ES2222445T3 - Procedimiento para el diagnostico diferencial de la demencia de alzheimer y dispositivo para el mismo. - Google Patents

Abstract

Kit diagnóstico para diagnosticar o llevar a cabo el seguimiento de la evolución de la demencia de Alzheimer, que comprende lo siguiente: por lo menos un anticuerpo monoclonal específico para la glutamina sintetasa monomérica humana asociada al cerebro que presenta un peso aproximado de 44 kDa, en el que dicho anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339 y el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3340.

Description

Procedimiento para el diagnóstico diferencial de la demencia de alzheimer y dispositivo para el mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para diagnosticar la demencia de Alzheimer (AD). La invención se refiere particularmente a un procedimiento para cuantificar la presencia de por lo menos un marcador bioquímico asociado con la demencia de Alzheimer. Más particularmente, la invención se refiere a un inmunoensayo en el lugar de atención al paciente que hace uso de anticuerpos únicos para permitir el diagnóstico diferencial de las formas de demencia tipo Alzheimer frente a las que no son de tipo Alzheimer.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer, también denominada demencia de Alzheimer o AD, es un trastorno neurogenerativo progresivo que causa pérdidas de memoria y un grave deterioro mental. Los médicos diagnosticadores han buscado desde hace mucho tiempo un medio para identificar la AD de manera definitiva durante el tiempo de vida de los pacientes que sufren la demencia, y no tras examen histopatológico del tejido cerebral, el cual es el único medio disponible actualmente para proporcionar un diagnóstico definitivo de AD. La AD es la forma más común de demencia, representando más de la mitad de todas las demencias y afectando a 4 millones de estadounidenses y a casi 15 millones de personas en todo el mundo. La demencia puede iniciarse con una ligera pérdida de memoria y confusión, pero avanza con el tiempo hasta una grave discapacidad intelectual y social. A los 65 años de edad, la prevalencia social de la AD se encuentra comprendida entre el 1 y 2%. Al llegar a los 75 años, se incrementa hasta el 7%, y alcanzados los 85 años es del 18%. La prevalencia de demencia en todos los individuos de más de 65 años es del 8%. De las personas residentes en instituciones, la prevalencia es aproximadamente del 50% a cualquier edad.

El impacto social de esta enfermedad es enorme, debido a la carga sobre los cuidadores, en particular en las últimas etapas de la enfermedad. Los costes económicos sustanciales se relacionan en gran parte con los cuidados de soporte y la admisión en instituciones. La proporción en rápido crecimiento de personas ancianas en la sociedad significa que el número de individuos afectados por AD crecerá espectacularmente, por lo tanto, encontrar un diagnóstico precoz exacto y una cura para la AD se está convirtiendo en una cuestión de gran importancia a nivel mundial.

Cuando se sospecha que un individuo sufre AD, se llevan a cabo varias pruebas recomendadas: (1) mini-examen de estado mental (MMSE): una prueba psicométrica escrita en forma de cuestionario de evaluación funcional (FAQ) con el fin de examinar la escala de autonomía funcional, (2) pruebas de laboratorio: recuento sanguíneo completo, medición de la hormona estimulante de la tiroides, electrolitos séricos, calcio sérico y niveles séricos de glucosa, (3) imágenes neurológicas: comúnmente se utiliza la tomografía computerizada (CT), la cual tiene un papel en la detección de ciertas causas de la demencia, tales como la demencia vascular (VaD), tumor, hidrocefalia con presión normal o hematoma subdural. Sin embargo, la formación de imágenes neurológicas es menos efectiva para distinguir la AD de otras demencias corticales derivadas del envejecimiento normal. En el contexto de la atención primaria, algunos trabajadores sugieren que la CT podría limitarse a casos atípicos, pero otros la recomiendan como técnica rutinaria. La resonancia magnética (MRI) en la actualidad no ofrece ninguna ventaja sobre la CT en la mayoría de casos de demencia.

Aunque el Alzheimer es la forma más común de demencia, representando por lo menos el 60% de los casos, los procedimientos diagnósticos para determinar la causa exacta de la demencia, entre más de 80 especies diferentes, es como mínimo difícil. Además, las pruebas que se llevan a cabo actualmente son inadecuadas para diferenciar la AD de otros tipos de demencia.

En comparación con otras enfermedades, el campo de la demencia plantea cuestiones referentes al valor del diagnóstico, debido a que hoy en día no existe cura o terapia efectiva. En la demencia, al igual que en otras ramas de la medicina, la seguridad de un diagnóstico tiene un impacto importante sobre la gestión del paciente. Aunque la AD en la actualidad no tiene cura, sí hay disponibles tratamientos sintomáticos y los primeros fármacos (inhibidores de la acetilcolinesterasa) para la recuperación temporal de la cognición y el comportamiento en la actualidad poseen autorización de la U.S. Food and Drug Administration. Otros fármacos se encuentran en diferentes etapas de ensayo clínico: (1) fármacos para evitar el deterioro en la AD: DESFERRIOXAMINA, ALCAR, fármacos antiinflamatorios, antioxidantes, estrógeno, (2) factores neurotróficos: NGF, (3) vacunas: el interesante trabajo reciente de Schenk et al. (Nature 400:173-177, 1999) plantea esperanzas de encontrar una vacuna para la AD.

La especificidad de las diversas terapias requiere de esta manera sofisticadas metodologías de diagnóstico con alto grado de sensibilidad para la AD para asegurar su éxito.

En la actualidad hay disponibles una multitud de pruebas que ayudan en el diagnóstico de la AD. Sin embargo, el único diagnóstico real existente se lleva a cabo mediante el examen patológico postmórtem de tejido cerebral conjuntamente con el historial clínico de la demencia. Dicho diagnóstico se basa en la presencia en el tejido cerebral de marañas neurofibrilares y de placas neuríticas (seniles) que se han correlacionado con la demencia clínica. Las placas neuríticas están constituidas de una proteína normalmente inofensiva llamada amiloide beta. Antes de que las neuronas empiecen a morir y se desarrollen síntomas, se forman depósitos de placa entre las neuronas inicialmente en el curso de la enfermedad. Las marañas neurofibrilares son agregados interneuronales compuestos de filamentos helicoidales normales y apareados y presumiblemente consisten de varias proteínas diferentes. La estructura interna de soporte de las neuronas cerebrales depende del funcionamiento normal de un proteína llamada tau. En la enfermedad de Alzheimer, los filamentos de proteína tau experimentan alteraciones que provocan que se retuerzan. La identificación neurohistopatológica y recuento de las placas neuríticas y marañas neurofibrilares requiere la tinción y examen microscópico de varias secciones del cerebro. Sin embargo, los resultados de esta metodología pueden variar ampliamente, requiere mucho tiempo y muchas horas de trabajo.

Dada la capacidad de las terapias farmacológicas tanto actuales como futuras para prevenir y/o revertir la aparición y/o progreso de la demencia de Alzheimer, un diagnóstico precoz de la AD ayudará a gestionar mejor el cuidado del paciente. Existen muchos casos en los que la demencia no AD podría confundirse con la demencia AD. Tales ejemplos incluyen los pequeños infartos no detectados que interrumpen temporalmente el flujo sanguíneo al cerebro. Los pacientes clínicamente deprimidos o aquellos con enfermedad de Parkinson también pueden experimentar lapsos de memoria. Muchas personas mayores toman una diversidad de medicamentos que podrían, como efecto secundario, solos o en combinación, perjudicar su capacidad de llevar a cabo tareas cognitivas.

De esta manera, si pudiesen proporcionarse técnicas diagnósticas para la diferenciación temprana de la AD, los médicos podrían mejorar su capacidad para prescribir una intervención terapéutica apropiada en una etapa precoz de la patogénesis de esta enfermedad.

Se conocen diversos marcadores bioquímicos de la AD y se han descrito técnicas analíticas para la determinación de tales marcadores. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "marcador", "marcador bioquímico" o "proteína marcadora" se refiere a cualquier enzima, proteína, polipéptido, péptido, forma isomérica de los mismos, fragmentos inmunológicamente detectables de los mismos u otra molécula que sea liberada en el cerebro durante el curso de la patogénesis de la AD. Tales marcadores incluyen, pero sin limitación, cualquier proteína única o isoforma de la misma que esté particularmente asociada con el cerebro.

La glutamina sintetasa (GS) se reconoce como un enzima específico de los astrocitos que está implicado en la regulación del metabolismo del amonio y del glutamato y que se sobreexpresa tras el daño cerebral (Norenberg y Martinex-Hernández, Brain Res. 161:303, 1979). Se han dado a conocer algunos estudios sobre el papel clínico de la glutamina sintetasa: Gunnersen y Haley (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11949, 1992) encontraron proteína GS monomérica en 38 de 39 muestras de líquido cerebroespinal (CSF) de pacientes con AD, Tumani et al. (Arch. Neurol. 56(10):1241, 1999) describen que la concentración de GS en CSF lumbar de pacientes con AD se encuentra significativamente incrementado pero de manera no específica (es decir, también se encuentra incrementado en VaD, esquizofrenia y ALS). En la página 1244, columna izquierda, Tumani afirma que no se encontró GS en el suero.

Las proteínas gamma-enolasa neuroespecíficas (NSE\gamma\gamma) y S100B, abundantes en el cerebro, también son marcadores útiles para evaluar el grado de daño cerebral: NSE\gamma\gamma para el daño neuronal y S100B para el daño a los astrocitos. Se han examinado las concentraciones de las proteínas NSE y S100B en regiones cerebrocorticales mediante ensayo de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA). Los niveles de estas proteínas en el córtex frontal de pacientes de AD se descubrió que se encontraban significativamente elevados (Kato et al., J. Mol. Neurosci. 3(2):95, 1991). Se ha relacionado íntimamente la sobreexpresión de S100B por los astrocitos activados con las placas neuríticas de \beta-amiloide de la AD (Sheng et al., J. Neurosci. Res. 39:398, 1994; Mrak et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55:273, 1996).

Existen varios usos potenciales diferentes para los biomarcadores en la evaluación de la AD y cada uso podría implicar un marcador o combinación de marcadores diferente. Tales usos podrían incluir, pero sin limitación, la utilización de un marcador para distinguir la AD de otras causas de demencia; la distinción entre demencia y los efectos no patológicos del envejecimiento; el seguimiento de la evolución de la enfermedad tras hacerse aparentes sus síntomas clínicos; la utilización de una variable de sustitución para realizar un seguimiento de la eficacia de las terapias futuras para la AD, el aislamiento de marcadores útiles como factores de evaluación de riesgo de AD y la identificación de los cambios biológicos más tempranos en el cerebro y otros cambios que se dan a medida que progresa la enfermedad. Idealmente, sería preferible aislar un solo marcador para satisfacer todos los requisitos con un elevado grado de sensibilidad y especificidad, sin embargo éste podría ser un objetivo no realista. Cualquier marcador individual debe evaluarse respecto a su sensibilidad, especificidad, fiabilidad y validez en el tipo de situación clínica al que se pretende aplicar. Un marcador que sea malo para distinguir la AD de otras causas de demencia podría ser, aún de esta manera, un marcador excelente para llevar a cabo un seguimiento de la progresión del proceso de la enfermedad o de la respuesta a la terapia.

Con respecto a los dispositivos diagnósticos, la evaluación clínica y utilización de pruebas en el lugar de atención al paciente que hacen uso de marcadores biológicos son herramientas valiosas para evaluar el riesgo, para seguir la evolución de la enfermedad y para guiar las intervenciones terapéuticas. Las ventajas que derivan de la utilización de marcadores biológicos como herramientas diagnósticas incluyen el fortalecimiento de la certidumbre en el diagnóstico clínico, la capacidad de distinguir la AD de otras causas de demencia y la cuantificación de la gravedad de la enfermedad y su tasa de evolución. Además, las pruebas con marcadores biológicos deberían ser rápidas, no invasivas, sencillas de llevar a cabo y económicas.

En la técnica se carece de un método y dispositivo no invasivos que sean efectivos para diagnosticar definitivamente la demencia de Alzheimer en pacientes vivos. Además, existe una gran necesidad de un método definitivo para evaluar el riesgo de desarrollar AD.

Descripción de la técnica anterior

La patente U.S. nº 5.445.937 de Haley da a conocer un método para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, así como un medio para el diagnóstico y diferenciación de otras enfermedades. Esto se lleva a cabo utilizando un marcador bioquímico específico de la enfermedad, la glutamina sintetasa (GS) y su sonda de fotoafinidad respectiva o anticuerpo marcado específico para GS, en el sitio de unión de GS. La patente '937 se centra en examinar el líquido cerebroespinal (CSF) con el fin de detectar la presencia de una proteína de unión a nucleótido con sonda de fotoafinidad o anticuerpo marcado, y correlaciona el nivel que resulta con la presencia de AD. Haley da a conocer una diversidad de técnicas de inmunoensayo para llevar a cabo dicho método. Aunque Haley plantea hipótesis sobre la utilidad futura de los métodos diagnósticos que hacen uso de sangre como muestra y sugiere además que podría desarrollarse un inmunoensayo con anticuerpos monoclonales y/o policlonales, sin embargo no pone en práctica ninguna de ambas posibilidades. De esta manera, la patente '937 indicada anteriormente de Haley solamente es útil en dar a conocer una prueba diagnóstica que hace uso de líquido cerebroespinal. La obtención de una muestra de líquido cerebroespinal implica la utilización de técnicas invasivas bastante incómodas para el paciente y requiere un periodo de tiempo largo. Además, los únicos anticuerpos policlonales y/o monoclonales sugeridos por Haley son aquellos con especificidad con el GS de cerebro ovino y no con una forma recombinante humana de GS, tal como se da a conocer inmediatamente en el presente documento.

En la patente U.S. nº 5.508.167, Roses et al. describen métodos para diagnosticar AD que implican la detección de una isoforma de apolipoproteína E tipo 4 (ApoE4) o ADN que codifica ApoE4. Los métodos pueden hacer uso de muestras de sangre y se analizan mediante un ensayo inmunoquímico. La muestra de sangre opcionalmente se combina con un agente reductor con el fin de reducir el enlace disulfuro en los residuos cisteína a los grupos de sulfhidrilo reactivo correspondientes. Roses et al. además describen un kit para detectar la isoforma de ApoE4. La prueba se basa en las diferencias en las secuencias de aminoácidos de las tres isoformas principales de ApoE. La prueba no es específica para la GS humana ni tiene sensibilidad para diagnosticar diferencialmente la demencia tipo AD frente a la de otros tipos.

Tumani et al. (Arch. Neurol. 56:1241-1246, 1999) examinan los niveles de GS en el CSF y el suero con el fin de determinar si GS es un marcador bioquímico útil en el diagnóstico de la AD. El análisis se lleva a cabo mediante una ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal marcado con biotina dirigido contra la GS de cerebro ovino. Los intervalos normales de concentración de GS dados a conocer se sitúan en 4 pg/ml en CSF humano y 36 pg/ml en suero humano. Las muestras de CSF en pacientes con AD están elevados, con un nivel medio de concentración de GS de 20 \pm 12 pg/ml, siendo de 13 \pm 13 pg/ml en pacientes con ALS y de una media elevada de 13 \pm 7 pg/ml en pacientes con demencia vascular (VaD). Los pacientes con demencia vascular y con ALS muestran un incremento ligeramente más pequeño. En los pacientes con AD se miden niveles medios en el suero de 111 \pm 53 pg/ml. Sin embargo, los pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y con demencia vascular también presentan niveles medios elevados de 116 \pm 62 pg/ml y 72 \pm 59 pg/ml en el suero, respectivamente. De esta manera, no pudo obtenerse un diagnóstico definitivo para la demencia AD o diagnóstico diferencial entre demencia AD frente a otros tipos a partir de estos ensayos.

Gunnersen y Haley (Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11949-11953, 1992) proporcionan evidencia de que se detecta GS en el CSF de pacientes con AD pero no en el CSF de sujetos sanos de control ni en controles con otras enfermedades. Las otras enfermedades bajo consideración eran la epilepsia, ALS y la enfermedad de Parkinson. Los pacientes con ALS o enfermedad de Pick además de AD no dan resultados positivos, mientras que los pacientes con ALS no muestran resultados positivos, indicando que GS es específico de la AD. Al igual que en otras publicaciones, se utilizan anticuerpos cultivados contra la GS no humana para la detección de la misma.

Generalmente, la mayoría de los artículos científicos tienden a centrarse en el péptido, \beta-amiloide, debido a que se ha postulado como un determinante importante de la AD. Esto se ve apoyado por la observación de que ciertas formas de mutación familiar de la AD resultan en la sobreproducción de \beta-amiloide, en particular la forma más larga (1-42), que se agrega más fácilmente que la forma más corta. Hensley et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3270-3274, 1994) examinan la neurotoxicidad del péptido \beta-amiloide basándose en que genera radicales libres en su estado de agregación. Sometieron a ensayo varios fragmentos sintéticos del péptido para determinar la neurotoxicidad resultante. A partir de los hechos de que el oxígeno parece ser necesario para la generación de radicales y de que los enzimas glutamato sintetasa y creatin quinasa son biomarcadores sensibles a la oxidación, se utilizó la inactivación de dichos enzimas como indicador del ataque activo sobre las moléculas biológicas por estos agregados fragmentados de \beta-amiloide.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para diagnosticar la demencia de Alzheimer (AD), particularmente a un método para diagnosticar y diferenciar la demencia de Alzheimer de otras formas de demencia mediante un ensayo de la presencia de marcadores bioquímicos específicos de la enfermedad de Alzheimer en líquidos corporales, en particular en sangre, productos sanguíneos, orina, saliva y similares. La invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para cuantificar la presencia de por lo menos un marcador bioquímico asociado con la demencia de Alzheimer. Más particularmente, la invención se refiere a un inmunoensayo en el lugar de atención al paciente que hace uso de anticuerpos únicos con el fin de permitir el diagnóstico diferencial de la demencia tipo Alzheimer frente a otros tipos no Alzheimer de demencia.

De acuerdo con la invención se proporciona un nuevo kit diagnóstico para diagnosticar o llevar a cabo el seguimiento de la evolución de la demencia de Alzheimer que comprende lo siguiente:

por lo menos un anticuerpo monoclonal específico para glutamina sintetasa monomérica humana asociada al cerebro que presenta un peso de aproximadamente 44 kDa, en el que dicho anticuerpo se se-
lecciona de entre el grupo que consiste en el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339 y el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC con el número de entrada PTA-3340.

También se proporciona un método para diagnosticar o seguir la evolución de la demencia de Alzheimer que comprende:

poner en contacto una muestra de sangre, producto sanguíneo o líquido cerebroespinal de un paciente del que se sospecha que sufre de demencia de Alzheimer, con un anticuerpo monoclonal, en el que dicho anticuerpo es específico de glutamina sintetasa monomérica humana asociada a cerebro que presenta un peso de aproximadamente 44 kDa y se selecciona de entre el grupo que consiste en el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339 y el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3340;

detectar la unión específica del anticuerpo a la muestra;

en la que la detección de un nivel elevado de dicha glutamina sintetasa en la muestra del paciente respecto a las muestras de control indica un diagnóstico de demencia de Alzheimer, o en la que el grado de elevación de dicha glutamina sintetasa en la muestra del paciente respecto a las muestras de control se correlaciona con la evolución de la demencia de Alzheimer en el paciente.

También se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339 y un anticuerpo monoclonal aislado producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3340 y los clones mismos.

La presente invención se refiere a los métodos y sistema ELISA para diagnosticar, subtipar y llevar a cabo el seguimiento de la enfermedad de Alzheimer. La invención se basa en el descubrimiento de que la proteína GS es liberada desde el cerebro y puede ser detectada en los líquidos corporales fuera del mismo.

Se describen la generación y purificación de GS recombinante humana. Dichas proteínas GS pueden utilizarse para generar anticuerpos monoclonales o policlonales que, a su vez, pueden utilizarse en inmunoensayos en los que entran en una inmu-
norreacción que puede seguirse y/o cuantificarse con el fin de detectar la proteína GS circulante en los individuos que se sospecha que sufren AD. Alternativamente, la proteína GS misma puede utilizarse en inmunoensayos para detectar autoanticuerpos circulantes en tales individuos. La incidencia de demencia de Alzheimer se caracteriza por el reconocimiento de niveles de un marcador bioquímico particular en líquido corporal, correlacionándose dichos niveles con la manifestación de los síntomas de la demencia de Alzheimer según se cuantifican mediante las pruebas MMSE. Como prueba de evaluación de riesgo, el reconocimiento de niveles de tales marcadores que son indicativos del desarrollo de demencia de Alzheimer aumenta adicionalmente la capacidad diagnóstica de la que dispone el médico experto.

La invención instantánea proporciona un método relativamente no invasivo y altamente sensible para el diagnóstico definitivo de la enfermedad de Alzheimer.

La invención también proporciona un método que incluye el análisis de por lo menos un líquido corporal de un paciente con el fin de determinar la presencia de por lo menos un marcador indicativo de AD y no de otro tipo de demencia.

La invención instantánea también proporciona anticuerpos específicos de proteínas relacionadas con neuronas, tal como se identifican mediante el método de la presente invención.

El inmunoensayo es efectivo para reconocer proteínas específicas de neuronas en uno o más líquidos corporales humanos. La invención instantánea utiliza un anticuerpo monoclonal purificado específico de la glutamina sintetasa humana. El kit de ensayo para el diagnóstico de la AD es adecuado como una prueba no invasiva en el lugar de atención del paciente que puede llevarse a cabo utilizando una muestra que comprenda sangre o cualquier producto sanguíneo.

Otros objetos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes de la descripción siguiente tomada conjuntamente con las figuras adjuntas, en las que se describen, mediante ilustración y ejemplo, determinadas realizaciones de la presente invención. Las figuras constituyen una parte de la presente especificación e incluyen realizaciones ejemplares de la presente invención e ilustran diversos objetos y características de la misma.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una comparación de valores estadísticamente significativos de GS, NSE y S100 en sangre de una cohorte de pacientes evaluados clínicamente como sufriendo una forma de demencia de Alzheimer;

La figura 2 es una comparación de valores estadísticamente significativos de GS, NSE y S100 en sangre de una cohorte de pacientes evaluados clínicamente como sufriendo de una forma de demencia no Alzheimer;

La figura 3 muestra gráficos de caja y bigotes de GS respecto a la edad en individuos sanos.

Descripción detallada de la invención

El marcador que se analiza de acuerdo con el método de la invención se libera en la circulación y puede estar presente en la sangre o en cualquier producto sanguíneo, por ejemplo plasma, suero, sangre lisada, por ejemplo mediante tratamiento con tampón hipotónico o detergentes, y diluciones y preparaciones de los mismos, y otros líquidos corporales, por ejemplo CSF, saliva, orina, linfa y similares. En otra realización preferente, puede medirse la concentración de los marcadores en el CSF.

Los términos "superior a normal" y "superior al nivel de corte" se utilizan para referirse a un nivel de un marcador mayor que el nivel del marcador observado en individuos normales que no están experimentando un suceso cerebral, es decir, degeneración cerebral o atrofia. Para algunos marcadores, pueden estar presentes niveles muy bajos de manera normal en la sangre del individuo. Para otros marcadores analizados de acuerdo con la invención, pueden estar presentes niveles detectables de manera normal en sangre. Por lo tanto, dichos términos indican un nivel significativamente superior al nivel normal observado en individuos sanos. El término "significativamente" o "estadísticamente significativo" se refiere a significancia estadística y generalmente significa dos desviaciones estándar (SD) o más por encima de la concentración normal del marcador. El método de ensayo mediante el que se lleva a cabo el análisis de la proteína marcadora debe ser suficientemente sensible para detectar el nivel de marcador en el intervalo de interés de concentraciones y también debe ser altamente específico.

Se han comparado el marcador y dos otros marcadores con el fin de evaluar su valor como herramienta diagnóstica, son proteínas liberadas por células específicas en el cerebro al quedar dañadas durante un suceso cerebral. Estos marcadores, por ejemplo proteínas, pueden estar en su forma nativa o pueden ser fragmentos inmunológicamente detectables de las proteínas, que resultan, por ejemplo, de la degradación proteolítica. Por "inmunológicamente detectable" se significa que los fragmentos de marcador contienen un epítopo que es específicamente reconocido por reactivos anticuerpo utilizados en el ensayo.

Los marcadores son específicos de tipo celular. El enzima enolasa cataliza la interconversión de 2-fosfoglicerato y fosfoenolpiruvato en la ruta glicolítica. El enzima tiene tres isoproteínas, cada una el producto de un gen diferente. Los loci génicos se han denominado ENO1, ENO2 y ENO3. El producto génico de ENO1 es la enolasa no neuronal (NNE o \alpha), ampliamente distribuida en diversos tejidos de mamífero. El producto génico de ENO2 es la enolasa muscular específica (MSE o \beta), localizada principalmente en el músculo cardíaco y en el estriado, mientras que el producto del gen ENO3 es la enolasa específica neuronal (NSE o \gamma), que se encuentra principalmente en las neuronas y células neuroendocrinas. Los enzimas nativos se encuentran en las isoformas homo o heterodiméricas compuestas de tres subunidades inmunológicamente distintas, \alpha, \beta y \gamma. Cada subunidad (\alpha, \beta y \gamma) presenta un peso molecular de 16 kDa, 44 kDa y 46 kDa, respectivamente.

Las isoformas \alpha\gamma y \gamma\gamma de la enolasa, denominadas enolasas específicas neuronales (NSE), presentan cada una un peso molecular de \sim80.000 Daltons. Se ha demostrado que la concentración de NSE en el CSF y en la sangre se incrementa tras el daño cerebral (por ejemplo infarto, traumatismo craneoencefálico) y la liberación de NSE desde el tejido cerebral dañado hacia el CSF y la circulación sanguínea refleja el grado de daño al tejido cerebral. El NSE tiene una vida media biológica de \sim48 horas.

La proteína S100 es una proteína citoplásmica ácida de unión al calcio que se encuentra predominantemente en la materia gris del cerebro, principalmente en las células astrogliales y de Schwann. La proteína existe en varias isoformas homodiméricas o heterodiméricas consistentes en dos subunidades inmunológicamente distintas, A1 (PM 10.400 Daltons) y B (PM 10.500 Daltons). En el sistema nervioso central (SNC), el homodímero S100 B-B (21.000 Daltons) y el heterodímero S100 A1-B (20.900 Daltons) constituyen más del 95% del total de S100 (Isobe et al., Biochem. Int. 6:419, 1983; Zimmer et al., Brain. Res. Bull. 37:417, 1995). Debido a que un elevado porcentaje de S100B se encuentra en el cerebro, varios estudios han examinado esta proteína como marcador de daño cerebral. La vida media biológica del S100B es de 113 minutos (Usui et al., Clin. Chem. 35:1942, 1989). Las mediciones repetidas de los niveles séricos de S100B son útiles para seguir el curso del daño neurológico.

La glutamina sintetasa (GS) es un enzima ubicuo que cataliza la conversión ATP-dependiente del glutamato a glutamina utilizando amonio como fuente de nitrógeno. La GS está presente a concentraciones elevadas en el hígado, músculo, riñón y cerebro (De Groot et al., Biochim. Biophys. Acta 908:231, 1987). La GS en el cerebro humano es un enzima específico de los astrocitos implicado en la protección de las neuronas a través de la conversión de los potencialmente neurotóxicos glutamato y amonia en glutamina.

El sitio de la GS con catión divalente hace que sea extremadamente sensible a la oxidación.

Las regiones densas en placas seniles del cerebro de pacientes con AD representan ambientes de elevado estrés oxidativo y dicha proteína en el cerebro de dichos pacientes se encuentra más oxidada que en el de los controles. Se ha propuesto que los microglia reactivos, extensamente presentes en las regiones de placas seniles, son una fuente de oxirradicales en el cerebro.

Se conocen tres tipos distintos de GS: GSI, GSII y GSIII. Se han encontrado genes para GSI y GSIII en bacterias. El gen de la GS humana pertenece al tipo GSII (Brown et al., J. Mol. Evol. 38:566, 1994). La GS en el cerebro se cree que existe como estructura octamérica con un peso molecular de 360.000-400.000 Daltons (Tumani et al., J. Immunol. Meth. 188:155, 1995). Sin embargo, en la circulación sanguínea la proteína se cree que se encuentra en la forma monomérica, con PM 44 \pm 1 kDa (Boksha et al., J. Neurochem. 75:2574, 2000). Se han dado a conocer concentraciones elevadas de GS en CSF lumbar en pacientes con AD (Gunnersen y Haley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11949, 1992; Tumani et al., Arch. Neurol. 56:1241, 1999).

Los mecanismos exactos que conducen a una concentración incrementada de GS en el CSF siguen siendo desconocidos. Se ha propuesto que resulta de la sobreexpresión de la GS en astrocitos reactivos y su posterior liberación en el espacio extracelular (Tumani et al., Arch. Neurol. 56:1241, 1999).

En una realización adicionalmente contemplada de la invención, pueden tomarse muestras de líquido corporal de un paciente en un punto del tiempo o en diferentes puntos del tiempo para el análisis continuo. Típicamente, se toma una primera muestra de un paciente al presentarse los posibles síntomas de AD y se analizan de acuerdo con la invención. Posteriormente, algún tiempo después de la presentación de los síntomas, por ejemplo unos 3 a 6 meses después de la primera presentación, se toma una segunda muestras y se analiza de acuerdo con la invención. Los datos pueden utilizarse para diagnosticar la AD, descartarla, distinguir entre ésta y otras demencias no AD.

Se midió el nivel de cualquiera de los tres marcadores específicos de interés, o de todos ellos, encontrado en el líquido corporal del paciente a partir de una sola muestra, aunque pueden medirse uno o más marcadores individuales en una sola muestra. Por "muestra" se significa un líquido corporal, tal como sangre o CSF. Todos los marcadores pueden medirse con un dispositivo de ensayo o utilizando un dispositivo de ensayo separado para cada marcador, para lo que pueden utilizarse alícuotas de la misma muestra. Es preferente medir cada uno de los marcadores hasta tres en la misma muestra única, con independencia de si los análisis se llevan a cabo con un solo dispositivo analítico o con dispositivos separados, de manera que el nivel de cada marcador presente simultáneamente en una misma muestra pueda utilizarse para proporcionar datos útiles.

La presencia de cada marcador se determina utilizando anticuerpos específicos para cada uno de ellos y detectando la unión específica de cada anticuerpo a su marcador respectivo. Puede utilizarse cualquier ensayo directo o indirecto, incluyendo aquellos disponibles comercialmente, con el fin de determinar el nivel de cada uno de los marcadores específicos medidos de acuerdo con la invención. Los ensayos pueden ser competitivos, de tipo sándwich, y el marcaje puede seleccionarse de entre el grupo de marcajes bien conocidos, tales como el radioinmunoensayo, el inmunoensayo fluorescente o quimioluminiscente, o la tecnología inmunoPCR. No es necesaria en el presente documento una discusión extensiva de las técnicas conocidas de inmunoensayo debido a que éstas son conocidas por los expertos en la materia. Ver Takahashi et al. (Clin. Chem. 45(8):1307, 1999) para el ensayo S100B.

Aunque sin limitación, el método de inmunoensayo utilizado en los ejemplos instantáneos comprendía un ELISA de doble anticuerpo o de tipo sándwich para medir el nivel de las proteínas marcadores en la muestra. De acuerdo con este método, uno de los anticuerpos es un anticuerpo "de captura" que se inmoviliza sobre una fase sólida y el otro es un anticuerpo "de detección" que se marca con, por ejemplo, un enzima. El anticuerpo de detección se une a la proteína marcadora, que está unida al anticuerpo de captura, formando una estructura de tipo sándwich. Para cada ensayo de los tres marcadores se utilizan estándares de proteína marcadora para preparar una curva estándar o de calibración de absorbancia frente a concentración de proteína marcadora. Este método es importante debido a que, además de las ventajas de la realización preferente, los marcadores añadidos, NSE y S100B, ayudan a indicar la existencia de des-
trucción en curso de neuronas y permiten llevar a cabo un seguimiento de sucesos agudos en el cerebro, respectivamente.

Los métodos de ensayo utilizados para medir las proteínas marcadores deben mostrar suficiente sensibilidad para poder medir cada proteína en un intervalo de concentraciones desde los valores normales presentes en las personas sanas hasta los niveles elevados presentes en las personas enfermas, es decir, 2 SD por encima de lo normal (= valor de corte) y más. Para la proteína GS, el valor de corte = 0,022 ng/ml, NSE = 8,34 ng/ml y S100B = 0,02 ng/ml.

El ensayo puede llevarse a cabo en diversos formatos, incluyendo un formato de placa de microtitración que es preferente para llevar a cabo los ensayos en un modo por lotes. Los ensayos también pueden llevarse a cabo en analizadores automatizados bien conocidos en la técnica. Otro formato de ensayo que puede utilizarse de acuerdo con la invención es una prueba manual rápida que pueda administrarse en el lugar de atención al paciente en cualquier sitio. Típicamente tales dispositivos proporcionarán un resultado por encima o por debajo de un valor de corte, es decir, un resultado semicuantitativo.

Expresión de rhGS y aislamiento de anticuerpos monoclonales

Con el fin de aislar un anticuerpo con propiedades específicas de unión a la glutamina sintetasa humana (GS humana recombinante o rhGS), se adquirió ADNc de la rhGS de la ATCC. La longitud completa del marco de lectura abierto (ORF) de la rhGS se obtuvo por PCR y subclonado en pET28a (NdeI/ShoI). El constructo incluía una etiqueta polihistidina en los extremos N-terminales del ORF de la rhGS y ninguna secuencia adicional en los extremos C-terminales. La proteína se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) mediante las técnicas descritas por Listrom et al. (Biochem. J. 328:159, 1997). La preparación de extracto celular crudo, así como la solubilización de los productos insolubles de expresión, consistente en el tratamiento con urea/álcali, se llevó a cabo siguiendo el método de Moreno et al. (J. Comp. Neurol. 350:260, 1994). La purificación por afinidad se llevó a cabo mediante cromatografía Ni-NTA siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Preparación de anticuerpos monoclonales

Se produjeron los anticuerpos monoclonales de la presente invención mediante el método de fusión celular mediada por polietilenglicol (PEG).

Preparación de inmunocitos

Se inmunizaron ratones Balb/c, una cepa con haplotipo H-2^{d} procedente de Charles River, Canada, St. Constant, Québec, Canada, hembras, de 7 a 9 semanas de edad, con rhGS emulsionado en un volumen igual de adyuvante completo de Freund (FCA) para la primera inyección y después en adyuvante incompleto de Freund (FIA) para las inyecciones posteriores a intervalos de 2 a 4 semanas con 25 a 100 \mug de GS. Los ratones inmunizados se sacrificaron 3 a 4 días después de la inmunización final, sea intravenosa y/o intraperitonealmente, en tampón salino tamponado con fosfato (PBS), pH 7,4.

Preparación de hibridoma

Se fusionaron las células de bazo procedentes de los ratones inmunizados con proteína GS y las células Sp2/0 en presencia de 42% de PEG de acuerdo con el método descrito por Fuller, S.A., Takahashi, M. y Hurrell, J.G.R. (Preparation of Monoclonal Antibodies. In: Susubel, F., Brent, B., Kingston, R. et al., editores. Current Protocols in Molecular Biology. Nueva York: Greene Publishing Associates, 1987: Unidad 11). Las células fusionadas resultantes se suspendieron en medio de selección HAT y se cultivaron en cuatro placas de 96 pocillos precultivadas con células alimentadores, células del exudado peritoneal (PEC), tal como describen Fuller et al. (ver la referencia anteriormente indicada).

Exploración de los hibridomas secretores de anticuerpo GS-específico

La exploración de los cultivos de hibridoma se llevó a cabo mediante dos métodos. (1) ELISA de fase sólida-exploración ELISA-1: se añadieron sobrenadantes de cultivo confluyente de hibridoma a placas de microtitración de 96 pocillos (marca comercial NUNC MaxiSorp, GIBCO BRL) recubiertas con rhGS a 2 \mug/ml en tampón carbonato 100 mM, pH 9,6. Los sitios de unión excedentes se bloquearon con albúmina de suero bovina (BSA) en PBS, pH 7,4. Tras lavar la placa con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (marca comercial WB), se incubaron sobrenadantes de cultivos de 100 \muL que contenían los anticuerpos monoclonales con el antígeno inmovilizado durante 1 hora a 37ºC. Después del lavado, se añadió IgG de cabra antiratón conjugada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Lab., Inc., West
Grove, Pa.) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) en un agitador orbital. Tras lavar, se añadió solución de sustrato TMB (Sigma). Tras incubar durante 5 minutos a RT en la oscuridad, se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 1 M y se leyó la densidad óptica a 450_{nm}. Los cultivos seleccionados positivos se sometieron a clonado mediante el método de dilución limitante, tal como describen Fuller et al. (ver la referencia anteriormente indicada). Se repitieron los procedimientos de exploración ELISA y de clonado hasta obtener la estabilidad y clonalidad de los cultivos. (2) exploración ELISA-2: en el segundo método, se capturaron los anticuerpos monoclonales en el sobrenadante del cultivo de hibridoma a través del IgG_{Fc} de cabra antiratón (Jackson ImmunoResearch) inmovilizado sobre la fase sólida de la placa ELISA. Tras incubación de 1 hora a 37ºC, se lavó la placa como en el método-1. Después, se añadió a cada pocillo, GS biotinilado (preparado utilizando el kit de marcado con biotina de Boehringer Mannheim siguiendo las recomendaciones del fabricante) diluido 1/2000 en PBS con BSA al 0,5%. Tras 30 minutos de incubación a RT bajo agitación, se lavó la placa y se añadió estreptavidina conjugada con HRP (Boehringer Mannheim) a 1/10.000 y se incubó durante 30 minutos a RT. Tras el lavado, se añadió solución de sustrato TMB y se leyó la reacción como en el método-1.

Para revelar un ensayo ELISA, se seleccionaron dos clones denominados 1G3 y 5G4. Dichos clones se depositaron, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110- 2209 el 25 de abril de 2001 bajo el número de acceso PTA-3339 y PTA-3340, respectivamente. De acuerdo con 37 CFR 1.808, los depositarios aseguran que todas las res-
tricciones impuestas sobre la disponibilidad para el público de los materiales depositados se eliminarán irrevocablemente al concederse la patente.

Producción de anticuerpos monoclonales

Se produjo el anticuerpo monoclonal GS-específico utilizando ascites. Las ascites se produjeron en ratones Balb/c tratados previamente con 0,25 ml de pristano mediante inyección intraperitoneal de 1 a 5 x 10^{6} células de hibridoma en 0,25 a 0,5 ml de PBS, pH 7,4. Diez a 14 días después, se recogieron los ascites. Se purificó el anticuerpo monoclonal procedente de los ascites en columna de afinidad (proteína G, marca comercial AVIDAL) utilizando procedimientos conocidos. El anticuerpo monoclonal purificado se utilizó para estudios inmunoquímicos.

Producción y purificación de anticuerpos policlonales

Se inmunizaron cabras con inyecciones bisemanales intramusculares y/o subcutáneas de 250 a 500 \mug de rhGS purificado emulsionado en adyuvante de Freund. Se llevó a cabo el seguimiento de la concentración de manera rutinaria mediante la exploración del suero mediante ELISA de tipo medio sándwich. Posteriormente, se purificaron los anticuerpos policlonales (PAb) específicos para la GS a partir del suero de cabra mediante purificación por afinidad utilizando sefarosa-4B activada con bromuro de cianógeno (marca comercial Pharmacia), acoplada a GS recombinante. Los anticuerpos policlonales purificados se dializaron contra PBS 10 mM, pH 7,4, se concentraron mediante ultrafiltración y se almacenaron a

\hbox{-20ºC.}

Ensayos diagnósticos y detección de GS en muestras biológicas

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar reactivos para su utilización en ensayos diagnósticos para detectar GS en individuos que sufren enfermedad de Alzheimer.

En un modo de la presente realización, puede utilizarse GS de la presente invención como antígenos en inmunoensayos para detectar qué individuos sufren AD. La proteína GS de la presente invención pueden utilizarse en cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, radioinmunoensayo, ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos de tipo "sándwich", reacciones de la precipitina, ensayo de inmunodifusión en gel, ensayo de aglutinación, inmunoensayos de fluorescencia, inmunoensayos con proteína A o con proteína G y ensayos de inmunoelectroforesis. De acuerdo con la presente invención, son útiles los anticuerpos monoclonales o policlonales producidos contra la GS humana en un inmunoensayo de muestras de sangre o productos sanguíneos, tales como suero, plasma o similar, líquido espinal u otro líquido corporal, por ejemplo saliva, orina, linfa y similar, con el fin de diagnosticar AD en pacientes. La demencia de Alzheimer puede determinarse utilizando un solo anticuerpo monoclonal o una pluralidad de anticuerpos monoclonales, solos o en combinación, específicos contra la glutamina sintetasa humana.

Los anticuerpos pueden utilizarse en cualquier tipo de inmunoensayo. Esto incluye el ensayo de tipo sándwich de dos sitios y el inmunoensayo de un solo sitio del tipo no competitivo, así como en los ensayos tradicionales de unión competitiva.

Es particularmente preferente, por su facilidad y simplicidad de detección y su naturaleza cuantitativa, el ensayo de tipo sándwich o de doble anticuerpo, del cual existen un número de variaciones, todas las cuales se encuentran contempladas por la presente invención. Por ejemplo, en un ensayo típico de tipo sándwich, se inmoviliza anticuerpo sin marcar sobre una fase sólida, por ejemplo sobre una placa de microtitración, y se añade la muestra a ensayar. Tras cierto periodo de incubación para permitir la formación de complejos anticuerpo-antígeno, se añade un segundo anticuerpo, marcado con una molécula señalizadora capaz de inducir una señal detectable, y se continúa la incubación permitiendo suficiente tiempo para la unión con el antígeno en un sitio diferente, resultando en la formación de un complejo de anticuerpo marcado con un anticuerpo-antígeno. La presencia del antígeno se determina por observación de una señal que puede ser cuantificada por comparación con muestras de control que contienen cantidades conocidas de antígeno.

Estudios clínicos

Se llevó a cabo un estudio observacional prospectivo piloto en tres clínicas geriátricas. El estudio evaluó 38 pacientes en la clínica, en la que se llevaron a cabo mini-exámenes de estado mental (MMSE) y otras pruebas de rutina. Del total de pacientes, se diagnosticó AD en 24 y otros tipos de demencia no AD en 14. La edad media de los pacientes que presentaban demencia de Alzheimer era de aproximadamente 79 años, con un intervalo de edades comprendido entre 54 y 87 años. Se registró la puntuación del mini-examen de estado mental (MMSE). Se obtuvieron muestras de sangre, y tras la coagulación, las centrifugaron las muestras y se congelaron alícuotas de suero y se almacenaron a 70ºC hasta la realización de los análisis para S100, NSE y GS.

Los sujetos de control incluían 153 donantes de sangre sanos (intervalo de edades comprendido entre 18 y 87 años: mediana de edad 71,03 \pm 9,95 años) de los que se utilizaron las muestras de sangre para determinar los valores de referencia para las concentraciones de S100, NSE y GS.

Se reconoce la enfermedad de Alzheimer como un proceso patológico progresivo que se inicia en el neocórtex basal, se extiende al hipocampo y finalmente invade todas las áreas corticales. No se da remisión durante el curso de la enfermedad (Braak y Braak, Neurobiol. Aging 18(4):351, 1997). Esto indica que la AD es un proceso patológico y no simplemente una consecuencia del envejecimiento. La patogénesis de la AD implica la continua y progresiva destrucción de neuronas. Aunque la NSE no presenta especificidad para la AD, este marcador contribuye como indicador de la destrucción continuada de neuronas. La utilización del anticuerpo monoclonal que se da a conocer instantáneamente para la GS humana hace posible un ensayo elegante, sensible y específico para la AD cuando se analiza dicha proteína en líquidos corporales no CSF. Esto difiere de otros ensayos de la técnica anterior, en los que los marcadores eran específicos para GS no humana y no podían derivarse datos específicos de los sueros o de cualquier otro líquido corporal que no fuese CSF. S100 no presenta esta sensibilidad pero es un marcador útil para llevar a cabo el seguimiento de sucesos agudos en el cerebro (por ejemplo, TIA, infarto, hipoxia conducente a sucesos isquémicos, etc.), que son sucesos comunes entre individuos de mayor edad, quienes son la población diana de la AD.

Todos los valores de referencia se dan a conocer como media + 2SD. Los valores de referencia para los tres marcadores son: GS = 0,022 ng/ml, NSE = 8,34 ng/ml y S100 = 0,02 ng/ml.

Los niveles de S100 y de NSE se analizaron utilizando un kit de ensayo ELISA SMART S100 y SMART NSE, respectivamente, disponibles en Syn-X Pharma Inc., Mississauga, Ont., CANADA. Para el ensayo de GS, se produjeron anticuerpos reactivos y de calibración (es decir, GS recombinante humana) en Syn-X Pharma y se desarrolló un ensayo ELISA tal como se ha descrito anteriormente.

Los gráficos de caja y bigotes en la figura 3 muestran el análisis de concentraciones séricas de proteína GS en individuos sanos categorizados según edad. De manera interesante, los individuos de entre 60 y 70 años presentaban niveles significativamente más elevados de GS en sangre en comparación con los grupos de edad más jóvenes. Sin embargo, el nivel medio de GS en sangre de los individuos de más de 70 años bajaba a niveles similares a los observados en individuos de entre 20 y 30 años y en individuos de entre 40 y 50 años. Se observó un patrón similar con la proteína S100. Por otra parte, la distribución de edad de las concentraciones séricas de NSE era diferente de la de los otros dos marcadores, observándose concentraciones significativamente más elevadas en el grupo de edad de 14 a 40 años. No se encontró relación entre los niveles séricos de las tres proteínas y el sexo. Sin respaldo teórico, se planteó la hipótesis de que las personas entre 60 y 70 años de edad con niveles elevados de GS (y/o de S100) en efecto ya estaban sufriendo un deterioro cerebral y tales individuos, ya entre 70 y 80 años, se reclasificaban como "pacientes" mientras que las personas restantes, denominadas "sanas", tenían un buen estado de salud y aparecían con niveles bajos de dichas proteínas marcadoras. De esta manera, se concluyó que centrarse en los niveles de GS en el grupo de edad de entre 60 y 70 años era especialmente valioso como diagnóstico en los estudios de evaluación de riesgos.

De las 24 muestras séricas de individuos (MMSE) con AD según los mini- exámenes del estado mental, 20 eran casos leves de AD y 4 eran casos moderados (ver la figura 1). La sensibilidad de los tres marcadores, es decir, GS, NSE y S100B era del 100%, 33% y 8%, respectivamente. El nivel de GS se correlacionaba bien con la gravedad de la AD, es decir, con la puntuación del MMSE, mientras que no se observó una correlación similar en el caso de la NSE. Sin embargo, aunque la sensibilidad de S100 era muy reducida, cuando este marcador presenta niveles elevados, puede constituir una indicación de la destrucción continuada de astrocitos en el cerebro causada por sucesos agudos.

De las 14 muestras de demencia no AD, sólo una muestra mostraba un nivel elevado de ambos GS y S100, mientras que 7 muestras mostraban una concentración de NSE por encima del nivel de corte (figura 2). Esto indica que GS y S100 son marcadores altamente específicos de AD.

Todas las patentes y publicaciones indicadas en la presente especificación son indicativas del nivel de conocimiento de los expertos en la materia con la que se relaciona la invención. Todas las patentes y publicaciones se incorporan en el presente documento por referencia en el mismo grado que si cada publicación individual se indicase específica e individualmente que quedaba incorporada por referencia.

Un experto en la materia apreciará fácilmente que la presente invención se adapta bien a la consecución de los objetivos y obtención de las metas y ventajas indicadas, así como los inherentes a la misma. Los oligonucleótidos, péptidos, polipéptidos, compuestos biológicamente relacionados, métodos, procedimientos y técnicas descritas en el presente documento en la actualidad son representativos de las realizaciones preferentes, se pretende que sean ejemplares de la invención y no son limitativas de la misma. Los expertos en la materia advertirán cambios de la invención y otros usos que se encuentran dentro del espíritu de la misma y quedan definidos por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque se ha descrito la invención en relación a realizaciones específicas preferentes, debe interpretarse que la invención tal como se reivindica no se encuentra indebidamente limitada a tales realizaciones específicas.

Claims (12)

1. Kit diagnóstico para diagnosticar o llevar a cabo el seguimiento de la evolución de la demencia de Alzheimer, que comprende lo siguiente:

por lo menos un anticuerpo monoclonal específico para la glutamina sintetasa monomérica humana asociada al cerebro que presenta un peso aproximado de 44 kDa, en el que dicho anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339 y el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3340.

2. Kit diagnóstico según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo está inmovilizado sobre un soporte sólido y además comprende por lo menos un segundo anticuerpo que está marcado, en el que dicho segundo anticuerpo se une específicamente a dicha glutamina sintetasa monomérica humana asociada al cerebro.

3. Kit diagnóstico según la reivindicación 1, en el que dicho primer anticuerpo es el anticuerpo codificado por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339.

4. Kit diagnóstico según la reivindicación 1, en el que dicho primer anticuerpo es el anticuerpo codificado por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3340.

5. Anticuerpo monoclonal aislado producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de
acceso PTA-3339.

6. Anticuerpo monoclonal aislado producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de
acceso PTA-3340.

7. Clon aislado depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339.

8. Clon aislado depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3340.

9. Método para diagnosticar o llevar a cabo el seguimiento de la evolución de la demencia de Alzheimer, que comprende:

poner en contacto una muestra de sangre, un producto sanguíneo o líquido cerebroespinal de un paciente del que se sospecha que sufre demencia de Alzheimer con un anticuerpo monoclonal, en el que dicho anticuerpo es específico para la glutamina sintetasa monomérica humana asociada al cerebro que presenta un peso aproximado de 44 kDa y se selecciona de entre el grupo que consiste en el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339 y el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3340.

detectar la unión específica del anticuerpo con la muestra;

en la que la detección de un nivel de dicha glutamina sintetasa en la muestra de un paciente elevado en comparación con dicho nivel en las muestras de control indica un diagnóstico de demencia de Alzheimer, o en el que el grado de elevación de dicha glutamina sintetasa en la muestra de un paciente en comparación con el de las muestras de control se correlaciona con la evolución de la demencia de Alzheimer en el paciente.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3339.

11. Método según la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo producido por el clon depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3340.

12. Método según la reivindicación 9, en el que dicha etapa de detección incluye por lo menos un inmunoensayo directo o indirecto seleccionado de entre el grupo que consiste en un ensayo de unión competitiva, un ensayo de unión no competitiva, un radioinmunoensayo, un ensayo de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA), un ensayo tipo sándwich, una reacción de precipitina, un ensayo de inmunodifusión en gel, un ensayo de aglutinación, un inmunoensayo de fluorescencia, un inmunoensayo de quimioluminiscencia, un inmunoensayo inmunoPCR, un inmunoensayo con proteína A o con proteína G y un ensayo de inmunoelectroforesis.