuación a tubos de ensayo de 12x75 mm y se hizo el recuento de las muestras en un contador gamma para medir el nivel de fijación de ^{125}I-PDGF-BB.

Los ensayos descritos anteriormente identificaron los cultivos de hibridoma que producen anticuerpos contra IgG/PDGFr-beta por ELISA, así como la capacidad para bloquear la fijación de ^{125}I-PDGF-BB al IgG/PDGFr-beta tetramérico. Estas muestras conjuntas que eran positivas se volvieron a ensayar posteriormente utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente para determinar cada uno de los pocillos de cultivo que contenían las células de hibridoma que producen anticuerpo contra el IgG/PDGFr-beta.

Se determinó posteriormente la capacidad para inhibir la fijación de ^{125}I-PDGF-BB a los fibroblastos dérmicos humanos en cada uno de los pocillos que se observó que era positivo a la fijación a IgG/PDGFr-beta. Se colocaron fibroblastos dérmicos humanos en placas de cultivo de 24 pocillos a razón aproximadamente de 20.000 células por pocillo. Se eliminó el medio de cultivo de las células y se añadió 0,5 ml por pocillo de medio de cultivo de ensayo de hibridoma, para duplicar los pocillos. Como referencia negativa, se añadió medio NS-1 solo, a un conjunto de pocillos. A un segundo conjunto de pocillos se añadió PDGF-BB a una concentración final de 20 ng/ml en medio NS-1 para determinar la fijación específica de ^{125}I-PDGF-BB. Se incubaron las células durante 1 hora a 4ºC, a continuación se añadió a cada pocillo100 \mul/pocillo (aproximadamente 26.000 cpm) de ^{125}I-PDGF-BB. Se incubaron las células durante 1 hora más a 4ºC, se lavaron con PBS, se incubaron con tampón de extracción. Se recogieron los extractos en tubos de 12x75 mm y se hizo el recuento en un contador gamma. Las muestras de la prueba que produjeron una disminución en la fijación de ^{125}I-PDGF-BB, comparadas con las muestras del medio NS-1 fueron analizadas como positivas con relación a la capacidad para inhibir la fijación de PDGF-BB al receptor de PDGF-beta natural en monocapas de fibroblastos dérmicos humanos.

Se identificaron varios hibridomas procedentes de la fusión 163 para que hicieran de anticuerpos contra el receptor de PDGF-beta. Los hibridomas identificados se clonaron dos veces por dilución limitativa para obtener clones individuales que hacen de anticuerpos monoclonales. Se identificó la producción de anticuerpos en los clones mediante los ensayos descritos anteriormente. Se seleccionó un hibridoma denominado 163.31 para su caracterización posterior.

Ejemplo 4

(no de la invención)

Caracterización de los MAb 162.62 y 163.31 del receptor anti-PDGF beta

Se comparó la capacidad para bloquear la fijación de ^{125}I-PDGF-BB a IgG/PDGFr-beta tetramérico o al receptor de PDGF-beta en fibroblastos dérmicos humanos en MAb 162.62 y 163.31 (producidos a partir de los clones 162.62 y 163.31 de hibridoma, respectivamente). Se determinó la inhibición de la fijación de ^{125}I-PDGF-BB a IgG/PDGFr-beta esencialmente como se describió anteriormente para la identificación de la fusión 163 en la íntima. En lugar de añadir medio de cultivo acondicionado, se añadieron cantidades conocidas de anticuerpo diluido en medio NS-1 simultáneamente con ^{125}I-PDGF-BB a los pocillos recubiertos con IgG/PDGFr-beta. Se utilizó medio NS-1 solo como referencia negativa. La adición de 500 ng/ml de PDGF-BB al medio NS-1 se utilizó para determinar el nivel de fijación no específica por ^{125}I-PDGF-BB. Se incubaron los pocillos a 4ºC durante 2 ½ horas, se lavaron a continuación con PBS. Se añadió 100 \mul de citrato 0,1 M, pH 2,5, a cada pocillo para separar ^{125}I-PDGF-BB unido, se transfirieron las muestras a tubos de 12x75 mm y a continuación se hizo el recuento de los tubos en un contador gamma.

Para determinar la fijación a los fibroblastos dérmicos humanos, se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos, fibroblastos a razón de aproximadamente 20.000 células/pocillo. Se utilizaron células para el ensayo 2 a 7 días después de la colocación en las placas. Se diluyeron los anticuerpos en medio fijación a las concentraciones mostradas en la Tabla 2, a continuación se mezclaron con ^{125}I-PDGF-BB y se añadieron alícuotas de 0,5 ml a los pocillos de fibroblastos por duplicado. Se utilizó medio de fijación solo como referencia negativa y se utilizó la adición de 500 ng/ml de PDGF-BB para determinar la fijación no específica de ^{125}I-PDGF-BB. Se incubaron las células durante 2 ½ horas a 4ºC, a continuación se lavaron con medio de fijación para separar el ligando no unido. Se incubaron las células a continuación con tampón de extracción, se recogieron los extractos y se hizo el recuento en un contador gamma.

Los resultados de los estudios de fijación se presentan en la Tabla 2. Los datos se presentan como fijación específica en cpm para ^{125}I-PDGF-BB. Se determinó la fijación no específica mediante la adición de 500 mg/ml de PDGF-BB sin marcar, fue de 260 cpm para los pocillos con IgG/PDGFr-beta y de 105 cpm para los fibroblastos dérmicos humanos y se ha sustraído en los datos presentados. % CB = porcentaje de fijación de referencia.

TABLA 2 Inhibición en MAb de la fijación de ^{125}I-PDGF-BB a IgG/PDGFr-beta y a fibroblastos dérmicos humanos

		IgG/PDGFr	Fibroblastos
Mab	Conc.	CPM	% CB	CPM	% CB
	(\mug/ml)
162.62	1,25	3	0	52	16
	0,62	40	1	71	22
	0,31	71	2	96	30
	0,15	91	3	69	21
163.31	1,25	274	9	244	76
	0,62	499	16	372	116
Referencia		3062	100	322	100

Estos resultados demuestran que tanto los MAb 162.62 como 163.31 son potentes inhibidores de la fijación de PDGF-BB a IgG/PDGF-beta. En cambio, MAb 162.62 es un inhibidor más potente que MAb 163.31 para la fijación de PDGF-BB a fibroblastos dérmicos humanos.

Se analizó también la capacidad de MAb 162.62 para desplazar la fijación de ^{125}I-PDGF a los receptores en monocapas de fibroblastos dérmicos humanos. Se incubó en primer lugar ^{125}I-PDGF-BB con monocapas de fibroblastos dérmicos humanos en placas de cultivo de 24 pocillos. Se lavaron las células con PBS, se incubaron a continuación posteriormente durante 1 hora a 4ºC con MAb 162.62, 5 \mug/ml, o con medio de fijación solo. Se lavaron las células, se incubaron con tampón de extracción y se hizo el recuento de los extractos en un contador gamma para determinar el nivel de fijación a ^{125}I-PDGF-BB. Para determinar la fijación no específica, se añadió 500 ng/ml de PDGF-BB no marcado durante la primera etapa de incubación. Los resultados, presentados en la Tabla 3, demuestran que la adición de Mab 162.62 conduce al 47% de desplazamiento de ^{125}I-PDGF-BB unido previamente. De este modo, MAb 162.62 fue capaz de desplazar PDGF-BB unido al receptor de la superficie de los fibroblastos dérmicos humanos.

TABLA 3 Capacidad de MAb 162.62 para desplazar ^{125}I-PDGF-BB unido al receptor de fibroblastos dérmicos humanos

1ª Inc.	2ª Inc.	Fijación de CPM	Separación de BB
^{125}I-BB	Medio de fijación	581
^{125}I-BB	MAb 162.62	308	47%

Se determinó por ELISA la subclase para los MAb 162.62 y 163.31 utilizando pocillos recubiertos con IgG/PDGFr-beta y la subclase para el anticuerpo secundario específico. Se observó que MAb 162.62 era un isotipo IgG2b mientras que MAb 163.31 se observó que era un isotipo IgG1.

Ejemplo 5

(no de la invención)

Identificación y caracterización de hibridomas que producen anticuerpos del receptor anti-PDGF alfa

Se determinó la producción de anticuerpos en hibridomas procedentes de la fusión celular 169 contra el receptor de PDGF-alfa mediante una combinación del ensayo por competencia de fijación ELISA/PDGF. Estos ensayos se realizaron en placas de microvaloración de 96 pocillos. Las placas se recubrieron inicialmente con 2 \mug/ml de IgG anti-humana de cabra, en tampón ELISA A, toda la noche a 4ºC. Se lavaron las placas con tampón ELISA C, se incubaron a continuación con tampón ELISA B para bloquear las zonas de fijación no específicas. Se lavaron las placas con tampón ELISA C, a continuación se incubaron toda la noche a 4ºC con IgG/PDGFr-alfa diluido a 25 ng/ml en el medio de fijación. Se lavaron las placas a continuación con tampón ELISA C para eliminar el IgG/PDGFr no unido.

Se agruparon en grupos de dos los sobrenadantes de hibridoma y se añadió 75 \mul de las muestras conjuntas a cada uno de los pocillos de microvaloración. Se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC, a continuación se lavaron con tampón ELISA C. Se añadió a los pocillos IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Tago) diluida 1:1000 con medio de fijación. Se incubaron los pocillos durante 1 hora a 37ºC, se lavaron a continuación con tampón ELISA C para eliminar el anticuerpo no unido. Se añadió a continuación a los pocillos ^{125}I-PDGF-AA, aproximadamente 25.000 cpm/pocillo, durante 1 hora más a 37ºC. Se lavaron los pocillos con medio de fijación, a continuación se incubaron con tampón de reacción durante el desarrollo del ELISA. Se interrumpió la reacción mediante la adición de 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 1 N, y se leyeron las placas en un lector de placas ELISA de Dynatech utilizando un filtro para controlar la absorbancia a 490 nm.

Los contenidos de los pocillos se transfirieron a continuación a tubos de ensayo de 12x75 mm y se hizo el recuento de las muestras en un contador gamma para medir el nivel de fijación de ^{125}I-PDGF-AA.

Este ensayo identificó los cultivos de hibridoma que producen anticuerpos contra IgG/PDGFr-alfa por ELISA y controló el anticuerpo que es capaz de bloquear la fijación de ^{125}I-PDGF-AA al IgG/PDGFr-alfa tetramérico. Estas muestras conjuntas que eran positivas en el ensayo inicial se volvieron a ensayar posteriormente utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente para determinar cada uno de los pocillos de cultivo que contenían las células de hibridoma que producen anticuerpo contra el IgG/PDGFr-alfa. Se identificó en varios pocillos la presencia de anticuerpo dirigido contra IgG/PDGFr-alfa. De éstos, se seleccionaron dos para análisis posterior, 169.14 y 169.31. Los hibridomas de estos pocillos se clonaron dos veces limitando la dilución para obtener clones individuales que producen anticuerpos monoclonales contra el receptor de PDGF-alfa. Se identificaron los clones utilizando la combinación de análisis de fijación competitiva ELISA/^{125}I- PDGF-AA descrita anteriormente.

Para comprobar que los MAb 169.14 y 169.31 reconocen el receptor natural de PDGF-alfa en monocapas de células de mamífero, se analizó la capacidad para bloquear la fijación ^{125}I-PDGF-AA a las células alfa T-7 en dos anticuerpos. Estas células son células epiteliales de riñón canino que no expresan de forma natural al receptor de PDGF-alfa, pero que se han transfectado con una codificación de ADNc para el receptor de PDGF-alfa completo (patentes U.S. nº 5.371.205o, nº 5.371.205; publicación PCT WO 90/14425). Estas células expresan aproximadamente 100.000 receptores recombinantes por célula. Las células alfa T-7 se cultivaron en placas de 96 pocillos para una confluencia aproximadamente del 95%. Se retiró el medio de cultivo y se añadieron diluciones de MAb 169.14 y 169.31 a las células. Las referencias fueron medio NS-1 y medio NS-1 conteniendo 500 ng/ml de PDGF-BB para determinar el componente de fijación no específica para ^{125}I-PDGF-AA. A cada pocillo se añadió 100 \mul de la muestra de la prueba más 10 \mul de ^{125}I-PDGF-AA (aproximadamente 22.000 cpm por pocillo). Se incubaron las células con las muestras durante 2 horas a 4ºC, se lavaron con PBS, a continuación se extrajeron con 100 \mul/pocillo de tampón de extracción. Se recogieron los extractos y se hizo el recuento en un contador gamma. Los resultados se presentan en la Tabla 4. Estos resultados demuestran que estos dos Mab reconocen el receptor de PDGF-alfa unido a la membrana en células de mamífero además de IgG/PDGFr-alfa.

TABLA 4 Competencia para la fijación del receptor de PDGF-alfa en las células alfa T-7 entre los MAb del receptor anti-PDGF alfa y ^{125}I-PDGF-AA

Conc. MAb	MAb 169.14	MAb 169.31
(\mug/ml)	CPM	% CB	CPM	% CB
1,5	2	1	8	2
0,75	2	1	15	4
0,37	7	2	18	5
0,18	5	2	15	4

CPM = recuentos por minuto de ^{125}I-PDGF-AA unido en presencia de anticuerpo. El valor no específico, 28 cpm, que se determinó mediante la adición de 500 ng/ml de PDGF-BB a los pocillos, se ha sustraído de los valores de CPM dados. La fijación de referencia fue 392 cpm. % CB = porcentaje de fijación de referencia.

\hrule

Se determinó por ELISA la subclase para los MAb 169.14 y 169.31 utilizando pocillos recubiertos con IgG/PDGFr-alfa y un anticuerpo secundario de subclase específica. Se analizaron tanto los MAb 169.14 como los 169.31 positivos al isotipo IgG2a.

Ejemplo 6

(no de la invención)

Especificidad de fijación de los MAb del receptor de anti-PDGF

Para demostrar la especificidad de fijación de la subunidad del receptor de PDGF, se analizó la fijación a las células del clon 8 y a las células alfa 1-10 en los MAb 162.62, 163.31, 169.14 y 169.31. Las células del clon 8 son células BHK 570 (ATCC CRL 10314) que han sido transferidas con un gen que codifica el receptor de PDGF-beta humano completo (Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435-3439, 1988). Estas células expresan aproximadamente 500.000 receptores de PDGF-beta humanos por célula. Las células alfa 1-10 son células BHK 570 que se han transfectado con un ADNc que codifica al receptor de PDGF-alfa humano completo (patente U.S. nº 5.371.205; publicación PCT WO 90/14425). Estas células expresan aproximadamente 1.000.000 de receptores de PDGF-alfa humano por célula. Para demostrar la especificidad de fijación para el receptor de PDGF-alfa o beta, se realizaron estudios de fijación a la superficie celular utilizando los MAb del receptor de anti-PDGF con estas dos líneas celulares.

Se cultivaron en placas de 24 pocillos tanto las células del clon 8 como las alfa 1-10 hasta confluencia. Se añadió PDGF-BB (200 ng/ml) a una mitad de las células para estimular la regulación por disminución del receptor de PDGF, y se añadió vehículo de referencia (ácido acético 10 mM, albúmina de suero de conejo al 0,25%) a la otra mitad. Se incubaron las células durante 1 a 2 horas a 37ºC, a continuación se lavaron con PBS, se enfriaron a 4ºC. Se añadieron MAb 162.62, 163.31, 169.14 y 169.31 purificados, diluidos a 5 \mug/ml en medio de fijación, a pocillos por triplicado de células tratadas con PDGF-BB y de referencia no tratadas. Se incubaron las células durante aproximadamente 2 horas en hielo, a continuación se lavaron con PBS enfriado para eliminar el anticuerpo no unido. Los pocillos de la prueba se incubaron a continuación en hielo durante 30 minutos con IgG anti-ratón de conejo marcado con ^{125}I, se diluyeron en medio de fijación a aproximadamente 400.000 cpm/pocillo. Se lavaron los pocillos con PBS, a continuación se incubaron con tampón de extracción. Se recogieron los extractos y se hizo el recuento en un contador gamma. Los resultados, mostrados en la Figura 1, demuestraron que únicamente los MAb 162.62 y 163.31 se unieron de forma específica al receptor de PDGF-beta, como se demuestra por la disminución significativa de la fijación a las células del clon 8 tratadas con PDGF-BB en comparación con las referencias no tratadas. El nivel elevado de fijación por MAb 169.14 era debido a un nivel elevado de fijación no específica por este anticuerpo, debido a que no existía disminución significativa en la fijación de IgG anti-ratón de conejo con ^{125}I a las células tratadas con PDGF-BB. En cambio, solamente los MAb 169.14 y 169.31 presentaban la fijación al receptor de PDGF-alfa como se demostró por la fijación específica a las células alfa 1-10 (Figura 2). Debido a la capacidad de estos anticuerpos para unirse al receptor de PDGF en la superficie celular, estos resultados confirman que estos anticuerpos reconocen los epítopos extracelulares en los receptores de PDGF.

Ejemplo 7

(no de la invención)

Neutralización de la actividad mitógena de PDGF en fibroblastos dérmicos humanos

Se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos fibroblastos dérmicos humanos a razón de aproximadamente 20.000 células por pocillo y se cultivaron hasta estabilidad en DMEM (GIBCO BRL) conteniendo suero de ternero fetal al 2%. Las células se estimularon con PDGF-AA, AB o BB. Se realizaron curvas patrón con concentraciones de 5, 1,25, 0,31 y 0 ng/ml de concentración final en las células. Se prepararon diluciones patrón de PDGF con ácido acético 10 mM conteniendo albúmina de suero de conejo al 0,25% y 50 \mul de las muestras de solución madre, o de vehículo solo, se añadió a los pocillos de cultivo para dar las concentraciones finales deseadas. Para analizar la capacidad de los MAb 162.62 y 169.14 para neutralizar la actividad mitógena de cada uno de los tres ligandos de PDGF, se añadió 5 ng/ml de PDGF a los pocillos junto con 20 \mug/ml (concentración final de las células) de los MAb 162.62 y 169.14 solos ó 20 \mug/ml de un grupo de los dos anticuerpos. Se incubaron las células con las muestras de la prueba durante aproximadamente 20 horas a 37ºC. Se aspiró el medio, a continuación se sustituyó con 1 ml de DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 5% y complementado con 37 kBq/ml (1 \muCi/ml) de [^{3}H]timidina. Se incubaron las células durante 4 horas a 37ºC, se lavaron con PBS, a continuación se recogieron con tripsina y se hizo el recuento para la incorporación de [^{3}H]timidina en un contador de centelleo líquido Betaplate™ de Wallac (Turku, Finlandia).Los resultados, presentados en la Figura 3A, demuestran que MAb 169.14 inhibió la actividad mitógena de PDGF-AA así como el grupo del anticuerpo, pero no MAb 162.62. MAb 162.62 inhibió la actividad mitógena de PDGF-AB aproximadamente el 80% y MAb 169.14 o el grupo de anticuerpo más del 92% (Figura 3B). En cambio MAb 169.14 inhibió la actividad de PDGF-BB solamente al mínimo, pero MAb 162.62 la inhibió aproximadamente el 80% y el grupo del anticuerpo más del 92% (Figura 3C).

Estos resultados son compatibles con el modelo de fijación al ligando de PDGF que describe que PDGF-AA se une a los dímeros del receptor de PDGF-alfa/alfa, PDGF-AB se une a los dímeros del receptor PDGF-alfa/alfa y de -alfa/beta y PDGF-BB se une a los tres dímeros del receptor de PDGF; -alfa/alfa, -alfa/beta y -beta/beta (estudiados en Hart et al, J. Invest. Derm. 94: 535-575, 1990). De este modo, si MAb 169.14 se une a PDGF e inhibe la fijación de PDGF al receptor alfa, entonces sería de esperar que inhibiese esencialmente el 100% de la actividad mitógena de PDGF-AA y AB, ya que la fijación del receptor alfa es necesaria para ambos ligandos. Este modelo es compatible con los resultados descritos anteriormente. La fijación y la inhibición del receptor de PDGF-beta por MAb 162.62 sería de esperar entonces que limitase la cantidad de PDGF-AB y BB mitógeno hasta un nivel que fuera compatible con PDGF-AA, ya que AB y BB solamente serían capaces de unirse a los dímeros alfa/alfa. De nuevo, esto es compatible con los descubrimientos del estudio descrito anteriormente.

En resumen, los MAb 162.62 y 169.14 del receptor anti-PDGF son capaces de inhibir la actividad mitógena de las tres formas de PDGF de manera que son compatibles con la hipótesis actual para la fijación del receptor de PDGF por los tres ligandos de PDGF. Además, la utilización de los dos anticuerpos en conjunto es capaz de inhibir esencialmente el 100% de la actividad mitógena de PDGF en los fibroblastos dérmicos humanos.

Ejemplo 8

(no de la invención)

Inhibición de la actividad mitógena de PDGF en las células del músculo liso de mandril

Se analizó la capacidad para inhibir la actividad mitógena de PDGF de los MAb del receptor anti-PDGF en células del músculo liso de mandril. Todos los ensayos de mitogenia realizados en las células vasculares del músculo liso de mandril (BVSMC) se realizaron en cultivos primarios de células entre los pasos 3 y 7 en el cultivo. Los cultivos iniciales se establecieron a partir de la excrecencia de explantes de tejido aórtico. Se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos células de músculo liso de mandril a razón aproximadamente de 30.000 células por pocillo, en DMEM complementado con suero de ternero fetal al 10%. Dos días antes de la utilización se retiró el medio de cultivo y se añadió 1 ml de medio Mito (Tabla 1) a cada pocillo para estabilizar las células. En el momento del experimento se estimularon las células con PDGF-AA, AB o BB. Se realizaron curvas patrón para cada uno de los tres ligandos utilizando las concentraciones finales mostradas en las Figuras 4 a 6. Se prepararon 20x soluciones madre para cada una de las concentraciones de PDGF por dilución en ácido acético 10 mM conteniendo albúmina al 0,25% y 50 \mul de PDGF o se añadió vehículo de dilución solo a los pocillos de cultivo.

Para los ensayos de mitogenia, se utilizaron concentraciones finales de PDGF de 10, 2 y 1,25 ng/ml para PDGF-AA, AB y BB respectivamente. Se añadieron los MAb 163.31 y 169.31 a los pocillos que contenían PDGF a una concentración final de 25 \mug/ml. Para los grupos de los dos anticuerpos, la concentración final de anticuerpo en las células fue 25 \mug/ml total, o 12,5 \mug/ml para cada uno de los MAb. Se incubaron las células entre 20 a 24 horas a 37ºC. Para los estudios de PDGF-AA y AB, se añadió a cada pocillo 50 \mul de una solución de 1,48 mBq/ml (40 \muCi/ml) de [^{3}H]timidina. Para el estudio de PDGF-BB se aspiró el medio, se sustituyó a continuación con 0,5 ml de DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 5% y se complementó con 74 kBq/ml (2 \muCi/ml) de [^{3}H]timidina. Se incubaron las células entre 2 y 4 horas a 37ºC, se lavaron con PBS, se recogieron a continuación con tripsina y se hizo el recuento para la incorporación de [^{3}H]timidina en un contador de centelleo líquido Betaplate™ (Wallac). Como se muestra en la Figura 4, MAb 169.31 así como por el grupo de anticuerpos inhibieron el 100% la actividad mitógena de PDGF-AA, pero no MAb 163.31. La actividad mitógena de PDGF-AB fue inhibida completamente tanto por cada MAb así como por el grupo de anticuerpos (Figura 5). Es interesante observar que el nivel de incorporación de [^{3}H]timidina en presencia de los MAb fue inferior al nivel obtenido solamente con la adición del vehículo de referencia. Esto se observó igualmente con MAb 169.31 en la placa de PDGF-AA (Figura 4). Para las células estimuladas con PDGF-BB, MAb 169.31 y MAb 163.31 dieron menos del 50% de inhibición cada una, mientras que un grupo de dos anticuerpos fue capaz de inhibir aproximadamente el 75% de la actividad mitógena de PDGF (Figura 6).

Para demostrar además la potencia inhibidora de estos anticuerpos para neutralizar la actividad mitógena de PDGF en células del músculo liso de mandril, se analizó la capacidad para inhibir la actividad mitógena de PDGF-AA en los MAb 169.14 y 169.31 del receptor anti-PDGF-alfa. Se colocaron en placas las BVSMC y se trataron esencialmente como se describió anteriormente. A un conjunto de pocillos se añadieron concentraciones crecientes de PDGF-AA con el fin de generar una curva patrón de actividad mitógena de PDGF-AA (Figura 7A). Las muestras de PDGF-AA se ordenaron en sentido decreciente de 10 ng/ml a 0,31 ng/ml. A un segundo conjunto de pocillos, se añadió una dilución patrón de PDGF-AA para dar una concentración final de 10 ng/ml. Se añadieron a continuación concentraciones decrecientes de MAb 169.14 y 169.31 a los pocillos para controlar la potencia inhibidora para cada uno de los MAb, determinada por una disminución en el nivel de incorporación de [^{3}H]timidina (Figura 7B). Los descubrimientos demostraron que incluso a 8 g/ml de anticuerpo, la inhibición era mayor del 90% de una solución de 10 ng/ml de PDGF-AA.

Ejemplo 9

(no de la invención)

Inhibición de la actividad mitógena del suero de mandril en las células del músculo liso de mandril

Se analizó la capacidad para inhibir la actividad mitógena del suero de mandril de los Mab del receptor anti-PDGF en células del músculo liso de mandril. Se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos las BVSMC a razón aproximadamente de 30.000 células por pocillo, en DMEM complementado con suero de ternero fetal al 10%. Tres días antes de la utilización se retiró el medio de cultivo y se añadió 1 ml de medio Mito (Tabla 1) a cada pocillo para estabilizar las células. En el momento del experimento se estimularon las células con cantidades variables de suero de mandril.

Se generó una curva patrón para la muestra de suero. Se prepararon 20x soluciones madre para cada una de las concentraciones de suero y se añadió 50 \mul de la dilución de suero o del vehículo de dilución, PBS, a los pocillos de cultivo para dar concentraciones finales de suero en las células que oscilan entre 2,5% hasta 0,15% en sentido decreciente. Se analizó la capacidad para inhibir la actividad mitógena del suero de mandril en los MAb 169.31 y 163.31. Para los estudios de inhibición del anticuerpo se utilizó una concentración final de suero del 2,5%. Se añadieron los MAb 169.31 y 163.31 a los pocillos que contienen suero a una concentración final de 25 \mug/ml. Para los grupos de dos anticuerpos, la concentración final de anticuerpo en las células fue de 25 \mug/ml total ó 12,5 \mug/ml para cada uno de los MAb. Se incubaron las células con las muestras de suero durante aproximadamente 20 horas a 37ºC. En este tiempo se aspiró el medio de las células, se sustituyó con 0,5 ml de DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 5% y complementado con 74 kBq/ml (2\muCi/ml) de [^{3}H]timidina. Se incubaron las células durante aproximadamente 3 horas a 37ºC, se lavaron con PBS, a continuación se recogieron con tripsina y se hizo el recuento para la incorporación de [^{3}H]timidina en un contador de centelleo Betaplate™ (Wallac). Los resultados, presentados en la Figura 8, demuestran que MAb 169.31 inhibe al mínimo la actividad mitógena del suero de mandril, pero MAb 163.31 la inhibe más del 50%. El grupo de los dos anticuerpos inhibió más del 75% la actividad mitógena del suero.

Estos resultados demuestran que se puede inhibir la mayoría de la actividad mitógena en el suero de mandril en relación con las células del músculo liso de mandril, mediante la utilización de anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF. Los estudios de los inventores han demostrado que la forma predominante de PDGF en las plaquetas de mandril es PDGF-BB. Debido al porcentaje mayor de receptores de PDGF-beta en las células del músculo liso de mandril, es compatible que el MAb del receptor de anti-PDGF-beta tenga una actividad inhibidora mayor en relación con el suero del mandril.

Ejemplo 10

(no de la invención)

Efecto del MAb 169.31 circulante sobre la actividad mitógena del suero de mandril

Se realizó un estudio para comprobar las concentraciones en circulación de MAb 169.31 después de la administración de una inyección intravenosa (i.v.) rápida de 25 mg en un mandril. Se extrajo suero en varios intervalos después de la inyección del anticuerpo y se determinó por ELISA la concentración de anticuerpo en circulación. Se añadió IgG anti-ratón de oveja a las placas de microvaloración de 96 pocillos en tampón ELISA A a una concentración de 2 \mug/ml. Se incubaron las placas toda la noche a 4ºC, se lavaron con tampón ELISA C, a continuación se incubaron con tampón ELISA B para bloquear las zonas de fijación no específica. Se lavaron las placas con tampón ELISA C, a continuación se incubaron con 100 \mul/pocillo de muestra de la prueba. Se diluyó el plasma o el suero de mandril que contiene anticuerpo monoclonal 169.31 a 1:1000 con tampón ELISA B y se añadió a los pocillos de la prueba. Patrones, consistentes en MAb 169.31 purificado reforzados con plasma o suero de mandril de referencia, se diluyeron a 1:1000, igual que las muestras de plasma/suero de la prueba, a continuación se añadieron a los pocillos de la prueba. Se ordenaron los patrones desde 100 ng/ml hasta 1,56 ng/ml de concentración final en los pocillos de ensayo. Se incubaron las muestras de plasma/suero en los pocillos durante 1 a 2 horas a 37ºC, se lavaron los pocillos con tampón ELISA C, a continuación se añadió IgG anti-ratón de cabra con peroxidasa de rábano picante. Se incubaron los pocillos durante 1 hora a 37ºC, se lavaron con tampón ELISA C, a continuación se incubaron con tampón de reacción. Se interrumpió la reacción por adición de H_{2}SO_{4}1 N y se leyeron las placas en un lector de placas ELISA a 490 nm. El análisis ELISA de las muestras de suero de mandril para las concentraciones en circulación de MAb 169.31 indicó que la vida media in vivo de este anticuerpo murino era aproximadamente de 15 horas.

Además, se determinó la potencia mitógena relativa de las muestras de suero obtenidas a la hora y a las 18 horas siguientes de la inyección. En esos momentos se determinaron las concentraciones en circulación de anticuerpo en el mandril, que eran 46 \mug/ml y 21 \mug/ml, respectivamente. Se comparó a continuación la actividad mitógena relativa en las muestras de suero de 1 hora y de 18 horas con la de una muestra de suero de referencia. Las diluciones de las muestras de suero se añadieron a las células de músculo liso vascular de mandril que se habían cultivado esencialmente como se describió en el estudio de suero de mandril presentado anteriormente. Las concentraciones finales de suero en las células de músculo liso se ordenaron desde 1,25% hasta 0,15% en sentido decreciente. Se controló la concentración de incorporación de [^{3}H]timidina en las células del músculo liso de mandril, como medio para determinar la actividad mitógena, esencialmente como se describió anteriormente.

Los resultados, presentados en la Figura 9, demuestran que existió una disminución significativa en la potencia mitógena relativa tanto para las muestras de suero de 1 hora como para las de 18 horas en comparación con la muestra de referencia, siendo la actividad mitógena en la muestra de las 18 horas intermedia entre la de las muestras de referencia y la de 1 hora. El nivel de neutralización por MAb 169.31 que estaba presente en la muestra desuero de las 18 horas es compatible con el nivel de neutralización obtenido cuando se añadía ex vivo este anticuerpo para controlar el suero de mandril (Figura 8). Por lo tanto, estos resultados demuestran que el MAb 169.31 que circula durante al menos 18 horas la sangre de mandril conserva esencialmente toda su actividad biológica para inhibir la actividad mitógena del suero de mandril en las células de músculo liso de mandril.

Ejemplo 11

(no de la invención)

Inhibición de la excrecencia celular en explantes aórticos de mandril

Se determinó la capacidad para disminuir la velocidad de migración hacia el exterior de las células del músculo liso procedentes de explantes de tejido aórtico de mandril. El medio interno de la aorta torácica de los mandriles se diseccionó en medio de cultivo DMEM que contenía Hepes 10 mM. Se seccionó el tejido aórtico en secciones cuadradas de 1 mm y se colocaron los explantes en matraces de cultivo de tejido. Después de 10 minutos de incubación para dar tiempo a que se adhieran los explantes a los matraces, se añadió a los explantes el medio de cultivo DMEM más 6 \mug/ml de insulina y 5 \mug/ml de transferina y se incubaron las muestras a 37ºC con CO_{2} al 5%. Se colocaron un total de 15 explantes en cada matraz de cultivo. En varios momentos después de colocar los explantes se examinaron al microscopio de alta potencia para hacer el recuento del número de explantes que tenían excrecencia celular visible en la placa de cultivo. Los explantes se consideraban positivos si al menos una célula migraba desde el tejido del explante a la superficie de la placa de cultivo. Se hizo el seguimiento de los explantes durante al menos siete días. En el experimento nº 1, los explantes se cultivaron en el medio de cultivo DMEM complementado con insulina y transferrina que contenía las siguientes muestras de la prueba: 1) MAb (169.31) del receptor anti-PDGF alfa a 50 \mug/ml; 2) MAb (163.31) del receptor anti-PDGF beta a 50 \mug/ml; o 3) medio DMEM solo (referencia). En el experimento nº 2, los explantes se cultivaron en DMEM más insulina y transferrina, y ambos: 1) un grupo de los MAb (169.31 y 163.31) de los receptores anti-PDGF alfa y beta a 25 \mug/ml de cada uno; 2) medio DMEM solo (referencia).

Los resultados, presentados como porcentaje medio de los explantes positivos para la excrecencia celular +/- SEM para cada condición de la prueba (Tabla 5), demuestran que cada uno de los anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF, así como en grupos, son capaces de disminuir el nivel de excrecencia celular del músculo liso en los explantes aórticos de mandril cuando se miden a los cuatro o siete días. Estos descubrimientos indican que estos anticuerpos son capaces de inhibir los procesos requeridos para la migración celular a través de una matriz sólida, tal como se necesitaría para que las células migrasen a través del tejido vascular existente hacia las zonas de hiperplasia de la íntima.

TABLA 5 Migración de las células vasculares del músculo liso de los explantes de tejido aórtico de mandril

2

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Ejemplo 12

(no de la invención)

Inhibición de la actividad mitógena de PDGF en fibroblastos dérmicos humanos para adición retardada de anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF

Se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos fibroblastos dérmicos humanos a razón de aproximadamente 20.000 células por pocillo y se cultivaron hasta estabilidad en DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 2%. Las células se estimularon con PDGF-AA, AB o BB. Se añadieron concentraciones crecientes de cada uno de los ligandos PDGF a las células para generar curvas patrón de potencia mitógena para las tres isoformas de PDGF. Las concentraciones finales de PDGF utilizadas para los patrones fueron 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 0,15 y 0,0 ng/ml. Se prepararon 50\times soluciones madre de PDGF en ácido acético 10 mM conteniendo albúmina de suero de conejo al 0,25%. Se añadió 25 \mul de cada una de las soluciones madre a los pocillos de ensayo por triplicado. Para observar la actividad inhibidora por los MAb 162.62 y 169.14, los pozos que contenían los fibroblastos se incubaron con 5 ng/ml de PDGF, de concentración final. En varios intervalos de tiempo después de la adición de las muestras de PDGF (1, 2, 4, 6 y 8 horas), se añadió una muestra conjunta de Mab 162.62 y MAb 162.62, concentración final de 25 \mug/ml para cada MAb, por triplicado a los pocillos de las células que se habían tratado con 5 ng/ml de PDGF. Nueve horas después de la adición de las muestras de PDGF, se añadió a cada pocillo 50 \mul de [^{3}H]timidina, 20 \muCi/ml en DMEM conteniendo 1% de suero de ternero fetal. Se incubaron las muestras durante otras 13 a 15 horas a 37ºC. Se lavaron las células con PBS, a continuación se recogieron en tripsina y se hizo el recuento en un contador de centelleo líquido Betaplate™ (Wallac).

Los resultados, presentados en la Tabla 6, se expresan como cpm media de [^{3}H]timidina incorporada +/- desviación estándar, para las determinaciones por triplicado. Se dan los datos tanto para las curvas patrón de PDGF como para el transcurso del tiempo de adición del anticuerpo. Los resultados demuestran que existía una disminución del 75% en la actividad mitógena para PDGF-AA cuando se añadían anticuerpos del receptor anti-PDGF a las células todavía a las 8 horas siguientes de la adición del ligando PDGF. Tanto para PDGF-AB como para BB, la adición de los anticuerpos del receptor anti-PDGF 8 horas después de la adición del ligando PDGF produjo una disminución mayor del 90% de la actividad mitógena de PDGF. Estos estudios demostraron que se pueden añadir anticuerpos monoclonales del receptor anti-PDGF a las células en periodos prolongados después de la presencia del ligando PDGF y todavía tienen potentes efectos neutralizantes frente a la actividad mitógena de PDGF.

TABLA 6

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3

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Ejemplo 13

(no de la invención)

Desplazamiento de ^{125}I-PDGF unido al receptor en las células de osteosarcoma humano por los MAb del receptor anti-PDGF

Se analizó la capacidad para desplazar ^{125}I-PDGF-AA e ^{125}I-PDGF-BB unidos a los receptores de PDGF de los 4 MAb 162.62, 163.31, 169.14 y 169.31 en monocapas de células de osteosarcoma humano (ATCC CRL 1427) que expresa aproximadamente cantidades iguales de PDGFr-alfa y PDGFr-beta. Se incubaron monocapas de células de osteosarcoma humano, cultivadas en placas de cultivo de 24 pocillos, durante 1 hora a 4ºC con ^{125}I-PDGF-AA o ^{125}I-PDGF-BB diluido en el medio de fijación. Se lavaron las células con PBS, a continuación se añadió a cada pocillo 1 ml de medio de fijación solo, MAb 169.14, 169.31, 162.62, 163.31 o un grupo de 169.31 y 162.62. Se diluyeron los anticuerpos en el medio de fijación y se añadió a las células 1 ml/pocillo a una concentración de 5\mug/ml. Se lavaron las células durante 1 hora a 4ºC, a continuación con PBS, se incubaron con tampón de extracción, a continuación se recogieron y se hizo el recuento en un contador gamma para controlar el nivel de fijación de ^{125}I-PDGF. Se añadió 100 ng/ml de PDGF-BB a los pocillos por triplicado con ^{125}I-PDGF-AA y ^{125}I-PDGF-BB para determinar los niveles de fijación no específica. Los resultados, presentados en la Tabla 7, se muestran como cpm específicos unidos (desv. est.) para ^{125}I-PDGF-AA e ^{125}I-PDGF-BB después de la segunda incubación con los compuestos de la prueba relacionados. Se determinó el valor del % de desplazamiento comparando la cpm unida para las muestras de la prueba con la cpm unida en los pocillos con medio de fijación solo. Los resultados demuestran que los MAb del receptor anti-PDGF alfa, 169.14 y 169.31, eran capaces de desplazar aproximadamente el 63% del ^{125}I-PDGF-AA previamente unido. En cambio, los MAb del receptor anti-PDGF beta, 162.62 y 163.31, no presentaban esencialmente ningún efecto, desplazándo menos del 10% de los recuentos. Para la fijación de ^{125}I-PDGF- BB, los MAb 169.14 y 169.31 fueron capaces de desplazarse entre el 22 y 25% de los recuentos previamente unidos mientras que MAb 162.62 fue capaz de desplazar el 34% de los recuentos. El grupo de 169.31 y 169.32 desplazó el 44% del ^{125}I-PDGF-BB unido previamente. Estos resultados demuestran que, además de ser capaces de bloquear la fijación de PDGF, los MAb del receptor anti-PDGF fueron también capaces de desplazar a PDGF-AA y BB unidos previamente en los receptores de la superficie de la célula.

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TABLA 7 Capacidad de los MAb del receptor anti-PDGF para desplazar ^{125}I-PDGF-AA y ^{125}I-PDGF-BB unido al receptor de las células de osteosarcoma humano

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4

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Ejemplo 14 Inhibición de la mitogenia de las células del músculo liso estimulada con suero de mandril y PDGF-BB por los MAb de anti-PDGFr aplicados de forma independiente o coordinada con heparina

Se analizaron MAb 169.31 anti-PDGF-alfa y MAb 163.31 anti-PDGFr-beta independientemente y en análisis de administración coordinada con heparina, para determinar la capacidad de los anticuerpos para inhibir la actividad mitógena de PDGF-BB y de suero de mandril en las BVSMC.

Para evaluar la actividad de los dos anticuerpos solos y para evaluar las actividades inhibidoras combinatorias de los anticuerpos administrados de forma coordinada con heparina, se colocaron en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos, a razón de 3,0 x 10^{4} células por pocillo en DMEM (GIBCO BRL) complementadas con suero de bovino fetal al 10%, células del músculo liso de las venas de mandril, en el paso 7 después de la excrecencia. Se mantuvieron las células en este medio durante tres días a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Se sustituyó a continuación el medio con 1 ml/pocillo de medio Mito y se cultivaron las células durante otras 24 horas.

En una primera serie de experimentos, se diluyó PDGF-BB con ácido acético 10 mM conteniendo albúmina de suero de conejo al 0,25% hasta una concentración de 40 ng/ml. A continuación se añadió 50 \mul de esta dilución de la solución madre a cada pocillo para dar una concentración final de 2 ng/ml en las células. A determinados pocillos de ensayo, se añadió heparina no fraccionada (UH) (Sigma Chemical, Co., St. Louis, MO) administrada sola o de forma coordinada con uno o más de los anticuerpos de PDGFr. La UH empleada para estos estudios fue una mezcla de especies de heparina de múltiples tamaños, con una actividad específica de aproximadamente 150 Unidades/mg en un análisis de tiempo normalizado con tromboplastina parcial activada (APTT). La adición de heparina a las células se realizó diluyendo la heparina a una concentración de 400 \mug/ml de la solución madre en PBS, y añadiendo 25 \mul de la solución de heparina a los pocillos apropiados para dar una concentración final de heparina de 10 \mug/ml en las células. Se diluyeron los anticuerpos anti-PDGFr con PBS para dar concentrados de solución madre 40x, a continuación se añadió 25 \mul de la solución de anticuerpos a los pocillos de ensayo apropiados. Aquellos pocillos que recibieron únicamente anticuerpo o heparina recibieron independientemente 25 \mul de PBS como tampón de referencia.

Se generó un perfil dosis-respuesta para la estimulación de PDGF-BB haciendo diluciones 2 veces de la PDGF con ácido acético 10 mM que contenía albúmina de suero de conejo y añadiendo 50 \mul de las soluciones madre a los pocillos apropiados para dar concentraciones finales de PDGF-BB en las células de 2,1 y 0,5 ng/ml.

Después de la adición de los tratamientos, se incubaron las células durante 20 horas a 37ºC. Se evaluó la estimulación mitógena de las BVSMC midiendo la absorción de [^{3}H]timidina. Se añadió directamente a las células 50 \mul de una solución madre de [^{3}H]timidina de 740 kBq/ml (20 \muCi/ml) preparada en DMEM; para una concentración final de 37 kBq/pocillo (1 \muCi/pocillo). Se incubaron las células durante 4 horas a 37ºC, se lavaron una vez con PBS, se trataron con 0,25 ml de tripsina hasta que se separaron las células y se recogieron en un filtro utilizando un recolector de células (LKB Wallac). Se hizo el recuento de los filtros utilizando un contador de centelleo líquido Betaplate™ (Wallac).

En la Tabla 8 se presentan los datos de la estimulación con PDGF-BB para la inhibición del anticuerpo y de anticuerpo/heparina. Los datos de la Tabla 8 se presentan como recuentos medios por minuto (cpm) de [^{3}H]timidina incorporada por las células del músculo liso de mandril estimuladas por PDGF-BB. Se determinaron directamente los valores de porcentaje de inhibición a partir de la disminución de la incorporación de [^{3}H]timidina medida. En la Tabla 8 se incluye una tabla de dosis-respuesta de la actividad mitógena de PDGF-BB. En el Experimento nº 1, la adición de anticuerpo 169.31 a las células estimuladas con PDGF-BB produjo una inhibición notable en la incorporación de [^{3}H]timidina a las dosis de 1 y 0,1 \mug/ml. La administración de heparina a las células de manera coordinada con anticuerpo 169.31 produjo un resultado anti-mitógeno combinatoriamente eficaz, es decir, la incorporación de [^{3}H]timidina se inhibió en mayor grado que la medida tanto para el anticuerpo como para la heparina administrados solos. El análisis del anticuerpo 163.31, Experimento nº 1, demostró que una dosis de 25 \mug/ml era capaz también de inhibir la incorporación de [^{3}H]timidina, pero en un nivel mucho menor que el observado para el anticuerpo 169.31. Al añadir heparina junto con el anticuerpo 163.31, se observó también una inhibición combinatoriamente eficaz, pero este efecto se observó únicamente a las concentraciones mayores de anticuerpo. La aplicación coordinada de los anticuerpos 169.31 (1 \mug/ml) y 163.31 (25 \mug/ml) se produjo también en un resultado combinatoriamente anti-mitótico, en el que la inhibición de la incorporación de [^{3}H]timidina estimulada con PDGF-BB por las BVSMC fue mayor que la observada después de la administración de uno de los dos anticuerpos solos.

En el Experimento nº 2, se analizaron además los anticuerpos 169.31 y 163.31, tanto en análisis por administración independiente como coordinada con otro o con heparina (UH, 10 \mug/ml), para determinar las actividades anti-mitóticas de los diversos tratamientos en la incorporación de [^{3}H]timidina estimulada con PDGF-BB por las BVSMC. Igual que en los resultados del Experimento nº 1, la administración coordinada de los dos anticuerpos proporcionó una inhibición más eficaz de la actividad mitógena en las BVSMC que la administración de uno de los dos anticuerpos solo. Además, la administración coordinada de heparina con un grupo de los dos anticuerpos condujo a la inhibición combinatoriamente eficaz por encima de la actividad inhibidora proporcionada por la heparina o por el grupo de anticuerpos solo.

En resumen, estos datos demuestran que la administración coordinada de heparina con los anticuerpos anti-PDGFr-alfa o anti-PDGFr-beta o con un grupo de los dos anticuerpos, así como la administración coordinada de los anticuerpos con otro, puede proporcionar un tratamiento combinatoriamente eficaz contra la actividad mitógena de PDGF-BB en las BVSMC.

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TABLA 8 Inhibición de la actividad mitógena de PDGF-BB por los MAb anti-PDGFr administrados de forma independiente o coordinada con heparina

Experimento 1

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Experimento 2

6

Se determinó la inhibición de la actividad mitógena del suero de mandril en una serie de experimentos en paralelo. Los experimentos se realizaron esencialmente como se describió anteriormente, añadiendo suero de mandril a los pocillos de ensayo a una concentración final de 1,25%, diluyendo el suero 1:4 con PBS y añadiendo 50 \mul del suero diluido a cada pocillo. Se generó un perfil dosis-respuesta para la estimulación del suero de mandril realizando diluciones dos veces del suero de mandril en PBS y añadiendo 50 \mul de las diluciones apropiadas a las concentraciones dadas de suero final de 1,25, 0,62, 0,31 y 0,15% en las células.

En la Tabla 9 se presentan los datos de la inhibición de la actividad mitógena del suero del anticuerpo y de anticuerpo/heparina en las BVSMC. Estos datos demuestran que el anticuerpo monoclonal 169.31 presentaba un efecto inhibidor mínimo sobre la incorporación de [^{3}H]timidina estimulada por la adición de suero de mandril al 1,25%, a la dosis de anticuerpo hasta 1 \mug/ml. Cuando se administró heparina de forma coordinada a las células junto con el anticuerpo 169.31, el nivel de inhibición observado no fue mayor que la actividad inhibidora presentada por la heparina sola. En cambio, los análisis que implican al anticuerpo monoclonal 163.31 presentaban una inhibición significativa de la incorporación de [^{3}H]timidina a una concentración de anticuerpo de 25 \mug/ml. Además, cuando se administraba heparina de forma coordinada con anticuerpo 163.31, no existía una inhibición combinatoriamente eficaz notable de actividad mitógena medida por la incorporación de [^{3}H]timidina, es decir los efectos anti-mitógenos observados anteriormente para el anticuerpo o la heparina solos. Esta inhibición combinatoriamente eficaz se declaró enparticul a concentraciones de MAb 163.31 entre 0,2 \mug/ml y 5 \mug/ml.

La administración coordinada de 1 \mug/ml del anticuerpo 169.31 con dosis crecientes del anticuerpo 163.31 mostró una inhibición de la incorporación de [^{3}H]timidina dependiente de la dosis. La administración coordinada del anticuerpo 169.31 con el anticuerpo 163.31 también produjo una inhibición pronunciada combinatoriamente eficaz de la actividad mitógena del suero tal como se presenta en la Tabla 9.

En la Tabla 9 se presentan los datos como recuentos medios por minuto (cpm) de [^{3}H]timidina incorporada por las células del músculo liso de mandril estimuladas con suero de mandril al 1,25%. Los valores del porcentaje de inhibición se calcularon a partir de una curva patrón generada utilizando los datos de dosis-respuesta de suero presentados.

TABLA 9 Inhibición de la mitogenia en las células del músculo liso estimulada por suero de mandril por los MAb anti-PDGFr administrados de forma independiente o coordinada con heparina

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Ejemplo 15 Inhibición de la actividad mitógena del suero en células del músculo liso vascular de mandril por heparina administrada sola o administrada de forma coordinada con los MAb anti-PDGFr

Se evaluó la capacidad para inhibir la actividad mitógena del suero de mandril tanto por la heparina no fraccionada (UH) (Sigma, St. Louis, MO) como por la heparina de bajo peso molecular (LMWH) (Logiparin®, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca) en las células del músculo liso vascular de mandril. Se administró cada una de las formas de heparina a las células de forma independiente o coordinada con los MAb anti-PDGFr. La LMWH utilizada para estos estudios se generó por tratamiento con heparinasa de una heparina no fraccionada, y está compuesta de especies de heparina con un peso molecular medio de 5.500 daltons. La LMWH presenta una actividad anti-trombocítica disminuida en comparación con la heparina no fraccionada en un análisis APTT, estimada en aproximadamente 50 Unidades/mg.

Para evaluar la actividad anti-mitogénica de las dos preparaciones de heparina, con y sin anticuerpos anti-PDGFr administrados de forma coordinada, se colocaron las BVSMC procedentes de explantes aórticos (denominadas células BO54) en placas de cultivo de tejido aórtico de 24 pocillos a razón de 2,5 x 10^{4} células por pocillo en DMEM (GIBCO BRL) complementado con suero bovino fetal al 10%. Las células se mantuvieron en este medio durante tres días a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. El medio se sustituyó a continuación con 1 ml/pocillo de medio Mito y se cultivaron las células en este medio durante otras 24 horas.

Se añadió suero de mandril a los pocillos de ensayo a una concentración final de 2,5%. Esto se hizó diluyendo el suero 1:1 con PBS y añadiendo 50 \mul del suero diluido a cada pocillo. Para analizar la inhibición de la síntesis de ADN estimulado por el suero de mandril de las preparaciones de heparina en las células del músculo liso de mandril, se añadió heparina a las células bien de forma independiente o coordinada con los dos anticuerpos monoclonales anti-PDGFr. Se diluyeron las muestras de heparina con PBS para dar un concentrado de 400 \mug/ml, a continuación se añadió 25 \mul del concentrado a cada pocillo de ensayo para dar una concentración de heparina final de 10 \mug/ml. Los pocillos de referencia recibieron únicamente solución salina tamponada con fosfato. Se diluyeron MAb 169.31 anti-PDGFr-alfa y MAb 163.31 anti-PDGFr-beta con PBS a 40 \mug/ml y 1 mg/ml, respectivamente, y se añadió 25 \mul de los anticuerpos diluidos a los pocillos de ensayo apropiados para dar concentraciones finales de anticuerpo de 1 \mug/ml para MAb 169.31 y 25 \mug/ml para Mab 163.31.

Después de la adición de los tratamientos, se incubaron las células durante 20 horas a 37ºC. Se evaluó la estimulación mitógena de las células del músculo liso midiendo la incorporación celular de [^{3}H]timidina como se describe en el Ejemplo 14.

Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla 10. Las células tratadas con suero únicamente en ausencia bien de heparina o de los MAb anti-PDGFr presentaron un índice de referencia para la incorporación de [^{3}H]timidina de 36.032 cpm/pocillo. El tratamiento de las células con anticuerpos monoclonales anti-PDGFr-alfa y anticuerpos monoclonales anti-PDGFr-beta administrados de forma coordinada produjeron una disminución en la incorporación de [^{3}H]timidina hasta 27.000 cpm (es decir una inhibición del 25% de la síntesis de ADN estimulada por suero). No existió reducción significativa en la incorporación de [^{3}H]timidina cuando las células se trataron con UH o con LMWH solas. Sin embargo, se observó una disminución significativa en la incorporación de [^{3}H]timidina cuando se añadió UH o la LMWH a las células de forma coordinada con el grupo de anticuerpos anti-PDGFr. Los datos demuestran que tanto UH como LMWH, cuando se administran de forma coordinada con un grupo de anticuerpos anti-PDGFr-alfa y anti-PDGFr-beta, inhiben la actividad mitógena del suero autólogo en las BVSMC de una manera combinatoriamente eficaz. Aquí de nuevo, el grado de inhibición combinatoriamente eficaz conseguido demuestra una relación sinérgica o potenciadora entre el anticuerpo y la heparina en un determinado régimen de administración coordinado analizado.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 10

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Ejemplo 16 Dosis-respuesta de inhibición de la actividad mitógena del suero en células del músculo liso vascular de mandril por los MAb anti-PDGFr aplicados de forma coordinada con heparina no fraccionada o heparina de bajo peso molecular

Se realizó un ensayo de dosis-respuesta de anticuerpo monoclonal 163.31 anti-PDGFr beta, en presencia de una cantidad constante de anticuerpo 169.31 anti-PDGFr alfa (1 \mug/ml), para evaluar la dependencia de la concentración de la inhibición de la síntesis de ADN por MAb anti-PDGFr en las BVSMC estimuladas por suero de mandril. Esta dosis-respuesta se evaluó en ausencia de cualquier heparina añadida, así como en presencia de 10 \mug/ml de una heparina no fraccionada (UH) con actividad anti-trombocítica de aproximadamente 150 Unidades/mg por análisis de APPT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) o una heparina de bajo peso molecular (LMWH) (Logiparin®, aproximadamente 50 Unidades/mg por análisis APPT) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca).

Para estos estudios de dosis-respuesta, se colocaron las BVSMC procedentes de explantes aórticos (células B054) en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos a razón de 2,5 x 10^{4} células por pocillo en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%. Después de 3 días se cambió el medio a medio Mito y se cultivaron las células durante otras 24 horas. Se estimularon las células para que experimentasen mitosis mediante la adición de 50 \mul/pocillo de suero de mandril que se había diluido 1:1 con PBS, dando una concentración final de suero en las células de 2,5%. Se diluyó MAb 163.31 con PBS para preparar 40x concentrados y se añadió 25 \mul del anticuerpo diluido a los pocillos de ensayo para dar concentraciones finales de anticuerpo en las células que oscilaban entre 25 \mug/ml y 1,25 \mug/ml. 25 \mul de una solución de 40 \mug/ml de MAb 169.31 se añadieron simultáneamente a los pocillos para dar una concentración final de anticuerpo de 1 \mug/ml en todos los pocillos tratados con 163.31. Se analizó la combinación de anticuerpos monoclonales 163.31 y 169.31 en ausencia de cualquier heparina añadida y, como alternativa, en un análisis de administración coordinado con UH o LMWH. Se diluyeron con PBS las dos preparaciones de heparina hasta una concentración final de 400 \mug/ml y se añadió 25 \mul de concentrado a los pocillos apropiados para dar una concentración final de heparina en las células de 10 \mug/ml. Se añadió PBS únicamente a estos pocillos de ensayo que no recibieron heparina.

Después de la adición de los tratamientos, las células se incubaron durante 20 horas a 37ºC. Se evaluó la actividad mitógena midiendo la absorción de [^{3}H]timidina como se describe en el Ejemplo 14.

Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla 11. En ausencia de heparina, se observó una disminución significativa en la actividad mitótica de las BVSMC únicamente en aquellos pocillos que recibieron dosis de 25 y 10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal 163.31. Sin embargo, en presencia de UH o LMWH, todas las concentraciones de anticuerpo monoclonal 163.31 probadas (en presencia de una cantidad constante de MAb 169.31) proporcionaron una inhibición combinatoriamente eficaz significativa, con resultados esencialmente idénticos obtenidos para las dos preparaciones de heparina. En presencia de heparina, la dosis de 1,25 \mug/ml de 163.31 fue más eficaz en la inhibición de la síntesis de ADN que la dosis de 25 \mug/ml de 163.31 en ausencia de heparina. La presencia de UH o de LMWH administradas independientemente de cualquier anticuerpo tuvo sólo un efecto mínimo sobre la actividad mitógena.

TABLA 11

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Ejemplo 17 Comparación de actividades anti-mitógenas de MAb 169.31 anti-PDGFr-alfa murino con anticuerpo anti-PDGFr-alfa híbrido de ratón/humano

Se generó un anticuerpo híbrido de ratón/humano utilizando el anticuerpo monoclonal 169.31 anti-PDGFr-alfa como anticuerpo precursor para clonar los dominios variables de las cadenas ligera y pesada. Este anticuerpo híbrido de ratón/humano comprende los dominios variables del anticuerpo monoclonal murino paterno y los dominios constantes para la cadena pesada de IgG4 humano y para la cadena ligera kappa humana. La construcción de este anticuerpo utilizó las técnicas estándar como se describe en Mountain y Adair, Biotech. and Genet. Eng. Rev. 10: 1-142, 1992; y Adair et al., Immunol. Rev. 130: 5-40, 1992. Se comparó directamente la capacidad del anticuerpo murino paterno y del anticuerpo híbrido de ratón/humano para inhibir la síntesis de ADN de las BVSMC (BO54) estimuladas con suero de mandril al 2%.

Se analizaron los anticuerpos el anti-PDGFr-alfa murino e híbrido paternos tanto a 1,0 como a 0,1 \mu/ml en presencia de 10 \mu/ml de anticuerpo 163.31 anti-PDGFr-beta murino y 10 \mu/ml de una heparina no fraccionada (Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, N.J.; actividad especifica \cong 150 unidades/mg). Además, se añadieron anticuerpos anti-PDGFr-alfa(1 \mu/ml) a las células en presencia de 10 \mu/ml de anticuerpo híbrido anti-PDGFr-beta (véase el ejemplo 18) y 10 \mu/ml de heparina. Los resultados presentados en la tabla 12, demuestran que tanto el MAb 169.31 murino paterno como el anticuerpo anti-PDGFr híbrido de ratón/humano tienen potencia inhibidora similar en presencia de MAb 163.31 anti-PDGFr-beta murino paterno o del anticuerpo anti-PDGF-beta híbrido de ratón/humano.

TABLA 12 Actividades anti-mitógenas de los anticuerpos murino y anti-PDGFr-alfa híbrido de ratón/humano paternos administrados de forma coordinada con heparina

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Ejemplo 18 Comparación de actividades anti-mitógenas de MAb 163.31 anti-PDGFr-beta murino con anticuerpo anti-PDGFr-beta híbrido de ratón/humano

Se generó un anticuerpo anti-PDGFr-beta híbrido de ratón/humano utilizando el anticuerpo monoclonal 163.31 anti-PDGFr-beta como anticuerpo paterno para clonar los dominios variables de las cadenas ligera y pesada. Este anticuerpo híbrido de ratón/humano comprende los dominios variables del anticuerpo monoclonal murino paterno y los dominios constantes para la cadena pesada de IgG4 humano y para la cadena ligera kappa humana. La construcción de este anticuerpo utilizó las mismas técnicas estándar para la construcción del anticuerpo híbrido descrito anteriormente para el anticuerpo anti-PDRFr-alfa híbrido (Ejemplo 17). Se comparó directamente la capacidad del anticuerpo murino paterno y del anticuerpo híbrido de ratón/humano para inhibir la síntesis de ADN en las células del músculo liso de mandril estimuladas con suero de mandril al 2%.

Se colocaron en placas las BVSMC (BO54) a una densidad de 2 x 10^{4} células/pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos y se cultivaron durante aproximadamente 48 horas en DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 10% a 37ºC. Se incubaron a continuación las células durante 24 horas en medio Mito para permitir que se estabilizaran.

Una placa de referencia de las células se estimuló con una serie de dilución dos veces de suero de mandril normal (2,0% a 0,125%) para producir una curva patrón. El suero se diluyó en PBS, y se añadió por triplicado 50 \mul de una solución madre 20x directamente a los pocillos.

Una serie de dilución de MAb 163.31 anti-PDGFr-beta o de anticuerpo anti-PDGFr-beta híbrido, se administró de forma coordinada en pocillos de ensayo apropiados con el Mab 169.31 anti-PDGFr-alfa (1 \mug/ml) y heparina no fraccionada (2 Unidades/ml) (Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, N.J.) para evaluar los efectos inhibidores de estos tratamientos en las BVSMC estimuladas por suero de mandril a 2,0%. Además, se analizaron los anticuerpos anti-PDGFr-beta paterno e híbrido en análisis por administración independiente y en análisis por administración coordinada utilizando el anticuerpo y heparina. Se añadieron los anticuerpos y heparina a pocillos de ensayo apropiados a 25 \mul por pocillo de una solución madre 40x diluida en PBS. Las concentraciones de anticuerpo utilizadas se indican en la Tabla 13.

Después de la administración de las muestras de la prueba, se incubaron las células durante 18 horas a 37ºC. Se evaluó la actividad mitógena por absorción de [^{3}H]timidina.

Los resultados del experimento dosis-respuesta de MAb anti-PDGFr-beta, presentados en la Tabla 13, demuestran que la actividad mitógena inducida por el suero de mandril se inhibió aproximadamente el 80% por una combinación de 25 \mug/ml de 163.31, 1 \mug/ml de 169.31 y 2 Unidades/ml de heparina. Similares resultados se obtuvieron utilizando el Mab anti-PDGFr-beta híbrido. La administración coordinada de cada MAb anti-PDGFr-beta murino e híbrido, a 25 \mug/ml, con el MAb 169.31 anti-PDGFr-alfa, produjo aproximadamente el 30% de inhibición de actividad mitógena de suero de mandril. Los MAb anti-PDGFr-beta administrados de manera coordinada con heparina produjeron aproximadamente el 40% de inhibición. Cada uno de los agentes anti-mitógenos produjeron menos del 30% de inhibición de la actividad mitógena del suero de mandril cuando se administraron independientemente.

Estos resultados demuestran que el anticuerpo anti-PDGFr-beta híbrido de ratón/humano tiene una actividad inhibidora similar a la del anticuerpo MAb 163.31 anti-PDGFr-beta paterno. Esta actividad proporciona una inhibición combinatoriamente eficaz de la actividad mitógena del suero en las BVSMC cuando se administra de forma coordinada anticuerpo anti-PDGFr-beta híbrido con el MAb 169.31 anti-PDGFr-alfa, heparina o una combinación de MAb anti-PDGFr-alfa y heparina.

TABLA 13 Comparación de las actividades anti-mitógenas de MAb 163.31 anti-PDGFr-beta murino y anti-PDGFr-beta híbrido de ratón/humano en ensayos de administración independiente y coordinada con MAb anti-PDGFr-alfa y heparina

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Los datos se presentan como recuentos por minuto (cpm) +/- desviación estándar de [^{3}H]timidina incorporada por las SMC de mandril seguida de estimulación con suero de mandril al 2%. Los índices de porcentaje de inhibición para estudios tanto de anticuerpos paterno como híbridos se determinaron comparando las cpm incorporadas de [^{3}H]timidina con una curva patrón generada a partir de los datos de dosis-respuesta de suero presentados a continuación.

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Ejemplo 19 Inhibición de la respuesta a la dosis de la actividad mitógena del suero en las células del músculo liso vascular de mandril por la heparina administrada de forma independiente o coordinada con anticuerpos anti-PDGFr

Células del músculo liso de mandril (BO54) se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos a una densidad de 2 x 10^{4} células/pocillo y se cultivaron durante aproximadamente 72 horas en DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 10% a 37ºC. Las células se estabilizaron a continuación incubándolas durante 24 horas en medio Mito. Se probó la capacidad de la heparina sola para inhibir la estimulación mitógena por el suero de mandril al 2% añadiendo una serie de dilución o una heparina no fraccionada (UH; aproximadamente 150 Unidades/mg) (Elkins-Sinn, Inc.) o heparina de bajo peso molecular (LMWH; Logiparin®, aproximadamente 50 Unidades/mg) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca) a las células a dosis que oscilan entre 15 U/ml y 0,06 U/ml (concentración final en las células). Se probó la misma serie de dilución para ambos tipos de heparina también en presencia de MAb 163.31 anti-PDGFr-beta (10 \mug/ml) y MAb 169.31 anti-PDGFr-alfa (1 \mug/ml).

Después de la adición de los tratamientos las células se incubaron durante 18 horas a 37ºC. Se evaluó la actividad mitógena del suero midiendo la absorción de [^{3}H]timidina. Los resultados de los experimentos de dosis-respuesta de heparina se presentan en la Tabla 14. La heparina sola probada a las dosis más altas tenía solamente un efecto inhibidor modesto en la incoporación de [^{3}H]timidina por las BVSMC, mientras que las dosis administradas de forma coordinada con anticuerpos del receptor anti-PDGF inhibió hasta el 90% de la actividad mitógena del suero. Suponiendo una actividad específica de 150 U/mg de la heparina no fraccionada por Elkins-Sinn y 50 U/mg para la heparina de bajo peso molecular, las dosis mayores utilizadas para las preparaciones de las dos heparinas fueron aproximadamente 100 y 300 \mug/ml respectivamente. A estas concentraciones en los ensayos con administración independiente hubo únicamente una inhibición mínima de actividad mitógena. En cambio, a dosis de heparina 100 veces más bajas hubo todavía un aumento significativo combinatoriamente eficaz de la actividad inhibidora cuando la heparina se administraba de forma coordinada por los anticuerpos anti-PDGFr. Estos resultados demuestran que se pueden utilizar dosis significativamente más bajas de heparina para actuar de un modo combinatoriamente eficaz con los anticuerpos anti-PDGFr para inhibir la incorporación de [^{3}H]timidina, muy por encima de los niveles de inhibición conseguidos con los anticuerpos o la heparina sola.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 14 Inhibición de la dosis-respuesta de la actividad mitógena del suero por la heparina administrada de forma independiente o coordinada con anticuerpos anti-PDGFr

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Ejemplo 20 Inhibición de la migración externa de las células del músculo liso en explantes aórticos de mandril por administración coordinada de los MAb anti-PDGFr y heparina

Se hicieron pruebas además en anticuerpos monoclonales anti-PDGFr en presencia o ausencia de heparina de su capacidad para disminuir las velocidades de migración externa de las células del músculo liso vascular de mandril de explantes de tejido aórtico de mandril. Se colocaron explantes aórticos de mandril esencialmente como se describe en el Ejemplo 11. Se cultivaron explantes en DMEM complementado con insulina y transferina y que contienen las muestras de la prueba siguientes: 1) MAb (169.31) anti-PDGFr-alfa y Mab (163.31) anti-PDGFr-beta, cada anticuerpo a 25 \mug/ml, 2) heparina no fraccionada (Sigma Chemical Co.) (100 \mug/ml), 3) MAb (169.31) del receptor de anti-PDGF alfa y MAb (163.31)del receptor de anti-PDGF beta (25 \mug/ml cada uno) y heparina no fraccionada (100 \mug/ml) y 4) DMEM (referencia).

Los resultados, presentados en la Tabla 15, demuestran que, cuando se midieron a los 7 días siguientes al establecimiento de los explantes, la heparina sola disminuyó el nivel de migración externa de las células del músculo liso al 82% de la referencia, mientras que la combinación de anticuerpo del receptor anti-PDGF disminuyó la excrecencia al 64% de la referencia. La administración coordinada, tanto de los anticuerpos del receptor anti-PDGF como de heparina disminuyó además el nivel de migración externa al 42% de la referencia. Por lo tanto, la heparina y los anticuerpos del receptor anti-PDGF inhibieron de forma combinatoria la migración externa de las células del músculo liso en los regímenes de administración coordinada probados.

TABLA 15 Inhibición de la excrecencia de las células del músculo liso de los explantes del tejido aórtico de mandril por combinación de los MAb anti-PDGFr y heparina

Condición	n	Media	Desv. estd.	% referencia
Referencia	7	65,6	16,8	- - - - -
Anti-PDGF	7	41,9	22,1	63,8
Heparina	7	53,7	17,2	81,9
Heparina +	7	27,7	13,5	42,3
Anti-PDGFr

Ejemplo 21 Análisis de fijación por saturación de MAb 163.31 en las células B054 en presencia y ausencia de heparina

Se determinó la capacidad de fijación de MAb 163.31 anti-PDGFr-beta en células del músculo liso del mandril (BO54) en presencia y ausencia de heparina. Se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos células del músculo liso de mandril (BO54) a una densidad de 20.000 células/pocillo y se cultivaron durante aproximadamente 48 horas a 37ºC en DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 10%. Se incubaron las células durante 24 horas en medio Mito hasta que se estabilizaron. Se lavaron a continuación una vez con medio de fijación a 4ºC (DMEM/Hams F-12, Hepes 25 mM, BSA al 0,1%). Se analizó la actividad de fijación de MAb 163.31 en los receptores de PDGF-beta en presencia de heparina añadiendo diluciones cuatro veces de MAb 163.31 marcado con ^{125}I (^{125}I-163.31) en medio de fijación a 4ºC (oscilando entre 2,1 x 10^{6} a 1 x 10^{3} cpm/ml) y 10 \mug/ml de heparina (Elkins-Sinn, Inc.) a los pocillos apropiados por triplicado en alícuotas de 1ml. En una placa por separado, se añadió la misma serie de dilución de ^{125}I-163.31 sin heparina. Para determinar el nivel de fijación no específica por ^{125}I-163.31, se colocó una serie de pocillos por triplicado en cada placa conteniendo 5,5 x 10^{5} cpm/pocillo de ^{125}I-163.31 más 25 \mug/ml de 163.31 no marcado. Se mantuvieron las placas en hielo mientras se estaban añadiendo las muestras, a continuación se incubaron durante 1,5 horas a 4ºC en un agitador rotativo. Después de lavar 3 x con PBS, se incubaron las células con un tampón de extracción (PBS, NP-40 al 1%) y se recogieron los extractos en tubos de 12 x 75 mm y se hizo el recuento en un contador gamma. Los resultados de los estudios de fijación, presentados en la Tabla 16, demuestran que la acción coordinada de heparina y anticuerpo no tuvo un efecto significativo en la fijación del anticuerpo. Por lo tanto, la eficacia combinatoria de la heparina administrada de forma coordinada con los anticuerpos anti-PDGFr-beta, presentada en los ejemplos anteriores, no parece ser atribuible a ninguna estimulación por heparina de la fijación del anticuerpo a los receptores de PDGF-beta en la superficie celular.

TABLA 16 Análisis de fijación con saturación de MAb 163.31 en las células del músculo liso vascular de mandril en presencia y ausencia de heparina

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Ejemplo 22 Análisis de fijación por saturación de PDGF-BB en las células del músculo liso vascular de mandril en presencia y ausencia de heparina

Se determinó la capacidad de PDGF-BB para fijarse a su receptor en las células del músculo liso del mandril en presencia y ausencia de heparina. Se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos células del músculo liso de mandril (BO54) a una densidad de 20.000 células/pocillo y se cultivaron durante aproximadamente 48 horas a 37ºC en DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 10%. Se estabilizaron las células a continuación incubándolas durante 24 horas en medio Mito, a continuación se lavaron una vez con medio de fijación a 4ºC. Se analizó la actividad de fijación de PDGF-BB a sus receptores en presencia de heparina añadiendo diluciones de dos veces de ^{125}I-PDGF-BB en medio de fijación a 4ºC (oscilando entre 2 x 10^{5} a 2,5 x 10^{4} cpm/ml) conteniendo 10 \mug/ml de heparina (Elkins-Sinn, Inc.) a los pocillos apropiados por triplicado en alícuotas de 1ml. En una placa por separado, se añadió la misma serie de dilución de ^{125}I-PDGF-BB sin heparina. Para determinar el nivel de fijación no específica por ^{125}I- PDGF-BB, una serie de pocillos por triplicado en cada placa contenía también 2,0 x 10^{5} cpm/pocillo de ^{125}I- PDGF-BB además de 1 \mug/ml de PDGF-BB no marcado. Se mantuvieron las placas en hielo mientras se estaban añadiendo las muestras y a continuación se incubaron durante 1,5 horas a 4ºC en un agitador rotativo. Después de lavar 3 x con PBS, se incubaron las células con un tampón de extracción, y se recogieron los extractos en tubos de 12 x 75 mm y se hizo el recuento en un contador gamma.

Los resultados, presentados en la Tabla 17, demuestran que la presencia de heparina no tuvo efecto significativo en la fijación de ^{125}I-PDGF-BB. Por lo tanto, la eficacia combinatoria de la heparina administrada de forma oordinada con los anticuerpos anti-PDGFr, presentada en los ejemplos anteriores, no parece ser atribuible a ninguna estimulación por heparina de la fijación de PDGF-BB a los receptores de PDGF en la superficie celular.

TABLA 17 Análisis de fijación con saturación de PDGF-BB en las células del músculo liso vascular de mandril en presencia y ausencia de heparina

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Ejemplo 23 Inhibición de la fijación de PDGF-BB en las células del músculo liso por MAb 163.31 en presencia y ausencia de heparina

Se realizó un experimento para determinar la capacidad de MAb 163.31 para inhibir la fijación de ^{125}I-PDGF-BB al beta-receptor de PDGF en las células del músculo liso vascular de mandril en presencia y ausencia de heparina.

Se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos células del músculo liso de mandril (BO54) a una densidad de 20.000 células/pocillo y se cultivaron durante aproximadamente 48 horas a 37ºC en DMEM conteniendo suero de ternero fetal al 10%. Se incubaron las células a continuación durante 24 horas estabilizándolas en medio Mito. Se diluyó MAb 163.31 en medio de fijación a las concentraciones mostradas en la Tabla 18, a continuación se mezclaron con ^{125}I-PDGF-BB y 10 \mug/ml de heparina (Elkins-Sinn, Inc.), y se añadieron por triplicado alícuotas de 1ml a los pocillos de células BO54. En una placa por separado, se añadió la misma serie de dilución de ^{125}I-PDGF-BB sin heparina. Para determinar el nivel de fijación no específica por ^{125}I-PDGF-BB, una serie de pocillos por triplicado en cada placa contenía ^{125}I- PDGF-BB más 1 \mug/ml de PDGF-BB no marcado. Se mantuvieron las placas en hielo mientras se estaban añadiendo las muestras y a continuación se incubaron durante 1,5 horas a 4ºC en un agitador rotativo. Después de lavar 3 x con PBS, se incubaron las células con un tampón de extracción, y se recogieron los extractos en tubos de 12 x 75 mm y se hizo el recuento en un contador
gamma.

Los resultados, presentados en la Tabla 18, demuestran que la presencia de heparina no tuvo efecto significativo en la actividad inhibidora dependiente de la dosis de MAb 163.31 en la fijación de ^{125}I-PDGF-BB a las BVSMC. Por lo tanto, la eficacia combinatoria de la heparina administrada de forma coordinada con los anticuerpos anti-PDGFr, presentada en los ejemplos anteriores, no parece ser atribuible a ninguna modulación directa por heparina de la actividad inhibidora de fijación de PDGF-BB del anticuerpo anti-PDGFr-beta.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 18

Inhibición de la fijación de ^{125}I-PDGF-BB a las células del músculo liso por MAb 163.31 en presencia y ausencia de heparina

cpm específica media \pm S.D. (tanto por ciento de referencia)

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Ejemplo 24 Infusión intravenosa continua de los MAb 169.31 y 163.31 en mandriles y análisis de la respuesta de IgG anti-murina en el mandril

Este estudio fue diseñado para controlar los niveles en circulación de los anticuerpos anti-PDGFr murinos después de la infusión en continuo por vía intravenosa o intraperitoneal. Se preparó un grupo de los MAb 163.31 y 169.31 anti-PDGFr con los dos anticuerpos a concentraciones aproximadas de 36 y 22 mg/ml, respectivamente. Los anticuerpos se formularon en un vehículo fisiológicamente aceptable de glicina al 1,5%, NaCl 0,2 M y Tween-20® al 0,1%. El grupo de anticuerpos se cargó en bombas osmóticas Alzet de 14 días, que contienen 2,1 ml de la muestra y suministran un caudal de aproximadamente 5 \mul/hora. Las dos bombas se colocaron en cada uno de los tres animales experimentales. Dos de los animales tenían las bombas colocadas intraperitonealmente (IP) en la cavidad peritoneal y un animal tenía las bombas colocadas en el espacio subcutáneo y se administró el anticuerpo por vía intravenosa (IV) mediante la utilización de un catéter elástico de silicona colocado en el sistema venoso.

Se recogieron muestras de plasma de los animales experimentales los días 1, 7, 14, 21 y 28 después de la colocación de la bomba. Se analizaron las concentraciones en circulación de los anticuerpos anti-PDGFr por ELISA en las muestras de plasma. Además, se analizó la presencia de anticuerpos de mandril en las muestras de plasma dirigida hacia los anticuerpos murinos.

Para analizar la presencia de anticuerpos murinos, se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos con IgG1 anti-ratón de cabra (Sigma Chemical Co.) o IgG2a anti-ratón de cabra (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) a 1 \mug/ml en tampón ELISA A. Se incubaron las placas toda la noche a 4ºC, a continuación se lavaron 2 x con tampón ELISA C. Se bloquearon las placas mediante adición de tampón ELISA B durante 2 horas a 37ºC, a continuación se lavaron 2 x con tampón ELISA C. Las muestras de plasma de mandril se diluyeron con tampón ELISA B, a continuación se añadieron a los pocillos de ensayo apropiados. Se añadieron diluciones de anticuerpos monoclonales 163.31 y 169.31 purificados, diluidos en plasma de mandril de referencia, a un conjunto de pocillos de ensayo para generar una curva patrón para su utilización para cuantificar las concentraciones de anticuerpo en las muestras de plasma de mandril. Se incubaron muestras de anticuerpo de la prueba durante 2 horas a 37ºC, a continuación se lavaron los pocillos 3 x con tampón ELISA C. Se añadió a continuación IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Tago, Burlingame, CA) a los pocillos y se incubaron las placas a 37ºC durante otras 2 horas. Se lavaron los pocillos con tampón ELISA C, a continuación se incubaron con tampón de reacción durante aproximadamente 1 minuto. Se interrumpió la reacción por adición de H_{2}SO_{4} 1 N y se leyeron las placas en un lector de placas de microvaloración ELISA a 492 nm. Utilizando los valores obtenidos en las muestras de anticuerpo purificado, se generó una curva patrón para cada anticuerpo y se determinaron las concentraciones de anticuerpos en las muestras de plasma de mandril a partir de estas curvas.

Los resultados presentados en la tabla 19, demuestran que hubo un pico en las concentraciones de anticuerpo en circulación el día 1 después de la colocación de la bomba en el animal infundido por vía intravenosa, mientras que se observaron concentraciones pico de anticuerpo el día 7 en los animales infundidos por vía intraperitoneal. Los días 14, 21 y 28 las concentraciones de anticuerpo en circulación fueron menores del 1% de las concentraciones pico medidas en los puntos de tiempo iniciales.

TABLA 19 Niveles en circulación de anticuerpo anti-PDGFr después de la infusión continua en mandriles

	Animal A (IP)	Animal B (IP)	Animal C (IV)
Día	MAb163	MAb169	MAb163	MAb169	MAb163	MAb169
1	1000	1600	340	600	8000	6400
7	9000	7000	4000	3200	2500	200
14	14	64	5	6	8	40
21	8	50	5	8	4	18
28	7	40	1	2	3	14

Se presentan los datos como ng/ml de niveles en circulación de los Mab anti-PDGFr-enabplasma de mandril en varias veces después del inicio de la infusión de anticuerpo. IP: infusión intraperitoneal, IV: infusión intravenosa.

\hrule

Se realizaron estudios utilizando ELISA para medir el potencial generado de anticuerpos de mandril contra los anticuerpos murinos infundidos. Los resultados sugieren que las bajas concentraciones de anticuerpo en circulación medidas a los 14 días fueron debidas a una respuesta inmunitaria generada en los mandriles contra los anticuerpos murinos. Estas observaciones sugieren que es útil proporcionar una concentración mantenida de anticuerpo anti-PDGFr en circulación en un sistema de primates, para seleccionar anticuerpos con el fin de minimizar su potencial inmunógeno. Esto se puede realizar mediante una variedad de medios convencionales, incluyendo la preparación de fragmentos Fab o F(ab')2, o construyendo anticuerpos híbridos de ratón/humano u otros fragmentos o construcciones de anticuerpo con inmunogenicidad disminuida.

Ejemplo 25 Determinación de la vida media en circulación del anticuerpo anti-PDGFr-beta híbrido en macacos de Java

Se determinó el metabolismo del anticuerpo anti-PDGFr-beta híbrido en macacos de Java. Esto se consiguió utilizando anticuerpo marcado con ^{125}I. Se marcó anticuerpo purificado con ^{125}Yodo por el método de la cloramina T a una actividad específica de aproximadamente 370 kBq/\mug (10 \muCi/\mug) de anticuerpo. Se utilizaron tres macacos de Java macho en este estudio, oscilando el peso corporal entre 6,0 y 6,6 kg. En la mañana del experimento, se introdujo el anticuerpo radiomarcado en una jeringuilla de 3 ml y se colocó en una bomba de infusión. Los monos se anestesiaron con cetamina, y se canuló la vena safena con un catéter intravenoso de calibre 24 (SURFLO, Terumo Medical Corp., Elkton, MD) conectado a tubo de polietileno. La jeringuilla que contenía el anticuerpo se conectó al tubo y se comenzó la infusión a un ritmo de 0,5 ml/minuto, seguido de un enjuague de 0,5 ml con solución salina. Cada animal recibió una dosis de 3,18 mg de anticuerpo/kg de peso corporal.

Inmediatamente después de la infusión, comenzó la extracción de sangre. Para determinar la vida media del anticuerpo, se introdujeron muestras en tubos al vacío que contenían EDTA a las 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, 120, 168, 240, 336, 504 y 672 horas. Se centrifugó la sangre, se decantó el plasma y se determinó la radioactividad en un contador gamma (80% de eficacia). Se determinaron las concentraciones de anticuerpo en el plasma comparando los recuentos en la sangre a la actividad específica inicial del anticuerpo radiomarcado, teniendo en cuenta la velocidad de desintegración del ^{125}I. Los análisis de las concentraciones de anticuerpo en las muestras de plasma demostraron que la vida media del anticuerpo era aproximadamente de 50 horas.

Ejemplo 26 Desarrollo de un modelo de lesión arterial en serie en mandriles para probar agentes antihiperplásicos y tratamientos después de la lesión vascular

Se desarrolló un modelo de lesión arterial en serie en el mandril para permitir probar la capacidad de los anticuerpos anti-PDGFr para inhibir la hiperplasia de la íntima provocada experimentalmente en primates. Este modelo se diseñó para permitir a cada animal actuar como su propia referencia utilizando lesiones arteriales bilaterales introducidas a intervalos de 28 días.

Se utilizaron en este estudio mandriles que pesaban aproximadamente 10 kg cada uno. El procedimiento quirúrgico inicial recordaba mucho el procedimiento reconstructivo vascular de la angioplastia con globo utilizada en aplicaciones clínicas para el tratamiento de la aterosclerosis humana. Para cada animal, se hizo una lesión inicial por desgarro con desolladura con globo en la arteria safena. El día 28 se practicó a los animales un segundo procedimiento quirúrgico mediante el cual se hizo una escisión en la arteria lesionada inicialmente y la arteria escindida se fijó por perfusión ex vivo a una presión de 100 mm Hg durante 1 hora con una solución de formalina al 10%. Después de la escisión de la primera arteria, la arteria safena del lado contrario recibió una lesión con desolladura con globo. Después del segundo periodo de 28 días se hizo una escisión en la arteria lesionada y se fijó por perfusión ex vivo de una forma similar a la de la primera arteria.

Ambas arterias escindidas se separaron en secciones múltiples y se empaparon en parafina. Se cortaron secciones de los bloques múltiples de tejido, se tiñeron con hematoxilina y eosina, a continuación se analizó la formación de la lesión en la íntima por análisis morfométrico utilizando un sistema de análisis por detección por imagen informatizado (Ferns et al., Science 253: 1129, 1991).

Los resultados del estudio, presentados en la Tabla 20, demuestran que las relaciones de la íntima/interna (I/M) para las arterias del lado contrario fueron muy similares, aún cuando las lesiones arteriales iniciales se realizaron 28 días antes. Esto sugiere que la presencia de una lesión arterial inicial y la eliminación posterior del segmento arterial lesionado, no afecta la respuesta de la segunda arteria lesionada. Estos resultados demuestran también que la extensión de una lesión arterial, medida por la relación de la íntima/interna, es más similar en un animal que entre animales. Estos descubrimientos demuestran que es posible utilizar un modelo de lesión secuencial, por lo que cada animal actúa como su propia referencia para evaluar la eficacia de los compuestos terapéuticos para inhibir la formación de la lesión de la íntima en el mandril.

TABLA 20 Análisis de la evolución de la lesión de la íntima después de lesiones arteriales de desolladura con globo en serie en el mandril

		Área de la íntima	Área interna	Relación I/M
Animal	Lado	(mm^{2})	(mm^{2})
Z6	D	0,1256	1,085	0,1151
Z6	I	0,0543	0,547	0,0995
Z8	D	0,1877	1,269	0,1493
Z8	I	0,1125	0,826	0,1344

Ejemplo 27 Evaluación de la terapia con anticuerpo receptor anti-PDGF/heparina para inhibir la hiperplasia de la íntima en primates

Se utilizaron mandriles que pesaban de 6 a 10 kg cada uno para estudiar la eficacia de los MAb anti-PDGFr y heparina. Se realizó una lesión inicial con desgarro por desolladura con globo a una arteria safena de cada animal utilizando catéter 2F de embolectomía (Fogarty). En el momento de la lesión se insertaron catéteres en la vena femoral y bombas osmóticas subcutáneas (SQ) (Alzet) (bombas de veintiocho días, dos bombas por animal). Las bombas suministraron un caudal combinado de 5 \mul/hora en la vena femoral. Durante el primer periodo de control de 28 días se cargaron las bombas con solución salina de placebo. Durante el periodo de 28 días después de la lesión con globo, los animales recibieron inyecciones i.v. de tampón con placebo en los días de estudio 1, 4, 8, 15 y 22.

El día 29 del estudio se realizó un segundo procedimiento quirúrgico en el que se hizo una escisión en la arteria lesionada anteriormente y se fijó por perfusión a una presión de 100 mm Hg durante 1 hora con solución de formalina al 10%. Las arterias se dividieron a continuación en 10 secciones de aproximadamente 0,5 cm de longitud. Se empapó cada pieza de tejido en parafina, y se cortaron secciones de cada bloque de tejido para análisis morfométrico, tal como describe Geary et al. (Circulation 91: 2972, 1995). Se cortaron secciones de 5 \mum de espesor en cada bloque y se tiñeron con colorante de Verhoeff van Gieson. Se proyectaron secciones transversales en una almohadilla digitalizadora informatizada con un microscopio y cámara luminosa y se midieron las áreas de la íntima e interna de cada sección transversal. Se determinaron valores medios de cada arteria lesionada promediando las mediciones de la sección transversal de los bloques de 6 a 8 tejidos para cada arteria. Se eliminaron los bloques de tejido más distales a partir del análisis de datos con el fin de evitar obtener secciones de áreas que no estaban englobadas.

Después de la escisión de la primera arteria, la arteria safena del lado contrario recibió una lesión por desolladura con globo. Se insertaron a continuación catéteres en la vena femoral y bombas osmóticas SQ. Se cargaron las bombas con heparina porcina, calidad II (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para suministrar un caudal de 0,13 mg/kg/hora. Las concentraciones en circulación de heparina se controlaron por análisis APTT utilizando un kit disponible en el comercio (HEPTEST Assay nº 803, American Diagnostica, Greenwich, CT) en una máquina de coagulación Electra 800 de MLA (Pleasantville, NY). La dosis de heparina utilizada en el estudio produjo un aumento aproximadamente al doble en APTT.

Los animales recibieron inyecciones i.v. de anticuerpo receptor anti-PDGF híbrido de ratón/humano (10 mg/ml en acetato de sodio 50 mM, NaCl 125 mM, pH 5,0) los días 1, 4, 8, 15 y 22 del estudio. Se utilizó una dosis de 10 mg/kg del anticuerpo receptor del anti-PDGF para proporcionar concentraciones de anticuerpo en circulación de aproximadamente 50 \mug/ml.

Se hicieron extracciones de sangre justo antes del momento de cada inyección de anticuerpo para determinar las concentraciones en circulación de anticuerpo receptor de anti-PDGF y de concentraciones en circulación de heparina. Se determinaron las concentraciones de anticuerpo en circulación utilizando ELISA. Se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos con proteína de fusión de receptor PDGF beta/IgG soluble. Se bloquearon las placas con PBS que contenía BSA al 0,1% y Tween-20® al 0,05% para eliminar la fijación no específica. Se añadieron diluciones de suero de mandril, realizadas en el mismo tampón, se añadierona los pocillos junto con una serie de dilución de anticuerpo híbrido purificado diluido en suero de mandril de referencia. Se incubaron las placas a 37ºC, se lavaron a continuación para eliminar el anticuerpo no fijado. Se añadió a continuación a los pocillos anticuerpo con IgG_{4} anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Zymed, So. San Francisco, CA) durante una hora a 37ºC. Se lavaron los pocillos con PBS conteniendo Tween-20 al 0,05%, a continuación se incubaron con solución de substrato OPD. Se interrumpió la reacción por adición de H_{2}SO_{4} 1 N y se leyeron las placas a 490 nm en un lector de placas de ELISA Dynatech. Se determinaron las concentraciones de anticuerpo en circulación por comparación de los puntos de los datos en una curva patrón. Las concentraciones de heparina se determinaron como se describió anteriormente. Además, se controló la respuesta del anticuerpo de mandril en los animales dirigida hacia el anticuerpo híbrido por ELISA utilizando una IgG anti-mono de cabra con peroxidasa de rábano picante (Cappel, Durham, NC).

Después del segundo periodo de 28 días, se hizo una escisión en la segunda arteria lesionada y se fijó por perfusión ex vivo de una manera similar a la de la primera arteria.

Se inscribieron un total de 15 animales en el estudio. Los estudios preliminares, expuestos anteriormente, utilizando el modelo de lesión en serie demostraron que había baja variabilidad entre las arterias lesionadas 28 días antes. El análisis de los estudios preliminares sugirió que se necesitaría una n = 15 para observar una disminución del 50% en la evolución de la lesión con un límite de confianza del 95%. Los animales se dividieron en tres grupos de cinco para facilidad del tratamiento quirúrgico. La parte del primer procedimiento de cada animal se mezcló al azar para eliminar cualquier variación de una parte a otra.

Se obtuvieron secciones de tejido de múltiples bloques para cada arteria de la prueba como se describió anteriormente y se determinaron las áreas de la íntima e interna absolutas para cada sección de tejido. Se promediaron a continuación los datos de múltiples secciones para cada arteria para dar valores medios del área de la íntima, del área interna y de la relación de la íntima/interna. Se eliminaron tres animales del estudio debido a la presencia de trombos obliterantes en la zona de la angioplastia. Las fotomicrografías de las secciones transversales de la arteria presentaban la íntima espesada en las arterias de referencia en comparación con las arterias tratadas con anticuerpo. No se observaron diferencias significativas entre las capas izquierda y derecha para el nivel de hiperplasia de la íntima en los animales tratados con anticuerpo. Los datos se resumen en la Tabla 21.

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Se determinó la concentración de anticuerpo en circulación para cada uno de los animales antes del tratamiento y los días 4, 8, 15, 22 y 29 del estudio. En general, las concentraciones de anticuerpo fueron mayores de 50 \mug/ml los días 4 y 8 del estudio. El día 15, tres de los animales presentaron concentraciones de anticuerpo que habían disminuido por debajo de 5 \mug/ml, mientras que el resto presentaron concentraciones que oscilaban entre 14 y 70 \mug/ml. El día 22 solamente cinco animales presentaron concentraciones de anticuerpo mayores de 17 \mug/kg. Los datos de la respuesta inmunitaria (no mostrados) sugieren que el descenso en las concentraciones de anticuerpo híbrido en circulación fue un resultado directo de la eliminación del anticuerpo por los sistemas inmunitarios de los animales. No se observó ninguna correlación entre la concentración de anticuerpo en circulación y la extensión de la formación de la lesión de la íntima, lo que sugiere que las concentraciones de anticuerpo inicialmente presentes eran suficientes para inhibir la generación de lesiones extensivas de la íntima y sugiere además que un periodo más corto de administración de anticuerpo proporcionaría resultados favorables.

El protocolo descrito anteriormente se puede utilizar para evaluar cada uno de los anticuerpos del receptor de anti-PDGF, en combinación o en presencia o ausencia de dosis variadas de heparina. Por ejemplo, se puede utilizar un protocolo similar para la evaluación de una preparación conjunta de (MAb 169.3.1) de receptor anti-PDGF alfa y de (MAb 163.3.1) de receptor anti-PDGF beta, así como para los dos anticuerpos híbridos individualmente. Además de utilizar análisis morfométrico para observar los cambios en la hiperplasia de la íntima, otros tipos de análisis que se pueden utilizar para controlar la formación de la lesión incluyen la angiografía, ultrasonidos intravasculares y barrido por resonancia magnética nuclear. Además, se pueden obtener muestras de tejido de la zona de la lesión en múltiples puntos de tiempo después de la producción de la lesión por aterectomía de reducción.

Claims (11)

1. Utilización de un antagonista del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)para la preparación de un medicamento que se administra junto con heparina para el tratamiento de enfermedades hiperproliferantes vasculares.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el medicamento comprende además heparina.

3. Utilización según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el medicamentoes para inhibir la hiperplasia de la íntima en el sistema vascular de un mamífero.

4. Utilización según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho antagonista y heparina son eficaces de manera combinatoria para inhibir un proceso hiperplásico de la íntima seleccionado de entre la proliferación de las células del músculo liso vascular, la migración de las células del músculo liso vascular y la deposición de la neoíntima de la matriz extracelular, en una zona de lesión vascular.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho antagonista de PDGF es un antagonista no peptídico de PDGF o un anticuerpo receptor de anti-PDGF, p. ej., un anticuerpo receptor de anti-PDGF monoclonal o un anticuerpo receptor de anti-PDGF-beta.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de una sola cadena o un anticuerpo híbrido, p. ej. un anticuerpo híbrido humano-ratón, opcionalmente en el que dicho anticuerpo híbrido comprende dominios variables de ratón unidos operativamente a los dominios constantes humanos.

7. Productos que contienen heparina y un antagonista de PDGF, en forma de preparación combinada para su utilización simultánea, por separado o sucesiva para el tratamiento de enfermedades hiperproliferantes vasculares.

8. Productos según la reivindicación 7, en los que el antagonista de PDGF se define además por la(s) característica(s) específica(s) de una cualquiera o más de las reivindicaciones 5 ó 6, o en los que la enfermedad hiperproliferante del sistema vascular se define además por los procesos hiperplásicos específicos de la íntima de la reivindicación 4.

9. Productos según la reivindicación 8, en los que dicho anticuerpo y heparina están incluidos en una relación anticuerpo:heparina en peso comprendida entre aproximadamente 0,01:1 y 100:1, preferentemente entre aproximadamente 0,05:1 y 20:1.

10. Productos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en los que dicha heparina comprende una heparina de bajo peso molecular que presenta actividad antitrombotica reducida o en la que dicha heparina comprende un sulfato de heparina.

11. Producto según la reivindicación 7, en el que dicho producto está en forma de kit farmacéutico para su utilización en el tratamiento de la hiperplasia de la íntima en el sistema vascular de un paciente mamífero, comprendiendo dicho kit farmacéutico:

un anticuerpo receptor del factor de crecimiento derivado de anti-plaquetas (PDGF) en un vehículo farmacológicamente adecuado; y

heparina en un vehículo farmacológicamente adecuado;

preferentemente en el que dicho anticuerpo y dicha heparina se combinan previamente en un solo vehículo.