ES2223464T3 - Compuestos adyuvantes inmunologicos. - Google Patents
Compuestos adyuvantes inmunologicos.Info
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Abstract
Un compuesto de la **fórmula** en la que: R1 se selecciona del grupo que consiste en (a) C(O); (b) C(O)-alquil(de 1 a 14 átomos de carbono)- C(O), en donde dicho alquilo de 1 a 14 átomos de carbono está opcionalmente substituido con hidroxi, alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquilendioxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino o alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo, en donde dicho resto arilo de dicho alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo está opcionalmente substituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)- amino, alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono)- amino, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino- alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O- alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino- alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O- alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)- alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)OH, -O- alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)- alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)- alquilo(de 1 a 5 átomos de carbono); (c) alquilo de cadena lineal o ramificada de 2 a 15 átomos de carbono opcionalmente substituido con hidroxi o alcoxi; y (d) -C(O)-arilen(de 6 a 12 átomos de carbono)- C(O)- en donde dicho arileno está opcionalmente substituido con hidroxi, halógeno, nitro o amino.
Description
Compuestos adyuvantes inmunológicos.
Las vacunas han resultado ser métodos altamente
aceptables satisfactorios para la prevención de enfermedades
infecciosas. Son económicas y no inducen resistencia antibiótica al
patógeno elegido o afectan a la flora normal presente en el
paciente. En muchos casos, tales como cuando se induce inmunidad
antiviral, las vacunas pueden prevenir una enfermedad para la que no
existen tratamientos curativos o mejoradores viables
disponibles.
Las vacunas funcionan activando el sistema
inmunitario para montar una respuesta a un agente, o antígeno,
típicamente un organismo infeccioso o una porción del mismo que se
introduce en el cuerpo en una forma infecciosa o no patógena. Una
vez que el sistema inmunitario ha sido "cebado" o sensibilizado
al organismo, la exposición ulterior del sistema inmunitario a este
organismo como un patógeno infeccioso da como resultado una
respuesta inmuntaria rápida y robusta que destruye el patógeno antes
de que pueda multiplicarse e infectar suficientes células en el
organismo del paciente para provocar síntomas de enfermedad.
El agente, o antígeno, usado para cebar el
sistema inmunitario puede ser todo el organismo en un estado menos
infeccioso, conocido como un organismo atenuado, o, en algunos
casos, componentes del organismo tales como carbohidratos, proteínas
o péptidos que representan diversos componentes estructurales del
organismo.
En muchos casos, es necesario mejorar la
respuesta inmunitaria a los antígenos presentes en una vacuna para
estimular el sistema inmunitario en una extensión suficiente para
hacer una vacuna eficaz, es decir, para conferir inmunidad. Muchos
antígenos proteínicos y la mayoría de los peptídicos y de
carbohidrato, administrados solos, no provocan una respuesta
anticorporal suficiente para conferir inmunidad. Tales antígenos
necesitan presentarse al sistema inmunitario de tal modo que serán
reconocidos como extraños y provocarán una respuesta inmunitaria. A
este fin, se han ideado aditivos (adyuvantes) que inmovilizan
antígenos y estimulan la respuesta inmunitaria.
El adyuvante más conocido, el adyuvante completo
de Freund, consiste en una mezcla de micobacterias en una emulsión
de aceite/agua. El adyuvante de Freund funciona de dos modos: en
primer lugar, mejorando la inmunidad mediada por células y
humoralmente, y, en segundo lugar, bloqueando la dispersión rápida
de la activación del antígeno (el "efecto depósito"). Sin
embargo, debido a las frecuentes reacciones fisiológicas e
inmunológicas tóxicas para este material, el adyuvante de Freund no
puede usarse en seres humanos. Otra molécula que se ha observado que
tiene actividad inmunoestimulante o adyuvante es la endotoxina,
también conocida como lipopolisacárido (LPS). El LPS estimula el
sistema inmunitario poniendo en marcha una respuesta inmunitaria
"innata" -una respuesta que se ha producido para permitir que
un organismo reconozca la endotoxina (y la bacteria invasora de la
que es un componente) sin la necesidad de que el organismo se haya
expuesto previamente. Aunque el LPS es demasiado tóxico para ser un
adyuvante viable, moléculas que están estructuralmente relacionadas
con la endotoxina, tales como monofosforil-lípido A
("MPL") se están probando como adyuvantes en experimentos
clínicos. Actualmente, sin embargo, el único adyuvante aprobado por
la FDA para usar en seres humanos son las sales de aluminio
(alumbre) que se usan para "depositar" antígenos mediante la
precipitación de los antígenos. El alumbre también estimula la
respuesta inmunitaria a antígenos.
Así, existe una necesidad reconocida en la
técnica de compuestos que puedan co-administrarse
con antígenos para estimular el sistema inmunitario para generar una
respuesta anticorporal más robusta al antígeno de la que se
observaría si el antígeno se inyectara solo o con alumbre.
Inoue K y otros; (1967) [Chem. Phys. Lipids 1967;
Vol. 1(4) pp. 360-7], Inoue K y otros: (1968)
[Chemical And Parmaceutical Bulletin. Vol. 16, Nº. 1, pp.
76-81] e Inoue K y otros: (1969) [Chem. Phys.
Lipids; Vol. 3 (1) pp. 70-7] describen la síntesis y
el estudio inmunológico de derivados de cardiolipina. Duralski y
otros, (1998) [Tetrahedron Letters, Vol. 39 (12) pp.
1607-1610] describen cardiolipinas marcadas
isotópicamente.
En un aspecto, la presente invención se dirige a
nuevos compuestos que funcionan como adyuvantes inmunológicos cuando
se co-administran con antígenos tales como vacunas
para enfermedades bacterianas y virales.
En un segundo aspecto, la presente invención se
dirige a nuevas formulaciones de adyuvante que comprenden al menos
uno de los compuestos adyuvantes de la invención.
En un tercer aspecto, la invención se dirige a
nuevas composiciones inmunoestimulantes que comprenden un antígeno y
al menos uno de los compuestos adyuvantes de la invención.
En otro aspecto, la presente invención se dirige
a métodos para la inmunización de un animal mediante la
co-administración de un compuesto de la invención
con un antígeno contra el que el animal ha de inmunizarse.
La figura 1 es una gráfica que muestra los
resultados de un ensayo in vitro para la inducción de
citoquina liberada por los compuestos 100, 184 ó 186 de la
invención.
La figura 2 es una gráfica que muestra la
estimulación de la expresión de fosfatasa alcalina a partir de un
constructo informador inducible con el promotor de TNF
(TNF-PLAP) en células THP-1 mediante
los compuestos 106 y 126 en ausencia y presencia de 10% de
suero.
La figura 3 es una gráfica que muestra la
estimulación de la liberación de IL-10 a partir de
esplenocitos de ratón normales por los compuestos 104, 106, 124,
126, 160 y 162 de la invención.
La figura 4 es una gráfica que muestra la
estimulación de la liberación de interferón gamma a partir de
esplenocitos de ratón normales por los compuestos 104, 106, 124,
126, 160 y 162 de la invención.
La figura 5 es una gráfica que ilustra los
resultados del análisis de valoración del suero para determinar las
cantidades de anticuerpo que se producen en respuesta a hemocianina
de lapa de ojo de cerradura en ausencia y presencia de los
compuestos 100, 124 y 126 de la invención.
La figura 6 es una gráfica que ilustra los
resultados del análisis de valoración del suero para determinar
cantidades de anticuerpo producidas en respuesta a toxoide del
tétanos en ausencia y presencia de los compuestos 100, 116, 126, 160
y 184 de la invención.
La presente invención se dirige en parte a nuevos
compuestos de fórmula 1
en la
que:
- \quad
- R^{1} se selecciona del grupo que consiste en
- (a)
- C(O);
- (b)
- C(O)-alquil(de 1 a 14 átomos de carbono)-C(O), en donde dicho alquilo de 1 a 14 átomos de carbono está opcionalmente substituido con hidroxi, alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquilendioxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino o alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo, en donde dicho resto arilo de dicho alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo está opcionalmente substituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino, alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)OH, -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)-alquilo(de 1 a 5 átomos de carbono);
- (c)
- alquilo de cadena lineal o ramificada de 2 a 15 átomos de carbono opcionalmente substituido con hidroxi o alcoxi; y
- (d)
- -C(O)-arilen(de 6 a 12 átomos de carbono)-C(O)- en donde dicho arileno está opcionalmente substituido con hidroxi, halógeno, nitro o amino;
- \quad
- a y b son independientemente 0, 1, 2, 3 ó 4;
- \quad
- d, d', d'', e, e' y e'' son independientemente un número enero de 1 a 4;
- \quad
- X^{1}, X^{2}, Y^{1} e Y^{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en nada, oxígeno, NH y N(C(O)-alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono)) y N(alquilo de 1 a 4 átomos de carbono)_{2};
- \quad
- W^{1} y W^{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en carbonilo, metileno, sulfona y sulfóxido;
- \quad
- R^{2} y R^{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
- (a)
- alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi,
- (b)
- alquenilo o dialquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi;
- (c)
- alcoxi de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi;
- (d)
- -NH-(alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono), en donde dicho grupo alquilo está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi; y
- (e)
- en donde Z se selecciona del grupo que consiste en O y NH, y M y N se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alcoxi, aciloxi, alquilamino y acilamino de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; R^{3} y R^{6} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo o alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono opcionalmente substituido con oxo o fluoro;
- \quad
- R^{4} y R^{7} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en C(O)-(alquilo o alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono); alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; alcoxi de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; en donde dichos grupos alquilo, alquenilo o alcoxi pueden estar substituidos independientemente y opcionalmente con hidroxi, fluoro o alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono;
- \quad
- G^{1}, G^{2}, G^{3} y G^{4} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxígeno, metileno, amino, tiol, -NHC(O)- y -N(C(O)alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono))-;
- \quad
- o G^{2}R^{4} o G^{4}R^{7} pueden ser juntos un átomo de hidrógeno o hidroxilo;
- \quad
- o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
La presente invención también abarca
formulaciones de adyuvante inmunológico que comprenden un compuesto
de fórmula 1
en la
que:
- \quad
- R^{1} se selecciona del grupo que consiste en
- (a)
- C(O);
- (b)
- C(O)-alquil(de 1 a 14 átomos de carbono)-C(O), en donde dicho alquilo de 1 a 14 átomos de carbono está opcionalmente substituido con hidroxi, alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquilendioxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino o alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo, en donde dicho resto arilo de dicho alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo está opcionalmente substituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino, alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)OH, -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)-alquilo(de 1 a 5 átomos de carbono);
- (c)
- alquilo de cadena lineal o ramificada de 2 a 15 átomos de carbono opcionalmente substituido con hidroxi o alcoxi; y
- (d)
- -C(O)-arilen(de 6 a 12 átomos de carbono)-C(O)- en donde dicho arileno está opcionalmente substituido con hidroxi, halógeno, nitro o amino;
- \quad
- a y b son independientemente 0, 1, 2, 3 ó 4
- \quad
- d, d', d'', e, e' y e'' son independientemente un número enero de 1 a 4;
- \quad
- X^{1}, X^{2}, Y^{1} e Y^{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en nada, oxígeno, NH y N(C(O)-alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono)) y N(alquilo de 1 a 4 átomos de carbono)_{2};
- \quad
- W^{1} y W^{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en carbonilo, metileno, sulfona y sulfóxido;
- \quad
- R^{2} y R^{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
- (a)
- alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi,
- (b)
- alquenilo o dialquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi;
- (c)
- alcoxi de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi;
- (d)
- -NH-(alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono), en donde dicho grupo alquilo está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi; y
- (e)
- en donde Z se selecciona del grupo que consiste en O y NH, y M y N se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alcoxi, aciloxi, alquilamino y acilamino de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; R^{3} y R^{6} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo o alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono opcionalmente substituido con oxo o fluoro;
- \quad
- R^{4} y R^{7} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en C(O)-(alquilo o alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono); alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; alcoxi de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; en donde dichos grupos alquilo, alquenilo o alcoxi pueden estar substituidos independientemente y opcionalmente con hidroxi, fluoro o alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono;
- \quad
- G^{1}, G^{2}, G^{3} y G^{4} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxígeno, metileno, amino, tiol, -NHC(O)- y -N(C(O)alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono))-;
- \quad
- o G^{2}R^{4} o G^{4}R^{7} pueden ser juntos un átomo de hidrógeno o hidroxilo;
- \quad
- o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
- \quad
- y al menos un componente adicional.
En compuestos preferidos de la invención, está
presente uno o más de lo siguiente: cada uno de a y b es 2; cada uno
de X^{1} e Y^{1} es NH; R^{1} es C(O) o
C(O)-alquil(de 1 a 14 átomos de
carbono)-C(O); cada uno de d' y e' es 1; cada
uno de d'' y e'' es 1; X es O o NH, más preferiblemente NH; y W es
C(O); o cada uno de d' y e' son 2.
En modalidades preferidas adicionales, R' es un
C(O)-alquil(de 1 a 14 átomos de
carbono)-C(O), en donde dicho alquilo de 1 a
14 átomos de carbono está substituido, por ejemplo con un grupo
alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono.
En una modalidad más preferida, la invención se
dirige a los compuestos ER 803022, ER 803058, ER 803732, ER 804053,
ER 804057, ER 804058, ER 804059, ER 804442, ER 804680 y ER 804764, y
a composiciones que contienen estos compuestos.
La invención también se dirige a nuevas
composiciones inmunoestimulantes que incluyen un antígeno y una
formulación de adyuvante inmunológico de la invención según se
describe previamente.
También se proporcionan métodos para la
inmunización de un animal mediante la
co-administración de un compuesto de la invención o
una formulación de adyuvante de la invención con un antígeno contra
el cual ha de inmunizarse el animal.
Carbonilo, según se usa aquí, es un resto
(C=O).
Dicarbonilo, según se usa aquí, es un resto con
la estructura (C=O)-alquil-(C=O) o
(C=O)-aril-(C=O), que está unido a una molécula a
través de los átomos de carbono de ambos restos carbonilo
terminales.
Oxo, según se usa aquí, es un grupo =O.
Éster alquílico, según se usa aquí, es un resto
con la estructura O-(C=O)-alquilo, que está unido a
una molécula a través del oxígeno no unido con doble enlace del
grupo éster.
Éster alquenílico, según se usa aquí, es un resto
con la estructura O-(C=O)-cadena carbonada, donde la
cadena carbonada contiene un doble enlace
carbono-carbono, que está unido a la molécula a
través del oxígeno no unido con doble enlace del grupo éster.
El término "alquileno" significa un grupo
hidrocarbúrico de alquilo de cadena lineal o ramificado
bivalente.
El término "alquenileno" significa un grupo
hidrocarbúrico de cadena lineal o ramificado bivalente que tiene un
solo doble enlace carbono-carbono.
El término "dialquenileno" significa un
grupo hidrocarbúrico de cadena lineal o cadena ramificada insaturado
bivalente que tiene dos dobles enlaces
carbono-carbono.
El término "arileno" se refiere a un grupo
aromático bivalente.
La abreviatura "Boc", según se usa aquí,
significa t-butiloxicarbonilo.
Según se usa aquí con referencia a compuestos y
composiciones de la invención, el término "tipo 1" se refiere a
los compuestos de la invención correspondientes a la fórmula I
previa donde los valores de a y b son iguales; los valores de d y e
son iguales; los valores de d' y e' son iguales; los valores de d''
y e'' son iguales; X^{1} e Y^{1} son iguales; X^{2} e Y^{2}
son iguales; W^{1} y W^{2} son iguales; R^{2} y R^{5} son
iguales; G^{1} y G^{3} son iguales; R^{3} y R^{6} son
iguales; G^{2} y G^{4} son iguales; y R^{4} y R^{7} son
iguales. "Tipo 2", según se usa aquí, se refiere a compuestos o
composiciones correspondientes a la fórmula I donde se aplica uno
cualquiera o más de los siguientes: los valores de a y b son
diferentes; los valores de d y e son diferentes; los valores de d' y
e' son diferentes; los valores de d'' y e'' son iguales; X^{1} e
Y^{1} son diferentes; X^{2} e Y^{2} son diferentes; W^{1} y
W^{2} son diferentes; R^{2} y R^{5} son diferentes; G^{1} y
G^{3} son diferentes; R^{3} y R^{6} son diferentes; o R^{4}
y R^{7} son diferentes.
En el caso de un conflicto en la terminología, la
presente memoria descriptiva es determinate.
En general, un
2-amino-1,3-dihidroxipropano
o (\pm)-serinol se transforma en el
2-azido-compuesto mediante la
reacción con trifluorometanosulfonil-azida seguido
por protección como el peracetato para una manipulación fácil. El
compuesto resultante se desacetila, seguido por la reacción con un
alcohol primario apropiadamente activado de un resto diol. El resto
alcohol primario del producto de esta reacción se protege a
continuación, por ejemplo usando TBDPSCl, seguido por la reacción
con fosgeno y a continuación alcohol alílico, para dar un diol
completamente protegido. El diol protegido se trata a continuación
para disociar el grupo protector del alcohol primario. El alcohol
desprotegido se hace reaccionar con un agente de fosforilación
apropiadamente funcionalizado con la fórmula (11) según se indica en
los Ejemplos, para formar un compuesto de éster de fosfato. El resto
azido del producto se reduce y a continuación se hace reaccionar con
un acil-ácido activado para formar una amida. La amina terminal
protegida en el fosfato funcionalizado se desprotege y
subsiguientemente se hace reaccionar con un fosgeno o un ácido
dicarboxílico en presencia de un agente deshidratante, tal como EDC.
Los grupos fosfato del compuesto resultante se desprotegen a
continuación, dando una amida racémica.
En general, un éster de aminoácido quiral con la
estructura deseada se protege con un éster de benzimidato. El
compuesto protegido se hace reaccionar con un agente reductor, por
ejemplo DIBAL o similares, para reducir el resto ácido del
aminoácido hasta un alcohol. El compuesto alcohólico resultante se
hace reaccionar con un alcohol primario apropiadamente activado de
un resto diol, seguido por la disociación del grupo protector
benzimidato. El diol se hace reaccionar a continuación con un
cloruro de ácido apropiado para dar una diolamida.
La diolamida se hace reaccionar a continuación
con un agente de fosforilación apropiadamente funcioncionalizado en
el grupo hidroxilo primario libre. El compuesto resultante se
esterifica en el grupo alcohol secundario con un resto acilo
apropiado. El grupo N-BOC se disocia a continuación
del grupo amino introducido por el reactivo de fosforilación (11),
dando un compuesto de éster de fosfato con una amina primaria libre.
Este producto se hace reaccionar a continuación con fosgeno o un
ácido dicarboxílico en presencia de un agente deshidratante, para
dar un producto de diamida. Los grupos fosfato protegidos del
producto de diamida se desprotegen a continuación, típicamente con
paladio(0) y fenilsilano.
Los compuestos de diamida quirales de Tipo 2 se
sintetizan esencialmente como se describe para compuestos de diamida
quirales de Tipo 1, hasta el punto justo después de la disociación
del grupo protector del grupo amina primaria del compuesto de éster
de fosfato. En este punto, un ácido dicarboxílico que tiene uno de
los restos ácidos protegido se hace reaccionar con el grupo amina
primaria, para dar una monoamida. El grupo protector del otro ácido
carboxílico se disocia a continuación, proporcionando un ácido
carboxílico libre que puede hacerse reaccionar a continuación con
una amina primaria a partir de un sistema de fosfato apropiadamente
substituido alternativo, en presencia de un agente deshidratante
para dar una diamida de Tipo 2, que a continuación puede tratarse
para desproteger el grupo o los grupos fosfato para dar un compuesto
deseado de la invención.
En el caso especial de compuestos de urea
quirales de Tipo 2 de la invención, el grupo amino primario del
grupo N-BOC-amino del éster de
fosfato se desprotege y a continuación se hace reaccionar con
cloroformiato de triclorometilo o similares, para formar un
compuesto de isocianato. El isocianato se hace reaccionar a
continuación con una amina primaria a partir de un sistema de
fosfato apropiadamente substituido alternativo para dar un producto
de urea de tipo 2. El producto puede tratarse a continuación para
desproteger el grupo o los grupos fosfato.
Estos compuestos de la invención tienen un resto
éster ligado al carbono que es beta con respecto a un grupo fosfato,
en lugar de un resto amida.
En general, estos compuestos se preparan mediante
la eterificación de un glicerol quiral protegido con un alcohol
primario activado de un resto diol, seguido por la esterificación
del resto alcohol secundario y la desprotección subsiguiente del
resto glicerol, para dar un nuevo diol. El grupo hidroxilo primario
del diol se protege a continuación y el grupo hidroxilo secundario
se condensa con un resto acilo para dar un diéster. El hidroxilo
primario se desprotege, seguido por esterificación con un agente de
fosforilación, del que el compuesto (11) ulterior es ejemplar.
Después de la desprotección del grupo amina introducido por el
agente de fosforilación, el producto se hace reaccionar con fosgeno
o un ácido dicarboxílico usando un agente deshidratante tal como
EDC. La desprotección subsiguiente de los grupos fosfato da
compuestos de la invención.
En la síntesis descrita generalmente previamente,
el substituyente en R^{1} de los compuestos de la invención puede
variarse fácilmente utilizando diferentes compuestos de ácido
dicarboxílico. Tales ácidos pueden acoplarse al grupo amina del
producto intermedio de éster de fosfato del esquema de reacción
esbozado previamente, usando un agente deshidratante tal como EDC o
activando el ácido dicarboxílico sintetizando, por ejemplo, el
cloruro de diácido correspondiente.
Los substituyentes representados por las
variables R^{2} y R^{5} en la fórmula I previa pueden variarse
fácilmente utilizando un ácido o cloruro de ácido activado apropiado
en la reacción de amidación o esterificación del heteroátomo
representado por X o Y en la fórmula I. Los substituyentes
representados por las variables R^{3} y R^{6} de fórmula I
pueden variarse usando un producto intermedio que contiene el número
deseado de átomos de carbono que también contiene una funcionalidad
de carbono activado, por ejemplo un halógeno o sulfonato
(OSO_{2}CH_{3}, OSO_{2}CF_{3},
OSO_{2}CH_{2}C_{6}H_{4}-p-CH_{3})
que puede hacerse reaccionar con los materiales de partida de
azidodiol, aminoalcohol o glicerol.
Los substituyentes representados por las
variables R^{4} y R^{7} en la fórmula I anterior pueden variarse
usando un ácido o cloruro de ácido activado apropiado en la
esterificación del grupo hidroxilo secundario usado en los esquemas
de reacción esbozados previamente.
Los valores de a y b en los compuestos de fórmula
I pueden variarse usando el aminoalcohol protegido con
N-BOC apropiado cuando se sintetiza el reactivo de
fosforilación, ejemplificado por el compuesto (11) ulterior. Los
valores de las variables d y e en los compuestos de fórmula I pueden
modificarse usando los materiales de partida de
2-aminodiol o 2-hidroxidiol
apropiados.
La presente invención también se dirige a
formulaciones de adyuvante que comprenden compuestos adyuvantes de
la invención, así como formulaciones de vacunas y otras
formulaciones inmunoestimulantes que comprenden los compuestos
adyuvantes de la invención. Los métodos para la estimulación de una
respuesta inmunitaria a un antígeno particular también están dentro
del alcance de la invención.
Los animales huésped a los que se administran
útilmente las formulaciones de vacuna que contienen adyuvantes de la
presente invención incluyen el ser humano así como mamíferos no
humanos, peces, reptiles, etc.
Típicamente, un antígeno se emplea mezclado con
los compuestos adyuvantes de la invención. En otras formulaciones
del adyuvante de la presente invención, puede ser útil en algunas
aplicaciones emplear un antígeno conectado covalentemente a un resto
amino, carboxilo, hidroxilo y/o fosfato de los compuestos adyuvantes
de la invención. La formulación específica de composiciones
terapéuticamente eficaces de la presente invención puede llevarse a
cabo así de cualquier manera adecuada que haga al adyuvante
biodisponible, seguro y eficaz en el sujeto al que se administra la
formulación.
La invención contempla ampliamente formulaciones
terapéuticas de adyuvante que, por ejemplo, pueden comprender (i) al
menos un antígeno o una vacuna terapéuticamente eficaz y (ii) al
menos un compuesto adyuvante de acuerdo con la invención.
Tal composición terapéutica puede comprender, por
ejemplo, al menos un agente antigénico seleccionado del grupo que
consiste en:
- (A)
- virus, bacterias, micoplasmas, hongos y protozoos vivos, muertos por calor o atenuados químicamente;
- (B)
- fragmentos, extractos, subunidades, metabolitos y constructos recombinantes de (A);
- (C)
- fragmentos, subunidades, metabolitos y constructos recombinantes de proteínas y glicoproteínas de mamífero;
- (D)
- antígenos específicos de tumores; y
- (E)
- vacunas de ácido nucleico.
La composición terapéutica puede utilizar por lo
tanto cualquier componente de antígeno o vacuna en combinación con
un compuesto adyuvante de la invención, por ejemplo un agente
antigénico seleccionado del grupo que consiste en antígenos de
organismos patógenos y no patógenos, virus y hongos, en combinación
con un compuesto adyuvante de la invención.
Como un ejemplo adicional, tales composiciones
terapéuticas pueden comprender adecuadamente proteínas, péptidos,
antígenos y vacunas que son farmacológicamente activos para estados
y condiciones patológicas tales como viruela, fiebre amarilla,
moquillo, cólera, peste aviar, escarlatina, difteria, tétanos, tos
ferina, influenza, rabia, paperas, sarampión, fiebre aftosa y
poliomielitis. En la formulación de vacuna resultante, que comprende
(i) un antígeno y (ii) al menos un compuesto adyuvante de la
invención, el antígeno y el compuesto adyuvante están presentes cada
uno en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria
cuando la formulación se administra a un animal, embrión o huevo
huésped vacunado con la misma.
En modalidades adicionales, los compuestos de la
invención pueden estar unidos covalentemente a antígenos vacunales,
por ejemplo a través de un resto amino, carbonilo, hidroxilo o
fosfato. Los métodos para conectar las composiciones de adyuvante de
la invención a antígenos vacunales son entendidos por personas de
experiencia normal en la técnica a la vista de esta descripción. Las
composiciones de adyuvante pueden conectarse a vacunas mediante
cualquiera de los métodos descritos en Hoffman y otros, Biol.
Chem. Hoppe-Sayler, 1989,
370:575-582; K.-H. Wiesmuller y otros,
Vaccine, 1989, 7:29-33; K.-H
Wiesmuller y otros, Int. J. Peptide Protein Res.,
1992, 40:255-260; J.-P. Defourt y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. 1992,
89:3879-3883; T. Tohokuni y otros, J. Am. Chem.
Soc., 1994, 116:395-396; F. Reichel,
Chem. Commun., 1997, 2087-2088; H.
Kamitakahara, Angew. Chem. Int. Ed. 1998,
37:1524-1528; W. Dullenkopf y otros, Chem. Eur.
J., 1999, 5:2432-2438.
Las formulaciones de vacuna resultantes, que
incluyen (i) un antígeno y (ii) un compuesto adyuvante, se emplean
útilmente para inducir una respuesta inmunitaria en un animal,
administrando a tal animal la formulación de vacuna, en una cantidad
suficiente para producir una respuesta anticorporal en tal
animal.
Los modos de administración pueden comprender el
uso de cualesquiera medios y/o métodos para aportar el adyuvante, la
vacuna que contiene adyuvante o el adyuvante y/o el antígeno a uno o
más lugares corporales del animal huésped donde el adyuvante y los
antígenos asociados son inmunoestimulantemente eficaces. Los modos
de aporte pueden incluir, sin limitación, métodos de administración
parenteral, tales como administración por inyección subcutánea (SC),
transcutánea, intranasal (IN), oftálmica, transdérmica,
intramuscular (IM), intradérmica (ID), intraperitoneal (IP),
intravaginal, pulmonar y rectal, así como administración no
parenteral, por ejemplo oral.
El grado de dosis y las formas de dosificación
adecuadas para las composiciones de adyuvante y vacuna de la
presente invención pueden ser fácilmente determinados por los
expertos normales en la técnica sin experimentación excesiva,
mediante el uso de técnicas de determinación de valoración de
anticuerpos convencionales y procedimientos de
bioeficacia/biocompatibilidad convencionales, y dependiendo del
antígeno o el agente terapéutico particular empleado con el
adyuvante, el efecto terapéutico deseado y el espacio de tiempo de
bioactividad deseado.
El adyuvante de la presente invención puede
administrarse útilmente al animal huésped con cualesquiera otros
agentes farmacológicamente o fisiológicamente activos adecuados, por
ejemplo substancias antigénicas y/u otras substancias biológicamente
activas.
Las formulaciones de la invención pueden incluir
componentes adicionales tales como solución salina, aceite,
escualeno, dispersiones de aceite-agua, liposomas y
otros adyuvantes tales como QS-21, péptidos
muramílicos, adyuvante incompleto de Freund y similares.
Todos los productos de reacción de los métodos
sintéticos descritos más adelante dan espectros de NMR y perfiles de
cromatografía en capa fina sobre gel de sílice satisfactorios. Toda
la cromatografía se realizó sobre gel de sílice y la elución se
controló mediante cromatografía en capa fina. Todas las reacciones
completadas se determinaron mediante análisis cromatográfico en capa
fina. Todas las reacciones se efectuaron bajo nitrógeno a
temperatura ambiente a no ser que se especifique otra cosa. Todos
los disolventes de reacción eran anhidros a no ser que se apunte
otra cosa. El tratamiento típico de las reacciones químicas
descritas más adelante incluye lavados acuosos, secado sobre sulfato
sódico anhidro y retirada de disolvente bajo presión reducida.
Se añadieron 300 ml de cloruro de metileno a una
solución de azida sódica (107,67 g) en 250 ml de agua. La mezcla se
enfrió hasta 0ºC y se añadió gota a gota anhídrido
trifluorometanosulfónico (57 ml) a una velocidad de 0,32 ml/minuto.
La mezcla se agitó durante 6 horas adicionales a 0ºC y se almacenó a
-20ºC durante 72 horas. La mezcla se calentó hasta 10ºC, seguido por
extracción con cloruro de metileno en un embudo separador de
Teflon®. Las capas orgánicas combinadas se secaron (sulfato
magnésico). La suspensión previa se filtró lentamente en una
solución agitada de
(\pm)-2-amino-1,3-dihidroxipropano
(1) (9,89 g) en metanol (200 ml) y
4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP, 54
g) a 10ºC. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 27
horas a temperatura ambiente.
El disolvente se retiró bajo presión reducida y
el residuo se disolvió en piridina (200 ml) y se enfrió hasta 0ºC.
Se añadió gota a gota anhídrido acético (50 ml) y la mezcla se agitó
durante 20 horas a temperatura ambiente. Se añadió anhídrido acético
adicional (20 ml) y, después de 4 horas, la mezcla se vertió sobre
hielo y se trató de la manera habitual. La cromatografía daba 16 g
del diacetato (2) como un aceite.
El diacetato (2) (16 g) se disolvió en metanol
(150 ml) y se añadió lentamente sodio metálico (2,0 g). La mezcla se
agitó durante 90 minutos y se añadió resina Dowex®
50-8 hasta que el pH era menor que o igual a 2. La
mezcla se filtró, seguido por concentración del filtrado y
cromatografía para dar 6,73 g del diol (3).
Se añadió gota a gota el
azido-diol (3) (6,73 g) en THF (100 ml) a una
suspensión de hidruro sódico (1,24 g de una dispersión en aceite al
60% lavada tres veces con hexanos y secada bajo nitrógeno) en
dimetilformamida (DMF, 200 ml), seguido por la adición gota a gota
de
3-R-hidroxi-1-O-tosil-1-decanol
(4) (tosilato, 9,44 g) en THF (100 ml). La mezcla se agitó durante
16 horas, se diluyó con metanol (200 ml), se agitó con Amberlite®
125 H^{+} durante 25 minutos y se concentró hasta sequedad. La
cromatografía daba 4,37 g de (5).
Se añadieron trietilamina (TEA, 6 ml) y DMAP
(traza) a una solución del diol (5) (5,32 g) en cloruro de metileno
(30 ml), seguido por cloruro de t-butildifenilsililo
(TBDPSCl, 5 ml) y la mezcla se agitó durante la noche. La mezcla se
trató como es habitual. La cromatografía daba 3,6 g del alcohol
secundario (6) como un aceite.
Se añadió piridina (1,8 ml) a una solución del
alcohol secundario (6) (2,95 g) en tolueno (300 ml), seguido por una
adición lenta de fosgeno (4,5 ml de una solución 1,93 M en tolueno)
a 0ºC. Después de agitar a 0ºC durante 20 minutos, se añadió gota a
gota alcohol alílico (3,1 ml). Después de una agitación adicional
durante 60 minutos a temperatura ambiente, la reacción se trató del
modo habitual. La cromatografía daba 3,24 g de alcohol protegido (7)
como un aceite.
Se añadió ácido fluorhídrico (HF, 4 ml) en
acetonitrilo (12 ml) a una solución de alcohol protegido (7) (1,29
g) en cloruro de metileno (3 ml). La mezcla se agitó durante la
noche y se trató del modo habitual. La cromatografía daba 150 mg del
alcohol (8) como un aceite.
Se añadieron tetrazol (74 mg) y el reactivo de
fosforilación (11) (175 mg) a una solución del alcohol (8) (150 mg)
en cloruro de metileno (0,6 ml). Después de 30 minutos, se añadió a
la mezcla de reacción enfriada oxona (323 mg) en una solución de THF
(0,5 ml)-agua (0,5 ml) enfriada. Después de 3 horas,
la reacción se trató del modo habitual. La cromatografía daba 242 mg
de (9) como un aceite.
Para elaborar el reactivo de fosforilación 11, se
añadió tetrazol (4,51 g) a temperatura ambiente a una solución de
diisopropilamina destilada (9,0 ml) en cloruro de metileno, seguido
por agitación durante 1,5 horas. Se añadió gota a gota
fosforodiamidita de alilo (10) (20,5 ml) a una velocidad de 6,5
ml/hora seguido por agitación durante 3 horas adicionales. Se añadió
gota a gota
N-Boc-2-aminoetanol
(10,36 g) en cloruro de metileno (50 ml) a la mezcla de reacción
previa a una velocidad de 8,4 ml/hora, seguido por agitación durante
18 horas adicionales. La suspensión blanca se filtró a través de
Celite 545 con dos lavados de 20 ml con cloruro de metileno. El
filtrado se concentró, seguido por la suspensión y la filtración del
residuo con hexanos (200 ml). El filtrado de hexanos resultante se
concentró hasta sequedad y se azeotropizó con dos porciones de 10 ml
de tolueno para proporcionar el producto (11) en bruto (21,54 g)
como un aceite.
Se añadió tiofenol (400 \mul) a una suspensión
de ditiofenol-estaño (1,3 g) en cloruro de metileno
(7,8 ml), seguido por TEA (543 \mul). La mezcla de reacción se
agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido por detener
la agitación y dejar que el residuo sedimentara hasta el fondo del
matraz. Se añadieron 1,0 ml de la solución previa a una solución de
la azida (9) (242 mg) en cloruro de metileno (0,5 ml) y se dejó
agitar durante 30 minutos. La extinción con NaOH 0,1 N seguida por
el tratamiento habitual producían 193,1 mg de la amina (12) como un
aceite.
Se añadió hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDC, 93 mg) a una solución agitada de la amina (12) (193 mg) y
acil-ácido (que puede elaborarse de acuerdo con la Patente de EE.UU.
Nº 5.530.113 de Chirst y otros) (132 mg) en cloruro de metileno.
Después de agitar a temperatura ambiente durante 90 minutos, la
reacción se extinguió y se procesó del modo habitual para
proporcionar 232 mg del fosfato protegido (13) como un aceite.
Se añadieron trietilsilano (TES, 120 \mul) y
ácido trifluoroacético (TFA, 1,2 ml) a una solución del fosfato
protegido (13) (232 mg) en cloruro de metileno (1 ml), seguido por
agitación durante 30 minutos. El TFA se retiró bajo presión
reducida, seguido por azeotropización con 3 porciones de 5 ml de
tolueno. Se añadieron 20 ml de cloruro de metileno y la mezcla se
trató de la manera habitual para dar 174 mg de amina libre (14) como
un aceite.
Se añadieron ácido succínico (12,1 mg) y EDC (59
mg) a una solución secada de la amina libre (14) (174 mg) en cloruro
de metileno (0,5 ml). La cromatografía daba 143,1 mg de difosfato
bloqueado (15) como un aceite.
Se añadió en primer lugar fenilsilano
(PhSiH_{3}, 50 \mul) y a continuación
tetraquis-trifenilfosfina-paladio
(0) (Pd(PPH_{3})_{4}, 70 mg) a una solución de
difosfato bloqueado (15) (177,9 mg) en cloroformo desgasificado (1,7
ml) en una cámara seca. Después de 1 hora, la reacción se retiró de
la cámara y se añadieron cloroformo:metanol:agua 2:3:1 y la mezcla
se agitó durante 1 hora, se vertió sobre una columna cromatográfica
de dietilaminoetilcelulosa (DEAE). La elución de la columna con un
gradiente lineal de acetato amónico de 0,0 M a 0,1 M en
cloroformo:metanol:agua 2:3:1, la extracción de las fracciones
deseadas con un volumen igual de cloroformo, la concentración hasta
sequedad y la adición de NaOH 0,1 N (175 \mul) seguido por
liofilización daban 136,2 mg de (16) como un sólido blanco.
Se añadió cloruro de metileno (200 ml) a una
solución enfriada de carbonato potásico (165 g) en agua (575 ml),
seguido por hidrocloruro de benzimidato de etilo (17) (100 g),
momento después de lo cual la mezcla se agitó durante 8 minutos. Las
capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con cloruro de
metileno. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron y el
disolvente se retiró bajo presión reducida para dar 83 g de
(18).
Se añadió benzimidato de etilo (18) (36 g) a una
solución de hidrocloruro de éster metílico de
L-serina (19) (41,6 g) en
1,2-dicloroetano (450 ml). La mezcla se calentó
hasta reflujo durante 20 horas, se enfrió, se filtró a través de
tierra diatomácea y se concentró hasta sequedad para dar 56 g de
éster etílico (21) como un sólido blanco.
Se añadió gota a gota hidruro de
diisobutilaluminio (DIBAL, 545 ml de una solución 1 M en hexano) a
una solución enfriada con hielo del éster etílico (21) (56 g) en THF
(500 ml). La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente
durante la noche y a continuación se vertió cuidadosamente sobre una
solución acuosa de sal de Rochelle (500 g en 1,0 l de agua). La
mezcla se agitó durante 1 hora y se trató de la manera habitual. La
cromatografía daba 25,5 g del alcohol (22) como un sólido
blanco.
Se añadió el alcohol (22) (24 g) en 250 ml de THF
a una suspensión de hidruro sódico lavado (5,3 g de una dispersión
en aceite al 60%) en DMF (200 ml). Después de 30 minutos, el
tosilato (4) se añadió en 250 ml de THF durante 2,5 horas y se agitó
durante la noche. La mezcla se enfrió en hielo, se añadió metanol,
el disolvente se retiró bajo presión reducida y se cromatografió
para dar 4,32 g del alcohol (24) como un aceite.
El alcohol (24) (4,3 g) se disolvió en ácido
clorhídrico acuoso 4 N y se calentó hasta reflujo durante 20 horas.
La mezcla se enfrió, se filtró, se extrajo con éter, se basificó con
hidróxido sódico y se extrajo dos veces con cloroformo. Las capas de
cloroformo combinadas se secaron y el disolvente se retiró para 2,88
g del diol (25) como un aceite.
El diol (25) (2,88 g) se disolvió en bicarbonato
sódico acuoso saturado (45 ml) y THF (25 ml) y se dejó agitar
durante 5 minutos. Se añadió gota a gota cloruro de miristoílo (3,4
ml) durante un período de 25 minutos, momento después de lo cual la
mezcla de reacción se dejó agitar durante una hora adicional. La
reacción se trató de la manera habitual y se cromatografió para dar
3,07 g del alcohol (26) como un aceite.
Se añadió tetrazol (683 mg) a una solución del
alcohol (26) (1,78 g) en cloruro de metileno (140 ml), seguido por
el reactivo de fosforilación (11) (1,6 ml). Después de 30 minutos,
la mezcla se enfrió en hielo y se añadió THF (105 ml) seguido por
una solución de oxona (3 g en 90 ml de agua). Después de 5 minutos,
el baño de hielo se retiró y la mezcla se agitó durante 30 minutos.
La reacción se trató de la manera habitual y se cromatografió para
dar 2,99 g del alcohol (27) como un aceite.
Se añadieron EDC (10,8 g), DMAP (66 mg) y ácido
dodecílico (1,62 g) a una solución del alcohol (27) (3,9 g) en
cloruro de metileno (126 ml) y se agitó durante la noche. Se
añadieron ácido (1,6 g), EDC (1 g) y DMAP (0,5 g) adicionales.
Después de 3 horas, la reacción se trató de la manera habitual y se
cromatografió para dar 2,07 g de la amina protegida por
N-BOC (28).
Se añadieron TES (240 \mul) y TFA (300 \mul)
a una solución de la amina protegida por N-BOC (28)
(187,3 mg) en cloruro de metileno (1,5 ml) y la mezcla se agitó
durante 45 minutos. Se añadió tolueno y el disolvente se retiró bajo
presión reducida. El residuo se disolvió en cloruro de metileno y se
trató de la manera habitual para dar 154 mg de la amina (29) como un
aceite.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió EDC (27 mg) a una solución enfriada con
hielo de la amina (29) (75,6 mg) y ácido malónico (4,8 mg) en
cloruro de metileno (0,5 ml), seguido por la retirada del baño de
enfriamiento. Después de 1 hora, se añadió una traza de DMAP.
Después de 25 horas, la mezcla se cromatografió directamente para
dar 54,1 mg del producto dímero (30).
Se añadieron PhSiH_{3} (14 \mul) y
Pd(PPH_{3})_{4} (18 mg) a una solución del dímero
(30) (54 mg) en cloroformo desgasificado (2 ml), seguido por la
retirada del baño de enfriamiento. Después de 1 hora, la reacción se
extinguió con cloroformo:metanol:agua (2:3:1) y se vertió en una
columna cromatográfica de DEAE-celulosa y se
cromatografió para dar un semisólido. El sólido se disolvió en agua
estéril y se añadió hidróxido sódico acuoso 0,1 N (306 \mul) y la
mezcla se liofilizó para dar un sólido blanco (31) (25 mg).
Se añadió benzimidato de etilo (20) (24 g) a una
solución de hidrocloruro de éster metílico de
D-serina (32) (25 g) en dicloroetano (270 ml).
Después de 20 horas a reflujo, la mezcla se enfrió hasta temperatura
ambiente, se filtró a través de tierra diatomácea y el disolvente se
retiró bajo presión reducida para dar 34 g del éster metílico (33)
como un sólido blanco.
Se añadió gota a gota una solución de DIBAL en
hexano (1,0 M, 322 ml) a una solución enfriada con hielo del éster
metílico (33) (34 g) en THF (300 ml). La mezcla se dejó calentar
hasta temperatura ambiente durante la noche y a continuación se
vertió cuidadosamente en una solución acuosa de sal de Rochelle. La
mezcla se agitó a continuación durante 1 hora y se trató. La
cromatografía daba 18,6 g del alcohol (36) como un sólido
blanco.
Se añadió una solución del alcohol (36) (8,6 g)
en THF (40 ml) a una suspensión de hidruro sódico lavado (4 g de una
suspensión en aceite al 60%) en DMF (100 ml). La mezcla se agitó
durante 1 hora y se añadió una solución en tosilato (23) (17,5 g) en
THF (40 ml). La mezcla se agitó durante la noche y a continuación se
añadió tosilato (23) adicional (5 g) y se agitó durante otras 4
horas. Se añadió metanol a la mezcla de reacción enfriada, el
disolvente se retiró bajo presión reducida y el residuo se
cromatografió para dar 1,03 g del alcohol (37) como un sólido.
El alcohol (37) (1,03 g) se disolvió en ácido
clorhídrico acuoso 4 N (25 ml) y la mezcla se calentó hasta 100ºC
durante 20 horas. Se añadió ácido clorhídrico adicional (5 ml) y el
reflujo continuó durante 6 horas. La mezcla se enfrió, se lavó con
éter, se basificó con hidróxido sódico acuoso 1 N y se extrajo (3
veces) con cloroformo. Las capas de cloroformo combinadas se secaron
y el disolvente se retiró bajo presión reducida para dar 553 mg del
aminodiol (39).
Se añadió bicarbonato sódico acuoso saturado (6
ml) a una solución del aminodiol (39) (553 mg) en THF (3 ml),
seguido por cloruro de miristoílo (628 \mul). Después de 50
minutos, la reacción se trató del modo habitual. La cromatografía
daba 389 mg del amidodiol (41) como un aceite.
Se añadió tetrazol (203 mg) a una solución del
amidodiol (41) (531 mg) en cloruro de metileno (40 ml) y la mezcla
se agitó durante 5 minutos. A continuación, se añadió reactivo de
fosforilación (11) (482 mg). Después de 20 minutos, se añadió
reactivo de fosforilación (11) adicional (100 mg) y, después de 20
minutos adicionales, se añadieron 100 mg más. Después de 20 minutos
adicionales, se añadieron 50 mg más. Después de 20 minutos, la
mezcla se vertió en una solución fría de THF (30 ml)/oxona (1,07
g)/agua (30 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 5 minutos y a
continuación 20 minutos a temperatura ambiente, momento después de
lo cual la reacción se trató de la manera habitual. La cromatografía
daba 852 mg del fosfatoalcohol (42) como un aceite.
Se añadieron EDC (10,8), DMAP (66 mg) y ácido
dodecílico (1,62 g) a una solución del fosfatoalcohol (42) (3,9 g)
en cloruro de metileno (126 ml). La mezcla de reacción se agitó
durante la noche. Se añadieron ácido (1,6 g), EDC (1 g) y DMAP (0,5
g) adicionales. Después de 3 horas, la reacción se trató de la
manera habitual y se cromatografió para 2,07 g de la amina protegida
(43).
Se añadieron TES (240 \mul) y TFA (300 \mul)
a una solución de la amina protegida (43) (194 mg) en cloruro de
metileno (1,5 ml). La mezcla se agitó durante 20 minutos y se
añadieron TES (50 \mul) y TFA (50 \mul) adicionales. Después de
1 hora, se añadió tolueno y el disolvente se retiró bajo presión
reducida y a continuación la mezcla se trató de la manera habitual.
El producto de amina libre (44) en bruto se usó inmediatamente en la
siguiente reacción.
Se añadieron malonato de
mono-t-butilo (8,3 \mul), EDC
(12,4 mg) y una traza de DMAP a una solución enfriada con hielo de
la amina libre (29) (43,5 mg) en cloruro de metileno (250 \mul).
El baño de hielo se retiró y, después de 2 horas, la reacción se
trató de la manera habitual. La cromatografía daba 44 mg de la amida
(45).
Se añadieron TES (90 \mul) y TFA (100 \mul) a
una solución de la amida (45) (44 mg) en cloruro de metileno (0,5
ml). Después de 2 horas, se añadió tolueno y el disolvente se retiró
bajo presión reducida. La mezcla se trató de la manera habitual para
dar 44,2 mg del ácido libre (46).
Se añadió EDC (13 mg) a una solución enfriada con
hielo del ácido libre (46) (41 mg) y la amina libre (44) (26,3 mg)
en cloruro de metileno (500 \mul) y la mezcla se agitó durante 30
minutos. Se añadieron EDC adicional (5 mg) y DMAP (2 mg) y, después
de 1 hora, la reacción se trató de la manera habitual. La
cromatografía daba 32,7 mg del compuesto acoplado 47 como un
aceite.
Se añadieron PhSiH_{3} (8,5 \mul) y
Pd(PPH_{3})_{4} (11 mg) a una solución del
compuesto acoplado (47) (32,7 mg) en cloroformo desgasificado (1,5
ml) en una cámara seca. La mezcla se retiró de la cámara y se enfrió
en hielo. Después de 5 minutos, el baño de hielo se retiró y,
después de 1 hora, se añadieron cloroformo:metanol:agua (2:3:1) y la
mezcla se agitó durante 15 minutos y se almacenó en el congelador
durante la noche. La mezcla se vertió a continuación en una columna
cromatográfica de DEAE. La cromatografía daba 13,9 mg de un
compuesto (48) como un polvo blanco después del tratamiento con NaOH
0,1 N seguido por la liofilización.
Se añadió bicarbonato sódico saturado (0,5
\mul) seguido por fosgeno (15 \mul de una solución 1,93 M en
tolueno) a una solución de la amina (44) (46,1 mg) en tolueno.
Después de 30 minutos, se añadió fosgeno adicional (10 \mul).
Después de 2 horas, se añadió fosgeno adicional (5 \mul). La
reacción se extinguió con bicarbonato sódico acuoso y se trató de la
manera habitual para dar 29,6 mg de la urea (49) con fosfatos
protegidos.
Se añadió PhSiH_{3} (8 \mul) a una solución
de la urea con fosfatos protegidos (49) (29,6 mg) en cloroformo
desgasificado (1,5 ml) en una cámara seca. El recipiente de reacción
se retiró de la cámara seca y se puso sobre hielo. Se añadió
Pd(PPh_{3})_{4} (10 mg) y, después de 5 minutos,
el baño de hielo se retiró. Después de 1 hora, la reacción se
extinguió mediante la adición de cloroformo:metanol:agua. La mezcla
se agitó durante 15 minutos y se almacenó durante la noche en el
congelador. Se cromatografió sobre DEAE para dar 24,1 mg de (50)
como un polvo blanco después del tratamiento con NaOH 0,1 N seguido
por la liofilización.
Se añadieron una solución de la amina libre (29)
(35) y
1,8-bis-(dimetilamino)-naftaleno en
cloruro de metileno (200 \mul) a una solución enfriada con hielo
de cloroformiato de triclorometilo (2,6 \mul) en cloruro de
metileno (200 \mul). Después de 5 minutos, el baño de hielo se
retiró. Después de 15 minutos, se añadió cloruro de metileno
adicional y la mezcla se trató de la manera habitual. La
cromatografía daba 9,4 mg del isocianato (51) como un aceite.
Se añadió una solución de la amina (44) (10,3 mg)
en cloruro de metileno a una solución del isocianato (51) (9,4 mg)
en cloruro de metileno (0,2 ml). Después de 15 minutos, la reacción
se trató de la manera habitual. La cromatografía daba 5,5 mg del
compuesto acoplado (61) como un aceite.
Se añadieron PhSiH_{3} (6,6 \mul) y
Pd(PPH_{3})_{4} (8,8 mg) a una solución del
compuesto acoplado (61) (25,2 mg) en cloroformo desgasificado (0,5
ml) en una cámara seca. La mezcla se retiró de la cámara y se enfrió
en hielo. Después de 5 minutos, el baño de hielo se retiró y,
después de 1 hora, se añadieron cloroformo:metanol:agua (2:3:1) y la
mezcla se agitó durante 15 minutos y se almacenó en el congelador
durante la noche. La mezcla se vertió a continuación sobre una
columna cromatográfica de DEAE. La cromatografía daba 7,5 mg de (62)
como un polvo blanco después del tratamiento con NaOH 0,1 N seguido
por la liofilización.
Se añadió el (S)-(+)-alcohol (63)
(0,41 ml) en 8 ml de THF a una suspensión agitada de hidruro sódico
(145,5 mg de dispersión en aceite al 60% lavada con hexano) en DMF
(12 ml), gota a gota durante un período de 1 hora. La mezcla se
agitó durante 30 minutos adicionales, seguido por una adición gota a
gota del tosilato (4) (0,789 g) en 10 ml de THF durante un período
de 10 minutos. La mezcla de reacción resultante se agitó durante la
noche. El tratamiento habitual daba 0,56 mg del aducto (65)
deseado.
Una solución de ácido láurico (1,40 g), EDC (1,35
g), DMAP (0,04 g) y el aducto alcohólico (65) (0,564 g) en 4 ml de
cloruro de metileno se agitó durante 15 horas a temperatura
ambiente. Se añadieron salmuera y bicarbonato sódico acuoso saturado
(1:1) y la mezcla se extrajo con cloruro de metileno. La mezcla se
trató de la manera habitual y se cromatografió. La fracción deseada
se disolvió en 20 ml de ácido acético:agua 4:1 y se agitó durante 15
horas. El disolvente se retiró bajo presión reducida y el residuo se
cromatografió para dar 0,77 g del diol semisólido (66).
Una solución del diol (66) (0,22 g), DMAP (6,3
mg), TEA (100 \mul) y TBDPSCl (164 \mul) se agitó durante 24
horas a temperatura ambiente. Se añadieron metanol (2 ml) y una
traza de ácido clorhídrico acuoso, seguido por extracción con
cloruro de metileno. La mezcla se trató del modo habitual. El
residuo se cromatografió para dar 0,3 g del alcohol (67) como un
aceite.
Una solución del alcohol (67) (0,3 g), DMAP (5,5
mg), EDC (258 mg) y ácido mirístico (308 mg) en cloruro de metileno
(4 ml) se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente, seguido por
la adición de salmuera y bicarbonato sódico saturado. La mezcla se
trató del modo habitual y se cromatografió para dar 0,4 g de
producto etéreo protegido con sililo (68).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ácido clorhídrico al 48% (0,756 ml) a
una solución del éter protegido con sililo (68) (195 mg) en
acetonitrilo (2,7 ml). Después de 30 horas, se añadió bicarbonato
sódico saturado y la mezcla se trató del modo habitual. La
cromatografía daba 94,7 mg del alcohol libre (69).
Se añadieron tetrazol (15,6 mg) y reactivo de
fosforilación (11) (40 mg) a temperatura ambiente a una solución del
alcohol libre (69) (57 mg) en cloruro de metileno (0,5 ml). Después
de 4 horas, la mezcla se enfrió hasta 0ºC, seguido por la adición de
oxona (82 mg) en THF (0,5 ml):agua (0,6 ml). La mezcla se calentó
hasta temperatura ambiente y se agitó durante 80 minutos. La mezcla
de reacción final se trató de la manera habitual. La cromatografía
daba 72 mg del fosfato protegido (70).
Se añadieron TES (120 \mul) y ácido
trifluoroacético (0,6 ml) a una solución del fosfato protegido (70)
(72 mg) en cloruro de metileno (1 ml), seguido por agitación durante
1 hora. El TFA se retiró bajo presión reducida seguido por
azeotropización con 10 ml de tolueno. Se añadieron 20 ml de cloruro
de metileno y la mezcla se trató de la manera habitual para dar 0,52
g de un aceite.
La amina en bruto se disolvió en cloruro de
metileno (0,7 ml) seguido por la adición de ácido malónico (4,5 mg)
y EDC (25,6 mg). La mezcla se agitó durante la noche y se trató del
modo habitual para dar 32,5 mg del producto dímero (71).
El dímero protegido (71) (32,5 mg) de la reacción
precedente se disolvió en cloroformo desgasificado (2 ml) y se
añadió PhSiH_{3} (8,6 \mul) en una cámara seca. La mezcla se
retiró de la cámara seca y se añadió
Pd(PPh_{3})_{4} (22,6 mg) previamente pesado en la
cámara seca. Después de 2 horas, la mezcla se cromatografió sobre
DEAE para dar 27,9 mg de sólido blanco (72) después de la adición de
hidróxido sódico 1 N (34,2 \mul) seguido por la liofilización.
Preparación de
ER-804253
El alcohol (558 mg) se disolvió en cloruro de
metileno (5 ml) enfriado hasta 0ºC y se añadió trietilamina (0,466
ml) bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de agitar durante 5
minutos se añadió gota a gota cloruro de metanosulfonilo (0,142 ml).
La mezcla se agitó durante 5 minutos adicionales a 0ºC y a
continuación se calentó hasta temperatura ambiente. Después de
agitar durante 1 hora adicional, la mezcla se trató con bicarbonato
sódico saturado, se extrajo con acetato de etilo y el extracto se
lavó con agua, ácido clorhídrico acuoso diluido, agua, salmuera, se
secó y el disolvente se retiró para dar 630 mg.
El mesilato (630 mg) y azida sódica (299 mg) se
disolvieron en DMSO (6 ml) y se calentaron hasta 60ºC durante 90
minutos. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla de
reacción se diluyó con cloruro de metileno, se lavó con agua y
salmuera. Después de extraer los lavados acuosos, la fase orgánica
combinada se secó, se concentró, se purificó sobre gel de sílice
usando una reacción 4:1 de hexanos a acetato de etilo y las
fracciones de producto secadas dan 420 mg.
La azida (295 mg) se disolvió en etanol (5 ml) y
se añadió catalizador de Lindlar (200 mg). Después de agitar bajo
una atmósfera de hidrógeno gaseoso a presión atmosférica, la
solución filtrada se secó para dar 274 mg.
La amina (930 mg) se disolvió en THF (10 ml) y
bicarbonato sódico saturado (22 ml). Después de agitar durante 5
minutos, se añadió gota a gota cloruro de lauroílo (0,712 ml)
durante 20 minutos. La mezcla final se extrajo con cloroformo y se
secó para dar 1,45 g.
La amida (1,11 g) se disolvió en metanol (14 ml)
y se añadió ácido clorhídrico 4 N (8 ml). La mezcla se agitó durante
1 hora a 50ºC y a continuación se concentró. Se añadieron metanol
(16 ml) e hidróxido sódico al 40% (8 ml) y la mezcla se sometió a
reflujo durante 1 hora. Se enfrió, se extrajo con cloruro de
metileno y el extracto se lavó con agua, se secó y el disolvente se
retiró para dar 930 mg.
El aminoalcohol se disolvió en THF (6 ml ) y se
añadió bicarbonato sódico saturado (13 ml). Después de 5 minutos, la
mezcla se enfrió hasta 0ºC y se añadió cloruro de miristoílo (300
\mul). Después de 30 minutos, la mezcla se trató del modo habitual
para dar 430 mg.
El alcohol (101,7 mg) se disolvió en cloruro de
metileno enfriado con hielo y se añadió reactivo de fosforilación 11
(90 \mul) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Se añadió oxona
enfriada con hielo (166,3 mg) y la mezcla se agitó durante 30
minutos. La reacción se extinguió con tiosulfato. La mezcla se trató
del modo habitual y se cromatografió para dar 174 mg (no
purificado).
La amina protegida de la reacción previa se
disolvió en cloruro de metileno enfriado con hielo (1 ml), se añadió
ácido trifluoroacético (1 ml) y la mezcla se agitó durante 1 hora.
El TFA se retiró y la mezcla se purificó para dar 106,7 mg.
La amina se disolvió en cloruro de metileno (3
ml) y se añadió solución saturada de bicarbonato sódico (3 ml). La
mezcla se enfrió en hielo y se añadió gota a gota fosgeno en tolueno
(0,55 equivalentes). La mezcla se agitó durante 20 minutos y se
trató para dar 112,3 mg.
Se añadieron fenilsilano (10,7 mg) y
tetraquis(trifenilfosfina)paladio [0] (28,7 mg) a una
solución del fosfato bloqueado (40,5 mg) en cloroformo enfriado con
hielo (2,6 ml) y la mezcla se agitó durante 1 hora. La mezcla se
cromatografió sobre una columna de DEAE para dar 27,7 mg de
ER-804253.
Preparación de
ER-804130
Se añadió un equivalente de
butil-litio a una solución de la amida (3 g) en THF
(65 ml) a -78ºC, seguido por una solución de cloruro de nonanoílo en
THF (6 ml). Se añadió cloruro amónico acuoso y la mezcla se trató de
la manera habitual para dar 5,35 g.
Se añadieron trietilamina (4,1 ml) y cloruro de
mesilo (2,1 ml) a una solución del alcohol (5 g) en cloruro de
metileno enfriado con hielo (100 ml). La mezcla se agitó durante 4
horas y se trató de la manera habitual para dar 6,99 g.
Se añadió bromuro potásico a una solución del
mesilato (6,99 g) en DMF enfriada con hielo (100 ml). La mezcla se
dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 5 horas.
Se trató de la manera habitual para dar 4,63 g de aceite
transparente.
Una solución de la amida (2,8 g) en THF (15 ml)
se añadió a una solución a -78ºC de bistrimetilsililamida sódica en
THF (15 ml). Después de 1 hora, se añadió el bromuro y la mezcla se
dejó calentar hasta temperatura ambiente y se trató de la manera
habitual para dar 1,02 g.
Se añadió paladio sobre carbono (126 mg) a una
solución de la olefina (1,02 g) en EtOAc y la mezcla se puso bajo
hidrógeno. Después de 4 horas, la mezcla se trató de la manera
habitual para dar 1,0 g.
Se añadió agua, peróxido de hidrógeno e hidróxido
de litio a una solución de la amida (1,0 g) en THF enfriado con
hielo (20 ml). Al día siguiente, la mezcla se trató de la manera
habitual para dar 590 mg de ácido.
Se añadió complejo de diborano:THF a una solución
del ácido en THF enfriado con hielo (10 ml) y la mezcla se dejó
calentar lentamente. Después de 7 horas, se añadió cuidadosamente
ácido clorhídrico diluido y la mezcla se trató de la manera
habitual. El material en bruto se disolvió en éter enfriado con
hielo y se añadió solución de LAH (2 ml de 1M). Después de 5
minutos, la mezcla se trató de la manera habitual para dar 556 mg
del alcohol.
Se añadió DMSO (1,1 ml) a una solución a -78ºC de
cloruro de oxalilo (2,2 ml) en cloruro de metileno (10 ml) y,
después de 2 minutos, se añadió el alcohol (556 mg) en cloruro de
metileno (5 ml). Después de 20 minutos, se añadió trietilamina (1
ml) y la mezcla se calentó hasta 0ºC. La mezcla se diluyó con éter y
se trató de la manera habitual para dar 567 mg.
El reactivo de Wittig (679 mg) se suspendió en
THF (10 ml) y se añadió solución de KHMDS (4 ml de 0,5 M). Después
de 20 minutos, la mezcla se enfrió hasta -78ºC y se añadió el
aldehído (567 mg) en THF (5 ml). Después de 15 minutos, la mezcla se
trató de la manera habitual para dar 342 mg.
Se añadió ácido yodhídrico a una solución del
éter enólico (342 mg) en acetonitrilo (3,5 ml) y agua (0,15 ml).
Después de 4 horas, la mezcla se trató de la manera habitual para
dar 325 mg.
Se añadió borohidruro sódico (38 mg) a una
solución del aldehído (325 mg) en metanol (10 ml). Después de 3
horas, la reacción se trató de la manera habitual para dar 303 mg
del alcohol.
Se añadieron trietilamina (150 \mul) y cloruro
de mesilo (76 \mul) a una solución enfriada con hielo del alcohol
(303 mg) en cloruro de metileno (10 ml). Después de 4 horas, la
reacción se trató de la manera habitual para dar 352 mg.
Se añadió solución de t-butóxido
potásico (2,2 ml de 1 M) a una solución de la oxazolina (1 ml) en
THF enfriado con hielo (5 ml). Después de 30 minutos, el mesilato se
añadió en THF (5 ml) y la mezcla se agitó durante 8 horas. El
tratamiento habitual daba 318,5 mg.
Una solución de la oxazolina en metanol (8 ml) y
ácido clorhídrico (4 ml de 4 M) se calentó hasta 50ºC durante 90
minutos. Se añadió metanol adicional y el disolvente se retiró. El
residuo se disolvió en metanol (8 ml) y solución de hidróxido sódico
(4 ml) y se calentó brevemente hasta 50ºC. La mezcla se enfrió y se
extrajo con cloroformo. El tratamiento habitual daba 114 mg.
Se añadió el cloruro de ácido a una solución de
la amina (114 mg) en THF (2 ml) y bicarbonato sódico acuoso saturado
(2 ml). Después de 30 minutos, se añadió cloruro de ácido adicional.
Después de 30 minutos, la reacción se trató de la manera habitual
para dar 146 mg.
Se añadió el alcohol (146 mg) a una solución del
tetrazol (48 mg) y el reactivo de fosforilación (122 mg) en cloruro
de metileno frío (2 ml). Se añadió oxona (230 mg) en agua (1 ml) y
THF (2 ml). Después de 90 minutos, se usó tiosulfato para extinguir
la reacción. El tratamiento estándar daba 140 mg.
Se añadieron trietilsilano (370 \mul) y ácido
trifluoroacético (110 \mul) a una solución del substrato en
cloruro de metileno frío. Después de 5 minutos, las materias
volátiles se retiraron para dar 148 mg.
Se añadieron bicarbonato sódico acuoso saturado
(0,8 ml) y solución de fosgeno (20 \mul de 1,93 M) a una solución
de la amina (36,9 mg) en cloruro de metileno enfriado con hielo (0,8
ml). Después de 1 hora, se añadió fosgeno adicional (10 \mul).
Después de 30 minutos, el tratamiento habitual daba 47,7 mg.
Se añadió el substrato a una solución de
fenilsilano (15 \mul) y
tetraquis(trifenilfosfina)paladio [0] (24,8 mg) en
cloroformo enfriado con hielo bajo una atmósfera inerte. Después de
5 minutos, la mezcla se aplicó a una columna de DEAE y se
cromatografió para dar 31 mg de ER-804130.
\newpage
Preparación de
ER-804558
Se añadieron trietilamina (321 \mul) y cloruro
de 1-dodecanosulfonilo a una solución de la amina
(325 mg) en cloruro de metileno. Después de 3 horas, el tratamiento
habitual daba 384 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron cloruro de tetrabutilamonio (123 mg)
y ácido acético (29 \mul) a una solución del alcohol protegido
(384 mg) en THF (4 ml). Después de 2 horas, el tratamiento habitual
daba 180 mg.
El resto de la síntesis se completó como se
esboza previamente para otros compuestos de la presente invención,
es decir fosforilando, desbloqueando, acoplando con fosgeno y
desprotegiendo con fenilsilano y paladio.
Preparación de
ER-804442
La diolamina se monoprotegió como su
t-butil-difenilsilil-éter esbozado
previamente.
La amina (2,6 g) y benzofenonimina (1,1 ml) se
mezclaron y se calentaron hasta 40ºC durante 4 días para dar,
después de la cromatografía, 3,3 g.
Se añadieron ácido láurico (1,5 g), EDC (1,7 g) y
DMAP (155 mg) a una solución de la imina (3,3 g). Al día siguiente,
la reacción se trató de la manera habitual para dar 3,15 g.
Se añadió ácido clorhídrico acuoso 1 N a una
solución de la imina (3,14 g) en éter. Al día siguiente, la reacción
se trató de la manera habitual para dar 2,81 g.
Se añadieron dodecilamina (18 \mul) y
diisopropiletilamina (17 \mul) a una solución de cloroformiato de
triclorometilo (12 \mul) en cloruro de metileno enfriado con hielo
(250 \mul). Después de 30 minutos, el disolvente se retiró, el
residuo se disolvió en cloruro de metileno enfriado con hielo, a lo
que se añadía la amina (55,6 mg) y diisopropiletilamina adicional
(13 \mul). Después de 2 horas, el tratamiento habitual daba,
después de la cromatografía, 60,9 mg.
Este producto se desprotegió con fluoruro, se
fosforiló, se desprotegió con TFA, se dimerizó con fosgeno y se
desbloqueó con fenilsilano y paladio según se esboza previamente
para dar ER-804442.
Preparación de
ER-804221
Se añadió cloruro de lauroílo (21,8 g) a una
solución enfriada con hielo de glicina (8,26 g) en hidróxido sódico
acuoso (4,4 g en 60 ml). Después de 1 hora, se añadió ácido y la
mezcla se trató del modo habitual. La recristalización en acetato de
etilo daba 9,7 g.
Se añadió azida tríflica (20 mg) a una solución
enfriada con hielo de la amina (1,4 g). Al día siguiente, se añadió
azida adicional. Después de 2 horas, la reacción se trató de la
manera habitual para dar, después de la cromatografía, 1,14 g.
Se añadieron cloruro de
t-butildifenilsililo (1,09 ml), trietilamina (1,8
ml) y DMAP (50 mg) a una solución del alcohol (1,14 g) en cloruro de
metileno. Después de 3 horas, el tratamiento habitual daba 1,4
g.
Se añadieron ácido láurico (826 mg), EDC (1,05 g)
y DMAP (33 mg) a una solución del alcohol (1,4 g) en cloruro de
metileno frío. Al día siguiente, el tratamiento habitual daba,
después de la cromatografía, 778 mg.
Se añadieron ácido acético (77 \mul) y TBAF
(323 mg) a una solución de la azida (778 mg) en THF. Al día
siguiente, el tratamiento habitual daba, después de la
cromatografía, 428 mg.
Se añadieron tetrazol (165 mg), el reactivo de
fosforilación (390 mg) y, después de 30 minutos, oxona en agua (722
mg en 3 ml) a una solución de la azida (460 mg) en cloruro de
metileno. La reacción se extinguió con tiosulfato. El tratamiento
habitual, después de la cromatografía, daba 392 mg.
La amina protegida (460 mg) se disolvió en
cloruro de metileno y ácido trifluoroacético (394 \mul) y
trietilsilano (308 \mul). Después de 1,5 horas, el tratamiento
habitual daba 392 mg.
Se añadieron bicarbonato sódico saturado (5,5 ml)
y fosgeno (164 \mul de una solución de 1,93 M en tolueno) a una
solución enfriada con hielo de la amina en cloruro de metileno (5,5
ml). Después de 15 minutos, el tratamiento habitual, después de la
cromatografía, daba 342 mg.
Se añadió el reactivo de estaño (1,5 ml), que se
preparaba según se esboza en U.S. 5.756.718 incorporada aquí
mediante referencia, a una solución enfriada con hielo de la azida
(187 mg) en cloruro de metileno. Después de 30 minutos, la mezcla se
cromatografió para dar 187 mg.
Se añadieron el ácido (59 mg) (preparado como
previamente) y EDC (44 mg) a una solución enfriada con hielo de la
urea (55 mg) en cloruro de metileno. Al día siguiente, se añadieron
EDC (5 mg) y ácido (5 mg) adicionales. Después de 2 horas, el
tratamiento normal proporcionaba 45,7 mg.
La retirada normal de los grupos protectores con
fenilsilano y paladio daba ER-804221.
Se preparó ER-804222 de una
manera similar, excepto que se usaba el producto de condensación
entre cloruro de laurilo y glicina, ácido
15-metilmirístico.
Preparación de
ER-804281
Se añadió CAN (41,4 g) a una solución enfriada
con hielo del alcohol protegido (8,3 g) en acetonitrilo:agua.
Después de 1 hora, el tratamiento habitual daba 5,7 g.
Una solución del alcohol (5,63 g) en solución de
HCl 4 N se calentó hasta reflujo durante 1 hora, se enfrió, se
neutralizó con hidróxido sódico y se trató de la manera habitual
para dar 2,1 g.
Se añadieron imidazol (0,7 g) y cloruro de
t-butildifenilsililo en 15 ml de cloruro de metileno
a una solución enfriada con hielo del alcohol (2,2 g) en cloruro de
metileno. Al día siguiente, el tratamiento habitual daba 1,54 g.
Se añadió benzofenonaimina (0,8 ml) a una
solución del alcohol (1,93 g) en cloruro de metileno (40 ml).
Después de 1 día, la mezcla se calentó hasta reflujo durante la
noche. El tratamiento habitual daba 1,67 g.
Se añadieron DMAP (159 mg), EDC (0,99 g) y ácido
láurico (1,04 g) a una solución enfriada con hielo del alcohol (1,67
g) en cloruro de metileno. Después de un día, el tratamiento
habitual daba un rendimiento de 74%.
Se añadió HCl 1 N (50 ml) a una solución enfriada
con hielo de la imina (2,9 g) en éter (50 ml). Al día siguiente, el
tratamiento habitual daba 2,09 g.
Se añadieron cianoborohidruro sódico (178 mg) y
tetradecanal (411 mg) a una solución de la amina (1,24 g) en
diclorometano. Al día siguiente, el tratamiento habitual daba 1,5
g.
Se añadieron cloroformiato de alilo (40 mg) y 308
\mul de una solución de NaOH 1N a una solución enfriada con hielo
de la amina (221 mg) en dioxano. Después de 2 horas, el tratamiento
habitual daba 200 mg.
Se añadieron TBAF (1924 \mul) y ácido acético
(122 \mul) a una solución enfriada con hielo del alcohol protegido
(365 mg) en THF. Al día siguiente, el tratamiento habitual daba 271
mg.
Este material se fosforiló, se desbloqueó con
TFA, se dimerizó con fosgeno y los grupos protectores alilo se
retiraron con fenilsilano y paladio como se describe previamente
para dar ER-804281.
Preparación de
ER-804339
ER-804281
\rightarrow
ER-804339
Se añadieron trietilamina (5 \mul), DMAP (0,6
mg) y cloruro de acetilo (1,8 \mul) a una solución enfriada con
hielo de ER-804281 (7 mg) en cloruro de metileno.
Después de 4 días, el tratamiento habitual daba 1,1 mg.
Preparación de
ER-804674
ER-804281
\rightarrow
ER-804674
Se añadieron yoduro de metilo (9,2 mg) y
bicarbonato sódico (6,8 mg) a una solución de
ER-804281 (12,7 mg) en THF (1,0 ml). La mezcla se
agitó durante 5 días y se añadieron bicarbonato sódico (14 mg) y
yoduro de metilo adicional (8 ml). Después de 3 días adicionales, se
añadieron bicarbonato (28 mg) y MeI (16 \mul) adicionales. Después
de 6 días adicionales, la mezcla se trató para dar 9,1 mg de
producto.
Preparación de
ER-804596
Se añadieron isopropilamina (210 \mul),
tetrazol (105 mg) y reactivo de fosforilación (como el descrito
previamente) (488 mg) a una solución del alcohol (393 mg) en cloruro
de metileno (2 ml). Después de 2 1/5 horas, el tratamiento habitual
daba el producto deseado.
Se añadieron tetrazol (175 mg) y la azida (1
equivalente) a una solución del diol (73 mg) en acetonitrilo.
Después de 3 horas, la mezcla se enfrió y se añadió a ozono (1229
mg). Al día siguiente, el tratamiento habitual daba el producto
deseado.
Se añadió CAN (358 mg) a una solución enfriada
con hielo del alcohol protegido (92,9 mg) en acetonitrilo:agua (6
ml:1,5 ml). Después de 1 hora, el tratamiento habitual proporcionaba
68,5 mg.
Se añadieron ácido láurico (76,5 mg), DMAP (4,7
mg) y EDC (73 mg) a una solución enfriada con hielo del diol (68,5
mg) en cloruro de metileno. Al día siguiente, el tratamiento
habitual daba 76,5 mg.
Las azidas se redujeron usando el reactivo de
estaño descrito previamente. La diamina se aciló con cloruro de
dodecanoílo y los grupos protectores se retiraron con fenilsilano y
paladio según se describe previamente para dar
ER-804596.
Preparación de
ER-804732
El alcohol (7,04 g) se disolvió en cloruro de
metileno (300 ml) con trietilamina (11,13 ml) y a continuación se
enfrió hasta 0ºC bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a
gota cloruro de metanosulfonilo (3,69 ml), momento después de lo
cual la reacción se agitaba a temperatura ambiente durante 1 hora.
El tratamiento habitual daba 5,551 g.
El compuesto mesilado (1,114 g) se disolvió en
DMF (30 ml), seguido por azida sódica (0,9337 g). La mezcla de
reacción se calentó hasta 57ºC y se agitó durante 16 horas y a
continuación hasta 104ºC durante 3 horas adicionales. Después de
enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se trató de la manera
habitual y daba 0,466 g.
El aminoalcohol protegido (0,466 g) se hidrolizó
usando HCl 4 N (15 ml) a 107ºC durante 3 horas. Después de enfriar
hasta temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró y se
extrajo con éter etílico, se secó, se concentró y se usó en la
siguiente reacción.
El aminoalcohol en bruto se disolvió en THF (5
ml) con bicarbonato sódico saturado (6 ml) y se enfrió hasta 0ºC. Se
añadió gota a gota cloruro de miristoílo (0,79 ml), momento después
de lo cual la reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se
agitó durante 2 horas. La mezcla de reacción se trató usando los
métodos habituales y daba 0,751 g.
El alcohol (0,185 g) se disolvió en DMF (3,0 ml)
con imidazol (0,077 g) y cloruro de
terc-butildifenilsililo (0,197 ml). La mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas, momento
después de lo cual el tratamiento habitual daba 0,320 g.
La azida (0,975 g) se disolvió en metanol (20 ml)
con paladio al 10% sobre carbono (0,180 g). La mezcla se agitó bajo
una atmósfera de hidrógeno gaseoso bajo presión atmosférica durante
2 horas, momento después de lo cual el gas se evacuó y la mezcla se
filtró sobre Celite 545 y se concentró. La purificación usando los
métodos habituales daba 0,873 g.
Se añadió gota a gota DMSO (1,5 ml) a cloruro de
oxalilo (0,92 ml) en cloruro de metileno (30 ml) a -78ºC. Después de
agitar durante 15 minutos, el alcohol (1,727 g) en cloruro de
metileno (30 ml) se añadió gota a gota y se agitó durante 30 minutos
adicionales. Se añadió gota a gota trietilamina (4,90 ml), la
reacción se calentó hasta 0ºC y se extinguió usando cloruro amónico
saturado. La purificación del producto en bruto usando cromatografía
en gel de sílice con acetato de etilo al 20% en hexanos daba 1,653
g.
\vskip1.000000\baselineskip
La amina primaria (0,135 g) y el aldehído (0,077
g) se disolvieron en 1,2-dicloroetano (5 ml) seguido
por la adición de cianoborohidruro sódico (0,032 g). La reacción se
agitó durante 20 horas, momento después de lo cual se añadió ácido
acético (0,02 ml) y la reacción se trató de la manera habitual para
dar 0,103 g.
La amina secundaria se disolvió en
1,4-dioxano (15 ml) y se enfrió hasta 0ºC seguido
por la adición lenta de hidróxido sódico 1 M (3,0 ml). Después de
agitar durante 10 minutos, se añadió gota a gota cloroformiato de
alilo (0,236 ml), momento después de lo cual la reacción se calentó
hasta temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas. El
tratamiento de la manera habitual daba 0,613 g.
El éter para-metoxibencílico
(0,613 g) se disolvió en una relación 4 a 1 de acetonitrilo a agua
(15 ml), se enfrió hasta 0ºC y a continuación se añadió CAN (1,525
g). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 2 horas y a
continuación se trató de la manera habitual para dar 0,357 g.
El alcohol (0,357 g) se disolvió en cloruro de
metileno (5 ml) con ácido láurico (0,184 g) y EDC (0,175 g) y se
enfrió hasta 0ºC. Se añadió 4-dimetilaminopiridina
(0,012 g) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente
durante 2 horas. El tratamiento de la manera habitual daba 0,436
g.
El alcohol protegido con sililo (0,211 g) se
disolvió en THF (5 ml) con ácido acético (0,03 ml). Se añadió en una
porción fluoruro de tetrabutilamonio (0,115 g) y la mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Un
tratamiento normal daba 0,150 g.
Este material se fosforiló, se desbloqueó con
TFA, se dimerizó con fosgeno y los grupos protectores alilo se
retiraron con fenilsilano y paladio como se describe previamente
para dar ER-804732.
Preparación de
ER-804680
El aldehído (1,54 g) se disolvió en THF (28 ml) y
se enfrió hasta 0ºC, momento después de lo cual se añadieron
2-metil-2-buteno (14
ml) y alcohol terc-butílico (28 ml). Se añadió a la
mezcla previa una suspensión agitada de clorito sódico (3,70 g) y
trihidrogenofosfato sódico (4,09 g) en agua (42,7 ml) y se agitó a
0ºC durante 1,5 horas. La reacción terminada se diluyó con acetato
de etilo (100 ml) y se lavó con bisulfito sódico al 10%, salmuera,
se secó, se concentró y se cromatografió en gel de sílice para dar
1,55 g.
La amina (0,553 g) y el ácido (0,381 g) se
mezclaron en cloruro de metileno (8 ml) y se enfriaron hasta 0ºC,
momento después de lo cual se añadió EDC (0,230 g) y la mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas. El
tratamiento habitual daba 0,567 g.
El éter metoxibencílico (0,567 g) se disolvió en
una relación 1 a 1 de acetonitrilo a agua (16 ml) con cloruro de
metileno (8 ml) y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió CAN (1,53 g) y la
mezcla de reacción se agitó durante 1 hora, momento después de lo
cual se trató de la manera habitual para dar el alcohol en
bruto.
El alcohol en bruto previo se disolvió en cloruro
de metileno (15 ml) con ácido láurico (0,280 g) y
4-dimetilaminopiridina (0,017 g). La mezcla de
reacción se enfrió hasta 0ºC y se añadió EDC (0,267 g) en una
porción, momento después de lo cual la mezcla de reacción se calentó
hasta temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas. Los
procedimientos de tratamiento normales proporcionaban 0,622 g.
El éter silílico (0,563 g) se disolvió en THF (10
ml) con ácido acético (0,087 ml). Se añadió fluoruro de
terc-butilamonio (0,330 g) y la reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 16 horas. El tratamiento de la manera
habitual daba 0,384 g. Este material se fosforiló, se desbloqueó con
TFA, se dimerizó con fosgeno y los grupos protectores alilo se
retiraron con fenilsilano y paladio como se describe previamente,
para dar ER-804780.
Preparación de
ER-804679
La amina secundaria protegida (0,071 g) se
disolvió en cloroformo desgasificado (3 ml) con fenilsilano (0,017
ml) y anhídrido acético (0,014 ml). La mezcla de reacción se enfrió
hasta 0ºC, seguido por la adición de
tetraquistrifenilfosfina-paladio(0) (0,002
g). La mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se
dejó agitar durante 30 minutos. La reacción terminada se diluyó con
cloruro de metileno, se lavó con agua, se secó, se concentró y se
cromatografió para dar 0,068 g.
El éter silílico se desprotegió en THF (5 ml) con
ácido acético (0,025 ml) con la adición de fluoruro de
terc-butilamonio (0,092 g). Después de agitar a
temperatura ambiente durante 16 horas, la reacción se trató de la
manera habitual para dar 0,120 g.
Este material se fosforiló, se desbloqueó con
TFA, se dimerizó con fosgeno y los grupos protectores alilo se
retiraron con fenilsilano y paladio como se describe previamente,
para dar ER-804679.
Preparación de
ER-804764
Se añadió gota a gota DMSO (0,33 ml) a cloruro de
oxalilo (0,203 ml) en cloruro de metileno (10 ml) a -78ºC. Después
de agitar durante 15 minutos, el alcohol (0,993 g) en cloruro de
metileno (3 ml) se añadió gota a gota y se agitó durante 30 minutos
adicionales. Se añadió gota a gota trietilamina (1,08 ml), la
reacción se calentó hasta 0ºC y se extinguió usando cloruro amónico
saturado. La purificación del producto en bruto usando cromatografía
en gel de sílice con acetato de etilo al 20% en hexanos daba 0,743
g.
El n-butil-litio
1,6 M en hexanos (1,5 ml) se añadió gota a gota a la sal de fosfonio
(0,797 g) en THF (10 ml) a 0ºC. Después de agitar durante 30
minutos, se añadió gota a gota el aldehído (0,734 g) en THF (15 ml).
Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, la reacción
se trató de la manera habitual para dar 0,193 g.
El éter enólico (0,183 g) se hidrolizó con yoduro
de hidrógeno al 57% (0,114 l) en acetonitrilo (2 ml). Después de
agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la reacción se
extinguió con bicarbonato sódico saturado, se extrajo con cloruro de
metileno y se secó para dar 0,211 g de aldehído en bruto.
El aldehído en bruto (0,211 g) se disolvió en
metanol (3 ml) y se añadió borohidruro sódico (0,033 g) a 0ºC.
Después de agitar durante 30 minutos, la reacción se diluyó con
agua, se extrajo con cloruro de metileno, se secó, se concentró y se
purificó mediante cromatografía en gel de sílice para dar 0,148
g.
Este material se fosforiló, se desbloqueó con
TFA, se dimerizó con fosgeno y los grupos protectores alilo se
retiraron con fenilsilano y paladio como se describe previamente,
para dar ER-807764.
Preparación de
ER-804772
\vskip1.000000\baselineskip
El diol disponible comercialmente (1,486 g) se
mezcló con el acetal (1,864 g) y ácido
para-toluenosulfónico (0,195 g) en DMF (10 ml).
Después de agitar durante 20 horas a temperatura ambiente bajo una
atmósfera de nitrógeno, la reacción se extinguió con bicarbonato
sódico saturado, se extrajo con cloruro de metileno, se secó y se
concentró a través de alto vacío. La cromatografía en gel de sílice
del producto en bruto resultante usando acetato de etilo al 10% en
hexano daba 2,084 g.
El acetal (2,084 g) se enfrió hasta -78ºC bajo
una atmósfera de nitrógeno en cloruro de metileno (30 ml), seguido
por la adición gota a gota de DIBAL 1,0 M en hexanos (14,3 ml).
Después de que se añadiera DIBAL adicional (14 ml), la mezcla de
reacción se agitó durante 1 hora, se calentó hasta temperatura
ambiente y se extinguió con tartrato
sódico-potásico. El tratamiento normal daba 2,1
g.
El alcohol (1,286 g) se mezcló con trietilamina
(0,883 g) en cloruro de metileno (15 ml) y se enfrió hasta 0ºC. Se
añadió gota a gota cloruro de metanosulfonilo (0,575 g), seguido por
agitación durante 20 minutos a 0ºC y a temperatura ambiente durante
2 horas. El tratamiento normal daba 1,496 g.
El alcohol (1,495 g) en DMF (10 ml) se añadió
gota a gota a una suspensión en agitación de hidruro sódico al 60%
lavado (0,257 g) en DMF (20 ml) a 0ºC. Después de agitar durante 3
horas, se añadió gota a gota el mesilato (0,925 g) en DMF (10 ml).
Después de agitar durante 3 días adicionales, la reacción se
extinguió y se trató de la manera habitual para dar 0,950 g.
Como con los ejemplos proporcionados previamente,
el grupo protector para-metoxibencilo se hidrolizó
con CAN, el aminoalcohol protegido se hidrolizó usando HCl acuoso y
a continuación KOH, acilación de la amina con cloruro de
tetradecanoílo, sililación del alcohol primario con TBDPS, acilación
del alcohol secundario con cloruro de dodecanoílo e hidrólisis del
grupo protector sililo usando TBAF para dar el alcohol primario.
Este material se fosforiló, se desbloqueó con TFA, se dimerizó con
fosgeno y los grupos protectores alilo se retiraron con fenilsilano
en paladio según se describe previamente para dar
ER-804772.
Preparación de
ER-804947
El alcohol (0,263 g) en THF (5 ml) se añadió gota
a gota a hidruro sódico al 60% lavado (0,216 g) en DMF (2,0 ml) a
temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de
reacción se agitó durante 30 minutos, momento después de lo cual se
añadió bromuro de bencilo (0,272 ml) con una cantidad catalítica
(0,05 g) de yoduro de tetrabutilamonio. La mezcla de reacción final
se agitó durante 1 hora adicional, momento después de lo cual la
mezcla se extinguió y se trató de la manera habitual para dar 0,365
g.
El aminoalcohol protegido (0,189 g) se hidrolizó
usando ácido clorhídrico 4 N (2,5 ml), seguido por hidróxido sódico
al 40% (2,5 ml), según se describe previamente, para proporcionar
0,121 g.
El aminoalcohol (0,121 g) se disolvió en cloruro
de metileno (2 ml) con bicarbonato sódico saturado (2 ml). Después
de enfriar hasta 0ºC, se añadió gota a gota cloruro de miristoílo
(0,199 ml). Después de la agitación continuada durante 2 horas, la
mezcla se trató de la manera habitual y daba 0,181 g.
El alcohol (0,181 g) se disolvió en cloruro de
metileno (5 ml) con el ácido (0,180 g) y
1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida
(EDC, 0,133 g). La mezcla se enfrió hasta 0ºC y se añadió
4-dimetilaminopiridina seguido por agitación durante
16 horas a temperatura ambiente. El tratamiento habitual daba 0,310
g.
El éter para-metoxibencílico
(0,305 g) se disolvió en acetonitrilo (8 ml) con agua (2 ml) y se
enfrió hasta 0ºC. Se añadió nitrato sérico-amónico
(1,110 g) y la mezcla de reacción se agitó durante 2 horas, momento
después de lo cual usar el tratamiento normal daba el alcohol en
bruto.
El alcohol en bruto se disolvió en cloruro de
metileno (8 ml) con ácido láurico (0,126 g) y
4-dimetilaminopiridina (0,011 g). Después de enfriar
hasta 0ºC, se añadió EDC (0,119 g) y la mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 16 horas. El tratamiento habitual daba
0,355 g.
El éter bencílico (0,355 g) se disolvió en
acetato de etilo (50 ml) con hidróxido de paladio (0,048 g) y ácido
acético (0,25 ml). La mezcla de reacción se puso bajo 50 psi de una
atmósfera de nitrógeno y se removió durante 10 horas. El tratamiento
de la manera habitual daba 0,255 g.
Este material se fosforiló, se desbloqueó con
TFA, se dimerizó con fosgeno y los grupos protectores alilo se
retiraron con fenilsilano y paladio según se describe previamente,
para dar ER-804947.
No existen ensayos in vitro validados que
puedan usarse como un indicador de la actividad del adyuvante. Sin
embargo, la incapacidad de una molécula para activar cualquier
respuesta estimulante en macrófagos es una indicación fuerte de que
no es probable que sea un imunoadyuvante. Por esta razón, la
capacidad de los compuestos para estimular la liberación de TNF alfa
y otras citoquinas a partir de células inmunitarias puede ser
indicativa de su capacidad para estimular una respuesta inmunitaria
que puede dar como resultado una actividad adyuvante.
El sistema humano más fácilmente disponible para
probar la actividad de un compuesto sobre monocitos/macrófa-
gos es en sangre entera. Diversas concentraciones de compuestos de la invención se añadieron como reservas concentradas 10 veces en 50 \mul de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) libre de Ca^{++} y Mg^{++}, seguido por 50 \mul de HBSS en 400 \mul de sangre entera heparinizada obtenida de voluntarios normales (18-51 años de edad; 110-230 libras) en los pocillos de placas de ensayo de plástico, para un volumen total de 500 \mul/pocillo (la concentración final de sangre entera era 80%). Después de una incubación de 3 horas con remoción suave a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%, las placas de ensayo se centrifugaron a 1000 x g durante 10 minutos a 4ºC y el plasma se extrajo y se congeló a -80ºC. Las muestras de plasma se analizaron con respecto al TNF-alfa mediante ELISA (Genzyme Corp. Cambridge, MA). Cada punto de ensayo se probó por triplicado.
gos es en sangre entera. Diversas concentraciones de compuestos de la invención se añadieron como reservas concentradas 10 veces en 50 \mul de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) libre de Ca^{++} y Mg^{++}, seguido por 50 \mul de HBSS en 400 \mul de sangre entera heparinizada obtenida de voluntarios normales (18-51 años de edad; 110-230 libras) en los pocillos de placas de ensayo de plástico, para un volumen total de 500 \mul/pocillo (la concentración final de sangre entera era 80%). Después de una incubación de 3 horas con remoción suave a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%, las placas de ensayo se centrifugaron a 1000 x g durante 10 minutos a 4ºC y el plasma se extrajo y se congeló a -80ºC. Las muestras de plasma se analizaron con respecto al TNF-alfa mediante ELISA (Genzyme Corp. Cambridge, MA). Cada punto de ensayo se probó por triplicado.
Según se muestra en la figura 1, compuestos tales
como 100, 184 y 186 estimulan a las células transportadas por sangre
para liberar TNF-alfa. Esta actividad estimulante
puede compararse con la de 10 ng/ml de endotoxina (o LPS) presente
en incubaciones similares en el mismo ensayo. Según se muestra en la
Tabla 1, la actividad de los compuestos (probados a 10 \muM) varía
desde inactivos (tales como el compuesto 110) hasta compuestos que
demuestran mayor actividad que el patrón de LPS.
Pueden obtenerse resultados similares cuando los
compuestos de la invención se prueban en un modelo de cultivo
celular. En este ensayo, los compuestos de la invención se prueban
con respecto a su capacidad para estimular la secreción de fosfatasa
alcalina a partir de células THP-1 que se han
transfectado con el gen para fosfatasa alcalina secretada bajo el
control del promotor de TNF-alfa, según se describe
con detalle en Goto y otros, Molecular Pharmacology 49;
860-873 (1996). Sin embargo, en este ensayo, pueden
evaluarse los efectos de retirar suero ^{1} - un estado que puede
imitar más probablemente un ambiente subcutáneo. Según se muestra en
la figura 2 y se describe en la Tabla 1, los resultados de estas
pruebas indican que los compuestos de la invención estimulan la
inducción de genes bajo el control del promotor de
TNF-alfa cuando se añaden a células en ausencia así
como en presencia de suero.
La capacidad de los compuestos para estimular la
liberación de citoquinas a partir de esplenocitos puede determinarse
en un modelo de ratón. Células del bazo recogidas de ratones C57BL/6
se cultivaron durante 24 horas en medio de cultivo celular RPMI 1640
que contenía FBS al 5%, piruvato sódico 1 mM,
L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de
penicilina/estreptomicina y beta-mercaptoetanol 50
\muM, diversas concentraciones de compuesto de prueba durante
20-24 horas, después de lo cual el sobrenadante de
cultivo celular se prueba con respecto a la presencia de
citoquinas.
Células del bazo recogidas de ratones se
cultivaron durante 24 horas con compuesto de prueba y el
sobrenadante se probó con respecto a la liberación de citoquinas.
Según se muestra en las figuras 3 y 4, la liberación de citoquinas
tales como IL-10 e interferon-gamma
de esplenocitos es estimulada por compuestos tales como 104, 106,
124, 126, 160 y 162.
Estos ensayos utilizaban una población
heterogénea de células derivadas del bazo. Esto hace posible que la
inducción de citoquinas pueda ser provocada tanto por efectos
directos de los compuestos de prueba sobre células como a través de
la estimulación más indirecta de "cascadas" de citoquinas donde
la liberación de una citoquina por un tipo de célula puede inducir
la liberación de otras citoquinas en otras células presentes en el
mismo medio. Es posible que este "medio ambiente" de citoquinas
sea responsable de parte de estas respuestas inmunitarias
robustas.
La prueba más crítica de la actividad adyuvante
es la determinación de si la adición de un compuesto a una
preparación de antígeno incrementa la respuesta inmunitaria elevando
el nivel de anticuerpos generados para ese antígeno cuando se
administra a un animal vivo.
Los experimentos iniciales implicaban la
inyección de ratones (Balb/c) con compuestos de la invención más un
péptido conjugado a un portador tal como hemocianina de lapa de ojo
de cerradura. El péptido elegido para estos estudios es un péptido
(P18) que corresponde a los aminoácidos 308-322 del
bucle V3 de la proteína gp 120 de HIV IIIB. Se ha presentado que el
péptido de 21 aa P18, correspondiente a los aminoácidos
308-322 del bucle V3 de la proteína gp 120 de HIV
IIIB, es inmunogénico. Este péptido con residuos espaciadores de
glicina/alanina/glicina más un residuo de cisteína aminoterminal fue
sintetizado por Genosys (Woodlands TX). La secuencia del péptido es
como sigue: CGAGIRIQRGPGRAFVTIGKG representando los
aminoácidos subrayados la secuencia natural. El péptido fue aislado
por el suministrador hasta >80% de pureza usando HPLC. El péptido
se acopló a través del residuo de cisteína a albúmina de suero
bovino (BSA) y hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) usando
conjugación activada por maleimida (Pierce Inmunochemical; cat Nº
77107). El péptido conjugado a KLH se usó como el inmunógeno y el
conjugado a BSA como el antígeno diana de rastreo para anticuerpos
específicos de P18. La cantidad indicada de conjugado de
KLH-P18, usada normalmente junto con 300 \mug de
compuesto de prueba, alumbre o PBS, se inyectó a intervalos de 2 ó 3
semanas (según se indica) en ratones Balb/c macho (Charles River
Laboratories) de aproximadamente 6-8 semanas de edad
(18-25 kg). Todas las inyecciones eran subcutáneas
en la parte trasera del cuello con 200 \mul de una mezcla de
antígeno más adyuvante en PBS administrada cada dos semanas (tres
semanas para polisacáridos o influenza) para un total de tres
inyecciones. Los ratones fueron sangrados una o dos semanas después
de las inyecciones 2ª y 3ª. Los sangrados de muestra se denominaban
según cuándo se recogen (es decir, el sangrado secundario es una
semana después de la segunda inyección de proteína o dos semanas
después de las segundas inyecciones de polisacáridos, el sangrado
terciario es después de la tercera inyección de antígeno/adyuvante).
Se recogió sangre después de sajar la vena de la cola y las gotas se
recogieron en tubos separadores de suero de Becton Dickinson tipo
Microtainer. El suero se separó de los glóbulos rojos mediante
microcentrifugación y se probó mediante ELISA con respecto a niveles
de IgG específica para el antígeno.
La respuesta inmunitaria al péptido puede
probarse mediante ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas
(ELISA), que puede cuantificar niveles de anticuerpo sérico que se
unen a péptido P18 conjugado a otra proteína que no reacciona
cruzadamente tal como albúmina de suero bovino
(P18-PSA) y revestidos sobre una placa de ELISA.
Según se muestra en la figura 5 y las Tablas 2 y
3, los ratones inyectados con los diversos compuestos junto con
KLH-antígeno P18 demostraban mayor respuesta
(niveles superiores de anticuerpo) que los inyectados con el
conjugado P18-KLH solo.
La actividad adyuvante también se obtuvo con
compuestos de la invención cuando se probaban con otros antígenos.
Compuestos tales como 100, 116, 126, 160, 184 y 186 pueden estimular
la producción de anticuerpo específico para antígeno hasta 26,8
veces (Tabla 4) para antígeno X-31 de influenza.
También se observan incrementos en la respuesta cuando se usan
toxoide del tétanos (figura 6) y polisacárido C meningocócico (Tabla
5) como antígenos activadores. En las pruebas, se usaron 1 \mug de
PS C meningocócico o 1,5 \mug de toxoide del tétanos o 5 \mug de
X31 de influenza (laboratorios SPAFAS). Se usó toxoide del tétanos
de Accurate Chemical (cat Nº sstettox) como un antígeno activador
mientras que se usó el toxoide purificado de List Biologicals (cat
Nº 191) como antígeno diana para el ensayo de ELISA.
El virus X-31 de influenza se
adquirió de SPAFAS (Storrs, CT) y estaba inactivado y se confirmó
por el suministrador que era inactivo [Payne y otros, Vaccine 16;
92-98 (1998)].
El polisacárido (PS) C meningocócico fue
suministrado por Pasteur Merrieur Connaught (Swiftwater PA). La
albúmina humana metilada puede obtenerse de acuerdo con los métodos
descritos por Gheesling y otros, J. Clin Microbiol. 32;
1475-82 (1994).
Para la preparación de mezclas de
antígeno/adyuvante, los compuestos de prueba liofilizados se
reconstituyeron hasta 2 mg/ml con solución salina tamponada con
fosfato (PBS; cat Nº P-3813; Sigma Chemical Co, St.
Louis MO) y se sometieron a ultrasonidos en un baño de agua
refrigerada durante dos minutos. Monophosphoryl Lipid A, MPL, (Ribi
Immunochemical) se reconstituyó hasta 2 mg/ml con agua estéril para
inyección, se incubó a 50ºC durante 15 minutos y a continuación se
sometió a ultrasonidos como previamente. Imject^{R} Alum,
adquirido de Pierce Immunochemical, se usó de acuerdo con las
directrices del fabricante, y comprendía aproximadamente
20-30% del volumen de inyección. Las cantidades
indicadas de antígeno, diluido en PBS, se mezclaron con los
compuestos, MPL o alumbre de modo que la concentración final del
compuesto o MPL fuera 300 \mug (a no ser que se indique otra cosa)
en los 200 \mul de volumen de inyección. Las mezclas se incubaron
a temperatura ambiente durante 40 minutos con remoción continua
antes de la inyección.
Los niveles de IgG específica para antígeno se
controlaron mediante ELISA directo donde el antígeno se revestía
pasivamente sobre placas de EIA/RIA Costar de 96 pocillos. Las
placas se revistieron con 50 \mul/pocillo del antígeno indicado y
se incubaron durante la noche (ON) a 4ºC y se lavaron 3 veces con
PBS + 0,05% de Tween 20 (PBS-t) en un lavador de
placas automatizado. Las placas se bloquearon a continuación con 200
\mul/pocillo de gelatina al 0,5% en PBS durante 1 hora a
temperatura ambiente (TA) y se lavaron 3 veces con
PBS-t. Los sueros de los ratones se diluyeron con
PBS-t más BSA al 0,3% y se añadieron 100 \mul de
diversas diluciones, por duplicado, a los pocillos revestidos con
antígeno (o pocillos revestidos con BSA como un control) y se
incubaron a TA durante 1 hora y de nuevo se lavaron 3 veces con
PBS-t. Se diluyó anti-(IgG de ratón) caprina
biotinilada (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham AL,
cat Nº 1031-08) 1:5000 en PBS-t y se
aplicaron 100 \mul/pocillo y se incubaron a TA durante 1 hora, se
lavaron 3 veces con PBS-t y seguido por la adición
de conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano
picante 1:10.000 (Southern Biotechnology Associates Inc.) en
PBS-t durante 30 minutos a TA y de nuevo se lavaron
3 veces con PBS-t. Los pocillos se incubaron a
continuación en 100 \mul de substrato TMB (Kirkegaard y Perry
Labs) durante 5 minutos. El desarrollo de color se detuvo con la
adición de un volumen igual de ácido fosfórico 1 M y la absorbancia
se leyó a 450 nm en un lector de placas Titertek Multiscan con un
paquete de análisis de software Deltasoft.
Para la cuantificación relativa de niveles de IgG
específica de antígeno, las curvas se compararon entre sí
determinando la dilución necesaria para obtener una cantidad fija de
color generado por anticuerpo. En algunos casos, un ensayo de IgG
total que usaba un reactivo específico anti-FAb para
capturar cantidades conocidas de IgG purificada (adquirido de
Southern Biotech.) como una curva estándar de IgG se efectuó junto
con el ELISA directo sobre el conjugado de BSA-P18.
El reactivo anti-FAb orienta la IgG purificada de
una manera similar a como un anticuerpo se uniría a un antígeno a
través de la región FAb. Esto permite la detección de anticuerpos
unidos mediante los mismos reactivos usados para medir la captura
específica para el antígeno de anticuerpos. Las mismas soluciones
usadas para la detección de los anticuerpos unidos a conjugados de
BSA-P18, a saber anti-IgG
biotinilado (específico de Fc) seguido por
HRP-estreptavidina, se aplicaron simultáneamente al
ensayo cuantitativo de IgG total anti-FAb y al
ensayo específico para el antígeno. De ahí que la señal de la unión
de la curva estándar de IgG purificada sea equivalente a la generada
para cantidades iguales de IgG unida en el ensayo
anti-antígeno diana. La cantidad de anticuerpo en el
suero se incorpora a continuación a partir del estándar de IgG
purificada usando un ajuste de curvas de 4 parámetros (paquete de
software DeltaSoft 3).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La Tabla 7 contiene el número de compuesto según
se refiere aquí al número ER correspondiente.
Claims (13)
1. Un compuesto de la fórmula I
en la
que:
- \quad
- R^{1} se selecciona del grupo que consiste en
- (a)
- C(O);
- (b)
- C(O)-alquil(de 1 a 14 átomos de carbono)-C(O), en donde dicho alquilo de 1 a 14 átomos de carbono está opcionalmente substituido con hidroxi, alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquilendioxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino o alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo, en donde dicho resto arilo de dicho alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo está opcionalmente substituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino, alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)OH, -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)-alquilo(de 1 a 5 átomos de carbono);
- (c)
- alquilo de cadena lineal o ramificada de 2 a 15 átomos de carbono opcionalmente substituido con hidroxi o alcoxi; y
- (d)
- -C(O)-arilen(de 6 a 12 átomos de carbono)-C(O)- en donde dicho arileno está opcionalmente substituido con hidroxi, halógeno, nitro o amino;
- \quad
- a y b son independientemente 0, 1, 2, 3 ó 4;
- \quad
- d, d', d'', e, e' y e'' son independientemente un número enero de 1 a 4;
- \quad
- X^{1}, X^{2}, Y^{1} e Y^{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en nada, oxígeno, NH y N(C(O)-alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono)) y N(alquilo de 1 a 4 átomos de carbono)_{2};
- \quad
- W^{1} y W^{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en carbonilo, metileno, sulfona y sulfóxido;
- \quad
- R^{2} y R^{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
- (a)
- alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi,
- (b)
- alquenilo o dialquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi;
- (c)
- alcoxi de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi;
- (d)
- -NH-(alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono), en donde dicho grupo alquilo está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi; y
- (e)
- en donde Z se selecciona del grupo que consiste en O y NH, y M y N se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alcoxi, aciloxi, alquilamino y acilamino de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; R^{3} y R^{6} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo o alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono opcionalmente substituido con oxo o fluoro;
- \quad
- R^{4} y R^{7} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en C(O)-(alquilo o alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono); alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; alcoxi de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; en donde dichos grupos alquilo, alquenilo o alcoxi pueden estar substituidos independientemente y opcionalmente con hidroxi, fluoro o alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono;
- \quad
- G^{1}, G^{2}, G^{3} y G^{4} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxígeno, metileno, amino, tiol, -NHC(O)- y -N(C(O)alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono))-;
- \quad
- o G^{2}R^{4} o G^{4}R^{7} pueden ser juntos un átomo de hidrógeno o hidroxilo;
- \quad
- o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R^{1} se selecciona del grupo que consiste en
C(O) y C(O)-alquil(de 1 a 14
átomos de carbono)-C(O).
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
2, en el que R^{1} es C(O)-alquil(de
1 a 14 átomos de carbono)-C(O).
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que cada uno de a y b son 2.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que X^{1} e Y^{1} son ambos NH.
6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que d y e son 1.
7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que G^{2}R^{4} y G^{4}R^{7} son ambos hidroxi.
8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, que se selecciona del grupo que consiste en ER 803022, ER 803058,
ER 803732, ER 804053, ER 804057, ER 804058, ER 804059, ER 804442, ER
804680 y ER 804764, según se indica en la Tabla 6.
9. Una formulación de adyuvante inmunológico que
comprende un compuesto de la fórmula 1, de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que:
- \quad
- R^{1} se selecciona del grupo que consiste en
- (a)
- C(O);
- (b)
- C(O)-alquil(de 1 a 14 átomos de carbono)-C(O), en donde dicho alquilo de 1 a 14 átomos de carbono está opcionalmente substituido con hidroxi, alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquilendioxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino o alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo, en donde dicho resto arilo de dicho alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-arilo está opcionalmente substituido con alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino, alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino, alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-alcoxi(de 1 a 5 átomos de carbono), -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)OH, -O-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-amino-C(O)-alquil(de 1 a 5 átomos de carbono)-C(O)-alquilo(de 1 a 5 átomos de carbono);
- (c)
- alquilo de cadena lineal o ramificada de 2 a 15 átomos de carbono opcionalmente substituido con hidroxi o alcoxi; y
- (d)
- -C(O)-arilen(de 6 a 12 átomos de carbono)-C(O)- en donde dicho arileno está opcionalmente substituido con hidroxi, halógeno, nitro o amino;
- \quad
- a y b son independientemente 0, 1, 2, 3 ó 4;
- \quad
- d, d', d'', e, e' y e'' son independientemente un número enero de 1 a 4;
- \quad
- X^{1}, X^{2}, Y^{1} e Y^{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en nada, oxígeno, NH y N(C(O)-alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono)) y N(alquilo de 1 a 4 átomos de carbono)_{2};
- \quad
- W^{1} y W^{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en carbonilo, metileno, sulfona y sulfóxido;
- \quad
- R^{2} y R^{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
- (a)
- alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi,
- (b)
- alquenilo o dialquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi;
- (c)
- alcoxi de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono que está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi;
- (d)
- -NH-(alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono), en donde dicho grupo alquilo está opcionalmente substituido con oxo, hidroxi o alcoxi; y
- (e)
- en donde Z se selecciona del grupo que consiste en O y NH, y M y N se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alcoxi, aciloxi, alquilamino y acilamino de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; R^{3} y R^{6} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo o alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono opcionalmente substituido con oxo o fluoro;
- \quad
- R^{4} y R^{7} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en C(O)-(alquilo o alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono); alquilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; alcoxi de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; alquenilo de cadena lineal o cadena ramificada de 2 a 20 átomos de carbono; en donde dichos grupos alquilo, alquenilo o alcoxi pueden estar substituidos independientemente y opcionalmente con hidroxi, fluoro o alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono;
- \quad
- G^{1}, G^{2}, G^{3} y G^{4} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxígeno, metileno, amino, tiol, -NHC(O)- y -N(C(O)alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono))-;
- \quad
- o G^{2}R^{4} o G^{4}R^{7} pueden ser juntos un átomo de hidrógeno o hidroxilo;
- \quad
- o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. Una formulación de vacuna que comprende un
antígeno y un compuesto adyuvante de fórmula I de acuerdo con la
reivindicación 9.
11. La formulación de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que dichos adyuvante y antígeno están
unidos covalentemente a través de un resto amino, carbonilo,
hidroxilo o fosfato de dicho adyuvante.
12. La formulación de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que R^{1} es un C(O) o
C(O)-alquil(de 3 a 14 átomos de
carbono)-C(O) y en la que dichos adyuvante y
antígeno están unidos covalentemente al resto carbonilo de dicho
carbonilo C_{1} de dicho C(O) o
C(O)-alquil(de 3 a 14 átomos de
carbono)-C(O).
13. Una formulación que comprende un antígeno y
un compuesto adyuvante de la fórmula I de acuerdo con la
reivindicación 9 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para usar en la estimulación de una respuesta inmunitaria a dicho
antígeno.
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