ES2223080T3 - Gases microencapsulados en un polimero y un lipido para utilizacion como agentes de visualizacion. - Google Patents

Abstract

SE HA DESCUBIERTO QUE LA INCORPORACION DE GASES, ESPECIALMENTE GASES FLUORADOS COMO, POR EJEMPLO, PERFLUOROCARBONOS, EN MICROPARTICULAS FORMADAS A PARTIR DE LA COMBINACION DE UN POLIMERO SINTETICO O NATURAL Y DE LIPIDO, AUMENTA SENSIBLEMENTE LA ECOGENICIDAD CON RELACION A LAS PARTICULAS QUE NO INCLUYEN EL LIPIDO. SE PUEDEN INCORPORAR TAMBIEN A LAS MICROPARTICULAS DE COMPUESTOS DISTINTOS DE LOS LIPIDOS QUE SON HIDROFOBICOS Y LIMITAN LA PENETRACION Y/O LA NUEVA TOMA DE AGUA EN LAS MICROPARTICULAS, PARA REALZAR SU ECOGENICIDAD. EN UN MODO DE REALIZACION PREFERIDO, LOS POLIMEROS SON POLIMEROS BIODEGRADABLES SINTETICOS. LAS MICROPARTICULAS SE FABRICAN CON UN DIAMETRO ADECUADO PARA EL TEJIDO OBJETIVADO A EXAMINAR Y PONER EN IMAGEN, POR EJEMPLO, UN DIAMETRO DE 0,5 A 8 MICRAS PARA LA ADMINISTRACION INTRAVASCULAR, Y UN DIAMETRO DE 0,5 A 5 MM PARA LA ADMINISTRACION ORAL PARA LA FORMACION DE IMAGENES DEL TRACTO GASTROINTESTINAL Y OTRAS LUCES. LOS POLIMEROS PREFERIDOS SON LOS ACIDOS POLIHIDROXILADOS COMO, POR EJEMPLO, EL ACIDO POLILACTICO - CO - ACIDO GLICOLICO, COMBINADOS, PREFERENTEMENTE, CON EL POLIETILENO GLICOL O CON OTRAS SUSTANCIAS QUE INHIBEN LA FIJACION POR EL SISTEMA RETICULOENDOTELIAL (RES). LOS LIPIDOS PREFERIDOS SON LOS FOSFOLIPIDOS, PREFERENTEMENTE DIPALMITOILFOSFATIDILCOLINA (DPPC), DISTEAROILFOSFATIDILCOLINA (DSPC), DIARAQUIDOILFOSFATIDILCOLINA (DAPC), DIBEHENOILFOSFATIDILCOLINA (DBPC), DITRICOSANOILFOSFATIDILCOLINA, DILIGNOCEROILFATIDILCOLINA (DLPC), INCORPORADOS SEGUN UNA RELACION DE 0,01 - 30 (LIPIDO EN PESO/POLIMERO EN PESO), CON UNA PREFERENCIA MAYOR DE 0,1 - 10 (LIPIDO EN PESO/POLIMERO EN PESO). SE PUEDEN FABRICAR TAMBIEN UNAS MICROPARTICULAS PARA LA FORMACION DE IMAGENES UTILIZANDO OTROS AGENTES DETECTABLES.

Description

Gases microencapsulados en un polímero y un lípido para utilización como agentes de visualización.

La presente invención se encuentra, de manera general, en el área de los agentes de diagnóstico por imagen, y se dirige, en particular, a los agentes de contraste en microparticulas para la visualización o formación de imágenes por ultrasonidos que llevan lípidos incorporados para mantener la ecogenicidad a lo largo del tiempo.

Cuando se utilizan ultrasonidos para obtener una imagen de los órganos y las estructuras internas de un ser humano o un animal, las ondas de ultrasonidos, ondas de energía del sonido a una frecuencia por encima de la discernible por el oído humano, se reflejan a medida que atraviesan el cuerpo. Los diferentes tipos de tejido corporal reflejan las ondas de ultrasonidos de manera distinta y se detectan las reflexiones producidas por las ondas de ultrasonidos que reflejan las diferentes estructuras internas y se convierten electrónicamente en una imagen visible.

Para algunos estados médicos, es especialmente difícil obtener una imagen útil del órgano o estructura de interés, porque los detalles de la estructura no son discernibles adecuadamente del tejido circundante en una imagen de ultrasonidos producida por la reflexión de ondas de ultrasonidos en ausencia de un agente que aumente el contraste. La detección y la observación de ciertos estados fisiológicos y patológicos se pueden mejorar sustancialmente aumentando el contraste en una imagen de ultrasonidos infundiendo un agente en un órgano u otra estructura de interés. En otros casos, la detección del movimiento del mismo agente que aumenta el contraste es particularmente importante. Por ejemplo, un determinado patrón de flujo sanguíneo que se conoce como resultante de determinadas anormalidades cardiovasculares, sólo se puede discernir infundiendo un agente de contraste en la corriente sanguínea y observando la dinámica del flujo sanguíneo.

Los materiales útiles como agentes de contraste de ultrasonidos funcionan produciendo un efecto en las ondas de ultrasonidos a medida que atraviesan el cuerpo y se reflejan para crear la imagen a partir de la que se realiza un diagnóstico médico. Diferentes tipos de sustancias afectan a las ondas de ultrasonidos de maneras diferentes y en distintos grados. Además, algunos de los efectos causados por los agentes que aumentan el contraste se miden y se observan más fácilmente que otros. Al seleccionar una composición ideal para un agente que aumenta el contraste, se preferiría la sustancia que tuviera el efecto más notable en la onda de ultrasonidos a medida que ésta atraviesa el cuerpo. Además, el efecto en la onda de ultrasonidos debería ser medido fácilmente. En una imagen de ultrasonidos se pueden observar tres efectos principales que aumentan el contraste: retrodispersión, atenuación de la radiación, y diferencial de velocidad del sonido.

Retrodispersión: Cuando una onda de ultrasonidos que atraviesa el cuerpo encuentra una estructura, tal como un órgano u otro tejido corporal, la estructura refleja una parte de la onda de ultrasonidos. Estructuras diferentes en el cuerpo reflejan la energía de ultrasonidos de maneras distintas y con intensidades variables. La energía reflejada se detecta y se utiliza para generar una imagen de las estructuras a través de las que la onda de ultrasonidos ha pasado. El término "retrodispersión" se refiere al fenómeno en el que la energía de ultrasonidos es dispersada hacia atrás en dirección a la fuente por una sustancia con unas propiedades físicas determinadas.

Desde hace tiempo se reconoció que el contraste observado en una imagen de ultrasonidos se puede aumentar con la presencia de sustancias que se sabe que causan una gran cantidad de retrodispersión. Cuando se suministra una sustancia tal a una parte determinada del cuerpo, aumenta el contraste entre la imagen de ultrasonidos de esta parte del cuerpo y los tejidos circundantes que no contienen la sustancia. Se comprende que, a causa de sus propiedades físicas, sustancias diferentes causan retrodispersión en grados variables. En consecuencia, la búsqueda de agentes que aumenten el contraste se ha centrado en sustancias que son estables y no tóxicas y que muestran la máxima retrodispersión.

La capacidad que tiene una sustancia para causar retrodispersión de la energía de ultrasonidos depende de las características de la sustancia, tales como su capacidad de ser comprimida. Cuando se examinan diferentes sustancias, es útil comparar una medida particular de la capacidad que tiene una sustancia para causar retrodispersión conocida como la "sección de dispersión". La sección de dispersión de una sustancia determinada es proporcional al radio del dispersante, y también depende de la longitud de onda de la energía de ultrasonidos y de otras propiedades físicas de la sustancia, J. Ophir y K.J. Parker, Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound, Ultrasound in Medicine & Biology, vol. IS, n. 4, p. 319, 323 (1989).

Al evaluar la utilidad de sustancias diferentes como agentes de contraste de imagen, se pueden calcular cuáles son los agentes que deberían tener la sección de dispersión mayor y, en consecuencia, cuáles son los agentes que deberían proporcionar el mayor contraste en una imagen de ultrasonidos. Se puede suponer que la compresibilidad de una partícula sólida es mucho menor que la del medio circundante y que la densidad de la partícula es mucho mayor. Utilizando esta suposición, se ha estimado que la sección de dispersión de un agente del tipo partícula sólida que aumenta el contraste es 1,75 (Ophir y Parker, supra, en 325). Para un dispersante líquido puro, la compresibilidad adiabática y la densidad del dispersante y el medio circundante es probable que sean aproximadamente iguales, por lo que los líquidos tendrían una sección de dispersión cero. No obstante, los líquidos pueden mostrar algo de retrodispersión si hay presentes grandes volúmenes de un agente líquido. Por ejemplo, si un agente líquido pasa de un recipiente muy pequeño a uno muy grande de manera que el líquido ocupa sustancialmente todo el recipiente, el líquido puede mostrar una retrodispersión que se puede medir. Sin embargo, los técnicos en la materia consideran que los líquidos puros son dispersantes relativamente ineficientes en comparación con las microburbujas de gas libre.

Atenuación de la radiación: Otro efecto que se puede observar con la presencia de ciertos agentes sólidos que aumentan el contraste es la atenuación de la onda de ultrasonidos. Se ha observado el contraste de la imagen en la visualización convencional a causa de diferencias de atenuación localizadas entre algunos tipos de tejido. K.J. Parker y R.C. Wang, "Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions selected from B-Scan Images", IEEE Trans. Biomed. Enar. BME 30(8), p. 431-37 (1983); K.J. Parker, R.C. Wang, y R.M. Lerner, "Attenuation of Ultrasound Magnitude and Frequency Dependence for Tissue Characterization", Radiology, 153(3), p. 785-88 (1984). Se ha realizado la hipótesis de que la medición de la atenuación de una región de un tejido tomada antes y después de la infusión de un agente puede resultar en una imagen mejorada. No obstante, las técnicas basadas en el contraste de atenuación como medio para medir la mejora del contraste de un agente líquido, no están bien desarrolladas y, aunque lo estuvieran, podrían padecer limitaciones respecto a los órganos o estructuras internas con los que esta técnica se puede utilizar. Por ejemplo, es poco probable que una pérdida de atenuación producida por agentes de contraste líquidos se pudiera observar en la imagen del sistema cardiovascular a causa del gran volumen de agente de contraste líquido que tendría que estar presente en un vaso determinado antes de que se pudiera medir una diferencia sustancial en la atenuación.

La absorción de energía por las partículas tiene lugar por un mecanismo denominado "movimiento relativo". Se puede demostrar que el cambio en la atenuación causado por el movimiento relativo aumenta linealmente con la concentración de partícula y como el cuadrado de la diferencia de densidad entre las partículas y el medio circundante. K.J. Parker, y otros, "A Particulate Contrast Agent with Potential for Ultrasound Imaging of Liver", Ultrasound in Medicine & Biology, Vol. 13, No. 9, p. 555, 561 (1987). En consecuencia, allí donde se produce una acumulación sustancial de partículas sólidas, el contraste de atenuación puede ser un mecanismo viable para observar un aumento del contraste de la imagen, aunque el efecto es de una magnitud mucho menor que el fenómeno de retrodispersión y sería de poca utilidad en los diagnósticos cardiovasculares.

Diferencial de velocidad del sonido: Se ha propuesto una técnica adicional para aumentar el contraste en una imagen de ultrasonidos a partir del hecho de que la velocidad del sonido varía según el medio a través del que viaja. Por consiguiente, si en un área objetivo se puede infundir un volumen suficientemente grande de un agente, a través del cual la velocidad del sonido es diferente que la del tejido circundante, se podrá medir la diferencia en la velocidad del sonido a través del área objetivo.

En resumen, los ultrasonidos de diagnóstico son una herramienta potente y no invasiva que se puede utilizar para obtener información de los órganos internos del cuerpo. La llegada de la formación de imágenes de visualización en escalas de grises y el Doppler de color han avanzado enormemente el alcance y la resolución de la técnica. Aunque las técnicas para realizar diagnósticos por ultrasonidos han mejorado significativamente, así como para preparar y utilizar agentes de contraste, todavía existe la necesidad de mejorar la resolución de la visualización de la perfusión cardiaca y de las cámaras cardíacas, los órganos sólidos y la perfusión renal; la perfusión de órganos sólidos; y las señales Doppler de la velocidad y la dirección del flujo sanguíneo durante la visualización a tiempo real.

Se han utilizado diferentes polímeros naturales y sintéticos para encapsular agentes de visualización por contraste, tales como el aire. Schneider y otros, Invest. Radiol., Vol. 27, pp. 134-139 (1992) describe partículas poliméricas de tres micrones rellenas de aire. Se describió que estas partículas eran estables en plasma y bajo presión aplicada. No obstante, a 2,5 MHz, su ecogenicidad era baja. Se obtuvo otro tipo de suspensión de microburbuja a partir de albúmina sonicada. Feinstein y otros, J. Am. Coll. Cardiol., Vol. 11, pp. 59-65 (1988). Feinstein describe la preparación de microburbujas de tamaño adecuado para el paso transpulmonar con una estabilidad excelente in vitro. Sin embargo, estas microburbujas tienen una vida corta in vivo, con una vida media del orden de pocos segundos (que es aproximadamente igual que una pasada de circulación) a causa de su inestabilidad bajo presión. Gottlieb, S. y otros, J. Am. Soc. Echo., Vol. 3, pp. 328 (1990), Resumen; y Shapiro, J.R. y otros, J. Am.
Coll. Cardiol., Vol. 16, pp. 1603-1607 (1990). Carroll y otros han descrito burbujas de aire encapsuladas con gelatina (Carroll, B.A. y otros, Invest. Radiol., Vol. 15, pp. 260-266 (1980), y Carroll, B.A. y otros, Radiology, Vol. 143, pp. 747-750 (1982)), pero a causa de sus grandes tamaños (12 y 80 \mum) no es probable que pasaran a través de los capilares pulmonar. Las microburbujas encapsuladas con gelatina también se han descrito en WO 80/02365, publicada el 13 de noviembre de 1980 por Rasor Associates, Inc. Éstas están formadas por "coalescencia" de la gelatina.

La microburbujas estabilizadas por microcristales de galactosa (SHU 454 y SHU 508) también se han descrito por Fritzch y otros. Fritzsch, T. y otros, Invest. Radiol., Vol. 23 (Supl. 1), pp. 302-305 (1988); y Fritzsch T. y otros, Invest. Radiol., Vol. 25 (Supl. 1), 160-161 (1990). Las microburbujas duran hasta 15 minutos in vitro pero menos de 20 segundos in vivo. Rovai, D. y otros, J. Am. Coll. Cardiol., Vol. 10, pp. 125-134 (1987); y Smith, M. y otros, J. Am. Coll. Cardiol, Vol. 13, pp. 1622-1628 (1989). Las microburbujas de gas encapsuladas en una cápsula de un material que contiene flúor se describen en WO 96/04018 por Molecular Biosystems, Inc.

La solicitud de patente europea No. 90901933,5 de Schering Aktiengesellschaft describe la preparación y el uso de gas microencapsulado o líquidos volátiles para la visualización por ultrasonidos, en la que las microcápsulas están formadas por polímeros sintéticos o polisacáridos. La patente europea No. 0 458 745 A1, publicada el 27 de noviembre de 1991 por Sintetica S.A. describe microesferas de aire o gas limitadas por una membrana de polímero depositado interfacialmente que se puede dispersar en un transportador acuoso para inyectarlas a un animal huésped o para administración oral, rectal, o uretral, con propósitos terapéuticos o diagnósticos. La patente WO 92/18164 de Delta Biotechnology Limited describe la preparación de micropartículas mediante secado por atomización en condiciones muy controladas de temperatura, velocidad de atomización, tamaño de partícula, y condiciones de secado, de una disolución acuosa de proteína, para formar esferas vacías con gas atrapado en el interior, con el fin de utilizarlas para visualización. La patente WO 93/25242 describe la síntesis de micropartículas para visualización ultrasónica formadas por un gas contenido en una cápsula de policianoacrilato o poliéster. WO 92/21382 describe la fabricación de agentes de contraste de micropartículas que incluyen una matriz unida covalentemente que contiene un gas, en el que la matriz es un carbohidrato. Las patentes de Estados Unidos Nos. 5.334.381, 5.123.414 y 5.352.435 de Unger describen el uso de liposomas como agentes de contraste de ultrasonidos, que incluyen gases, precursores de gases, tales como un precursor gaseoso activado por pH o fotoactivado, u otros agentes que aumentan el contraste líquido o sólido.

La patente de Estados Unidos No. 5.393.524 de Quay describe la utilización de agentes, incluyendo fluorocarbonos, para aumentar el contraste en una imagen de ultrasonidos. Los agentes consisten en burbujas extremadamente pequeñas, o microburbujas, de gases seleccionados, que muestran una larga duración en disolución y son suficientemente pequeñas para atravesar los pulmones, permitiendo su uso en la visualización por ultrasonidos del sistema cardiovascular y otros órganos vitales. WO 95/23615 de Nycomed describe microcápsulas para visualización formadas por coacervación de una disolución, por ejemplo, una disolución de proteína, que contiene un perfluorocarbono. WO 95/03357, publicada el 2 de febrero de 1995 por el Massachusets Institute of Technology, describe micropartículas formadas por polímeros bloque de polietilenglicol-poli(láctido-co-glicólido) con agentes de visualización encapsulados en los mismos, incluyendo gases tales como aire y perfluorocarbonos. Tal como se describe en WO 94/16739 de Sonus Pharmaceuticals, Inc., mientras que los sólidos y los líquidos reflejan el sonido de manera similar, se conoce que los gases son más eficientes y son el medio preferido para la utilización como agentes de contraste de ultrasonidos. De hecho, tal como se muestra con el ejemplo 12 de la solicitud del Tratado de Cooperación de Patentes (PCT) de Sonus, las microcápsulas de proteínas se desestimaron al aumentar la preocupación por la seguridad (y también por motivos de eficacia) cuando se administraba a cerdos pequeños, en comparación con las emulsiones o suspensiones coloidales.

Ninguno de éstos describe micropartículas que se pueden detectar utilizando otros métodos de detección, tales como rayos x, tomografía de emisión de positrones o fotones, o visualización por resonancia magnética.

En todos estos casos es deseable mejorar la ecogenicidad del agente de visualización, conjuntamente con la mejora o el mantenimiento de la estabilidad y la facilidad de fabricación del agente de visualización. Una manera de aumentar la ecogenicidad de una micropartícula es aumentar el tiempo que los gases encapsulados permanecen en las micropartículas circulantes. Desgraciadamente, en la mayoría de casos, los gases difunden rápidamente hacia fuera, independientemente de la naturaleza del gas o del material de encapsulación, particularmente en el entorno acuoso de la circulación vascular.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es dar a conocer micropartículas con una ecogenicidad significativamente mejorada. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar micropartículas que contengan un agente de visualización que pueda permanecer más de unas pocas pasadas de circulación in vivo. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar micropartículas que retengan gas encapsulado durante períodos de tiempo más largos, aumentando así la ecogenicidad de las micropartículas in vivo.

Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer micropartículas que contengan un agente de visualización. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar micropartículas que contengan agentes de visualización que estén dirigidos a regiones específicas del cuerpo. Todavía otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para preparar micropartículas que tengan agentes de visualización atrapados en el interior.

Características de la invención

Se ha descubierto que la incorporación de gases, especialmente gases fluorados, tales como perfluorocarbonados, en micropartículas formadas a partir de la combinación de un polímero natural o sintético y un lípido, tiene una ecogenicidad significativamente aumentada en comparación con micropartículas que no incluyen el lípido. Para mejorar la ecogenicidad, también se pueden incorporar en las micropartículas compuestos distintos de los lípidos que sean hidrofóbicos y limiten la difusión de agua hacia el interior de las micropartículas. En la realización preferente, los polímeros son polímeros biodegradables sintéticos. Las micropartículas se fabrican con un diámetro adecuado para el tejido de interés que se visualizará, por ejemplo, con un diámetro entre 0,5 y 8 micrones para la administración intravascular, y un diámetro entre 0,5 y 5 mm para la administración oral para visualizar el tracto gastrointestinal u otros lúmenes. Los polímeros preferidos son polihidroxiácidos tales como ácido poliláctico-ácido co-glicólico, poliláctido o poliglicólido, más preferiblemente conjugado con polietilenglicol u otros materiales que inhiben la captación por el sistema reticuloendotelial (SRE). Los lípidos más preferentes son los fosfolípidos, preferiblemente dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), dibehenoilfosfatidil-colina (DBPC),ditricosanoilfosfatidilcolina (DTPC), dilignoceroil-fatidilcolina (DLPC), incorporados en una proporción entre 0,01-30 (peso de lípido/peso de polímero), más preferiblemente entre 0,1-10 (peso de lípido/peso de polímero).

La adhesión de estas micropartículas se puede aumentar o reducir mediante la selección de polímeros bioadhesivos. Por ejemplo, la adhesión se puede aumentar cuando el polímero se utiliza para administración oral. El direccionado también se puede conseguir por selección del polímero o incorporación en el interior o acoplando ligandos al polímero que se unan específicamente a tipos de tejidos determinados o moléculas de superficie celular. Adicionalmente, los ligandos se pueden unir a las microesferas que afectan la carga, la lipofilicidad o la hidrofilicidad de la partícula. La micropartículas poliméricas son útiles en una variedad de procesos de diagnóstico por imagen, incluyendo visualización por ultrasonidos, visualización por resonancia magnética, fluoroscopia, rayos-x, y tomografía computerizada. Las microesferas se pueden utilizar en muchas aplicaciones de visualización, incluyendo aplicaciones en cardiología, aplicaciones en perfusión sanguínea, así como en la visualización de órganos y venas periféricas.

Breve descripción del dibujo

La figura 1 es un gráfico del efecto de la longitud de cadena de carbonos de lípido incorporado en micropartículas poliméricas, trazada como grado de retrodispersión a lo largo del tiempo (minutos) para la lecitina (círculos sólidos), DPPC (cuadrados abiertos), DSPC (rombos abiertos), y DAPC (X).

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan métodos para la síntesis de sistemas de distribución poliméricos de micropartículas de polímero-lípido que contienen gases, especialmente perfluorocarbonos. Las micropartículas son útiles en diferentes aplicaciones de diagnóstico por imagen de ultrasonidos, en particular en procedimientos de ultrasonidos tales como la visualización de vasos sanguíneos y la ecocardiografía. La incorporación de lípido adicional aumenta significativamente la ecogenicidad en comparación con las mismas micropartículas poliméricas sin el lípido adicional.

Procesos y reactivos para producir micropartículas

Tal como se utiliza en la presente invención, el término micropartícula incluye microesferas y microcápsulas, así como micropartículas, a menos que se especifique de otra manera. Las micropartículas pueden tener o no una forma esférica. Las microcápsulas se definen como micropartículas que tienen una cápsula polimérica exterior circundante a un núcleo de otro material, en este caso, un gas. Las microesferas son, generalmente, esferas poliméricas sólidas, que pueden incluir una estructura en forma de panal de abeja constituida por poros a través del polímero que están rellenos con un gas con propósitos de visualización, tal como se describe a continuación.

Polímeros

Para la distribución de gases, se pueden utilizar tanto matrices no biodegradables como biodegradables mezcladas con lípidos, aunque se prefieren las matrices biodegradables, en particular para la inyección intravenosa. Para la administración oral se pueden utilizar polímeros no erosionables. Se prefieren los polímeros sintéticos por su síntesis y degradación reproducibles. El polímero se selecciona según el tiempo requerido de estabilidad in vivo, es decir, el tiempo requerido para la distribución al sitio que se desea visualizar, y el tiempo requerido para la visualización. En una realización, se pueden fabricar las micropartículas con una estabilidad in vivo entre 20 y 30 minutos o más, por ejemplo, para utilización en aplicaciones tales como ecocardiografía, neurosonografía, histerosalpingografía, y procedimientos diagnósticos en órganos sólidos. La estabilidad in vivo de micropartículas que encapsulan a los agentes de contraste, se puede ajustar durante la producción utilizando polímeros tales como poliláctido co-glicólido copolimerizado con polietilenglicol (PEG). Si se expone PEG en la superficie externa, puede alargar el tiempo que estos materiales circulan, ya que es hidrofílico.

Polímeros sintéticos representativos son: poli(hidroxiácidos) tales como ácido poli(láctico), ácido poli(glicólico) y ácido poli(láctico-co-glicólico), poliglicólidos, poliláctidos, copolímeros y mezclas de poliláctido co-glicólido, polianhídridos, poliortoésteres, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles tales como poli(etilenglicol), óxidos de polialquileno tales como óxido de poli(etileno), tereftalatos de polialquileno tales como tereftalato de poli(etileno), alcoholes de polivinilo, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo tales como cloruro de poli(vinilo), polivinil-pirrolidona, polisiloxanos, alcoholes de poli(vinilo), acetato de poli(vinilo), poliestireno, poliuretanos y copolímeros de los mismos, celulosas derivatizadas tales como alquil celulosa, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, metil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, hidroxibutil metil celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato acetato de celulosa, ftalato acetato de celulosa, carboxiletil celulosa, triacetato de celulosa, y sal sódica del sulfato de celulosa (conjuntamente denominados en la presente invención como "celulosas sintéticas"), polímeros de ácido acrílico, ácido metacrílico o copolímeros o derivados de los mismos, incluyendo ésteres, poli(metil metacrilato), poli(etil metacrilato), poli(butil metacrilato), poli(isobutil metacrilato), poli(hexil metacrilato), poli(isodecil metacrilato), poli(lauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), y poli(octadecil acrilato) (conjuntamente denominados en la presente invención como "ácidos poliacrílicos"), ácido poli(butírico), ácido poli(valérico), y poli(láctido-co-caprolactona), copolímeros y mezclas de los mismos. Tal como se utiliza en la presente invención, "derivados" incluye polímeros que tienen sustituciones, adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones, y otras modificaciones realizadas rutinariamente por los técnicos en la materia.

Ejemplos de los polímeros no biodegradables preferentes incluyen acetato de etilenvinilo, ácido poli(met)acrílico, poliamidas, copolímeros y mezclas de los mismos.

Ejemplos de los polímeros biodegradables preferentes incluyen polímeros de hidroxiácidos, tales como ácido láctico y ácido glicólico, poliláctido, poliglicólido, poliláctido-co-glicólido, y copolímeros con PEG, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, ácido poli(butírico), ácido poli(valérico), poli(láctido-co-caprolactona), mezclas y copolímeros de los mismos.

Ejemplos de los polímeros naturales preferidos incluyen proteínas, tales como albúmina y prolaminas, por ejemplo, ceína, y polisacáridos como alginato, celulosa y polihidroxialcanoatos, por ejemplo, polihidroxibutirato.

Polímeros bioadhesivos de interés particular para la utilización en la visualización de superficies mucosas, como en el tracto gastrointestinal, incluyen polianhídridos, ácido poliacrílico, poli(metil metacrilatos), poli(etil metacrilatos), poli(butil metacrilato), poli(isobutil metacrilato), poli(hexil metacrilato), poli(isodecil metacrilato), poli(lauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), y poli(octadecil acrilato).

Disolventes

Tal como se define en la presente invención, el disolvente del polímero es un disolvente orgánico que es volátil o con un punto de ebullición relativamente bajo o se puede eliminar al vacío y que es aceptable para la administración a humanos a nivel de trazas, tales como cloruro de metileno. También se pueden utilizar otros disolventes, tales como acetato de etilo, etanol, metanol, dimetilformamida (DMF), acetona, acetonitrilo, tetrahidrofurano (THF), ácido acético, dimetilsulfóxido (DMSO) y cloroformo, o combinaciones de los mismos. En general, el polímero se disuelve en el disolvente para formar una disolución de polímero con una concentración entre 0,1 y 60% peso respecto a volumen (p/v), más preferiblemente entre 0,25 y 30%.

Compuestos Hidrofóbicos Lípidos

En general, la incorporación de compuestos hidrofóbicos y, en una cantidad efectiva, limitan por tanto la penetración y/o la captación de agua por las micropartículas, son efectivos para aumentar la ecogenicidad de las micropartículas poliméricas que contienen gas encapsulado, especialmente gases fluorados, tales como perfluorocarbones. Los lípidos que se pueden utilizar para estabilizar el gas en el interior de las micropartículas poliméricas incluyen las siguientes clases de lípidos: ácidos grasos y derivados, mono-, di y triglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, colesterol y derivados de esteroides, terpenos y vitaminas. Los ácidos grasos y derivados de los mismos pueden incluir ácidos grasos saturados e insaturados, ácidos grasos de número par e impar, isómeros cis y trans, y derivados de ácidos grasos incluyendo alcoholes, ésteres, anhídridos, hidroxiácidos grasos y prostaglandinas. Los ácidos grasos saturados e insaturados que se pueden utilizar incluyen moléculas que tienen entre 12 y 22 átomos de carbono tanto en forma lineal como ramificada. Ejemplos de ácidos grasos saturados que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitación a, ácido láurico, mirístico, palmítico y esteárico. Ejemplos de ácidos grasos insaturados que se pueden utilizar incluyen ácido láurico, fisetérico, miristoleico, palmitoleico, petroselínico, y oleico. Ejemplos de ácidos grasos ramificados que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitación, ácido isoláurico, isomirístico, isopalmítico, e isosteárico e isoprenoides. Derivados de ácidos grasos incluyen ácido 12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecanoico; ácido N-[12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecanoil]-2-amino-palmítico; N-succinil-dioleoilfosfatidiletanolamina y palmitoil-homocisteína; y/o combinaciones de los mismos. Mono, di y triglicéridos o derivados de los mismos que se pueden utilizar incluyen moléculas que tienen ácidos grasos o mezclas de ácidos grasos entre 6 y 24 átomos de carbono, digalactosildiglicérido, 1,2-dioleoil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3 succinilglicerol; y 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol.

Los fosfolípidos que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitación, ácidos fosfatídicos, fosfatidilcolinas tanto con lípidos saturados como insaturados, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, derivados de lisofosfatidil, cardiolipina, y \beta-acil-y-alquil fosfolípidos. Ejemplos de fosfolípidos incluyen, pero sin limitación, fosfatidilcolinas, tales como dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipentadecanoilfosfatidilcolina dilauroilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), dibehenoilfosfatidilcolina (DBPC), ditricosanoil-fosfatidilcolina (DTPC), dilignoceroilfosfatidilcolina (DLPC); y fosfatidiletanolaminas tales como dioleoilfosfatidiletanolamina o 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina. También se pueden utilizar fosfolípidos sintéticos con cadenas acilo asimétricas (por ejemplo, con una cadena acilo de 6 carbonos y otra cadena acilo de 12 carbonos).

Los esfingolípidos que se pueden utilizar incluyen ceramidas, esfingomielinas, cerebrósidos, gangliósidos, sulfátidos y lisosulfátidos. Ejempos de esfingolípidos incluyen, pero sin limitación, los gangliósidos GM1 y GM2.

Los esteroides que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitación, colesterol, sulfato de colesterol, hemisuccinato de colesterol, 6-(5-colesterol 3\beta-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio-\alpha-D-galactopiranósido, 6-(5-colesten-3\beta-tioxi)hexil-6-amino-6-desoxil-1-tio-\alpha-D-manopiranósido y colesteril) 4'-trimetil 35 amonio)butanoato.

Compuestos lípidos adicionales que se pueden utilizar incluyen tocoferol y derivados, y aceites y aceites derivatizados, tales como estearilamina.

Se pueden utilizar una variedad de lípidos catiónicos tales como DOTMA, cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio; DOTAP, 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio) propano; y DOTB, 1,2-dioleoil-3-(4'-trimetilamonio) butanoil-sn glicerol.

Los lípidos más preferidos son los fosfolípidos, preferiblemente DPPC, DDSPC, DAPC, DSPC, DTPC, DBPC, DLPC y más preferiblemente DPPC, DAPC y DBPC.

El contenido de lípido se encuentra entre 0,01-30 (peso de lípido/peso de polímero); más preferiblemente entre 0,1-10 (peso de lípido/peso de polímero).

Otros compuestos hidrofóbicos

Otros compuestos hidrofóbicos preferidos incluyen aminoácidos tales como triptófano, tirosina, isoleucina, leucina, y valina, compuestos aromáticos, tales como un alquil paraben, por ejemplo, metil paraben, y ácido benzoico.

Agentes de visualización Gases

Cualquier gas biocompatible o aceptable farmacológicamente se puede incorporar en las micropartículas. El término gas se refiere a cualquier compuesto que sea un gas o sea capaz de formar un gas a la temperatura a la que se lleva a cabo la visualización. El gas puede estar formado por un solo compuesto tal como oxígeno, nitrógeno, xenón, argón, nitrógeno o una mezcla de compuestos, tales como aire. Se prefieren los gases fluorados. Ejemplos de gases fluorados incluyen CF_{4}, C_{2}F_{6},C_{3}F_{8}, C_{4}F_{8}, SF_{6}, C_{2}F_{4}, y C_{3}F_{6}. El perfluoropropano es particularmente preferido porque proporciona un gas insoluble que no condensará a la temperatura de utilización y es farmacológicamente aceptable.

Otros agentes de visualización

Otros agentes de visualización se pueden incorporar en lugar de un gas, o en combinación con el gas. Agentes de visualización que se pueden utilizar incluyen agentes disponibles comercialmente utilizados en la tomografía de emisión de positrones (PET), tomografía computerizada (CAT), tomografía computerizada de emisión de un solo fotón, rayos-x, fluoroscopia, y visualización por resonancia magnética (MRI). Las micropartículas cargadas con estos agentes se pueden detectar utilizando técnicas estándares disponibles en el sector y equipos comerciales disponibles.

Ejemplos de materiales adecuados para la utilización como agentes de contraste en MRI incluyen quelatos de gadolinio actualmente disponibles, tales como ácido de dietilen triamino pentacético (DTPA) y gadopentetato de dimeglumina, así como hierro, magnesio, manganeso, cobre y cromo.

Ejemplos de materiales útiles para CAT y rayos-x incluyen materiales basados en iodo para la administración intravenosa, tales como monómeros iónicos representados por diatrizoato e iotalamato, monómeros no iónicos, tales como iopamidol, isohexol, e ioversol, dímeros no iónicos, tales como iotrol e iodixanol y dímeros iónicos, por ejemplo, ioxaglato. Otros materiales útiles incluyen bario para el uso oral.

Micropartículas y métodos para la preparación de las mismas

En la realización más preferida, las micropartículas se producen mediante secado por atomización. Se pueden utilizar otras técnicas, tales como extracción con disolvente, encapsulación mediante fusión con calor, y evaporación del disolvente, tal como se ha comentado anteriormente. Un criterio esencial es que el polímero debe estar disuelto o fundido con el lípido, antes de formar la micropartícula. Aunque se ha descrito específicamente con referencia a la incorporación de un lípido, se entiende que otros compuestos hidrofóbicos útiles podrían sustituir el lípido.

En una realización preferida, el gas se sustituye, entonces, aplicando una corriente del gas deseado, o poniendo en marcha el vacío, en las micropartículas para eliminar el gas encapsulado, rellenándolas, así, con el gas deseado.

a.

Evaporación del Disolvente. En este método el polímero y el lípido se disuelven en un disolvente orgánico volátil, tal como cloruro de metileno. Se puede añadir a la disolución un agente formador de poros como sólido o en disolución, para utilizarlo en la formación de micropartículas que incorporarán gas como agente de visualización. Si hay que incorporar otros agentes de visualización, el agente de visualización se puede añadir tanto como sólido o en disolución a la disolución de polímero. La mezcla se sonica o se homogeniza y la dispersión o emulsión resultante se añade a una disolución acuosa que contiene un agente activo superficial, tal como TWEEN™ 20, TWEEN™ 80, PEG o alcohol de poli(vinilo) y se homogeniza para formar una emulsión. La emulsión resultante se mezcla hasta que se evapora la mayor parte del disolvente orgánico, dejando las micropartículas. Se pueden utilizar varias concentraciones de polímero diferentes (0,05-0,60 g/ml). Con este método se pueden obtener micropartículas con tamaños (1-1000 micrones) y morfologías diferentes. Este método es útil para polímeros relativamente estables como los poliésteres.

La evaporación de disolvente está descrita por E. Mathiowitz, y otros, J. Scanning Microscopy, 4, 329 (1990); L.R. Beck, y otros, Fertil. Steril., 31, 545 (1979); y S. Benita, y otros, J. Pharm. Sci., 73, 1721 (1984).

Sin embargo, polímeros lábiles, tales como los polianhídridos, se pueden degradar durante el proceso de fabricación a causa de la presencia de agua. Para estos polímeros son más útiles los dos métodos siguientes, que se realizan completamente en disolventes orgánicos.

b.

Microencapsulación por Fusión con Calor. En este método, el polímero y el lípido se funden en primer lugar y después se mezclan con las partículas sólidas del agente formador de poros o el agente de diagnóstico sólido o líquido. La mezcla se suspende en un disolvente no miscible (como aceite de silicona), y, mientras se agita continuamente, se calienta hasta 5ºC por encima del punto de fusión del polímero. Una vez la emulsión se ha estabilizado, se enfría hasta que las partículas de polímero se solidifican. Las micropartículas resultantes se lavan por decantación con un polímero no disolvente, tal como éter de petróleo, para dar lugar a un polvo suelto. Con este método se pueden obtener micropartículas con tamaños entre uno y 1.000 micrones. Las superficies externas de las partículas preparadas con esta técnica son, habitualmente, lisas y densas. Este procedimiento se utiliza para preparar micropartículas formadas por poliésteres y polianhídridos. No obstante, este método se limita a polímeros con pesos moleculares entre 1.000-50.000.

La microencapsulación por fusión con calor está descrita por E. Mathiowitz, y otros, Reactive Polymers, 6, 275 (1987). Por ejemplo, mediante microencapsulación por fusión con calor se pueden preparar polianhídridos formados por bis-carboxifenoxipropano y ácido sebácico con una proporción molar de 20:80 (P(CPP-SA) 20:80) (Mw 20.000) o, por ejemplo, se pueden preparar mediante microencapsulación por fusión con calor micropartículas de poli(fumárico-co-sebácico) (20:80) (Mw 15.000).

c.

Eliminación del Disolvente. Esta técnica se diseñó en primer lugar para polianhídridos. En este método, el agente formador de poros se dispersa o se disuelve en una disolución de polímero seleccionado y el lípido en un disolvente orgánico volátil, tal como cloruro de metileno. Esta mezcla se suspende mediante agitación en un aceite orgánico (tal como aceite de silicona) para formar una emulsión. A diferencia de la evaporación del disolvente, este método se puede utilizar para preparar micropartículas a partir de polímeros con puntos de fusión elevados y pesos moleculares diferentes. La morfología externa de las partículas producidas con esta técnica depende en gran medida del tipo de polímero utilizado.

d.

Secado de Micropartículas por Atomización. Las micropartículas se pueden producir mediante el secado por atomización disolviendo un polímero y lípido biocompatibles en un disolvente apropiado, dispersando un agente formador de poros en la disolución de polímero, y, entonces, secando por atomización la disolución de polímero, para formar micropartículas. Tal como se define en la presente invención, el proceso de "secado por atomización" de una disolución de un polímero y un agente formador de poros se refiere a un proceso en el que la disolución se atomiza para formar una niebla fina y se seca por contacto directo con gases transportadores calientes. Utilizando aparatos de secado por atomización disponibles en el sector, se puede distribuir la disolución de polímero a través de la abertura de entrada del secador de atomización, pasar a través de un tubo en el secador y, después, atomizarse a través del abertura de salida. La temperatura puede variar según el gas o el polímero utilizado. La temperatura de los aberturas de entrada y salida se puede controlar para producir los productos deseados.

El tamaño de las partículas de la disolución de polímero es una función de la boquilla utilizada para atomizar la disolución de polímero, la presión de la boquilla, la velocidad del flujo, el polímero utilizado, la concentración de polímero, el tipo de disolvente y la temperatura de atomización (tanto la temperatura de entrada como de salida) y el peso molecular. Generalmente, a mayor peso molecular, mayor tamaño de partícula, asumiendo que la concentración es la misma. Parámetros habituales de proceso para el secado por atomización son los siguientes: concentración de polímero = 0,005-0,20 g/ml, temperatura de entrada = 30-1000ºC, temperatura de salida = 20-100ºC, velocidad de flujo del polímero = 5-200 ml/min, y diámetro de la boquilla = 0,2-4 mm ID. Se pueden obtener micropartículas con un diámetro entre uno y diez micrones con una morfología que depende de la selección del polímero, la concentración, el peso molecular y el flujo de atomización.

Si el agente visualizador es un sólido, se puede encapsular el agente como partículas sólidas que se añaden a la disolución de polímero antes de realizar la atomización, o se puede disolver el agente de visualización en una disolución acuosa que se emulsiona, a continuación, con la disolución de polímero antes de realizar la atomización, o se puede cosolubilizar el sólido junto con el polímero en un disolvente apropiado antes de realizar la atomización.

e.

Micropartículas de Hidrogel. Las micropartículas formadas por polímeros de tipo gel, tales como polifosfaceno o polimetilmetacrilato, se producen disolviendo el polímero en una disolución acuosa, suspendiendo si se desea un agente formador de poros y suspendiendo un lípido en la mezcla, homogenizando la mezcla, y extruyendo el material a través de un dispositivo formador de microgotas, produciendo microgotas que caen dentro de un baño endurecedor que consiste en un ión de carga opuesta o una disolución de polielectrolitos, que se agita lentamente. La ventaja de estos sistemas es la capacidad de modificar adicionalmente la superficie de las micropartículas recubriéndolas con polímeros policatiónicos, tal como la polilisina después de su fabricación. Las partículas de tipo micropartículas se controlan utilizando extrusoras de varios tamaños.

Aditivos para facilitar la formación de micropartículas

Se pueden añadir distintos surfactantes durante la síntesis de las micropartículas que contienen el agente de visualización. Emulsionantes o surfactantes que a título de ejemplo se pueden utilizar (0,1-5% en peso) incluyen la mayoría de emulsionantes aceptables fisiológicamente. Entre los ejemplos se incluyen las formas naturales y sintéticas de sales biliares o ácidos biliares, tanto conjugados con aminoácidos como no conjugadas, tales como taurodeoxicolato, y ácido cólico.

Los agentes formadores de poro se pueden incluir en una cantidad entre el 0,01 y el 90% peso respecto a volumen, para aumentar la formación de poros. Por ejemplo, en el secado por atomización y evaporación de disolvente, un agente formador de poros, tal como una sal volátil, por ejemplo, bicarbonato amónico, acetato amónico, cloruro amónico o benzoato amónico u otra sal liofilizable, se disuelve en primer lugar en agua. Entonces, la disolución que contiene el agente formador de poros se emulsiona, a continuación, con la disolución de polímero para crear pequeñas gotas del agente formador de poros en el polímero. A continuación, esta emulsión se seca por atomización o se somete a un proceso de evaporación/extracción con disolventes. Una vez el polímero está precipitado, las micropartículas endurecidas se congelan y se liofilizan para eliminar los agentes formadores de poros.

Tamaño de micropartícula

En una realización preferida para la preparación de micropartículas inyectables capaces de atravesar el lecho capilar pulmonar, las micropartículas deberían tener un diámetro aproximado entre uno y diez micrones. Las micropartículas de un tamaño mayor podrían bloquear el lecho pulmonar, y las micropartículas más pequeñas podría ser que no proporcionaran una ecogenicidad suficiente. Las micropartículas de mayor tamaño son útiles para la administración por rutas distintas de la inyección, por ejemplo, oral (para evaluar el tracto gastrointestinal), aplicación a otras superficies mucosas (rectal, vaginal, oral, nasal) o por inhalación. El tamaño de partícula preferido para la administración oral es entre 0,5 micrones y 5 mm. Entre los transportadores aceptables farmacéuticamente se incluyen el suero salino que contiene glicerol y TWEEN™ 20 y manitol isotónico que contiene TWEEN™ 20. Se pueden realizar análisis de tamaño de partícula en un contador Coulter mediante microscopía óptica, microscopía electrónica de escaneado o microscopía electrónica de
transmisión.

Manipulación de la dirección

Las micropartículas se pueden dirigir específica o no específicamente a través de la selección del polímero que forma la micropartícula, del tamaño de la micropartícula, y/o de la incorporación o unión de un ligando a las micropartículas. Por ejemplo, moléculas activas biológicamente, o moléculas que afectan a la carga, la lipofilicidad o hidrofilicidad de la partícula, se pueden unir a la superficie de la micropartícula. Además, las moléculas se pueden unir a las micropartículas que minimizan la adhesión tisular, o que facilitan la manipulación de la dirección específica de las micropartículas in vivo. Entre las moléculas representativas directoras se incluyen anticuerpos, lectinas, y otras moléculas que se unen específicamente mediante receptores en las superficies de células de un tipo determinado.

Inhibición de la captación por el SER

La captación y la eliminación de las micropartículas también se puede minimizar a través de la selección del polímero y/o de la incorporación o el acoplamiento de moléculas que minimizan la adhesión o la captación. Por ejemplo, la adhesión tisular por parte de la micropartícula se puede minimizar con la unión covalente de unidades poli(alquilenglicol) a la superficie de la micropartícula. Las unidades poli(alquilenglicol) de la superficie tienen una gran afinidad por el agua que reduce la adsorción de la proteína en la superficie de la partícula. Por consiguiente, se reduce el reconocimiento y la captación de la micropartícula por parte del sistema reticuloendotelial (SRE).

Por ejemplo, se puede utilizar el grupo hidroxilo terminal del poli(alquilenglicol) para unir covalentemente moléculas activas biológicamente, o moléculas que afecten la carga, la lipofilicidad o hidrofilicidad de la partícula, en la superficie de la micropartícula. Se pueden utilizar métodos disponibles en el sector para unir a las micropartículas cualquiera de los múltiples ligandos existentes para mejorar las propiedades de distribución, la estabilidad u otras propiedades de las micropartículas in vivo.

Aplicaciones diagnósticas

Habitualmente, las micropartículas se combinan con un transportador aceptable farmacéuticamente, tal como un tampón salino fosfato o suero fisiológico salino o manitol, entonces una cantidad efectiva para la detección se administra a un paciente utilizando una ruta adecuada, normalmente por inyección en un vaso sanguíneo (i.v.) u oralmente. Las micropartículas que contienen un agente de visualización encapsulado se pueden utilizar en la visualización vascular, así como en aplicaciones para detectar enfermedades hepáticas y renales, en aplicaciones de cardiología, en la detección y caracterización de masas y tejidos tumorales, y en la medición de la velocidad del flujo sanguíneo periférico. Las micropartículas también se pueden unir con ligandos que minimicen la adhesión tisular o que dirijan las micropartículas a regiones específicas del cuerpo in vivo, tal como se ha descrito anteriormente.

Los métodos y composiciones descritos anteriormente se comprenderán mejor a partir de los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Preparación de micropartículas de PEG-PLGA/PLGA Octafluoropropano con Lecitina

Se disolvieron 3,2 g de PEG-PLGA (75:25) (IV=0,75 dL/g Birmingham Polymers), 6,4 g PLGA (50:50) (IV= 0.4 dL/g Henley Chemicals), 23 mg Lecitina (Spectrum Chemicals), y 193 mg de Ácido Palmítico (Spectrum Chemicals) en 190 ml de cloruro de metileno. A la disolución de polímero se añadieron 10,8 ml de acetato de amonio 0,70 g/ml y el polímero/acetato de amonio se añadió a la disolución de polímero y la mezcla polímero/acetato de amonio se homogenizó a 10.000 RPM durante 1 minuto utilizando un homogenizador Virtis. La disolución se bombeó a un flujo de 20 ml/min y se secó por atomización utilizando un secador de atomización Bucchi Lab. La temperatura interna era de 40ºC. El polvo de micropartícula se recogió y se liofilizó en un liofilizador de bandeja FTS durante 120 horas. Las micropartículas se alicuotaron en viales de 5 ml Purform y se sellaron con tapones de butilo y se ajustaron las cápsulas de los tapones al cuello del envase. Los viales se llenaron con octafluoropropano a una presión de 10 psig y se purgaron continuamente bajo el gas durante tres minutos. Después de este punto, se conservaron los viales a 4ºC hasta su utilización. Los diámetros de partícula eran de 1-10 micrones cuando se midieron en un contador Coulter, con un número promedio de 2,0 micrones. La microscopía electrónica de barrido demostró que las partículas eran generalmente esféricas con superficies lisas y microdeformaciones ocasionales de la superficie.

Ejemplo 2 Preparación de micropartículas de PEG-PLGA/PLGA Octafluoropropano con dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC)

Las micropartículas se prepararon como en el Ejemplo 1, excepto que se utilizaron 29,6 mg de dipalmitoilfosfatidilcolina (Avanti, Birmingham Al) en lugar de la lecitina.

Ejemplo 3 Preparación de micropartículas de PEG-PLGA/PLGA Octafluoropropano con distearoilfosfatidilcolina (DSPC)

Las micropartículas se prepararon como en el Ejemplo 2, excepto que se utilizaron 29,9 mg de distearoilfosfatidilcolina (Avanti, Birmingham Al) en lugar de la lecitina.

Ejemplo 4 Preparación de micropartículas de PEG-PLGA/PLGA Octafluoropropano con diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC)

Las micropartículas se prepararon como en el Ejemplo 2, excepto que se utilizaron 29,9 mg de diaraquidoilfosfatidilcolina (Avanti, Birmingham Al) en lugar de la lecitina.

Ejemplo 5 Medida de la retrodispersión de micropartículas In Vitro

La retrodispersión de las diferentes micropartículas poliméricas que contienen octafluoropropano producidas en los Ejemplos 1-4 se obtuvo exponiendo 10 microlitros de suspensión de las micropartículas a una radiación de ultrasonidos enfocada. La potencia acústica de retrodispersión como función de la profundidad en la muestra se determinó como se indica a continuación. Se utilizó un pulsador-receptor (Panametrics® Modelo 5800) para excitar mediante choque un transductor de ultrasonidos enfocado (2,25 MHz), que envía un pulso de ultrasonidos a la suspensión de micropartículas en suero fisiológico salino.

La suspensión estaba contenida en una cámara de muestra cilíndrica (55 ml de suero salino) que está situada en un baño de agua con temperatura controlada ajustada a 37ºC. La cámara estaba situada a 1,5 pulgadas del transductor, de manera que el transductor estaba enfocado en la ventana acústica de la cámara. Las cámaras se hicieron rotar a 15 rpm para mantener las micropartículas en suspensión. El contenido de gas disuelto del suero salino se mantuvo a, aproximadamente, el 90% de saturación de aire, tal como se determinó con un medidor de oxígeno disuelto (Orion® modelo 840). El funcionamiento del sistema de prueba acústica está controlado por un ordenador que hace funcionar un programa patentado escrito bajo LabVIEW® (National Instruments®). El ordenador disparó el pulsador-receptor para excitar mediante choque el transductor de ultrasonidos.

El mismo transductor recibió la señal de retrodispersión, y la unidad pulsadora-receptora amplificó la señal de retorno. La señal amplificada se pasó a un osciloscopio digital (LeCroy® modelo 9310AM) para ser digitalizada a 100MSa/s. La señal digitalizada se procesó adicionalmente. La señal se elevó al cuadrado, se analizó por FFT y se integró entre la anchura de banda de 6 dB del transductor. Los datos acústicos recogidos por el sistema se convirtieron en potencia de retrodispersión integrada (IBP), en unidades arbitrarias, como función de la profundidad en la suspensión microparticulada. Se promediaron la IBP vs. los datos de profundidad de 50 pulsos, se determinó la mejor regresión lineal a través de los datos de IBP promediados determinados y el punto de intersección en el eje y, que es proporcional al coeficiente de retrodispersión. Cada muestra se analizó a intervalos de 2,5 minutos durante un período de tiempo total de 10 minutos.

En la figura 1 se muestra la retrodispersión en función del tiempo para los cuatro lotes diferentes de micropartículas. La lecitina es una mezcla de fosfolípidos de longitudes de cadena diferentes. A medida que la longitud de cadena del ácido graso unido a la fosfocolina aumenta, la magnitud de la retrodispersión se mantiene más durante un periodo de tiempo más largo, indicando un aumento de estabilidad del octafluoropropano en las micropartículas. Utilizando los fosfolípidos altamente purificados también es más efectiva la estabilización del gas en comparación con la mezcla de fosfolípidos contenidos en la lecitina.

Claims (28)

1. Método para la preparación de micropartículas para diagnóstico por imagen, en el que las micropartículas están formadas por un polímero biocompatible y contienen un gas, que comprende

(a)

la incorporación en el polímero de un compuesto hidrofóbico, bien por disolución del polímero y el compuesto hidrofóbico en un disolvente orgánico o fundiendo el polímero con el compuesto hidrofóbico antes de formar las micropartículas, y

(b)

formar las micropartículas o bien por eliminación del disolvente del polímero o enfriando el polímero,

en el que el compuesto hidrofóbico se mezcla con el polímero en la micropartícula en una cantidad efectiva para aumentar la ecogenicidad de la micropartícula en comparación con la ecogenicidad de la micropartícula sin el compuesto hidrofóbico y

en el que el compuesto hidrofóbico se selecciona del grupo formado por ácidos grasos, alcoholes de ácidos grasos, anhídridos de ácidos grasos, hidroxiácidos grasos, prostaglandinas, fosfolípidos, esfingolípidos, colesterol y derivados de esteroides, vitaminas, terpenos, triptófano, tirosina, isoleucina, leucina, valina, alquil paraben, y ácido benzoico.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el compuesto hidrofóbico se incorpora en el polímero en una proporción entre 0,01 y 30 en peso del compuesto hidrofóbico respecto al peso del polímero.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que el compuesto hidrofóbico es un lípido incorporado en el polímero en una proporción entre 0,01 y 30 (peso de lípido/peso de polímero).

4. Método, según la reivindicación 3, en el que el lípido es un fosfolípido seleccionado del grupo formado por ácidos fosfatídicos, fosfatidilcolinas tanto con lípidos saturados como insaturados, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, derivados de lisofosfatidil, cardiolipina, y \beta-acil-y-alquil fosfolípidos.

5. Método, según la reivindicación 4, en el que el fosfolípido se selecciona del grupo formado por dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipenta-decanoilfosfatidilcolina, dilauroilfosfatidilcolina, dipalmitoil-fosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, diaraquidoil-fosfatidilcolina, dibehenoilfosfatidilcolina, ditricosanoil-fosfatidilcolina, dilignoceroilfosfatidilcolina; y fosfatidil-etanolaminas.

6. Método, según la reivindicación 1, en el que el gas se selecciona del grupo formado por gases fluorados, oxígeno, xenón, argón, helio, y aire.

7. Método, según la reivindicación 6, en el que el gas se selecciona del grupo formado por CF_{4}, C_{2}F_{6},C_{3}F_{8}, C_{4}F_{8}, SF_{6}, C_{2}F_{4}, y C_{3}F_{6}.

8. Método, según la reivindicación 8, en el que el gas es octafluoropropano.

9. Método, según la reivindicación 1, en el que la micropartícula está formada por un polímero sintético.

10. Método, según la reivindicación 1, en el que la micropartícula está formada por un polímero natural.

11. Método, según la reivindicación 1, en el que la micropartícula está formada por un polímero bioadhesivo.

12. Método, según la reivindicación 9, en el que la micropartícula está formada por un polímero sintético seleccionado del grupo formado por poli(hidroxiácidos), polianhídridos, poliortoésteres, poliamidas, policarbonatos, tereftalatos de polialquileno, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo, polisiloxanos, acetato de polivinilo, poliestireno, poliuretanos y copolímeros de los mismos, celulosas sintéticas, ácidos poliacrílicos, ácido poli(butírico), ácido poli(valérico), y poli(láctido-co-caprolactona), acetato de etilenvinilo, copolímeros y mezclas de los mismos.

13. Composición para el diagnóstico por imagen que comprende micropartículas poliméricas biocompatibles que incorporan un gas, formadas por las etapas de

(a)

disolución del polímero y un compuesto hidrofóbico en un disolvente orgánico o fusión del polímero y el compuesto hidrofóbico, antes de formar las micropartículas,

(b)

formación de las micropartículas eliminando el disolvente o enfriando el polímero,

en la que el compuesto hidrofóbico se mezcla con el polímero en la micropartícula en una cantidad efectiva para aumentar la ecogenicidad de la micropartícula en comparación con la ecogenicidad de la micropartícula sin el compuesto hidrofóbico, y

en la que el compuesto hidrofóbico se selecciona del grupo formado por ácidos grasos, alcoholes de ácidos grasos, anhídridos de ácidos grasos, hidroxiácidos grasos, prostaglandinas, fosfolípidos, esfingolípidos, colesterol y derivados de esteroides, vitaminas, terpenos, triptófano, tirosina, isoleucina, leucina, valina, alquil paraben, y ácido benzoico.

14. Micropartículas, según la reivindicación 13, en las que el compuesto hidrofóbico se incorpora con el polímero en una proporción entre 0,01 y 30 en peso del compuesto hidrofóbico respecto al peso del polímero.

15. Micropartículas, según la reivindicación 14, en las que el compuesto hidrofóbico es un lípido incorporado con el polímero en una proporción entre 0,01 y 30 (peso de lípido/peso de polímero).

16. Micropartículas, según la reivindicación 13, en las que el lípido es un fosfolípido seleccionado del grupo formado por ácidos fosfatídicos, fosfatidilcolinas tanto con lípidos saturados como insaturados, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, derivados de liso-fosfatidil, cardiolipina, y \beta-acil-y-alquil fosfolípidos.

17. Micropartículas, según la reivindicación 16, en las que el fosfolípido se selecciona del grupo formado por dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipenta-decanoilfosfatidilcolina dilauroilfosfatidilcolina, dipalmitoil-fosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, diaraquidoil-fosfatidilcolina, dibehenoilfosfatidilcolina, ditricosanoil-fosfatidilcolina, dilignoceroilfosfatidilcolina; y fosfatidil-etanolaminas.

18. Micropartículas, según la reivindicación 13, en las que el gas se selecciona del grupo formado por gases fluorados, oxígeno, xenón, argón, helio, y aire.

19. Micropartículas, según la reivindicación 18, en las que el gas se selecciona del grupo formado por CF_{4}, C_{2}F_{6},C_{3}F_{8}, C_{4}F_{8}, SF_{6}, C_{2}F_{4}, y C_{3}F_{6}.

20. Micropartículas, según la reivindicación 19, en las que el gas es octafluoropropano.

21. Micropartículas, según la reivindicación 13, en las que la micropartícula está formada por un polímero sintético.

22. Micropartículas, según la reivindicación 21, en las que el polímero se selecciona del grupo formado por poli(hidroxiácidos), polianhídridos, poliortoésteres, poliamidas, policarbonatos, tereftalatos de polialquileno, alcoholes de polivinilo, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo, polisiloxanos, acetato de poli(vinilo), poliestireno, poliuretanos y copolímeros de los mismos, celulosas sintéticas, ácidos poliacrílicos, ácido poli(butírico), ácido poli(valérico), y poli(láctido-co-caprolactona), acetato de etilenvinilo, copolímeros y mezclas de los mismos.

23. Micropartículas, según la reivindicación 15, en las que el lípido se licua con el polímero para formar las micropartículas.

24. Micropartículas, según la reivindicación 23, en las que el lípido y el polímero se disuelven en un disolvente para formar ambos, entonces, micropartículas.

25. Micropartículas, según la reivindicación 23, en las que el gas se incorpora en la micropartícula una vez el polímero y el lípido se han solidificado.

26. Micropartículas, según la reivindicación 13, en las que el polímero es un polímero natural seleccionado del grupo formado por proteínas y polisacáridos.

27. Método para aumentar la hidrofobicidad de micropartículas formadas por un polímero hidrofóbico biocompatible y que lleva incorporado un agente de visualización gaseoso, que comprende

disolver el polímero y un compuesto hidrofóbico en un disolvente orgánico o fundir el polímero y un compuesto hidrofóbico,

eliminar el disolvente o enfriar el polímero para formar las partículas,

en el que el compuesto hidrofóbico se mezcla con el polímero en la micropartícula en una cantidad efectiva para aumentar la ecogenicidad de la micropartícula en comparación con la ecogenicidad de la micropartícula sin el compuesto hidrofóbico.

28. Método, según la reivindicación 27, en el que el compuesto hidrofóbico se selecciona del grupo formado por ácidos grasos, alcoholes de ácidos grasos, anhídridos de ácidos grasos, hidroxiácidos grasos, prostaglandinas, fosfolípidos, esfingo-lípidos, colesterol y derivados de esteroides, vitaminas, y terpenos.