ES2224065T3 - Utilizacion de inhibidores de ikk-beta y procedimiento de localizacion de los indicados inhibidores. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de screening (selección primaria) para localizar inhibidores de IKK-beta en células endoteliales comprendiendo el procedimiento la compactación de un inhibidor potencial con células endoteliales activadas y una determinación de la secreción de la MCP-1 de las células endoteliales.

Description

Utilización de inhibidores de IKK-\beta y procedimiento de localización de los indicados inhibidores.

La presente invención se refiere a una nueva aplicación de inhibidores especiales para la preparación de medicamentos destinados a la prevención y al tratamiento de la arteriosclerosis, así como a un procedimiento de screening (selección primaria) especial para la localización de nuevos inhibidores.

Es sabido que la arteriosclerosis es una consecuencia de lesiones del endotelio vascular, que se ve favorecida por hipertonía, formación de nódulos locales o falta de oxigeno. Se supone que debido a las estructuras subendioteliales de la pared vascular, que han quedado al descubierto debido a las lesiones, se adhieren a los puntos dañados del endotelio plaquetas circulantes (adherencia de plaquetas) y que a continuación forman grumos entre si (agregación de plaquetas).

Debido a la interacción de las plaquetas con las células endoteliales se forman multitud de procesos secundarios, que dan lugar a una acumulación de lípidos en la pared vascular. Con la acumulación de lípidos en la pared vascular comienza la formación de las llamadas placas ateroescleróticas. En las placas se enriquecen células esponjosas, que se forman a partir de macrófagos que han inmigrado. Las células esponjosas absorben los lípidos acumulados y los descomponen. Mientras que algunas lipoproteínas se pueden descomponer de forma sencilla, en cambio la colesterina y el éster de colesterina se mantienen prácticamente sin descomponer. Por lo tanto las células esponjosas se sobrecargan de colesterina y éster de colesterina.

Como consecuencia de las placas ateroescleróticas pueden llegar a producirse necrosis centrales, en cuyas proximidades se depositan sales calizas. En las fases avanzadas se pueden rasgar las placas de manera que se forman lesiones ateroescleróticas, que a continuación son recubiertas por un trombo. El engrosamiento de la pared arterial y la formación de trombos superficiales pueden estrechar el lumen vascular hasta llegar a cerrarlo por completo. Los trombos que se desprenden de las arterias grandes provocan la obstrucción de los vasos menores en la periferia del cuerpo. Las alteraciones del riego sanguíneo arterial, que son debidas en la mayoría de los casos a procesos ateroescleróticos, constituyen, en un porcentaje de aproximadamente un 50%, la causa de muerte más frecuente en los llamados países industrializados.

Los mecanismos moleculares de la aterogénesis apenas se conocen, en particular los procesos que determinan la quemotaxis de los monocitos y la transmigración de monocitos. Sin embargo, es sabido que en los procesos de inflamación de la pared arterial aparece citoquina MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) y atrae monocitos al lugar de la inflamación. También es sabido que la MCP-1 se puede exprimir en células endoteliales. La expresión y secreción de la MCP-1 se controla por medio de cascadas de señales complejas. Los detalles de la expresión y secreción de la MCP-1 en células endoteliales en fases tempranas de aterogénesis no se conocen por el estado de la técnica. En particular no se conocen proteínas de destino relacionadas con la arteriosclerosis, influyendo sobre las cuales se pudiera influir en la aparición y desarrollo precoz de la enfermedad.

El impedimento o reducción de la atracción e inmigración de monocitos en la pared vascular dentro del marco de los procesos ateroescleróticos puede ralentizar el enriquecimiento de células esponjosas en placas ateroescleróticas, y por lo tanto sería adecuado para frenar o evitar los procesos ateroescleróticos.

El objetivo de la invención es el de facilitar un nuevo procedimiento mediante el cual se pueda evitar o tratar la ateroesclerosis.

También es un objetivo de la presente invención el de facilitar un procedimiento de screening (selección primaria) para la localización de nuevas substancias activas mediante las cuales se pueda evitar o tratar la ateroesclerosis.

Estos objetivos se resuelven de acuerdo con las reivindicaciones. La presente invención está basada en el conocimiento de que una expresión de la MCP-1 en células endoteliales no presupone una agregación de plaquetas sobre el endotelio vascular. Más bien las plaquetas activadas inducen ya en una fase de aterogenesis una expresión de la MCP-1 en células endoteliales, en la cual todavía no se puede demostrar ninguna agregación de plaquetas. Se ha observado que las plaquetas activadas, que in vivo simplemente se adhieren de forma provisional pero firme sin llegar a aglomerarse, en una monocapa endotelial activada por isquemia, desgranulan y activan el factor de transcripción NF-\kappaB en las células endoteliales contiguas. Esta nueva forma de interacción entre las plaquetas y las células endoteliales activadas, que no presupone ninguna clase de lesiones reconocibles, se diferencia por una parte de las interacciones rolling, conocidas según el estado de la técnica, en las que no se llega a producir una adherencia firme, y por otra parte de la adherencia firme y formación de grumos en la agregación de plaquetas, que no es solo transitoria sino permanente. La activación de NF-\kappaB en las células endoteliales producida por las plaquetas activadas da lugar a una secreción de la MCP-1 de las células endoteliales. Mediante la secreción de la MCP-1 se atraen monocitos en las fases tempranas de aterogénesis, que pueden llegar a inmigrar en la pared vascular. Por lo tanto una adherencia simplemente transitoria de plaquetas activadas conduce a una secreción de la MCP-1, que es condición para la formación de las placas en los procesos ateroescleróticos.

La presente invención está basada además en el conocimiento de que durante la activación de NF-\kappaB transmitida por las plaquetas activadas se fosforilizan y con ello queda activada la proteína inhibidora I\kappaB especial de la IKK-\beta-quinasa del complejo IKK. Debido a la activación especial de corta duración debida a las plaquetas activadas y con la participación de IKK-\beta se produce una actividad de fosforilización intensa y persistente de I\kappaB que dura hasta una hora. Debido a la descomposición de la proteína inhibidora I\kappaB que tiene lugar al mismo tiempo, se produce una activación intensa y de larga duración de NF-\kappaB y la correspondiente secreción de la MCP-1. Esto resulta sorprendente con vistas al hecho de que la interacción con las plaquetas tiene lugar solo durante un tiempo relativamente corto.

El perfil de activación en el tiempo del complejo IKK durante la activación debida a las plaquetas activadas es básicamente distinto de las de la activación debida a IL-1\beta o TNF, que ya son conocidos según el estado de la técnica como activadores del complejo IKK. Las plaquetas activadas activan el complejo IKK durante unos 60 minutos, alcanzándose el nivel máximo de fosforilización al cabo de unos 30 minutos, y apenas se observa una diferencia entre la activación de IKK-\alpha y IKK-\beta. El TNF da lugar a una activación extremadamente intensa que dura solo unos pocos minutos, en particular del complejo IKK, pero que al cabo de 20 minutos ya no se puede demostrar. En cambio IL-1\beta provoca una activación de muy larga duración, en particular de IKK-\beta, que persiste durante unas dos horas. Sin embargo la activación de IKK-\beta es considerablemente menos intensa que la activación debida a las plaquetas
activadas.

Mediante la activación del complejo IKK con plaquetas activadas se activa por lo tanto la quinasa

\hbox{IKK- \beta }

de forma intensa y de larga duración, lo que resulta decisivo para la activación de NF-\kappaB en relación con la secreción de la MCP-1, y por lo tanto para la formación de placas en los procesos ateroescleróticos. Este mecanismo no solamente afecta a un paso decisivo en la regulación de procesos ateroescleróticos precoces, sino también en la formación, propagación y desestabilización de las placas.

La invención propone por lo tanto el empleo de un inhibidor de IKK-\beta para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de o a la prevención de la ateroesclerosis.

La invención ofrece la ventaja de que durante la inhibición de IKK-\beta en una fase precoz de aterogénesis, la capa endotelial todavía no está apantallada por la agregación de plaquetas o por la formación de trombos superficiales, de manera que las células endoteliales pueden ser alcanzadas de forma sencilla y eficaz con inhibidores que influyen en una expresión de la MCP-1. Esta fase está caracterizada por unas lesiones endoteliales mínimas, a menudo denominadas "fatty streaks".

La invención ofrece además la ventaja de que con la inhibición del IKK-\beta en las células endoteliales que estén contiguas a placas ateroescleróticas, se puede evitar el engrosamiento de las placas o se pueden estabilizar las placas existentes.

La invención ofrece además la ventaja de que se inhibe una proteína en la cascada de señales de la expresión de MCP-1, la cual juega un papel principal en la activación mediante plaquetas activadas, aunque la proteína no es la proteína NF-\kappaB, cuya influencia directa daría lugar a efectos secundarios graves, ya que NF-\kappaB también participa en la expresión de otras proteínas, como por ejemplo en la expresión de citoquinas, quemocinas, factores de crecimiento, por ejemplo TNF, IL-1\beta, IL-8, moléculas de adhesión, por ejemplo ICAM-1, VCAM-1 y ELAM-1, proteasas, como por ejemplo MMP-9 y en la molécula protombógena TF. Mediante la inhibición IKK-\beta se inhibe más bien una proteína que afecta a una vía de activación NF-\kappaB eficaz, relacionada especialmente con procesos ateroescleróticos.

La invención ofrece además la ventaja de que al evitar una secreción de larga duración de la MCP-1 procedente de células endoteliales, el efecto para evitar la inmigración de monocitos es incomparablemente superior que al evitar una secreción de la MCP-1 de corta duración pero más intensa, tal como sucede en el caso de una inhibición de TNF.

La invención ofrece además la ventaja de que se puede regular el flujo de monocitos/macrófagos a la pared vascular, a nivel de la capa endotelial y por lo tanto antes de que los monocitos/macrófagos hayan penetrado en la pared vascular.

A diferencia de los tratamientos convencionales de ateroesclerosis, de acuerdo con la invención se puede elegir una nueva clase de pacientes para una terapia, para quienes las terapias conocidas resultan ineficaces o para quienes las terapias conocidas se consideran inaceptables debido a los efectos secundarios.

Una primera subclase especial de pacientes incluye a aquellos que para evitar un episodio cardiovascular, tal como apoplejía o infarto cardiaco, son tratados de acuerdo con la invención, como profilaxis primaria, con un inhibidor de IKK-\beta, eligiéndose estos pacientes sobre la base de una evaluación de los factores de riesgo y/o basándose en un diagnóstico de una fase precoz de ateroesclerosis, pudiendo asignarse a esta primera subclase especial.

La elección y asignación de pacientes basándose en la evaluación de los factores de riesgo puede efectuarse sobre la base de una evaluación de los factores de riesgo conocidos. La evaluación de los factores de riesgo que se hayan determinado puede efectuarse de modo subjetivo, basándose en la experiencia general del médico que realiza el tratamiento, o de modo objetivo, basándose en procedimientos de evaluación normalizados. Se empleará preferentemente el procedimiento de evaluación normalizado. En particular se empleará el sistema de evaluación propuesto por G. Assmann y cols. (Circulation 2002; 105: 310-315), basado en el estudio PROCAM. En este sistema de evaluación se asignan a los siguientes factores de riesgo particulares de un paciente unos coeficientes normalizados, de cuya suma resulta un valor que está correlacionado con el riesgo de que aparezca un episodio cardiovascular agudo en los próximos diez años: edad, colesterina LDL, colesterina HDL, triglicéridos, fumador/no fumador, diabetes mellitus, casos de MI en la familia, así como la tensión arterial sistólica. Los pacientes que tengan un valor que sea superior o igual a 50 se pueden seleccionar y asignar a esta subclase.

La elección y asignación de pacientes basándose en un diagnóstico de una fase precoz de ateroesclerosis puede efectuarse tomando como base una evaluación de los síntomas conocidos de existencia de ateroesclerosis. En particular se puede efectuar la selección basándose en una medición del espesor de pared intima-máxima de la arteria carotis interna, donde un espesor superior a 1,2 mm es indicio de una alteración ateroesclerótica. La medición del espesor de pared se efectúa mediante un aparato de ultrasonido que permita una resolución adecuada, tal como por ejemplo un aparato de ultrasonido convencional con un cabezal sónico de 12 MHz.

A esta subclase pueden pertenecer también pacientes en los que, hasta la fecha haya aparecido un episodio cardiovascular y que presenten placas ricas en lípidos o incluso placas con sedimentos de cal.

De acuerdo con la invención, en esta subclase se puede impedir, mediante la administración de un inhibidor de IKK-\beta, por profilaxis primaria, la progresión de las alteraciones ateroescleróticas de los vasos, de manera que se reduce el riesgo de un episodio cardiovascular o el aumento del riesgo de un episodio cardiovascular.

Una segunda subclase especial de pacientes se refiere a aquellos que, para evitar otros episodios cardiovasculares como apoplejía o infarto, son tratados para profilaxis secundaria después de un episodio cardiovascular, de acuerdo con la invención, con un inhibidor de IKK-\beta. En este caso, los pacientes se pueden seleccionar únicamente basándose en el episodio primario y/o tal como se ha descrito anteriormente, basándose en una evaluación de los factores de riesgo y/o basándose en un diagnostico de ateroesclerosis, asignándolos a esta segunda subclase especial.

La presente invención se refiere también por tanto a procedimientos para la prevención o el tratamiento de la ateroesclerosis, que están caracterizados porque a los pacientes se les administra un inhibidor de IKK-\beta. El inhibidor se puede administrar de todas las formas conocidas. Por ejemplo, el inhibidor se puede administrar por vía enteral o parenteral. El inhibidor también se puede administrar como fase previa, por ejemplo como vector, mediante una terapia genética. La administración enteral se realizará preferentemente por vía oral. La administración parenteral puede ser intravenosa, intraarterial, intramuscular o subcutánea, prefiriéndose la administración intravenosa o intraarterial. También existe la posibilidad de combinar la administración del inhibidor por vía enteral, parenteral o mediante terapia genética. Para el caso de que se tenga que administrar el inhibidor de forma repetida a lo largo de un periodo de tiempo prolongado, se elegirá preferentemente un inhibidor que se pueda administrar por vía oral.

En una forma de realización preferida, se trata de pacientes pertenecientes a la primera subclase especial. En este procedimiento para la prevención o el tratamiento de la ateroesclerosis antes de un episodio cardiovascular primario, el inhibidor se administra preferentemente por vía oral.

En otra forma de realización preferida los pacientes son personas pertenecientes a la segunda subclase especial. En este procedimiento para la prevención o el tratamiento de la ateroesclerosis antes de un episodio cardiovascular primario, el inhibidor se administra preferentemente por vía oral.

En otra forma de realización preferida se trata de pacientes pertenecientes a la primera o a la segunda subclase especial, administrándose el inhibidor como etapa previa a través de un vector en las células endoteliales de los vasos, para tener dispuesto el inhibidor en las células endoteliales como producto de expresión de una o varias secuencias de nucleótidos del vector. Este planteamiento ofrece la ventaja de que se evita la administración repetida al paciente de un medicamento durante un período de tiempo prolongado.

A continuación se describe la invención con mayores detalles.

La inhibición de IKK-\beta puede efectuarse a nivel de ADN por el hecho de que se impida la expresión de la proteína. La inhibición puede iniciarse en todas las fases de la expresión genética, así por ejemplo en el propio gen o en los productos de expresión tales como ARNs y proteínas. Por el estado de la técnica se conocen diversos procedimientos para la alteración estructural de los genes. En particular, se remite al empleo de vectores especiales. En los ejemplos se describe una utilización especial de un vector. La expresión de IKK-\beta se puede impedir además frenando la trascripción o la traslación del gen IKK-\beta o del correspondiente ARNm. Como ejemplos de tales inhibidores se pueden citar los ARN-antisense y las ribocimas.

La inhibición de IKK-\beta, sin embargo se puede efectuar también a nivel de proteína, inhibiendo para ello la función de la proteína IKK-\beta expresada. La inhibición a nivel de proteína puede efectuarse mediante proteínas o no-proteínas. Como ejemplos de proteínas inhibidoras pueden citarse anticuerpos que reaccionen con epitopos de IKK-\beta, o proteínas que tengan una interacción con un punto activo de IKK-\beta impidiendo la actividad de fosforilización. Ejemplos de no-proteínas son las substancias activas que tengan interacción con un punto activo de IKK-\beta e impidan la actividad de fosforilización. Para ejemplos especiales de inhibidores moleculares de IKK-\beta se hace referencia expresa a la patente US-A 5.939.302.

El inhibidor es preferentemente selectivo para IKK-\beta.

En una forma de realización preferida de la presente invención, el inhibidor es un compuesto que frena la expresión del gen que codifica IKK-\beta, por ejemplo una ribocima o un ARN-antisense. En una forma de realización especialmente preferida, el inhibidor es un ARN-antisense, que es complementario del ARNm transcrito por el gen codificado IKK-\beta o una parte de éste, preferentemente la zona codificada, y que se puede combinar específicamente con este ARNm, con lo cual se reduce o frena la síntesis de IKK-\beta. En otra forma de realización especialmente preferida el inhibidor es una ribocima, que es complementaria del ARNm transcrito por el gen codificado IKK-\beta o una parte de éste, y que se puede combinar específicamente con este ARNm y disgregarse de éste, con lo cual se reduce o frena la síntesis de IKK-\beta. Procedimientos adecuados para la preparación de ARN-antisense se describen en las patentes EB-B1 0 223 399 o EP-A1 0 458. Las ribocimas se componen de un único ramal de ARN y pueden fisionar intermolecularmente otros ARNs, por ejemplo, los ARNm transcritos por las secuencias que codifican el IKK-\beta. Estas ribocimas han de disponer principalmente de dos dominios, (1) un dominio catalítico \gamma (2) un dominio que sea complementario del ARN de destino, y que se pueda combinar con éste, lo que constituye una condición previa para la fisión del ARN de destino. Partiendo de las formas de proceder descritas en la bibliografía existe mientras tanto la posibilidad de construir ribocimas específicas que seccionen un ARN deseado en un punto determinado preseleccionado (véase por ejemplo: Tanner y cols., en: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993, 415-426).

En otra forma de realización preferida, el inhibidor es un vector.

En otra forma de realización preferida, el inhibidor es un anticuerpo que combina IKK-\beta o un fragmento de éste. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales o sintéticos, o fragmentos de éstos. A este respecto, el concepto de "fragmento" se refiere a todas las partes del anticuerpo monoclonal (por ejemplo fragmentos Fab, Fv o "single chain Fv"), que tengan la misma epitopoespecificidad que el anticuerpo completo. Los anticuerpos objeto de la invención son preferentemente anticuerpos monoclonales. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo procedente de un animal (por ejemplo ratón), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico o un fragmento de éstos. Los anticuerpos quiméricos, semejantes a los anticuerpos humanos o los anticuerpos humanizados, poseen un carácter antígeno potencial reducido, pero en cambio no está reducida su afinidad con respecto al objetivo. La preparación de anticuerpos quiméricos y humanizados, o de anticuerpos semejantes a anticuerpos humanos ya ha sido descrita detalladamente (véase por ejemplo Queen y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, y Verhoeyan y cols., Science 239 (1988), 1534). Las inmunoglobulinas humanizadas presentan unos sectores de estructura básica variable, que proceden esencialmente de una inmunoglobulina humana (con la designación de inmonoglobulina-aceptador) y la complementariedad de los sectores determinantes que proceden esencialmente de una inmunoglobulina no-humana (por ejemplo de ratón) (con la designación de inmunoglobulina de donante). El sector o sectores constantes proceden, en su caso, también esencialmente de una inmunoglobulina humana. En la administración a pacientes humanos, los anticuerpos humanizados (así como los humanos) presentan una serie de ventajas frente a los anticuerpos procedentes de ratones o de otras especies: (a) el sistema inmunitario humano no debería reconocer como extraña la estructura básica o el sector constante del anticuerpo humanizado y por lo tanto, la respuesta inmune contra un anticuerpo de esta clase que haya sido inyectado debería ser menor que frente a un anticuerpo de ratón totalmente extraño o un anticuerpo quimérico parcialmente extraño; (b) dado que el campo efector del anticuerpo humanizado es humano, interactúa mejor con otras partes del sistema inmunitario humano, y (c) los anticuerpos humanizados inyectados presentan un tiempo de semidesintegración que es esencialmente equivalente al de los anticuerpos humanos naturales, lo que permite administrar dosis menores y con menor frecuencia en comparación con los anticuerpos de otras especies.

También se pueden utilizar ácidos nucleicos que combinen directamente con las proteínas, los llamados aptámeros. Estos se identifican y depuran a través de las proteínas depuradas de grandes bibliotecas de ARNs modificados químicamente.

Los inhibidores de aptámeros, de ribocima, de ARN anti-sense y de anticuerpos se pueden administrar como tales o también preferentemente a través de la terapia genética, para lo cual se insertan preferentemente en un vector de expresión unas secuencias de ADN codificadas adecuadas y se llevan al tejido de destino. De esta manera, la presente invención comprende también vectores de expresión que contengan estas secuencias de ADN que codifiquen los inhibidores. La expresión "vector" se refiere a un virus o a otro vehículo adecuado. Las secuencias de ADN están enlazadas funcionalmente en el vector con elementos reguladores, que permiten su expresión en células huésped eucarióticas. Estos vectores contienen además de los elementos reguladores, por ejemplo un promotor, típicamente un origen de replicación y genes específicos que permiten la selección fenotípica de una célula huésped transformada. Secuencias reguladoras adecuadas se describen además en Goeddel: Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Entre los vectores de expresión adecuados para células de mamíferos se cuentan por ejemplo los vectores procedentes de pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 y pCEV4 así como de pcDNA/amp, pcDNAZ/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, psV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y de pHyg.

Las secuencias de ADN descritas anteriormente se insertan preferentemente en un vector adecuado para la terapia genética, por ejemplo bajo el control de un promotor específico del tejido, y se transportan al interior de las células. En una forma de realización preferida el vector que contiene las secuencias de ADN antes descritas es un virus, como por ejemplo un adenovirus, un virus adeno-asociado, vaccinia-virus o retrovirus. Ejemplos de retrovirus adecuados son MomuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV o GaLV. Se prefieren especialmente los adenovirus, en particular aquellos que contienen mutaciones E1 y/o E3 (delecciones), que pueden presentar adicionalmente una mutación E4 (delección) o los llamados adenovirus "glutless". Los vectores adecuados para una terapia genética se describen además en las WO 93/04701, WO 92/22635 WO 92/20316, WO 92/19749 y WO 92/06180. Para los fines de terapia genética, las secuencias de ADN objeto de la invención también se pueden transportar a las células de destino en forma de dispersiones coloidales. Esto incluye por ejemplo los liposomas o los lipoplexos (Mannino y cols., Biotechniques 8 (1988), 682).

Para la construcción de los vectores de expresión que contengan estas secuencias de ADN y secuencias de control adecuadas se pueden emplear procedimientos generales conocidos en el campo técnico. Estos conocimientos incluyen, por ejemplo técnicas de recombinación in vitro, procedimientos sintéticos así como procedimientos de recombinación in vivo, tal como se describen en los libros de texto corrientes.

Los compuestos anteriores o que contengan estas secuencias de ADN codificadas o vectores se administran eventualmente con un soporte farmacéuticamente compatible.

El técnico conoce soportes adecuados y la formulación de esta clase de medicamentos. Entre los soportes adecuados se encuentran, por ejemplo, soluciones de sal de cocina tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, por ejemplo emulsiones de aceite/agua, humidificantes, soluciones estériles, etc. La dosis adecuada la determina el médico que realiza el tratamiento, y depende de diversos factores, como por ejemplo, de la edad, del sexo, del peso del paciente, de la clase y fase de la cardiopatía o de la forma de administración.

En otra forma de realización preferida, el inhibidor es una sustancia activa que se elije de entre el grupo siguiente:

Sulinda (véase Y. Yamamoto y cols., J. Biol. Chem. 1999; 274 (38): 27307-14); NEMO-binding domain peptide (véase May Mj. y cols., Science 2000; 289: 1550-4); 3-[(4-metilfenil)-sulfonil]-2-propenonitrilo y 3-[(4-t-butilfenil-sulfonil]-2-propenonitrilo (véase J. W. Pierce y cols., J. Biol. Chem. 1997; 272(34)).

La presente invención presenta además un procedimiento de screening (selección primaria) para la localización de inhibidores selectivos de IKK-\beta, en elcual se utilizan células endoteliales activadas para ensayar la eficacia de las sustancias activas potenciales, especialmente para evitar una secreción de la MCP-1.

Una actividad enzimática o expresión genética reducida o totalmente frenada indica que el compuesto objeto del ensayo es eficaz como inhibidor. El especialista conoce ensayos adecuados. Este procedimiento se lleva a cabo en un ensayo celular, en el que se emplean células endoteliales. En cuanto a los compuestos objeto del ensayo se puede tratar de compuestos muy diversos, tanto de compuestos de origen natural como también sintéticos, orgánicos e inorgánicos, así como de polímeros (como por ejemplo oligopéptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y polinucleótidos), así como de pequeñas moléculas, anticuerpos, azúcar, ácidos grasos, nucleótidos y análogos a nucleótidos, análogos de estructuras de origen natural (por ejemplo "imitadores" de péptido, análogos de ácido nucleico, etc.) y otros numerosos compuestos. Además de esto se pueden clasificar como material de partida gran número de compuestos frenadores de IKK-\beta posiblemente útiles, en extractos de productos naturales. Estos extractos pueden proceder de una gran diversidad de fuentes, por ejemplo de especies de hongos, actinomicetos, algas, insectos, protozoos, plantas y bacterias. Los extractos que presenten actividad se pueden analizar entonces para aislar la molécula activa. Véase por ejemplo Turner, J. Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 3943 y Suh, Anticancer Res. 15 (1995) 233-239. En la industria biotecnológica y farmacéutica se conocen bien formatos de ensayo básicamente adecuados para la identificación de compuestos de ensayo que influyan en la expresión o actividad de IKK-\beta y para el técnico resultan evidentes otros ensayos adicionales y variaciones de estos ensayos. Las alteraciones en el nivel de expresión IKK-\beta se pueden investigar utilizando procedimientos bien conocidos para el especialista. Esto incluye la vigilancia de la concentración de ARNm (por ejemplo utilizando sondas o cebadores adecuados), inmunoensayos en cuanto a la concentración de proteínas, ensayos de protección de ARN, ensayos de amplificación y cualquier otro medio que sea adecuado para una demostración y que sea conocido para el especialista.

La búsqueda de inhibidores también puede efectuarse a gran escala, por ejemplo clasificando en bibliotecas de sustancias un número muy grande de compuestos candidatos, pudiendo contener las bibliotecas de sustancias molécula sintéticas y/o naturales.

En cualquier caso, la preparación y clasificación simultánea de grandes bancos de moléculas sintéticas puede realizarse mediante procedimientos bien conocidos de la química combinatoria, véase por ejemplo van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 y Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167. El procedimiento objeto de la invención también se puede acelerar intensamente como screening (selección primaria) de alto caudal ("high throughput screening"). Los ensayos aquí descritos se pueden modificar debidamente para utilizarlos en un procedimiento de esta clase.

La figura 1 muestra interacciones entre plaquetas y células endoteliales in vivo. Las interacciones de células endoteliales y plaquetas se investigaron mediante microscopía intravital en arteriolos de la microvascularización de un intestino de ratones, que habían sido sometidos a condiciones isquémicas (ACTIVADO, activated). Unos animales experimentales sirvieron como control (en reposo, resting). Figura 1A: Las plaquetas se clasificaron de acuerdo con sus interacciones con las células endoteliales, tal como se describe en el estado de la técnica (1, 2): las plaquetas rodantes se indican como número de células por segundo y milímetro de diámetro de vaso (Rolling); las plaquetas adheridas se indican como cantidad por mm^{2} de superficie vascular (Firm adhesion), valor medio +- SEM, n = 6 animales de ensayo por grupo. *p < 0,01 con respecto a los experimentales (Método de Dunn'sche). Figura 1B: Plaquetas marcadas con rodamina-6G se hicieron visibles en arteriolos empleando microscopía fluorescente intravital. Aunque sólo hay pocas plaquetas adheridas en el endotelio en los animales experimentales, la adherencia de las plaquetas en las células endoteliales aumenta de forma significativa en condiciones de isquemia. Ampliación de las tomas: 450 veces.

La figura 2 muestra una adherencia de plaquetas - endotelios hecha visible mediante microscopía electrónica, sobre una monocapa endotelial. Se empleó la miscroscopía electrónica para mostrar que las plaquetas se adhieren a una monocapa endotelial postisquémica intacta. Figura 2A: Se muestra una plaqueta rodante con contacto suelto respecto al endotelio. Obsérvese el aspecto normal y la distribución normal de los gránulos de plaquetas. La figura 2B muestra una plaqueta firmemente adherida a la monocapa endotelial. En las zonas de separación y de firme adherencia la plaqueta ha sufrido una desgranulación significativa, lo cual es indicio de una segregación de compuestos procedentes de la plaqueta. Ampliación: 20.000 veces. Las barras significan 0,5 \mum.

La figura 3 muestra que la adhesión de las plaquetas al endotelio está relacionada con una activación de NF-\kappaB. Unos cortes criostáticos de muestras de intestino se incubaron con un anticuerpo monoclonal (mAb) frente a p65 (= NF-\kappaB activado) emitido por I\kappaB, seguido de un teñido sirviéndose de la técnica de peroxidasa - antiperoxidasa. La inmunoreactividad p65 queda señalizada por el producto de reacción rojo (que en la figura aparece oscuro). Figura 3A: En los animales de control (Resting), en el endotelio vascular no había prácticamente ninguna inmunoreactividad de p65. Figura 3B: En experimentos con adhesión endotélica de plaquetas intensificada (Activated) se encontró más intensamente una coloración p65 en los arteriolos y en el tejido circundante. Figura 3C: En las zonas con acumulación masiva de plaquetas, que se muestra en una ampliación de un detalle de la Figura 3B, el p65 emitido por I\kappaB se encontraba preferentemente en la monocapa endotelial (flechas). Ampliación: 40 veces en la figura 3A y 3B y 100 veces en la figura 3C. Las barras significan 10 \mum.

La figura 4 muestra el efecto de una interacción transitoria de plaquetas activadas con HUVEC sobre la secreción de la MCP-1. El HUVEC se trató, con o sin plaquetas activadas, con \alpha-trombina (PLT; 2 \times 10^{8}/ml), IL-1\beta (100 pg/ml) o TNF (1,67 ng/ml), durante 5 a 300 minutos. A continuación se eliminaron las plaquetas o citoquinas mediante lavado y se añadió nuevo medio de cultivo. Las células se incubaron durante un total de 5 horas. A continuación se aspiró el exceso y se empleó un ELISA para medir la MCP-1. Las curvas muestran el valor medio +/- la desviación estándar de cuatro experimentos independientes, cada uno de los cuales se realizó tres veces.

La figura 5 muestra la activación de NF-\kappaB dependiente de la simulación y la descomposición de I\kappaB en HUVEC. Figura 5A: Extractos de núcleo de HUVEC estimulado con plaquetas (PLT; 2 \times 10^{8}/ml) se investigaron mediante EMSA en cuanto a NF-\kappaB o combinación Sp-1, lo que está representado entre paréntesis. Figura 5B: Se analizaron extractos de citosol procedentes de células estimuladas con plaquetas sirviéndose de Western-Blots. Las proteínas I\kappaB-\alpha, I\kappaB-\varepsilon, IKK-\alpha e IKK-\beta están indicadas mediante puntas de flecha. Como control de carga sirvió \alpha-actina. Figura 5C: Se investigaron extractos de citosol procedentes de células estimuladas con IL-\beta (100 pg/ml) sirviéndose de Western-Blots. Figura 5D: Las células se incubaron con TNF (1,67 ng/ml) y los extractos de citosol se investigaron sirviéndose de Western-Blots. La flecha superior muestra las formas fosforilizadas de I\kappaB-\alpha o -\varepsilon. Para todos los casos se muestra un Blot representativo (n = 3).

La figura 6 muestra la activación compleja diferencial IKK en células endoteliales. Las células se incubaron tal como se ha indicado y se prepararon extractos de citosol. Después de una immunoprecipitación (IP) mediante anticuerpos de antiquinasa, tal como se ha indicado, se efectuó un ensayo de quinasa, empleando el sustrato GST.I\kappaB-\alpha en presencia de ^{32}P-ATP. Se muestra una fosforilización del sustrato en función del tiempo, respectivamente después de la estimulación de HUVEC con plaquetas (PLT; 2 \times 10^{8}/ml) (figura 6A), IL-1\beta (100 pg/ml) (figura 6B) o TNF (1,67 ng/ml) (figura 6C). Para cada uno de los casos se muestra un experimento representativo (n = 3). Figura 6D: Los ensayos de quinasa se escanearon y se analizaron por densitometría. El diagrama muestra los factores de inducción de la actividad IKK frente a los controles, después de la estimulación.

La figura 7 muestra que la transcripción dependiente del Promotor \kappaB- y MCP-1/VCAM-1 se inhibe por sobreexpresión de componentes del complejo IKK dominantes negativos. Figura 7A y figura 7B: Se cotransformaron células ECV304 mediante 3kB.luci, pRLtk y plásmidos de hiperexpresión de quinasa (IKK-\alpha, -\beta o NIK, tipo salvaje o mutado, o un vector vacío, CVM), en transformacionesindividuales o dobles, tal como se ha indicado. Después de una incubación durante una noche se estimularon las células, bien con plaquetas activadas (PLT; 108/ml) (figura 7A) o IL-1\beta (100 pg/ml) (figura 7B), durante 60 minutos. Al cabo de otras 15 horas se lisaron las células y se midió el RLU de luciérnaga y de Renilla. Los resultados se muestran como múltiplos de la inducción respecto a aquellos que se habían obtenido con células transformadas CMV sin estimular. Las barras de la izquierda muestran el efecto bien de NIK salvaje (wt) o mutado así como de IKK-\alpha y -\beta sobre la transcripción dependiente de \kappaB inducida por el estímulo. Se muestran ensayos representativos (n = 3). Con; células no estimuladas. Figura 7C: Unas células tal como las indicadas se transformaron bien mediante un plásmido reporter de luciferasa dependiente de un promotor MCP-1 o VCAM-1, junto con pRLtk e IKK, a través de plásmidos de expresión. Después de una estimulación con plaquetas o IL-1\beta se midió el RLU de luciérnaga y de Renilla. Los resultados se muestran como porcentaje de inhibición obtenido en relación con las células transformadas con el tipo salvaje (wt), que se indican en la línea de puntos en el 100%. Las barras muestran el valor medio \pm desviación estándar procedentes de tres experimentos independientes. \alpha, IKK-\alpha; \beta, IKK-\beta: KA el punto activo de quinasa está mutado.

La figura 8 muestra que el transfer IKK-\beta dominante negativo transmitido mediante rAAV inhibe una secreción endotelial de la MCP-1 inducida por plaquetas e IL-1\beta. Los subconfluentes HUVEC se dejaron sin tratar, o se transformaron mediante mutantes de control, rAAV-GFP, rAAV-IKK-\beta tipo salvaje o rAAV-IKK-\beta_{\kappa A} mutante dominante negativo. 48 horas después de una transformación se dejaron las células sin tratar o se estimularon durante 60 minutos con plaquetas activadas (PLT; 2 \times 10^{8}/ml) o IL-1\beta (100 pg/ml), se lavaron y se siguieron incubando tal como está indicado. Figura 8A: Las células se investigaron en cuanto a expresión GFP mediante citometría de flujo, para determinar el rendimiento de transformación. La curva señalada como non infected muestra células no infectadas, y la curva marcada con rAAV-GFP-infected muestra células que fueron tratadas con rAAV-GFP. Aproximadamente el 50% de los HUVEC se infectan con rAAV-GFP. Figura 8B: Una expresión de GFP se analizó mediante microscopía fluorescente. Imagen superior: Contraste de fases de la monocapa HUVEC; Imagen inferior: La correspondiente micrografía de fluorescencia verde (puntos claros). Figura 8C: Se investigaron extractos de citosol de HUVEC transformados con rAAV-IKK-\beta, rAAV-IKK-\beta_{\kappa A} o rAAV-GFP mediante Western-Blots en cuanto a proteína IKK-\beta endógena (GFP) y sobreexprimida. Como control de carga se utilizó \alpha-actina. Figura 8D: 4 horas después del lavado se determinó cuantitativamente la MCP-1 soluble en el remanente de las células, sirviéndose de ELISA. Los datos se muestran como valor medio \pm desviación estándar, procedente cada uno de tres experimentos realizados por duplicado.

La invención se describe a continuación con mayor detalle sirviéndose de algunos ejemplos especiales.

Ejemplos Materiales y métodos Animales y microscopía de fluorescencia intravital

Se emplearon ratones hembra Balb/c (Charles River, Sulzfeld) de 5 a 7 semanas de edad (10 animales de ensayo, 10 donantes de plaquetas). El procedimiento quirúrgico es parte del estado de la técnica (1, 2). En particular, se separó hacia el exterior un segmento del yeyuno y se sometió a una isquemia normotérmica de 60 minutos. Las plaquetas de los ratones se aislaron de plétora y se marcaron con rodamina-6G. Las interacciones entre plaquetas y células endoteliales se investigaron en la microvascularización postisquémica en arteriolos submucosas mediante microscopía intravital, 60 minutos antes y 60 después de la isquemia. Se eligieron al azar cinco zonas interesadas, que no se solapaban y se llevó a cabo una determinación cuantitativa de las interacciones de plaquetas-células endotelicas. Estas interacciones se clasificaron como adhesión de plaquetas rodante ("Rolling") o firme.

Microscopio electrónico e investigaciones inmunohistoquímicas

Se tomaron muestras de los segmentos del intestino 60 minutos antes y 60 minutos después de la isquemia. Para fines de microscopía electrónica se fijó el tejido y se trató tal como se describe en el estado de la técnica (2). Se cortaron zonas ultradelgadas y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se investigaron bajo un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 900 (Zeiss, Oberkochen), que funciona a 80 kV. A efectos del teñido inmune las biopsias se colocaron en un compuesto O.C.T. (Tissue-Tek; Miles Inc., Elkhart, IN, USA) y se congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido. Para hacer visible el NF-\kappaB activado se incubaron cortes crioestáticos fijados con acetona (6 \mum) con \alpha-p65mAb ratón antihumano conjugado con biotina (Roche Diagnostics, Mannheim), que reacciona selectivamente con p65 sólo en ausencia de I\kappaB, y que por lo tanto reconoce la forma activada de NF-\kappaB, y que reacciona de forma cruzada con los correspondientes antígenos de ratón (3). Después de una incubación con el anticuerpo primario se tiñeron las secciones con kits de inmunoistoquimia de peroxidada (Vectastain, Camon, Wiesbaden). La actividad endógena de peroxidada se bloqueó mediante metanol H_{2}O_{2} durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Cultivo de las células

Se obtuvieron cultivos primarios de células endótelicas de vena de ombligo humano (HUVEC) mediante tratamiento con colagenasa de venas umbilicales, tal como se describe en (4). Se reunieron las células de 4 - 6 preparaciones y se cultivaron sobre placas de cultivo con 24 depresiones en un medio de cultivo de células endótelicas completo (PromoCell, Heidelberg), que contenía un 2% de FCS, 1 \mug/ml de hidrocortisona, 0,1 ng/ml de hEGF, 1,0 ng/ml de FGF, 50 \mug/ml de gentamicina y 2,5 \mug/ml de anfotericina B.

La línea de células endoteliales humanas ECV304 (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA) se cultivó en M199, que estaba enriquecido con 10% de FCS, 1% de piruvato sódico, 1 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina (Biochrom, Berlín). Con el fin de eliminar la contaminación por endotoxinas se sometieron todas las soluciones cristaloides a ultrafiltración (U 200, Gambro, Hechingen), y las soluciones madre de proteínas se descontaminaron mediante columnas de polimixina (Pierce, Rockford, IL, USA). Para excluir la contaminación por endotoxinas se evaluaron todas las suspensiones de células en un ensayo de lisado con amoebocito con limulus que formaba colorante (Schulz, Heidelberg), después de cada uno de los experimentos.

Determinación de la MCP-1

Las concentraciones de proteína MCP-1 se determinaron en los remanentes de HUVEC mediante ELISA (Quantikine R&D, Wiesbaden-Nordenstadt).

Cultivo conjunto de monocapas de endotelios con plaquetas

Las plaquetas se aislaron de plétora tratada con anticoagulante ácido-citrato-dextrosa, obtenido de personas sanas, que no eran fumadoras, que no estuvieran bajo la influencia de ningún medicamento del que se sepa que influye en la función de las plaquetas. Las plaquetas se lavaron y se resuspendieron en solución de Tyrode tampón/HEPES (HEPES 2,5 mM, 150 mM de NaCl, 12 mM de NaHCO_{3}, 2,5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl_{2}, 5,5 mM de D-glucosa, 1mg/ml de BSA, pH 7,4), para obtener un número de plaquetas de 4 \times 10^{8}/ml tal como se describe en (5). Las plaquetas se preestimularon durante 20 minutos con 2 U/ml de \alpha-trombina (Sigma, Deisenhofen), seguido de una antagonización de la trombina mediante 5 U/ml de hirudina (Roche Diagnostics). Se verificó la activación de las plaquetas mediante la determinación de la expresión superficial P-selectin y del receptor del fibrinógeno activado (LIBS-1, Dr. Mark Ginsberg, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Se añadió 1 ml de la suspensión de plaquetas a 1 ml de medio completo (cantidad final de plaquetas 10^{8}/ml) y se pasó a depresiones con monocapas confluentes HUVEC sobre placas con 6 rebajes. Las células se dejaron sin tratar o se incubaron a 37ºC con plaquetas tal como se indica.

Por último se eliminaron las plaquetas mediante varias etapas de lavado cuidadosas y se añadió medio de cultivo a las depresiones hasta que hubo trascurrido el tiempo total de incubación. Mediante investigaciones provisionales, utilizando un anti-CD42b mAb específico para plaquetas se aseguró por vía microscópica y citometría de flujo que mediante el lavado se habían eliminado todas las plaquetas de la monocapa de endotelio.

Electrophoretic mobility shift assay (EMSA = Ensayo de retardo con gel)

Se prepararon y se analizaron extractos de núcleos de las células tal como se describe en el estado de la técnica (6). El oligonucleótido prototípico de cadenas de \kappa inmunoglobulina se empleó como sonda y se marcó mediante el fragmento Nenow de ADN polimerasa I (Roche Diagnostics). Las proteínas de núcleo se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en un tampón de combinación (6), mediante sondas radiomarcadas con [\alpha-^{32}P]dCTP (NEN Life Science Products, Bruselas, Bélgica). Las muestras se dejaron correr en 0,25x TBE sobre geles de poliacrilamida al cuatro por ciento no desnaturalizadas. La combinación del factor de transcripción Sp-1 se analizó utilizando un oligonucleótido de consenso (Promega, Heidelberg), que estaba marcado con [\gamma-^{32}P]ATP (NEN Life Science Products) y T4 quinasa de polinucleótido (Roche Diagnostics). Los geles se secaron y se analizaron por autoradiografía.

PAGE y análisis Western Blot

Se aislaron extractos de citosol y se llevó a cabo una electroforesis y un blotting tal como se describe en el estado de la técnica (6, 7). Después de transferirlas las membranas se incubaron con anticuerpos contra I\kappaB-\alpha (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg), I\kappaB-\varepsilon (Profesor N. Rice, NIH, Frederick, MD), IKK-\alpha, IKK-\beta (Santa Cruz Biotechnology) o \alpha-actina (Sigma). Las proteínas se hicieron visibles sobre película de rayos X utilizando un reactivo químico luminiscente Western Blot (NEN Life Science Products). Los tamaños de las proteínas se confirmaron por medio de patrones de peso molecular (Amersham Pharmacia Biotech, Braunschweig, Bio-Rad, Munich).

Inmunoprecipitación y ensayo de quinasa

Los extractos de citosol se sometieron a una inmunoprecipitación (IP) (7) en tampón TNT, que contenía 1 mM de ditiotreitol, 0,5 \muM 4-(2-aminoetil)-benzolsulfonilfluoruro (AEBSF) y 0,75 \mug/ml respectivamente de leupeptina, antipaina, aprotinina, pepstatina A, quimostatina (Sigma). Las combinaciones no específicas se bloquearon mediante incubación con 1 \mug de IgG de conejo normal (Santa Cruz Biotechnology) y 25 \mul de 6% proteína A-Agarosa (Roche-Diagnostics) durante 30 minutos a 4ºC, seguidos de una inumnoprecipitación durante 2 horas a 4ºC con 1 \mug de un anticuerpo antiquinasa adecuado (Santa Cruz Biotechnology). Después de lavar tres veces respectivamente con TNT y tampón de quinasa (20 mM HEPES, pH 8,0; 10 mM de MgCl_{2}, 100 \muM de Na_{3}VO_{4}; 20 mM de \beta-glicerofosfato; 50 mM de NaCl; 2 mM de ditiotreitol; 0,5 \muM AEBSF, 0,75 \mug/ml respectivamente de leupeptina, antipaina, aprotinina, pepstatina A, quimostatina), se analizaron las proteinas precipitadas mediante un ensayo de quinasa. La reacción se llevó a cabo en un tampón de quinasa durante 30 minutos a 30ºC en presencia de 5 \muCi [\gamma-^{32}P]ATP (NEN Life Science Products) y GST-I\kappaB-\alpha (Santa Cruz Biotechnology).Las proteínas se analizaron mediante PAGE y se hicieron visibles mediante autorradiografía.

Transfección de células endoteliales

En las investigaciones sobre transfección se emplearon los siguientes plásmidos reporter:

-

3x\kappaB-luci, un plásmido reportador de luciferasa de la luciérnaga, que contiene tres copias de un punto \kappaB prototípico (7);

-

VCAM-1.luci, comprendiendo 1811 pares de bases de la gama del promotor VCAM-1 (Dr. Nigel Mackmann, Scripps Research Instituite, La Jolla, CA); y

-

-MCT-1.luci, conteniendo las zonas proximales de promotor y distales de reforzador del gen MCP-1 humano (8, 9) (Dr. Teizo Yoshimura, NIH, Frederick, MD).

Se emplearon los siguientes plásmidos de hiperexpresión:

-

IKK-\alpha

-

IKK-\beta

-

NIK

(Tipo salvaje y mutado, formas inactivas de quinasa, Dr. Mike Rothe, Tularik Inc., South San Francisco, CA).

Como control negativo se empleó ROCMV vacío (Invitrogen, Groningen, Holanda). Estos plásmidos se cotransformaron solos o en combinación, de forma transitoria, con un plásmido de control de luciferasa Renilla, constitutivamente activo, PRLtk (Promega), en células endoteliales, tal como se describe en el estado de la técnica (10). Al cabo de 24 horas se estimularon las células durante 60 minutos, bien con IL-1\beta o con plaquetas, seguido de un cultivo durante otras 15 horas. Después de la estimulación se lisaron las células y se determinó la actividad de luciferasa, utilizando el sistema de ensayo dual reportero de luciferasa (Promega). Los resultados se expresan como relación entre las unidades luminosas relativas (RLU) de piróforos y luciferasa-renilla.

Construcción y depuración de un virus recombinante adeno-asociado

El plásmido pTR-UF5 fue facilitado por Dr. Muzyczka (Gene Therapy Center, Gainsville, Florida) (11, 12) y el plásmido pDG fue facilitado por Dr. Kleinschmidt (Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Heidelberg, Alemania) (11, 13). Se construyó un virus recombinante, adeno-asociado deficiente de replicación (rAAV), que contiene la proteína fluorescente verde (rAAV-GFP) del tipo humano IKK-\beta (rAAV-IKK-\beta) o IKK-\beta_{KA}mutado(rAAV-IKK-\beta_{KA}), en la forma siguiente: La secuencia de codificación de tipo salvaje o del IKK-\beta mutado se insertó en la secuencia multienlace del vector pTR-UF5. Los plásmidos contenidos se cotransformaron a continuación con el plásmido pDG en células subconfluentes HEK 293 empleando un método modificado de coprecipitación de fosfato cálcico, y la generación de rAAV se realizó tal como se describe en el estado de la técnica (13, 14). El título de las partículas virales infecciosas (IVP) se evaluó mediante infección de células HeLa proliferantes.

Transducción de células endoteliales

HUVEC se extendió sobre placas con 96 depresiones a razón de 10^{4} células por depresión, en 200 \mul de medio de cultivo. Al producirse la subconfluencia, aproximadamente 16 a 24 horas más tarde, se añadieron a cada célula de 1 a 3 \times 10^{3} IVP de rAAV. Los medios se cambiaron 16 horas después de añadir rAAV, y las células transducidas se cultivaron durante otras 48 horas. A continuación se estimularon las células durante 60 minutos con plaquetas activadas con IL-1\beta o \alpha-trombina, evaluándose 4 horas más tarde una secreción de MCP-1. El rendimiento de la transducción endotelial rAAV-GFP se evaluó mediante citometría de flujo, microscopía fluorescente y Western Blot.

Resultados Interacción de plaquetas en vivo

El modelo de ratón de la isquemia aquí utilizado permite diferenciar distintas clases de adhesión de plaquetas, que se hizo visible mediante microscopía intravital.

En estado fisiológico in vivo, las plaquetas circulantes raras veces interactúan con el endotelio microvascular (figura 1A y B en reposo). Se observaron pocas plaquetas que rodaban a lo largo del revestimiento de células endoteliales de los arteriolos (< 1/s/ml). Al mismo tiempo, por mm^{2} de superficie de células endoteliales se encontraron únicamente 38 \pm 16 plaquetas firmemente adheridas.

En cambio, en el caso de realizar mediciones similares en arteriolos bajo condiciones de isquemia (isquemia de 60 minutos) se halló una adhesión de plaquetas en células endoteliales tremendamente incrementada (figura 1 A y B activada). Se halló un incremento de aproximadamente 160 veces en la interacción rodante y un incremento de 13 veces de la adhesión firme de las plaquetas en endotelio isquémico (P <0,01).

Adhesión firme de plaquetas en el endotelio, que induce una secreción de gránulos

Para investigar las alteraciones morfológicas que tienen lugar en las plaquetas cuando éstas se adhieren in vivo al endotelio vascular se realizaron investigaciones con microscopio electrónico. Se halló que algunas plaquetas aisladas se adhieren a las células del endotelio también en ausencia de agregados, sin que se pudieran reconocer defectos en la capa de células del endotelio (figura 2). Estas plaquetas adheridas de manera suelta a las células del endotelio (Rolling) mostraban el dibujo típico de gránulos completos que todavía no están desgranulados (figura 2a). En cambio las plaquetas que están extendidas sobre la superficie de las células del endotelio (adhesión firme) están caracterizados por una intensa secreción de sus gránulos, tal como está demostrado por los organelos vacíos que se hallan en estas zonas (figura 2B).

NF-\kappaB se activa en la microvascularización en las zonas de adhesión de plaquetas

Por las investigaciones in vitro se conoce que la interacción de las plaquetas activadas con células del endotelio (co-cultivo permanente) dan lugar a una expresión de genes de quemoquinas y moléculas de adhesión, a través de una activación de NF-\kappaB. Para investigar la activación de este factor de transcripción en zonas de mayor adhesión de plaquetas al endotelio en la microvascularización, se llevó a cabo una inmunohistoquimia sobre cortes criostáticos, utilizando un mAb contra la subunidad NF-\kappaB p65 liberada por I\kappaB. En ratones experimentales falta casi totalmente la activación de NF-\kappaB (figura 3A, Resting). En condiciones de una interacción más intensa entre plaquetas y endotelio se observó en la microvascularización una mayor inmunoreactividad de NF-\kappaB activado, mostrado por marcación p65 ((figura 3B, activado) y principalmente en la monocapa del endotelio contigua a los agregados de plaquetas (figura 3C). Esto indica que una adhesión más intensa de plaquetas al endotelio da lugar a una activación de NF-\kappaB in vivo.

La incubación transitoria de HUVEC con plaquetas activadas induce una secreción de MCP-1

Dado que se observaron cantidades significativas de NF-\kappaB activado en zonas que mostraron adhesión de plaquetas, se investigaron los efectos de las plaquetas activadas sobre HUVEC activados. Primeramente se investigó in vitro el desarrollo a lo largo del tiempo de la secreción de endotelios inducida por plaquetas en quemoquina MCP-1, que se regula mediante NF-\kappaB (8,9). Unas monocapas confluentes de HUVEC se dejaron sin tratar o se incubaron durante 5 a 300 minutos con plaquetas activadas con \alpha-trombina, 100 pg/ml de IL-1\beta o 1,67 ng/ml de TNF. A continuación se retiraron las plaquetas o las citoquinas de la monocapa endotelial y se determinó la cantidad de MCP-1 en el remanente después de otras 4 horas de incubación (co-cultivo transitorio).

La incubación transitoria de HUVEC con plaquetas activadas durante 30 minutos dio lugar a un fuerte aumento de la secreción de MCP-1, que es comparable con una estimulación IL-1\beta (figura 4), siendo algo más débil el efecto TNF. La incubación de HUVEC con plaquetas en reposo no indujo ningún incremento significativo de la secreción de MCP-1.

Activación endotelial de NF-\kappaB y muestras de proteólisis I\kappaB-\alpha/\varepsilon, tras la incubación de plaquetas

Con el fin de seguir aclarando el mecanismo mediante el cual las plaquetas inducen la expresión de productos genéticos de destino NF-\kappaB tales como MCP-1, se llevaron a cabo experimentos para la determinación del tiempo con el fin de observar una activación de NF-\kappaB que se determinó mediante EMSA. Las plaquetas activadas indujeron una activación intensa y dependiente del tiempo de NF-\kappaB en HUVEC, observándose los efectos máximos al cabo de 60 minutos (figura 5A). En los mismos extractos de núcleos se investigó también la combinación de proteínas con oligonucleótidos Sp-1, que actúan como Loading-Control (figura 5A).

A continuación se investigó el marco de tiempo y el volumen de proteólisis inducida por las plaquetas en la proteína inhibidora I\kappaB. La incubación de HUVEC con plaquetas activadas así como IL-1\beta dio lugar a una proteólisis importante de I\kappaB-\alpha e I\kappaB-\varepsilon (figuras 5B y C). A pesar de que las muestras de proteólisis de la proteína I\kappaB eran similares a continuación de ambos estímulos se observaron algunas diferencias: el I\kappaB-\alpha se descompuso algo más rápidamente después de la acción de IL-1\beta, comenzando al cabo de 15 minutos después de la incubación, en comparación con el caso de una estimulación de plaquetas, donde se observó la descomposición después de unos 30 minutos. A la inversa, las plaquetas inducen una proteólisis anterior de I\kappaB-\varepsilon e IL-1\beta (efecto significativo: 30 minutos con respecto a 60). En fuerte contraste con ésto, TNF indujo una descomposición mucho más rápida de ambas proteínas I\kappaB en HUVEC (figura 5D).

Activación diferencial del complejo IKK en células endoteliales después de la estimulación con plaquetas, IL-1\beta o TNF

Las proteínas I\kappaB se fosforilizan antes de su descomposición, siendo provocado este proceso por el complejo IKK. Para caracterizar el efecto de las plaquetas sobre este sistema de quinasa, se emplearon ensayos de quinasa in vitro. HUVEC fueron estimulados con plaquetas activadas, IL-1\beta o TNF durante los periodos de tiempo indicados, antes de preparar extractos de citosol. Se llevó a cabo una inmunoprecipitación, bien con anticuerpos IKK-\alpha o IKK-\beta, y se determinó la actividad de quinasa mediante la medición del estado de fosforilización de GST-I\kappaB-\alpha. La incubación con plaquetas indujo una activación notable del complejo IKK con unos niveles de fosforilización máximos a los 30 minutos, que en un plazo de 60 minutos descendieron rápidamente a los valores de la línea base (figuras 6A y D). Se obtuvieron resultados similares cuando se añadió IL-1\beta a HUVEC, a pesar de que se observaron diferencias en un pico de activación a los 45 minutos, que se mantuvieron por lo menos durante 90 minutos (figuras 6B y D). Cuando se utilizó TNF para estimular HUVEC, la activación de IKK se produjo rápidamente en un plazo de 2,5 minutos, volviendo a valores más bajos al cabo de 20 minutos (figuras 6C y D). En estas condiciones, los niveles de IKK-\alpha y -\beta se mantuvieron constantes (figuras 5B y C). Se obtuvieron unos resultados similares empleando células ECV 304.

IKK-\beta y NIK participan en una activación de NF-\kappaB inducida por plaquetas

Con el fin de investigar el papel de las proteínas IKK y NIK en las cascadas de señales que afectan a NF-\kappaB, se transformó ECV 304 antes de la estimulación con plaquetas o IL-1\beta, con vectores de hiperexpresión para el tipo salvaje o quinasas mutadas marcadas con flag, junto con un plásmido reporter de \kappaB luciferasa. Un Western Blot, empleando un anticuerpo anti-flag, confirmó que la proteína respectiva había sido hiperexprimida en el sistema existente y que el vector de control sin inserción no mostraba ninguna marca flag no específica. Unos experimentos complementarios mostraron que las proteínas precipitadas marcadas con flag eran activas para la quinasa, mientras que las formas mutadas no mostraban actividad. Cuando se hiperexprimió NIK, se observó una inducción drástica de la señal 3x\kappaB.luci, comparado con el control CMV, que se incrementó aún más incubando las células con plaquetas activadas o IL-1\beta (figuras 7A y B, columnas de la izquierda). La transfección de NIK mutado provocó una disminución drástica de este efecto tanto por la señal inducida por el tipo salvaje como también por el incremento adicional causado por la ulterior estimulación. Una cotransformación de tipo salvaje IKK-\alpha y -\beta juntas tuvo también un efecto directo sobre el plásmido 3\kappaB.luci, que se intensificó notablemente mediante la estimulación, bien con plaquetas o con IL-1\beta (figuras 7A y B, columna izquierda). Una hiperexpresión de las formas mutadas de IKK-\alpha y -\beta juntas, inhibió no sólo los efectos directos sino también los inducidos por el estímulo, desapareciendo casi totalmente la señal inducida por las plaquetas, observándose un efecto más débil para IL-1\beta. Cuando se exprimieron las quinasas individualmente, en lugar de hacerlo en combinación, se halló una inhibición importante con IKK-\beta_{KA}, como consecuencia de una incubación con plaquetas o IL-1\beta (figuras 7A y B, columnas de la derecha). IKK-\alpha_{KA} sólo mostró efecto inhibidor para plaquetas, pero no para células estimuladas con IL-1\beta.

Igualmente se investigó el efecto de una hiperexpresión de IKK-\alpha y -\beta mutado sobre la transcripción dependiente de plaquetas o dependiente del promotor inducida por IL-1\beta. ECV 304 se transformaron con vectores de hiperexpresión para tipo salvaje o quinasas mutadas, junto con plásmidos reporter de luciferasa, que contenían fragmentos promotores que llevaban MCP-1 o VCAM-1 \kappaB. En este caso solamente se obtuvo una reducción significativa de la transcripción inducida por plaquetas o IL-1\beta mediante IKK-\beta_{KA}, pero noIKK-\alpha_{KA}, bajo la regulación de estos promotores (figura 7C).

Una hiperexpresión de IKK-\beta_{KA} inhibe la secreción inducida por plaquetas de MCP-1 en HUVEC transducido por rAAV

Para mostrar el efecto de una hiperexpresión de IKK-\beta_{KA} sobre el nivel de proteínas, se clonaron el tipo salvaje o secuencias mutadas de IKK-\beta en un sistema de virus recombinante adeno-asociado (13, 14). Las investigaciones se realizaron en un principio para comprobar si los rAAV podían transducir cultivos HUVEC primarios. Unas monocapas endoteliales subconfluentes se incubaron durante 16 horas con rAAV-GFP y después de otras 48 horas en cultivo de células se analizó la expresión de GFP en HUVEC infectados, mediante citometría de flujo y microscopía fluorescente (figuras 8A y B). Se halló que en las condiciones aplicadas había una transducción importante de HUVEC con un rendimiento de aproximadamente un 50%. Esto supone una diferencia ventajosa respecto a la tasa de transfección de aproximadamente un 5 a un 10%, tal como se encuentra en HUVEC empleando los métodos de transfección convencionales. La hiperexpresión de IKK-\beta mediante el sistema rAAV se confirmó mediante el empleo de un análisis Western (figura 8C). Para investigar los efectos de hiperexpresión de IKK-\beta e IKK-\beta_{KA}, se transdujeron HUVEC con rAAV, que codifica estas proteínas, o mediante el control rAAV-GFP. Después de la incubación inicial, seguida de otro cultivo durante 48 horas, se trataron las células transducidas durante 60 minutos con plaquetas activadas con IL-1\beta, determinándose después de 4 horas una secreción de la MCP-1. Las células que habían sido transducidas con rAAV-IKK-\beta_{KA}, mostraron una disminución importante de la secreción de la MCP-1 inducida por plaquetas o IL-1\beta, en comparación con las células tratadas con rAAV-GFP o rAAV-IKK-\beta (figura 8D). Estos resultados muestran que el sistema rAAV, y el alto rendimiento de transfección conseguido con ello, permiten la demostración directa a través de una determinación de la concentración de proteínas, de que el mutante negativo dominante IKK-\beta_{KA}, inhibe intensamente la expresión delgen endotelial de inflamación de MCP-1, que es inducido por la interacción transitoria con plaquetas activadas o IL-1\beta.

Bibliografía

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14. Hauswirth y cols. (2000) Methods Enzymol. 316, 743-761.

Claims (3)

1. Procedimiento de screening (selección primaria) para localizar inhibidores de IKK-\beta en células endoteliales comprendiendo el procedimiento la compactación de un inhibidor potencial con células endoteliales activadas y una determinación de la secreción de la MCP-1 de las células endoteliales.

2. Procedimiento de screening (selección primaria) según la reivindicación 1, en el que se activan las células endoteliales mediante plaquetas activadas.

3. Utilización de un inhibidor de IKK-\beta, elegido entre Sulindac, NEMO-binding domain peptide, 3-[(4-metilfenil)-sulfonil]-2-propenonitrilo y 3-[(4-t-butilfenil)-sulfonil]-propenonitrilo, para la preparación de un medicamento destinado a la

(a)

profilaxis primaria de ateroesclerosis en pacientes cuyo valor PROCAM sea mayor o igual a 50, o para la

(b)

profilaxis secundaria después de un episodio cardiovascular.