ES2225084T3

ES2225084T3 - Fucogalactano sulfatado.

Info

Publication number: ES2225084T3
Application number: ES00904062T
Authority: ES
Inventors: Takeshi Sakai; Hitomi Kimura; Kaoru Kojima; Kaoru Central Research Laboratories KATAYAMA; Kazuo Shimanaka; Katsushige Ikai; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-02-23
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2020-02-21
Also published as: KR100601330B1; TWI247751B; EP1176153A4; ATE277085T1; US6590097B1; CN1191261C; CN1670027A; DE60014065D1; DE60014065T2; CN1341126A; CA2359839A1; KR20020002372A; JP3523597B2; EP1176153B1; EP1176153A1; WO2000050464A1; AU2575100A; CN1305884C

Abstract

Un fucogalactano sulfatado con las siguientes propiedades físicas y químicas: (1) contiene galactosa y mucosa como sacáridos constituyentes, en una proporción molar de 1:1 a 6:1; (2) contiene un sacárido sulfatado de la formula general (XI) como componente esencial de los sacáridos constituyentes: en la que R es H o S03H, y al menos un R es SO3H; y (3) es convertido por una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado en moléculas de menor tamaño para generar al menos un compuesto elegido del grupo formado por los compuestos de las fórmulas generales de (I) a (IV): en las que R es H o SO3H, y al menos un R es SO3H o una sal del mismo.

Description

Fucogalactano sulfatado.

Campo técnico

La presente invención trata de un fucogalactano sulfatado que es útil como reactivo en glucotecnología, una molécula de menor tamaño derivada del polisacárido sulfatado, y de un método para producir la misma, así como de una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado que es útil en el campo de la glucotecnología y de un método para producir la enzima.

Antecedentes de la técnica

Las algas feófitas contienen una variedad de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada. Por ejemplo, se conocen polisacáridos que contienen fucosa sulfatada tales como (1) fucanos sulfatados formados por fucosa y grupos sulfato; (2) fucoglucuronomananos sulfatados que contienen ácido glucurónico, manosa, fucosa y grupos sulfato, por ejemplo, el polisacárido U que contiene fucosa sulfatada según se describe en el documento WO 97/26896 (proporción molar aproximada de los sacáridos constituyentes, fucosa : manosa : galactosa : ácido urónico: grupo sulfato = 10 : 7 : 4 : 5 : 20; denominado en lo sucesivo U-fucoidano); y (3) fucogalactano sulfatado formado por fucosa y galactosa, por ejemplo, el polisacárido F que contiene fucosa sulfatada, según se describe en el documento WO 97/26896 (proporción molar aproximada de los sacáridos constituyentes, fucosa : galactosa = 10 : 1; denominado en lo sucesivo F-fucoidano). Prácticamente la totalidad de estos polisacáridos que contienen fucosa sulfatada son aniones macromoleculares. Por lo tanto, se comportan química y físicamente de forma similar en diversas etapas de purificación, haciendo difícil separarlos entre sí. Por esta razón, las actividades biológicas de los polisacáridos que contienen fucosa sulfatada derivados de las algas feófitas se han examinado con frecuencia sin separarlos entre sí. Por lo tanto, fue difícil identificar al polisacárido que contenía fucosa sulfatada que era responsable de la actividad biológica observada.

Lacombe Felió, M. A. y Duarte, J. H., Carbohydrate Research, 44: 241-249 (1975), describen un fucogalactano no sulfatado de agregados de huevas de caracol de la especie Ampullarius, y estudios estructurales del mismo en los que dicho fucogalactano está compuesto por D-galactosa (98%) y L-fucosa (2%).

El documento EP-O-884-383 describe un método para purificar o eliminar los virus contenidos en muestras adsorbiendo los virus sobre polisacáridos que contienen sulfato de fucosa o los productos de degradación de los mismos, en los que los sacáridos constituyentes de dichos polisacáridos son galactosa y fucosa en una proporción molar de aproximadamente 1:10, o fucosa, manosa, galactosa, glucosa, ramnosa, xilosa y ácido urónico.

Hasta la fecha, se ha conocido la correlación entre una actividad y una molécula para la fracción de fucano sulfatado, según se describe en Agricultural and Biological Chemistry, 44(8): 1965-1966 (1980), que es responsable de la actividad anticoagulante, y el U-fucoidano según se describe en el documento WO 97/26896, que es responsable de una actividad inductora de la apoptosis en las células tumorales.

Se ha estudiado el uso de la fracción de fucano sulfatado como anticoagulante en lugar de la heparina. Sin embargo, si el fucano sulfatado va a usarse como producto farmacéutico, se requiere la obtención de un fucano sulfatado altamente puro, con objeto de evitar efectos secundarios debidos a actividades inesperadas. Por lo tanto, se ha deseado un método para ello.

Con respecto al U-fucoidano, similarmente se requiere, para obtener convenientemente un polisacárido U que contiene fucosa sulfatada altamente puro, con objeto de preparar un producto farmacéutico que utilice la actividad inductora de apoptosis en las células tumorales. Por lo tanto, se ha deseado un método para ello.

En general, la digestión enzimática es la forma más eficaz utilizada para los análisis estructurales de polisacáridos y la producción de oligosacáridos. Adicionalmente, sólo un polisacárido puede extraerse con facilidad a partir de una mezcla de polisacáridos que apenas están separados entre sí, como sigue. El polisacárido a extraer se convierte en moléculas de menor tamaño digiriéndolo con una enzima que digiere específicamente el polisacárido. Entonces la mezcla se somete a un fraccionamiento por peso molecular, tal como una ultrafiltración.

Si hay disponible una enzima que digiera específicamente un fucogalactano sulfatado, el análisis estructural del fucogalactano sulfatado y la producción de un oligosacárido fucogalactano sulfatado se lleva a cabo con facilidad.

Según se ha descrito anteriormente, se han deseado una enzima que digiera fucogalactano sulfatado y un método para producir enzimáticamente un oligosacárido fucogalactano sulfatado.

Objetos de la invención

Por lo tanto, el principal objeto de la presente invención es proporcionar (1) un fucogalactano sulfatado o una sal del mismo, que es útil como un reactivo en glucotecnología o como un inductor de la producción del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF); (2) una molécula de menor tamaño obtenida permitiendo que una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado actúe sobre un fucogalactano sulfatado o una sal del mismo; (3) una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado que es útil en glucotecnología; (4) un método para producir una molécula de menor tamaño obtenida permitiendo que dicha enzima actúe sobre un fucogalactano sulfatado o sobre una sal del mismo; y (5) un método para producir una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado.

Resumen de la invención

Como resultado de un estudio intenso, los presentes inventores han encontrado un fucogalactano sulfatado contenido en las algas feófitas, una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado que digiere el polisacárido sulfatado y un método para producirlo. Adicionalmente, los presentes inventores han descubierto una molécula de menor tamaño a partir de un fucogalactano sulfatado que puede utilizarse como un reactivo en glucotecnología, y un método para producirla, completando así la presente invención.

El primer aspecto de la presente invención trata de un fucogalactano sulfatado con las siguientes propiedades físicas y químicas o de una sal del mismo. El fucogalactano sulfatado contiene galactosa y fucosa como sacáridos constituyentes en una proporción molar de 1:1 a 6:1 y contiene un sacárido sulfatado de fórmula general (XI) como componente básico de los sacáridos constituyentes:

1

en la que R es H ó SO_{3}H, y al menos un R es SO_{3}H.

Adicionalmente, el fucogalactano sulfatado se convierte en moléculas de menor tamaño mediante una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención para generar al menos un compuesto elegido del grupo formado por los compuestos con las fórmulas generales (I) a (IV):

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3

4

5

en las que R es H ó SO_{3}H, y al menos un R es SO_{2}H.

El segundo aspecto de la presente invención trata de un sacárido con una estructura química elegida del grupo formado por las fórmulas generales (II), (III) y (IV):

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en las que R es H ó SO_{3}H, y al menos un R es SO_{3}H, o una sal del mismo.

El tercer aspecto de la presente invención trata de una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado con las siguientes propiedades físicas y químicas. La enzima puede actuar sobre un fucogalactano sulfatado que contenga galactosa y fucosa como sacáridos constituyentes en una proporción molar de 1:1 a 6:1 o una sal de los mismos para convertir el fucogalactano sulfatado en moléculas de menor tamaño y generar un oligosacárido con galactosa sulfatada o galactosa en su extremo reductor, tiene un pH óptimo de aproximadamente 7 a 9, y tiene una temperatura óptima de aproximadamente 25 a 45ºC.

El cuarto aspecto de la presente invención trata de un método para producir una molécula de menor tamaño a partir de un fucogalactano sulfatado o una sal del mismo, caracterizado porque el método comprende permitir que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según el tercer aspecto actúe sobre un fucogalactano sulfatado derivado de algas feófitas o una sal del mismo, y obtener una molécula de menor tamaño. Algunos ejemplos de las moléculas de menor tamaño obtenidas usando la enzima incluyen el oligosacárido o una sal del mismo según el segundo aspecto.

El quinto aspecto de la presente invención trata de un método para producir la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según el tercer aspecto, caracterizado porque el método comprende cultivar una bacteria del género Flavobacterium capaz de producir la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado y recoger la enzima del cultivo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: gráfica que ilustra la relación entre el pH y la actividad relativa (%) de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 2: gráfica que ilustra la relación entre la temperatura y la actividad relativa (%) de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 3: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (A) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figure 4: figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (A) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 5: figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (A) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 6: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (B) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 7: figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (B) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 8: figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (B) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 9: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (C) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 10: figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (C) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 11: figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (C) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

\newpage

Figura 12: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (D) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 13: figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (D) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 14: figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (C) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 15: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (E) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 16: figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (E) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 17: figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (E) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 18: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (D) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 19: figura que ilustra el espectro de ^{13}C-DEPT-135º de la molécula de menor tamaño (F) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 20: figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (F) del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 21: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 22: figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 23: figura que ilustra el espectro infrarrojo de absorción del fucogalactano sulfatado según la presente invención.

Figura 24: figura que ilustra el espectro de masas de la fracción de la molécula de menor tamaño del polisacárido que contiene fucosa sulfatada eluida con cloruro sódico 0,4 M.

Figura 25: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la fracción de la molécula de menor tamaño del polisacárido que contiene en fucosa sulfatada eluida con cloruro sódico 0,4 M.

Figura 26: figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la fracción de la molécula de menor tamaño del polisacárido que contiene fucosa sulfatada eluida con cloruro sódico 0,4 M.

Figura 27: figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la fracción de la molécula de menor tamaño del polisacárido que contiene fucosa sulfatada eluida con cloruro sódico 0,6 M.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se explicará en detalle.

Las algas marinas pertenecientes a las algas feófitas contienen varios tipos de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada. Se han observado muchos tipos moleculares de dichos polisacáridos, incluidos fucanos sulfatados y fucoglucuronomananos sulfatados.

El fucogalactano sulfatado de la presente invención contiene principalmente galactosa y fucosa como sacáridos constituyentes en una proporción molar de 1:1 a 6:1 (denominado en lo sucesivo fucogalactano sulfatado de la presente invención o G-fucoidano). Algunos ejemplos del mismo incluyen un fucogalactano sulfatado que contiene galactosa y fucosa en una proporción molar de 2:1. El fucogalactano sulfatado es un polisacárido sulfatado con un peso molecular medio de aproximadamente 130.000 (distribución del peso molecular: desde aproximadamente 100.000 hasta aproximadamente 200.000), tal y como se determinó mediante una HPLC de filtración en gel, por ejemplo. El peso molecular, la composición en sacáridos, y el contenido en grupos sulfato del fucogalactano sulfatado varían dependiendo del momento de recogida de la materia prima para el fucogalactano sulfatado, del método usado para secar la materia prima y del método usado para almacenar la materia prima. Además, varían en función de las condiciones de calentamiento, del pH y similares usados para extraer el fucogalactano sulfatado. Por ejemplo, el fucogalactano sulfatado puede hidrolizarse con un ácido. Así, el peso molecular, la distribución del peso molecular, la composición en sacáridos o el contenido en grupos sulfato del fucogalactano sulfatado según se describe en el presente documento son sólo ejemplos que pueden modificarse fácilmente dependiendo de las condiciones usadas para extraer el fucogalactano sulfatado. Por ejemplo, cuando el fucogalactano sulfatado de la presente invención se prepara usando la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada y la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada según se describe en el presente documento, se obtiene el fucogalactano sulfatado de la presente invención con la composición en sacáridos y el peso molecular según se ha descrito anteriormente. Así, se puede preparar un fucogalactano sulfatado con cualquier peso molecular, distribución del peso molecular, composición en sacáridos o contenido en grupos sulfato, usando unas condiciones de preparación elegidas adecuadamente. Por ejemplo, seis de los principales sacáridos constituyentes del fucogalactano sulfatado de la presente invención contienen aproximadamente cinco residuos de grupos sulfato. En general, los grupos sulfato unidos a sacáridos mediante enlaces éster son químicamente inestables y se escinden fácilmente con un ácido, un álcali o calor. El contenido en grupos sulfato se reduce, por ejemplo, calentando en condiciones ácidas o alcalinas. Consecuentemente, el fucogalactano sulfatado de la presente invención se puede desulfatar intencionadamente. La cantidad de grupos sulfato a escindir puede controlarse eligiendo el tipo y/o la concentración del ácido o del álcali, así como la temperatura y/o el tiempo de calentamiento en la desulfatación. Así, los fucogalactanos sulfatados de la presente invención incluyen todos aquellos derivados de las algas feófitas que sean los fucogalactanos sulfatados con las características descritas anteriormente y los fucogalactanos sulfatados que se han convertido en moléculas de menor tamaño mediante la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención.

El esqueleto principal del fucogalactano sulfatado de la presente invención está representado mediante la fórmula general (XII), a continuación. Los fucogalactanos sulfatados de la presente invención incluyen aquellos de la fórmula general en la que n sea un número entero de 1 o más, por ejemplo, de 1 a 1.000, preferiblemente de 1 a 500. Los fucogalactanos sulfatados de la presente invención incluyen aquellos con una estructura en la que la fórmula general (XII) se repita continuamente, y aquellos con una estructura en la que la fórmula general (XII) esté incluida discontinuamente, al interponerse otras estructuras, siempre que cumplan la definición según se ha descrito anteriormente.

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en la que R es H o SO_{3}H.

Por ejemplo, las algas feófitas a partir de las cuales se pueden preparar los fucogalactanos sulfatados de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Kjellmaniella crassifolia, Undaria pinnatifida, Laminaria japonica, Eisenia bicyclis, Ecklonia cava, Ecklonia kurome, Lessonia nigrescence, kelpos gigantes y durvillaea. Sin limitación, los fucoidanos derivados de, por ejemplo, Kjellmaniella crassifolia, contienen U-fucoidano y F-fucoidano, así como G-fucoidano de la presente invención.

Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables como las sales del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Algunos ejemplos de las sales incluyen sales de metales alcalinos, tales como sodio y potasio, de metales alcalinotérreos, tales como calcio y magnesio, y de metales de transición, tales como el cinc, así como sales de amonio.

Según se usa en el presente documento, una molécula de menor tamaño de un fucogalactano sulfatado se refiere a un oligosacárido con galactosa sulfatada o galactosa en su extremo reductor, que se obtiene permitiendo que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención actúe sobre el fucogalactano sulfatado de la presente invención.

La enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención actúa sobre el fucogalactano sulfatado de la presente invención para convertir el fucogalactano sulfatado en moléculas de menor tamaño y generar un oligosacárido con galactosa sulfatada o galactosa en su extremo reductor. La enzima digestiva del polisacárido que contiene sulfato de fucosa de tipo endo, según se describe en el documento WO 97/26896, que digiere un polisacárido F que contiene fucosa sulfatada, no digiere el fucogalactano sulfatado de la presente invención. Además, la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención es una enzima que digiere los enlaces \beta 1-6 y los enlaces \beta 1-4 entre la D-galactosa sulfatada o la galactosa y la D-galactosa sulfatada o la galactosa en el fucogalactano sulfatado de la presente invención internamente.

Es conveniente producir el fucogalactano sulfatado de la presente invención como el substrato de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención obteniendo en primer lugar una fracción que contenga polisacáridos que contienen fucosa sulfatada a partir de las algas feófitas y purificando después el fucogalactano sulfatado de la presente invención a partir de ella. Por ejemplo, en primer lugar se obtiene un extracto de una fracción soluble en agua a partir de las algas feófitas, con objeto de producir la fracción que contiene los polisacáridos que contienen fucosa sulfatada. En este caso, es preferible llevar a cabo la extracción a un pH de 4-9, a una temperatura de 100ºC o inferior, con objeto de evitar la conversión de los polisacáridos que contienen fucosa sulfatada en moléculas de menor tamaño.

Los métodos utilizados para la eliminación del ácido algínico del extracto incluyen un método que utiliza la precipitación isoeléctrica del ácido algínico mediante su tratamiento en condiciones ácidas, un método en el que se añade una sal (por ejemplo, una sal de calcio) que forme un precipitado con el ácido algínico, un método en el que el ácido algínico se digiere con una enzima que degrade el ácido algínico, y similares. Adicionalmente, las moléculas de poco tamaño, tales como los aminoácidos y el manitol, pueden eliminarse eficazmente usando una ultrafiltración. El tratamiento con carbón activo es eficaz para la eliminación de sustancias hidrófobas.

Según se describe anteriormente, se puede obtener una mezcla de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada. El fucogalactano sulfatado de la presente invención puede prepararse a partir de la mezcla permitiendo que la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada, según se describe en el documento WO 97/26896, como una enzima digestiva del polisacárido que contiene sulfato de fucosa de tipo endo, y la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada, según se describe en el documento WO 97/26896 como una enzima digestiva del fucoidano de tipo endo, actúen sobre la mezcla de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada, y, eliminando después las fracciones de moléculas de menor tamaño usando una ultrafiltración.

El preparado de fucogalactano sulfatado así obtenido puede contener muchos tipos de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada, además del fucogalactano sulfatado. En este caso, el fucogalactano sulfatado de la presente invención puede aislarse, por ejemplo, mediante separación y purificación con una resina de intercambio aniónico. El uso de dicho procedimiento hace que la cantidad de resina a usar sea menor a la cantidad usada en un procedimiento en el que una mezcla de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada se somete directamente a una separación con una resina de intercambio aniónico. Adicionalmente, la separación está notablemente mejorada debido a la ausencia de los dos tipos anteriormente mencionados de polisacáridos contaminantes que contienen fucosa sulfatada.

El fucogalactano sulfatado de la presente invención, obtenido según se ha descrito anteriormente, puede utilizarse como substrato para determinar una actividad cuando se purifica la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Alternativamente, puede usarse como materia prima para producir los oligosacáridos fucogalactanos sulfatados de la presente invención. La mezcla anteriormente mencionada de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada puede utilizarse como materia prima para producir los oligosacáridos fucogalactanos sulfatados.

Puede usarse cualquier cepa bacteriana para producir la enzima de la presente invención, siempre que produzca una enzima que convierta el fucogalactano sulfatado de la presente invención en moléculas de menor tamaño. Por ejemplo, pueden usarse preferiblemente especies de Flavobacterium SA-0082, según se describe en el documento WO 97/26896. Esta cepa se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio e Industria Internacionales, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japón, el 29 de marzo de 1995, con número de registro de entrada FERM P-14872, y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio e Industria Internacionales, con número de registro de entrada FERM BP-5402 (fecha de solicitud de transmisión al organismo depositario internacional: 15 de febrero de 1996). Se determinó que esta cepa pertenecía al género Flavobacterium en base a las propiedades bacteriológicas, incluyendo la tinción de Gram, el contenido en GC del ADN y la quinona principal. Por otro lado, los presentes inventores realizaron una búsqueda de homologías en la secuencia de bases de los ADNr 16S de la presente bacteria usando la búsqueda "Advanced BLAST" del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI), que está disponible en Internet, ya que las secuencias base de los ADNr 16S se tienen a menudo en cuenta recientemente en los criterios de clasificación.

La búsqueda de una bacteria cuya secuencia de genes sea altamente homóloga a la anteriormente mencionada secuencia de bases reveló que el gen de Polaribacter filamentus tiene la homología más alta de la región completa (89% de homología en una región de 1424 bases). No se encontró ninguna otra bacteria con una secuencia altamente homóloga en la región completa. Las secuencias de Polaribacter irgensii (89% de homología en una región de 1360 bases), Cytophaga sps. (92% de homología en una región de 1249 bases) y Flexibacter maritimus (91% de homología en una región de 1247 bases) mostraron una homología relativamente alta. En general, no se pueden identificar las bacterias como pertenecientes al mismo género si la homología entre las secuencias de bases de los ADNr 16S es del 90% o inferior. Por lo tanto, se estableció que la presente bacteria no pertenecía a un género de bacterias conocidas, si se usa dicha clasificación genética. Así, se considera que la presente bacteria es una bacteria nueva perteneciente al orden Citophagales, porque la mayor parte de las propiedades bacteriológicas de la presente bacteria coinciden con las de las bacterias del género Flavobacterium pertenecientes al orden Citophagales, y porque las cuatro bacterias cuyas secuencias de bases de los ADNr 16S son altamente homólogas a la secuencias de bases de los ADNr 16S de la presente bacteria pertenecen al orden Citophagales. Según se usan en el presente documento, las bacterias del género Flavobacterium incluyen bacterias clasificadas bacteriológicamente en el género Flavobacterium, así como bacterias clasificadas genéticamente en el orden Citophagales, en base a la homología de las secuencias. Así, los métodos para producir la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención incluyen un método en el que se cultiva una bacteria perteneciente al orden Citophagales para producir la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención.

En el método puede usarse cualquier medio para una cepa bacteriana para producir la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención, siempre que sea metabolizado por la cepa bacteriana usada para producir la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Por ejemplo, puede utilizarse como fuente de carbono un fucogalactano sulfatado, una mezcla de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada, polvo de algas marinas, ácido algínico, fucosa, galactosa, glucosa, manitol, glicerol, sacarosa, maltosa y similares. Como fuente de nitrógeno puede usarse preferiblemente peptonas, extracto de levadura, extracto de carne y similares. Adicionalmente, la presente bacteria crece muy bien en agua marina o agua marina artificial que contenga los nutrientes descritos anteriormente.

El rendimiento varía dependiendo de las condiciones usadas para cultivar la cepa productora de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Las condiciones de cultivo preferibles son una temperatura de cultivo de 15 a 30ºC y un pH del medio de 6 a 9. El máximo rendimiento de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención se consigue tras cultivar con aireación y en agitación durante de 5 a 72 horas. Por supuesto, las condiciones de cultivo se determinan de forma tal que el rendimiento de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención sea máximo, dependiendo de la cepa bacteriana utilizada, de la composición del medio y similares. La enzima digestiva del fucogalactano sulfatado está presente tanto en las células como en el sobrenadante del cultivo.

Se obtiene un extracto libre de células cultivando especies de Flavobacterium SA-0082 en un medio adecuado, recogiendo las células y desorganizándolas mediante los medios convencionales de desorganización celular, tal como el tratamiento con ultrasonidos. Después puede obtenerse un preparado de enzima purificada a partir del extracto mediante los medios de purificación convencionales. La enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención puede obtenerse en una forma purificada sustancialmente libre de otras enzimas digestivas del polisacárido sulfatado que contiene fucosa sulfatada mediante purificación, usando, por ejemplo, precipitación salina, cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía en columna de uniones hidrófobas, filtración en gel o similares. Adicionalmente, puede usarse el procedimiento de purificación similar al de la purificación de la enzima intracelular para purificar la enzima de la presente invención a partir del sobrenadante del cultivo, que también contiene la enzima en grandes cantidades, y se obtiene eliminando las células del cultivo.

Las propiedades químicas y físicas de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención son las siguientes:

(I) actuar sobre un fucogalactano sulfatado que contiene galactosa y fucosa como sacáridos constituyentes en una proporción molar de 1:1 a 6:1 o una sal del mismo para convertir el fucogalactano sulfatado en moléculas de menor tamaño y generar un oligosacárido con galactosa sulfatada o galactosa en su extremo reductor;

(II) tener un pH óptimo de aproximadamente 7 a 9 (Figura 1, una gráfica que ilustra la relación entre el pH de la reacción y la actividad relativa de la enzima de la presente invención, en la que el eje vertical representa la actividad relativa (%) y el eje horizontal representa el pH); y

(III) tener una temperatura óptima de aproximadamente 25 a 45ºC (Figura 2, una gráfica que ilustra la relación entre la temperatura de reacción y la actividad relativa de la enzima de la presente invención, en la que el eje vertical representa la actividad relativa (%) y el eje horizontal representa la temperatura (ºC).

La actividad de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención puede determinarse, por ejemplo, analizando el producto de la digestión, que se obtiene permitiendo que la enzima actúe sobre el fucogalactano sulfatado, usando HPLC y determinando el grado de conversión en moléculas de menor tamaño. Alternativamente, la actividad puede determinarse midiendo la generación de extremos reductores, según un método convencional. La actividad puede determinarse usando bien un extracto de células a partir de la cepa productora o bien una disolución enzimática obtenida tras la purificación por cromatografía.

La molécula de menor tamaño de fucogalactano sulfatado de la presente invención o una sal del mismo puede prepararse permitiendo que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención actúe sobre el fucogalactano sulfatado de la presente invención o un material que contenga el fucogalactano sulfatado. Por ejemplo, puede usarse preferiblemente como material que contiene el fucogalactano sulfatado de la presente invención, un producto parcialmente purificado a partir del fucogalactano sulfatado de la presente invención, una fracción de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada derivados de algas feófitas, un producto obtenido mediante la extracción de algas feófitas con un disolvente acuoso, o las propias algas feófitas.

El fucogalactano sulfatado de la presente invención, o el material que contiene el fucogalactano sulfatado, puede disolverse según un método convencional. El fucogalactano sulfatado de la presente invención, o el material que contiene el fucogalactano sulfatado, puede disolverse en la disolución a la concentración máxima. Sin embargo, la concentración se elige habitualmente teniendo en cuenta su operacionalidad y el título de la enzima. El disolvente del fucogalactano sulfatado de la presente invención puede elegirse entre agua, tampones y similares, dependiendo de los objetos. Normalmente, el pH de la disolución es prácticamente neutro. La reacción enzimática se lleva a cabo generalmente a aproximadamente 30ºC. El peso molecular de las moléculas de menor tamaño puede controlarse ajustando la cantidad de la enzima, el tiempo de reacción y similares. Pueden prepararse moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado de la presente invención con una distribución del peso molecular más homogénea sometiendo las moléculas de menor tamaño a un fraccionamiento por peso molecular. Pueden aplicarse medios convencionales de fraccionamiento por peso molecular, tales como la filtración en gel y la membrana de fraccionamiento por peso molecular. Opcionalmente, las moléculas de menor tamaño pueden purificarse adicionalmente usando un tratamiento con una resina de intercambio iónico, un tratamiento con carbón activo o similares, o pueden precipitarse con sales, esterilizarse o liofilizarse.

Sin limitación, las moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado incluyen, por ejemplo, de disacáridos a hexasacáridos obtenidos permitiendo que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención actúe sobre el fucogalactano sulfatado de la presente invención. Las posiciones de sustitución con grupos sulfato en las moléculas de menor tamaño de la presente invención varían dependiendo del método de preparación. Todas las moléculas de menor tamaño obtenidas por la acción de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención están incluidas en las moléculas de menor tamaño de la presente invención. Por ejemplo, las estructuras químicas de las moléculas de menor tamaño están representadas por las fórmulas generales de (I) a (IV), a continuación. Entre ellas, se supone que la formula general (III) es una unidad constituyente del fucogalactano sulfatado.

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en las que R es H ó SO_{3}H.

Las moléculas de menor tamaño de la presente invención tienen grupos sulfatos dentro de las moléculas, grupos que reaccionan con varias bases para formar sales. La molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado de la presente invención es estable cuando está en forma de una sal. Suele proporcionarse en forma de una sal de sodio y/o de potasio y/o de calcio. La molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado de la presente invención en forma libre puede derivar de una sal del mismo utilizando una resina de intercambio catiónico, tal como Dowex 50W (Dow Chemical). Opcionalmente, puede someterse adicionalmente a un intercambio salino convencional para convertirlo en cualquiera de las varias sales de interés.

Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables como las sales de las moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Entre los ejemplos de las sales se incluyen sales con metales alcalinos como el sodio y el potasio, metales alcalinotérreos como el calcio y el magnesio y metales de transición como el cinc, así como sales de amonio.

Únicamente el fucogalactano sulfatado de la presente invención contenido en cualquier fracción que contenga polisacáridos con contenido en fucosa sulfatada puede convertirse en moléculas de menor tamaño mediante la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Algunos ejemplos de las sales incluyen sales de metales alcalinos, tales como sodio y potasio, de metales alcalinotérreos, tales como calcio y magnesio, y de metales de transición, tales como cinc, así como sales de amonio.

Sólo el fucogalactano sulfatado de la presente invención contenido en cualquiera de las fracciones que contienen polisacáridos que contienen fucosa sulfatada puede convertirse en moléculas de menor tamaño usando la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Así, el fucogalactano sulfatado de la presente invención puede eliminarse selectivamente usando la enzima en combinación con un fraccionamiento por peso molecular. Por ejemplo, se ha observado que las fracciones que contienen fucanos sulfatados tienen diversas actividades biológicas, tales como una actividad anticoagulante, una actividad supresora de metástasis del cáncer y una actividad supresora de infecciones víricas. Las fracciones que contienen fucanos sulfatados obtenidos a partir de algas feófitas según métodos convencionales contienen fucanos sulfatados y otros polisacáridos. El fucogalactano sulfatado puede eliminarse de las fracciones que contienen fucanos sulfatados utilizando la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Como resultado pueden obtenerse fucanos sulfatados altamente puros.

Adicionalmente, se ha observado que, por ejemplo, los fucoglucuronomananos sulfatados tienen una actividad inductora de apoptosis en las células tumorales. El fucogalactano sulfatado de la presente invención, contaminante en fucoglucuronomananos sulfatados obtenidos a partir de algas feófitas, puede eliminarse fácilmente utilizando la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Como resultado, pueden obtenerse adecuadamente fucoglucuronomananos sulfatados altamente puros.

Por ejemplo, se prepara una disolución de un material que contenga el fucogalactano sulfatado de la presente invención en un disolvente acuoso con objeto de eliminar el fucogalactano sulfatado de la presente invención. El material que contiene el fucogalactano sulfatado de la presente invención puede disolverse según un método convencional. El material que contiene el fucogalactano sulfatado de la presente invención puede disolverse en la disolución a la concentración máxima. Sin embargo, la concentración se elige habitualmente teniendo en cuenta su operacionalidad y el título de la enzima. El disolvente del fucogalactano sulfatado de la presente invención puede elegirse entre agua, tampones y similares, dependiendo de los objetos. Habitualmente, el pH preferible de la disolución es prácticamente neutro. La enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención o una sustancia sobre la que se haya inmovilizado la enzima, o ambas, se añade entonces y reacciona con la disolución del material que contiene el fucogalactano sulfatado de la presente invención para convertir el fucogalactano sulfatado de la presente invención en moléculas de menor tamaño. La reacción enzimática se llevar a cabo habitualmente a aproximadamente 30ºC. La cantidad de la enzima, el tiempo de reacción y similares, pueden ajustarse adecuadamente dependiendo de la eficacia del fraccionamiento por peso molecular de la etapa subsiguiente. Puede prepararse un producto de interés del cual se hayan eliminado fácilmente las moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado de la presente invención sometiendo la mezcla resultante a un fraccionamiento por peso molecular. Pueden aplicarse medios convencionales de fraccionamiento por peso molecular, tales como la filtración en gel y la ultrafiltración, utilizando una membrana de fraccionamiento por peso molecular.

La enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención actúa sobre el fucogalactano sulfatado de la presente invención. Así, puede usarse para realizar el análisis estructural del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Por ejemplo, las moléculas de menor tamaño con la estructura química de las formulas generales anteriores de (I) a (IV) se obtienen permitiendo que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención actúe sobre el fucogalactano sulfatado de la presente invención.

El componente fucogalactano sulfatado de la presente invención puede eliminarse selectivamente de los polisacáridos que contienen fucosa sulfatada que contienen el fucogalactano sulfatado de la presente invención usando enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Por ejemplo, pueden usarse preferiblemente fucanos sulfatados o fucoglucuronomananos sulfatados altamente puros de los que se haya eliminado el componente fucogalactano sulfatado como materias primas para productos farmacéuticos.

La enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención puede usarse en combinación con la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada, según se describe en el documento WO 97/26896 y/o la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada, tal y como se describe en el documento WO 97/26896. Sin limitación, cuando una mezcla de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada obtenidos, por ejemplo, mediante extracción de Kjellmaniella crassifolia a un pH de 4 a 9, a 100ºC o menos, se trata con la anteriormente citada enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada y con la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención, pueden obtenerse polisacáridos sulfatados que contengan sacáridos sulfatados de la fórmula general (XIV), a continuación, como componentes esenciales de los sacáridos constituyentes de forma repetitiva. Se obtienen sacáridos sulfatados con la siguiente formula general, en la que n es un número entero de 1 ó más, por ejemplo, de 1 a 10.000, preferiblemente de 1 a 5.000.

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en la que R es H ó OSO_{3}H.

El anteriormente mencionado polisacárido sulfatado contiene fucosa como sacárido constituyente. Por ejemplo, la extracción a un pH de 6 a 8, a 95ºC durante 2 horas da como resultado un peso molecular medio de aproximadamente 200.000 (distribución del peso molecular: desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 1.000.000). Adicionalmente, por ejemplo, la extracción a un pH de 6 a 8, a 25ºC durante 24 horas da como resultado un peso molecular medio de aproximadamente 13.000.000 (distribución del peso molecular: desde aproximadamente 100.000 hasta aproximadamente 20.000.000). El peso molecular medio y la distribución del peso molecular varían dependiendo de las condiciones de extracción, según se describe anteriormente. Sin embargo, los polisacáridos sulfatados resultantes se convierten en moléculas de menor tamaño mediante la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada, independientemente de las condiciones de extracción usadas. El peso molecular y el contenido en grupos sulfato del polisacárido sulfatado varían dependiendo del momento de la recogida de la materia prima para los polisacáridos sulfatados, del método usado para secar la materia prima y del método usado para almacenar la materia prima. Además, varían dependiendo de las condiciones de calentamiento, del pH y similares, usados en la extracción. Por ejemplo, el polisacárido sulfatado puede hidrolizarse con un ácido. Por lo tanto, el peso molecular, la distribución del peso molecular o el contenido en grupos sulfato del polisacárido sulfatado según se describen en el presente documento son sólo ejemplos, y pueden cambiarse fácilmente dependiendo de las condiciones usadas para extraer el polisacárido sulfatado. Así, puede prepararse un polisacárido sulfatado con cualquier peso molecular, distribución del peso molecular o contenido en grupos sulfato, usando unas condiciones de preparación elegidas adecuadamente. Por ejemplo, hay aproximadamente doce grupos sulfato contenidos en siete principales sacáridos constituyentes del polisacárido sulfatado. En general, los grupos sulfato unidos a sacáridos mediante enlaces éster son químicamente inestables y se escinden fácilmente con un ácido, un álcali o calor. El contenido en grupos sulfato se reduce, por ejemplo, calentando en condiciones ácidas o alcalinas. Consecuentemente, los polisacáridos sulfatados pueden desulfatarse intencionadamente. La cantidad de grupos sulfato a escindir puede controlarse eligiendo el tipo y/o la concentración del ácido o del álcali, así como la temperatura y/o el tiempo de calentamiento en la desulfatación.

Adicionalmente, pueden obtenerse nuevos sacáridos sulfatados mediante la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado, la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada y la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada combinadas. Además, los sacáridos sulfatados pueden clasificarse de una manera diferente a la convencional mediante el uso de la combinación de las tres enzimas digestivas anteriormente mencionadas. Sin limitación, por ejemplo, pueden obtenerse las siguientes fracciones cuando se permite que las enzimas actúen sobre una mezcla de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada derivados de algas feófitas tales como Kjellmaniella crassifolia:

(1) una fracción de sacáridos sulfatados que no son digeridos por la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada ni por la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada, pero que son digeridos por la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado (el fucogalactano sulfatado de la presente invención);

(2) una fracción de sacáridos sulfatados que no son digeridos por la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado ni por la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada, pero que son digeridos por la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada;

(3) una fracción de sacáridos sulfatados que no son digeridos por la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado ni por la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada, pero que son digeridos por la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada; y

(4) una fracción de sacáridos sulfatados que no son digeridos por la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado, la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada ni la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada. Estas fracciones de sacáridos sulfatados no podrían obtenerse sin el uso de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención en combinación con la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada o la enzima digestiva del polisacárido U con contenido en fucosa sulfatada.

El fucogalactano sulfatado de la presente invención o una sal del mismo tiene una actividad inductora de la producción del factor de crecimiento, en particular, una actividad inductora de la producción del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF).

El hígado se regenera rápidamente hasta su tamaño original tras haberlo sometido a una hepatectomía parcial. El factor esencial implicado en la regeneración del hígado fue desconocido durante mucho tiempo. Después, se encontró HGF en el plasma de pacientes con hepatitis fulminante y se aisló y se purificó a partir del mismo (J. Clin. Invest., 88: 414-419, 1988). Adicionalmente, se clonó el ADNc del HGF humano, y se reveló la estructura primaria del HGF (Biochem. Biophys. Res. Commun., 163: 967-973, 1989). Adicionalmente, se demostró que el factor de dispersión (SF), que activa la motilidad de las células, y el factor citotóxico tumoral (TCF) son la misma sustancia que el HGF (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 7001-7005, 1991; Biochem. Biophys. Res. Commun., 180: 1151-1158,
1991).

El HGF estimula el crecimiento de muchos tipos de células epiteliales, incluidas las células epiteliales del conducto biliar, las células epiteliales de los túbulos renales y las células de los ventrículos de la mucosa de la túnica, además de hepatocitos. Adicionalmente, el HGF es una sustancia activa polifuncional que muestra una amplia variedad de actividades fisiológicas, incluyendo la activación de la motilidad de las células epiteliales, así como la inducción de morfogénesis, tales como la vascularización y la formación del lumen de las células epiteliales. En otras palabras, el HGF está implicado en la estimulación del crecimiento y en la activación de la motilidad de las células epiteliales para la reparación del órgano dañado, en la inducción de morfogénesis, tales como la vascularización y similares, de varios órganos. El HGF también muestra una actividad de proliferación de hepatocitos, una actividad de estimulación de la síntesis de proteínas, una actividad de mejora de la colestasis, una actividad de prevención del daño renal por fármacos y similares. Según estos hechos, se espera que el HGF sirva como agente terapéutico para la hepatitis grave, la cirrosis y la colestasis del hígado.

El ARNm del HGF se sintetiza en el cerebro, el riñón, el pulmón y similares. El HGF muestra actividades de crecimiento en hepatocitos, células de los túbulos renales, células epidérmicas y similares. Así, el HGF es un factor de crecimiento de células mesodérmicas. Por lo tanto, el fucogalactano sulfatado de la presente invención o una sal del mismo, que induce la producción del factor de crecimiento de los hepatocitos, es útil como ingrediente en una composición para tratar o prevenir la hepatitis, la hepatitis grave, la cirrosis, la colestasis del hígado, la nefritis crónica, la neumonía y las heridas.

El fucogalactano sulfatado de la presente invención o una sal del mismo puede usarse como principio activo de una composición cosmética en base a su actividad inductora de la producción de HGF. Por ejemplo, es útil como una composición cosmética para inducir la producción de HGF. Así, se puede proporcionar una composición cosmética con una actividad inductora de la producción de HGF.

Puede formularse una composición cosmética para inducir la producción del factor de crecimiento (por ejemplo, una composición cosmética para inducir la producción de HGF) que contenga el fucogalactano sulfatado de la presente invención o una sal del mismo, según métodos convencionales, en loción, loción lechosa, crema, compresas, agente de baño, agente limpiador facial, agente limpiador de baño, agente capilar, tónico capilar y champú.

El fucogalactano sulfatado de la presente invención, la molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado, o una sal del mismo, pueden usarse como un antígeno. Los anticuerpos se producen según métodos convencionales. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo policlonal inmunizando a un animal, tal como un conejo, con el fucogalactano sulfatado de la presente invención, la molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado, o una sal del mismo, junto con un coadyuvante. Adicionalmente, puede prepararse un anticuerpo monoclonal fusionando células de melanoma con linfocitos B productores de anticuerpos obtenidos mediante inmunización con un antígeno, eligiendo hibridomas que produzcan el anticuerpo de interés y cultivando las células. Dichos anticuerpos pueden usarse para purificar el fucogalactano sulfatado de la presente invención, la molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado o una sal del mismo. También pueden usarse los anticuerpos para identificar el fucogalactano sulfatado de la presente invención en algas marinas. Por ejemplo, puede determinarse fácilmente el contenido del fucogalactano sulfatado de la presente invención en un extracto de algas marinas con un anticuerpo que reconozca el fucogalactano sulfatado de la presente invención. Así, puede prepararse eficazmente un extracto con un alto contenido. Adicionalmente, los anticuerpos que reconocen el fucogalactano sulfatado de la presente invención, la molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado o una sal del mismo son útiles para analizar el modo de acción para inhibir la fertilización, el modo de acción para inhibir la infección vírica, el metabolismo in vivo o similares del fucogalactano sulfatado de la presente invención, de la molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado o una sal del mismo.

Adicionalmente, la molécula de menor tamaño, o el oligosacárido, obtenido permitiendo que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención actúe sobre el fucogalactano sulfatado de la presente invención o una sal del mismo, puede usarse como reactivo en glucotecnología. Puede proporcionarse una sustancia que es muy útil como reactivo en glucotecnología, por ejemplo, sometiendo la molécula de menor tamaño a una piridil-(2)-aminación, según se describe en el documento JP-B 5-65108, para preparar un producto piridil-(2)-aminado de la molécula de menor tamaño.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención en detalle, pero no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Preparación del fucogalactano sulfatado (1) El fucogalactano sulfatado se preparó como sigue

Se desorganizaron 2 Kg de Kjellmaniella crassifolia seca mediante una molturadora (Masuko Sangyo) equipada con un tamiz con un diámetro de poro de 1 mm, se agitaron en 20 l de etanol al 80% a 25ºC durante 3 horas, se filtraron y se lavaron. El residuo resultante se suspendió en 20 l de tampón de imidazol 30 mM (pH 8,2) que contenían cloruro cálcico 50 mM, cloruro sódico 100 mM, etanol al 10% y 1 U de la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada. La enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada se obtuvo a partir de un cultivo de la especie Alteromonas SN-1009 (depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio e Industria Internacionales, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japón, el 13 de febrero de 1996, con número de registro de entrada FERM P-15436, y depositado en Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio e Industria Internacionales con número de registro de entrada FERM BP-5747 (fecha de solicitud de transmisión a un organismo depositario internacional: 15 de noviembre de 1996)), según se describe en el documento WO97/26896. La alta viscosidad y elasticidad debidas a los polisacáridos que contienen fucosa sulfatada con altos pesos moleculares se perdieron completamente tras agitar la suspensión a 25ºC durante 2 días. La suspensión se filtró a través de un tamiz de acero inoxidable con un diámetro de poro de 32 \mum para eliminar las moléculas de menor tamaño de los polisacáridos que contienen fucosa sulfatada, y después se lavó. El residuo resultante se suspendió en 40 l de tampón de fosfato sódico (pH 6.6) que contenía cloruro sódico 100 mM, etanol al 10% y 4 g de alginato liasa K (Nagase Biochemicals). La suspensión se agitó a 25ºC durante 4 días y después se centrifugó para obtener un sobrenadante. El sobrenadante se concentró hasta 2 l usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000, para eliminar las moléculas de menor tamaño del ácido algínico contenido en el sobrenadante. El disolvente del concentrado se sustituyó por cloruro sódico 100 mM que contenía un 10% de etanol. Se añadió un volumen igual de acetato cálcico 400 mM a la disolución. Después de agitarla, la mezcla se centrifugó. Se añadió ácido clorhídrico 1 N al sobrenadante resultante para ajustar el pH a 2, mientras se enfriaba en hielo. El precipitado formado se eliminó mediante centrifugación. Se añadió hidróxido sódico 1 N al sobrenadante resultante para ajustar el pH a 8,0. La disolución se concentró hasta 1 l mediante ultrafiltración y el disolvente se sustituyó por cloruro sódico 100 mM. El precipitado formado se eliminó mediante centrifugación. Se llevó a cabo el siguiente procedimiento con objeto de eliminar las sustancias hidrófobas del sobrenadante resultante. Se añadió cloruro sódico al sobrenadante, a una concentración de 1 M. La mezcla se cargó en una columna de fenil-Cellulofine (Seikagaku Corporation) equilibrada con cloruro sódico 1 M y se obtuvieron fracciones de flujo a través. Las fracciones se concentraron usando un dispositivo de ultrafiltración, se sometieron a un intercambio de disolvente por cloruro sódico 20 mM, y se liofilizaron. El peso del producto de la liofilización fue de 29,3 g.

(2) se disolvieron 15 g del producto de la liofilización en 1,5 l de un tampón de tris-clorhídrico 50 mM que contenía cloruro sódico 400 mM y 9 U de la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada. La enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada se obtuvo a partir de un cultivo de la especie de Flavobacterium SA-0082 (depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio e Industria Internacionales, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japón, el 29 de marzo de 1995, con número de registro de entrada FERM P-14872, y depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio e Industria Internacionales, con número de registro de entrada FERM BP-5402 (fecha de solicitud de transmisión a un organismo depositario internacional: 15 de febrero de 1996)), según se describe en el documento W097/26896. La disolución se hizo reaccionar a 25ºC durante 6 días, y después se concentró hasta aproximadamente 300 ml usando un evaporador. El concentrado se colocó en un tubo de diálisis con un peso de exclusión molecular de 3.500, y se dializó extensamente para eliminar las moléculas de menor tamaño de los fucoglucuronomananos sulfatados. La disolución retenida en el tubo de diálisis se cargó en una DEAE-Cellulofine A-800 de 4 l (Chisso Corporation) equilibrada con cloruro sódico 50 mM. Tras un lavado extensivo con cloruro sódico 50 mM, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 50 a 650 mM. Adicionalmente se llevó a cabo una elución extensiva desde la columna con cloruro sódico 650 mM. La fracción eluida con cloruro sódico 650 mM se recogió como una fracción del fucogalactano sulfatado, se concentró usando un dispositivo de ultrafiltración con un peso de exclusión molecular de 100.000, se sometió a un intercambio del disolvente por cloruro sódico 10 mM y se liofilizó para obtener 0,85 g de un producto de liofilización de la fracción de fucogalactano sulfatado. Se analizó la composición en sacáridos de la fracción. La cantidad de fucosa se determinó según se describe en Journal of Biological Chemistry, 175: 595 (1948).

El producto seco del fucogalactano sulfatado se disolvió en ácido clorhídrico 1 N a una concentración del 0,5%. La disolución se trató a 110ºC durante 2 horas para hidrolizarla en sus monosacáridos constituyentes. Los extremos reductores de los monosacáridos resultantes de la hidrólisis se sometieron a una piridil-(2)-aminación usando GlycoTAG (Takara Shuzo) y el kit de reactivos GlycoTAG (Takara Shuzo) para determinar la proporción de sacáridos constituyentes usando HPLC. La HPLC se llevó a cabo como sigue.

Instrumento: L-6200 (Hitachi);

Columna: Palpak de Tipo A (4,6 mm x 150 mm; Takara Shuzo);

Eluyente: tampón de borato 700 mM (pH 9,0) : acetonitrilo, = 9 : 1;

Detección: longitud de onda de excitación a 310 nm, y longitud de onda de emisión a 380 nm usando un detector de fluorescencia F-1150 (Hitachi);

Tasa de flujo: 0,3 ml/minuto; y

Temperatura de la columna: 65ºC.

La cantidad de ácido urónico se determinó según se describe en Analytical Biochemistry, 4: 330 (1962). Adicionalemnte, se determinó el contenido en sulfato según se describe en Biochemical Journal, 84: 106 (1962).

Como resultado, el fucogalactano sulfatado contenía galactosa y fucosa como sacáridos constituyentes en una proporción molar de aproximadamente 2 : 1. No contenía sustancialmente nada de ácido urónico ni de ningún otro azúcar neutro. La proporción molar entre la fucosa y el grupo sulfato era de aproximadamente 1 : 2.

(3) Método para medir la actividad de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado

La actividad de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención se midió usando la fracción de fucogalactano sulfatado contenida en (2), como sigue.

En resumen, se mezclaron 60 \mul de un tampón de imidazol-clorhídrico 50 mM (pH 7,5), 4,8 \mul de una disolución al 2,5% de la fracción de fucogalactano sulfatado, 6 \mul de cloruro sódico 4 M, 37,2 \mul de agua y 12 \mul de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado del primer aspecto de la presente invención. Tras reaccionar a 37ºC durante 3 horas, la mezcla de reacción se trató a 100ºC durante 10 minutos. Tras la centrifugación, se analizaron 100 \mul del sobrenadante usando HPLC, para determinar el grado de conversión en moléculas de menor tamaño. Como control, se prepararon, una mezcla de reacción obtenida mediante reacción en unas condiciones similares en las usó el tampón usado para disolver la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado del primer aspecto de la presente invención, que se usó en lugar de la enzima, y una mezcla de reacción obtenida mediante reacción en la que se usó agua en lugar del fucogalactano sulfatado, y se analizaron de forma similar usando HPLC.

Se define 1 unidad de la enzima como una cantidad de la enzima que escinde enlaces de galactosilo en 1 \mumol de la fracción de fucogalactano sulfatado en 1 minuto en el sistema de reacción anteriormente mencionado. La cantidad de enlaces de galactosilo escindidos se calculó según la siguiente ecuación.

{(4,8x1.000x2,5/100)MG} x {(MG/M)-1} x {1/(180x0,012)} = U/ml

4,8x1.000x2,5/100: fucogalactano sulfatado añadido al sistema de reacción (\mug);

MG: peso molecular medio del fucogalactano sulfatado en la fracción como sustrato;

M: peso molecular medio del producto de la reacción;

(MG/M)-1: número de enlaces escindidos por la enzima en una molécula del fucogalactano sulfatado;

180: tiempo de reacción (minutos); y

0,012: volumen de la disolución enzimática (ml).

La HPLC se llevó a cabo como sigue.

Instrumento: L-6200 (Hitachi);

Columna: OHpak SB-806HQ (8 x 300 mm; Showa Denko);

Eluyente: cloruro sódico 50 mM que contiene azida sódica 5 mM;

Detección: detector del índice de refracción diferencial (Shodex RI-71, Showa Denko);

Tasa de flujo: 1 ml/minuto; y

Temperatura de la columna: 25ºC.

El siguiente procedimiento se llevó a cabo para determinar el peso molecular medio del producto de reacción. Se analizó un pululano disponible comercialmente (ESTÁNDAR P-82, Showa Denko) cuyo peso molecular se conocía en las mismas condiciones a las del análisis HPLC anteriormente mencionado. La relación entre el peso molecular del pululano y el tiempo de retención se expresó como una curva, que se usó como curva estándar para determinar el peso molecular del producto de la reacción enzimática.

La cantidad de proteínas se determinó midiendo la absorbancia de la disolución enzimática a 280 nm. El cálculo se llevó a cabo definiendo la absorbancia de una disolución que contiene una proteína a una concentración de 1 mg/ml como 1,0.

Ejemplo 2 Determinación del modo de acción de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado (1) Preparación de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado

Para la producción de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado se inoculó la especie de Flavobacterium SA-0082 (FERM BP-5402) en 600 ml de un medio formado por agua marina artificial (Jamarine Laboratory) que contenía glucosa al 0,1%, peptona al 1,0% y extracto de levadura al 0,05% (pH 7,5) que había sido esterilizada a 120ºC durante 20 minutos, y cultivada a 24ºC durante 23 horas para preparar un cultivo de semillas. Se colocaron 20 l de un medio formado por agua marina artificial que contenía una fracción de polisacárido que contiene fucosa sulfatada de Kjellmaniella crassifolia al 0,2%, preparado según se describe en el Ejemplo 3 (1) a continuación, peptona al 2,0%, extracto de levadura 0,01% y agente antiespumante al 0,01% (KM70, Shin-Etsu Chemical) (pH 7,5) en un fermentador de tinaja de 30 L y se esterilizaron a 120ºC durante 20 minutos. Después de enfriar, se inocularon en el medio 600 ml del cultivo de semillas, y se cultivaron a 24ºC durante 23 horas con una aireación de 10 L por minuto y con agitación a 125 rpm. Tras cultivarse, el cultivo se centrifugó para recoger las células.

Las células se suspendieron en 1.200 ml de tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 0,4 M, se trataron con ultrasonidos y centrifugaron para obtener un extracto de células. El extracto de células se dializó extensamente frente al mismo tampón, y se centrifugó para obtener un sobrenadante. Se añadió sulfato amónico al sobrenadante con una concentración final de un 90% de saturación. El precipitado formado se recogió mediante centrifugación, se disolvió en 150 ml de un tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 50 mM y se dializó extensamente frente al mismo tampón. Se cargó un sobrenadante obtenido mediante centrifugación en una columna DEAE-sefarosa FF de 500 mL (Amersham Pharmacia) equilibrada con el mismo tampón. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 50 mM a 600 mM para recoger una fracción activa.

La fracción activa se dializó extensamente frente a un tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 0,1 M, cargado en una columna de 100 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con el mismo tampón. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 0,1 M a 0,4 M para recoger una fracción activa. Se añadió cloruro sódico a la fracción activa a una concentración de 4 M. La fracción se cargó en una columna de 20 ml de fenil-Cellulofine (Chisso Corporation) equilibrada con un tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 4 M. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 4 M a 1 M. Adicionalmente, se llevó a cabo una elución extensiva con un tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 1 M para recoger una fracción activa. Se añadió cloruro sódico a la fracción activa a una concentración de 3 M. La fracción se cargó en una columna de 10 ml de fenil-Cellulofine (Chisso Corporation), equilibrada con un tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 3M. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 3 M a 0,5 M. Adicionalmente, se llevó a cabo una elución extensiva con un tampón de tris-clorhídrico 10mM (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 0,5 M para recoger una fracción activa. La enzima purificada así obtenida se usó como enzima digestiva del fucogalactano sulfatado.

(2) Preparación de moléculas de menor tamaño a partir del fucogalactano sulfatado

Se prepararon moléculas de menor tamaño permitiendo que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado purificada actuase sobre la fracción de fucogalactano sulfatado según se describe en el Ejemplo1(2). En resumen, se disolvieron 1,94 g de la fracción de fucogalactano sulfatado en un tampón de tris-clorhídrico 25 mM (pH 8.0) que contenía cloruro sódico 0,2 M. Se añadieron 186 mU de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según se describe en el Ejemplo 2(1). La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 6 días. La mezcla de la reacción se concentró hasta 80 ml mediante un evaporador y se sometió a un fraccionamiento por peso molecular usando una columna de Cellulofine GCL-1000 (Chisso Corporation) (4 x 90 cm). Se recogió una fracción correspondiente a un peso molecular de 15.000 o menos para obtener una fracción del digerido enzimático de fucogalactano sulfatado.

Una porción de la fracción del digerido enzimático de fucogalactano sulfatado se sometió a una piridil-(2)-aminación de los extremos reductores usando GlycoTAG (Takara Shuzo) y el kit de reactivos GlycoTAG (Takara Shuzo). Los sacáridos piridil-(2)-aminados resultantes se hidrolizaron mediante un tratamiento con ácido clorhídrico 2 N a 100ºC durante 3 horas. se examinaron los extremos reductores de los sacáridos usando HPLC. La HPLC se llevó a cabo como sigue.

Instrumento: L-6200 (Hitachi);

Columna: Palpak de tipo A (4,6 x 150 mm; Takara Shuzo);

Eluyente: tampón de borato 0,7 M (pH 9,0) : acetonitrilo = 9 : 1;

Detección: longitud de la onda de excitación a 310 nm y longitud de la onda emisión a 380 nm con un detector de fluorescencia (F-1150, Hitachi);

Tasa de flujo: 0,3 ml/minuto; y

Temperatura de la columna: 65ºC.

Como resultado, sólo se detectó galactosa. Así, se demostró que todos los sacáridos de los extremos reductores de la fracción del digerido enzimático del fucogalactano sulfatado eran galactosa sulfatada o galactosa.

Adicionalmente, una porción de la muestra que había sido sometida al análisis de los sacáridos en sus extremos reductores se sometió a una piridil-(2)-aminación de nuevo y se analizó usando HPLC según se ha descrito anteriormente con objeto de analizar la composición de sacáridos neutros en la fracción del digerido enzimático de fucogalactano sulfatado. Como resultado, se demostró que la fracción del digerido enzimático de fucogalactano sulfatado estaba formada por galactosa y fucosa en una proporción molar de aproximadamente 2 : 1. Los resultados anteriormente mencionados demostraron que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención era una galactosidasa de tipo endo que escinde los enlaces de galactosilo en el fucogalactano sulfatado para generar oligosacáridos con galactosa sulfatada o galactosa en sus extremos reductores.

Ejemplo 3

(1) Se preparó una fracción de polisacárido que contenía fucosa sulfatada a partir de Kjellmaniella crassifolia. En resumen, se desorganizaron 2 Kg de Kjellmaniella crassifolia seca disponible comercialmente usando una molturadora (Masuko Sangyo) equipada con un tamiz con un diámetro de poro de 1 mm y se suspendieron en 20 l de etanol al 80%. La suspensión se agitó a 25ºC durante 3 horas y se filtró a través de un filtro de papel. El residuo resultante se suspendió en 40 l de tampón de fosfato sódico 30 mM (pH 6,5) que contenía cloruro sódico 100 mM. La suspensión se trató a 95ºC durante 2 horas y se filtró a través de un tamiz de acero inoxidable con un diámetro de poro de 106 \mum. Se añadieron al filtrado 200 g de carbón activo, 4,5 l de etanol y 12.000 U de alginato liasa K (Nagase Biochemicals). La mezcla se agitó a 25ºC durante 20 horas, y después se centrifugó. El sobrenadante resultante se concentró hasta 4 l usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000, se centrifugó para eliminar las sustancias insolubles y se dejó reposar a 5ºC durante 24 horas. El precipitado formado se eliminó mediante centrifugación. El disolvente del sobrenadante resultante se intercambió por cloruro sódico 100 mM usando un dispositivo de ultrafiltración. La disolución se enfrió hasta una temperatura de 4ºC o menos, y se ajustó el pH a 2,0 con ácido clorhídrico. El precipitado formado se eliminó mediante centrifugación. El pH del sobrenadante resultante se ajustó con hidróxido sódico a 8,0. El sobrenadante se concentró hasta 4 l. El disolvente se intercambió por cloruro sódico 20 mM usando un dispositivo de ultrafiltración. Las sustancias insolubles de la disolución se eliminaron mediante centrifugación. Se añadieron a la disolución 82 ml de etanol al 50%. La mezcla se liofilizó para obtener 76 g de un producto seco de la fracción del polisacárido que contiene fucosa sulfatada de Kjellmaniella crassifolia.

(2) Se inoculó la especie de Flavobacterium SA-0082 (FERM BP-5402) en 100 ml de un medio formado por agua marina artificial que contenía un 0,2% de una fracción de polisacárido que contiene fucosa sulfatada de Kjellmaniella crassifolia preparado según se describe en el Ejemplo 3(1), un 1,0% de peptona y un 0,01% de extracto de levadura (pH 7,5) en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml que había sido esterilizado a 120ºC durante 20 minutos, y se cultivó a 24ºC durante 23 horas con agitación. Tras ser cultivado, el cultivo se centrifugó para obtener células y un sobrenadante del cultivo.

Las células se suspendieron en 5 ml de tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 0,4 M, se trataron con ultrasonidos y se centrifugaron para obtener un extracto de células.

Las actividades de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención detectadas en el sobrenadante del cultivo y en el extracto de células fueron de 2 mU/ml del medio y 2 mU/ml del medio, respectivamente. Se demostró que las células de la bacteria de género Flavobacterium cultivadas en las condiciones descritas anteriormente contenían en su interior y en su exterior casi las mismas cantidades de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención.

Ejemplo 4

Se disolvieron 7 g de la fracción de polisacárido que contiene fucosa sulfatada obtenida en el Ejemplo 3(1) en 700 ml de un tampón de imidazol clorhídrico (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 50 mM y etanol al 10%. La disolución se cargó en una columna de 5 l de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con el mismo tampón. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo una elución con un gradiente de cloruro sódico de 50 a 1.550 mM. Se recogió una fracción de polisacárido que contiene fucosa sulfatada que eluyó a una concentración salina de 550 a 1.550 mM.

La fracción contenía un componente que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado convierte en moléculas de menor tamaño, es decir, el fucogalactano sulfatado de la presente invención a una concentración de aproximadamente el 10%. La fracción se desalinizó usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas de un peso de exclusión molecular de 100.000. El disolvente se sustituyó por un tampón de imidazol-clorhídrico (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 200 mM. Se añadieron 600 mU de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 3 días y se sometió a ultrafiltración. Se prosiguió la ultrafiltración hasta que la cantidad de azúcar contenida en el filtrado se hizo indetectable, medida según el método del fenol-ácido sulfúrico. El componente que es convertido en moléculas de menor tamaño por la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención, es decir, el fucogalactano sulfatado de la presente invención, puede eliminarse de la fracción de polisacárido que contiene fucosa sulfatada mediante estas etapas.

Ejemplo 5 (1) Preparación del digerido enzimático a partir del fucogalactano sulfatado (i)

Se disolvieron 70 g de la fracción de polisacárido que contiene fucosa sulfatada de Kjellmaniella crassifolia obtenida en el Ejemplo 3 en un tampón de imidazol-clorhídrico 20 mM (pH 7,5) que contenía cloruro sódico 300 mM, cloruro cálcico 20 mM y etanol al 10%, y se sometió a ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para eliminar completamente cualquier sustancia que pudiera ser filtrada. Para la ultrafiltración se usó el mismo tampón que el utilizado anteriormente para la disolu-
ción.

Se añadieron, a la disolución retenida tras la ultrafiltración, 5 U de la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada, obtenida a partir de un cultivo de la especie Alteromonas SN-1009 (FERM BP-5747) según se describe en el documento WO97/26896. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 3 días. La mezcla de la reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso molecular de exclusión de 100.000 para eliminar completamente las sustancias convertidas en moléculas de menor tamaño por la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada, es decir, las moléculas de menor tamaño del fucoidano. Para la ultrafiltración se usó el mismo tampón que el utilizado anteriormente para la mezcla de reacción.

Se añadieron, a la disolución retenida tras la ultrafiltración, 20 U de la enzima digestiva del polisacárido que contiene fucosa sulfatada, obtenida de un cultivo de la especie Flavobacterium SA-0082 (FERM BP-5402) según se describe en el documento W097/26896. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 5 días. La mezcla de reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para eliminar completamente las sustancias que la enzima digestiva del polisacárido U con contenido en fucosa sulfatada había convertido en moléculas de menor tamaño, es decir, moléculas de menor tamaño del fucoglucuronomanano sulfatado. Se usó agua para la ultrafiltración, que finalmente se intercambió por un tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 200 mM.

Se añadieron 2 U de la enzima digestiva de fucogalactano sulfatado según se describe en el Ejemplo 2(1) a la disolución retenida tras la ultrafiltración. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 5 días. La mezcla de reacción se dividió en dos porciones iguales. Una porción se sometió a una ultrafiltración con un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas de un peso de exclusión molecular de 100.000 para ultrafiltrar completamente las sustancias que convirtió en moléculas de menor tamaño la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado, es decir, moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado. Se usó tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 50 mM para la ultrafiltración. El filtrado así obtenido se designó como el digerido enzimático de fucogalactano sulfatado (i).

(2) Preparación del digerido enzimático a partir del fucogalactano sulfatado (ii)

Se añadieron 550 mU de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado, según se describe en el Ejemplo 2(1), a la porción restante de la mezcla de reacción dividida en el Ejemplo 5(1). La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 7 días y se confirmó la conversión en moléculas de menor tamaño. La mezcla de reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para ultrafiltrar completamente las moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado. Se utilizó un tampón de tris-clorhídrico 10 mM que contenía cloruro sódico 50 mM para la ultrafiltración. El filtrado así obtenido se designó como el digerido enzimático de fucogalactano sulfatado (ii).

(3) Separación y purificación del digerido enzimático a partir del fucogalactano sulfatado (i)

El digerido enzimático de fucogalactano sulfatado (i) obtenido en el Ejemplo 5(1) se concentró hasta 500 ml usando un evaporador, se desalinizó mediante un dispositivo de electrodiálisis y se cargó en una columna de 1 l DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con tampón de imidazol-clorhídrico (pH 8) que contenía cloruro sódico 10 mM. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 10 mM a 900 mM. Se recogieron 62 ml del eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con cloruro sódico aproximadamente 130 mM y cloruro sódico aproximadamente 220 mM formaron picos de contenido en azúcar. Dichas fracciones se recogieron y se designaron como una fracción eluida a 130 mM (i) y una fracción eluida a 220 mM (i), respectiva-
mente.

La fracción eluida a 130 mM (i) se desalinizó usando un dispositivo de electrodiálisis. Se disolvió cloruro sódico en la fracción a una concentración de 50 mM. La disolución se cargó en una columna de 100 ml de DEAE-Cellulofine A- 800 (Chisso Corporation) equilibrada con un tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 50 mM. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó cabo una elución con un gradiente de cloruro sódico de 50 mM a 200 mM. Se recogieron 10 ml del eluido para cada fracción. El contenido en azúcar se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con cloruro sódico aproximadamente 55 mM hasta aproximadamente 75 mM formaron un pico de contenido en azúcar. Se recogieron las fracciones eluidas con cloruro sódico aproximadamente 60 mM, se concentraron hasta 2 ml usando SpeedVac (SAVANT Instruments Inc.), se cargaron en una columna de 200 ml de Cellulofine GCL-25 (Chisso Corporation) equilibrada con etanol al 10%, y se eluyeron con el mismo tampón. Se recogieron 2 ml del eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Se recogió una fracción que constituía un pico de contenido en azúcar y se designó como (A).

Por otro lado, la fracción eluida a 220 mM (i) se desalinizó usando un dispositivo de electrodiálisis. Se disolvió cloruro sódico en la fracción a una concentración de 100 mM. La disolución se cargó en una columna de 100 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con un tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 100 mM. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 100 mM a 350 mM. Se recogieron 10 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Se recogió una fracción que eluyó con cloruro sódico aproximadamente 160 mM, se concentró hasta 2 ml usando SpeedVac (SAVANT Instruments Inc.), se cargó en una columna de 200 ml Cellulofine GCL-25 (Chisso Corporation), se equilibró con etanol al 10% y se eluyó con el mismo tampón. Se recogieron 2 ml del eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Se recogió una fracción constituyente de un pico de contenido en azúcar y se designó como (B).

(4) Separación y purificación del digerido enzimático a partir del fucogalactano sulfatado (ii)

El digerido enzimático de fucogalactano sulfatado (ii) según se describe en el Ejemplo 5(2) se concentró hasta 500 ml usando un evaporador, se desalinizó usando un dispositivo de electrodiálisis y se cargó en una columna de 1 l de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 10 mM. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 10 mM a 900 mM. Se recogieron 61 ml del eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con cloruro sódico aproximadamente 130 mM, aproximadamente 220 mM y aproximadamente 270 mM formaron picos de contenido en azúcar. Estas fracciones se recogieron y se designaron como una fracción eluida a 130 mM (ii), una fracción a eluida 220 mM (ii) y una fracción a eluida 270 mM respectivamente.

La fracción eluida a 130 mM (ii) se desalinizó usando un dispositivo de electrodiálisis. Se disolvió cloruro sódico en la fracción a una concentración de 20 mM. La disolución se cargó en una columna de 200 ml de DEAE-Cellulofine A- 800 (Chisso Corporation) equilibrada con un tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 20 mM. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 20 mM a 150 mM. Se obtuvieron 13 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con cloruro sódico de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 70 mM se recogieron, se concentraron hasta 30 ml usando un evaporador, se cargaron en una columna de 1.200 ml de Cellulofine GCL-25 (Chisso Corporation) equilibrada con etanol al 10% y se eluyeron con el mismo tampón. Se obtuvieron 10 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Se recogió una fracción constituyente de un pico de contenido en azúcar. Se añadió ácido acético a la fracción a una concentración de 10 mM. El pH se ajustó a 3,5 con ácido clorhídrico. Se añadió cloruro sódico de forma que la conductividad fuera la misma que la del tampón de acetato 10 mM (pH 3,5), que contenía cloruro sódico 20 mM. La disolución de cargó en una columna de 30 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con tampón de acetato 10 mM (pH 3,5) que contenía cloruro sódico 20 mM. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 20 mM a 120 mM. Se recogieron 3 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con cloruro sódico de aproximadamente 65 mM a aproximadamente 80 mM se recogieron, se diluyeron con agua de forma que la conductividad fuera la misma que la del tampón de acetato 10 mM (pH 3,5) que contenía cloruro sódico 40 mM. La disolución se cargó en una columna de 20 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con tampón de acetato 10 mM (pH 3,5) que contenía cloruro sódico 40 mM. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 40 mM a 80 mM. Se obtuvieron 3 ml del eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método de fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con cloruro sódico de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 65 mM se recogieron, se concentraron hasta 2 ml usando SpeedVac (SAVANT Instruments Inc.), se cargaron en una columna de 200 ml de Cellulofine GCL-25 (Chisso Corporation) equilibrada con etanol al 10%, y se eluyeron con la misma disolución. Se recogieron 2 ml del eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método de fenol-ácido sulfúrico. El análisis espectrométrico de masas de las fracciones que constituían picos de contenido en azúcar demostró que una primera fracción contenía la misma sustancia que (A), mientras que una última fracción estaba sustancialmente libre de la misma sustancia que (A). La última fracción se recogió y se designó como (C).

Por otro lado, se añadió agua a la fracción eluida a 220 mM (ii) de forma que la conductividad fuera la misma que la del tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM que contenía cloruro sódico 100 mM. La disolución se cargó en una columna de 200 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation), equilibrada con un tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 100 mM. Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 100 mM a 300 mM. Se recogieron 13 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con cloruro sódico de aproximadamente 140 mM a aproximadamente 170 mM se recogieron, se concentraron hasta 30 ml usando un evaporador, se cargaron en una columna de 1.200 ml de Cellulofine GCL-25 (Chisso Corporation) equilibrada con etanol al 10%, y se eluyeron con la misma disolución. Se recogieron 10 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. El análisis espectrométrico de masas de la fracción recogida que constituía un pico de contenido en azúcar sugirió que la fracción contenía la misma sustancia que (B), según se describe en el Ejemplo 5(3).

Adicionalmente, se añadió agua a la fracción eluida a 270 mM (ii) de forma que la conductividad fuera la misma que la del tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 150 mM. La disolución se cargó en una columna de 200 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con un tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 150 mM. Después de lavar con el mismo tampón, la elución se llevó acabo con un gradiente de cloruro sódico de 150 mM a 300 mM. Se obtuvieron 12 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con cloruro sódico de aproximadamente 160 mM a aproximadamente 180 mM se recogieron, se concentraron hasta 2 ml usando SpeedVac (SAVANT Instruments Inc.), se cargaron en una columna de 200 ml de Cellulofine GCL-25 (Chisso Corporation) equilibrada con etanol al 10%, y se eluyeron con la misma disolución. Se recogieron 2 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Se recogió una fracción que constituía un pico de contenido en azúcar y se designó como (D).

Ejemplo 6 (1) Preparación del digerido enzimático a partir de fucogalactano sulfatado (iii)

Se disolvieron 15 g de la fracción del polisacárido que contiene fucosa sulfatada de Kjellmaniella crassifolia obtenida en el Ejemplo 3 en 1.500 ml de un tampón de imidazol-clorhídrico 20 mM (pH 7,5) que contenía cloruro sódico 300 mM, cloruro cálcico 20 mM y etanol al 10%, y se sometieron a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para eliminar completamente cualquier sustancia que pudiera filtrarse. Para la ultrafiltración se usó el mismo tampón al usado anteriormente para la mezcla de reacción. Se añadió 1 U de la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada usada en el Ejemplo 5(1) a la disolución retenida tras la ultrafiltración. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 3 días.

La mezcla de reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para eliminar completamente las sustancias que la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada había convertido en moléculas de menor tamaño, es decir, moléculas de menor tamaño del fucoidano. Para la ultrafiltración se usó el mismo tampón al usado anteriormente para la disolución.

Se añadió 1 U de la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada usada en el Ejemplo 5(1) a la disolución retenida tras la ultrafiltración. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 5 días.

La mezcla de reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100,000 para eliminar completamente las sustancias que la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada había convertido en moléculas de menor tamaño, es decir, moléculas de menor tamaño del fucoglucuronomanano sulfatado. Para la ultrafiltración se usó un tampón de tris-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 200 mM y etanol al 10%.

Se añadieron 600 mU de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según se describió en el Ejemplo 2(1) a la disolución retenida tras la ultrafiltración. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 5 días. La mezcla de la reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para ultrafiltrar completamente las sustancias que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado había convertido en moléculas de menor tamaño, es decir, moléculas de menor tamaño de fucogalactano sulfatado. Para la ultrafiltración se usó etanol al 10% que contenía cloruro sódico 20 mM. El filtrado obtenido así obtenido se designó como el digerido enzimático de fucogalactano sulfatado (iii).

(2) Separación y purificación del digerido enzimático a partir del fucogalatano sulfatado (iii)

El digerido enzimático del fucogalactano sulfatado (iii) obtenido en el Ejemplo 6(1) se desalinizó usando un dispositivo de electrodiálisis, se concentró hasta 50 ml usando un evaporador y se cargó en una columna de 100 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con acetato amónico 50 mM (pH 5,5). Después de lavar con el mismo tampón, la elución se llevó a cabo con un gradiente de acetato amónico de 50 mM a 4 M. Se recogieron 10 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con acetato de amonio de aproximadamente 420 mM a aproximadamente 620 mM formaron un pico de contenido en azúcar. Estas fracciones se recogieron y se designaron como fracción eluida de 420 mM a 620 mM.

(3) Purificación de la fracción eluida de 420 mM a 620 mM

La fracción se desalinizó usando un dispositivo de electrodiálisis. La conductividad se ajustó a la de la disolución de acetato amónico 50 mM. La disolución se cargó en una columna de 100 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con acetato amónico 50 mM (pH 5,5). Después de lavar con el mismo tampón, seguido de acetato amónico 100 mM (pH 5,5), se llevó a cabo la elución con un gradiente de acetato amónico de 100 mM a 800 mM. Se recogieron 10 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Se recogieron fracciones eluidas con acetato amónico de aproximadamente 440 mM a aproximadamente 530 mM.

Las fracciones se desalinizaron usando un dispositivo de electrodiálisis. La conductividad se ajustó a la de la disolución de acetato amónico 200 mM. La disolución se cargó en una columna de 100 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con acetato amónico 200 mM (pH 5,5). Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de acetato amónico de 200 mM a 700 mM. Se recogieron 10 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del fenol-ácido sulfúrico. Se obtuvieron fracciones con acetato amónico de aproximadamente 420 mM a aproximadamente 470 mM. El análisis espectrométrico de masas y el análisis espectrométrico por resonancia magnética nuclear (RMN) de la fracción sugirió que la fracción contenía la misma sustancia que (B), según se describe en el Ejemplo 5(3). El análisis espectrométrico de masas se llevó a cabo usando un espectrómetro de masas API-III (Perkin-Elmer Sciex). El análisis de RMN se llevó a cabo usando un aparato de resonancia magnética nuclear JMN-\alpha500 (Nippon Denshi).

(4) Digestión enzimática adicional y separación/purificación del digerido enzimático a partir del fucogalactano sulfatado

Dado que las fracciones distintas a la fracción eluida de 420 mM a 620 mM del Ejemplo 6(2) contenían sustancias con un peso molecular relativamente alto, se digirieron de nuevo con la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado. En resumen, las fracciones eluidas distintas a la fracción eluida de 420 mM a 620 mM del Ejemplo 6(2) se recogieron y desalinizaron usando un dispositivo de electrodiálisis. La composición de la disolución se ajustó para contener un tampón de fosfato 10 mM (pH 7,5), cloruro sódico 200 mM y etanol al 10%. Se añadieron 460 mU de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según se describe en el Ejemplo 2(1), y se hizo reaccionar a 25ºC durante 8 días. La mezcla de reacción se desalinizó usando un dispositivo de electrodiálisis. La conductividad se ajustó a la de la disolución de acetato amónico 50 mM. La disolución se cargó en una columna de 100 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (Chisso Corporation) equilibrada con acetato amónico 50 mM (pH 5,5). Después de lavar con el mismo tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de acetato amónico de 100 mM a 1 M. Se recogieron 10 ml de eluido para cada fracción. El contenido en azúcar de cada fracción se midió según el método del ácido sulfúrico-fenol. Las fracciones eluidas con aproximadamente 180 mM a aproximadamente 280 mM de acetato amónico y con aproximadamente 360 mM a aproximadamente 430 mM de acetato amónico se recogieron y se designaron como (E) y (F), respectivamente.

Ejemplo 7 Determinación estructural de los digeridos enzimáticos a partir de fucogalatano sulfatado

Las seis fracciones (A), (B), (C), (D), (E) y (F) obtenidas en los Ejemplos 5 y 6 se desalinizaron usando un dispositivo de electrodiálisis, se liofilizaron, y se sometieron a un análisis de la composición en sacáridos y a un análisis espectrométrico de masas. El análisis espectrométrico de masas se llevó a cabo usando un espectrómetro de masas API-III (Perkin-Elmer Sciex). El análisis de RMN se llevó a cabo usando un aparato de resonancia magnética nuclear JNM-\alpha500 (Nippon Denshi). Las muestras se sometieron a un análisis estructural tras el intercambio por agua pesada, según un método convencional. Los enlaces de los sacáridos constituyentes se analizaron usando el método HMBC, un método para la conectividad de enlaces múltiples heteronucleares detectada en ^{1}H. El método DQF-COSY y el método HOHAHA se usaron para la identificación en RMN-^{1}H. El método HSQC se usó para la identificación en RMN-^{13}C.

(1) Propiedades físicas de la molécula de menor tamaño (A)

A continuación se muestran los resultados del análisis espectrométrico de masas y la identificación por RMN. El espectro de RMN-^{1}H, el espectro de RMN-^{13}C y el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (A) del fucogalactano sulfatado de la presente invención están ilustrados en las Figuras 3, 4 y 5, respectivamente. La Figura 3 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (A) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 4 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (A) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 5 es una figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (A) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. En las figuras 3 y 4, los ejes verticales representan la intensidad de la señal y los ejes horizontales representan el valor del desplazamiento químico (ppm). En la figura 5, el eje vertical representa la intensidad relativa (%) y el eje vertical el valor m/z.

Peso molecular: 632

MS m/z 653,2 [M+Na^{+}-2H^{+}]^{-}, 315,0 [M-2H^{+}]^{2-}

RMN-^{1}H (D_{2}O)

\delta; 5,15 (1H, d, J=4,3 Hz, F1-1-H), 4,93 (1H, d, J=3,7 Hz, F2-1-H), 4,53 (1H, d-d, J=10,4, 4,3 Hz, F1-3-H), 4,49 (1H, d, J=7,6 Hz, G1-1-H), 4,46 (1H, d-d, J=10,7, 3,1 Hz, F2-3-H), 4,36 (1H, q, J=6,7 Hz, F2-5-H), 4,14 (1H, q, J=6,7 Hz, F1-5-H), 4,09 (1H, d, J=2,4 Hz, F1-4-H), 4,03 (1H, d, J=3,1 Hz, F2-4-H), 3,97 (1H, d-d, J=10,4, 4,3 Hz, F1-2-H), 3,90 (1H, br-s, G1-4-H), 3,81 (1H, d-d, J=10,7, 3,7 Hz, F2-2-H), 3,59 (1H, m, G1-3-H), 3,59 (1H, m, G1-5-H), 3,59 (2H, m, G1-6-H), 3,56 (1H, m, G1-2-H), 1,19 (3H, d, J=6,7, F1-6-H), 1,14 (3H, d, J=6,7, F2-6-H)

RMN-^{13}C (D_{2}O)

Los valores del desplazamiento químico de los respectivos carbonos del análisis por RMN-^{13}C se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN-^{13}C (ppm)
G1-1	97,1
G1-2	71,9
G1-3	81,8
G1-4	69,6
G1-5	76,0
G1-6	61,8
F1-1	101,6
F1-2	67,4

TABLA 1 (continuación)

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN-^{13}C (ppm)
F1-3	77,2
F1-4	78,2
F1-5	68,9
F1-6	16,4
F2-1	100,8
F2-2	67,4
F2-3	78,5
F2-4	71,3
F2-5	67,9
F2-6	16,2
Composición en sacáridos: L-fucosa : D-galactosa = 2 : 1
Grupo sulfato: 2 moléculas

Las cifras para la identificación de los picos en RMN-^{1}H son las indicadas en la fórmula (V), a continuación.

15

(2) Propiedades físicas de la molécula de menor tamaño (B)

A continuación se muestran los resultados del análisis espectrométrico de masas y de la identificación por RMN. El espectro de RMN-^{1}H, el espectro de RMN-^{13}C y el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (B) del fucogalactano sulfatado de la presente invención se ilustran en las Figuras 6, 7 y 8, respectivamente. La Figura 6 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (B) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 7 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (B) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 8 es una figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (B) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. En las Figuras 6 y 7, los ejes verticales representan la intensidad de la señal y los ejes horizontales el valor del desplazamiento químico. En la Figura 8, el eje vertical representa la intensidad relativa (%) y el eje horizontal representa el valor m/z.

Peso molecular: 1116

MS m/z 1181,2 [M+3Na^{+}-4H^{+}]^{-} , 579,0 [M+2Na^{+}-4H^{+}]^{2-}, 378,6

[M+Na^{+}-4H^{+}]^{3-}

RMN-^{1}H (D_{2}O)

\delta; 5,20 (1H, d, J=4,3 Hz, F1-1-H), 4,95 (1H, d, J=3,7 Hz, F2-1-H), 4,64 (1H, superpuesto con HOD, G1-1-H), 4,60 (1H, d, J=7,9 Hz, G2-1-H), 4,55 (1H, d-d, J=10,7, 1,8 Hz, F1-3-H), 4,47 (1H, m, F2-3-H), 4,45 (1H, d, J=7,6 Hz, G3-1-H), 4,42 (1H, br-s, G2-4-H), 4,38 (1H, q, J=6,4 Hz, F2-5-H) , 4,28 (1H, m, G2-3-H), 4,20 (1H, m, G3-3-H), 4,17 (1H, br-s, G3-4-H), 4,14 (1H, q, J=6,4Hz, F1-5-H), 4,11 (1H, d, J=1,8 Hz, F1-4-H), 4,06 (1H, d, J=1,8 Hz, F2-4-H), 4,01 (1H, m, G2-6-H), 3,97 (1H, d-d, J=10,7, 4,3 Hz, F1-2-H), 3,90 (1H, br-s, G1-4-H), 3,88 (1H, m, G2-5-H), 3,83 (1H, m, G2-6-H), 3,82 (1H, m, F2-2-H), 3,68 (1H, m, G1-3-H), 3,66 (1H, m, G2-2-H), 3,65 (2H, m, G3-6-H), 3,62 (1H, m, G3-5-H), 3,61 (2H, m, G1-6-H), 3,59 (1H, m, G1-2-H), 3,55 (1H, m, G1-5-H), 3,54 (1H, m, G3-2-H), 1,21 (3H, d, J=6,4, F1-6-H), 1,15 (3H, d, J=6,4, F2-6-H)

RMN-^{13}C (D_{2}O)

Los valores del desplazamiento químico de los respectivos carbonos del análisis por RMN-^{13}C se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN-^{13}C (ppm)
G1-1	103,4
G1-2	71,4
G1-3	81,0
G1-4	69,6
G1-5	75,6
G1-6	61,6
G2-1	97,0
G2-2	70,3
G2-3	80,9
G2-4	73,9
G2-5	74,3
G2-6	70,7
G3-1	103,8
G3-2	69,6
G3-3	81,0
G3-4	67,4
G3-5	75,5
G3-6	61,7
F1-1	101,3
F1-2	67,4
F1-3	77,2
F1-4	78,2
F1-5	68,8
F1-6	16,3
F2-1	100,8
F2-2	67,4
F2-3	78,5

TABLA 2 (continuación)

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN-^{13}C (ppm)
F2-4	71,2
F2-5	67,7
F2-6	16,2
Composición en sacáridos: L-fucosa : D-galactosa = 2 : 3
Grupo sulfato: 4 moléculas

Las cifras para la identificación de los picos en RMN-^{1}H son las indicadas en la fórmula (VI), a continuación.

16

(3) Propiedades físicas de la molécula de menor tamaño (C)

A continuación se muestran los resultados del análisis espectrométrico y la identificación por RMN. El espectro de RMN-^{1}H, El espectro de RMN-^{13}C y el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (C) del fucogalactano sulfatado de la presente invención se ilustran en las Figuras 9, 10 y 11, respectivamente. La Figura 9 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado de la presente invención (C). La Figura 10 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (C) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 11 es una figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (C) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. En las Figuras 9 y 10, los ejes verticales representan la intensidad de la señal y los ejes horizontales representan el valor del desplazamiento químico (ppm). En la Figura 11, el eje vertical representa la intensidad relativa(%) y el eje horizontal representa el valor m/z.

Peso molecular: 502

MS m/z 523 [M+Na^{+}-2H^{+}]^{-}, 250 [M-2H]^{+2-}

RMN-^{1}H (D_{2}O)

\delta 4,57 (1H, d, J=7,9 Hz, G1-1-H), 4,43 (1H, d, J=7,9 Hz, G2-1-H), 4,20 (1H, br-s, G1-3-H), 4,20 (1H, br-s, G1-4-H), 4,20 (1H, br-s, G2-3-H), 4,15 (1H, br-s, G2-4-H), 3,95 (1H, m, G1-6-H), 3,82 (1H, m, G1-5-H), 3,80 (1H, m, G1-6-H), 3,63 (2H, m, G2-6-H), 3,62 (1H, m, G2-5-H), 3,55 (1H, m, G2-2-H), 3,50 (1H, m, G1-2-H)

RMN-^{13}C (D_{2}O)

Los valores del desplazamiento químico de los respectivos carbonos del análisis por RMN-^{13}C se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN^{13}C (ppm)
G1-1	96,7
G1-2	70,4
G1-3	80,7
G1-4	67,6
G1-5	74,0
G1-6	69,7
G2-1	103,4
G2-2	69,4
G2-3	80,7
G2-4	67,4
G2-5	75,3
G2-6	61,4
Composición en sacáridos: D-galactosa
Grupos sulfato: 2 moléculas

Las cifras para la identificación de los picos en RMN-^{1}H son según se indican en la Fórmula (VII), a continuación.

17

(4) Propiedades físicas de la molécula de menor tamaño (D)

A continuación se muestran los resultados del análisis espectrométrico y de la identificación por RMN. El espectro de RMN-^{1}H, el espectro de RMN-^{13}C y el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (D) del fucogalactano sulfatado de la presente invención se ilustran en las Figuras 12, 13 y 14, respectivamente. La Figura 12 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (D) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 13 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (D) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 14 es una figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (D) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. En las Figuras 12 y 13, los ejes verticales representan la intensidad de la señal y los ejes horizontales representan el valor del desplazamiento químico (ppm). En la Figura 14, el eje vertical representa la intensidad relativa (%) y el eje horizontal representa el valor m/z.

Peso molecular: 1358

MS m/z 711,2 [M+3Na^{+}-5H^{+}]^{2-}, 466,6 [M+2Na^{+}-5H^{+}]^{3-}, 344,2 [M+Na^{+}-5H^{+}]^{4-}

RMN-^{1}H (D_{2}O)

\delta; 5,19 (1H, d, J=4,3 Hz, F1-1-H), 4,93 (1H, d, J=3,7 Hz, F2-1-H), 4,62 (1H, superpuesto con HOD, G1-1-H), 4,59 (1H, superpuesto con HOD, G2-1-H), 4,54 (1H, d-d, J=10,6, 2,7 Hz, F1-3-H), 4,46 (1H, d, J=7,6 Hz, G3-1-H), 4,46 (1H, m, F2-3-H), 4,41 (1H, br-s, G2-4-H), 4,41 (1H, d, J=7,6Hz, G4-1-H), 4,37 (1H, q, J=6,4Hz, F2-5-H), 4,27 (1H, m, G2-3-H), 4,24 (1H, br-s, G3-4-H), 4,21 (1H, m, G3-3-H), 4,19 (1H, m, G4-3-H), 4,15 (1H, br-s, G4-4-H), 4,13 (1H, q, J=6,7 Hz, F1-5-H), 4,09 (1H, d, J=2,7 Hz, F1-4-H), 4,04 (1H, d, J=2,8 Hz, F2-4-H), 3,98 (1H, m, G2-6-H), 3,96 (1H, d-d, J=10,6, 4,3 Hz, F1-2-H), 3,93 (1H, m, G3-6-H), 3,88 (1H, br-s, G1-4-H), 3,86 (1H, m, G2-5-H), 3,81 (1H, m, G2-6-H), 3,81 (1H, m, F2-2-H), 3,80 (1H, m, G3-5-H), 3,80 (1H, m, G3-6-H), 3,66 (1H, m, G1-3-H), 3,65 (1H, m, G2-2-H), 3,64 (1H, m, G1-6-H), 3,64 (1H, m, G4-6-H), 3,61 (1H, m, G4-5-H), 3,58 (1H, m, G1-2-H), 3,56 (1H, m, G1-6-H), 3,56 (1H, m, G4-6-H), 3,55 (1H, m, G4-2-H), 3,54 (1H, m, G1-5-H), 3,54 (1H, m, G3-2-H), 1,20 (3H, d, J=6,7, F1-6-H), 1,14 (3H, d, J=6,4, F2-6-H)

RMN-^{13}C (D_{2}O)

Los valores del desplazamiento químico de los respectivos carbonos en el análisis por RMN-^{13}C se muestran en las Tablas 4 y 5.

TABLA 4

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN-^{13}C (ppm)
G1-1	103,4
G1-2	71,4
G1-3	80,9
G1-4	69,5
G1-5	75,6
G1-6	61,7
G2-1	97,0
G2-2	70,7
G2-3	80,9
G2-4	73,8
G2-5	74,1
G2-6	70,8
G3-1	103,7
G3-2	69,5
G3-3	80,8
G3-4	67,4
G3-5	73,6
G3-6	69,0
G4-1	103,6
G4-2	69,5
G4-3	81,1
G4-4	67,7
G4-5	75,5
G4-6	61,7

TABLA 5

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN^{13}C (ppm)
F1-1	101,4
F1-2	67,4
F1-3	77,1
F1-4	78,2
F1-5	68,8
F1-6	16,3
F2-1	100,8
F2-2	67,4
F2-3	78,4
F2-4	71,2
F2-5	67,8
F2-6	16,2
Composición en sacáridos: L-fucosa : D-galactosa = 2 : 4
Grupo sulfato: 5 moléculas

Las cifras para la identificación de los picos en RMN-^{1}H son según se indica en la fórmula (VIII), a continuación.

18

(5) Propiedades físicas de la molécula de menor tamaño (E)

A continuación se muestran los resultados del análisis espectrométrico y la identificación por RMN. El espectro de RMN-^{1}H, el espectro de RMN-^{13}C y el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (E) del fucogalactano sulfatado de la presente invención se ilustran en las figuras 15, 16 y 17, respectivamente. La figura 15 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (E) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 16 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C de la molécula de menor tamaño (E) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 17 es una figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (E) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. En las Figuras 15 y 16, los ejes verticales representan la intensidad de la señal y los ejes horizontales representan el valor del desplazamiento químico (ppm). En la Figura 17, el eje vertical representa la intensidad relativa (%) y el eje horizontal representa el valor m/z.

Peso molecular: 1036

MS m/z 528,0[M+Na^{+}-3H^{+}]^{2-}, 344,0 [M-3H^{+})3^{-}

RMN-^{1}H (D_{2}O)

\delta; 5,19 (1H, d, J=4,3 Hz, F1-1-H), 4,87 (1H, d, J=3,7 Hz, F2-1-H), 4,63 (1H, superpuesto con HOD, G1-1-H), 4,59 (1H, d, J=7,9 Hz, G2-1-H), 4,53 (1H, d-d, J=10,7, 1,8 Hz, F1-3-H), 4,44 (1H, d, J=7,6 Hz, G3-1-H), 4,40 (1H, br-s, G2-4-H), 4,32 (1H, q, J=6,4 Hz, F2-5-H), 4,27 (1H, m, G2-3-H), 4,19 (1H, m, G3-3-H), 4,16 (1H, br-s, G3-4-H), 4,12 (1H, q, J=6,4Hz, F1-5-H), 4,06 (1H, d, J=1,8 Hz, F1-4-H), 3,99 (1H, m, G2-6-H), 3,88 (1H, br-s, G1-4-H), 3,88 (1H, d-d, J=10,7, 4,3 Hz, F1-2-H), 3,86 (1H, m, G2-5-H), 3,81 (1H, m, G2-6-H), 3,81 (1H, m, F2-3-H), 3,69 (1H, d, J=1,8 Hz, F2-4-H), 3,66 (1H, m, G1-3-H), 3,65 (1H, m, G2-2-H), 3,64 (1H, m, F2-2-H), 3,63 (2H, m, G1-6-H), 3,61 (1H, m, G3-5-H), 3,61 (2H, m, G3-6-H), 3,60 (1H, m, G1-2-H), 3,53 (1H, m, G1-5-H), 3,53 (1H, m, G3-2-H), 1,19 (3H, d, J=6,4, F1-6-H), 1,12 (3H, d, J=6,4, F2-6-H)

RMN-^{13}C (D_{2}O)

Los valores del desplazamiento químico de los respectivos carbonos en el análisis por RMN-^{13}C se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN-^{13}C
G1-1	103,2
G1-2	71,2
G1-3	80,3
G1-4	69,3
G1-5	75,4
G1-6	61,3
G2-1	96,7
G2-2	70,4
G2-3	80,8
G2-4	73,7
G2-5	74,0
G2-6	70,6
G3-1	103,5
G3-2	69,4
G3-3	80,8
G3-4	67,4
G3-5	75,2
G3-6	61,5
F1-1	101,1
F1-2	67,3
F1-3	76,9

TABLA 6 (continuación)

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN-^{13}C
F1-4	77,8
F1-5	68,5
F1-6	16,1
F2-1	100,6
F2-2	69,2
F2-3	69,8
F2-4	72,7
F2-5	67,7
F2-6	16,0
Composición en sacáridos: L-fucosa : D-galactosa = 2 : 3
Grupo sulfato: 3 moléculas

Las cifras para la identificación de los picos en RMN-^{1}H se indican en la fórmula (IX), a continuación.

19

(6) Propiedades físicas de las moléculas de menor tamaño (F)

A continuación se muestran los resultados del análisis espectrométrico de masas y la identificación por RMN. El espectro de RMN-^{1}H, el espectro de ^{13}C-DEPT-135º y el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (F) del fucogalactano sulfatado de la presente invención se ilustran en las Figuras 18, 19 y 20, respectivamente. La Figura 18 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la molécula de menor tamaño (F) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 19 es una figura que ilustra el espectro de ^{13}C-DEPT-135º de la molécula de menor tamaño (F) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 20 es una figura que ilustra el espectro de masas de la molécula de menor tamaño (F) del fucogalactano sulfatado de la presente invención. En las Figuras 18 y 19, los ejes verticales representan la intensidad de la señal y los ejes horizontales representan el valor del desplazamiento químico (ppm). En la figura 20 el eje vertical representa la intensidad relativa (%) y el eje horizontal representa el valor m/z.

Peso molecular: 1278

MS m/z 660,0 [M+2Na^{+}-4H^{+}]^{2-}, 432,0 [M+Na^{+}-4H^{+}]^{3-}, 318,2 [M-4H^{+}]^{4-}

RMN-^{1}H (D_{2}O)

\delta; 5,19 (1H, d, J=4,3 Hz, F1-1-H), 4,87 (1H, d, J=3,8 Hz, F2-1-H), 4,61 (1H, superpuesto con HOD, G1-1-H), 4,59 (1H, J=7,9 Hz, G2-1-H), 4,53 (1H, d-d, J=10,6, 2,7 Hz, F1-3-H), 4,46 (1H, d, J=7,6 Hz, G3-1-H), 4,42 (1H, d, J=7,6 Hz, G4-1-H), 4,41 (1H, br-s, G2-4-H), 4,32 (1H, q, J=6,4 Hz, F2-5-H), 4,27 (1H, m, G2-3-H), 4,24 (1H, br-s, G3-4-H), 4,20 (1H, m, G3-3-H), 4,20 (1H, m, G4-3-H), 4,16 (1H, br-s, G4-4-H), 4,12 (1H, q, J=6,7Hz, F1-5-H), 4,06 (1H, d, J=2,7 Hz, F1-4-H), 3,98 (1H, m, G2-6-H), 3,94 (1H, m, G3-6-H), 3,89 (1H, d-d, J=10,6, 4,3 Hz, F1-2-H), 3,88 (1H, br-s, G1-4-H), 3,86 (1H, m, G2-5-H), 3,86 (1H, m, G2-6-H), 3,82 (1H, m, F2-3-H), 3,80 (1H, m, G3-5-H), 3,80 (1H, m, G3-6-H), 3,69 (1H, d, J=2,8, F2-4-H), 3,66 (1H, m, G1-3-H), 3,65 (2H, m, G1-6-H), 3,65 (2H, m, G4-6-H), 3,64 (1H, m, G2-2-H), 3,64 (1H, m, F2-2-H), 3,62 (1H, m, G4-5-H), 3,59 (1H, m, G1-2-H), 3,54 (1H, m, G1-5-H), 3,54 (1H, m, G3-2-H), 3,54 (1H, m, G4-2-H), 1,19 (3H, d, J=6,7, F1-6-H), 1,12 (3H, d, J=6,4, F2-6-H)

RMN-^{13}C(D_{2}O)

Los valores de. desplazamiento químico de los carbonos respectivos en el análisis por RMN-^{13}C se muestran en las Tablas 7 y 8.

TABLA 7

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico RMN-^{13}C
G1-1	103,2
G1-2	71,2
G1-3	80,4
G1-4	69,3
G1-5	75,3
G1-6	61,3
G2-1	96,7
G2-2	70,4
G2-3	80,5
G2-4	73,7
G2-5	73,8
G2-6	70,5
G3-1	103,5
G3-2	69,2
G3-3	80,5
G3-4	67,2
G3-5	73,4
G3-6	68,8
G4-1	103,4
G4-2	69,2
G4-3	80,8
G4-4	67,4
G4-5	75,3
G4-6	61,3

TABLA 8

Posición de carbono	Valor de desplazamiento químico (ppm) RMN-^{13}C
F1-1	101,0
F1-2	67,3
F1-3	76,9
F1-4	77,7
F1-5	68,5
F1-6	16,0
F2-1	100,5
F2-2	69,1
F2-3	69,7
F2-4	72,7
F2-5	67,7
F2-6	15,9
Composición en sacáridos: L-fucosa : D-galactosa = 2 : 4
Grupo sulfato: 4 moléculas

Las cifras para la identificación de los picos en RMN-^{1}H son según se indica en la fórmula (X), a continuación.

20

Ejemplo 8 (1) Análisis de la estructura principal del fucogalactano sulfatado de la presente invención

Se llevó a cabo un análisis por RMN para determinar la estructura completa de la fracción de fucogalactano sulfatado según se preparó en el Ejemplo 1(2), y el sitio de escisión de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado.

A continuación se muestra la identificación por RMN. El espectro de RMN-^{1}H, el espectro de RMN-^{13}C y el espectro de absorción infrarroja (IR) del fucogalactano sulfatado de la presente invención se ilustran en las Figuras 21, 22 y 23, respectivamente. La Figura 21 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 22 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C del fucogalactano sulfatado de la presente invención. La Figura 23 es una figura que ilustra el espectro de absorción infrarroja del fucogalactano sulfatado de la presente invención. En las Figuras 21 y 22, los ejes verticales representan la intensidad de la señal, y los ejes horizontales representan el valor del desplazamiento químico (ppm). En la Figura 23, el eje vertical representa la transmisividad (%) y el eje horizontal representa el número de onda (cm^{-1}). Los resultados del análisis por RMN-^{1}H y del análisis por RMN-^{13}C se muestran en las Tablas 9 y 10.

TABLA 9

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico (ppm)
	RMN-^{13}C	RMN-^{1}H
G1-1	103,4	4,63
G1-2	71,3	3,61
G1-3	80,8	3,67
G1-4	69,6	3,89
G1-5	75,6	3,57
G1-6	61,7	3,62, 3,68
G2-1	103,7	4,45
G2-2	69,6	3,56
G2-3	80,8	4,32
G2-4	74,1	4,44
G2-5	74,1	3,87
G2-6	71,3	3,83, 3,97
G3-1	103,7	4,45
G3-2	69,6	3,56
G3-3	80,8	4,23
G3-4	67,4	4,24
G3-5	74,1	3,82
G3-6	69,6	3,85, 3,99
G4-1	103,7	4,45
G4-2	69,6	3,56
G4-3	80,8	4,23
G4-4	67,4	4,17
G4-5	74,1	3,82

TABLA 10

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico (ppm)
	RMN-^{13}C	RMN-^{1}H
G4-6	68,8	4,07, 4,17
F1-1	101,5	5,20
F1-2	67,4	3,97
F1-3	77,1	4,58
F1-4	78,5	4,11
F1-5	68,8	4,14
F1-6	16,3	1,21
F2-1	100,8	4,95
F2-2	67,4	3,82
F2-3	78,5	4,50
F2-4	71,3	4,05
F2-5	67,8	4,39
F2-6	16,2	1,15

En base a la identificación según se muestra en las Tablas 9 y 10, se demostró que el esqueleto principal del fucogalactano sulfatado de la presente invención es el compuesto (D) del Ejemplo 7(4), y que el fucogalactano sulfatado de la presente invención tiene una estructura en la que los compuestos están unidos repetitivamente. El enlace entre la estructura repetitiva era un enlace \beta de la galactosa G2 con la posición 6 de la galactosa G4, según se muestra en la fórmula (XIII), a continuación. Así, se demostró que el fucogalactano sulfatado tiene una estructura repetitiva de sus esqueletos principales, según se muestra a continuación.

21

Además, en base a las estructuras químicas del fucogalactano sulfatado de la presente invención y las moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado de la presente invención, se demostró que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención es una enzima que digiere el enlace \beta 1-6 y el enlace \beta 1-4 entre la D-galactosa sulfatada o galactosa y la D-galactosa sulfatada o galactosa en el fucogalactano sulfatado internamente. Adicionalmente, el peso molecular medio del fucogalactano sulfatado de la presente invención era de aproximadamente 130.000, con una distribución del peso molecular desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 200.000, según se midió en las condiciones descritas en el Ejemplo 1(3).

(2) Actividad inductora de la producción del HGF del fucogalactano sulfatado de la presente invención

Se determinó la actividad inductora de la producción del HGF del fucogalactano sulfatado de la presente invención obtenido según se describe en el Ejemplo 1(2). La actividad inductora de la producción de HGF se midió tal y como sigue. En resumen, se colocaron 500 \mul de una suspensión que contenía células MRC-5 (CCL171; Dainippon Pharmaceutical, código 02-021) en medio DME que contenía suero bovino fetal al 10% en una concentración de 1x 10^{5} células/ml en cada pocillo de una placa de cultivo de células de 48 pocillos, y la placa se incubó a 37ºC durante 24 horas en presencia de CO_{2} al 5%. Entonces el medio se sustituyó por medio DME que contenía suero bovino fetal al 1%. El fucogalactano sulfatado obtenido según se describe en el Ejemplo 1-(2) se añadió como muestra al pocillo a una concentración final de 1, 10 ó 100 \mug/ml. La placa se incubó durante 24 horas más. La cantidad de HGF en el medio recogido se midió entonces usando el kit ELISA quanticina para el factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HGF) (Funakoshi, código RS-0641-00). Como control, se añadió agua destilada en una cantidad igual a la de la muestra. La cantidad de HGF para el control, 4,3 ng/ml, se definió como el 100%. Las cantidades de HGF producidas para los grupos a los que se añadió la muestra se muestran en la Tabla 11. Todos los experimentos se llevaron a cabo por duplicado. Se muestran los valores medios.

TABLA 11

Concentración (\mug/ml)	Aumento en la producción de HGF (%)
1	194
10	355
100	429

La cantidad de HGF producida para el control fue de 4,3 ng/ml.

Según se muestra en la Tabla 11, se confirmó que el fucogalactano sulfatado de la presente invención induce la producción del HGF, y así, el fucogalactano sulfatado de la presente invención resulta útil como inductor de la producción del HGF.

Ejemplo 9

(1) Se disolvieron 70 g de la fracción del polisacárido que contiene fucosa sulfatada de Kjellmaniella crassifolia obtenido en el Ejemplo 3 en un tampón de imidazol-clorhídrico 20 mM (pH 7,5) que contenía cloruro sódico 300 mM y etanol al 10%, y se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para eliminar completamente cualquier sustancia que pudiera filtrarse. Para la ultrafiltración se usó el mismo tampón usado anteriormente para la disolución.

A la disolución retenida tras la ultrafiltración se añadieron 20 U de la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada obtenida a partir de un cultivo de la especie de Flavobacterium SA-0082 (FERM BP-5402), según de describe en el documento W097/26896. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 5 días. La mezcla de reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para eliminar completamente las sustancias que la enzima digestiva del polisacárido U que contiene ucosa sulfatada había convertido en moléculas de menor tamaño, es decir, moléculas de menor tamaño del fucoglucoromanano sulfatado. Se usó agua para la ultrafiltración, que finalmente se sustituyó por un tampón de imidazol-clorhídrico 10 mM (pH 8) que contenía cloruro sódico 200 mM.

A la disolución retenida tras la ultrafiltración se añadieron 2 U de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según se describe en el Ejemplo 2(1). La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 5 días. La mezcla de reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para eliminar completamente las sustancias que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado había convertido en moléculas de menor tamaño, es decir, moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado. Para la ultrafiltración se usó el mismo tampón utilizado para la mezcla de reacción.

A la disolución retenida tras la ultrafiltración se añadió cloruro cálcico a una concentración final de 20 mM y 5 U de la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada obtenida a partir de un cultivo de la especie de Alteromonas SN-1009 (FERM BP-5747), según se describe en el documento W097/26896. La mezcla se hizo reaccionar a 25ºC durante 3 días. La mezcla de reacción se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 100.000 para eliminar completamente las sustancias que la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada había convertido en moléculas de menor tamaño. Se usó agua para la ultrafiltración. Se examinaron las propiedades físicas y químicas de las moléculas de menor tamaño del polisacárido que contiene sulfato de fucosa contenidas en el filtrado así obte-
nido.

(2) El filtrado obtenido en (1) anteriormente se recogió y se sometió a una ultrafiltración usando un dispositivo de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso de exclusión molecular de 3.000 para separar un filtrado de un no filtrado.

El filtrado se concentró hasta aproximadamente 3 l usando un evaporador rotatorio y se centrifugó para obtener un sobrenadante. El sobrenadante se desalinizó usando un dispositivo de electrodiálisis equipado con una membrana con peso de exclusión molecular de 300. Se añadió acetato cálcico a la disolución desalinizada a una concentración de 0,1 M. El precipitado formado se eliminó por centrifugación. El sobrenadante resultante se cargó en una columna de DEAE-Cellulofine (volumen de resina: 4 l) equilibrada con acetato cálcico 50 mM. Tras un intenso lavado con acetato cálcico 50 mM y cloruro sódico 50 mM, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 50 mM a 800 mM. Se obtuvieron 500 ml de eluido para cada fracción. Las fracciones recogidas se analizaron según el método de electroforesis en membrana de acetato de celulosa [Analytical Biochemistry, 37: 197-202 (1970)], y se encontró que la fracción eluida con cloruro sódico aproximadamente 0,4 M (denominada en lo sucesivo fracción eluida a 0,4 M) era homogénea. Adicionalmente, la fracción eluida con cloruro sódico aproximadamente 0,6 M (denominada en lo sucesivo fracción eluida a 0,6 M) era prácticamente homogénea, según se determinó por electroforesis.

La fracción eluida a 0,4 M se concentró hasta 150 ml. Se añadió cloruro sódico a la misma a una concentración de 4 M. La disolución resultante se cargó en una columna de fenil-Cellulofine (volumen de resina: 200 ml) equilibrada con cloruro sódico 4 M. Tras un intenso lavado con cloruro sódico 4 M, las fracciones que contenían un sacárido sulfatado no adsortivo se recogieron y desalinizaron usando un dispositivo de electrodiálisis equipado con una membrana con peso de exclusión molecular de 300 para obtener 505 ml de una disolución desalinizada.

Se cargaron 40 ml de la disolución desalinizada así obtenida en una columna de Cellulofine GCL-90 (4,1 cm x 87 cm) equilibrada con sódico 0,2 M que contenía etanol al 10% para una filtración en gel. Se recogieron 9,2 ml del eluido para cada fracción.

El contenido total en azúcar se midió para cada fracción según el método del fenol-ácido sulfúrico [Analytical Chemistry, 28: 350 (1956)].

El sacárido sulfatado formó un pico. Se recogió una fracción en la porción intermedia del pico, se desalinizó mediante un dispositivo de electrodiálisis equipado con una membrana con un peso de exclusión molecular de 300 y se liofilizó para obtener 112 mg de un producto seco del sacárido sulfatado de la presente invención. Se sometió una porción del producto seco a un análisis de la composición en sacáridos y a un análisis espectrométrico de masas. Además, se sometieron 10 mg del producto seco a un análisis por RMN tras un intercambio por agua pesada, según un método convencional.

Los resultados del análisis de la composición en sacáridos demostraron que la fracción eluida a 0,4 M contenía un sacárido sulfatado formado por fucosa.

En la Figura 24 se muestran los resultados del análisis espectrométrico de masas del sacárido sulfatado, usando un espectrómetro de masas API-III (Perkin-Elmer Sciex). Los resultados analíticos se muestran a continuación. La Figura 24 es una figura que muestra los resultados del análisis espectrométrico de masas del sacárido sulfatado. El eje vertical representa la intensidad relativa (%) y el eje horizontal representa el valor m/z. Se determinó que el peso molecular era de 2264 \pm 1, siempre que todos los grupos sulfato formasen sales sódicas. El sacárido sulfatado contiene únicamente fucosa como sacárido constituyente. Así, se demostró que el sacárido sulfatado es aquel en el que están unidas 7 moléculas de fucosa y 12 moléculas de grupo sulfato, y tiene un peso molecular teórico de 2265, siempre que todos los grupos sulfato formen sales sódicas.

Las principales señales de la Figura 24 pueden identificarse como sigue, definiendo la presente sustancia como M.

m/z	1109,05	--- [M-2Na^{+}]^{2-} (valor teórico: 1109,5)
	731,45	--- [M-3Na^{+}]^{3}- (valor teórico: 732)
	542,75	--- [M-4Na^{+}]^{4-} (valor teórico: 543,25)
	430,05	--- [M-5Na^{+}]^{5-} (valor teórico: 430)

Por tanto, la presente sustancia es un oligosacárido formado por 7 moléculas de fucosa y 12 moléculas de grupo sulfato.

Entonces se llevó cabo un análisis por RMN usando un aparato de resonancia magnética nuclear JNM-a500 (Nippon Denshi) con objeto de analizar el enlace de la fucosa y determinar las posiciones en las que están unidas los grupos sulfato. Los enlaces de los sacáridos constituyentes se analizan usando el método HMBC, un método para la detección de enlaces heteronucleares del ^{1}H. Se usaron el método DQF-COSY y el método HOHAHA para la identificación por RMN-^{1}H. Se usó el método HSQC para la identificación por RMN-^{13}C.

Los resultados de la identificación por RMN se muestran a continuación. El espectro de RMN-^{1}H y el espectro de RMN-^{13}C del sacárido sulfatado en la fracción eluida a 0,4 M se ilustran en las Figuras 25 y 26, respectivamente. Los valores del desplazamiento químico en RMN-^{1}H se expresan asumiendo que el valor del desplazamiento químico del dioxano es 3,53 ppm. Los valores del desplazamiento químico en RMN-^{13}C se expresan asumiendo que el valor del desplazamiento químico del dioxano es 66,5 ppm. Ambas medidas se llevaron a cabo a 60ºC. La Figura 25 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H del sacárido sulfatado en la fracción eluida a 0,4 M. La Figura 26 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{13}C del sacárido sulfatado en la fracción eluida a 0,4 M. En las figuras 25 y 26, los ejes verticales representan la intensidad de la señal y los ejes horizontales representan el valor del desplazamiento químico (ppm). Los resultados del análisis por RMN-^{1}H y del análisis por RMN-^{13}C se muestran en las Tablas 12 y 13.

TABLA 12

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico (ppm)
	RMN-^{13}C	RMN-^{1}H
A-1	89,3	5,30
A-2	75,4	4,30
A-3	73,9	4,17
A-4	78,6	4,67
A-5	67,5	4,14
A-6	15,3	1,12
B-1	98,3	5,23
B-2	74,5	4,33
B-3	75,9	4,18
B-4	80,6	4,72
B-5	68,0	4,10
B-6	15,9	1,08
C-1	98,9	5,18
C-2	73,6	4,35
C-3	70,9	4,32
C-4	77,5	4,62
C-5	66,9	4,24
C-6	16,0	1,11
D-1	89,3	5,16
D-2	73,9	3,98
D-3	74,2	4,16
D-4	73,0	4,64
D-5	70,6	4,25
D-6	13,1	1,34

TABLA 13

Posición del carbono	Valor del desplazamiento químico (ppm)
	RMN-^{13}C	RMN-^{1}H
E-1	97,1	5,20
E-2	73,0	4,37
E-3	69,9	4,17
E-4	77,4	4,65
E-5	67,5	4,21
E-6	15,8	1,15
F-1	94,6	5,19
F-2	74,8	4,27
F-3	66,5	4,18
F-4	81,3	4,49
F-5	66,3	4,27
F-6	15,8	1,06
G-1	99,2	5,09
G-2	65,6	3,78
G-3	77,9	4,36
G-4	70,1	3,97
G-5	66,7	3,96
G-6	15,4	1,04

Las cifras para la identificación de los picos en RMN son según se indican en la fórmula (XV), a continuación.

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En base a estos resultados, se demostró que la presente sustancia era un sacárido sulfatado de la fórmula (XVI), a continuación.

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(3) La fracción eluida a 0,6 M a partir de la DEAE-Cellulofine según se describe en el Ejemplo 9(2) se purificó según se describió anteriormente para la fracción eluida a 0,4 M, para obtener un producto de liofilización.

El análisis del producto usando HPLC demostró que el producto era un sacárido sulfatado con un peso molecular mayor que el del producto contenido en la fracción eluida a 0,4 M. El análisis por RMN del producto proporcionó prácticamente el mismo espectro al obtenido para la fracción eluida a 0,4 M.

En la Figura 27 se ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la fracción eluida a 0,6 M. Se usó agua pesada como disolvente. Los valores del desplazamiento químico en RMN-^{1}H se expresan asumiendo que el valor del desplazamiento químico del dioxano es 3,53 ppm. La medida se llevó a cabo a 60ºC. La Figura 27 es una figura que ilustra el espectro de RMN-^{1}H de la fracción eluida a 0,6 M. El eje vertical representa la intensidad de la señal y el eje horizontal representa el valor del desplazamiento químico (ppm).

Los resultados sugirieron firmemente que la fracción eluida a 0,6 M tenía una estructura en la que estaban unidas muchas moléculas de la fracción eluida a 0,4 M. Cuando los productos obtenidos mediante una digestión adicional de la fracción eluida a 0,6 M con la enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada según se describe en el Ejemplo 9(1) se analizaron usando HPLC, muchos de los productos de la reacción eluyeron en la misma posición que el sacárido sulfatado en la fracción eluida a 0,4 M de la DEAE-Cellulofine, según se describe en el Ejemplo 9(2).

La HPLC se llevó a cabo como sigue.

Columna: Shodex SB802.5 (Showa Denko);

Temperatura de la columna: 25ºC;

Eluyente: cloruro sódico 50 mM que contenía azida sódica 5 mM; y

Detección: detector del índice de refracción diferencial Shodex RI-71.

El peso molecular de determinó mediante filtración en gel usando pululano (Showa Denko) como estándar para la fracción eluida a 0,6 M y la fracción eluida a 0,4 M. Como resultado, se demostró que la fracción eluida a 0,4 M tenía un peso molecular de aproximadamente 8.500 basado en el peso molecular del pululano, y que la fracción eluida a 0,6 M tenía un peso molecular de aproximadamente 26.000 basado en el peso molecular del pululano, indicando que la fracción eluida a 0,6 M era un trímero del sacárido sulfatado en la fracción eluida a 0,4 M. Adicionalmente, un análisis detallado del espectro de RMN-^{1}H de la fracción eluida a 0,6 M demostró que cada uno de los heptasacáridos repetitivos unidos a la posición 3 de la fucosa F en la fórmula (XV) a través de un enlace \alpha-(1\rightarrow3). Adicionalmente, se obtuvo un pentámero del sacárido sulfatado de (XVI), es decir, del sacárido sulfatado de la fórmula general (XIV), a continuación, en la que n es 5, a partir del polisacárido que contiene sulfato de fucosa según el método anteriormente mencionado.

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en la que R es H ó OSO_{3}H.

Según se ha descrito anteriormente, se confirmó que un polisacárido sulfatado que es convertido en moléculas de menor tamaño por la acción de una enzima digestiva del polisacárido F que contiene fucosa sulfatada y que contiene un sacárido sulfatado de la fórmula general a continuación, como un componente esencial del sacárido constituyente, se obtiene tratando un polisacárido que contiene fucosa sulfatada obtenido a partir de algas feófitas tales como Kjellmaniella crassifolia con la enzima digestiva del polisacárido U que contiene fucosa sulfatada y la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. El peso molecular medio del polisacárido sulfatado era de aproximadamente 200.000 (distribución del peso molecular: desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 1.000.000) en unas condiciones de extracción a pH 6-8, a 95ºC durante aproximadamente 2 horas, medido según el método descrito en el Ejemplo 1(3). El peso molecular medio era de aproximadamente 13.000.000 (distribución del peso molecular: desde aproximadamente 100.000 hasta aproximadamente 20.000.000) en unas condiciones de extracción a pH 6-8, a 25ºC durante aproximadamente 24 horas.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un fucogalactano sulfatado y una molécula de menor tamaño del fucogalactano sulfatado que son útiles como reactivos en glucotecnología o como inductores de la producción de HGF. La presente invención también proporciona una nueva enzima digestiva del fucogalactano sulfatado que puede usarse para el análisis estructural y la digestión del fucogalactano sulfatado y la producción reproducible de las moléculas de menor tamaño del fucogalactano sulfatado. La presente invención proporciona además un método para producir la enzima. La presente invención también proporciona un método para eliminar selectivamente el fucogalactano sulfatado a partir de una mezcla de polisacáridos que contienen fucosa sulfatada usando la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención. Adicionalmente, la presente invención proporciona un nuevo sacárido sulfatado obtenido mediante el uso de la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado de la presente invención en combinación con otras enzimas digestivas de polisacáridos que contienen sulfato de fucosa.

Claims

1. Un fucogalactano sulfatado con las siguientes propiedades físicas y químicas:

(1) contiene galactosa y mucosa como sacáridos constituyentes, en una proporción molar de 1:1 a 6:1;

(2) contiene un sacárido sulfatado de la formula general (XI) como componente esencial de los sacáridos constituyentes:

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en la que R es H o SO_{3}H, y al menos un R es SO_{3}H; y

(3) es convertido por una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado en moléculas de menor tamaño para generar al menos un compuesto elegido del grupo formado por los compuestos de las fórmulas generales de (I) a (IV):

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27

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en las que R es H o SO_{3}H, y al menos un R es SO_{3}H o una sal del mismo.

2. Un sacárido con una estructura química elegida del grupo formado por las fórmulas generales (II), (III) y (IV):

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\vskip1.000000\baselineskip

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en las que R es H ó SO_{3}H, y al menos un R es SO_{3}H, o una sal del mismo.

3. Una enzima digestiva del fucogalactano sulfatado con las siguientes propiedades físicas y químicas:

(1) actúa sobre un fucogalactano sulfatado que contiene galactosa y fucosa como sacáridos constituyentes en una proporción molar de 1:1 a 6:1 o una sal del mismo para convertir el fucogalactano sulfatado en moléculas de menor tamaño y generar un oligosacárido con galactosa sulfatada o galactosa en su extremo reductor;

(2) tiene un pH óptimo de 7 a 9; y

(3) tiene una temperatura óptima de 25 a 45ºC

4. Un método para producir un oligosacárido con galactosa sulfatada en su extremo reductor a partir de un fucogalactano sulfatado, caracterizado porque el método comprende permitir que la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según la reivindicación 3 actúe sobre el fucogalactano sulfatado derivado de algas feófitas o una sal del mismo, y obtener un oligosacárido con galactosa sulfatada en su extremo reductor.

5. Un método para producir la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según la reivindicación 3, caracterizado porque el método comprende cultivar una bacteria del género Flavobacterium capaz de producir la enzima digestiva del fucogalactano sulfatado según la reivindicación 3, y recoger la enzima del cultivo.