ES2221064T3 - Tratamiento de enfermedades pulmonares inducidas por metabolitos lipidicos poliinsaturados y ensayos para inhibidores epoxido hidrolasa. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES INFLAMATORIAS INDUCIDAS POR METABOLITOS LIPIDICOS POLIINSATURADOS, POR INHIBICION DE LA HIDROLASA DE EPOXIDO, PROCEDIMIENTOS DE DOSIFICACION O DE CRIBADO DE LOS INHIBIDORES DE LA HIDROLASA DE EPOXIDO EN FUNCION DE SU ESPECIFICIDAD INHIBIDORA Y DE SU TOXICIDAD, Y NUEVO DIOLES BIOLOGICAMENTE ACTIVOS DE TETRAHIDROFURANO DE ACIDO ARACONICO, ASI COMO SUS ANTICUERPOS.

Description

Tratamiento de enfermedades pulmonares inducidas por metabolitos lipídicos poliinsaturados y ensayos para inhibidores epóxido hidrolasa.

Campo de la invención

En general, la presente invención hace referencia al tratamiento de las condiciones inflamatorias, como el síndrome de la dificultad respiratoria (ARDS) y a otras condiciones inflamatorias agudas, como el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SARS) y más particularmente a los procedimientos de tratamiento de las enfermedades inflamatorias mediadas por metabolitos de lípidos poliinsaturados mediante la inhibición de la epóxido hidrolasa, a los procedimientos para analizar o cribar inhibidores de la epóxido hidrolasa por su toxicidad, y a los procedimientos para el análisis de metabolitos lipídicos como indicadores del estrés oxidativo y del estado de la enfermedad. La invención también incluye como uno de los aspectos nuevos los dioles tetrahidrofuranos activos biológicamente del ácido araquidónico (dihidroxidro-eicosadienoatos o DiHOxyEDEs).

La presente invención se ha realizado con financiación estatal Grant ES02710, concedida por el Instituto Nacional de la Salud. El Estado tiene pues ciertos derechos en la presente invención.

Antecedentes de la invención

La inflamación se evidencia por la aparición de rojez, sudoración, calor y dolor como una reacción del cuerpo contra una lesión o agresión. Se han implicado diversos agentes químicos como mediadores químicos de la reacción inflamatoria, incluyendo la histamina, las quininas, las prostaglandinas, los factores activadores de plaquetas, los leucotrienos y la sustancia P de las terminaciones nerviosas. Los mediadores de la reacción inflamatoria aguda parecen estar implicados en uno o más de los siguientes procesos: incremento de permeabilidad vascular, atracción de leucocitos, aparición de dolor, edema local y necrosis.

La respuesta inflamatoria es una de los mecanismos fisiológicos más importantes para el mantenimiento de la salud en el hombre. Sin embargo, los trastornos inflamatorios o una respuesta inflamatoria inadecuada pueden resultar en una lesión tisular, o desencadenar la morbilidad o la mortalidad.

La sudoración es una respuesta inflamatoria característica de los tejidos frente a una lesión. La sudoración se produce por la fuga de agua y solutos desde el torrente sanguíneo a la matriz celular. Un aumento de dicha fuga de los vasos sanguíneos tras una lesión puede ser debida a daños directos en los vasos sanguíneos, o puede tener lugar después de la liberación de sustancias como la histamina (mediadores de inflamación), que abren brechas entre las células endoteliales que limitan los vasos sanguíneos. Estas y otras señales inflamatorias pueden actuar directamente sobre los leucocitos conduciendo a su adhesión en las paredes de los vasos sanguíneos, a un cambio en la morfología leucocitaria y al movimiento a través de la pared del vaso hacia los tejidos. Un grado moderado de sudoración (o edema) no afecta la integridad funcional de los tejidos lesionados (excepto quizás en el cerebro), pero, en lesiones graves, la sudoración abundante distorsiona la arquitectura tisular, impide la liberación de oxígeno en las células y causa una pérdida importante de fluido del compartimiento vascular.

La inflamación también está implicada en diversas condiciones crónicas, como el asma, aunque no está del todo claro qué células inflamatorias o qué mediadores en particular están implicados significativamente en el asma.

El síndrome de la insuficiencia respiratoria del adulto (ARDS) es una enfermedad pulmonar que tiene una tasa de mortalidad del 50% y se deriva de lesiones pulmonares causadas por diversas condiciones halladas en pacientes traumáticos y en víctimas de quemaduras graves. Ingram, R.H. Jr., "Adult Respiratory Distress Syndrome", Harrison's Principals of Internal Medicine, 13, p. 1240, 1995. A excepción, posiblemente, de los glucocorticoides, no se conocen agentes terapéuticos eficaces en la prevención o la mejora de la lesión tisular, como el daño microvascular asociado con la inflamación aguda que se produce durante el desarrollo temprano de ARDS.

El ARDS, que se define en parte por el desarrollo de edema pulmonar, representa una manifestación clínica de enfermedad pulmonar que deriva tanto de la lesión directa como indirecta. Mientras que estudios anteriores citan diversos agentes no relacionados aparentemente como agentes causales, los eventos iniciales que subrayan la patofisiología del ARDS todavía no son bien conocidos. El ARDS se consideró en un principio como un fallo orgánico, pero ahora se le considera un componente del síndrome de deficiencia orgánica multisistémica (MOFS). La intervención farmacológica o la prevención de la respuesta inflamatoria se consideran actualmente más bien un procedimiento más prometedor de control del proceso de enfermedad que técnicas de apoyo para una mejor ventilación. Véase, por ejemplo, Demling, Annu. Rev. Med., 46, pp. 193-203, 1995.

Otra enfermedad (o grupo de enfermedades) que implica la inflamación aguda es el síndrome de respuesta inflamatoria sistemática, por ejemplo, la sepsis, la pancreatitis, el trauma múltiple como la lesión cerebral y la lesión tisular, la laceración de la musculatura, la cirugía cerebral, el choque hemorrágico y las lesiones orgánicas inmuno-mediadas. Bone, JAMA, 268:24, pp. 3452-3455, 1992.

En la patente americana 5.504.11, publicada el 2 de Abril de 1996, cuyos inventores son Falvin y col., se sugiere la utilización de ácido 2,3-alquilcarboniloxibenzoico en el tratamiento del ARDS. Los patentadores sugieren también una utilización para su invención en el tratamiento terapéutico y/o la prevención de sepsis y choque séptico, ya que igualmente se ha demostrado que muchos de los procesos fisiológicos e, incluso, patológicos implicados con el ARDS están implicados en la condición de sepsis y choque séptico.

En la patente americana U.S. 5.488.033, publicada el 30 de enero de 1996, cuyo inventor es Wei, se describen los tratamientos con el factor de liberación de corticotropina como de utilidad en las condiciones inflamatorias sistémicas tal que el SIRS, cuando dichas afecciones se caracterizan por el derrame vascular, mediante supresión de dicho derrame vascular.

La patente americana 5.455.271, publicada el 3 de octubre de 1995, cuyos inventores son Yuan y col., describe los inhibidores del leucotrieno A4 hidrolasa. Se sabe que esta metaloproteína hidrolasa presenta inhibición de las actividades epóxido hidrolasa y epóxido aminopeptidasa. La patente sugiere que los inhibidores de LTA4 hidrolasa son de interés como agentes potenciales anti-inflamatorios. La patente describe una clase de estado de transición análogo a los inhibidores basados en el mecanismo propuesto de la actividad aminopeptidasa y a la estructura del sustrato natural de la enzima LTA4 hidrolasa.

La patente americana 5.530.114, publicada el 25 de junio de 1996, cuyos inventores son Bennet y col., describe los procedimientos de tratamiento de enfermedades factibles de modulación de la síntesis o el metabolismo del ácido araquidónico al proporcionar los oligonucleótidos anti-sentido capaces de inhibir la función del RNA que codifica proteínas en la síntesis y metabolismo del ácido araquidónico y de compuestos relacionados. En particular, se describen diversos de los leucotrienos que provienen de una vía oxidativa (la vía de la lipoxigenasa).

Resumen de la invención

Se describe aquí un procedimiento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en particular el síndrome de la deficiencia respiratoria (ARDS), que comprende la administración a un paciente que necesita terapia de una cantidad terapéutica eficaz de un inhibidor de la epóxido hidrolasa. Según ello, la presente invención proporciona la utilización de un inhibidor de epóxido hidrolasa soluble o de la microsomal para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria.

Los aspectos de la invención hacen referencia en general a nuestro descubrimiento de que el metabolito tiol de linoleato parece conducir a síntomas de ARDS e incrementar la inflamación. Según ello, los fármacos que inhiben la formación de leucotrina y diol de leucotoxina, incluyendo los inhibidores de la epóxido hidrolasa como los óxidos de chalcona, los alcóxidos lipídicos, los glicidoles y las diimidas, o los que tratan la inflamación (causada por el diol de leucotoxina) mediante los THF-dioles de un araquidonato, que actúan de forma anti-inflamatoria, pueden utilizarse para la fabricación del medicamento. Más particularmente, el inhibidor soluble o microsomal del inhibidor de hidrolasa retrasa o previene la respuesta inflamatoria en un paciente mediante una inhibición de la formación de uno o más metabolitos lipídicos poliinsaturados. Por ejemplo, la utilización es eficaz para inhibir la formación de uno o más dihidroxi-oxi-eicosadienoatos, o DiHOxiEDES en las series de ácido araquidónico de oxilipinas, los dioles de leucotoxina en las series de ácido linoleico, u otros dioles lipídicos incluyendo los dioles de tetrahidrofurano.

Hasta ahora se ha considerado a la leucotoxina, o ácido cis-9,10-epoxioctadeco-12(Z)- enoico, como el agente causante de las respuestas tóxicas caracterizadas por el ARDS debido a su presencia en piel y plasma de dichos pacientes. La leucotoxina y la isoleucotoxina (ácido cis-9,10-epoxioactadec-12(z)-enoico y el ácido 12,13-epoxioctadec-9(Z)-enoico) son monoepóxidos del ácido linoléico (octadeca-9(Z), 12(Z)-dienoico), un ácido grado que se halla de forma natural en los aceites vegetales y las grasas animales. En el cuerpo, el ácido linoleico se activa a regioisómeros de la leucotoxina e isoleucotoxina mediante el citocromo P-450 y otras vías oxidativas, y luego se metaboliza en los compuestos dihidroxi correspondientes, leucotoxina diol (ácido cis-9,10-dihidroxioctadec-12(Z)-enoico o 9,10-DiHODE) e isoleucotoxina diol (ácido cis-12,13-dihidroxioctadec-9(Z)-enoico o 12,13-DIHODE) mediante epóxido hidrolasa. Esta reacción se lleva a cabo mediante la epóxido hidrolasa microsomal (mEH) y la epóxido hidrolasa soluble (sEH), siendo la enzima soluble de mayor importancia.

Sorprendentemente, nuestros estudios han mostrado que la citotoxicidad de la leucotoxina parece ser el resultado de la conversión de su epóxido al correspondiente vic-diol (9,10-DiHODE), una reacción catalizada por la epóxido hidrolasa (esquema 1). Parece ser que el metabolito (producido por la epóxido hidrolasa) de la leucotoxina es tóxico para el epitelio 1 pulmonar y vascular y otros tipos celulares asociados con el(SRDS) y enfermedades relacionadas. Es probable que los metabolitos diol sean responsables de algunos de los efectos biológicos atribuidos a las leucotoxinas.

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Esquema 1

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La importancia de este nuevo descubrimiento es el hecho de que la epóxido hidrolasa parece bioactivar un mediador derivado de la inflamación, y la relevancia clínica de 12s daños mediados por leucotoxina, sugieren la necesidad de inhibidores efectivos y selectivos de la epóxido hidrolasa. Debido a que en este momento existen pocos inhibidores específicos de la epóxido hidrolasa que también no afecten a la homeostasis celular, otro aspecto del invento es el uso de un sistema de ensayo para evaluar clases de inhibidores de la epóxido hidrolasa (p.ej. óxidos de chalcona, glicidoles, esteres epoxi de ácidos grasos) para ver la efectividad de la inhibición sobre la epóxido hidrolasa que tendría mínimos efectos secundarios en la homeostasis celular.

De acuerdo con estos conceptos, también se describe en esta patente un procedimiento para efectuar un cribaje de inhibidores de la epóxido hidrolasa, que comprende el proporcionar un sistema de crecimiento de células de insecto. Estas células de insecto son infectadas con un baculovirus recombinante que expresa la epóxido hidrolasa en las células de insecto bajo condiciones de crecimiento. Un inhibidor potencial se incuba con las células de insecto en el sistema celular de insecto, y después se examina la viabilidad de las células de insecto. Los enzimas activadores que oxidan lípidos a metabolitos biológicamente activos de precursores serian también de valor. Son particularmente preferibles las células de insectos que expresan reductasa y P-450 como una simple fusión.

También se describe en esta patente un procedimiento para ensayar inhibidores de una epóxido hidrolasa con reducidos efectos secundarios in vivo comprendidos y se provee un sistema celular que incluye una línea celular de mamíferos donde la línea celular expresa una epóxido hidrolasa y tiene un nivel determinable de Ca^{2+} intracelular libre o una permeabilidad determinable de membrana. El candidato inhibidor se incuba con la línea celular y después se examinan en las células incubadas los cambios en el Ca2+ intracelular libre o la permeabilidad en la membrana. Más preferiblemente, el examen incluye la monitorización del flujo de calcio.

Un anticuerpo (monoclonal o policlonal) podría ser generado contra DiHOxiEDEs, dioles de leucotoxina y otras oxilipinas similares y ser usado en diagnostico o para aplicaciones clínicas.

También se describe en esta patente el uso de sistemas transgénicos para producir leucotoxinas, dioles de leucotoxinas, DiHOxiEDEs y otras oxilipinas usando P450 y/o epóxido hidrolasa. Entre otros usos, estos materiales pueden ser empleados como fármacos o profármacos. Por ejemplo, esta descrito que bajos niveles de leucotoxinas tienen actividad antimicrobiana en sistemas de animales y plantas. Nosotros creemos que el diol de la leucotoxina podría ser un marcador seleccionable para plantas recombinantes y podría ser utilizado para controlar patógenos en sistemas de plantas. En otro aspecto más de la presente invención, se describen DiHOxiEDEs con actividad biológica.

Otros objetos o aspectos de este invento serán aclarados después de leer las siguientes descripciones y los datos de los experimentos ilustrativos y resultados.

Descripción resumida de las figuras

Las dos partes de la figura 1, panel (A) y (B), muestran los efectos de los lípidos en las propiedades bioeléctricas de los cultivos primarios monocapa de células epiteliales de alveolo pulmonar de rata.

Las diferentes partes de la Figura 2 muestran gráficamente los efectos de los lípidos en la viabilidad de cultivos celulares de Spodoptera frugiperda que fueron infectados con baculovirus recombinantes para producir varios enzimas.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Nosotros mostramos aquí que en ambos experimentos in vivo e in vitro que las leucotoxinas dioles son mucho mas tóxicos y causan muchos mas síntomas pronunciados a bajas concentraciones que sus análogas leucotoxinas. Las concentraciones de leucotoxina diol que muestran actividad biológica in vitro son acordes a los niveles in vivo de leucotoxinas observados en quemados y pacientes con SRDS. Estos datos indican que las numerosas patologías atribuidas a leucotoxina e isoleucotoxina son resultado de la activación enzimática mediada mayormente por la epóxido hidrolasa soluble.

Nuestros datos de la activación enzimática de leucotoxina e isoleucotoxina, ambos in vivo e in vitro, demuestran la capacidad de la epóxido hidrolasa para metabolizar una amplia variedad de oxilipinas. Se entiende por "oxilipina" cualquier ácido graso con oxígenos adicionales -por ejemplo epóxidos, dioles, monohidroxis, prostaglandinas y similares. Estos datos indican que la conversión de los epóxidos de ácidos araquidónicos a dioles y ácido araquidónico diepóxidos a tetrahidrofuranodioles y tetraoles. Así, el presente invento, proporciona procedimientos terapéuticos basados en la intervención clínica para prevenir las acciones de la epóxido hidrolasa. En particular, la práctica del presente invento está dirigida a inhibir la epóxido hidrolasa por cuatro clases de inhibidores sintéticos químicos o por nucleótidos antisentido.

Los inhibidores adecuados de la epóxido hidrolasa son compuestos que proporcionan sustratos alternativos al enzima, alcóxidos lipídicos )p.ej., el 9-metóxido del ácido esteárico), diimidas lipofílicas (p.ej., diciclohexilcarbodiimida), glicidoles fenilo (p.ej. SS-4-nitrofenilglicidol), y óxidos de chalcona.

Según ello, en un paciente con necesidad de terapia se administrará una cantidad efectiva terapéutica del inhibidor de la epóxido hidrolasa o de un ácido nucleico antisentido. La administración será típicamente en forma de una composición farmacéutica, donde, por ejemplo, el inhibidor como agente activo podría ser adicionado en forma de sal de ácido y la composición formulada para ser disponible para administración oral o parenteral o como supositorio. Además se contemplan las composiciones adecuadas para inyecciones constituidas por inyectables acuosos tamponados o no tamponados isotónicos y salinos estériles o soluciones de glucosa. El componente activo puede también ser usado en composiciones como comprimidos o pastillas, preferiblemente que contengan una dosis unitaria, y pueden ser mezclados con componentes convencionales de comprimidos. Los niveles actuales de dosificación de los inhibidores de la epóxido hidrolasa pueden variar para obtener la respuesta terapéutica deseada para una composición particular o método de administración. La dosis total diaria administrada se contempla que puede ser entre 0,001 y 100 \muM/kg de peso. Por otra parte en la práctica de la invención, deberían evitarse fármacos como el clofibrato, conocido por inducir la epóxido hidrolasa soluble y el P450, y un fármaco como el acetaminofeno, que disminuyen glutación. Esto es debido a que disponemos de datos experimentales que sugieren que cuando los niveles de glutatión disminuyen, las leucotoxinas son más tóxicas. En contraste, las terapias paralelas diseñadas a aumentar las vías alternativas del metabolismo de leucotoxinas como la administración de N-acetilcisteína y glutatión y sus esteres metílicos deberían ser potenciadas.

Otros inhibidores de la epóxido hidrolasa y potentes agentes terapéuticos para el SRDS podrían descubrirse en ensayos enzimáticos o celulares. En el primer caso, el inhibidor probable (como los compuestos basados en propiedades estéricas o electrónicas de conocidos substratos o a través de la comprensión del mecanismo enzimático) se añade en un pequeño volumen (1 \mul) de cosolvente orgánico a una solución acuosa de epóxido hidrolasa recombinante o natural. Después de la preincubación a 37°C (0-10 minutos) se añade el substrato en 1 \mul de cosolvente orgánico y se incuba la muestra de 1 a 10 minutos. El diol se monitoriza espectrofotométricamente (Wixtrom y col., Analy, Biochem., 174, pp. 291-299, 1988; Dietz y col., Analy. Biochem., 216, pp. 176-187, 1994), o por radioactividad (Borhan y col., Analy. Biochem., 231, pp. 188-200, 1995).

En los ensayos celulares el linoleato o leucotoxina podrían ser añadidos en cosolventes orgánicos seguidos por el supuesto inhibidor a las células de insectos infectadas o transfectadas con un baculovirus recombinante. Por ejemplo, las células Sf transfectadas con P-450, epóxido hidrolasas, glutatión transferasa u otros genes relevantes podrían ser preparadas como se ha descrito recientemente por varios de nosotros (ver Grant y col., Biochem. Pharmacol., 51, pp. 503-515, 1996). La viabilidad celular podría ser determinada con MTT.

Entre los inhibidores de epóxido hidrolasa que podrían ser utilizados en la práctica de esta invención son substratos alternativos para el enzima, tales como el epóxido o el metil oleato y otros ácidos grasos y esteres o metil epoxioctadecenoato (EpOD) administrados intravenosamente en la vena femoral o aspirados en el pulmón. Los óxidos de chalcona adecuados para este uso se muestran en la Tabla A.

TABLA A

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Como se muestra en los datos de la Tabla A, se efectuaron tests de inhibición en enzimas de ratón y humano de epóxido hidrolasa, con valores de IC50 mostrados donde los valores de sEH en enzima de ratón se llevaron a cabo a 8 \mug/ml (0.3 \muM) y los valores de sEH en enzima humano se llevaron a cabo a 16 \mug/ml (0.26 \muM).

Entre los óxidos de chalcona adecuados se incluyen óxidos de 4-fenilchalcona y óxidos de 4-fluorochalcona. Entre los glicidoles adecuados se incluye el S,S-4-nitrofenilglicidol. Se cree que estos compuestos forman acil enzimas estables y mimetizan el estado de transición. De manera alternativa, los alcoxilípidos o hidrocarburos se muestran como inhibidores competitivos. El grupo alcoxi (OCH3,OC2H5, OC3H9) se cree que es estable a la hidrólisis estérica y que mimetiza el substrato. La estructura general es RCH(OCH3)R' para un metóxido donde R y R' son hidrofóbicas. Un compuesto típico es el ácido 9-metoxioctadecanoico. Pueden ser preparados con rendimientos elevados a partir de la correspondiente olefina por oxomercuración-demercuración de Brown en un solvente apropiado (p.ej. etanol para los etóxidos y metanol para los metóxidos).

Sin embargo, debido a que estos inhibidores específicos pueden afectar otros aspectos de la homeostasis celular, es necesaria una búsqueda continua de otros inhibidores de la epóxido hidrolasa, terapéuticamente activos y con mínimos efectos secundarios. Esta búsqueda se facilita con otros aspectos del invento para efectuar un cribaje potencialmente útil de inhibidores de la epóxido hidrolasa y para determinar efectos secundarios. Estos dos ensayos de detallan a continuación.

Una incubación simultánea de leucotoxina e isoleucotoxina y del potencial inhibidor podría llevarse a cabo con células de insecto, tales como las células Sf-21 que expresan epóxido hidrolasa soluble. Después de una incubación suficiente, por ejemplo de 2 a 5 horas, estos protegen a las células Sf-21 que expresan la enzima. Entre las ventajas de tales sistemas frente a los ensayos enzimáticos es que la bioactividad de inhibidores potenciales (a través de la membrana celular) se tiene en cuenta y por otra parte se podrían discriminar los inhibidores con un alto grado de toxicidad celular y no habría un gasto inútil de compuestos radioactivos. Este ensayo se discutirá más adelante.

Entre los diferentes aspectos de esta invención se hallan los descubrimientos de la ruta del ácido araquidónico (AA). El AA puede ser metabolizado por la citocromo p-450 epoxigenasa para dar ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs). Estos EETs pueden ser posteriormente metabolizados por la epóxido hidrolasa liposoluble a los correspondientes ácidos dihidroxieicosatrienoicos (DHETs). Diversos estudios muestran que los EETs y los DHETs tienen numerosas actividades biológicas tales como la inhibición de ATPasas de Na/K, vasodilatación de las arterias coronarias, y mobilización, de Ca^{2+} e inhibición de la agregación plaquetaria. De manera análoga, la citocromo P-450 epoxigenasa convierte el ácido linoleico libre en 9,10-epoxioctadec-12-enoato (leucotoxina).

Otro aspecto del presente invento es nuestro descubrimiento que la citocromo P-450 epoxigenasa puede también convertir ácidos grasos libres, incluyendo el AA, a varios diepóxidos posicionales así como monoepóxidos (EETs), y estos diepóxidos del AA (diepoxieicosadienoatos o DiEpEDE) son metabolizados por la epóxido hidrolasa soluble en previamente desconocidos DiHOxiEDEs. Nosotros hemos sintetizado y purificado cis- y 5-trans-regio e isómeros posicionales de 5 miembros de DiHOxiEDEs y hemos encontrado algunos de ellos biológicamente activos, de los cuales los nuevos compuestos se muestran en la Tabla 1.

Hemos sido capaces de detectar la biosíntesis de estos DiHOxiEDEs biológicamente activos en matrices biológicas. Este descubrimiento sirve para adicionalmente extenderlo a la rama del P-450/epóxido hidrolasa de la ruta del ácido araquidónico, y nosotros creemos que puede tener implicaciones directas para el tratamiento del SRDS. Además, nosotros creemos que esta tercera ruta del AA está implicada en una variedad de otros eventos celulares mediados como la diabetes.

Algunas vías de señalización de transducción están relacionadas con la cascada del ácido araquidónico. Esta cascada se inicia cuando un ligando específico como una hormona o factores de crecimiento se unen al receptor de la superficie celular y este receptor activa una fosfolipasa. La fosfolipasa A2 rompe el ácido graso en la posición acilo 2 de los fosfolípidos en la parte interna de la membrana plasmática. El ácido araquidónico se encuentra comúnmente en esta posición. Este ácido araquidónico libre se metaboliza en un conjunto de moléculas reguladoras importantes que están relacionadas con eventos como la activación celular, división, quimiotaxis, inflamación, ovulación y proceso de curación de una herida. Existen dos vías bien estudiadas del metabolismo del ácido araquidónico. La primera es la vía de la ciclooxigenasa que conlleva la producción de prostaglandinas y eventualmente tromboxanos y prostaciclinas. La segunda es la vía de la lipooxigenasa que convierte el ácido araquidónico en compuestos tales como una variedad de leucotrienos. Los productos de la cascada del ácido araquidónico (AA) pueden ser liberados de las células y unirse a receptores específicos de superficie de otros tipos celulares. Los receptores para leucotrienos, tromboxanos y prostaglandinas están a menudo acoplados a la vía del fosfatidilinositol, que causa un aumento intracelular de Ca^{2+} libre. Inicialmente el aumento intracelular de Ca^{2+} libre es debido a la liberación del mismo dele retículo endoplasmático. Este aumento de Ca^{2+} intracelular conlleva la producción de mensajeros secundarios no identificados que estimulan el flujo de Ca^{2+} desde el espacio extracelular. Por lo tanto, los ensayos para la potencia de metabolitos del AA a menudo se basan en su habilidad para producir un aumento del Ca2+ intracelular. Como se verá más adelante, un aspecto del invento es el descubrimiento de nuevos metabolitos del ácido araquidónico en los que mostramos que presentan actividad biológica mientras que en concordancia con el invento se pueden llevar a cabo ensayos para determinar si se afectan los niveles de Ca2+.

Vimos una aplicación terapéutica importante como un aspecto de este invento el tratamiento de enfermedades del pulmón. El pulmón y su extensa área de superficie están expuestos directamente al medio y son particularmente susceptibles de daños oxidativos y productos de inflamación. Ya que la toda la señalización cardiaca pasa a través de la arteria pulmonar, los pulmones pueden ser dañados por agentes transportados en sangre. La heterogeneidad celular del pulmón de mamíferos complica directamente el estudio de las células pulmonares más susceptibles a ser dañadas. Además la compleja anatomía pulmonar hace difícil distinguir con precisión donde son metabolizados los agentes biológicos en los tejidos del pulmón. El tejido diana y la secuencia de eventos del edema alveolar no están establecidos definitivamente; en consecuencia, las interrelaciones y la relativa contribución del endotelio versus epitelio versus compartimientos inflamatorios para disminuir el daño en la barrera aire-sangre son confusas.

Ya que el epitelio alveolar proporciona la resistencia principal al flujo de fluido y solutos a través de barrera aire-sangre, nuestras metodologías experimentales se han centrado en este componente, usando un modelo in vitro de barrera epitelial fisiológica. El uso de sistemas celulares sin suero junto con oxilipinas sintetizadas y purificadas, permiten efectuar experimentos de mecanismo diseñados para elucidar los procesos celulares críticos en el mantenimiento y resolución de la función de la barrera epitelial alveolar.

Los achaques de SRDS se ponen de manifiesto en una variedad de pacientes con quemaduras severas o sepsis. De hecho, la sepsis es uno de los síndromes SIRS. En el SRDS hay una reacción inflamatoria aguda con un alto número de neutrófilos que migran hacia el intersticio y los alvéolos. Si este hecho progresa, hay un incremento en la inflamación, edema, proliferación celular y como resultado final queda dañada la función de extraer oxígeno. El SRDS es así una común complicación en una amplia variedad de enfermedades y traumas. El único tratamiento es sintomático. Se estiman 150.000 casos por año y porcentajes de mortalidad entre el 10 y el 90%.

La causa exacta del SRDS es desconocida. Se ha propuesto que una sobreactivación de los neutrófilos conllevaría a la liberación de ácido linoleico en altos niveles vía fosfolipasa A2. El ácido linoléico se convertiría en 9,10-epoxi-12-octadecenoato enzimáticamente por la neutrófilo citocromo P-450 epoxigenasa. Este epóxido lipídico, o leucotoxina, se encuentra en altos niveles en piel de quemados y en el suero de pacientes quemados. Además cuando se inyecta en ratas, ratones, perros y otros mamíferos produce el SRDS. El mecanismo de acción es desconocido.

Los productos epóxidos del AA (DiEpEDEs) pueden ser metabolizados por la epóxido hidrolasa soluble y producir los DiHOxiEDEs, el epóxido del linoleato (leucotoxina) puede también ser convertido por la epóxido hidrolasa en 9,10-DiHODE. Este diol leucotoxina es análogo a DiHOxiEDEs. La leucotoxina no produce un aumento de Ca^{2+} intracelular en las células alveolares. No obstante, 9,10-DiHODE produce un aumento en el Ca^{2+} intracelular. Creemos que la mayoría del daño en las células alveolares en el SRDS puede ser aumentado por el enorme incremento del Ca^{2+} intracelular libre. Se cree que el aumento del Ca^{2+} intracelular es causado por 9,10-DiHODE y 12,13-DiHODE. El daño y muerte celular, en general, son causados por un aumento irreversible del Ca^{2+} intracelular. De esta forma, es la primera vez que se propone un mecanismo del SRDS.

Los lípidos poliinsaturados tales como el ácido linoleico y el araquidonico sirven como precursores de metabolitos activos. La simple adición de un simple oxígeno, vía química o enzimática, a una olefina o hidrocarburo de estos ácidos grasos esenciales, produce epóxidos y otros metabolitos que contienen oxígeno (comúnmente denominados oxilipinas)que son intermedios clave en las rutas biosintéticas.

Por ejemplo, un metabolito del ácido araquidonico de la 5-lipooxigenasa (p.ej. el leucotrieno A4) muestra actividad biológica djrectamente y es metabolizado a potentes mediadores. Un metabolito del araquidonato por la P-450 monooxigenasa, el 5,6-epoxieicosatrienoato, ha sido propuesto como segundo mensajero de la entrada celular de calcio inducida por agonistas. Una vía de eliminación de estos compuestos conlleva la hidratación por epóxido hidrolasas. Estas enzimas, que convierten epóxidos en dioles supuestamente menos reactivos (y más solubles en agua), se encuentran en tejidos de vertebrados, con altos niveles de expresión en hígado y riñón. Se cree que el papel de las epóxido hidrolasas es dotar a la célula de protección frente a endógenos y exógenos epóxidos considerándose un sistema de desintoxicación.

La epóxido hidrolasa (EH) es un enzima ubiquitaria que se encuentra en todos los tejidos de vertebrados que se han analizado con máximas concentraciones en el hígado y el riñón. Existen dos principales tipos de EH con una amplia especificidad de substrato, la epóxido hidrolasa microsomal (MEH) y la epóxido hidrolasa soluble (SEH). Ambos enzimas son miembros de la familia \alpha/\beta-hidrolasa. Al contrario que la colesterol epóxido hidrolasa y la leucotrieno A4 hidrolasa, estas enzimas convierten epóxidos en dioles en un mecanismo de dos pasos que comporta la formación de un intermedio acil enzima covalente y aislable. Ambas enzimas metabolizan epóxidos a trans-dioles o dioles trans-vecinales. Los compuestos que hidroliza la EH son más hidrofílicos y de esta forma mucho más fácilmente excretables que sus compuestos precedentes. De esta forma se cree que EH es una vía de desintoxicación. Ocasionalmente, EH activa un compuesto hacia especies reactivamente más tóxicas, como en el caso del benzo(a)pireno. Un procedimiento adecuado de monitorización de los productos formados por EH es añadir el substrato directamente a la enzima purificada. De todas formas, este procedimiento no proporciona información acerca de la toxicidad de productos derivados del metabolismo o del comportamiento del substrato y/o del metabolito en el medio celular.

En primer lugar se observa que ni la leucotoxina ni la isoleucotoxina inducen citoxicidad en una línea celular de insectos (células Sf-21) que normalmente expresa niveles bajos de actividad epóxido hidrolasa; por otra parte, los correspondientes dioles inducen una fuerte toxicidad.

Usando un sistema de expresión por baculovirus en este modelo, se estableció que leucotoxina era citotóxica solamente en células que habían sido transfectadas con epóxido hidrolasa, confirmando así el papel del enzima en la activación de la leucotoxina. Posteriormente analizamos la toxicidad selectiva de las oxilipinas derivadas de leucotoxina en nuestro modelo de pulmón de mamíferos (p.ej. monocapas de cultivos primarios de células epiteliales de rata).

Como se ha mencionado antes brevemente, hemos desarrollado un método de cribaje en el cual, se transfectan baculovirus que expresan la SEH clonada de mamíferos y humanos en células de insectos como Spodoptera frugiperda (células Sf-21). Recientemente se ha publicado una descripción de la transfección de este tipo de células. Ver Grant y col., "Development of an in situ Toxicity Assay System Using Recombinant Baculoviruses," Biochem. Pharmacol., 51, pp. 503-515, 1996, que se incorpora del todo como referencia. La ventaja de este sistema celular de insecto sobre otros sistemas son los altos niveles relativos de enzima transgénica y los bajos niveles de enzima endógeno. Por lo tanto, las interferencias de enzimas endógenos no son un problema tal y como pasa en otros sistemas celulares.

Por otra parte no se obtienen mismas ventajas que proporcionan los tests de toxicidad en células de mamífero, ya, que el medio en las células de mamífero es más parecido al medio fisiológico de las células de humano que las células Sf-21. De esta forma, se ha desarrollado otro sistema celular de un cultivo primario en forma de monocapa de células alveolares de rata de tipo II para efectuar tests de citotoxicidad. En este sistema, se monitoriza en las células permeabilidad y flujo de calcio frente a estímulos dañinos. Este ensayo se puede llevar a cabo tal y como se muestra a continuación.

Las células epiteliales alveolares del pulmón se aislaron de ratas adultas usando procedimientos descritos previamente. (Cheek y col., Toxicol. Appl. Pharmacol., 125, pp.59-69, 1994). Brevemente, las ratas fueron anestesiadas, traqueotomizadas y desangradas. Después se efectuó una perfusión de los vasos pulmonares, se extrajeron los pulmones y se llenaron con una emulsión de Fluorinert FC-75 (3M, St. Paul, Minnesota) y albúmina bovina sérica en una solución salina equilibrada durante 20 minutos a 37°C. Después del desplazamiento de la emulsión por lavado, una solución de elastasa se infundió por las vías aéreas y se incubó durante 20 minutos a 37°C. Los pulmones digeridos por la elastasa se trocean, filtran y se agrupan para proporcionar una suspensión celular purificada por el método paneles de IgG (Dobbs y col., Am. Rev. Resp. Dis., 134,pp. 141-145, 1986) para obtener una suspensión celular final de \sim80% de células alveolares epiteliales de tipo II. Para efectuar los estudios fisiológicos, las células aisladas de tipo II se siembran en frascos de cultivo de tejido tratados con insertos Transwell (Costar, Van Nuys, California) en medio de Ham's F-12 suplementado con un 10% de suero bovino fetal y 0.1 pM de dexametasona (Sigma, St. Louis, Missouri) y sembradas a una densidad de 1.5 x 10(6) células/cm^{2}. Para los experimentos de visualización de la imagen (p.ej. estudios de flujo de calcio), las células aisladas de tipo II se siembran en cubreobjetos. Después de 48 h de cultivo a 37°C en 5% CO_{2}/aire, se reemplazó el medio inicial con medio de nutrientes sin suero F-12+6 que consiste en medio de Ham F-12 suplementado con bicarbonato sódico (14 mM), ácido N-2-hidroxietilpiperacina-N-2-etansulfónico (HEPES, 10 mM) y L-cistina (0.15 mM) y los siguientes factores de crecimiento: insulina (5 \mug/ml), transferrina (5 \mug/ml), factor de crecimiento epidérmico (25 ng/ml), hidrocortisona (1\muM), extracto bovino de hipotálamo (7.5 \mug/ml) y retinol (0.1 \muM) como se había descrito anteriormente (Cheek y col., Ibíd.). Las monocapas se incubaron en medio sin suero durante 24-48 h más y después se sacaron del incubador para efectuar los estudios de citotoxicidad

En los dos sistemas celulares descritos anteriormente, los estudios de citotoxicidad se llevaron a cabo con los ésteres metílicos y los ácidos libres del ácido linolenico, leucotoxina, isoleucotoxina, leucotoxina vic-diol y isoleucotoxina vic-diol. A pesar que previamente otros investigadores sugirieron que leucotoxina ere el compuesto que mostraba una respuesta tóxica en pacientes quemados, los resultados en células Sf-21 que expresaron Lac Z y las células alveolares de tipo II de rata no mostraron signos de citotoxicidad después de la exposición al metil linoleato, metil leucotoxina, ni metil isoleucotoxina. Además, no solamente ambos vic-dioles probaron ser altamente tóxicos en ambos sistemas, sino que también se produjo un proceso de muerte celular en las células Sf-21 que expresaron EH y se expusieron a metil leucotoxina y metil isoleucotoxina. Por lo tanto, estos datos sugieren que es el diol resultante de la actividad EH, no el epóxido, el que causa la toxicidad asociada en pacientes quemados y posiblemente en pacientes con SRDS.

Nuestros estudios preliminares en hígado de ratón nos llevaron al descubrimiento de los tetrahidrofuranodioles del ácido araquidónico. Los ésteres metílicos de estos compuestos provocaron una activación in vitro de los leucocitos polimorfonucleares humanos, mientras que en los mismos ensayos sus progenitores metil diepoxiaraquidonatos no fueron bioactivos. Esta diferencia de efectos biológicos implica la activación de los diepóxidos por epóxido hidrolasas solubles y sugiere un papel proinflamatorio de los tetrahidrofuranodioles del ácido araquidonico.

En otros experimentos, un conjunto de análogos del metil araquidonato, mostraron efectos inhibidores frente a una epóxido hidrolasa soluble purificada (sEH). La importancia de este descubrimiento es el hecho que estos compuestos pueden servir potencialmente como herramientas bioquímicas en los estudios para determinar el papel de las sEH in vivo. Además, los productos de la sEH deberían estar implicados en el desarrollo de la inflamación y los inhibidores podrían servir como agentes farmacológicos en la prevención de enfermedades inflamatorias. Otro tipo de actividad biológica asociada con los metóxidos de metil araquidonatos es su inhibición in vitro del crecimiento y citotoxicidad en queratinocitos y producción de alexinas en tubérculos de patata infectados con hongos patogénicos.

La síntesis de metil araquidonato THF-dioles se llevó a cabo por epoxidación del metil araquidonato seguida de la separación de los diepóxidos e hidrólisis ácida y ciclación -el ácido cataliza los procesos de hidrólisis y ciclación de estos diepóxidos. Los productos de hidrólisis se sometieron a cromatografía en columna para separar los metil araquidonato THF-dioles del resto de la mezcla. Estos THF-dioles sintéticos se usaron como estándares en cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en ionización química negativa. Este hecho nos llevó al descubrimiento de estos compuestos como productos naturales en el hígado de ratón. Además, estos productos sintéticos se usaron in vitro en los ensayos de activación de leucocitos polimorfonucleares. La activación de estos leucocitos se determinó usando métodos establecidos de citometría de flujo.

Los metil araquidonato metóxidos se sintetizaron por metoximercuriación del metil araquidonato que comportó una adición neta de MeOH a uno o más dobles enlaces y resultó en una mezcla de mono-, di-, tri, y tetrametoxiaraquidonatos. Después de la separación del metil araquidonato que no reaccionó del resto de la mezcla, la mezcla de metóxidos del metil araquidonato se determino como inhibidor de la epóxido hidrolasa soluble usando como estándar el ensayo de inhibición TSO. Los niveles inhibidores de la mezcla fueron del 98% a 100 \muM, 95% a 10 \muM, y 30% a 1 \muM. Debido a este importante descubrimiento, nos interesamos en la toxicidad general de estos compuestos y decidimos probar su toxicidad con incubaciones con queratinocitos in vitro y midiendo la citotoxicidad o inhibición del crecimiento de estas células. A concentraciones de 10 \muM, estos compuestos presentaron un 100% de toxicidad en los queratinocitos. En otro experimento, a niveles de 10 \muM estos compuestos inhibieron completamente el crecimiento de este tipo celular. También se descubrió que los metóxidos del metil araquidonato eran capaces de inducir la producción de fitoalexina en tubérculo de patata infectado con hongos a una concentración de 50 \mug/disco. La producción de fitoalexina es importante para la capacidad de lucha contra la enfermedad cuando es infectada por patógenos.

Metil leucotoxina y metil isoleucotoxina, y sus dioles fueron químicamente sintetizados a partir del metil linoleato usando ácido m-cloroperbenzoico, como se había descrito anteriormente y se ha ilustrado en el Esquema 1. Los dos monoepóxidos y los diastereómeros de 9,10-12,13-diepóxido (no mostrados) se separaron uno de otro y de los compuestos de interferencia usando cromatografía en columna en fase normal de anhídrido de sílice. Cada uno de estos monoepóxidos fueron hidrolizados a dioles utilizando ácido perclórico y purificado o también enzimáticamente con epóxido hidrolasa soluble recombinante. La pureza e identidad de todos los compuestos se confirmó utilizando una combinación de al menos una cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de gas (GC), cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de impacto electrónico de baja resolución (GC/LRNI/MS), y resonancia magnética nuclear (RMN) de ^{1}H y ^{13}C y las comparaciones de estos datos con las que figuran en la literatura. Los ácidos grasos libres se purificaron usando el mismo sistema de solvente con un 1% de ácido acético. La toxicidad de estos compuestos se evaluó en ratas Sprague-Dawley de Simonson Laboratorios, Gilroy, CA.

Después de anestesiar las ratas con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital, se suministraron los ácidos grasos libres en tampón fosfato salino con un 5% de DMSO por punción cardiaca. La exposición del sistema pulmonar al diol de leucotoxina puro causó una inmediata insuficiencia respiratoria con muerte en menos de 2 horas cuando se inyectaron dosis de 35 mg/kg. No se observaron signos claros o mortalidad con dosis de leucotoxina hasta 100 mg/kg. Después de anestesiar los ratones machos Swiss-Webster (18-20 g) de Bantin-Kingman (Fremon, CA) mediante inhalación de metoxifluorano, los ratones recibieron inyecciones de ácidos grasos libres disueltos en 2-metoxietanol en la vena de la cola. Cuando se administró una mezcla de dioles de leucotoxina/isoleucotoxina (200 mg/kg), se produjo un 30% de mortalidad en cuatro minutos. Todos los ratones tratados estuvieron letárgicos y mostraron dificultad en la respiración durante al menos dos horas. A una dosis de 500 mg/kg de leucotoxinas solamente se observó un 25% de mortalidad entre las 18 y 24 horas y no se observaron síntomas durante mas de 10 minutos. No se observaron síntomas ni efectos letales con inyecciones intraperitoneales o subcutáneas de leucotoxina, isoleucotoxina, o sus dioles a dosis hasta de 175 mg/kg.

Las células Sf-21 se infectaron con baculovirus recombinantes produciendo epóxido hidrolasa soluble humana (hsEH), epóxido hidrolasa soluble de ratón (msEH), epóxido hidrolasa humana microsomal (hmEH), o \beta-galactosidasa (Lac Z) como virus control. Dos días después de la infección se añadieron varias concentraciones de lípidos disueltas en una concentración final de DMSO del 2% (v/v). Tres días después de la infección se llevó a cabo el test de viabilidad con MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio).

Tal y como se observa en la Figura 2(A) el metil linoleato no produjo cambios en la viabilidad. En la Figura 2(B) metil leucotoxina no mostró toxicidad en células que expresaron Lac Z, toxicidad leve en células que expresaron hmEH pero mostró toxicidad (LC_{50}\sim290 \muM) en células que expresaron sEH de humanos o de ratón. En la Figura 2 (C), el diol de la metil leucotoxina fue tóxico en todos los tipos celulares (LC_{50}\sim160 \muM). En la Figura 2(D), metil isoleucotoxina no fue tóxica en células que expresaban Lac Z, levemente tóxica en células que expresaron hmEH, y tóxica (LC_{50}\sim150 \muM) en aquellas células que expresaron sEH de ratón o humana. En la Figura 2(E), el diol de la metil leucotoxina fue tóxico (LC_{50}\sim200 \muM) en todas las células mostrando que la hidrólisis de los epóxidos de metil leucotoxina y metil isoleucotoxina a sus respectivos dioles provoca la toxicidad atribuida a estos compuestos.

Todos los experimentos se repitieron de 3 a 7 veces en diferente días. Todos los replicados se usaron en el cálculo de LC_{50} con los límites superior e inferior convencionales calculados con el programa Polo. Se obtuvieron resultados similares a los de los ésteres de metilo con los ácidos grasos libres (datos no presentados). Los diepóxidos mostraron mucha menos toxicidad (LC_{50}\sim600 \muM) y sus productos de hidratación (datos no presentados) no causaron toxicidad en ningún tipo celular hasta concentraciones de 1 mM.

Los siguientes datos en la Fig. 1 se presentan como la media +/- la desviación estándar; n=5-10 monocapas. (*) indica una media significativamente menor que su lípido correspondiente (metil linoleato) con el mismo tiempo de exposición como se determinó en un ANOVA de una vía / contraste de Scheffeé.

En referencia a la Fig. 1, las monocapas se trataron con metil linoleato a una concentración de 300 \muM (cuadrados vacíos, línea punteada), metil leucotoxina (triángulos negros, línea discontinua), metil isoleucotoxina (círculos negros, línea continua), metil leucotoxina diol (triángulos vacíos, líneas discontinuas) o metil isoleucotoxina dial (círculos vacíos, líneas continuas), administrado en menos del 2% de metanol (v/v). Inmediatamente antes de la exposición (o horas) y a varios tiempos después de la exposición al lípido, se registraron las propiedades bioeléctricas de la monocapa [resistencia transepitelial (R_{t}), corriente de circuito corto (I_{eq})] usando un voltímetro como se había descrito anteriormente. En la Figura 1(A), el tratamiento de las monocapas con 300 \muM de leucotoxina diol o isoleucotoxina dial resultó en una disminución de I_{eq} 5 horas después de la exposición, hecho indicativo de la reducción transporte de neto de iones. La ausencia completa de I_{eq} después de 24 horas de exposición sugiere una pérdida de viabilidad de las células epiteliales. En la Figura 1(B), se muestran los valores de R_{t} de las mismas monocapas mostradas en (A). Se observa una disminución de R_{t} 5 horas después de la exposición a 300 \muM de isoleucotoxina, indicando que la permeabilidad paracelular incrementa como resultado de la administración del lípido. 24 horas después de la exposición a metil leucotoxina dial o metil isoleucotoxina diol, los valores de R_{t} fueron negligibles, confirmando así una disminución en la viabilidad celular y la integridad de la monocapa como resultado del tratamiento con los dioles. No se observó actividad biológica en el sistema con los compuestos precursores, monoepóxido(s), o diol(es) en las series del metil oleato. En experimentos separados solamente el metil leucotoxina dial y el metil isoleucotoxina dial fueron efectivos en el incremento de calcio monitorizado por Fura-2 siendo 50 \muM la dosis efectiva más baja en las células alveolares epiteliales mientras que los otros compuestos fueron inactivos a dosis de hasta 300 \muM (datos no presentados).

Posteriormente, se realizó una hidrólisis enzimática in vitro de diepóxidos metileno-interrumpidos AA de diepoxieicosadienoatos (DiEpDEs) con sus diles-THF o dihidroxi-oxi-eicosadienoatos (DiHoxyEDEs) y se analizó su actividad biológica.

Por ello, se prepararon los estándares de metil DiEpEDE y DiHOxyEDE y se confirmaron sus estructuras. La identidad de las mezclas del estándar de DiHOxyEDE se definió utilizando espectrometría de masas de ionización química iónica negativa de cromatografía de gases, o sea cromatografía de interfaz gas/líquida con espectrometría de masas de ionización química negativa (GC/NICl/MS), después de su conversión a éteres de trimetil lisil (TMS) de éster pentafluorobencilo (PFB) utilizando metodología estándar. Lo lógico para no utilizar un estándar puro diastereoméricamente fue abarcar todos los diastereómeros presentes potencialmente in vivo. El análisis GC/NICl/MS de estos compuestos derivados produjo un fragmento diagnóstico muy claro en m/z497 que representó todos los diastereómeros posibles de aniones carboxilato de bis-TMS éter ([M-PFB)-) de DiHOxyEDE. Además, los ésteres de DiHOxyEDE PFB éster bis-d^{9}-TMS se obtuvieron a m/z a 515; confirmando la presencia de únicamente dos grupos hidroxilo. Los ésteres hidrogenados del éster PFB bis-TMS se obtuvieron a m/z 501; indicando la presencia de dos olefinas. Desafortunadamente, dichos procedimientos de detección no pudieron aplicarse al DiEpEDEs porque estos compuestos parecía que sufrieran reordenaciones, con lo que se obstaculizaba la detección del anión carboxilato correspondiente.

Con el fin de investigar la biogénesis de DiEpEDEs, se extrajeron los hígados de ratones alimentados con clofibrato, se saponificaron y se derivaron. El análisis de los derivados del éter TMS éster PFB de extractos de hígados de ratones alimentados con clofibrato pusieron de manifiesto la presencia de compuestos que se obtenían a m/z 497 en el mismo tiempo de retención que nuestras mezclas autentificadas de estándares. Además, el enriquecimiento de muestras de hígado con la mezcla estándar sintetizada condujo a la coelución de los analitos con los estándares. Adicionalmente, los analitos en los extractos lipídicos procesados se comportaron de forma idéntica a nuestros estándares sintéticos en todas las condiciones de derivación descritas anteriormente. El tratamiento del metil araquidonato con nuestros procedimientos de extracción, hidrólisis y derivación no produjeron DiHoxyEDEs. Ello descarta la posibilidad de una producción artefactual de DiEpEDEs y DiHOxyEDEs a partir de AA. Mientras que la eliminación de la etapa de hidrólisis a partir de nuestra metodología eliminó la producción de DiHOxyEDE de estándares DiEpEDE sintéticos (sin ácido), no inhibió completamente la detección de DiHOxyEDEs en extractos de hígado. Esto constituye a los DiHOxyEDEs como metabolitos auténticos de AA en el hígado de ratón. Además, ya que es posible formar ésteres DiHOxyEDE PFB sin hidrólisis de extractos lipídicos, se puede concluir que el DiHoxyEDEs existe en las células en sus formas no ácidas.

Las concentraciones de DiHOxyEDE en nuestras preparaciones saponificadas indica que, en ausencia de una etapa de hidrólisis, una fracción de DiHOxyEDEs detectada se formó mediante hidrólisis de epóxidos en DiEpEDEs y/o DiEpEDEs y DiHOxyEDEs. A la inversa, los niveles aumentados de DiHOxyEDEs en tejidos de ratones tratados con clofribato sugieren una vía biológica en lugar de auto-oxidativa para su producción. Otra posibilidad es que un incremento en la concentración de H2O2 procedente de la proliferación de peroxisomas es responsable en parte de la epoxidación AA, que a su vez conduce a la producción de DiHOxyEDEs. El significado de esta vía de epoxidación puede ser mínima debido a la inductibilidad del citocromo P-450 por el clofibrato. Por último, los tejidos de ratas Zucker obesas contienen niveles superiores de DiHOxyEDEs que las de animales delgados. Dado que las ratas Zucker son propensas a la diabetes, esto puede sugerir un papel fisiológico del DiHOxyEDEs en la etiología de esta enfermedad.

En un esfuerzo para definir la actividad biológica de DiEpEDEs y de DiHOxyEDEs, estos compuestos se prepararon químicamente y se separaron como metil ésteres. A continuación, se analizaron mezclas metil AA, diastereoméricas y posicionales del metil DiEpEDEs y del metil DiHOxyEDEs se analizaron en un ensayo de entrada de calcio utilizando células epiteliales de alvéolos pulmonares de rata.

La mezcla de metil DiHOxyEDE causó un incremento rápido y prolongado de la entrada de Ca2+ desde el medio al interior de las células (resultados no mostrados). Posteriormente, se demostró que el DiHOxyEDEs no era tóxico para los queratinocitos y fibroblastos durante un período largo de tiempo. Tras exposición a la mezcla de metil DiEpEDE se produjo un aumento retardado, lento y transitorio de la entrada de Ca2+ en las células epiteliales. La escasa actividad observada por los diepóxidos puede estar causada por su conversión in situ a DiHOxyEDEs. El metil AA no afectó a la entrada de Ca2+ en las células epiteliales aún cuando estas células respondieron aun ionóforo de Ca2+.

Con el fin de estudiar la relación cuantitativa de estructura/actividad del metil DiHOxyEDEs, se purificó e incubó individualmente con las células pulmonares epiteliales. Como puede observarse, todos los compuestos que se hallaban en posición trans través del anillo de tetrahidrofurano (referido aquí como isómeros trans), eran virtualmente inactivos para causar la entrada de Ca2+. De forma invariable, los regio-isómeros con un grupo hidroxilo exocíclico en el \omega-terminal del ácido graso fueron más potentes. Además, la oxidación de cadena media aumentó la potencia del DiHOxyEDEs.

La Tabla 1 muestra los compuestos nuevos, biológicamente activos que hemos descubierto junto con algunos datos de su actividad.

TABLA 1

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TABLA 2

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Tal como se resume en las Tablas 1 y 2, los nuevos compuestos de esta tercera cascada AA, denominados DiEpEDEs y los isómeros 5 trans y 5 cis de DiHOxyEDEs, se analizaron por su capacidad para producir un aumento en el nivel intracelular de Ca2+ libre en las células alveolares pulmonares. En primer lugar, se analizó el efecto de la molécula parental metil AA y se halló que no tenía capacidad para provocar un aumento de Ca2+ intracelular. La incubación de estas células con el metil DiHoxyEDEs durante más de 24 horas no produjo muerte celular. A continuación se analizó una mezcla de los isómeros diasteroméricos y posicionales de DiEpEDEs y se halló que a niveles de concentración de 20 \muM a 300 \muM, se causó un aumento gradual pero persistente de Ca2+ intracelular de forma dependiente de la dosis. Los DiEpEDEs se transformaron en DiHoxyEDEs, con lo que su efecto gradual puede ser debido a su conversión lenta a DiHoxyEDEs por las epóxido hidrolasas celulares. Una mezcla racémica de los regio-isómeros cis y trans de DiHOxyEDEs causó un aumento dramático e inmediato de Ca2+ intracelular.

Tal como se resume en la Tabla 1, la cuantificación de calcio intracelular se realizó de la manera siguiente. El Ca2+ intracelular se cuantificó utilizando el procedimiento de fura-2 (Grynkiewicz y col., J. Biol. Chem., 260, pp. 3440-3450, 1985). Se añadió fura-2/AM (1 \muM) (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) a las células crecidas en cubreobjetos, incubándose durante 20 minutos a 37°C. Las células se lavaron con tampón fisiológico y se prepararon para su observación al microscopio invertido acoplado con un espectrofluorímetro (Photon Technology Inc.). Las células individuales se excitaron alternativamente a 340 nm y 380 nm y se cuantificó la emisión a 510 nm para ambas longitudes de onda. La proporción de fluorescencia (340/380) es una cuantificación indirecta del Ca2+ intracelular. Para cuantificaciones de entrada de calcio intracelular en las células epiteliales alveolares, los neumocitos se cultivaron con un tampón fisiológico, pH 7,2, que consistía de: NaCl (125 mM), KCl (5 mM), KH2PO4 (1,2 mM), CaCl2 (2,0 mM), HEPES (25 mM), glucosa (6 mM), MgSO4 (1,2 mM). Para experimentos en ausencia de calcio extracelular, las células se mantuvieron en tampón de calcio que contenía NaCl 125 mM, KCl 3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, MgSO_{4} 1,2 mM y MgCl_{2} 3,8 mM. En los experimentos que requerían incubaciones con calcio, se añadió etilén-glicol-bis-tetraacético (EGTA) al tampón de Ca2+ nominal a una concentración final de 1 mM para eliminar el calcio residual extracelular. Al final de las incubaciones sin calcio, se restauraron los niveles necesarios de calcio del tampón nominal de Ca2+ mediante adición de CaCl2 3 mM. Al término de los experimentos, el ionóforo de calcio ionomicina se añadió como un control positivo para asegurar que el indicador Fura-2 respondía a los cambios de calcio libre intracelular.

En consecuencia, con el fin de estudiar la relación estructura/actividad del DiHOxyEDEs, se purificaron y analizaron para conocer su capacidad de producir un aumento de Ca2+ libre intracelular. Los cis DiHOxyEDEs (a 50 \muM) eran mucho más potentes que los trans DiHOxyEDEs en causar un aumento de Ca2+ intracelular. Los cis DiHOxyEDEs provocaron un aumento en Ca2+ que fue desde el 23% al 161% superior que los niveles basales 5 minutos después de la exposición. Sin embargo, los trans DiHOxyEDEs sólo provocaron un aumento muy pequeño de Ca2+ libre intracelular en cualquier sitio desde el 0% al 11% por encima de los niveles de Ca2+ libre basales, al cabo de 5 minutos de la exposición al DiHOxyEDEs. Por tanto, había una diferencia significativa en la potencia biológica entre los estereoisómeros cis y trans de estos nuevos metabolitos AA. La eficacia bioactiva también depende de la situación del grupo tetrahidrofurano-diol en la cadena carbonada. La localización de la porción tetrahidrofurano-diol en cada extremo de la cadena de carbono produjo una reducción en la capacidad del DiHOxyEDE para provocar un aumento en el nivel de Ca2+ intracelular, es decir, la oxidación de cadena media aumentó la potencia. Tal como se indicó anteriormente, en la Tabla 1 se resumen las estructuras de los nuevos metabolitos araquidónicos activos biológicamente.

Desde hace tiempo, el ión de calcio se ha considerado un regulador fisiológico importante. Muchas células responden a los estímulos extracelulares mediante la alteración de su concentración de calcio intracelular, que a su vez ejerce cambios bioquímicos por el mismo o mediante su interacción con la calmodulina. En muchas células musculares, la activación de la adenilato ciclasa produce una entrada de calcio extracelular. El cAMP activa el canal de calcio dependiente de voltaje en la membrana del nervio presináptico, permitiendo el flujo de los iones de calcio al interior y provocando una transmisión sináptica. La entrada de calcio en las células musculares provoca la contracción muscular y es responsable del aumento y fuerza de los latidos del corazón causados por los agonistas \beta-adrenérgicos. En la región de intercambio de gases del pulmón de mamífero humano, el epitelio alveolar proporciona la resistencia principal al movimiento del agua y solutos a través de la barrera sanguínea y, a los espacios aéreos de los alvéolos, previniendo el edema pulmonar. La alteración de las concentraciones intracelulares de calcio en las células epiteliales del pulmón puede alterar su capacidad para mantener la función de la barrera epitelial y la producción de tensioactivo.

Los dos enzimas implicados en la biogénesis del DiHOEDES, que hemos demostrado son metabolitos endógenos capaces de provocar la entrada de calcio, son inducibles por diversos fármacos y pesticidas. Nuestros estudios in vitro han demostrado que las mezclas sintéticas de metil DiHoEDEs pueden elevar rápidamente los niveles de calcio intracelular en las células epiteliales pulmonares. La mezcla del precursor metil DiEpEDEs aumentó los niveles de calcio intracelular a un valor significativamente inferior. Después de purificar la mezcla de los isómeros de metil DiHOEDE, se observó que algunas de estos regio-isómeros e isómeros posicionales eran más potentes que otros y algunos fueron inactivos en el ensayo de entrada de calcio intracelular (véase la Tabla 1).

Ya que los DiHOEDEs son bioactivos y su biogénesis es inducible, estos nuevos metabolitos deberían considerarse como mediadores químicos importantes capaces de alterar la homeostasis celular.

En consecuencia, el descubrimiento de estos eiconsanoides activos biológicamente enmascara otra vía de medicación química importante que está influenciada por los xenobióticos y es capaz de elevar las concentraciones intracelulares de calcio. Esta vía puede servir potencialmente como punto de intervención farmacológica de ciertos sucesos biológicos. Por último, los DiHOEDEs representan un grupo valioso de herramientas bioquímicas para llevar a cabo experimentos relacionados con el calcio (y otros iones).

Debido a su actividad biológica, estos compuestos tienen diversas utilizaciones. Por ejemplo, al igual que las leucotoxinas y sus dioles pueden utilizarse como herramientas de investigación diagnóstica y clínica y es posible producir anticuerpos contra ellos. Una vez obtenidos los anticuerpos contra oxilipinas de linoleato o araquidonato, éstos se pueden utilizar para monitorizar estos compuestos en tejidos específicos mediante técnicas inmunohistológicas.

Se han producido anticuerpos policlonales contra el DiHOxyEDEs y otras oxilipinas utilizando la metodología descrita. Es decir, los anticuerpos se generan por lo general en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del hapteno y un adyuvante. Puede ser útil conjugar los compuestos con una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, p.ej., la hemocianina de la lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivante, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoilo sulfato (conjugación a través de los residuos de cisteína), la N-hidroxi-succinimida (a través de los residuos de lisina), el glutaraldehído, el anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R1N= C = NR. El acoplamiento puede realizarse a través del ácido C-1, diol o preferentemente a través de un adaptador de \omega-carbono exponiendo la mayoría de grupos funcionales. Se puede utilizar un metabolito de la oxilipina como un hapteno. Por ejemplo, para esta utilización, se ha preparado el metabolito beta-glucurónido del diol de la leucotoxina. Diferentes tratamientos en ensayos heterólogos incrementará la sensibilidad del ensayo.

Se puede inmunizar los animales contra conjugados inmunogénicos o derivados combinando 0,1 mg del conjugado, para conejos o ratones con adyuvante completo de Freund e inyectando la solución s.c. en múltiples sitios (conejos) o i.p. para ratones. Un mees más tarde los animales se volvieron a estimular. Al cabo de siete a catorce días, se sangraron los animales y se analizó el suero para conocer el título del anti-hapteno. Los animales se estimularon hasta alanzar y la fase de la meseta de titulación del anticuerpo. Preferentemente, el título se confirmó con un conjugado del mismo hapteno, pero conjugado a una proteína distinta y/o a través de un agente de entrecruzamiento distinto. También se utilizaron los agentes agregantes como el alumbre para aumentar la respuesta inmune.

Los anticuerpos monoclonales se prepararon recuperando las células del bazo de los animales inmunizados e inmortalizando las células de forma convencional, p.ej., mediante fusión con las células de mieloma o mediante transformación con el virus EB y rastro de los clones que expresan el anticuerpo deseado.

Dichos anticuerpos son de utilidad en los ensayos diagnósticos. En una realización de un ensayo de unión del receptor, una composición de anticuerpos que se une a toda la diversidad de miembros seleccionados de los nuevos compuestos se inmoviliza en una matriz insoluble, la muestra test se contada con la composición del anticuerpo inmovilizado con el fin de adsorber todos los compuestos y luego los compuestos inmovilizados se contactaron con los diversos anticuerpos específicos para cada miembro, cada uno de los anticuerpos identificados individualmente como específicos para un miembro de la familia predeterminado, al igual que para los marcajes únicos como por ejemplo los fluoróforos discretos o similares. Determinando la presencia y/o la cantidad de cada marcaje único, se puede determinar la proporción relativa y la cantidad de cada miembro de la familia.

Dichos anticuerpos son también de utilidad para la purificación por afinidad del cultivo o de fuentes naturales de las células recombinantes. Los anticuerpos y los inmunodiagnósticos resultantes para las leucotoxinas y dioles de leucotoxina son de utilidad para predecir la susceptibilidad del ARDS y de los trastornos relacionados, el progreso de la enfermedad y el éxito del control de la terapia. Los inmunodiagnósticos para los dioles de tetrahidrofurano son de utilidad para controlar el progreso de la enfermedad y la terapia, por ejemplo, en la diabetes y los trastornos inflamatorios.

Ejemplo 1 Anticuerpos policlonales contra metabolitos del THF-Diol del ácido araquidónico

Hapteno: se utilizó una mezcla de dioles-THF de ácido araquidónico (AATHF-dioles; compuestos 1-12 en la Tabla 1) como el hapteno para el desarrollo de los anticuerpos.

Química de acoplamiento: el hapteno se acopló a diversas proteínas a través de su grupo ácido carboxílico. El ácido carboxílico de los AATHF-dioles se activó utilizando N-hidroxisulfosuccinimida y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Los AATHF dioles activados se hicieron reaccionar con varias soluciones de proteínas (albúmina sérica bovina, BSA; ovalbúmina, OVA; con albúmina, CONA; hemocianina de la lapa, KLH) para producir los siguientes conjugados de proteína (antígenos de recubrimiento):

BSA-AATHF-dioles

OVA-AATHF-dioles

CONA-AATHF-dioles

KLH-AATHF-dioles

2390A30-AATHF-dioles

239A30 es la ovalbúmina que tiene grupos amino libres I modificados con 1-3, diaminopropano, con un espaciador entre la superficie y el hapteno conjugado. Todos los conjugados se purificaron mediante diálisis extensa y se almacenaron a -20°C.

Inmunización de conejos: los dioles KLH-AATHF y los 239-A30-AATHF se utilizaron para inmunizar conejos. Los anticuerpos policlonales se generaron en conejos New Zealand blancos (3-5 Kg). Los antígenos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund y se administraron intradérmicamente en la espalda de los conejos. En un protocolo de inmunización típico, los conejos se inyectaron intradérmicamente con 100 \mug de antígeno el día 1. Al cabo de un mes, se volvieron a estimular los conejos con 50-100 \mug adicionales de antígeno en adyuvante completo de Freund y se extrajeron de 10-15 ml de sangre de la vena de la oreja 10 días después. Se aisló el suero mediante centrifugación, se añadió azida de sodio como conservante (0,002%), y luego se alicuotó y almacenó a - 20°C o -80°C. A continuación, se analizó el suero para reconocer el analito. Desde la obtención de los anticuerpos contra AATHF-dioles, se realizó una nueva estimulación y sangrado, como antes, y se continuó mensualmente. Los conejos se desangraron después del cuarto estímulo. La caracterización de los anticuerpos se realizó en el sangrado final.

Rastreo de los sueros de conejo para la unión con los antígenos de revestimiento producida anteriormente: Para determinar si los antisueros producidos podían unirse a los AATHf-dioles, se realizó un test de titulación en panel donde cada suero de conejo se cribó contra diversos antígenos de revestimiento producidos anteriormente. Las titulaciones del panel se realizaron utilizando un ensayo indirecto e inmunoabsorbente ligado a enzima. En resumen, los antígenos de revestimiento se depositaron en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos en un tampón a pH elevado utilizando una adsorción pasiva. Cada antígeno de revestimiento se analizó a diversas concentraciones. Después de una etapa de lavado, se añadieron distintas soluciones del anticuerpo a cada pocillo. Después de una incubación, un segundo anticuerpo (IgG de cabra anti-conejo conjugado a fosfatasa alcalina) se añadió e incubó a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado, los anticuerpos se detectaron mediante la conversión de p-nitrofenilfosfato a p-nitrofenol.

Los antisueros resultantes unidos al pocillo contra e BSA-AATHF-diol y los antígenos de revestimiento
OVA-AATHF-diol. El recubrimiento de CONA-AATHF-diol, todavía no se ha probado. El rastreo subsiguiente mostró que el anticuerpo 935 (anti-KLH-AATHF) unido al pocillo contra 293A30-AATHF-diol.

ELISA de rastreo para la estabilidad del solvente: debido a la posibilidad de problemas de solubilidad con el analito, se eligió DMSO para mejorar la solubilización a la vez que se limitaban los efectos negativos del solvente sobre el anticuerpo. Los primeros estudios analizaron la unión y la inhibición del anticuerpo por AATHF-dioles en presencia de diversas concentraciones de DMSO. No se obtuvo una disminución significativa con DMSO al 10 y al 25% e la señal máxima generada en ausencia de analito. La inhibición relativa por AATHF-dioles permaneció inalterable. En consecuencia, se utilizó DMSO al 25% en los experimentos siguientes.

Inmunoensayo enzimático competitivo: se utilizó un formato de ELISA para detectar AATHF-dioles. En resumen, se revistieron los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos con 239A30-AATHF-diol mediante adsorción pasiva. Después de un lavado, se añadió el analito (AATHF-dioles u otros compuestos relacionados estructuralmente) y a continuación el anticuerpo anti-AATHF-dioles (#935). Al cabo de una hora de incubación, se eliminaron los materiales no unidos del pocillo mediante una etapa de lavado. El segundo anticuerpo (IgG de cabra anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina) se añadió a cada uno de los pocillos, incubándose durante una hora. Los materiales no unidos se lavaron y se añadió el sustratos. La producción de producto fue inversamente proporciona a la cantidad de analito presente en el pocillo.

Inhibición del inmunoensayo enzimático competitivo por metabolitos de ácido araquidónico y otros compuestos relacionados estructuralmente: Este sistema (revestimiento con 239A30-AATHF-dioles, 1 \mug/ml; anticuerpo 935 diluido 1/1000; preparación del analito a una concentración final de DMSO en el pocillo del 25%) se utilizó para conducir los rastreos de inhibición mediante diversos metabolitos del ácido araquidónico y otros compuestos relacionados estructuralmente (véase Tabla 3).

TABLA 3

5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \hskip-0.3cm  ^{a} La numeración entre
paréntesis corresponden con el número de la Tabla 1.\cr 
 \hskip-0.3cm  ^{b} Estos compuestos son
los mismos compuestos 1 y 2 con excepción de que carecen de dobles
enlaces.\cr}

En el primer experimento, las concentraciones analizadas fueron 1, 100, 10.000 y 1000.000 pg/\mul. En el segundo experimento las concentraciones analizadas fueron de 10^{-6} pg/\mul, 10^{-4} pg/\mul, 0, 01, 1, 100, 10.000 y 1.000. 000 pg/\mul. Aunque se obtuvieron las curvas sigmoidales esperadas para la mayoría de los compuestos, el intervalo de concentración fue demasiado amplio para calcular con precisión un IC50 (utilizado a menudo como un indicador de la sensibilidad). En consecuencia, los resultados publicados en la presente invención se indican como un porcentaje de inhibición a 100 pg/\mul.

Cuando se analizó el mismo compuesto en los dos experimentos, las inhibiciones a 100 pg/\mul fueron muy similares, indicativo de que estos anticuerpos pueden reconocer los THF-dioles del ácido araquidónico, ácido linoleicoay ácido eicosadienoico tanto en la forma sin ácido y en la metil éster.

Ejemplo 2

Se administró a los ratones (inyección intravenosa) los dioles de leucotoxina/iso-leucotoxina (400 mg/Kg) o leucotoxina/isoleucotoxina (400 mg/Kg) por la vena de la cola. Los ratones que recibieron dioles de leucotoxina/iso-leucotoxina murieron de insuficiencia respiratoria en 5 minutos después de la inyección, mientras que a los que se administró leucotoxina/iso-leucotoxina sobrevivieron.

En resumen, hemos demostrado que el diol de leucotoxina actúa más rápidamente y es más tóxico que la leucotoxina en diversas células, como el epitelio alveolar de rata, el epitelio bronquiolar humano (HeLa) y el músculo cardíaco. Las inyecciones intravenosas del diol de leucotoxina (300 mg/Kg) inducen rápidamente síntomas similares al ARDS como el edema pulmonar, la dificultad en la respiración y múltiples fallos orgánicos. Al cabo de una hora de exposición al diol de leucotoxina, tanto el hígado como el pulmón murinos mostraron signos dramáticos de necrosis celular. Estos dos órganos son también los primeros en fallar en el ARDS. Estos resultados son inesperados ya que generalmente se considera a la epóxido hidrolasa como una enzima desintoxicante. Según ello, en un aspecto de la presente invención se aplica al tratamiento de la enfermedad inflamatoria, en particular el ARDS, se proporcionan procedimientos para el rastreo de inhibidores de la epóxido hidrolasa y mediante administración de cantidades terapéuticas de los inhibidores de la epóxido hidrolasa a los pacientes. Y dado que hemos descubierto que nuevos DiHOxyEDEs son biomarcadores de inflamación, otro aspecto de la invención es generar anticuerpos contra el linoleato u oxilipinas de araquidónico que sean útiles en el análisis en tejidos mediante técnicas inmunohistológicas.

Se entenderá que mientras la invención descrita anteriormente junto con las realizaciones específicas preferidas, la descripción y los ejemplos intentan ilustrar y no limitar el ámbito de la invención, la cual se define por el ámbito de las reivindicaciones anexadas.

Claims (9)

1. Utilización de un inhibidor de la epóxido hidrolasa o la epóxido hidrolasa microsomal para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha enfermedad inflamatoria es el síndrome de la insuficiencia respiratoria.

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el inhibidor de la epóxido hidrolasa soluble o la epóxido hidrolasa microsomal inhibe la formación de dihidroxi-oxi-eicosadienoatos (DiHOxyEDEs) o inhibe la formación de dihidroxi lípidos.

4. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el inhibidor de la epóxido hidrolasa soluble o la epóxido hidrolasa microsomal es un ácido nucleico anti-sentido, un sustrato alternativo para las enzimas, un óxido de chalcona, un fenil glicidol, un alcóxido lipídico, o una diimida lipofílica.

5. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el óxido de chalcona es un óxido de 4-fenilchalcona u óxido de 4-fluorochalcona.

6. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el fenil glicidol es el S,S-4-nitrofenilglicidol.

7. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el inhibidor de la epóxido hidrolasa soluble o de la epóxido hidrolasa microsomal es el 9-metóxido del ácido esteárico.

8. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el inhibidor de la epóxido hidrolasa soluble o de la epóxido hidrolasa microsomal es un diciclohexilcarbodiido.

9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el inhibidor de la epóxido hidrolasa soluble o de la epóxido hidrolasa microsomal es un metil araquidonato metóxido.