ES2221920T3 - Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico. - Google Patents

Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico.

Info

Publication number
ES2221920T3
ES2221920T3 ES93909508T ES93909508T ES2221920T3 ES 2221920 T3 ES2221920 T3 ES 2221920T3 ES 93909508 T ES93909508 T ES 93909508T ES 93909508 T ES93909508 T ES 93909508T ES 2221920 T3 ES2221920 T3 ES 2221920T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
composition
component
dna
uelm
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES93909508T
Other languages
English (en)
Inventor
Francis C. Szoka, Jr.
Jean Haensler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27127858&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2221920(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University of California Berkeley, University of California San Diego UCSD filed Critical University of California Berkeley
Application granted granted Critical
Publication of ES2221920T3 publication Critical patent/ES2221920T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G2261/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbon-to-carbon link in the main chain of the macromolecule
    • C08G2261/30—Monomer units or repeat units incorporating structural elements in the main chain
    • C08G2261/31—Monomer units or repeat units incorporating structural elements in the main chain incorporating aromatic structural elements in the main chain
    • C08G2261/312—Non-condensed aromatic systems, e.g. benzene

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

ESTA INVENCION PROVEE UN SISTEMA DE DISTRIBUCION POLINUCLEOTIDO DE AUTOMONTAJE QUE COMPRENDE LOS COMPONENTES QUE AYUDAN EN LA DISTRIBUCION DEL POLINUCLEOTIDO A LOS DESTINOS DESEADOS QUE ESTAN ASOCIADOS POR INTERACCIONES NO COVALENTES CON EL POLINUCLEOTIDO. LOS COMPONENTES DE ESTE SISTEMA INCLUYEN COMPONENTES ENMASCARADORES DE DNA, COMPONENTES DE RECONOCIMIENTO DE CELULA, NEUTRALIZACION DE CARGA Y COMPONENTES DE PERMEABILIZACION DE MEMBRANA, Y COMPONENTES DE LOCALIZACION SUBCELULAR. SE PREVEEN LOS COMPONENTES ESPECIFICOS UTILES EN ESTE SISTEMA

Description

Sistema de liberación de polinucleótidos de autoensamblaje que comprende un péptido catiónico anfipático.
Campo técnico
Esta invención se refiere al campo de la liberación de oligonucleótidos y de la terapia génica. En particular, esta invención se refiere a un sistema de liberación de polinucleótidos de autoensamblaje que comprende componentes que ayudan a liberar el polinucleótido en el sitio deseado, que están asociados por interacciones no covalentes con el polinucleótido. Los componentes de este sistema incluyen componentes de enmascaramiento de ADN, componentes de reconocimiento celular, componentes de neutralización de carga y de permeabilización de membrana, y componentes de localización subcelular.
Antecedentes de la técnica
La fibrosis quística (CF) es una enfermedad genética recesiva fatal caracterizada por anormalidades en el transporte de cloruro (McPherson & Dorner, 1991). El locus de la enfermedad se ha localizado en mutaciones en el gen que codifica el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). J. R. Riordan et al., Science (1989) 245:1066-1073; B. Kerem et al., Science (1989) 245:1073-1080. La corrección del defecto génico subyacente por complementación o reemplazo del CFTR defectuoso es la curación final de la CF. La terapia génica, la liberación in vivo y la expresión de genes, es una ciencia que se desarrolla rápidamente y que puede usarse para reemplazar genes defectuosos.
La terapia génica ya es posible. T. Friedmann, Science (1989) 244:1275-1281; M. Bluestone, Biotechnol (1992) 10:132-134. En la técnica se conocen sistemas y polímeros para liberar polinucleótidos. P.L. Felgner, Adv Drug Delivery Rev (1990) 5:163-187. Se han usado vectores adenovirales para transferir CFTR al pulmón de rata de algodón in vivo. M.A. Rosenfeld et al., Cell (1992) 68:143-155. Aunque se ha informado que se producen altos niveles de transfección in vivo con los vectores adenovirales, los sistemas de liberación no virales tienen varias ventajas y deben desarrollarse enérgicamente. Rosenfeld et al., supra; M.A. Rosenfeld et al., Science (1991) 252:431-434.
Durante la última década, se han desarrollado varios métodos para introducir genes funcionales en células de mamífero in vitro. Estas técnicas son aplicables a la terapia génica si es posible retirar del cuerpo las células diana, tratarlas, amplificar las células transfectadas y después devolverlas al paciente. Esta opción no es posible en los pacientes con CF. En el momento actual, se obtienen las mejores eficacias de transfección in vivo con retrovirus (Bluestone, supra) y adenovirus (Rosenfeld et al., supra). Sin embargo, la eficacia es variable y un problema es que la liberación de un gen basado en un virus podría producir infecciones víricas o cáncer. Ciertos ensayos clínicos humanos iniciales han revelado que no se producen complicaciones agudas con vectores retrovirales, pero la posibilidad de que se produzcan complicaciones a largo plazo exige un control cuidadoso de los pacientes. K. Cornetta et al., Human Gene Ther (1991) 2:3-14.
El riesgo de usar vectores basados en virus y las ventajas conceptuales en el uso de construcciones de ADN plasmídico para terapia génica (discutido en P.L. Felgner et al., Nature (1991) 349:351-352) han conducido a un desarrollo paralelo de diversos métodos físicos y químicos para la transferencia génica. Los sistemas estudiados más intensamente implican el tratamiento de las células con fosfato cálcico o un facilitador catiónico (Felgner et al., supra). Otros métodos populares implican la inyección de ADN durante la punción física de la membrana (M.R. Capecchi, Cell (1980) 22:479-485) o la captación pasiva durante una permeabilización o abrasión de la membrana celular (Felgner et al., supra). Todos estos métodos son intrínsecamente agresivos y aplicables sólo in vitro.
Esta invención pertenece al campo de la liberación génica directa que no implica el uso de vehículos virales. Un vehículo no viral para liberación génica debe poder superar muchas barreras: debe sobrevivir en circulación, debe poder dirigirse a la célula elegida, debe poder introducir ADN en el citoplasma, y debe poder transportar el ADN al núcleo.
Enmascaramiento. Una preocupación acerca de la liberación directa de genes in vivo es la capacidad del polinucleótido para sobrevivir en circulación durante suficiente tiempo como para llegar al destino celular deseado. El "enmascaramiento" o la protección de los polinucleótidos es una forma de solucionar este problema.
Los microparticulados (tales como los eritrocitos fantasmas, envueltas virales reconstituidas y liposomas), se han usado en parte como protección en la transferencia de genes. C. Nicolau et al., Crit Rev Ther Carr Sys (1989) 6:239-271; R.J. Mannio et al., Biotechniques (1988) 6:682-690. El sistema de liposomas más satisfactorio usa el reactivo lipídico catiónico dioleiloxitrimetilamonio (DOTMA). P.L. Felgner et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1987) 84:7413-7417. DOTMA se mezcla con fosfatidiletanolamina (PE) para formar el reactivo Lipofectin™. La ventaja de usar Lipofectin™ es que el liposoma catiónico simplemente se mezcla con el ADN y se añade a la célula. No es necesario encapsular el ADN dentro del liposoma con los reactivos catiónicos. Lipofectin™ se ha usado para introducir genes indicadores por medio de transfección en células epiteliales de pulmón humano en cultivo (L. Lu et al., Pflugers Arch (1989) 415:198-203), para introducir el gen CAT en ratas por vía intratraqueal (T.A. Hazinski et al., Am J Respir Cell Mol Biol (1991) 4:206-209) y para introducir el gen CAT en ratones por vía intratraqueal e intravenosa (K.L. Brigham et al., Am J Med Sci (1989) 298:278-281; A. Bout et al., "Abstracts of the 1991 Cystic Fibrosis Conference", Abstract nº 87 (1991)). Aproximadamente un 50% de las células epiteliales de las vías respiratorias expresaban de forma transitoria el gen indicador de la \beta galactosidasa (Hazinski et al., supra), pero no se cuantificó el nivel de expresión. Cuando se introdujo por transfección cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) unida a un promotor sensible a esteroides en pulmón de rata, la expresión pudo regularse positivamente por dexametasona. Hazinski et al., supra. Con altas concentraciones de Lipofectin™ existe el problema de la citotoxicidad.
Los sustitutos de DOTMA incluyen lipopoliamina (J. Loeffler et al., J. Neurochem (1990) 54:1812-1815), polilisinas lipófilas (X. Zhou et al., Biochim Biophys Acta (1991) 1065:8-14) y un colesterol catiónico (X. Gao et al., Biochem Biophys Res Comm (1991) 179:280-285). Estos sustitutos se han usado para mediar la transferencia génica en cultivo. Aunque se han observado algunas mejoras con respecto a las velocidades de transfección observadas con Lipofectin™ (aproximadamente tres veces mayores), la toxicidad sigue siendo un problema. Debe mencionarse que no se dispone de estudios sobre el mecanismo responsable de la transfección usando los lípidos catiónicos. La estrategia previa ha sido sintetizar diferentes lípidos catiónicos y probarlos en ensayos de transfección en lugar de estudiar sistemáticamente cómo los sistemas de liberación introducen ADN en la célula. Los liposomas de DOTMA/PE pueden experimentar fusión de bicapas con liposomas aniónicos (N. Duzgunes et al., Biochem (1989) 28:9179-9184), lo que sugiere que en el modo de acción de DOTMA está implicada la entrada directa del ADN a través de la membrana plasmática. La transfección de alta eficacia usando sistemas lipídicos catiónicos requiere la inclusión de PE, posiblemente porque la PE puede formar intermedios lipídicos intramembrana que facilitan la fusión de las membranas. Se ha estudiado ampliamente el papel de la PE en la permeabilización y fusión de las membranas. Por ejemplo, M.,-Z. Lai et al., Biochem (1985) 24:1646-1653; H. Ellens et al., Biochem (1986) 25:285-294; J. Bentz et al., Biochem (1987) 26:2105-2116).
Dirección Celular. Una transferencia génica eficaz requiere la dirección del ADN a la célula elegida. Recientemente se han descrito procedimientos basados en endocitosis mediada por receptores para la transferencia génica. G.Y. Wu et al., J Biol Chem (1987) 262:4429; G.Y. Wu et al., J Biol Chem (1988) 263:14621-14624. Un complejo de ligando-polilisina con especificidad de célula se une a ácidos nucleicos por medio de interacciones de carga. El complejo resultante se recoge por las células diana. Wu et al., supra, informaron que se producía una transfección eficaz de la línea celular de hepatoma humano HepG2 y de hepatocitos de rata in vivo usando este sistema de liberación con asialoorosomucoide como ligando. Huckett et al., Biochem Pharmacol (1990) 40:253-263, notificaron la expresión estable de una actividad enzimática en células HepG2 después de la dirección dirigida por insulina. Finalmente, Wagner et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1990) 87:3410-3414 y (1991) 88:4255-4259 observaron la liberación de un plásmido mediada por policationes de transferrina en la línea de células de leucemia humana K-562 y la posterior expresión del gen de luciferasa codificado. Sin embargo, los sistemas de liberación descritos se basan en proteínas de dirección de alto peso molecular unidas al ADN a través de un enlazador de polilisina. Estos conjugados grandes de ligando-policatión son heterogéneos en cuanto al tamaño y la composición, no están bien definidos químicamente y son difíciles de preparar de una forma reproducible (Wu et al., supra; Wagner et al., supra). Además, en muchos de los sistemas mediados por receptor, se requiere cloroquina u otros agentes para alterar el tráfico intracelular para conseguir altos niveles de transfección. En un estudio, se ha usado adenovirus para mejorar la liberación génica de los sistemas mediados por receptores. D.T. Curiel et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1991) 88:8850-8854.
Todos estos estudios conjuntamente demuestran que pueden liberarse genes en el interior de células de mamífero por endocitosis mediada por receptor y que una fracción del ADN exógeno escapa a la degradación, entra en el núcleo y se expresa. El nivel de expresión es bajo, probablemente debido a la entrada limitada del ADN extraño en el citoplasma.
Neutralización de carga y permeabilización de la membrana
La liberación directa de genes se ayuda por la capacidad de neutralizar la gran carga negativa presente en el polinucleótido, y la capacidad (a menudo concomitante) de permeabilizar la membrana de la célula diana. El uso de policationes para neutralizar la carga del polinucleótido y ayudar a la permeabilización de la membrana y a la translocación es bien conocido. Felgner, supra. También se han usado lípidos catiónicos para este fin. P.L. Felgner et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1987) 84:7413-7417; Patente de Estados Unidos Nº 4.946.787 de Eppstein et al. También se conocen ciertos lípidos catiónicos denominados lipopoliaminas y lipointercaladores. J.-P. Behr, Tet Lett (1986) 27:5861-5864.
Localización Subcelular. Una vez que el polinucleótido ha entrado en la célula diana, la liberación directa de genes se ayudaría por la capacidad de dirigir los genes a la localización subcelular apropiada. Una diana obvia para la liberación de desoxirribonucleótidos es el núcleo. Son ligandos que se sabe que ayudan en este proceso péptidos de localización nuclear, o proteínas que contienen estas secuencias de localización nuclear. C. Dingwall et al., TIBS (1991) 16:478-481.
Y. Kaneda et al., Science (1989) 243:375-378, demostraron que la eficacia de transfección obtenida con envueltas virales reconstituidas aumenta cuando el gen extraño se libera en el interior de las células diana junto con proteínas nucleares. El ADN mezclado con proteínas nucleares presenta un aumento modesto en la transfección con respecto al ADN que se mezcló con albúmina (Kaneda et al., supra). Se supone que el ADN se incorpora en el núcleo más fácilmente cuando están asociadas con el plásmido proteínas que contienen la secuencia de localización nuclear (NLS) pro-lys-lys-lys-arg-lys-val (P.A. Silver. Cell (1991) 64:489-497). La NLS en una proteína la designa para el transporte a través del poro nuclear. Se han unido secuencias de localización nucleares de 14 aminoácidos a una diversidad de macromoléculas e incluso a partículas de oro (diámetro de 150 A) y, cuando se introducen en el citoplasma, se incorporan rápidamente en el núcleo (D.R. findlay et al., J. Cell Sci Supp (1989) 11:225-242; Silver, supra). La sugerencia de que la entrada en el núcleo es limitante de la velocidad para conseguir una transfección estable satisfactoria, también se confirma por el hallazgo de que el ADN plasmídico microinyectado en el citoplasma no puede realizar la transfección de las células (ausencia de transfección en 1000 inyecciones citoplásmicas), mientras que la microinyección de plásmidos directamente en el núcleo produce una transfección de más del 50% de las células microinyectadas. Cappecchi, supra. Si la unión de señales de localización nuclear en el plásmido conduce al transporte del ADN plasmídico al interior del núcleo, aumentaría la eficacia de transfección. Proponemos un nuevo método para unir NLS y otros ligando al polinucleótido deseado.
Finalmente, los investigadores han demostrado que las eficacias de transfección aumentan cuando el ADN se condensa usando diversas proteínas catiónicas. T.I. Tikchonenko et al., Gene (1988) 63:321-330; M. Bottger et al., Biochim Biophys Acta (1988) 950:221-228; Wagner et al., supra. La razón de por qué la condensación de ADN aumenta la transfección no es fácilmente evidente, puede aumentar la captación celular de ADN (Wagner et al., supra), pero también puede reducir la susceptibilidad del ADN a la actividad nucleasa, lo cual puede producir mayores cantidades de ADN intacto en la célula.
Asociación de Polinucleótidos. La liberación directa de genes asociados con una de las clases descritas anteriormente de moléculas se ayuda adicionalmente por la capacidad de esos componentes de permanecer asociados con el ADN. Wu et al., supra, asociaron su ligando de receptor con el polinucleótido uniendo covalentemente el ligando al policatión polilisina. Wagner et al., supra, además de a la polilisina, también unieron covalentemente el ligando a un intercalador de ADN, homodímero de etidio (diclorhidrato de dicloruro de (5,5'-diazadecametilen-bis(3,8-diamino-6-fenilfenantridio)). P.E. Nielsen, Eur J Biochem (1982) 122:283-289, asociaron marcadores de fotoafinidad al ADN por medio de la unión covalente a 9-aminoacridina y ciertas bis-acridinas.
Ninguna de las referencias anteriores describe un sistema para la liberación de polinucleótidos dirigido a los múltiples aspectos de los problemas implicados en la puesta de un polinucleótido circulante en una localización subcelular diana de una célula diana. Esta invención soluciona esos problemas asociando el polinucleótido con una combinación de uno o más de los siguientes componentes funcionales: componentes de enmascaramiento del ADN, componentes de reconocimiento celular, componentes de neutralización de carga y de permeabilización de la membrana, y componentes de localización subcelular.
Sumario de la invención
A la luz de los problemas mencionados anteriormente de la liberación génica directa, esta invención contempla un sistema de liberación de polinucleótidos de autoensamblaje de acuerdo con la reivindicación 1 que utiliza uno o más de un componente de permeabilización de la membrana y preferiblemente de los siguientes componentes funcionales: componentes de enmascaramiento del ADN, componentes de reconocimiento celular, componentes de neutralización de carga y componentes de localización subcelular. Cada componente de este sistema puede realizar su función indicada y también ser capaz de ensamblarse o desensamblarse con el polinucleótido cuando sea necesario. Por ejemplo, ciertos componente pueden tener que disociarse del polinucleótido para realizar su función deseada.
Por consiguiente, es un objeto primario de esta invención proporcionar una composición de acuerdo con la reivindicación 1 para presentar un polinucleótido a un componente subcelular de una célula eucariota, que comprende el polinucleótido asociado con un componente de permeabilización de membrana capaz de transportar el polinucleótido a través de la membrana citoplásmica de la célula eucariota.
Una composición para presentar un polinucleótido al núcleo de una célula eucariota comprende el polinucleótido asociado adicionalmente con un componente de reconocimiento celular capaz de reconocer la célula eucariota.
Una composición para presentar un polinucleótido al núcleo de una célula eucariota comprende el polinucleótido asociado tanto con un componente de reconocimiento celular capaz de reconocer la célula eucariota, como con un componente de permeabilización de la membrana capaz de transportar el polinucleótido a través de la membrana citoplásmica de la célula eucariota.
Una composición para presentar un polinucleótido a un componente subcelular de una célula eucariota comprende el polinucleótido asociado adicionalmente con un componente de localización subcelular capaz de liberar el polinucleótido desde el citoplasma de la célula eucariota a un componente subcelular de la célula eucariota.
Una composición para presentar un polinucleótido a un componente subcelular de una célula eucariota comprende el polinucleótido, un componente de reconocimiento celular capaz de reconocer dicha célula eucariota, un componente de permeabilización de la membrana capaz de transportar el polinucleótido a través de la membrana citoplásmica de dicha célula eucariota, un componente de localización subcelular capaz de liberar el polinucleótido desde el citoplasma de dicha célula eucariota a un componente subcelular de dicha célula eucariota, y un componente de enmascaramiento capaz de aumentar la vida media en circulación del polinucleótido.
Un componente útil en sistemas de liberación de polinucleótidos de autoensamblaje tiene la fórmula
Ar_{1}---NH---(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{C=O}{\uelm{\para}{\uelm{\hskip-0.1cm(CH _{2} ) _{p} }{\uelm{\para}{X-Y}}}}}}
---(CH_{2})_{m}---NH---Ar_{2}
donde cada uno de n y m es independientemente un número entero de 1 a 20, p es un número entero de 0 a 20, Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y N-metil-2,7-diazapirenio, y derivados de los mismos, X es un grupo de acoplamiento reactivo, e Y se selecciona entre el grupo compuesto por ligandos del receptor de la superficie celular, secuencias de localización subcelular y componentes de permeabilización de la membrana.
Un componente intercalador reactivo tiene la fórmula
Ar_{1}---NH---(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{C=O}{\uelm{\para}{\uelm{\hskip-0.1cm(CH _{2} ) _{p} }{\uelm{\para}{X}}}}}}
---(CH_{2})_{m}---NH---Ar_{2}
donde cada uno de n y m es independientemente un número entero de 1 a 20, p es un número entero de 0 a 20, Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y N-metil-2,7-diazapirenio, y derivados de los mismos, y X es un grupo reactivo.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra una realización del sistema de liberación de polinucleótidos de la invención, donde NLS es una secuencia de localización nuclear, MD es un componente de permeabilización de la membrana y el ligando es un componente de reconocimiento celular.
La figura 2 muestra la estructura de la gramicidina S.
La figura 3 compara la eficacia de la transfección de luciferasa con Lipofectin™, liposomas sensibles al pH y el complejo de gramicidina S/DOPE/ADN.
La figura 4 muestra el efecto de la relación entre gramicidina S y ADN sobre la eficacia de la transfección.
La figura 5 muestra el efecto de la relación entre gramicidina S y DOPE sobre la eficacia de la transfección.
La figura 6 muestra el efecto del tipo de lípido en el complejo de gramicidina S/lípido/ADN sobre la eficacia de la transfección.
La figura 7 muestra el efecto de substituir la gramicidina S en el complejo de gramicidina S/lípido/ADN por otros péptidos sobre la eficacia de la transfección.
La figura 8 muestra un esquema sintético para unir carbohidratos de dirección y/o maleimida reactiva a espermidina bis-acridina.
La figura 9 muestra el esquema básico para acoplar péptidos a la maleimido-espermidina bis-acridina.
La figura 10 muestra un esquema sintético para el acoplamiento a un péptido Lys-Lys degradable bis-acridina.
La figura 11 muestra los resultados del ensayo de retardo en gel del ejemplo 3.
La figura 12 muestra la capacidad de varias galactosil bis-acridinas para unirse al ADN plasmídico en hepatocitos.
La figura 13 muestra un esquema sintético para la espermidina bis-acridina trigalactosilada del ejemplo 6.
Descripción detallada de la invención Definiciones
El término "polinucleótido", como se usa en este documento, incluye las secuencias de ARN o ADN de más de un nucleótido en forma de una sola cadena, de dúplex o de múltiples cadenas. "Polinucleótido" es genérico para polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2'-desoxi-D-ribosa o formas modificadas de la misma) es decir, ADN, para polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa o formas modificadas de la misma) es decir, ARN, y para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glicósido o C-glicósido de una base de purina o pirimidina, o una base de purina o pirimidina modificada o nucleótidos abásicos. El polinucleótido puede codificar regiones promotoras, regiones operadoras, regiones estructurales, regiones de terminación, combinaciones de las mismas o cualquier otro material genéticamente relevante.
Los polinucleótidos de la invención también pueden contener uno o más enlaces "sustitutos", como se entiende generalmente en la técnica. Algunos de estos enlaces substitutos son no polares y contribuyen a la capacidad deseada del polinucleótido de difundir a través de las membranas. Otros contribuyen a un aumento o reducción de la biodegradabilidad del polinucleótido. (La biodegradabilidad se verá afectada, por ejemplo, por un aumento o reducción de la sensibilidad a nucleasas). Estos enlaces "sustitutos" se definen en este documento como enlaces alternativos convencionales tales como fosforotioato o fosforamidato, y se sintetizan como se describe en la bibliografía disponible generalmente. No es necesario que todos estos enlaces sean idénticos en el mismo polinucleótido.
También se incluyen modificaciones en el resto de azúcar del polinucleótido, por ejemplo, donde uno o más de los grupos hidroxilo se reemplazan por halógeno, grupos alifáticos o se funcionalizan como éteres, aminas y similares, o donde la ribosa o desoxirribosa se reemplaza por otras estructuras funcionalmente equivalentes. Las modificaciones en el resto de la base incluyen purinas o pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros heterociclos. Tales "purinas análogas" y "pirimidinas análogas" son las conocidas generalmente en la técnica, y muchas de ellas se usan como agentes quimioterapéuticos.
En particular, el esqueleto de azúcar-fosfato del polinucleótido puede reemplazarse por un esqueleto sin carbohidratos tal como un péptido u otro tipo de esqueleto polimérico como se describe en P.E. Nielsen et al., Science (1991) 254:1497-1500.
La expresión "componente funcional", como se usa en este documento, incluye componentes de enmascaramiento del ADN, componentes de reconocimiento celular, componentes de neutralización de carga y de permeabilización de membrana, y componentes de localización subcelular.
La expresión "componente de enmascaramiento de ADN", como se usa en este documento, se refiere a una molécula capaz de enmascarar todo o parte del polinucleótido, aumentando de esta manera su vida media en circulación por medio de la inhibición del ataque por reactivos de degradación (tales como nucleasas) presentes en la circulación.
La expresión "componente de permeabilización de la membrana", como se usa en este documento, se refiere a cualquier componente que ayuda en el paso de un polinucleótido a través de una membrana. De esta manera, este término incluye en parte componentes de neutralización de carga, normalmente policationes, que neutralizan la gran carga negativa sobre los polinucleótidos, y permiten que el polinucleótido atraviese el interior hidrófobo de una membrana. Muchos componentes neutralizadores de carga pueden actuar como agentes de permeabilización de la membrana. La permeabilización de la membrana también puede producirse con moléculas anfipáticas.
Un permeabilizador de la membrana es una molécula que puede ayudar a una molécula normalmente impermeable a atravesar las membranas celulares y entrar en el citoplasma de la célula. Un permeabilizador de la membrana puede ser un péptido, sal biliar, glicolípido, carbohidrato, fosfolípido o molécula de detergente. Los permeabilizadores de membrana a menudo tienen propiedades anfipáticas de tal forma que una porción sea hidrófoba y otra sea hidrófila, permitiendo que interaccionen con las membranas.
El término "liposoma", como se usa en este documento, se refiere a vesículas pequeñas compuestas de lípidos anfipáticos dispuestos en bicapas esféricas. Los liposomas normalmente se clasifican como vesículas unilamelares pequeñas (SUV), vesículas unilamelares grandes (LUV), o vesículas multilamelares (MLV). Las SUV y LUV, por definición, tienen sólo una bicapa, mientras que las MLV contienen muchas bicapas concéntricas. Los liposomas pueden usarse para encapsular diversos materiales, atrapando moléculas hidrófilas en el interior acuoso o entre bicapas, o atrapando moléculas hidrófobas dentro de la bicapa.
Los liposomas presentan una amplia diversidad de características, dependiendo de su tamaño, composición y carga. Por ejemplo, los liposomas que tienen un pequeño porcentaje de lípidos insaturados tienden a ser ligeramente más permeables, mientras que los liposomas que incorporan colesterol u otros esteroles tienden a ser más rígidos y menos permeables. Los liposomas pueden tener carga positiva, negativa o neutra, dependiendo del grupo hidrófilo. Por ejemplo, los lípidos basados en colina imparten una carga global neutra, los lípidos basados en fosfato y sulfato aportan una carga negativa, los lípidos basados en glicerol generalmente tienen una carga negativa, y los esteroles generalmente son neutros en solución pero tienen grupos cargados.
La expresión "componente de reconocimiento celular", como se usa en este documento, se refiere a una molécula capaz de reconocer un componente en la superficie de una célula diana. Los componentes de reconocimiento celular incluyen: anticuerpos contra antígenos de la superficie celular, ligandos para receptores de la superficie celular incluyendo los implicados en endocitosis mediada por receptores, hormonas peptídicas y similares.
La expresión "resto de asociación al ADN" se refiere a una molécula o a porciones de la misma que interaccionan de una forma no covalente con los ácidos nucleicos. Los restos de asociación al ADN incluyen agentes de unión a los surcos mayoritarios y minoritarios, que son moléculas que se cree que interaccionan con el ADN por asociación con el surco mayoritario o minoritario del ADN bicatenario. Los restos de asociación al ADN también incluyen intercaladores de ADN, que son moléculas planas o porciones planas de moléculas que se cree que se intercalan en el ADN por inserción entre pares de bases de nucleótidos y en posición paralela a estos pares de bases. Los restos de asociación al ADN también incluyen policationes, que se cree que se asocian con las cargas negativas del esqueleto de ADN. Cuando como cadena terapéutica se usa un ARN o ADN monocatenario, la "cadena enlazadora" complementaria, como se describe en este documento, puede actuar funcionalmente como "resto de asociación al ADN".
Los restos de asociación del ADN pueden unirse covalentemente a través de un "grupo reactivo" a un componente funcional de esta invención. Estos grupos reactivos reaccionan fácilmente con un nucleófilo presente sobre el componente funcional. Tales grupos reactivos (con sus correspondientes nucleófilos reactivos) incluyen, pero sin limitación: N-hidroxisuccinimida (amina), maleimida y maleimidofenil (sulfhidrilo), piridil disulfuro (sulfhidrilo), hidrazida (carbohidrato), y fenilglioxal (arginina).
La expresión "componente de localización subcelular", como se usa en este documento, se refiere a una molécula capaz de reconocer un componente subcelular en una célula diana. Los componentes subcelulares reconocidos incluyen el núcleo, ribosomas, mitocondrias y cloroplastos. Los componentes de localización subcelular particulares incluyen los "componentes de localización nuclear" que ayudan a llevar las moléculas al interior del núcleo y se sabe que incluyen los péptidos de localización nuclear y secuencias de aminoácidos.
Las composiciones
Las composiciones de esta invención en parte son sistemas de liberación de polinucleótidos de autoensamblaje que utilizan, de acuerdo con la reivindicación 1, un polinucleótido en combinación con un componente de permeabilización de la membrana y preferiblemente uno o más de los siguientes componentes funcionales: componentes de enmascaramiento del ADN, componentes de reconocimiento celular, componentes de neutralización de carga y componentes de localización subcelular. Cada elemento de este sistema puede realizar su función indicada y también ser capaz de ensamblarse o desensamblarse con el polinucleótido cuando se requiera. También se contemplan como parte de esta invención elementos individuales de este sistema y métodos e intermedios para obtener estos elementos. En la figura 1 se muestra una realización del sistema.
El polinucleótido
El polinucleótido puede ser ARN o ADN monocatenario, ADN bicatenario o un híbrido de ADN-ARN. También se contemplan dentro del alcance de esta invención polinucleótidos de triple o cuádruple cadena con valor terapéutico. Los ejemplos de ADN bicatenario incluirían genes estructurales, genes que incluyen regiones de control y terminación de operadores, y sistemas de autorreplicación tales como ADN plasmídico.
Los polinucleótidos monocatenarios incluyen polinucleótidos antisentido (ADN y ARN), ribozimas y oligonucleótidos que forman triplex. Esta "cadena terapéutica", para tener una actividad prolongada, preferiblemente tiene como algunos o todos los enlaces nucleotídicos, enlaces estables que no son fosfodiéster. Tales enlaces incluyen, por ejemplo, los enlaces fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenato, u O-alquil fosfotriéster donde el grupo alquilo es metilo o etilo.
En el caso de estos polinucleótidos monocatenarios, puede ser preferible preparar la cadena complementaria a la cadena terapéutica como parte de la composición administrada. Esta cadena complementaria se denomina "cadena enlazadora", y normalmente se sintetiza con un enlace fosfodiéster para que se degrade después de entrar en la célula. La "cadena enlazadora" puede ser una cadena separada o puede estar unida covalentemente o ser una mera extensión de la cadena terapéutica de forma que la cadena terapéutica se doble esencialmente e hibride consigo misma.
La cadena enlazadora también puede tener funcionalidades en el extremo 3' o 5' o en el carbohidrato o esqueleto del enlazador, que sirven como componentes funcionales para aumentar la actividad de la cadena terapéutica. Por ejemplo, la cadena enlazadora de fosfodiéster puede contener un ligando de dirección tal como un derivado de folato que permita el reconocimiento e internalización en las células diana. Si el enlazador está unido a su cadena terapéutica complementaria que está compuesta de enlaces resistentes a la degradación, el duplex se internaliza. Una vez dentro de la célula, el enlazador se degrada liberando la cadena terapéutica. De esta manera, la cadena terapéutica no tiene funcionalidades adicionales unidas y su función no se ve impedida por restos no esenciales. Esta estrategia se podría aplicar a cualquier ribozima o polinucleótido formador de triplex antisentido. Se podría usar para liberar polinucleótidos antivirales, antibacterianos, antineoplásicos, antiinflamatorios, antiproliferativos, anti-bloqueo de receptores o anti-transporte, y similares.
Puede sintetizarse una "cadena enlazadora" por separado que tenga la secuencia complementaria directa a la cadena terapéutica e hibride de una forma de uno a uno. Como alternativa, la cadena enlazadora puede construirse de forma que la región 5' de la cadena enlazadora hibride con la región 5' de la cadena terapéutica y la región 3' de la cadena enlazadora hibride con la región 3' de la cadena terapéutica para formar un concatenado de la siguiente estructura
5'-------------------- 
\hskip0,2cm
-------------------- 
\hskip0,2cm
-------------------- 
\hskip1cm
3'-------------------- 
\hskip0,2cm
-------------------- 
\hskip0,2cm
--------------------
Este concatenado tiene la ventaja de que se aumenta el peso molecular aparente de los ácidos nucleicos terapéuticos y sus propiedades farmacocinéticas y la relación de ligando de dirección: ligando terapéutico puede ajustarse para conseguir el efecto terapéutico óptimo.
Los Componentes Funcionales
Componentes de Enmascaramiento del ADN. El elemento de enmascaramiento de ADN de este sistema es una molécula capaz de enmascarar todo o parte del polinucleótido, aumentando de esta manera su vida media en circulación por medio de la inhibición del ataque por reactivos de degradación presentes en la circulación.
En esta invención, puede unirse covalentemente polietilenglicol (PEG) con un resto de asociación al ADN por métodos convencionales como se describe más adelante, y usarse como componente de enmascaramiento del ADN. El PEG tendrá un peso molecular de aproximadamente 700 a aproximadamente 20.000 daltons, preferiblemente de aproximadamente 1800 a 6000 daltons, y preferiblemente estará presente en una relación (moléculas PEG:pb de ADN) de aproximadamente 1:4 a 1:100, más preferiblemente de aproximadamente 1:20.
Como alternativa, el ADN puede enmascararse por medio de la asociación con lípidos. En una realización, el ADN se encierra en liposomas convencionales como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.394.448 de Szoka et al.
En otra realización, el ADN se incuba con un lípido catiónico sintético similar a los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 4.897.355 de Eppstein et al. Estos lípidos catiónicos tienen la fórmula general
1
en la que n es un número entero de 1 a 8, R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son alquilo o alquenilo que tienen de 6 a 24 átomos de carbono, R^{3} es hidrógeno, alquilo o alquilamina que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y R^{4} es un alquilo o alquilamina lineal o ramificado, cargado positivamente, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, donde uno o más de los átomos de carbono puede estar substituido con NR', donde R' es hidrógeno, alquilo o alquilamina que tiene de 1 a 10 carbonos. Son grupos preferidos que pueden funcionar como resto N-R' tris(aminoetil)amina (NH_{2}CH_{2}CH_{2})_{3}N, agmatina (descarboxiarginina) H_{2}N(CH_{2})_{4}C(=NH)NH_{2}, 3-aminoetil-1,3-propanodiamina H_{2}N(CH_{2})_{3}NH(CH_{2})_{2}NH_{2}, 3-dimetilaminopropilamina (CH_{3})_{2}NH(CH_{2})_{3}NH_{2}, iminobis(N,N')dimetilpropilamina NH((CH_{2})_{3}N(CH_{3})_{2})_{2}, iminobis(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina, 1,4-bis(3-aminopropil)piperazina, bis(propilamina) (NH_{2}(CH_{2})_{3})_{2}NH, espermidina y espermina, donde estos grupos se unen a la molécula de lípido a través de uno de sus átomos de nitrógeno.
En una realización preferida específicamente, el lípido catiónico sintético es un lípido de cola catiónica sintético que tiene la fórmula
2
en la que n es un número entero de 6 a 24, Y se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno, etanolamina, colina, glicerol, serina e inositol, R^{1} es alquilo o alquenilo que tiene de 6 a 24 átomos de carbono, R^{3} es hidrógeno, alquilo o alquilamina que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, y R^{4} es un alquilo o alquilamina lineal o ramificado, cargado positivamente, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, donde uno o más de los átomos de carbono puede estar substituido con NR', donde R' es hidrógeno, alquilo o alquilamina que tiene de 1 a 10 carbonos. Son grupos preferidos que pueden funcionar como resto N-R' tris(aminoetil)amina (NH_{2}CH_{2}CH_{2})_{3}N, agmatina (descarboxiarginina) H_{2}N(CH_{2})_{4}C(=NH)NH_{2}, 3-aminoetil-1,3-propanodiamina H_{2}N(CH_{2})_{3}NH(CH_{2})_{2}NH_{2}, 3-dimetilaminopropilamina (CH_{3})_{2}
NH(CH_{2})_{3}NH_{2}, iminobis(N,N')dimetilpropilamina NH((CH_{2})_{3}N(CH_{3})_{2})_{2}, iminobis(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina, 1,4-bis(3-aminopropil)piperazina, bis(propilamina) (NH_{2}(CH_{2})_{3})_{2}NH, espermidina y espermina, donde estos grupos se unen a la molécula de lípido a través de uno de sus átomos de nitrógeno.
Se ha descubierto que los lípidos catiónicos sintéticos descritos anteriormente enmascaran eficazmente el ADN cuando se asocian con él. Sin intención de limitar la intención de forma alguna, se cree que los lípidos forman una estructura de monocapa que encapsula el ADN de alguna forma.
Componentes de Reconocimiento Celular. El elemento de reconocimiento celular de este sistema es una molécula capaz de reconocer un componente en la superficie de una célula diana, unido covalentemente con un resto de asociación al ADN por métodos convencionales como se describe más adelante. Los componentes de reconocimiento celular incluyen: anticuerpos contra antígenos de la superficie celular, ligandos para receptores de la superficie celular incluyendo los implicados en endocitosis mediada por receptores, hormonas peptídicas, etc. Los ligandos específicos contemplados por esta invención incluyen: ligandos de carbohidrato tales como galactosa, manosa, manosil 5-fosfato, fucosa, grupos siálicos, N-acetilglucosamina o combinaciones de estos grupos como carbohidratos complejos, tales como los encontrados en glicolípidos de los grupos sanguíneos o en diversas proteínas secretadas. Otros ligandos incluyen folato, biotina, diversos péptidos que pueden interaccionar con receptores de la superficie celular o intracelulares tales como el péptido quimioatrayente N-formil-met-leu-phe, péptidos que contienen la secuencia arg-asp-glicina o péptidos cys-ser-gly-arg-glu-asp-val-trp, péptidos que contienen un resto de cistina o que interaccionan con proteínas de la superficie celular tales como la proteína GP-120 del virus de la inmunodeficiencia humana, y péptidos que interaccionan con CD-4. Otros ligandos incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tales como los descritos por A. Hertler y A. Frankel, J. Clin Oncol 7: 1932-1942. La especificidad de los anticuerpos puede dirigirse contra una diversidad de epítopos que pueden expresarse en las superficies celulares incluyendo macromoléculas de histocompatibilidad, antígenos autoinmunes, proteínas virales, parasitarias o bacterianas. Otros ligandos proteicos incluyen hormonas tales como la hormona de crecimiento e insulina o factores de crecimiento de proteínas tales como GM-CSF, G-CSF, eritropoyetina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico y ácido y similares. Otros ligandos proteicos incluirían diversas citoquinas que actuarían por medio de receptores de la superficie celular, tales como interleuquina 2, interleuquina 1, factor de necrosis tumoral y fragmentos peptídicos adecuados de tales macromoléculas.
Componentes de Permeabilización de la Membrana. El elemento de permeabilización de la membrana de este sistema es una molécula que ayuda en el paso de un polinucleótido a través de una membrana. Los liposomas y lípidos catiónicos sintéticos descritos anteriormente como componentes de enmascaramiento de ADN también pueden funcionar como componentes de permeabilización de la membrana.
El componente de permeabilización de la membrana de la invención es un péptido catiónico anfipático. Los péptidos catiónicos anfipáticos son péptidos cuya configuración nativa es tal que se considera que el péptido tiene una cara catiónica y una cara hidrófoba neutra. En una realización preferida, el péptido es un péptido cíclico. Son ejemplos de los péptidos cíclicos catiónicos anfipáticos de esta invención gramicidina S (cuya estructura se muestra en la figura 2) y las tirocidinas. El péptido también puede contener algunos o todos los aminoácidos en la configuración D en oposición a la configuración L que existe de forma natural.
En una realización particularmente preferida, el elemento de permeabilización de la membrana incluye, además de los péptidos cíclicos catiónicos anfipáticos, (1) un lípido o (2) una poliamina simple, o ambas cosas.
El lípido de la invención es una molécula anfipática que es capaz de formar liposomas, y es sustancialmente no tóxico cuando se administra a las concentraciones necesarias en forma nativa o como liposomas. Los lípidos adecuados generalmente tienen un extremo polar o hidrófilo y un extremo no polar o hidrófobo. Los lípidos adecuados incluyen, sin limitación, fosfatidilcolina de huevo (EPC), fosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol (Chol), colesterilfosforilcolina, 3,6,9-trioxaoctan-1-colesteril-3e-ol, dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), y otros derivados de hidroxicolesterol o aminocolesterol (véase, por ejemplo, K.R. Patel et al., Biochim Biophys Acta (1985) 814:256-64). El lípido preferiblemente se añade en forma de liposomas.
La poliamina añadida preferiblemente es espermina o espermidina.
Los elementos de permeabilización de la membrana - - el péptido cíclico y el fosfolípido y la poliamina opcionales - - pueden añadirse a la composición simultánea o consecutivamente. Preferiblemente, primero se añade el péptido cíclico y posteriormente se añade el fosfolípido o la poliamina. La relación molar entre el péptido cíclico añadido y la poliamina añadida preferiblemente es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:3. La relación molar entre el péptido cíclico añadido y el fosfolípido añadido preferiblemente es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:20.
Componentes de Localización Subcelular. El elemento de localización subcelular de este sistema es una molécula capaz de reconocer un componente subcelular en una célula diana, unido covalentemente con un resto de asociación al ADN por métodos convencionales como se describe más adelante. Los componentes subcelulares particulares incluyen el núcleo, los ribosomas, las mitocondrias y los cloroplastos.
En una realización preferida de esta invención, el componente de localización subcelular es un componente de localización nuclear. El componente de localización nuclear incluye péptidos conocidos de secuencias de aminoácidos definidas, y secuencias más largas que contienen estos péptidos. Una secuencia peptídica conocida es el antígeno T grande de SV 40 heptapeptídico pro-lys-lys-lys-arg-lys-val. Otros péptidos incluyen la nucleoproteína del virus de la influenza decapeptídica ala-ala-phe-glu-asp-leu-arg-val-leu-ser, y la secuencia de la proteína EIa de adenovirus lys-arg-pro-arg-pro. Pueden encontrarse otras secuencias en C. Dingwall et al., TIBS (1991) 16:478-481.
En otra realización, el componente de localización subcelular es un componente de localización lisosomal. Un componente conocido para la dirección hacia el lisosoma es un péptido que contiene la secuencia lys-phe-glu-arg-gln. En otra realización, el componente de localización subcelular es un componente de localización mitocondrial. Un componente conocido para la dirección hacia las mitocondrias es un péptido que contiene la secuencia met-leu-ser-leu-arg-gln-ser-ile-arg-phe-phe-lys-pro-ala-thr-arg.
Restos de asociación al ADN
El resto de asociación al ADN de este sistema se refiere a una porción de un componente funcional que interacciona de una forma no covalente con ácidos nucleicos. El resto se une covalentemente al resto del componente funcional por medios convencionales o como se describe más adelante. Los restos de asociación al ADN preferiblemente son agentes de unión a los surcos mayoritarios o minoritarios, intercaladores de ADN o agentes de unión al ADN generales. En el caso de polinucleótidos monocatenarios, el resto de asociación al ADN puede incluso ser la cadena enlazadora que se ha descrito anteriormente. En tal caso, el resto funcional, tal como el componente de reconocimiento celular o de localización subcelular, se une covalentemente a la cadena enlazadora.
En una realización preferida, el resto de asociación al ADN es un agente de unión a los surcos mayoritarios o minoritarios. Estos agentes de unión a los surcos mayoritarios y minoritarios son restos que se sabe que se asocian o "se sitúan" en el surco mayoritario o minoritario del ADN. Estos agentes de unión incluyen distamicina A y colorante Hoechst 33258.
En otra realización, el resto de asociación al ADN es un agente de unión al ADN no específico tal como un policatión. Los policationes de esta invención incluyen polilisina, poliarginina, poli(lisina-arginina) y polipéptidos similares, y las poliaminas.
En otra realización preferida, el resto de asociación al ADN es un intercalador de ADN. Los intercaladores de ADN son moléculas policíclicas planas tales como bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y N-metil-2,7-diazapirenio, y derivados de los mismos. En una realización particular preferida, el intercalador es un dímero que consta de dos moléculas policíclicas planas unidas covalentemente. Un resto dimérico policíclico plano de esta invención tiene la estructura
Ar_{1}---NH(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{C=O}{\uelm{\para}{\uelm{\hskip-0.2cm(CH _{2} ) _{p} }{\uelm{\para}{Z}}}}}}
---(CH_{2})_{m}---NH---Ar_{2}
en la que Z es un enlace, cada uno de n y m es independientemente un número entero de 1 a 20 y p es un número entero de 0 a 20; y
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y n-metil-2,7-diazapirenio, y derivados de los mismos.
Los valores de n y m son importantes ya que determinan la separación de los monómeros de acridina intercalados en el ADN. Los valores más preferidos de n y m son 3 y 4, respectivamente. Se prefieren los dímeros de bis-acridina donde tanto Ar_{1} como Ar_{2} son acridina.
Este resto de asociación al ADN preferido se unirá covalentemente a un resto funcional, siendo dicho resto un resto de reconocimiento celular, un resto de localización subcelular o un resto de permeabilización de la membrana como se ha descrito anteriormente. El valor de p determina la separación del intercalador del resto funcional. Son valores preferidos para p de 0 a 8.
El resto de asociación al ADN puede unirse covalentemente a copias múltiples de un resto funcional o a más de un resto funcional. Por ejemplo, el dímero de bis-acridina puede unirse a tres restos de galactosa que se unen al receptor asialoorosomucoide de hepatocitos como se muestra en la figura 13.
En un método preferido para unir el dímero de asociación al ADN al resto funcional está implicado un precursor que tiene la fórmula
Ar_{1}---NH---(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{C=O}{\uelm{\para}{\uelm{\hskip-0.1cm(CH _{2} ) _{p} }{\uelm{\para}{X}}}}}}
---(CH_{2})_{m}---NH---Ar_{2}
en la que cada uno de n y m es independientemente un número entero de 1 a 20 y p es un número entero de 0 a 20;
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y n-metil-2,7-diazapirenio, y derivados de los mismos; y
X es un grupo reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por N-hidroxisuccinimida, maleimida, maleimidofenilo, piridil disulfuro, hidrazida y fenilglioxal.
En una realización preferida, Ar_{1} y Ar_{2} son acridina, p es 4 y X es p-maleimidofenilo. Este resto de intercalación después se acopla al resto funcional a través de un grupo sulfhidrilo presente en el resto funcional, por ejemplo, para obtener un componente bifuncional que tiene la estructura
Ar_{1}---NH---(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{C=O}{\uelm{\para}{\uelm{\hskip-0.1cm(CH _{2} ) _{p} }{\uelm{\para}{X-Y}}}}}}
---(CH_{2})_{m}---NH---Ar_{2}
en la que Y es un componente funcional;
cada uno de n y m es independientemente un número entero de 1 a 20, y p es un número entero de 0 a 20;
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y N-metil-2,7-diazapirenio, y derivados de los mismos; y
X es un grupo reactivo seleccionado entre el grupo compuesto por N-hidroxisuccinimida, maleimida, maleimidofenilo, piridil disulfuro, hidrazida y fenilglioxal.
Para unir el componente funcional al intercalador también pueden usarse enlazadores biodegradables tales como péptidos que tienen la secuencia -lys-lys-.
En otra realización de esta invención, el dímero policíclico plano tiene la fórmula
(aa)_{x}---
\delm{aa _{1} }{\delm{\para}{\delm{N ^{1} H}{\delm{\para}{Ar _{1} }}}}
---(aa)_{y}---
\delm{aa _{2} }{\delm{\para}{\delm{
N ^{2} H}{\delm{\para}{Ar _{2} }}}}
--- (aa)_{z}
en la que Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y N-metil-2,7-diazapirenio y derivados de los mismos;
cada aa es independientemente un aminoácido;
x y z son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 100;
y es un número entero de 0 a 5;
aa_{1} y aa_{2} son restos de lisina; y
N^{1} y N^{2} son nitrógenos de los grupos \in-amino de los restos de lisina aa_{1} y aa_{2}.
Utilidad del sistema de liberación de polinucleótidos
El sistema de liberación de polinucleótidos de la invención es útil en un contexto terapéutico. En aplicaciones terapéuticas, el sistema de la invención puede formularse para una diversidad de modos de administración, incluyendo la administración sistémica, tópica o localizada. Pueden encontrarse técnicas y formulaciones generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
En el caso de la administración sistémica, se prefiere la administración parenteral, tal como la inyección, incluyendo la inyección intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para tratar trastornos del pulmón, la administración del sistema de liberación de polinucleótidos se realiza por inhalación o instilación del sistema directamente en el pulmón.
Para inyección, los sistemas de la invención se formulan en soluciones líquidas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, los sistemas pueden formularse en forma sólida y redisolverse o resuspenderse inmediatamente antes del uso. También se incluyen formas liofilizadas.
La administración sistémica también puede realizarse por vía transmucosa o transdérmica, o los sistemas pueden administrarse por vía oral, o a través de aerosoles intranasales o inhalados. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Tales penetrantes generalmente son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración a través de la mucosa, sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, pueden usarse detergentes para facilitar la infiltración. La administración a través de la mucosa puede realizarse por medio de pulverizaciones nasales, por ejemplo, o usando supositorios. Para la administración oral, los sistemas se formulan en formas de administración oral convencionales tales como cápsulas, comprimidos y tónicos.
Para la administración tópica, los sistemas de la invención se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas, como generalmente es conocido en la técnica.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar la invención.
Ejemplo 1 Transfección con gramicidina S
Lipofectin™ es un lípido catiónico sintético, dioleiloxitrimetilamonio (DOTMA) en combinación con fosfatidiletanolamina para formar un complejo de carga con ADN cargado negativamente. Se cree que este complejo se fusiona con la membrana celular y libera el ADN en el interior del citoplasma. Una estrategia alternativa usa liposomas sensibles al pH compuestos de un lípido cargado negativamente y fosfatidiletanolamina. C.Y. Wang et al., Biochem (1989) 28:9508-9514. El mecanismo de liberación implica la endocitosis del liposoma, ya que el pH del endosoma se vuelve ácido, la bicapa liposomal se desestabiliza y se fusiona con la membrana endosómica. El contenido del liposoma después se introduce en el citoplasma de la célula. C.-J. Chu et al., Pharmaceut Res (1990) 7:824-834.
Hemos comparado Lipofectin™ con una composición de liposomas sensible al pH de colesterilhemisuccinato (Chems)/fosfatidiletanolamina (PE) y con complejos de gramicidina S/dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE)/ADN con respecto a la liberación y expresión de ADN en células de mamífero. Como indicadores para la transferencia génica se usaron plásmidos que contenían promotores fuertes y luciferasa de luciérnaga o \beta-galactosidasa.
Protocolo de transfección de células
Se proporcionaron células CV-1, p388D1, HepG2 y HeLa por la UCSF Cell Culture Facility. El reactivo Lipofectin™ se usó como se describe en el prospecto del producto (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Se obtuvieron células KD83 en DNAX (Palo Alto, CA). Las células se cultivaron a una densidad de 0,5-1 x 10^{6} células por placa de 60 mm y se dejaron crecer durante un período de 16 a 20 horas a 37ºC con un 5% de CO_{2} en el medio apropiado que contenía un 10% de suero de ternero fetal (FCS). Antes de la incubación con liposomas, Lipofectin™ o el complejo de gramicidina S/DOPE/ADN, las células se lavaron una vez con 2 ml de medio DME H-21 sin FCS. Después se añadió el sistema de transfección en 2 ml del mismo medio. En algunos experimentos, la transfección tuvo lugar en DME H-21 que contenía un 10% de FCS. Después de 5 horas, se retiró el medio y se reemplazó por 3 ml del medio apropiado con un 10% de FCS. La actividad luciferasa se midió después de 48 horas como se ha descrito (A.R. Brasier et al., Biotechniques (1989) 7:1116-1122). En resumen, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo sin Ca^{2+} y Mg^{2+} (PBS), se trataron con 400 \mul de glicilglicina 25 mM (pH 7,8) en tampón de lisis (que contenía un 1% de Triton) y se rasparon. Después de la centrifugación, se mezclaron 100 \mul de sobrenadante con una cantidad óptima de ATP 50 mM. Después se inyectó D-luciferina (Sigma, 100 \mul de una solución 1 mM) y la luz emitida se integró durante los 10 primeros segundos usando un bioluminómetro (Bioluminescence Analytical Laboratories Inc., San Diego, CA). Las proteínas del sobrenadante se ensayaron usando la técnica de Bradford (kit Bio-Rad). Los resultados se expresaron como unidades de luz por mg de proteína celular.
Ensayo de luciferasa
Para comparar la potencia de tres promotores virales diferentes del gen de la luciferasa, RSV, SV40 y CMV, hemos transfectado varias líneas de células de mamífero con los correspondientes plásmidos complejados con Lipofectin™. Cada placa de células recibió 2 \mul de plásmido combinados con 10 \mul de Lipofectin™ como se ha descrito anteriormente. La fuerza del promotor se estimó por la expresión de luciferasa a las 48 horas proporcionada por el plásmido correspondiente. El promotor de CMV (plásmido pCluc4) condujo a la mayor expresión de la luciferasa en células HeLa, HepG2 y p38BBD1, mientras que el promotor de SV40 (plásmido pSV2) fue más potente en células CV-1. Por lo tanto, para experimentos adicionales, en células CV-1 se ha usado el plásmido pSV2 y en otras líneas celulares se ha usado pCluc4.
Caracterización de liposomas
La eficacia de encapsulación de los plásmidos se determinó después de la separación de los plásmidos encapsulados de los no encapsulados en gradientes de Ficoll. Se encapsuló aproximadamente un 22 \pm 3% del ADN total añadido. Los diámetros de los liposomas se midieron por dispersión de luz dinámica y fueron de 327\pm38 nm, 295\pm65 nm y 464\pm20 nm para los liposomas DOPE/CHEMS, DOPC/CHEMS y PS/Chol respectivamente (los resultados son la media \pm desviación típica de tres determinaciones de dispersión de luz independientes).
A. Gramicidina S y fosfatidiletanolamina
Se realizó la preparación típica del complejo diluyendo 20 \mug de ADN plasmídico en 300 \mul de Tris Cl pH 9 30 mM en un tubo de poliestireno. Se diluyó gramicidina S en tampón Tris Cl pH 9 30 mM hasta una concentración de 2 mg/ml a partir de una solución madre a 20 mg/ml en DMSO. Se añadieron 20 \mul de gramicidina S diluida (es decir, 40 \mug) al ADN y se mezclaron rápidamente. Después se añadieron lentamente 170 nmoles de liposomas gota a gota a la mezcla de ADN y gramicidina S. Los liposomas se prepararon secando 4 \mumoles de lípidos en una atmósfera de nitrógeno con un evaporador rotatorio y rehidratando la película con 4 ml de tampón Tris Cl pH 9 30 mM. Los liposomas posteriormente se sonicaron durante 30 minutos en una atmósfera de argón usando un sonicador de baño. El diámetro del complejo se determinó por dispersión de luz dinámica. Para formar el complejo con ADN y lípidos también se usaron otros péptidos, incluyendo tirocidina (U.S. Biochemicals), polimixina B (Sigma) y polilisina 100 (Sigma).
La eficacia de la transfección se controló midiendo la expresión de luciferasa en células CV-1 como se ha descrito anteriormente. En la figura 3 se ilustra la respuesta a la dosis comparando la cantidad de ADN añadido en los tres sistemas de transfección. En el eje Y se representan las unidades de luz por mg de proteína celular en una escala logarítmica y en el eje X la cantidad de ADN añadido. El recuadro blanco designa los resultados usando el complejo de gramicidina S-dioleoilfosfatidil etanolamina-ADN. Este complejo induce un nivel de expresión diez veces mayor que el obtenido con Lipofectin, y un nivel de expresión de 1000 a 10.000 veces mayor que el obtenido usando los liposomas sensibles al pH.
B. Efectos de la relación entre gramicidina S y ADN
Se preparó el complejo de gramicidina S-DOPE-ADN como se ha descrito en el ejemplo 1-A con la excepción de que la cantidad de gramicidina S añadida al complejo se varió a cantidades constantes de ADN (20 \mug) y DOPE (170 nmoles). El complejo se añadió a células CV-1 y la actividad luciferasa se midió como se describe en el ejemplo 1. El resultado se presenta en la figura 4 e ilustra que la expresión máxima usando el complejo de gramicidina S-DOPE-ADN se produce cuando la carga del ADN se neutraliza por la carga de la gramicidina.
C. Efectos de la concentración de lípidos
Se preparó el complejo de gramicidina S-DOPE-ADN como se ha descrito en el ejemplo 1 con la excepción de que la cantidad de DOPE añadida al complejo se varió a cantidades constantes de ADN (20 \mug) y gramicidina S (40 \mug). El complejo se añadió a células CV-1 y la actividad luciferasa se midió como se ha descrito en el ejemplo 1. El resultado se presenta en la figura 5, que ilustra que en ausencia del DOPE, la expresión es baja. Se produce una expresión máxima usando el complejo de gramicidina S-DOPE-ADN cuando la relación entre DOPE y gramicidina S está por encima de 5/1:mol/mol.
D. Efectos del tipo de lípido
Se preparó el complejo de gramicidina S-lípido-ADN como se ha descrito en el ejemplo 1 con la excepción de que el tipo de fosfolípido añadido al complejo se varió a cantidades constantes de ADN (20 \mug) y gramicidina S (40 \mug). Las composiciones de lípidos empleadas fueron DOPE; DOPE:dioleoilfosfatidilcolina (DOPC):2/1, palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), monometil DOPE (mmDOPE); dimetil DOPE (dm DOPE); DOPC y dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE). El complejo se añadió a células CV-1 y la actividad luciferasa se midió como se describe en el ejemplo 1. El resultado se presenta en la figura 6, que ilustra que la expresión de la actividad luciferasa es máxima con DOPE o una mezcla de DOPE/DOPC:2/1 en el complejo. La actividad luciferasa se reduce apreciablemente cuando el grupo amino del DOPE está substituido con 2 (dm DOPE) o 3 grupos metilo (DOPC). La expresión del gen codificado también se reduce apreciablemente cuando se usa DPPE. Este último lípido tiene cadenas acilo saturadas y una alta temperatura de transición, lo que significa que las cadenas acilo de DPPE son menos fluidas que los otros lípidos ensayados en esta serie.
E. Efectos de la adición de espermidina cargada positivamente no anfipática
Los datos presentados en el ejemplo 2 demuestran que la expresión génica debida al complejo de gramicidina S-DOPE-ADN es máxima cuando las cargas negativas del ADN se neutralizan por las cargas positivas de la gramicidina. Para determinar si es más importante la neutralización de carga o la permeabilización de la membrana para la transferencia génica usando este sistema, se reemplazó de forma creciente la contribución de la carga positiva de la gramicidina S por la poliamina cargada positivamente, espermidina. Se preparó el complejo de gramicidina S-lípido-ADN como se ha descrito en el ejemplo 1, con la excepción de que la cantidad de gramicidina S añadida al complejo se varió a cantidades constantes de ADN (20 \mug). Las cargas positivas requeridas para neutralizar el ADN se suministraron por la espermidina. El complejo se preparó con o sin 170 nmoles de DOPE. El complejo se añadió a células CV-1 y la actividad luciferasa se midió como se ha descrito en el ejemplo 1. Los resultados se proporcionan en la tabla 1 presentada a continuación, expresándose la actividad luciferasa como unidades de luz/mg de proteína celular. La primera actividad siempre fue mayor cuando estaba presente DOPE en el complejo. En ausencia de DOPE, un reemplazo secuencial de la carga positiva debida a la gramicidina S por espermidina conduce a una respuesta bifásica; la expresión de la luciferasa aumenta inicialmente hasta un valor aproximadamente 100 veces menor que la respuesta máxima obtenida en presencia de DOPE. Cuando el porcentaje de neutralización de carga debida a la gramicidina S se redujo por debajo del 25%, se perdió totalmente la actividad de transfección. De esta manera, la función de permeabilización de la membrana de la gramicidina S es más importante que la función de neutralización de carga.
TABLA 1
Neutralización de Carga de la Espermidina
% de cargas aportadas por GS sin lípidos con lípidos
100 4,5 \pm 2 10^{3} 8,5 \pm 0,7 10^{8}
75 4 \pm 2,5 10^{5} 5 \pm 2 10^{8}
25 2 \pm 2,5 10^{6} 2 \pm 0,5 10^{7}
12,5 0 2 \pm 0,5 10^{7}
F. Uso de otros péptidos cargados positivamente
Se preparó el complejo de péptido-DOPE-ADN como se ha descrito en el ejemplo 1, con la excepción de que el tipo de péptido añadido al complejo se varió a cantidades constantes de ADN (20 \mug) y DOPE (170 nmoles). Los péptidos empleados fueron polimixina B, un péptido catiónico cíclico; polilisina, un péptido catiónico lineal; tirocidina, un péptido catiónico cíclico con una estructura similar a la de la gramicidina S pero que sólo contenía una carga positiva, y gramicidina S. El plásmido de luciferasa también se introdujo en las células por transfección usando Lipofectin. El complejo se añadió a células CV-1 y la actividad luciferasa se midió como se ha descrito en el ejemplo 1. La figura 7 demuestra que la gramicidina S inducía el mayor nivel de expresión, seguida de cerca por el péptido cíclico relacionado tirocidina. Los dos péptidos cíclicos fueron superiores a Lipofectin en la transferencia del ADN al interior de las células. También se observó actividad con los otros dos péptidos, polimixina B y polilisina, sin embargo, el nivel de expresión de luciferasa mediada por estos dos péptidos catiónicos fue inferior a la inducida por la gramicidina S o la tirocidina.
G. Comparación de transfección mediada por un complejo de ADN-Dendrímero con la obtenida con un complejo de ADN-Polilisina
Para encontrar alternativas mejor definidas químicamente a los polímeros de poliamina tales como la polilisina, hemos empleado macromoléculas policatiónicas ramificadas hidrófilas también conocidas como micropartículas de dendrímero Starburst™, Tomalia et al., supra, para formar un complejo con ADN o con ADN y el péptido anfipático de permeabilización GALA. R. Parente et al., Biochemistry (1990) 29:8720-8728. El complejo se preparó diluyendo 12 \mug del plásmido pCLUC4 en 660 \mul de HBS (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) en un tubo de poliestireno. Se disolvieron polilisina (Sigma Chemical Co.) o micropartículas de dendrímero Starburst™ de la quinta generación (1 nmol) (Polysciences, Inc) en 340 \mul de HBS y se añadieron lentamente (gota a gota) a la solución de ADN. En estas condiciones, las cargas positivas de los grupos epsilon-amino de las polilisinas o de las aminas periféricas de los dendrímeros están en un exceso de 1,3 veces con respecto a las cargas negativas de los plásmidos. Cuando se añadió el péptido GALA, se añadió de forma que las cargas negativas de GALA neutralizaran las cargas en exceso del dendrímero. La mezcla se dejó en reposo durante 30 minutos después de la última adición a temperatura ambiente, y después se añadieron 500 \mul de la mezcla a células CV-1. El protocolo de transfección se realizó como se ha descrito anteriormente. En este experimento, el mejor protocolo de transfección se realizó con el complejo GALA-dendrímero-ADN, seguido de dendrímero-ADN y después de polilisina-ADN (tabla 2).
TABLA 2
Transfección mediada por ADN-Dendrímero
Condición Iluminaciones de luciferasa (unidades por mg de proteína celular)
Dendrímero-GALA-ADN (9 \pm 2) x 10^{5} (n = 2)
Dendrímero-ADN (5 \pm 2) x 10^{5} (n = 2)
Polilisina-ADN (2,7 \pm 0,1) x 10^{5} (n = 2)
Ejemplo 2 Síntesis de espermidina bis-acridinas reactivas y funcionalizadas
Los derivados de espermidina bis-acridina (la síntesis se muestra en la figura 8) se intercalan en ácidos nucleicos bicatenarios con constantes de afinidad mayores que 1 x 10^{4} (pH 7,4; NaCl 0,2 M) y pueden usarse para unir una diversidad de moléculas de dirección al ADN. Como ligandos de dirección pueden usarse carbohidratos, péptidos, hormonas, vitaminas, cofactores, proteínas o anticuerpos.
A. Espermidina bis-acridina
El esquema para dirigir los ácidos nucleicos a ciertos sitios del cuerpo se basa en la intercalación de un ligando que interacciona con un componente de la superficie celular en el ADN bicatenario. Se ha informado sobre un procedimiento para la N^{4}-acilación selectiva de la espermidina, usando N^{1}, N^{8}-bis (t-butoxicarbonil) espermidina como material de partida. R.J. Bergeron et al., Synthesis (1982) 689-692. Hemos usado este procedimiento (figura 8) para asociar los derivados de galactosilo funcionalizados con ácido 9 y 9' al grupo amino secundario de la N^{1},N^{8}-espermidina Boc-protegida (15), y las espermidinas galactosiladas resultantes 17 y 17', después de la desprotección, se alquilaron adicionalmente con 9-fenoxiacridina por un procedimiento químico convencional para transformarlas en compuestos bis-intercaladores 21 y 21'. La síntesis de los derivados de galactosilo funcionalizados con ácido carboxílico se detalla (J. Haensler et al., Biochim Biophys Acta (1988) 946:95-105) y es fácilmente aplicable a una amplia serie de ligandos constituidos por carbohidratos (M.M. Ponpipom et al., J Med Chem (1981) 24:1388-1395). Los compuestos del título se obtuvieron con un rendimiento total del 30% y los datos de RMN y de espectrometría de masas son coherentes con la estructura propuesta.
B. Espermidina bis-acridina activada
Basándose en el esquema anterior, se ha creado un método versátil para unir péptidos a un derivado de espermidina bis-acridina. Se N^{4}-aciló N^{1},N^{8}-bis(t-butoxicarbonil)espermidina con N-succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (SMPB) (4), se desprotegió y se acopló a anillos de acridina para obtener un bis-intercalador que llevaba un grupo maleimida (20). Se obtuvo un solo compuesto después de la purificación cromatográfica en ácido silícico con un rendimiento total del 25%. Los resultados de la RMN y de la espectrometría de masas son coherentes con la estructura asignada.
C. Espermidina bis-acridina unida a NLS
El péptido NLS PKKKRKV (Kaneda et al., supra) y péptidos de control con la misma composición pero con una secuencia diferente se han sintetizado en un sintetizador de péptidos automático ABI con un resto de cisteína N-terminal. El cisteína-péptido después se une al intercalador que lleva maleimida (figura 9) y puede anclarse a ácidos nucleicos bicatenarios.
D. Enlazadores biodegradables
Se sintetizan enlazadores biodegradables que constan de un enlace peptídico lys-lys de la manera mostrada en la figura 10. En la figura, se pone un resto de galactosa sobre la amina desprotegida. Como alternativa, se sintetiza un péptido protegido que contiene dos restos de lisina adyacentes por síntesis en fase sólida. El péptido lleva funciones de permeabilización de la membrana o funciones de dirección y se añaden restos de acridina a los dos grupos \in-amino de las lisinas.
Ejemplo 3 Ensayo de retraso en gel del plásmido PC LUC4 con intercaladores galactosilados y aglutinina
Para demostrar que las bis-acridinas galactosiladas 21 y 21' del ejemplo 2 (21' es el homólogo de 21 donde la galactosa está separada de la espermidina bis-acridina por tres carbonos extra) pueden interaccionar con un receptor soluble mientras están unidas al ADN, usamos un ensayo de desplazamiento en gel. En este ensayo se incubó una proteína de unión a galactosa, lectina de Ricinus communis RCA_{120}, con el complejo de galactosil-bis-acridina-ADN. Si esta proteína interacciona con el complejo y el complejo permanece asociado con el ADN, el ADN no migra al interior del gel de electroforesis. Cada muestra del plásmido pC LUC4 (2 \mul; 140 ng) se mezcló con 13,5 pmoles de 21 o 21' y se añadió 1 \mul (33,3 pmoles) de RCA_{120} con un exceso de galactosa libre (1,35 nmoles) cuando está indicado. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, las muestras se sometieron a electroforesis a través de un gel de agarosa al 0,8% usando un sistema tampón Tris-acetato 0,04 M (pH 7,6) y se tiñeron con bromuro de etidio para visualizar el ADN (figura 11).
La intercalación de las espermidina bis-acridinas galactosiladas en el plásmido pC LUC4 se demuestra por el retraso observado para el plásmido cuando formó complejos con los compuestos 21' (calle B) o 21 (calle E). La intercalación de la bis-acridina en el ADN produce un cambio desde la forma superenrollada a una forma circular relajada, que migra más lentamente.
La capacidad del complejo de plásmido-galactosa para unirse a un receptor soluble para la galactosa se muestra por el retraso casi completo del complejo en presencia de la lectina de Ricinus communis RCA_{120} (calles C y F). RCA_{120} es un dímero y tiene dos sitios de unión selectivos para los restos de \beta-D-galactosilo terminales, por lo que también puede formar enlaces cruzados con los complejos de plásmido-galactosa. La interacción de RCA_{120} con el plásmido pC LUC4 cuando forma complejos con los compuestos 21 o 21', ocasiona la formación de agregados grandes que no penetran en el gel. Cuando el plásmido forma complejos con 21' esta interacción parece ser mucho más eficaz que cuando forma complejos con 21. Para formar enlaces cruzados con los plásmidos, RCA_{120} tiene que superar las repulsiones electrostáticas existentes entre plásmidos adyacentes. De esta manera, al separar la galactosa de la superficie de los plásmidos por un brazo espaciador, como ocurre en los complejos obtenidos con el compuesto 21', se facilita la unión de la lectina. Como resultado de una interacción multivalente, los agregados de plásmido formados por RCA_{120} son muy estables y no se disocian por un exceso de 100 veces de un ligando monovalente competitivo tal como galactosa (calles D y G).
Ejemplo 4 Unión de bis-acridinas a ADN bicatenario usando un ensayo de desplazamiento de bromuro de etidio
La afinidad de las bis-acridinas por ADN de timo de ternero se calculó a partir del desplazamiento de bromuro de etidio desde ácidos nucleicos bicatenarios (Nielsen, supra). El desplazamiento de etidio se controló por la reducción de la fluorescencia de bromuro de etidio (ex. = 540 nm, em. = 610 nm) que se produce cuando se libera desde el ADN. Las constantes de asociación de las bis-acridinas con respecto al bromuro de etidio se calculan a partir de su IC_{50}. En este estudio, como compuesto de referencia se usó triclorhidrato de espermidina bis-acridina (SBA-3HCl) sintetizado como se describe (Nielsen, supra). Como resultado de la pérdida de una de sus tres cargas positivas, se observa una reducción ligera pero significativa en la afinidad cuando el grupo N^{4} amino de la espermidina bis-acridina se encaja en un enlace amida con el carbohidrato de dirección del compuesto 21 (Gal-BA-2HCl). Sin embargo, predecimos un aumento de afinidad cuando la espermidina bis-acridina se une al péptido NLS PKKKRKV con una alta carga positiva. G. Karup et al., Int J Peptide Protein Res (1988) 32:331-343. En la tabla 3 se proporcionan conjugados sintetizados para unir ligandos de dirección al ADN en los diversos ejemplos.
TABLA 3
Constante de Disociación de las Bis-acridinas de ADN de Timo de Ternero (en M)
SBA\cdot3HCl 2,4 X 10^{-8}
Gal-3-bA^{1} 3,5 X 10^{-7}
Gal-6-bA^{2} 7,9 X 10^{-7}
Gal_{3}Lys_{2}-bA^{3} 5,4 X 10^{-6}
Maleimido-bA^{4} 6,5 X 10^{-7}
WTcys-bA^{5} 1,4 X 10^{-7}
SNL-bA^{6} 1,4 X 10^{-7}
^{1}Compuesto 21 donde n=3
^{2}Compuesto 21 donde n=6
^{3}Compuesto 26 (mostrado en el ejemplo 6)
^{4}Compuesto 20
^{5}SBA unida a CGYGPKKKRKVGG
^{6}SBA unida a CGYKPKVRGKGKG
Las constantes de unión para las diversas bis-acridinas se calculan a partir de un ensayo de desplazamiento de bromuro de etidio usando un método para determinar la afinidad de unión de un tetrámero por una red lineal por medio de unión competitiva no cooperativa con un dímero (A. Wolfe y T. Meehan. J. Mol. Biol. 223, 1063-1087, 1992) y una constante de disociación intrínseca de 5,3 X 10^{-6} M para el bromuro de etidio.
Ejemplo 5 Capacidad de ligandos de bis-acridina galactosilo de dirigir el ADN a receptores de la superficie celular
Para demostrar los factores que controlan la capacidad de dirección de los intercaladores de bis-acridina que contienen un ligando de dirección de galactosilo, se aislaron hepatocitos de rata a partir de hígado de rata y se pusieron en cultivo a una densidad de 10^{6} hepatocitos en placas petri de 60 mm en 3 ml de medio MEM que contenía un 5% de suero de ternero fetal y antibióticos. Se demuestra que los hepatocitos tienen receptores de galactosa por medio de la unión de asialoorosomucoide. Después de 18 horas a 37ºC, el medio se retira y se reemplaza por 1 ml de MEM. Después, a la placa de cultivo se le añade 1 \mug de ADN plasmídico marcado con ^{125}I complejado con BA\cdot3HCl, Gal-3-bA, Gal-6-bA o Gal_{3}-Lys_{2}-bA en 100 \mul de agua. La relación entre intercalador y plásmido fue de 500:1 o 1000:1. Las células se incubaron durante 1 hora más a 37ºC, después se aclararon y la proteína se digirió en 1 ml de NaOH (1 N). En el lisado celular se contó la radiactividad y se midió la proteína. La cantidad de plásmido asociado a la célula se expresa como ng de plásmido por mg de proteína celular y se representa como una función del agente complejante (figura 12). Aunque los tres compuestos de galactosil bis acridina se unen al ADN (tabla 2) y pueden interaccionar con una proteína de unión a galactosa soluble (ejemplo 3), sólo el Gal_{3}-Lys_{2}-bA pudo interaccionar con el receptor de la superficie celular. De esta manera, una dirección eficaz a receptores de la superficie celular requiere un brazo espaciador más largo, ya que el proporcionado por la Gal_{3}-Lys_{2}-bA podía interaccionar con el receptor de la superficie celular (síntesis mostrada en la figura 13 y en el ejemplo 6).
Ejemplo 6 Síntesis de una bis-acridina biodegradable que contiene tres ligandos de dirección: espermidina bis-acridina trigalactosilada
La síntesis completa de esta molécula se muestra en la figura 13.
Síntesis de bis-trifluoroacetato de L-lisil-L-lisina (22): Se mezclaron N-\in-BOC-L-lisina (603 mg, 2,45 mmol) y N-N-\in-bis-BOC-L-lisina-p-nitrofenil éster (2,28 g; 4,9 mmol) en 40 ml de N-metil morfolina que contenía 640 \mul de N,N diisopropiletilamina (3,7 mmol). La mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente en una atmósfera de argón, se filtró para retirar las trazas insolubles de N-\in-BOC-L-lisina que no había reaccionado y se evaporó a sequedad a alto vacío. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice eluida con el sistema CHCl_{3}/CH_{3}OH/H_{2}O 9:1:0,1 para producir 1,22 g de dímero de lisina protegida con BOC puro; rendimiento 87%.
Desprotección: En un matraz enfriado (hielo seco) que contenía 700 mg (1,2 mmol) del dímero de lisina protegido con BOC se añadieron 5 ml de TFA. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó en una atmósfera de argón. Después de 30 minutos de agitación, el ácido trifluoroacético se evaporó al vacío. El residuo se recogió en acetona y se evaporó (5 veces). Finalmente, el residuo se redisolvió en 14 ml de agua, se extrajo tres veces con 8 ml de cloroformo y se liofilizó para dar 480 mg del compuesto del título; rendimiento 80%.
Dímero de trigalactosil lisina protegida: Síntesis de N\alpha-[N\alpha, N\in-Bis(6-(1-tio-2,3,4,6,-tetra-O-acetil-\beta-D-galactopiranosil)hexanoil]-L-lisil-N\in-(6-1-tio-2,3,4,6,-tetra-O-acetil-\beta-D-galactopiranosil)hexanoil]-L-Lisina (23). A una solución de bis-trifluoroacetato de L-lisil-L-Lisina (400 mg; 0,8 mmol) en 8 ml de DMF anhidra que contenía 505 \mul de trietilamina (3,6 mmol) se le añadió 6-(1-tio-2,3,4,6-tetra-O-acetil-\beta-D-galactopiranosil)hexanoato de p-nitrofenilo (1,44 g; 2,4 mmol). La mezcla se agitó durante una noche en una atmósfera de argón y se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en una columna de gel de sílice eluida con CHCl_{3}/CH_{3}OH/H_{2}) 90:10:0,5 para dar 463 mg del compuesto del título: rendimiento 35%.
MS: Calculado para C_{73}H_{112}N_{4}O_{32}S_{3} m/z = 1652, encontrado m/z = 1653,6 (M+H)^{+}, m/z = 1677,6 (M+Na)^{+}, m/z = 1693,6 (M+K)+.
Reacción con espermidina bloqueada selectivamente:
N4-[N\alpha-[N\alpha,N\in-Bis(6-(1-tio-2,3,4,6-tetra-O-acetil-\beta-D-galactopiranosil)hexanoil]-L-lisil-N\in-(6-1-tio-2,3,4,6-tetra-O-acetil-\beta-D-galactopiranosil)hexanoil]-L-lisil]-N1,N8-bis-BOC-espermidina. (24).
El compuesto 23 (132 mg; 80 \mumol) se activó por esterificación con N-hidroxisuccinimida (11 mg, 96 \mumol) en presencia de DCC (20 mg; 97 \mumol) en 5 ml de cloruro de metileno anhidro. Después de 4 horas de agitación a temperatura ambiente en una atmósfera de argón, el precipitado de urea se retiró por filtración y el filtrado se evaporó al vacío. El residuo seco se redisolvió en 3 ml de acetonitrilo y se añadió gota a gota a una solución de clorhidrato de N1, N8-bis(t-butoxicarbonil espermidina) (30 mg; 80 \mummol) en 3 ml de acetonitrilo que contenía 14 \mul de trietilamina (100 \mul). La mezcla se agitó adicionalmente durante 48 horas a temperatura ambiente en una atmósfera de argón, y se evaporó al vacío hasta que se obtuvo un residuo que se purificó en una columna de gel de sílice eluida con CHCl_{3}/CH_{3}OH/H_{2}O 90:10:1 para producir 71 mg del compuesto del título; rendimiento 45%.
Desprotección: síntesis de N4-[N\alpha-[N\alpha,N\in-Bis(6-(1-tio-\beta-D-galactopiranosil)hexanoil]-L-lisil-N\in-(6-(1-tio-\beta-D-galactopiranosil)hexanoil]-L-lisil]espermidina (25). El compuesto 24 (71 mg; 36 \mumol) se desprotegió como se ha descrito previamente para el compuesto 11. Los grupos protectores BOC se retiraron del enlazador de espermidina por tratamiento con 5 ml de TFA durante 30 minutos y los grupos protectores acetilo se retiraron de los grupos de cabeza de galactosilo por tratamiento durante una noche con una mezcla de CH_{3}OH/NEt_{3}/H_{2}O 5:4:1. La sal bis-trifluoroacetato del derivado de espermidina se convirtió en la amina libre pasando una solución acuosa de la sal a través de una columna BIO-RAD AG 1X2 (OH^{-}) pequeña. Las fracciones positivas para los carbohidratos y las aminas se reunieron y se liofilizaron. Se obtuvieron 36 mg del compuesto 25; rendimiento 79%.
Unión de acridina: Síntesis de N4-[N\alpha-[N\alpha,N\in-Bis(6-(1-tio-\beta-D-galactopiranosil)hexanoil]-L-lisil-N\in-(6-1-tio-\beta-D-galactopiranosil)hexanoil]-L-lisil]-N1,N8-bis-acridina espermidina. (26) ("Gal_{3}-Lys_{2}-bA").
Se disolvieron compuesto 25 (36 mg; 28,5 \mumol) y 18 mg de 9-fenoxiacridina en 3 g de fenol a 80ºC y la solución se agitó adicionalmente durante 2 h a 80ºC en una atmósfera de argón. La mezcla después se enfrió a aproximadamente 40ºC y se vertió en 15 ml de éter para precipitar las aminoacridinas. El precipitado amarillo se recogió por filtración en un papel de filtro y se redisolvió en 4 ml de una mezcla de butanol/metanol 3:1. Esta solución después se condensó por evaporación hasta aproximadamente 1 ml y el derivado de bis-acridina se aisló por cromatografía en un gel de sílice 6:2:1:2. Se obtuvieron 34 mg del compuesto del título; rendimiento 21%; MS: Calculado para C_{81}H_{117}N_{9}O_{20}S_{3} m/z = 1631, encontrado m/z = 1632,8 (M+H)^{+}, m/z = 1654,8 (M+Na)^{+}.
Ejemplo 7 Ensayo de transfección usando secuencias de localización nuclear
Se añadieron 5 \mul de tampón TE que contenía una pequeña cantidad de un plásmido radioyodado de 5Kb (CMV-\betaGal) y 50 \mul de agua que contenían 8 nmoles del conjugado de péptido de localización nuclear-bis-acridina del ejemplo 2-C, a 80 \mug de pCLUC4 (123 neq. pb) en solución en 45 \mul de tampón TE (pH 8). La relación entre el plásmido y el conjugado de péptido fue de 1:300. Después de 1 hora en reposo a temperatura ambiente, se añadieron 100 \mul de tampón Tris-Cl (pH 9) al complejo y la solución resultante se mezcló con 12 \mumoles de lípidos (relación molar DOPE/CHEMS 2:1) disueltos en 600 \mul de éter para la preparación de liposomas sensibles al pH.
Las vesículas que contenían los complejos de ADN-péptido se separaron del material no encapsulado por flotación de los liposomas a través de un gradiente de Ficoll. La eficacia de encapsulación (20% \pm 4%) se determinó por dispersión de luz dinámica (Coulter N4, Coultronics).
Las células se transfectaron con 4 \mul de plásmido encapsulado en liposomas (100 \mul de la solución de liposomas) durante 5 horas a 37ºC y la actividad luciferasa se contó después de 48 horas en un bioluminómetro. La tabla 4 muestra las unidades de luz medida/mg de proteína celular en función del contenido de liposomas. Los valores son las medias de tres determinaciones.
TABLA 4
Contenido de Liposomas
complejo de plásmido solo complejo de plásmido WTcys-bA plásmido-SNL-bA
(0,32 \pm 0,02) 10^{6} (0,82 \pm 0,36) 10^{6} (1,36 \pm 0,28) 10^{6}
Control positivo: Lipofectin™ = (1,4 \pm 0,2) 10^{8}.
Si admitimos que los liposomas sensibles al pH liberan su contenido en el citoplasma de la célula hospedadora, el plásmido desnudo debe poder atravesar el núcleo.
Si excluimos que los conjugados de péptido-bis-acridina protegen al ADN de la degradación, el aumento de transfección observado debe ser el resultado de una mayor entrada en el núcleo. El aumento de la transfección de 4-5 veces coincide con los resultados publicados (Kaneda et al., supra que usan proteínas que se unen al ADN para aumentar la entrada del ADN en el núcleo. Tanto el péptido SNL como el péptido WTcys aumentan la expresión y son una técnica conveniente para dirigir el ADN al interior del núcleo.
Ejemplo 8 Síntesis de polietilenglicol-bis acridina
La síntesis de bis-acridina espermidina acoplada a PEG sigue la química convencional e implica las siguientes etapas:
R'O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-H- - - - -Agente de activación- ->
R'O(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-R*- - - - -bis-acridina- - - - ->
R'O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-R-Bis acridina donde R' = H o CH_{3} y R* = grupo de activación y n = 10-250, preferiblemente 20-60.
Hay muchos métodos para preparar moléculas de monometoxi-PEG activadas o moléculas de PEG activadas. D. Larwood y F. Szoka, J Labelled Comp & Radiopharm (1984) 21:603-614 han descrito un método preferido. Se preparó polietilenglicol 1900 carbonil-imidazol metil éter poniendo 530 mg (0,28 mmol) de PEG 1900 monometil éter seco en 2 ml de cloruro de metileno seco y añadiendo 78 mg (0,46 mmol) de carbonildiimidazol y 10 mg (0,11 mmol) de imidazol (sal de sodio). Después de agitar durante una noche, se añadieron 6 ml de cloruro de metileno seco, la mezcla se extrajo con 3,75 ml de agua y después se secó con sulfato sódico anhidro. Después de la filtración, se retiró el disolvente con un rendimiento cuantitativo. Como alternativa, el disolvente se retiró y el aceite resultante se recristalizó en cloroformo/éter dietílico a -20ºC. Los cristales blancos de carbamato de imidazol resultantes se filtraron a través de un embudo enfriado, se aclararon con una pequeña cantidad de éter dietílico y se usaron inmediatamente.
El carbamato de imidazol (0,1 mM) se añadió a una concentración 0,125 mM de N,N'-bis-(9-acridinil)-4-aza-1,8-diaminooctano ("bis acridina-espermidina", preparado como se describe por P. Nielsen, Eur. J. Biochem. 122:283-289, 1992) disuelto en fenol y la reacción se procesó a 80ºC en una atmósfera de argón durante 2 horas. La mezcla se llevó a sequedad y el producto amarillo se lavó con etanol frío y después con éter dietílico. El PEG se acopló a través de un enlace carbamato a la amina secundaria de la bis-acridina espermidina para formar la monometoxi PEG-bis acridina espermidina, que soluble en agua.
De una forma similar, el PEG no bloqueado (peso molecular 6000) se activó como se ha indicado anteriormente para formar el bis-imidazol carbamato PEG. El bis-imidazol carbamato PEG se hizo reaccionar con un exceso de 2,5 veces de bis-acridina espermidina para formar el complejo bis(bis-acridina espermidina)-PEG 6000.
En la patente de Estados Unidos 5.013.556 de Woodle et al. se han descrito diversos tipos de activadores para PEG y monometoxi PEG. Estos métodos pueden usarse para generar PEG reactivos que puedan unirse a la molécula de bis-acridina por medio de una diversidad de químicas. Por ejemplo, un sulfhidrilo que contiene monometoxi-PEG puede unirse a la bis-acridina que contiene maleimida del ejemplo 2-B.
Ejemplo 9 Enmascaramiento de ADN con PEG-bis-acridina
Las moléculas de PEG pueden usarse para enmascarar la superficie del ADN y permitir que el ADN circule durante un período más prolongado. Se mezcla ADN plasmídico radioyodado con monometoxi-PEG-1900-bis-acridina espermidina, como se sintetizó en el ejemplo 8, en una relación de 20 pb de ADN por una molécula de PEG, durante 30 minutos a temperatura ambiente. En cada grupo de 12 ratones se inyecta a través de la vena de la cola una alícuota del complejo, 5 \mug de ADN en 0,2 ml de PBS. Los ratones se sacrifican a diversos períodos después de la inyección. Se extraen la sangre y otros órganos y se determina la radiactividad asociada con cada órgano. El ADN que no se ha complejado con la monometoxi-PEG-bis-acridina-espermidina se inyecta en un segundo grupo de ratones, denominados ratones de control. La evidencia que demuestra que después de 10 minutos, en la sangre de los ratones de control permanece un 15% del ADN plasmídico radiactivo mientras que en el grupo de monometoxi PEG-bis acridina espermidina ADN permanecen en la circulación niveles significativamente mayores del complejo de plásmido radiomarcado-PEG, indica un efecto de enmascaramiento pronunciado de la molécula de ADN por la PEG bis acridina espermidina.
Ejemplo 10 Síntesis de un reactivo de enmascaramiento de lecitina acil amina
La síntesis de lípidos de enmascaramiento de polinucleótidos se realiza por medio de la química convencional, tal como se describe en C. Pidgeon et al., Anal Biochem (1989) 176:36-47.
1. ácido 1,12-dodecanodicarboxílico + DCC
- - - THF, 25ºC - - - - ->
anhídrido de ácido dodecanodicarboxílico (anhídrido cíclico)
2. monoacil lisolecitina + anhídrido cíclico
- - - - - CHCl_{3}, DMAP, 25ºC 48 h - - - - ->
Lecitina - COOH
3. Lecitina-COOH + carbonildiimidazol
- - - - CHCl_{3}, 25ºC, 2 h - - ->
Lecitina imidazolida
4. Lecitina imidazolida + reactivo de amina
- - - - CHCl_{3}, 25ºC, 24 h - - ->
lecitina catiónica
La reacción final del reactivo de amina con la lecitina imidazolida se realiza inmediatamente después de la formación de la lectina imidazolida. La lecitina imidazolida (0,1 mM) se añade a una solución de la amina (0,7 mM) en cloroformo. En la memoria descriptiva se indican aminas adecuadas para este acoplamiento.
Después de dos horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se añade a un volumen de dos veces de agua/metanol y el pH se ajusta a 10. La amina unida a la lecitina se extrae en la fase orgánica. La fase orgánica después se lava con cloruro sódico 0,1 M y la fase orgánica se lleva a sequedad. La acil amina lecitina resultante se usa para enmascarar la superficie del polinucleótido. Pueden usarse diversas moléculas de lisolecitina para preparar la lecitina-COOH, incluyendo dodecilo, miristoílo, palmitoílo, oleílo o fitanilo, o estearilo. La lecitina puede substituirse por otros grupos de cabeza tales como etanolamina o ácido fosfatídico si se protegen convenientemente en las etapas de activación y se desprotegen al final de la reacción.
Ejemplo 11 Enmascaramiento de ADN con lecitina acil amina
La lecitina acil amina del ejemplo 10 puede añadirse a ADN desde una solución de etanol en una relación de una carga positiva por cada grupo fosfato del ADN. La molécula puede usarse para enmascarar la superficie del ADN y permitir que el ADN circule durante un período más prolongado. Se inyecta una alícuota del complejo, 5 \mug de ADN en 0,2 ml de PBS, a través de la vena de la cola en cada grupo de 12 ratones. Los ratones se sacrifican a diversos períodos después de la inyección. Se extraen la sangre y otros órganos y se determina la radiactividad asociada con cada órgano. El ADN que no se ha complejado con la lecitina acil amida se inyecta en un segundo grupo de ratones, denominados ratones de control. La evidencia que demuestra que después de 10 minutos, en los ratones de control permanece en la sangre el 15% del ADN plasmídico radiactivo, mientras que en el grupo de monometoxi PEG-bis acridina espermidina ADN permanecen en la circulación niveles significativamente mayores del complejo de plásmido radiomarcado-PEG, indica un efecto de enmascaramiento pronunciado de la molécula de ADN por la lecitina acil amina.

Claims (27)

1. Una composición para presentar un polinucleótido a un componente subcelular de una célula eucariota, comprendiendo dicha composición el polinucleótido asociado con un componente de permeabilización de la membrana capaz de transportar el polinucleótido a través de la membrana citoplásmica de dicha célula eucariota, donde dicho componente de permeabilización de la membrana es un péptido catiónico anfipático.
2. La composición de la reivindicación 1, donde dicho péptido es un péptido cíclico.
3. La composición de la reivindicación 2, donde dicho péptido cíclico se selecciona entre el grupo compuesto por gramicidina S y tirocidinas.
4. La composición de la reivindicación 3, donde dicho péptido cíclico es gramicidina S.
5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un fosfolípido.
6. La composición de la reivindicación 5, donde dicho fosfolípido es una fosfatidiletanolamina.
7. La composición de la reivindicación 6, donde dicha fosfatidiletanolamina es dioleoil fosfatidiletanolamina.
8. La composición de la reivindicación 5, donde dicho fosfolípido está en forma de liposomas.
9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además un policatión.
10. La composición de la reivindicación 9, donde dicho policatión es una poliamina.
11. La composición de la reivindicación 10, donde dicho poliamina se selecciona entre el grupo compuesto por espermina, espermidina, 3,3'-diamino-bispropilamina, iminobis(N,N)-dimetilpropilamina, iminobis(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina, y dendrímeros catiónicos.
12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para presentar un polinucleótido a un componente subcelular de una célula eucariota que comprende el polinucleótido asociado con un componente de reconocimiento celular capaz de reconocer dicha célula eucariota.
13. La composición de la reivindicación 12, donde dicho componente de reconocimiento celular comprende un ligando para un receptor de la superficie celular en dicha célula eucariota, acoplándose dicho ligando a un resto de asociación al ADN.
14. La composición de la reivindicación 13, donde dicho resto de asociación al ADN es un agente intercalador.
15. La composición de la reivindicación 13, donde dicho resto de asociación al ADN es un agente de unión a los surcos mayoritarios o minoritarios.
16. La composición de la reivindicación 14, donde dicho agente intercalador tiene la fórmula
Ar_{1}---NH(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{C=O}{\uelm{\para}{\uelm{\hskip-0.2cm(CH _{2} ) _{p} }{\uelm{\para}{Z}}}}}}
---(CH_{2})_{m}---NH---Ar_{2}
en la que
Z es un enlace;
cada uno de n y m es independientemente un número entero de 1 a 20, y p es un número entero de 0 a 20; y
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y N-metil-2,7-diazapirenio, y derivados de los mismos.
17. La composición de la reivindicación 16, donde dicho agente intercalador se acopla a una pluralidad de ligandos.
18. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para presentar un polinucleótido a un componente subcelular de una célula eucariota, que comprende el polinucleótido asociado con un componente de localización subcelular capaz de suministrar el polinucleótido desde el citoplasma de dicha célula eucariota a un componente subcelular de dicha célula eucariota.
19. La composición de la reivindicación 18, donde dicho componente subcelular es el núcleo, y dicho componente de localización subcelular es un componente de localización nuclear.
20. La composición de la reivindicación 19, donde dicho componente de localización nuclear comprende una secuencia de localización nuclear acoplada a un resto de asociación al ADN.
21. La composición de la reivindicación 20, donde dicho resto de asociación al ADN es un agente intercalador.
22. La composición de la reivindicación 21, donde dicho agente intercalador tiene la fórmula
Ar_{1}---NH(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{C=O}{\uelm{\para}{\uelm{\hskip-0.2cm(CH _{2} ) _{p} }{\uelm{\para}{Z}}}}}}
---(CH_{2})_{m}---NH---Ar_{2}
en la que
Z es un enlace;
cada uno de n y m es independientemente un número entero de 1 a 20, y p es un número entero de 0 a 20; y
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por bromuro de etidio, acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y N-metil-2,7-diazapirenio y derivados de los mismos.
23. Una composición para presentar un polinucleótido a un componente subcelular de una célula eucariota, que comprende
(a)
el polinucleótido;
(b)
un componente de reconocimiento celular capaz de reconocer dicha célula eucariota;
(c)
el componente de permeabilización de la membrana de la reivindicación 1; y
(d)
un componente de localización nuclear capaz de suministrar el polinucleótido desde el citoplasma de dicha célula eucariota a un componente subcelular de dicha célula eucariota.
24. La composición de la reivindicación 23, que comprende además:
(e)
un componente de enmascaramiento capaz de aumentar la vida media en circulación del polinucleótido.
25. La composición de la reivindicación 24, donde dicho componente de enmascaramiento es polietilenglicol (PEG) unido covalentemente a un resto de asociación al ADN.
26. La composición de la reivindicación 24, donde uno o más de los componentes de reconocimiento celular, el componente de permeabilización de la membrana, el componente de localización subcelular y el componente de enmascaramiento son capaces de disociarse del polinucleótido.
27. La composición de la reivindicación 1, donde dicho componente de permeabilización de la membrana es GALA.
ES93909508T 1992-04-03 1993-04-05 Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico. Expired - Lifetime ES2221920T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86487692A 1992-04-03 1992-04-03
US864876 1992-04-03
US91366992A 1992-07-14 1992-07-14
US913669 1992-07-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2221920T3 true ES2221920T3 (es) 2005-01-16

Family

ID=27127858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES93909508T Expired - Lifetime ES2221920T3 (es) 1992-04-03 1993-04-05 Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico.

Country Status (11)

Country Link
US (3) US6300317B1 (es)
EP (2) EP1236473A3 (es)
JP (4) JP4074658B2 (es)
AT (1) ATE260679T1 (es)
AU (1) AU682308C (es)
CA (1) CA2133323C (es)
DE (1) DE69333434T2 (es)
DK (1) DK0636028T3 (es)
ES (1) ES2221920T3 (es)
PT (1) PT636028E (es)
WO (1) WO1993019768A1 (es)

Families Citing this family (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5795870A (en) * 1991-12-13 1998-08-18 Trustees Of Princeton University Compositions and methods for cell transformation
JP3785187B2 (ja) * 1993-07-14 2006-06-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系
US5674908A (en) * 1993-12-20 1997-10-07 Life Technologies, Inc. Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids
US6995008B1 (en) 1994-03-07 2006-02-07 Merck & Co., Inc. Coordinate in vivo gene expression
US5651981A (en) * 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
WO1995034647A1 (en) * 1994-06-13 1995-12-21 Vanderbilt University Compositions for and methods of enhancing delivery of nucleic acids to cells
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US6630455B1 (en) 1995-01-13 2003-10-07 Vanderbilt University Methods for inducing mucosal immune responses
US6008202A (en) 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
FR2730637B1 (fr) * 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
EA001616B1 (ru) 1995-02-28 2001-06-25 Зе Риджентс Оф Зи Юнивесити Оф Кэлифоньэ Способ лечения болезни сердца, способ лечения недостаточности периферических сосудов и способ ограничения доставки и экспрессии трансгенной конструкции в определенном органе или структуре
US6752987B1 (en) 1995-02-28 2004-06-22 The Regents Of The University Of California Adenovirus encoding human adenylylcyclase (AC) VI
AU5122796A (en) * 1995-03-31 1996-10-16 Drug Delivery System Institute, Ltd. Amidite derivatives and oligonucleotide derivatives
AU728176B2 (en) * 1995-05-04 2001-01-04 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US8071737B2 (en) 1995-05-04 2011-12-06 Glead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
EP0874910A4 (en) * 1995-06-07 1999-04-21 Life Technologies Inc ENHANCED CATIONIC LIPID TRANSFECTION BY PEPTIDES
US20030069173A1 (en) 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
EP0831922A2 (en) * 1995-06-08 1998-04-01 Therexsys Limited Improved pharmaceutical compositions for gene therapy
US7011976B1 (en) 1997-03-03 2006-03-14 Calydon, Inc. Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof
US6676935B2 (en) 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
US6254862B1 (en) * 1997-03-03 2001-07-03 Calydon, Inc. Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof
US6392069B2 (en) 1996-01-08 2002-05-21 Canji, Inc. Compositions for enhancing delivery of nucleic acids to cells
US7002027B1 (en) 1996-01-08 2006-02-21 Canji, Inc. Compositions and methods for therapeutic use
DE19605175A1 (de) 1996-02-13 1997-08-14 Sourovoi Andrej Dr Lipidverbindungen und deren Verwendung
RS50101B (sr) 1996-02-24 2009-01-22 Boehringer Ingelheim International Gmbh., Farmaceutski preparati za imunomodulaciju
US6140305A (en) 1996-04-04 2000-10-31 Bio-Rad Laboratories, Inc. Hereditary hemochromatosis gene products
US7026116B1 (en) 1996-04-04 2006-04-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Polymorphisms in the region of the human hemochromatosis gene
US6444806B1 (en) * 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
WO1997040679A1 (en) 1996-05-01 1997-11-06 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods for delivering compounds into a cell
US6849399B1 (en) 1996-05-23 2005-02-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for diagnosis and treatment of iron misregulation diseases
GB9623051D0 (en) * 1996-11-06 1997-01-08 Schacht Etienne H Delivery of DNA to target cells in biological systems
ES2392246T3 (es) * 1996-11-12 2012-12-07 The Regents Of The University Of California Preparación de formulaciones estables de complejos de lípido-ácido nucleico para el suministro eficaz in vivo
FR2755976B1 (fr) * 1996-11-15 1999-01-15 Idm Immuno Designed Molecules Nouveaux complexes d'acides nucleiques et de polymere substitue par des residus entrainant la destabilisation des membranes cellulaires
US6074850A (en) * 1996-11-15 2000-06-13 Canji, Inc. Retinoblastoma fusion polypeptides
WO1998021228A1 (en) 1996-11-15 1998-05-22 Canji, Inc. Tissue specific expression of retinoblastoma protein
US6514987B1 (en) * 1997-01-06 2003-02-04 Cerus Corporation Frangible compounds for pathogen inactivation
US6034072A (en) * 1997-02-10 2000-03-07 Genemedicine, Inc. IL-2 gene expression and delivery systems and uses
US5948878A (en) * 1997-04-15 1999-09-07 Burgess; Stephen W. Cationic polymers for nucleic acid transfection and bioactive agent delivery
AU8589998A (en) 1997-07-24 1999-02-16 Valentis, Inc. Ghrh expression system and methods of use
AUPP373698A0 (en) * 1998-05-27 1998-06-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Molecular coatings
US6300319B1 (en) * 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
WO2000009086A2 (en) 1998-08-14 2000-02-24 Valentis, Inc. Protected one-vial formulation for nucleic acid molecules, methods of making the same by in-line mixing, and related products and methods
US6693087B1 (en) 1998-08-20 2004-02-17 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding POMP91A protein of Chlamydia
WO2000011181A1 (en) 1998-08-20 2000-03-02 Connaught Laboratories Limited NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING INCLUSION MEMBRANE PROTEIN C OF $i(CHLAMYDIA)
US6686339B1 (en) 1998-08-20 2004-02-03 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia
SE9803099D0 (sv) * 1998-09-13 1998-09-13 Karolinska Innovations Ab Nucleic acid transfer
US5952232A (en) * 1998-09-17 1999-09-14 Rothman; James Edward Expandible microparticle intracellular delivery system
FR2785293B1 (fr) 1998-10-30 2002-07-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Acides nucleiques et polypeptides specifiques des souches pathogenes du genre neisseria
NZ512244A (en) 1998-11-12 2003-12-19 Invitrogen Corp Polycationic transfection reagents for introducing anions into a cell
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
EP1141364A1 (de) 1999-01-08 2001-10-10 Amaxa GmbH Ausnutzung zelleigener transportsysteme zum transfer von nukleinsäuren durch die kernhülle
EP1046394A3 (en) * 1999-04-19 2001-10-10 ImaRx Pharmaceutical Corp. Novel compositions useful for delivering compounds into a cell
US6852334B1 (en) * 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
US8541548B2 (en) * 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
US20080281041A1 (en) * 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
CA2390716A1 (en) * 1999-09-24 2001-04-05 Alan D. King Process for enhancing electric field-mediated delivery of biological materials into cells
US20040082509A1 (en) 1999-10-12 2004-04-29 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US8183339B1 (en) 1999-10-12 2012-05-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
CA2388337C (en) 1999-10-22 2013-01-08 Aventis Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
EP1255822A2 (en) 1999-12-27 2002-11-13 The Regents Of The University Of California Modified adenylylcyclase type vi useful in gene therapy for congestive heart failure
US20030212022A1 (en) * 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
DE10016881B4 (de) 2000-04-05 2006-06-01 Qiagen Gmbh Gezielte Transfektion von Zellen mittels biotinyliertem Dendrimer
US7189705B2 (en) * 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
EP1792995A3 (en) 2000-05-08 2007-06-13 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia secretory locus orf and uses thereof
DK1282702T3 (da) 2000-05-10 2007-04-02 Sanofi Pasteur Ltd Immunogene polypeptider, som er kodet af KAGE-minigener, og anvendelser deraf
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US7033597B2 (en) * 2000-10-13 2006-04-25 Université de Lausanne Intracellular delivery of biological effectors
FR2825364A1 (fr) * 2001-05-29 2002-12-06 Genethon Iii Vecteur peptiidique pour le transfert d'acides nucleiques dans des cellules eucaryotes
AR037038A1 (es) 2001-10-26 2004-10-20 Baylor College Medicine Una composicion y metodo para alterar la masa corporal magra y las propiedades oseas en un sujeto
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
AU2002357143B2 (en) 2001-12-11 2009-07-30 Advisys, Inc. Growth hormone releasing hormone supplementation for treating chronically ill subjects
DE60335608D1 (de) * 2002-02-27 2011-02-17 Pharmain Corp Zusammensetzungen zur abgabe von therapeutika und anderen materialien und verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
US7635463B2 (en) 2002-02-27 2009-12-22 Pharmain Corporation Compositions for delivery of therapeutics and other materials
US8138383B2 (en) * 2002-03-11 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Membrane active heteropolymers
US8008355B2 (en) * 2002-03-11 2011-08-30 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(vinyl ether) polymers
EP1356820A1 (en) 2002-04-26 2003-10-29 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) DNA vaccine combined with an inducer of tumor cell apoptosis
GB0228525D0 (en) * 2002-12-06 2003-01-15 Univ Cambridge Tech Polymers and their use
US7709047B2 (en) * 2003-01-24 2010-05-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target activated microtransfer
US7695752B2 (en) 2003-01-24 2010-04-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target activated microtransfer
CA2557737C (en) 2003-03-12 2014-08-05 Advisys, Inc. Insulin-like growth factor (igf-i) plasmid-mediated supplementation for therapeutic applications
TW200424214A (en) * 2003-04-21 2004-11-16 Advisys Inc Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
WO2005112977A2 (en) * 2004-04-23 2005-12-01 Pharmain, Ltd. Compositions for treatment with glucagon-like peptide, and methods of making and using the same
DK1766077T3 (da) 2004-06-21 2012-07-16 Univ Leland Stanford Junior Differentielt udtrykte gener og veje i bipolar forstyrrelse og/eller alvorlig depressiv forstyrrelse
JPWO2006030788A1 (ja) * 2004-09-14 2008-05-15 信一郎 礒部 インターカレータ及びそれを用いた遺伝子検出方法
JP5541861B2 (ja) 2005-04-29 2014-07-09 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 超分岐ポリマーおよびそれらの適用
US8080517B2 (en) * 2005-09-12 2011-12-20 Xigen Sa Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2007031098A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
US7957466B2 (en) * 2005-09-16 2011-06-07 Sony Corporation Adaptive area of influence filter for moving object boundaries
AU2006315562C1 (en) 2005-11-12 2013-10-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for treating depression using NCAM peptide mimetics
KR101529318B1 (ko) 2005-12-19 2015-06-16 파마인 코포레이션 치료제를 전달하기 위한 소수성 코어 담체 조성물, 이조성물의 제조 방법 및 그 조성물의 이용 방법
GB0606190D0 (en) 2006-03-28 2006-05-10 Isis Innovation Construct
CN101500548A (zh) * 2006-08-18 2009-08-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US8017109B2 (en) * 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
WO2008034123A2 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric conjugates containing positively-charged moieties
US7960336B2 (en) 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
US8563527B2 (en) 2007-08-20 2013-10-22 Pharmain Corporation Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
GB0719367D0 (en) 2007-10-03 2007-11-14 Procarta Biosystems Ltd Transcription factor decoys, compositions and methods
US20090176892A1 (en) 2008-01-09 2009-07-09 Pharmain Corporation Soluble Hydrophobic Core Carrier Compositions for Delivery of Therapeutic Agents, Methods of Making and Using the Same
WO2009143865A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2009143864A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory digestive diseases
WO2010072228A1 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Xigen S.A. Novel transporter constructs and transporter cargo conjugate molecules
CA2756070C (en) 2009-03-27 2019-08-20 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Kanamycin antisense nucleic acid for the treatment of cancer
GB0918679D0 (en) 2009-10-23 2009-12-09 Iqur Ltd Influenza vaccine
GB0918782D0 (en) 2009-10-26 2009-12-09 St Georges Hosp Medical School A protein as an adjuvant for a vaccine
JP5457813B2 (ja) * 2009-12-16 2014-04-02 ルネサスエレクトロニクス株式会社 Ａｄｐｌｌ回路、半導体装置及び携帯情報機器
GB201002413D0 (en) 2010-02-12 2010-03-31 Procarta Biosystems Ltd Nucleic acid complexes
EP2536747B1 (en) 2010-02-19 2017-09-27 Université de Liège A polynucleotide for use in treatment of influenza a virus induced diseases, encoding modified mx protein, said modified mx protein, and a transgenic animal expressing gene encoding modified mx protein
SI2539451T1 (sl) * 2010-02-24 2016-04-29 Arrowhead Research Corporation Sestavki za ciljano dostavo sirna
GB201004475D0 (en) 2010-03-17 2010-05-05 Isis Innovation Gene silencing
GB201005545D0 (en) * 2010-04-01 2010-05-19 Procarta Biosystems Ltd Transcription factor decoys
WO2011160653A1 (en) 2010-06-21 2011-12-29 Xigen S.A. Novel jnk inhibitor molecules
WO2012013249A1 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Université de Liège Dentin matrix protein 1 (dmp1) for use in pharmaceutical compositions
GB201014026D0 (en) 2010-08-20 2010-10-06 Ucl Business Plc Treatment
WO2012048721A1 (en) 2010-10-14 2012-04-19 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory eye diseases
US9849087B2 (en) * 2011-11-08 2017-12-26 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods and compositions for X-ray induced release from pH sensitive liposomes
WO2013091670A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Xigen S.A. Novel jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
CN104271772A (zh) 2012-03-29 2015-01-07 科罗拉多州立大学董事会,公司实体 点击核酸
US20140120116A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The Chinese University Of Hong Kong Treatment of cancer using smad3 inhibitor
EP3004173B1 (en) 2013-06-06 2018-05-30 iQur Limited Single domain antibody display
WO2014206427A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
KR20160023669A (ko) 2013-06-26 2016-03-03 자이겐 인플라메이션 리미티드 다양한 질병의 치료를 위한 jnk 신호 전달 경로의 세포 투과성 펩타이드 억제자의 새로운 용도
WO2015197097A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
EP3169310A1 (en) 2014-07-15 2017-05-24 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
US11352437B2 (en) * 2016-03-15 2022-06-07 Defence Therapeutics Inc. Conjugates enhancing total cellular accumulation
JP2020500020A (ja) 2016-11-14 2020-01-09 ノバルティス アーゲー 融合誘導性タンパク質ｍｉｎｉｏｎに関連する組成物、方法、および治療上の使用
WO2019112965A1 (en) * 2017-12-04 2019-06-13 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for delivery of macromolecules
GB201811382D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Taylor John Hermon Vaccine
US11325978B2 (en) 2018-11-06 2022-05-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for treating beta-globinopathies
IT201900007060A1 (it) 2019-05-21 2020-11-21 St Superiore Di Sanita Cellule tumorali ingegnerizzate e loro usi
IT201900012540A1 (it) 2019-07-22 2021-01-22 Humanitas Mirasole Spa Inibitori di CHI3L1 e loro usi
JP2023546359A (ja) 2020-10-06 2023-11-02 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球療法によるｎｓｃｌｃ患者の治療
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
AU2021401302A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
EP4262827A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
CN116847884B (zh) 2020-12-18 2026-02-13 防御治疗公司 用于改善免疫应答和/或稳定性的共价修饰的抗原
CA3208643A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof
CA3215830A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Rafael CUBAS Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
CA3217745A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 Simon BEAUDOIN Steroid acid-based immunogen enhancers
US20240352456A1 (en) 2021-05-13 2024-10-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Compositions and methods for treating sickle cell diseases
JP2024527961A (ja) 2021-07-28 2024-07-26 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｋｒａｓ阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法によるがん患者の治療
US20230321268A1 (en) 2021-10-18 2023-10-12 Defence Therapeutics Inc. Conjugates enhancing total cellular accumulation
WO2023077015A2 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
WO2023081167A2 (en) 2021-11-02 2023-05-11 The Regents Of The University Of California P-selectin mutants and modulation of integrin-mediated signaling
CA3237410A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Friedrich Graf Finck VON FINCKENSTEIN Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023087103A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Defence Therapeutics Inc. Steroid acid-peptide based cytotoxic compounds
US20250092106A1 (en) 2022-01-25 2025-03-20 The Regents Of The University Of California Vegf mutants and modulation of integrin-mediated signaling
JP2025512401A (ja) 2022-04-15 2025-04-17 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 特定のサイトカインの組み合わせ及び／またはＡＫＴｉ処理を使用したＴＩＬ拡張プロセス
US12233130B2 (en) 2022-12-22 2025-02-25 Defence Therapeutics Inc. Covalently-modified steroid acid-peptides having enhanced stability and/or biological activity
WO2024200831A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Vivadju Pvax14 nucleic acid in combination with all-trans retinoic acid (atra) and a checkpoint inhibitor for the treatment of cancer

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4650909A (en) * 1984-11-28 1987-03-17 Yoakum George H Polyethylene glycol (PEG) reagent
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
AU6408586A (en) * 1985-10-03 1987-04-24 Biotechnology Research Partners Limited Novel lipoprotein-based drug-delivery systems
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
AU5192190A (en) * 1989-02-24 1990-09-26 City Of Hope Heterologous block oligomers
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
WO1991004753A1 (en) * 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
CA2070823C (en) * 1989-12-05 1999-01-12 William H. Ii Frey Neurologic agents for nasal administration to the brain
US5279833A (en) * 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0532525B1 (de) * 1990-05-18 1995-08-16 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Neue protein-polykation-konjugate
DK0587738T3 (da) * 1991-06-05 2000-12-18 Univ Connecticut Destineret levering af gener, som koder for sekretionsproteiner
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
IL112920A (en) * 1994-03-07 2003-04-10 Dow Chemical Co Composition comprising a dendritic polymer complexed with at least one unit of biological response modifier and a process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP0636028A4 (en) 1998-12-09
US5977084A (en) 1999-11-02
CA2133323A1 (en) 1993-10-14
JP3688278B2 (ja) 2005-08-24
PT636028E (pt) 2004-07-30
CA2133323C (en) 2010-10-26
US5955365A (en) 1999-09-21
US6300317B1 (en) 2001-10-09
JP2005110696A (ja) 2005-04-28
EP0636028A1 (en) 1995-02-01
JP3950472B2 (ja) 2007-08-01
AU682308B2 (en) 1997-10-02
AU4027893A (en) 1993-11-08
EP1236473A2 (en) 2002-09-04
JP4074658B2 (ja) 2008-04-09
DE69333434D1 (de) 2004-04-08
WO1993019768A1 (en) 1993-10-14
JP2004000245A (ja) 2004-01-08
JPH07505639A (ja) 1995-06-22
JP2007006899A (ja) 2007-01-18
EP1236473A3 (en) 2003-01-15
EP0636028B1 (en) 2004-03-03
DK0636028T3 (da) 2004-07-12
DE69333434T2 (de) 2005-03-03
AU682308C (en) 2006-08-17
ATE260679T1 (de) 2004-03-15
JP3907662B2 (ja) 2007-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2221920T3 (es) Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico.
ES2211882T3 (es) Sistema de cesion de polinucleotido, automontable que comprende policationes de dendrimeros.
US5990089A (en) Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
Mével et al. DODAG; a versatile new cationic lipid that mediates efficient delivery of pDNA and siRNA
ES2392246T3 (es) Preparación de formulaciones estables de complejos de lípido-ácido nucleico para el suministro eficaz in vivo
US5908777A (en) Lipidic vector for nucleic acid delivery
ES2295018T3 (es) Encapsulacion de complejos bioactivos en liposomas.
US20040241855A1 (en) Cationic peg-lipids and methods of use
ES2226932T3 (es) Lipido cationico neutro destinado a la aportacion de acidos nucleicos y de farmacos.
JP2007521247A (ja) 生体適合性−遺伝子送達剤としての新規カチオン性リポポリマー
Mével et al. Paromomycin and neomycin B derived cationic lipids: synthesis and transfection studies
CN115151278B (zh) 用于核酸疗法的靶向肿瘤的多肽纳米颗粒递送系统
JP2005515990A (ja) 化合物
Sawant et al. Design and synthesis of novel functional lipid-based bioconjugates for drug delivery and other applications
US20040197390A1 (en) Neutral-cationic lipid for systemic delivery of factor VIII gene