ES2225172T3 - Procedimdiento para la determinacion de la fertilidad de mamiferos, en especial de seres humanos. - Google Patents
Procedimdiento para la determinacion de la fertilidad de mamiferos, en especial de seres humanos.Info
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Abstract
Procedimiento para la determinación de la fertilidad de mamíferos, en especial de seres humanos, caracterizado porque u se determina el contenido de afamina de un líquido corporal u orgánico tomado de un mamífero y u el contenido de afamina determinado se compara con un valor de referencia.
Description
Procedimiento para la determinación de la
fertilidad de mamíferos, en especial de seres humanos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la determinación de la fertilidad de mamíferos,
en especial de seres humanos.
Debido al aumento en conocimientos y habilidades
en la técnica de fertilización in vitro, se ha incrementado
fuertemente la necesidad de métodos de determinación de la
fertilidad fiables y económicos. A este respecto no se trata solo
de la diagnosis principal de trastornos de fertilidad sino en
medida creciente de la detección de grados de fertilización y de la
determinación de la fecundación y/o anidación del oocito
fecundado.
La afamina es una proteína de 87 kDa que
pertenece al grupo de la albúmina y que presenta muchas similitudes
estructurales y bioquímicas con las proteínas de este grupo, como
p.ej. con la seroalbúmina humana, la
\alpha-fetoproteína humana o la proteína de unión
a la vitamina D humana. La afamina ya se ha clonado y secuenciado y
está a disposición por consiguiente también en forma recombinante
(documento WO 95/27059).
Además de esto, investigaciones bioquímicas y
fisiológicas dieron por resultado que esta proteína presenta
propiedades de unión a la vitamina E. Ha podido comprobarse que la
afamina no se presenta solo en la sangre, sino también en otros
líquidos corporales u orgánicos, como por ejemplo líquido
cefalorraquídeo, folícular y semen.
El cometido de la presente invención radica en
proporcionar un método de determinación de la fertilidad de tipo
totalmente nuevo.
Este cometido se resuelve conforme a la invención
mediante un procedimiento para la determinación de la fertilidad de
mamíferos, en especial de seres humanos, que se caracteriza
porque
- \bullet
- se determina el contenido de afamina de un líquido corporal u orgánico tomado de un mamífero y
- \bullet
- el contenido de afamina determinado se compara con un valor de referencia para la determinación de la fertilidad.
La presente invención se basa en el sorprendente
conocimiento de que la concentración de afamina en los distintos
líquidos corporales u orgánicos en los que la afamina está
presente, se correlaciona directamente con propiedades de
fertilidad. Esta correlación no se limita solo a la presencia de
trastornos de fertilidad, sino que también es posible para la
diagnosis de fluctuaciones de fertilidad o embarazos. Conforme a la
invención ha resultado incluso que además de la detección de
presencia o ausencia de oocitos a través de la metodología conforme
a la invención para la determinación del contenido de afamina es
posible hasta una declaración respecto al grado de maduración de los
oocitos.
La presente invención puede utilizarse en la
medicina humana, en especial en el control de fertilizaciones in
vitro o en diagnosis y dictámenes de fertilización. Pero
también ofrece enormes posibilidades de utilización en el marco de
la moderna reproducción animal, pues puede estandarizarse de modo
sencillo y no son precisos equipos de laboratorio complicados para
la realización del ensayo.
La afamina está presente en muchos líquidos
corporales u orgánicos y conforme a la invención ha resultado que
el contenido de afamina en todos estos líquidos se correlaciona con
las propiedades de fertilidad. Según formas de realización
preferidas de la presente invención el contenido de afamina se
determina no obstante predominantemente en líquidos corporales u
orgánicos que se caracterizan por un elevado contenido fisiológico
de afamina, como p.ej. el suero, líquido folicular o semen. Pero
naturalmente también es posible llevar a cabo el procedimiento
conforme a la invención con otros líquidos corporales u orgánicos,
como por ejemplo líquido cefalorraquídeo, pues también la
concentración de afamina se encuentra en estos otros líquidos en
intervalos que por regla general no conllevan problema alguno en lo
que respecta al posible límite de identificación de la afamina.
La forma y modo en que se lleva a cabo el
procedimiento conforme a la invención en la práctica es totalmente
discrecional, ante todo en lo que concierne a la forma de la toma
del líquido corporal u orgánico o de la determinación del contenido
de afamina. Por ejemplo, el contenido de afamina puede determinarse
inmunológicamente, electroforéticamente o cromatográficamente. Los
procedimientos inmunológicos de determinación para la afamina se
prefieren frecuentemente conforme a la invención, pues no solo se
dispone de una serie de distintos anticuerpos monoclonales contra
los más distintos epítopos de afamina, sino que precisamente los
ensayos inmunológicos pueden concebirse, por ejemplo en forma de
ensayo ELISA estándar, de modo tan sencillo que pueden llevarse a
cabo y evaluarse también sin un costoso instrumental de laboratorio
(por ejemplo en combinación con procedimientos de identificación
colorimétricos). Por consiguiente es posible proporcionar el
procedimiento de determinación conforme a la invención también en
una forma realizable por profanos.
Como valor de referencia se establece
habitualmente un valor normal de afamina para el respectivo líquido
corporal u orgánico. Este puede establecerse por ejemplo en forma
de valores de comparación, curvas de comparación o tablas de
comparación en el procedimiento conforme a la invención o - lo que
en general se prefiere - por determinación simultánea de una
muestra de referencia (con contenido de afamina definido) junto con
la muestra del líquido corporal u orgánico tomada. En el último
caso, el error sistemático, que probablemente no pueda excluirse
nunca totalmente, puede implicar impedir de antemano los distintos
métodos de determinación o las distintas condiciones de
determinación. Esto puede ser importante ante todo en
determinaciones en las que solo se trata de diferencias graduales
en el contenido de afamina (por ejemplo en determinaciones del
grado de maduración de oocitos).
Preferiblemente la muestra medida conforme a la
invención no se compara solo con un valor de referencia, sino con
dos o más valores de referencia. Así, por ejemplo puede preverse
además de un "valor normal" también otro valor de referencia o
una muestra de referencia, como por ejemplo una referencia
"patológica" o una referencia de "embarazo", etc.
Conforme a la invención es preferido sin embargo
en cualquier caso el prever un valor de referencia para el
contenido de afamina en el correspondiente líquido corporal u
orgánico que corresponda al valor de afamina de un paciente normal
(o en el caso de la reproducción animal de la muestra del animal
normal).
Este valor de referencia se obtiene de forma
preferida en la realización del procedimiento conforme a la
invención determinando paralelamente a la determinación de
fertilidad de la muestra el contenido de afamina de una muestra de
referencia.
Conforme a la invención es preferida la
determinación del contenido de afamina mediante métodos
inmunológicos, en especial utilizando un anticuerpo monoclonal,
pues de este modo la estandarización puede conseguirse muy
eficientemente y también viene dada mutuamente para las más
distintas cargas de un kit de determinación la compatibilidad de
los datos determinados.
Se ha comprobado conforme a la invención que en
especial en el líquido folicular y el semen además del contenido de
afamina también se correlaciona el contenido de vitamina E
directamente con la propiedad de fertilidad y puede establecerse
igualmente para el procedimiento conforme a la invención.
Preferiblemente se asocia por consiguiente el procedimiento conforme
a la invención además con una determinación del contenido de
vitamina E en el correspondiente líquido corporal u orgánico, cuyo
contenido de vitamina E se compara entonces dado el caso también
con un valor de referencia.
Procedimientos para la determinación de vitamina
E en líquidos corporales u orgánicos se han descrito en múltiples
ocasiones. Como en la determinación del contenido de afamina en el
marco de la presente invención, la forma y modo en que se determine
el contenido de vitamina E no es crítico en la presente invención,
no obstante son la HPLC u otros métodos bioquímicos los métodos
preferidos para la determinación de concentraciones de vitamina
E.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de un kit, que comprende
- \bullet
- una muestra de un líquido corporal u orgánico de un mamífero o un recipiente para recoger el líquido corporal u orgánico,
- \bullet
- un reactivo para la detección del contenido de afamina en la muestra, y
- \bullet
- agente de referencia de afamina,
para la determinación de la
fertilidad de
mamíferos.
Como se ha mencionado anteriormente, la elección
del reactivo para la detección del contenido de afamina depende
naturalmente del método de detección correspondiente. A modo de
ejemplo el reactivo para la detección del contenido de afamina
comprende preferiblemente un anticuerpo contra la afamina, en
especial un anticuerpo de afamina monoclonal. Preferiblemente este
anticuerpo de afamina presenta también otro agente de
identificación, como por ejemplo grupos fluorescentes, radiactivos
o cromógenos, o puede unirse mediante otro agente de detección
(p.ej. mediante anticuerpo secundario).
El agente de referencia de afamina comprende
preferiblemente una cantidad estandarizada de afamina, por ejemplo
una muestra de referencia del correspondiente líquido corporal u
orgánico. Por otra parte, no obstante, el agente de referencia de
afamina puede estar constituido también por un valor de
comparación, curva de comparación o tabla de comparación sencillos
que preferiblemente esté estandarizado para el correspondiente
líquido corporal u orgánico y el correspondiente método de
identificación.
Es especialmente preferido un kit conforme a la
invención que presente una serie completa de muestras de afamina
estandarizadas que, p.ej., definan una recta de calibración o sean
representativas de determinadas características de
fertilización.
Si hay que determinar también el contenido de
vitamina E del correspondiente líquido corporal u orgánico,
naturalmente son precisos también los reactivos y agentes de
referencia precisos para esta medición (los últimos son en la
previsión de muestras de referencia naturalmente idénticos).
Conforme a otro aspecto, la presente invención se
refiere a una determinación de fertilidad mediante la determinación
del contenido de vitamina E de semen y líquido folicular y la
correlación de este contenido con un correspondiente valor de
referencia, así como a un correspondiente kit para la realización
de este procedimiento.
El procedimiento conforme a la invención o el kit
conforme a la invención se utilizan preferiblemente para el control
de pacientes en el marco de procedimientos de fertilización, en
especial en fertilización in vitro e inyección
intracitoplasmática de espermatozoides. A este respecto, en ensayos
con personas es preciso controlar rutinariamente muy precisamente la
presencia o ausencia de oocitos así como su calidad para una
fecundación con éxito o la funcionalidad de los espermatozoides con
un ensayo sencillo.
Otro uso preferido del ensayo conforme a la
invención o del kit conforme a la invención radica en la
determinación del grado de maduración de oocitos o
espermatozoides.
Además, el procedimiento conforme a la invención
o el kit conforme a la invención puede utilizarse para la
investigación de trastornos de fertilidad y reproducción y es en
especial muy bien adecuado para ensayos en serie amplios y para el
examen sistemático de grupos numerosos de personas.
Otra especial posibilidad de aplicación del
procedimiento conforme a la invención o del kit conforme a la
invención radica en el control de embarazos, comenzando con la
comprobación de la existencia de un embarazo (como test de
embarazo) y siguiendo con el control del embarazo, en especial del
riesgo de perjuicios por substancias oxidativas o radicales,
causado por un contenido reducido de afamina o vitamina E.
La presente invención se ilustra con más detalle
con ayuda de los siguientes ejemplos y las figuras. Estas
muestran:
Fig. 1: la correlación de afamina en líquido
folicular de personas con o sin óvulo;
Fig. 2: la correlación de concentración de
afamina y tamaño de folículo;
Fig. 3: la correlación de afamina y
\alpha-tocoferol en líquido folicular;
Fig. 4: la correlación de afamina y grado de
maduración de oocitos en líquido folicular y suero subdivididos en
oocitos grandes, medios y pequeños;
Fig. 5: SDS-PAGE con
inmunotransferencia de 9 muestras de líquido folicular;
Fig. 6: SDS-PAGE con
inmunotransferencia de 3 muestras de líquido cefalorraquídeo.
A pacientes que se habían sometido a una
inducción a la ovulación para fertilización in vitro (ivf) o
a inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) se les
puncionaron folículos de distintos tamaños mediante medios
ultrasonográficos. En las muestras individuales del líquido
folicular se analizó la presencia o ausencia de oocitos, se
centrifugaron y se almacenaron para posteriores estudios. Se
extrajeron muestras de sangre de estos pacientes el día de la
punción folicular y se reunieron para el procesamiento del suero.
Se midió cuantitativamente la concentración de afamina en el líquido
folicular y en el suero mediante ELISA de sándwich (utilizando
anticuerpos monoclonales). La determinación de vitamina E en estas
muestras se efectuó por precipitación de proteínas y HPLC de fase
inversa. El análisis cualitativo de afamina en el líquido folicular
y suero se efectuó mediante SDS-PAGE e
inmunotransferencia.
Primeramente se tomaron respectivamente 27
muestras de pacientes con y sin óvulo y se determinó el contenido
de afamina. Resultó que las muestras de pacientes con óvulo
presentaban una concentración media de afamina de 38,9 \mug/ml,
las muestras de pacientes sin óvulo sin embargo solamente 30,5
(fig. 1). Resultó también que la concentración de afamina en
pacientes con óvulo se encontraba solamente un 30% más alta que el
"valor normal" (= sin óvulo).
A continuación de esto se examinó si el tamaño
del folículo se correlacionaba con la concentración de afamina. A
este respecto los folículos se clasificaron en 3 distintos tipos de
tamaño y se representaron gráficamente en la fig. 2 frente a la
concentración de afamina determinada. Se muestra que también aquí
resalta una inequívoca correlación, de modo que la concentración de
afamina representa una medida directa del grado de maduración de un
óvulo.
De la fig. 3 resulta que también existe una
correlación inequívoca entre la concentración de vitamina E y la
concentración de afamina en el líquido folicular, es decir, cuanto
más elevada es la concentración de afamina tanto más elevada se
encuentra la concentración de vitamina E.
En otra serie de ensayos se analizó si se daba la
correlación mostrada entre presencia/ausencia de óvulos o los
distintos grados de maduración de los oocitos para el líquido
folicular también p.ej. en suero.
Como puede verse en la fig. 4, también pueden
determinarse en suero los distintos grados de maduración de los
óvulos mediante el contenido de afamina.
En la fig. 5 está representada una serie de 9
muestras distintas mediante SDS-PAGE e
inmunotransferencia con un anticuerpo de afamina monoclonal. A este
respecto la determinación de afamina puede efectuarse a través del
patrón (totalmente a la izquierda en la fig.5).
Finalmente, se ha analizado también si el sistema
conforme a la invención puede aplicarse también en líquido
cefalorraquídeo (fig. 6). Como resulta de esta fig. 6, también aquí
puede llegarse a dictámenes inequívocos sobre las propiedades de
fertilidad sobre la base de la varianza en los contenidos de
afamina.
Claims (14)
1. Procedimiento para la determinación de la
fertilidad de mamíferos, en especial de seres humanos,
caracterizado porque
- \bullet
- se determina el contenido de afamina de un líquido corporal u orgánico tomado de un mamífero y
- \bullet
- el contenido de afamina determinado se compara con un valor de referencia.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque el líquido corporal u orgánico es
suero, líquido folicular o semen.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 ó
2, caracterizado porque el valor de referencia es el
contenido de afamina en el líquido corporal u orgánico
correspondiente de un paciente normal.
4. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el valor de
referencia se determina paralelamente a la determinación de la
fertilidad.
5. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el contenido de
afamina se determina mediante métodos inmunológicos, en especial
utilizando un anticuerpo mono-
clonal.
clonal.
6. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque adicionalmente
se determina el contenido de vitamina E en el líquido corporal u
orgánico y dado el caso se compara con un valor de referencia.
7. Uso de un kit, que comprende
- \bullet
- una muestra de un líquido corporal u orgánico de un mamífero o un recipiente para recoger el líquido corporal u orgánico,
- \bullet
- un reactivo para la detección del contenido de afamina en la muestra,
- \bullet
- un agente de referencia de afamina,
para la determinación de la
fertilidad de
mamíferos.
8. Uso conforme a la reivindicación 7,
caracterizado porque el reactivo para la detección del
contenido de afamina contiene un anticuerpo, en especial un
anticuerpo monoclonal.
9. Uso conforme a la reivindicación 7 u 8,
caracterizado porque el agente de referencia de afamina es
una cantidad estandarizada de afamina.
10. Uso conforme a una de las reivindicaciones 7
a 9, caracterizado porque el estándar de afamina es una
serie de muestras de afamina estandarizadas.
11. Uso de un procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 6, o de un kit como el definido en una de las
reivindicaciones 7 a 10, para el control de pacientes en el marco
de procedimientos de fertilización, en especial en fertilización
in vitro e inyección intracitoplasmática de
espermatozoides.
12. Uso de un procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 6, o de un kit como el definido en una de las
reivindicaciones 7 a 10, para la determinación del grado de
maduración de oocitos o espermatozoides.
13. Uso de un procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 6, o de un kit como el definido en una de las
reivindicaciones 7 a 10, para la investigación de trastornos de
fertilidad y reproducción.
14. Uso de un procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 6, o de un kit como el definido en una de las
reivindicaciones 7 a 10, para el control de embarazos.
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