ES2223392T3 - Un virus recombinante de la enfermedad de newcastle como vacuna embrionaria. - Google Patents

Abstract

Un mutante de NDV que expresa su proteína V en un nivel reducido (NDV V-), caracterizado porque el mutante es fenotípicamente positivo en proteína V y en el que <-6% de su ARNm derivado del gen P en células infectadas codifica el ORF V.

Description

Un virus recombinante de la enfermedad de Newcastle como vacuna embrionaria.

La presente invención se refiere a un mutante del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) que expresa su proteína V en un nivel reducido, a una vacuna que comprende el mutante de NDV y el uso del mutante de NDV para la fabricación de una vacuna para proteger a aves frente a la ND.

La enfermedad de Newcastle (ND) es una de las enfermedades devastadoras para las aves y tiene un impacto económico sustancial en la industria de la avicultura. El NDV es un agente etiológico de esta enfermedad y pertenece a la familia Paramyxoviridiae. La enfermedad de Newcastle se complica ya que los diferentes aislados y cepas del virus pueden inducir una variación sustancial en la gravedad de la enfermedad. En general, cuando más joven es el pollo más aguda y grave es la enfermedad. La infección puede tener lugar por inhalación o ingestión del virus. La forma infecciosa del virus se contagia de un ave a otra.

Para reducir las pérdidas económicas provocadas por la ND en la industria de la avicultura, la vacunación de los pollos, particularmente de aquellos destinados al consumo comercial, se realiza en todo el mundo de forma rutinaria. Algunos ejemplos de cepas de vacunas vivas (lentogénicas) usadas habitualmente contra el NDV son la cepa V4, Hitchner B1, F y La Sota. Sin embargo, estas cepas de vacunas todavía causan reacciones a la vacunación de leves a moderadas, en particular en el tracto respiratorio tras la primera vacunación de aves jóvenes.

Se ha desarrollado cepas de vacunas de NDV suaves que no causan reacciones (respiratorias) a la vacunación tras la administración a aves jóvenes: la Patente de Estados Unidos Nº 5.250.298 (University of Delaware) describe un mutante vivo, adaptado al frío sensible a la temperatura de la cepa Hitchner B1, designada cono CaTs. La Patente de Estados Unidos Nº 5.149.530 (Duphar Int. Res. B.V.) describe una cepa de NDV, designada como NDW, que es un mutante derivado de la cepa Ulster 2C. La Patente de Estados Unidos Nº 5.750.111 (Azko Nobel N.V.) describe una cepa de vacuna suave, designada como la cepa C2, que no induce reacciones adversas en pollos de un día.

Las vacunas de NDV disponibles en la actualidad solo pueden administrarse a pollos eclosionados en el agua de beber, mediante aerosol, gotas oculares o por vías parenterales. Estos métodos de aplicación tienen algunas desventajas, la más importante es que son caros debido al trabajo que se requiere para su aplicación. Recientemente, el uso de vacunas, tales como las vacunas del herpesvirus del pavo y del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa como vacunas embrionarias (Sharma y Burmester, Avian Diseases 26, 134-149, 1982 y Sharma, Avian Diseases 29, 1155-1169, 1985) ha demostrado ser eficaz y económico. Además, se descubrió que la vacunación embrionaria era ventajosa debido a la reducida edad de resistencia a la enfermedad específica y la administración de una dosis uniforme de vacuna en cada huevo usando máquinas semiautomáticas con múltiples cabezales de inyección.

Debe observarse que muchas vacunas usadas habitualmente para la vacunación post-eclosión no pueden usarse para la vacunación in ovo. Los embriones en etapas avanzadas son altamente susceptibles a infección con la mayoría de los virus de vacuna examinados, incluyendo aquellos virus de vacuna que pueden usarse con seguridad en pollos eclosionados de un día. Por consiguiente, las vacunas convencionales deben modificarse para el uso in ovo.

En la actualidad, no hay ninguna vacuna contra la ND adecuada disponible en el mercado que pueda aplicarse in ovo, principalmente debido al alto nivel de mortalidad en embriones asociado incluso con dos las cepas de vacuna contra el NDV disponibles en el mercado más suaves: NDW y C2.

La Patente de Estados Unidos 5.427.791 (Regents of the University of Minnesota) describe el uso de agentes químicos mutagénicos para producir mutantes del NDV de la cepa Hitchner B1 que no son patogénicos para embriones en etapas avanzadas. El tratamiento químico de la cepa B1 con sulfonato de etilmetano (EMS) dio como resultado el virus mutante de NDV-B1-EMS que podía administrarse de forma segura a huevos de pollos en el día 18 de incubación. Sin embargo, tal proceso mutagénico lleva a la introducción de mutaciones aleatorias en el genoma del virus de una forma no controlada y no reproducible. Tales mutaciones aleatorias pueden influir en las propiedades del virus distintas de las relacionadas con la seguridad in ovo, tales como las propiedades relacionadas con la inmunogenicidad. Además, desafortunadamente, cada etapa de pase en el huevo de esta cepa debe realizarse en presencia del agente mutagénico EMS debido a la propiedad del mutante para volver a la cepa B1 que no es segura para los embriones.

Recientemente, la modificación genética de virus de ARN de cadena negativa no segmentada se ha hecho posible por el desarrollo de un proceso denominado "genética inversa" (revisado en Conzelmann, J. Gen. Virology 77 381-389, 1996; Conzelmann, Annu. Rev. Genet. 32 123-162, 1998 y Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 11354-11358, 1996). El sistema de genética inversa establecido que permite la manipulación genética controlada de virus de ARN de cadena negativa tiene aplicaciones potenciales para el desarrollo de nuevas cepas de vacunas.

El NDV es un miembro de la familia Paramyxoviridiae y su genoma de virus de ARN de cadena negativa contiene seis genes que codifican seis proteínas estructurales principales (3' NP-P-M-F-HN-L 5'). Sin embargo, una característica general de los paramyxovirus es la presencia de otras proteínas víricas estructurales o no estructurales resultantes del uso de marcos de lectura alternativos y de la edición de ARN de su gen P (revisado por Kolakofsky et al., J. Virology 72, 891-899, 1998). Como otros paramyxovirus, se ha descubierto que el NDV también edita su gen P insertando uno o dos restos G en el locus de edición (UUUUUCCC). Los tres ARNm codifican la proteína P (no editada), el ORF V (con cambio de marco +1) y el ORF W (con cambio de marco +2) (Steward et al., J. Gen. Virology 74, 2539-2547, 1993). La traducción de los ARNm específicos P, V y W tiene como resultado la expresión de las tres proteínas que tienen la misma mitad N-terminal pero que difieren en sus mitades C-terminales como resultado del uso de distintos marcos de lectura a continuación del locus de edición.

Peeters et al. (J. Virology 73, 5001-5009, 1999) y Römer-Oberdöfer et al. (J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999) describieron la generación de NDV infeccioso totalmente a partir de ADNc mediante el sistema de genética inversa. En Peeters et al. (1999) se demuestra que la virulencia de una cepa de vacuna contra NDV puede aumentarse espectacularmente modificando la secuencia de aminoácidos en el sitio de escisión de la proteína F_{0}. También se sugiere que la eliminación de la expresión de la proteína V del NDV puede tener como resultado un fenotipo atenuado en aves (Peeters et al., 1999, supra).

Es un objeto de la presente invención identificar un mutante de NDV que pueda usarse para la fabricación de una vacuna para la protección de aves frente a la ND que pueda administrarse no sólo a aves jóvenes después de la eclosión, sino que también pueda administrarse de forma segura in ovo.

En este documento se ha identificado un nuevo mutante de NDV que no solo muestra propiedades suaves, atenuadas en pollos jóvenes eclosionados similares a las que muestran las cepas de vacuna suaves disponibles en el mercado NDW y C2, sino que en contraste con las cepas de vacuna NDW y C2, también pueden usarse con seguridad para la vacunación embrionaria.

La invención proporciona un mutante de NDV que expresa su proteína V en un nivel reducido (NDV V^{-}) caracterizado porque el mutante es fenotípicamente positivo en proteína V y en el que \leq 6% de su ARNm derivado del gen P de las células infectadas codifica V ORF.

Se ha descubierto que un mutante de NDV como el definido anteriormente provoca una mortalidad del embrión significativamente menor, incluso si se administra a embriones de 11 días. Esto contrasta con la cepa de vacuna lentogénica precursora de la que se deriva el mutante. Esta cepa de vacuna mata a todos los embriones antes de la eclosión.

Adicionalmente, se descubrió que un mutante de NDV V^{-} no afecta a la probabilidad de eclosionar de los huevos, particularmente de huevos de pollos comerciales y que los pollos eclosionados de huevos vacunados en etapa embrionaria estaban protegidos frente a una infección virulenta de NDV.

Estas propiedades inesperadas combinadas de un mutante de NDV V^{-} hacen a tal mutante especialmente adecuado para la fabricación de una vacuna para la administración in ovo.

Sorprendentemente, se ha descubierto que los mutantes de NDV que no pueden expresar la proteína V generada por técnicas de genética inversa no pueden recuperarse después del pasaje de los sobrenadantes de transfección en huevos de pollo embrionados. La eliminación completa de la expresión de la proteína V de un mutante de NDV no resulta en partículas de virus infeccioso y, por tanto, debe prevenirse.

Por lo tanto, un mutante de NDV de acuerdo con la invención es fenotípicamente positivo pero los ensayos inmunológicos demuestran que el nivel de proteína V producido en una célula infectada es menor en comparación con una célula infectada con el NDV precursor.

La presencia o ausencia (el fenotipo) y nivel relativo de expresión de proteína V en una célula de huésped infectado puede determinarse en un ensayo de fluorescencia inmune (IFT) o por inmunotransferencia usando un antisuero específico de la proteína V frente al extremo C de la proteína V como se describe en este documento.

Un mutante de NDV V^{-} de acuerdo con la invención muestra claramente una edición defectuosa del ARNm del gen P. En comparación con células infectadas con el NDV precursor en las que el ARNm derivado del gen P que codifica V ORF (y W ORF) está presente con una frecuencia de aproximadamente 30% (y 2%), un mutante de NDV V^{-} de acuerdo con la invención edita su gen P con una frecuencia de solo \leq6%.

La presencia relativa de las poblaciones de ARNm derivado del gen P puede determinarse como se describe en el Ejemplo 1. En este respecto, el número de clones usados para la determinación de la frecuencia de edición del ARNm del gen P debe ser al menos de 100, preferiblemente entre 100 y 500. Para un mutante de NDV V^{-} fenotípicamente positivo en proteína P, la edición de V ORF es mayor del 0%.

Preferiblemente, el mutante de NDV V^{-} fenotípicamente positivo en proteína P es un mutante en el que \leq3% y preferiblemente \leq1% de su ARNm derivado del gen P en células infectadas codifica V ORF.

Alternativamente, un NDV V^{-} de acuerdo con la invención también puede definirse por medio del nivel de su frecuencia de edición de V ORF: el mutante de NDV V^{-} de acuerdo con la invención muestra un porcentaje de frecuencia de edición de V ORF (f.e.) de 0 < f.e. \leq 6, preferiblemente 0 < f.e. \leq 3, más preferiblemente 0 < f.e. < 1.

El mutante de NDV V^{-} puede usarse para la fabricación de una vacuna contra la ND para administración in ovo de acuerdo con métodos convencionales como los usados habitualmente para la preparación de vacunas vivas convencionales contra la ND.

En resumen, un sustrato susceptible se inocula con un mutante de NDV V^{-} y se propaga hasta que el virus se replica hasta el nivel deseado después del cual se recoge el material que contiene el NDV. Posteriormente, el material recogido se formula en una preparación farmacéutica con propiedades inmunizantes.

Puede usarse cualquier sustrato capaz de soportar la replicación de virus ND en la presente invención, incluyendo cultivos de células primarias (de aves), tales como células de fibroblasto de embrión de pollo (CEF) o células de riñón de pollo (CK) o líneas celulares de mamíferos tales como la línea celular VERO o la línea celular de riñón de cría de hámster (BHK).

Unos sustratos particularmente adecuados sobre los que puede propagarse el mutante de NDV V^{-} son los huevos embrionados SPF. Los huevos embrionados pueden inocularse con, por ejemplo, 0,2 ml de NDV que contiene fluido alantónico que comprende al menos 10^{20} EID_{50} por huevo. Preferiblemente, se inocula a huevos embrionados de 9-12 días con aproximadamente 10^{5,0} EID_{50} y se incuban posteriormente a 37ºC durante 2-4 días. Después de 2-4 días, el producto del virus ND puede recogerse preferiblemente recogiendo el líquido alantónico. El líquido puede centrifugarse entonces durante 10 minutos a 2500 g seguido de la filtración del sobrenadante a través de un filtro (100 \mum).

La vacuna a usar en la administración in ovo comprende el mutante vivo del virus ND y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente usado habitualmente en tales composiciones. La vacuna puede prepararse y comercializarse en forma de suspensión o en forma liofilizada. Los vehículos incluyen estabilizantes, conservantes y tampones. Los estabilizantes adecuados son, por ejemplo, SPGA, carbohidratos (tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano, glutamato o glucosa), proteínas (tales como suero de leche seco, albúmina o caseína) o productos de degradación de las mismas. Los tampones adecuados son, por ejemplo, fosfatos de metales alcalinos. Algunos conservantes adecuados son timerosal, mertiolato y gentamicina. Los diluyentes incluyen agua, tampón acuoso (tal como solución salina con tampón) y polioles (tal como glicerol).

La vacuna que comprende el mutante de NDV V^{-} puede inyectarse en huevos embrionados de acuerdo con métodos de vacunación in ovo convencionales. Usualmente, la vacuna se inyecta en huevos embrionados durante las etapas avanzadas de formación del embrión, generalmente durante el último cuarto del periodo de incubación (día 15-21), preferiblemente el día 18 del periodo de incubación.

El mecanismo de inyección de los huevos incubados no es particularmente crítico ya que no daña tejidos ni órganos del embrión. Por ejemplo, se realiza un pequeño agujero con una aguja (1-1½ pulgadas, calibre aproximadamente 22) unida a la jeringa en el extremo grande de la cáscara y se inyecta la vacuna por debajo de la membrana interna de la cáscara y de la membrana corioalantónica (Patentes de Estados Unidos 5.458.630, 5.427.791, WO 98/56413 y WO 95/35121). Preferiblemente, todo el proceso de vacunación del embrión se realiza usando sistemas automatizados de vacunación, tales como el sistema Inovoject®, disponible en el mercado.

El mutante de NDV V^{-} usado para la fabricación de la vacuna ND para administración in ovo puede prepararse de acuerdo con el método de genética inversa establecido que ha usado ya para la modificación genética de muchos virus de ARN de cadena negativa no segmentada (véanse referencias anteriores). Adicionalmente, también se ha descrito tal método para NDV en Peeters et al. (1999, supra) y Römer-Oberdöfer et al. (1999, supra).

Típicamente, en primer lugar, un clon de ADNc de longitud completa del genoma de NDV se ensambla (con fragmentos de ADNc solapados) y se clona en un plásmido de trascripción entre a promotor de ARN polimerasa (T7) y un ribozima autocatalítico de virus delta de hepatitis. La transfección de este plásmido en células que expresan ARN polimerasa tiene como resultado la síntesis de ARN NDV antigenoma. La expresión simultánea de plásmidos cotransfectados de las proteínas víricas que se requieren para la replicación y transcripción del virus (proteínas NP, P y L) tiene como resultado la generación del virus infeccioso a partir de ADNc clonado.

Se conocen las secuencias de nucleótidos de todos los genes NDV. La secuencia de nucleótidos del gen P se ha descrito en Ishida et al., NAR 14, 6551-6564, 1986; McGinnes et al., Virology 164, 256-264, 1988; Daskalakis et al., NAR 20, 616, 1992 y Steward et al., J. Gen. Virology 74, 2539-2547, 1993). Varios grupos de investigación han presentado también la secuencia de nucleótidos completa del genoma de NDV (de Leeuw et al., J. Gen. Virology 80, 131-136, 1999, Nº entrada GenBank AF077761; Krishnamurthy et al., J. Gen. Virology 79, 2419-2424, 1998, Phillips et al., Arch. Virol. 143, 1993-2002, 1998, Nº entrada EMBL AJ225127, AH225128 y AJ225129 y Römer-Oberdöfer et al., J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999; Nº entrada EMBL Y18898). La longitud del genoma completo NDV es de 15.186 nucleótidos incluyendo los extremos 3'- y 5'- terminales.

El gen P se localiza en el genoma de NDV en los nucleótidos 1804-3254 (cepa NDV Clone 30®, numeración usada por Römer-Oberdöfer et al., Nº entrada EMBL Y18898; esta numeración se usará en este documento para identificar posiciones en el genoma de NDV). El marco abierto de lectura (ORF) que codifica la proteína P está situado en los nucleótidos 1887-3074. El locus de edición del ARNm del gen P UUU UUC CC (sentido genoma ARN) a mutar que da como resultado el mutante de NDV V^{-} está situado en la posición 2280-2287. Los extremo de los ORF que codifican las proteínas P, V y W están en las posiciones 3074 (TAA), 2605 (TAA) y 2424 (TGA), respectivamente.

La proteína P tiene una longitud de 395 aminoácidos y la mitad N-terminal de la proteína P, que es idéntica a la mitad N-terminal de la proteína V (y proteína W) se extiende del aminoácido 1 al 135. Las mitades C-terminales de las proteínas P y V, es decir, los fragmentos de la proteína P y V que no comparten homología secuencial, se extienden en los aminoácidos 136-395 y 136-239, respectivamente. Debido al cambio de marco (+1) en el extremo del locus de edición durante la transcripción, las mitades C-terminales de la proteína P y V no muestran ninguna similitud.

Preferiblemente, la presente invención proporciona un mutante de NDV V^{-} que expresa su proteína V en un nivel reducido como resultado de una mutación en el locus de edición UUU UUC CC. La alteración de esta secuencia altamente específica tiene como resultado una reducción de la frecuencia de inserción de restos G sin plantilla en el sitio de edición durante la transcripción y, por consiguiente, en una reducción de la expresión de proteína V (y W).

Una mutación se entiende como un cambio en la información genética en el locus de edición del gen P de una cepa NDV precursor que puede expresar una proteína V. La mutación es, en particular, una sustitución de ácido nucleico.

En particular, se introduce una sustitución de ácido nucleico en uno de los codones del locus de edición lo que tiene como resultado en una mutación silenciosa, es decir, una mutación que altera el códon pero no el aminoácido codificado por ese codón. Tal mutación garantiza que el ORF del gen P todavía expresa una proteína funcional P. Los ejemplos de mutaciones silenciosas a el sitio de edición conservado incluyendo un mutación en la posición 3 (UUC UUC CC) o en la posición 6 (UUU UUU CC) o una combinación de ambas mutaciones (UUC UUU CC) están dentro del alcance de esta invención.

Como se demuestra en el Ejemplo 1, las sustituciones de 3 o más nucleótidos y la supresión de nucleótidos tienen como resultado mutantes de NDV que no pueden expresar la proteína V y no pueden recuperarse de los sobrenadantes de transfección. Por lo tanto, la sustitución en el locus de edición de un mutante de NDV de acuerdo con la invención comprende 1 ó 2 nucleótidos. Además, se ha demostrado en el Ejemplo 1 que las mutaciones introducidas en la posición 1-5 implicando 1 ó 2 nucleótidos del locus de edición resultan ventajosamente en un mutante de NDV que puede recuperarse de los sobrenadantes de transfección y muestra una menor expresión V aproximadamente 20 veces menor que la del virus precursor. Además, todos los mutantes tienen una patogenicidad considerablemente atenuada en los embriones de pollo. A la vista de estos descubrimientos, se contempla específicamente un mutante de NDV como el descrito anteriormente con 1 ó 2 mutaciones en la posición 1-5 del locus de edición, preferiblemente en la posición 3 ó 4.

Un ejemplo muy ventajoso de mutante de NDV V^{-} de acuerdo con la invención con una mutación en la posición 3 del locus de edición comprende la secuencia de nucleótidos UUC UUC CC en el locus de edición. Aunque el primer codón del locus de edición de este mutante está cambiado, el aminoácido que contiene este codón permanece igual (resto lisina). Este mutante de NDV V^{-} reduce en gran medida la edición del ARNm del gen P tal y como se demuestra con la reducción (a \leq6%) de ARNm de ORF de V (y W a niveles indetectables). Los mutantes de NDV V^{-} que muestran una reducción similar de edición de ORF V pueden obtenerse también mediante otras sustituciones sencillas de nucleótidos en el locus de edición. En tal mutante de NDV V^{-}, un resto U del locus de edición se sustituye con un resto C, G o A, preferiblemente con un resto C o un resto C del locus de edición se sustituye con un resto U, G o A, preferiblemente un resto U.

Algunos ejemplos ventajosos de tales mutantes de NDV V^{-} son mutantes de NDV que comprenden la secuencia de nucleótidos UCUUUCCC, UUUGUCCC y UUUUCCC en el locus de edición.

Un ejemplo típico de mutante de NDV de acuerdo con la invención que tiene 2 mutaciones en el locus de edición comprende la secuencia de nucleótidos GCUUUCCC.

Las mutaciones deseadas pueden introducirse en el genoma de NDV por medio de métodos conocidos generalmente en la técnica para este propósito. En particular, las mutaciones se introducen por medio de mutagénesis dirigida a sitio. Tal método se describe en este documento, pero también se usa generalmente en la técnica (Peeters et al., 1999, supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F.M. Ausubel et al., Wiley N.Y., 1995 edition, páginas 8.5.1-8.5.9 y Kunkel et al., Methods in Enzymology Vol. 154, 376-282, 1987).

Un mutante de NDV V^{-} particularmente preferido para usarse de acuerdo con la presente invención es un mutante de NDV como se ha descrito anteriormente que comprende otras mutaciones atenuantes. Tales mutantes de NDV pueden derivarse de cualquier cepa de vacuna contra la ND. Algunos ejemplos de tales cepas adecuadas de vacunas contra la ND presentes en vacunas contra la ND disponibles en el mercado son: Clone-30®, La Sota, Hitchner B1, NDW, C2 y AV4, siendo Clone-30® la cepa de vacuna preferida.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna dinámica frente a la NF en aves adecuada para la administración in ovo, caracterizada porque la vacuna comprende un mutante de NDV V^{-} como se ha descrito anteriormente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Típicamente, tal vacuna comprende dosis de 100 \mul o menos, preferiblemente de 50 \mul, por huevo. La administración de la vacuna in ovo en tales volúmenes de dosificación aumenta la probabilidad de eclosión de los embriones vacunados.

En una realización adicional de la presente invención se proporciona una combinación dinámica de vacunas que, además del mutante de NDV V^{-} descrito anteriormente, comprende una cepa de vacuna segura para el embrión de otro patógeno de las aves. La administración combinada de más de una cepa de vacuna es ventajosa por razones económicas, ya que requiere menos inoculaciones de vacuna en el huevo. Además, cuantas menos veces se introduce una aguja en el huevo menor es el riesgo de contaminar el huevo.

La expresión cepa de vacuna segura para el embrión significa una cepa de vacuna dinámica que, si se inocula en huevos SPG el día 18 de formación del embrión, tiene como resultado una probabilidad de eclosión de los huevos de al menos 70%, preferiblemente al menos 90%. En particular, la vacuna de combinación comprende una o más cepas de vacuna seguras para el embrión de virus de la enfermedad de Marek (MDV), virus de la bronquitis infecciosa (IVC), virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), adenovirus de las aves (FAV), virus de la rinotraqueitis del pavo (TRTV) o reovirus. Algunos ejemplos de tales cepas de vacunas seguras para el embrión son las vacunas MDV Ovovac®-HVT y Ovovac®-SB1, las vacunas IBDV Bursamune® y Bursaplex®.

Está claro pues que, debido a las propiedades ventajosas atenuadas del mutante de NDV V^{-} tal y como se muestra en este documento, la vacuna dinámica de acuerdo con la presente invención también puede administrarse a aves después de la eclosión de forma similar a las vacunas vivas contra la ND que se usan habitualmente para prevenir la ND en poblaciones comerciales.

En otra realización de la presente invención se proporciona una vacuna vector que no solo puede usarse para la preparación de una vacuna frente a la infección por un NDV específico sino también frente a otras enfermedades infecciosas de las aves. Por ejemplo, una vacuna vector basada en un mutante de NDV V^{-} como se ha descrito anteriormente ofrece la posibilidad de inmunizar frente a otros patógenos de las aves mediante la expresión de antígenos de estos patógenos aviarios en células infectadas del huésped inmunizado. Tal vector NDV puede obtenerse insertando una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un polipéptido heterólogo en una región no traducida del mutante de NDV V^{-}. Una región no traducida adecuada para este propósito se encuentra entre el promotor genómico y el comienzo del gen NP y en las uniones de los genes NP/P, P/M, M/F, F/HN y HN/L. La secuencia heteróloga de ácido nucleico puede codificar un antígeno de un patógeno aviario tal como el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, virus de la bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, virus de la encefalomielitis aviaria, reovirus aviario, virus de la gripe aviaria, virus de la anemia aviaria, Salmonella spp., E. coli. y Elimeria spp.

El mutante de NDV V^{-} descrito anteriormente también ofrece la posibilidad de preparar una vacuna inactivada con propiedades ventajosas para la administración post-eclosión. Una ventaja importante de tal vacuna inactivada es el alto nivel de anticuerpos protectores de larga duración que pueden conseguirse como resultado de la alta masa antigénica producida por el mutante de NDV V^{-} después de la propagación en huevos embrionados o cultivo celular.

El objetivo de la inactivación de los virus ND recogidos después de la etapa de propagación es eliminar la reproducción de los virus. En general, esto puede conseguirse por medios químicos o físicos. La inactivación química puede efectuarse tratando los virus, por ejemplo, con enzimas, formaldehído, \beta-propiolactona, etilen-imina o un derivado de los mismos. Si es necesario, el compuesto inactivador se neutraliza posteriormente. El material inactivado con formaldehído puede neutralizarse, por ejemplo, con tiosulfato o metabisulfito sódico. La inactivación física puede realizarse sometiendo los virus a radiación rica en energía tal como luz UV, radiación X o radiación \gamma. Si se desea, el pH puede volver a fijarse a un valor de aproximadamente 7 después del tratamiento.

Una vacuna que contiene el virus ND inactivado puede comprender, por ejemplo, uno o más de los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables mencionados anteriormente adecuados para este propósito.

Preferiblemente, una vacuna inactivada de acuerdo con la invención comprende uno o más compuestos con actividad adyuvante. Los compuestos o composiciones adecuadas para este propósito incluyen hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, emulsión de aceite en agua o de agua en aceite basada por ejemplo, en un aceite mineral, tal como Bayol F® o Marcol 52® o en un aceite vegetal tal como acetato de vitamina E y saponinas.

La vacuna de acuerdo con la invención comprende una dosificación eficaz del mutante de NDV V^{-} como componente activo, es decir, una cantidad de material NDV inmunizante que inducirá inmunidad en las aves vacunadas frente a una infección de un virus ND virulento. La inmunidad se define en este documento como la inducción de un nivel de protección significativamente mayor en una población de aves después de la vacunación en comparación con un grupo no vacunado.

Típicamente, la vacuna dinámica de acuerdo con la invención puede administrarse en una dosis de 10^{3,0}-10^{8,0} de dosis de infección en embrión (EID_{50}) por huevo o ave, preferiblemente en una dosis en el intervalo de 10^{4,0}-10^{7,0} EID_{50}, en particular 10^{5,0}-10^{7,0} EID_{50}.

Las vacunas inactivadas pueden contener el equivalente antigénico de 10^{4,0}-10^{9,0} EID_{50} por animal, preferiblemente entre 10^{6,0}-10^{8,0} EID_{50} por animal.

Las vacunas inactivadas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intramuscular o subcutánea.

Aunque la vacuna de acuerdo con la invención puede usarse eficazmente en pollos, otras aves como pavos, gallinas de guinea y perdices pueden vacunarse satisfactoriamente con esta vacuna.

Los NDV también se han descrito como agentes terapéuticos en seres humanos, particularmente en el tratamiento de cáncer en seres humanos (Lorence et al., J. Natl. Cancer Inst. 80, 1305-1312, 1988; Murray et al., Cancer 52, 856-862, 1983; Reichard et al., J. Surg. Res. 52, 448-453, 1992). Como el NDC causa conjuntivitis en seres humanos, se desea una cepa de NDV muy atenuada para propósitos terapéuticos. Por lo tanto, a la vista de las propiedades ventajosas del mutante de NDV V^{-} descrito anteriormente, el mutante de NDV (si se desea, comprendiendo un gen extraño que codifica una proteína terapéutica o profiláctica) puede usarse como agente terapéutico en seres humanos, por ejemplo, en el control de cáncer humano o animal y SIDA.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de un mutante de NDV V^{-} Materiales y métodos

Síntesis de ADNc y ensamblado del clon completo. Los detalles de estos experimentos fueron descritos por Römer-Oberdöfer et al. (1999, supra). La cepa NDV Clone-30® (Intervet International B.V., Holanda) se purificó con 50 ml de líquido alantónico con una titulación de 10^{10} dosis infecciosas de embrión (EID_{50}) por ml. El ARN vírico se aisló por extracción con isotiocianato de guanidinio y posterior centrifugación a través de una base de CsCl. ElADNc a RAN genómico se generó usando Transcriptasa Inversa Rnasa H SuperScript^{TM} II (Gibco). La PCR se realizó en 1 \mul de la primera cepa de ADNc usando el sistema PCR de Expansión de Alta Fidelidad (HF) (Boehringer Mannheim, Alemania). Las secuencias terminales del ARN genómico se determinaron como se ha descrito en Mundt y Mueller (Virology 209 209-219, 1995). Después, los oligonucleótidos específicos de PCR se dedujeron para amplificar la cabeza y la cola. La PCR de estos fragmentos contenía sitios M1uI creados artificialmente (nt 76 en el región no codificante de NP y nt 15.039 en la región no codificante de L) por mutación de cinco nucleótidos (nt 76, 79, 15.039, 15.041 y 15.042). Para la construcción de un plásmido de expresión del antigenoma completo de NDV, los fragmentos de PCR anteriores se clonaron en múltiples etapas entre el promotor de la ARN polimerasa T7 y la secuencia autocatalítica de la ribozima del virus delta de la hepatitis en el sitio Smal del plásmido X8dT (Schenell et al., EMBO J. 13, 4195-4203, 1994). El clon completo resultante se denomina pflNDV.

Construcción de plásmidos de expresión. Para la construcción de los plásmidos de expresión NP, P y L se clonaron marcos abiertos de lectura de NP (nt 122 a 1791), P (nt 1887 a nt 3524) y L (nt 8381 a 15051) en pCite 2a (Novagen). Con este propósito, se generaron fragmentos HF-PCR con el codón de inicio de translación respectivo contenido en un adaptador NcoI o AflIII. Estos fragmentos se traspasaron a un vector pCite 2a en el marco abierto de lectura correcto (Römer-Oberdöfer et al., 1999, supra).

Introducción de mutaciones en el ADNc del NDV completo. Para introducir una mutación atenuante en el genoma del Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV), se usó como base el plásmido pflNDV, que expresa el ARN antigenoma completo de la cepa de la vacuna lentogénica de NDV Clone-30. Como el NDV edita el ARNm de su gen P, insertando restos G sin plantilla, se modificó el sitio de edición (UUUUUCCC) introduciendo 1, 2, 3 ó 6 sustituciones de nucleótidos o supresiones de 6 ó 12 nucleótidos indicados en la Fig. 1. La PCR se realizó con la plantilla pflNDV usando los cebadores respectivos enumerados en la Tabla 1. Después, los productos de PCR se digirieron con AatII/ApaI y se clonaron en los mismos sitios del pflNDV. Para bloquear de forma selectiva la expresión de la única parte C-terminal de la proteína V, se introdujo un codón de parada en el marco trans V sin afectar al marco P. La PCR se realizó y el producto se digirió con ApaI y RsrII y se ligó en el mismo sitio del pflNDV. La región nueva introducida en cada clon se secuenció para descartar los errores introducidos por la PCR. Los clones completos resultantes, con sustituciones o supresiones de nucleótidos en el sitio de edición, o inserción de un codón de parada en el ORF V, se nombraron como se muestra en la Fig. 1.

Tabla 1

Cebadores usados para introducir mutaciones en el clon de ADNc completo pflNDV. Los cambios en los nucleótidos se muestran en negrita. Las secuencias de nucleótidos y posiciones de nucleótidos están de acuerdo con Römer-Oberdöfer et al., J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999; Nº de entrada EMBL Y18898).

1

Generación de virus recombinantes. Se cultivaron aproximadamente 1,5x10^{6} células BSR T7/5 expresando establemente la ARN polimerasa de fago T7 (Bucholz et al., J. Virology 73, 251-259, 1999) durante una noche hasta una confluencia de 90%. Las células se transfectaron con mezclas de plásmidos que contenían 5 \mug de pCite-NP, 2,5 \mug de pCite-P, 2,5 \mug de pCite-L y 10 \mug de uno de los clones completos usando un kit de transfección en mamíferos (protocolo de transfección CaPO_{4}, Stratagene). De tres a cinco días después de la transfección, el sobrenadante se recogió y se inyectó en la cavidad alantónica de huevos de pollo embrionados de 9-11 días (200 \mul por huevo). La presencia del virus en el líquido alantónico se determinó por ensayo de hemaaglutinación (HA) después de 3-4 días de incubación. Se prepararon reservas de virus después de 2-6 pases en huevos embrionados.

RT-PCR. Se preparó ARN total de células BSR T7/5 infectadas después de la infección usando el kit Rneasy (Qiagen). La transcripción inversa con transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviaria se cebó con el oligonucleótidos específico del gen P de NDV P#13 (5'-CCACCCAGGCCACAGACGAAG-3', nucleótidos 2676-2196) usando 1\mug de ARN total. La amplificación del ADN se realizó con el cebador P#13 y P#17 (5'-ATGAATTCAGCTGTTGGA-3', nucleótidos 2680-2696). Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1% y se usaron directamente para el secuenciamiento.

Pases en serie de virus de huevos SPF embrionados. Los virus recombinantes NDV V^{-} se pasaron en serie de dos a nueve veces en huevos SPF embrionados de 9-11 días. Los huevos inoculados se incubaron durante 2-5 días a 37ºC. El líquido alantónico de cada huevo infectado se sometió primero a un ensayo HA convencional y solo se recogió y usó para un pase posterior el líquido alantónico HA-positivo. Las reservas de virus en cada pase se valoraron en huevos SPF embrionados de 9-11 días.

Producción de anticuerpo contra el péptido anti-V. Para detectar la expresión de proteína V en células infectadas, es esencial un suero que reconozca específicamente al extremo C de la proteína V, ya que las proteínas P, V y W son amino-coterminales. Con este propósito, se seleccionó un secuencia antigénica potencial en el único extremo C de la proteína V y se sintetizó un péptido que comprende los 16 aminoácidos del extremo C de la proteína V (posiciones de aminoácidos 224-239). Cinco mg del péptido se conjugaron con una proteína vehículo de hemocianina de lapa californiana (KLH). Se inmunizaron dos conejos con el péptido conjugado con KLH y se reforzaron dos veces después de 2 y 4 semanas. Se recogieron muestras de sangre antes de la primera inyección (pre-inmune) y 2 y 3 meses después.

Inmunotransferencia. Para la purificación del virus, se infectaron huevos de pollo SPF embrionados de 9-11 días y se recogió el líquido alantónico 3-4 días después de la infección. Después, el virus del líquido alantónico se purificó y concentró por centrifugación a través de un colchón de sacarosa al 20% en un rotor Beckman SW28 a 21.000 rpm durante 90 minutos. El gránulo se resuspendió y se mezcló con muestra de proteína para alterar los viriones. Las proteínas víricas de los viriones purificados se resolvieron después con electroforesis en gel de dodecil-sulfato sódico-poliacrilamida, se traspasaron a membranas de PVDF (Millipore) y se incubaron con el suero con péptido anti-V específico de los 16 aminoácidos C-terminales de la proteína V del NDV, cepa Clone-30 o anticuerpo monoclonal (MAb) específico de la proteína NDV^{-}NP. Después, las membranas se incubaron con inmunoglobulina de cabra, anti-conejo o anti-cabra conjugada con peroxidasa. Las proteínas se visualizaron después de la incubación con sustrato de peroxidasa (Vector).

Análisis por inmunofluorescencia de la expresión de la proteína V. Para el análisis de la proteína de expresión vírica, se infectaron células BSR-T7 con una multiplicidad de infección (moi) de \sim10 con distintos niveles de pase de NDV V^{-} o virus precursor y se incubaron durante 1-2 días. Las células infectadas se fijaron con etanol frío (96%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBS, las células se incubaron con suero de conejo con péptido anti-V (suero recogido después de 3 meses de la primera inmunización) durante 1 hora a 37ºC. Las células infectadas paralelamente se incubaron con MAbs reaccionando con proteína F o NP de NDV o con un suero policlonal de pollo que reconoce distintas proteínas del NDV. Las células se lavaron y pigmentaron con anticuerpo anti-conejo, anti-pollo o anti-ratón conjugado con FITC y se examinó por microscopia de fluorescencia.

Determinación de la frecuencia de edición del ARNm del gen P. El ARN total aislado de células infectadas con FINDV y pases en serie de mutante de NDV V^{-} P1 se somete a transcripción inversa usando un cebador oligo(dT) para amplificar solo los ARNm. Después se realiza la PCR con los cebadores P#17 (NDV V^{-}EcoRI 2680 5'-ATG AAT TCA GCT GTT CGA-3') y P#13 (NDV P+2176 5'-CGA CCC AGG CCA CAG ACG AAG-3'). El fragmento PCR se digirió con EcoRV y SalI y se ligó en el mismo sitio del vector pSKT7T. Los plásmidos clonados se secuenciaron con colonias independientes y se examinaron para detectar la presencia o ausencia de inserciones de un resto G sin plantilla en el sitio de edición (Tabla 2).

Resultados Recuperación de NDV sin edición del ARNm del gen P de clones de ADNc

Para alterar la edición de ARNm del gen P conservada o bloquear selectivamente la expresión de la parte C-terminal de la proteína V, se realizaron las modificaciones mostradas en la Fig. 1 sobre el clon completo de ADNc (pflINDV) de NDV, cepa Clone-30. Cada clon completo de ADNc, junto con tres plásmidos de soporte que expresaban las proteínas NDV, NP, P y L se transfectó en células BSR-T7/5. Los experimentos de transfección también se realizaron con el ADNc completo no modificado, pflNDV, para comparar las eficacias en la recuperación. Después de 3-5 días de incubación, los sobrenadantes se recogieron y las células transfectadas se sometieron a pigmentación con inmunofluorescencia (IF) usando MAb anti-F. Se detectaron al menos 20-50 células IF-positivas en todos los experimentos de transfección que implicaban pflNDV o clones completos, mostrando que hubo replicación del genoma y expresión de las proteínas víricas en el cultivo celular.

Los huevos de pollo SPF embrionados, que se conocen desde hace tiempo como los mejores sustratos para la propagación de NDV lentogénicos (Nagai et al., Virology 72, 494-508, 1976), se inocularon con sobrenadantes de transfección. Después de 3-4 días de incubación, se recogieron muestras del líquido alantónico y se sometieron a un ensayo de HA. Se detectó HA en algunos de los huevos inoculados con el sobrenadante de células transfectadas con el pflNDV. Sin embargo, se necesito de 1 a 2 pases extra adicionales para detectar los virus modificados que contenían una o dos sustituciones de nucleótidos en el sitio de edición (NDV-P1, NDV-PG2, NDV-PC4, NDV-PG5 y NDV-PCG12) usando el ensayo HA.

Sorprendentemente, no se detectaron virus infecciosos en el líquido alantónico de huevos embrionados inoculados con sobrenadantes de transfección obtenidos de mutantes por supresión (NDV-\Delta6 y NDV-\Delta12), mutantes que tienen tres o más sustituciones de nucleótidos (NDV-PA, NDV-PD, NDV-PR, NDV-PRR) o en el mutante que carece de la parte C-terminal de la proteína V (NDV-Vparada). A pesar de los tres experimentos de recuperación repetidos y cuatro pasajes satisfactorios en cada experimento, no se pudo detectar virus infecciosos en el líquido alantónico de huevos embrionados.

Los mutantes para los cuales fue posible la recuperación, se sometieron a pases en serie de 2 a 6 veces en huevos embrionados de 9-11 días.

Expresión de la proteína V. Para determinar la presencia o ausencia de expresión de proteína V, se infectaron células BSR-T7 con distintos mutantes (NDV-P1, NDV-PG2, NDV-PC4, NDV-PG5 y NDV-PCG12) o el virus precursor y se realizó un análisis de inmunofluorescencia o aislamiento de ARN. Usando un suero de pollo anti-NDV o MAbs en reacción con NDV F o NP, el nivel y el patrón de fluorescencia en células infectadas con uno de los mutantes o con el virus precursor eran indistinguibles. Por el contrario, el suero con péptido anti-V reaccionó con alta intensidad de fluorescencia sólo con células infectadas con el FINDV. Una concentración similar del suero reveló una señal de fluorescencia específica pero muy débil, que era compatible con los mutantes y un mayor pase de NDV P1 (niveles de pase 5-9), indicando niveles igualmente bajos de expresión V en todos los mutantes examinados. Esto indicó que, a pesar de la interrupción del estrechamiento U en el locus de edición, la edición de ARN y por tanto la expresión de la proteína V no se suprime completamente en los virus mutantes, incluyendo el nivel de pasaje 6 de P1 que previamente no mostraba ARNm de ORF V entre los 39 clones de ARNm examinados. Por tanto, se escogió el mutante de NDV P1 para análisis posteriores.

La proteína V es un componente estructural del NDV, por lo tanto tenía interés para determinar si el bajo nivel de expresión V en células infectadas conduciría a un bajo nivel de incorporación de V en viriones. De esta forma, los viriones de NDV P1 purificados y concentrados con sacarosa al 20% se sometieron a experimentos de inmunotransferencia. Usando MAb específico de NP, que reacciona con la proteína NP de ambos virus con igual intensidad, fue posible estandarizar la cantidad de proteína cargada en el gel (Fig. 2). Aunque se sometieron cantidades comparables de virus precursor y proteínas P1 del mutante de NDV V^{-} al análisis por transferencia Western, el contenido en proteína V del mutante de NDV V^{-} fue considerablemente menor que el del virus precursor, demostrando un bajo nivel de incorporación de proteína V en los viriones de NDV V^{-}. El análisis de las muestras diluidas por transferencia Western reveló que el contenido en proteína V de los viriones NDV V^{-} era aproximadamente 20 veces menor que el del virus precursor.

La secuencia alrededor del locus de edición del ARNm del gen P del NDV V^{-} se determinó con un total de 319 colonias independientes de plásmidos derivados de niveles de pasaje 5 a 9 (Tabla 2). Como comparación, se secuenciaron un total de 41 colonias independientes para FlNDV y 28 de 41 (68,3%) de los plásmidos secuenciados codificaban la versión no editada de la proteína P. Los plásmidos que codificaban la proteína V con inserción de un resto G no templated eran 12 de 21 (29,3%). Solo un plásmido de 41 tenía una inserción de dos restos G no templated (Tabla 2). Por el contrario, de un total de 319 colonias independientes secuenciadas del mutante de NDV V^{-} P1, solo cuatro plásmidos contenían una inserción de resto G no templado que conducía a V-ORF. Los plásmidos que codifican V en los niveles de pasaje 6, 8 y 9 tienen una única inserción G, mientras que el plásmido del nivel 7 tenía una inserción de cuatro restos G, lo que también daría como resultado la expresión de la proteína V. En conjunto, estos resultados muestran que la sustitución realizada en el sitio de edición de ARN no bloqueaba completamente la edición del ARNm del gen P, sino que reducía dramáticamente la frecuencia de edición del ARN. En comparación con el virus precursor, el virus NDV V^{-} edita su ARNm del gen P con una frecuencia 10-20 veces menor y por tanto sintetiza la proteína V en un nivel correspondientemente bajo.

TABLA 2 Determinación de la frecuencia de edición del ARNm del gen P del mutante de NDV V^{-} P1

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Ejemplo 2 Experimentos in vivo con el mutante de NDV V^{-}: vacunación de embriones de pollo SPF Materiales y métodos

Titulación de virus en huevos en periodo de formación de embrión. Se realizó una dilución de 10 veces en seria y se inocularon dos grupos de huevos en periodo de formación de embrión de 11 días con las diluciones en serie. Se realizó un ensayo HA en un grupo de huevos inoculados después de 4 días de incubación y la titulación, expresada como dosis de infección del 50% de embriones (EID_{50}), se calculó usando el método de Reed y Muench (Am.J.Hyg. 27, 493-497, 1938). Se observó diariamente la mortalidad del otro grupo de huevos inoculados y se determinó la dosis letal para el 50% de embriones (ELD_{50}) usando el mismo método.

Vacunación in ovo y estimulación. Se inocularon huevos fertilizados de dieciocho días de pollos SPF a través de un agujero realizado en el extremo romo del huevo. Usando una aguja 23G, se inyectaron 0,1 ml de la dilución del virus o de líquido alantónico negativo justo por debajo de la membrana de aire. Se registró la tasa de eclosión y se observó diariamente a todos los pollos para controlar el estado de salud general. A los 14 días, todos los pollos se pesaron y se les tomó muestras de sangre. Las muestras de suero se examinaron para detectar la presencia/ausencia de anticuerpos de NDV en el ensayo convencional de hemaaglutinación de NDV. A los 14 días (\sim17 días después de la vacunación) a todos los animales se les inyectó intramuscularmente NDV virulento, cepa Herts. Los pollos se observaron a diario durante un periodo de 10 días para detectar la ocurrencia de signos clínicos de enfermedad o mortalidad.

Resultados

Patogeneidad de NDV V^{-}. Los NDV aislados varían en su virulencia en huevos en periodo de formación del embrión así como en pollos. El grado de virulencia de un NDV aislado dado puede medirse evaluando la patogeneidad del virus in vivo. Uno de estos métodos implica calcular el tiempo medio de muerte (MDT) de embriones de pollo de 10-12 días infectados con una dosis mínima letal del virus. El MDT de algunas cepas bien caracterizadas de NDV varía de 48 horas en algunas cepas velogénicas y algunas cepas mesogénicas a 160 horas en cepas lentogénicas (la mayoría de las cepas de vacunas). Con el propósito de determinar la dosis media letal para embriones de los mutantes de NDV V^{-}, se inocularon diluciones del virus 10 veces en serie en huevos en periodo de formación de embrión de 11 días y se incubaron durante 7 días. Sorprendentemente, no se detectó mortalidad específica de embrión durante la observación en los grupos inoculados con NDV P1 y NDV PC4 (Tabla 3), mostrando que estos mutantes de NDV V^{-} son seguros para embriones de pollo incluso cuando se inoculan a los 11 días de edad y en una mayor dosis (Tabla 3). Hasta nuestro conocimiento, son los primeros ejemplos de cepas de NDV que no causan mortalidad en embriones.

Un segundo grupo de mutantes consistentes en PG2, PG5 y PCG12 causan un bajo nivel de mortalidad en embriones en condiciones similares, pero todavía tienen una patogeneicidad espectacularmente reducida en embriones de pollo. La diferencia entre la EID_{50} y la ELD_{50} de estos mutantes es al menos 4,8 log_{10}, en comparación con 0,3 log_{10} del virus precursor, mostrando que están atenuados al menos 30.000 veces más que sus virus precursores (Tabla 4).

TABLA 3 Determinación de mortalidad en embriones después de inoculación de NDV P1 o NDV P4 en huevos de pollos SPF embrionados de 11 días durante 7 días de incubación

3

TABLA 4 Diferencia entre EID_{50}y ELD_{50} de los mutantes de NDV

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Probabilidad de eclosión con NDV V^{-} cuando se aplica in ovo . En la actualidad no hay ninguna vacuna dinámica contra la ND que pueda aplicarse in ovo, principalmente debido a la alta mortalidad embrionaria y muy baja probabilidad de eclosión aún con las cepas de NDV altamente atenuadas. Como se ha descubierto que los mutantes de NDV V^{-} P1 y PC4 no son patogénicos en embriones cuando se aplican el día 11 de la formación de embrión, se realizó un experimento de vacunación embrionaria en huevos en periodo de formación de embrión de 18 días usando el mutantes de NDV V^{-} P1 y NDW (Poulvac NDW®, una vacuna dinámica posteclosión disponible en el mercado, Fort Dodge, USA). Se descubrió que la probabilidad de eclosión alcanzaba 93% (28 de 30) para NDV V^{-} en comparación con el 96% (29 de 30) del grupo de control (Tabla 5). La menor tasa de eclosión (23%) se obtuvo con el grupo de huevos inoculados con NDW, una de las vacunas vivas más atenuadas. Este resultado muestra que el mutante de NDV V^{-} no afecta de forma significativa a la tasa de eclosión.

NDV V^{-} protege a los pollos frente a una infección letal. A las dos semanas de edad, se tomó muestras de sangre de todos los pollos eclosionados de los huevos inoculados in ovo, se pesaron y se les infectó con la cepa Herts de NDV por inoculación intramuscular (Tabla 5). Los pollos vacunados como embriones con NDV V^{-} desarrollaron altos niveles de anticuerpos y tuvieron una ganancia media de peso de 131 g en comparación con 85 g de los animales inoculados con NDW y 141 g de los animales de control. Interesantemente, más del 95% de los animales vacunados con NDV V^{-} estaban protegidos frente a la exposición a la infección mientras que todos los pollos no vacunados murieron. Estos datos muestran que el mutante de NDV V es seguro y eficaz cuando se aplica a huevos en periodo de formación de embrión de 18 días originados en pollos SPF.

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A: Titulación de inhibición de hemaaglutinación (HI) (2 log) a las 2 semanas

B: Los pollos se infectaron con cepa Herts de NDV 10^{5,5} ELD_{50}/pollo intramuscular

Nd: No realizado

Ejemplo 3 Experimentos in vivo con el mutante de NDV V^{-} P1: vacunación de embriones comerciales de pollos Materiales y métodos

Vacunación in ovo y estimulación. Este experimento en embriones comerciales de pollo, con anticuerpos derivados por vía materna, se realizó esencialmente como se describe para el experimento in ovo en embriones de pollos SPF. En resumen, se asignó un total de 120 huevos de pollos comerciales fertilizados de 18 días a cuatro grupos de 30 huevos cada uno. Se aplicó NDV V^{-} in ovo en tres dosis distintas a tres grupos distintos. Un grupo de 30 huevos se inoculó con líquido alantónico negativo. A los 14 días de edad (\sim17 días después de la vacunación) todos los animales fueron infectados intramuscularmente con NDV virulento, cepa Herts. Se observó a los pollos diariamente durante un periodo de 10 días para detectar la ocurrencia de signos de enfermedad o mortalidad. Justo antes de la infección, se tomaron muestras de sangre de todos los pollos vacunados y de control de forma individual. Las muestras de suero se examinaron para detectar anticuerpos contra NDV mediante un ensayo HI.

Resultados

Tasa de eclosión y ganancia de peso en pollos vacunados con NDV V^{-}. De forma similar a los resultados obtenidos en huevos de pollos SPF, la tasa de eclosión de huevos de pollos comerciales no se vio afectada por la administración in ovo de NDV V^{-} (Tabla 6). Todos los pollos eclosionados estaban sanos en todos los grupos antes de la infección. Además, la ganancia en peso de todos los grupos de pollos vacunados con NDV V^{-} fue comparable a la del grupo de control negativo, lo que demuestra la seguridad de NDV cuando se administra in ovo en huevos de pollos comerciales en proceso de formación de embrión de 18 días.

Seroconversión y protección frente a una estimulación letal. El nivel de respuesta de anticuerpos y de protección en pollos vacunados como embriones con NDV V^{-} se muestra en la Tabla 6. El grupo que recibió la mayor dosis tenía una titulación HI media de 1,8 y el 85% de los pollos de este grupo estaban protegidos frente a la infección. La capacidad de NDV V^{-} para superar el nivel presumiblemente alto de anticuerpo maternal en el momento de la aplicación y conferir protección al 85% de los pollos es destacable. Como el nivel de protección depende de la dosis, se espera que una dosis ligeramente mayor proteja a más del 90% de los pollos vacunados.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Leyenda de la figura Figura 1

Introducción de mutaciones en el locus de edición del gen P del genoma del virus de la enfermedad de Newcastle. Se muestra una representación esquemática del orden de los genes del NDV en el ARN genómico de cadena negativa. Las secuencias alrededor del sitio de edición (posición 2274-2300) se presentan en sentido positivo. Las modificaciones se muestran en cajas. Los cambios de aminoácidos como resultado de las distintas modificaciones se muestran en negrita. Las secuencias de nucleótidos y posiciones de nucleótidos están de acuerdo con Römer-Oberdöfer et al., J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999; Nº entrada EMBL Y18898).

Figura 2

Proteínas NP y V de virus recombinantes purificados en sacarosa. Los viriones en el líquido alantónico de huevos embrionados infectados se purificaron por centrifugación en sacarosa al 20% y las proteínas víricas se sometieron a análisis por inmunotransferencia. Los volúmenes cargados en el gel se normalizaron de acuerdo con el contenido de NP. Las muestran se cargaron por duplicado y las transferencias se incubaron con MAb anti-NP (bandas 1-3) o con suero con péptido anti-V (bandas 4-6). AF: líquido alantónico de huevos embrionados no infectados; P1: mutante de NDV V^{-} P1; rNDV: el virus FlNDV precursor.

Claims (17)

1. Un mutante de NDV que expresa su proteína V en un nivel reducido (NDV V^{-}), caracterizado porque el mutante es fenotípicamente positivo en proteína V y en el que \leq6% de su ARNm derivado del gen P en células infectadas codifica el ORF V.

2. Un mutante de NDV de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque \leq3%, más preferiblemente \leq1% de su ARNm derivado del gen P en células infectadas codifica el ORF V.

3. Un mutante de NDV de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el locus de edición del ARNm del gen fosfoproteína (P) UUU UUC CC (sentido ARN genoma) comprende una mutación para reducir la edición.

4. Un mutante de NDV de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la mutación en el locus de edición es una sustitución de nucleótidos.

5. Un mutante de NDV de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la mutación es una mutación silenciosa.

6. Un mutante de NDV de acuerdo con las reivindicaciones 3-5, caracterizado porque la mutación comprende 1 ó 2 nucleótidos, preferiblemente 1 nucleótido.

7. Un mutante de NDV de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el mutante comprende una mutación en la posición 1-5 del locus de edición.

8. Un mutante de NDV de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el mutante comprende una mutación en la posición 3 ó 4 del locus de edición, preferiblemente en la posición 3.

9. Un mutante de NDV de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del locus de edición del mutante de NDV es UUC UUC CC o UUUGUCCC.

10. Un mutante de NDV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el mutante del NDV comprende mutaciones atenuantes adicionales.

11. Un mutante del NDV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el mutante comprende adicionalmente un gen heterólogo que codifica un antígeno de un patógeno aviario.

12. Una vacuna dinámica contra la enfermedad de Newcastle en aves, caracterizada porque comprende un mutante del NDV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y una vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Una vacuna dinámica contra la enfermedad de Newcastle en aves para administración in ovo caracterizada porque comprende un mutante de NDV como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una vacuna dinámica de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13 caracterizada porque la vacuna comprende dosis de 100 \mul o menos, preferiblemente 50 \mul por huevo.

15. Una vacuna dinámica de acuerdo con las reivindicaciones 12-14 caracterizada porque la vacuna comprende adicionalmente una cepa de vacuna segura para el embrión de otro patógeno aviario.

16. Una vacuna inactivada contra la enfermedad de Newcastle en aves, caracterizada porque la vacuna comprende un mutante del NDV inactivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un adyuvante.

17. El uso de un mutante del NDV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para la fabricación de una vacuna para la protección de aves contra la ND para administración in ovo.