ES2225904T3 - Preparacion de banco multicombinatorio de vectores de expresion de genes de anticuerpos. - Google Patents

Abstract

PARTIENDO DE UN PRIMER REPERTORIO DE GENES CODIFICADORES DE UNA POBLACION DE UNO DE DOS TIPOS DE POLIPEPTIDOS CAPACES DE ASOCIARSE DE FORMA COVALENTE O NO, EN PARTICULAR DE REGIONES VARIABLES DE UNO DE LOS TIPOS DE ANTICUERPOS DE CADENA LIGERA O CADENA PESADA, Y DE AL MENOS UN GEN CODIFICADOR DEL OTRO TIPO DE POLIPEPTIDO, EN PARTICULAR DE UNA REGION VARIABLE DEL OTRO TIPO DE CADENA DE ANTICUERPOS, O, PREFERENTEMENTE, DE UN SEGUNDO REPERTORIO DE GENES CODIFICADORES DE UNA POBLACION DE ESE OTRO TIPO, SE INTRODUCEN LOS GENES DEL PRIMER REPERTORIO EN UN PRIMER VECTOR PARA FORMAR UNA POBLACION DE VECTORES PORTADORES DE LOS DISTINTOS GENES DE ESE PRIMER REPERTORIO, Y SE INTRODUCE EL GEN DEL OTRO TIPO O LOS GENES DEL SEGUNDO REPERTORIO EN UN SEGUNDO VECTOR. LOS DOS VECTORES DE PARTIDA ESTAN DOTADOS DE MEDIOS PARA INTERCAMBIAR POR RECOMBINACION/ONES IRREVERSIBLE/S CADA UNO UNA PARTE, DE TAL MODO QUE SE GENERAN, TRAS RECOMBINACION/ONES, VECTORES FINALES RECOMBINADOS CADA UNO DE LOS CUALES CONTIENE UN GEN DE UNO DE LOS DOS TIPOS Y UN GEN DEL OTRO TIPO.

Description

Preparación de banco multicombinatorio de vectores de expresión de genes de anticuerpos.

Las moléculas de anticuerpos están constituidas por la asociación de dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) por medio de puentes disulfuro. Las dos cadenas pesadas se asocian entre sí según una estructura en forma de Y y las dos cadenas ligeras se asocian respectivamente a las dos ramas de esta estructura, de tal forma que los dominios variables de las cadenas ligeras (V_{L}) y pesadas (V_{H}) se sitúen próximos entre sí. La unión al antígeno resulta de las propiedades de las partes variables de las cadenas ligeras y pesadas. Un sistema complejo de reorganización y de selección permite entonces inducir rápidamente una cantidad importante de anticuerpos específicos contra un antígeno.

La técnica clásica de los hibridomas permite la selección de clones de células híbridas que expresan genes codificantes de las cadenas ligera y pesada de una molécula de anticuerpo. Esta técnica necesita la fusión de células de origen linfocitario, que contienen los genes que presiden la formación de los anticuerpos, y de células que forman líneas inmortalizadas. Las células portadoras de los genes en cuestión son, en general, obtenidas por creación al azar de bancos de células circulantes, con o sin inmunización previa por el antígeno específico, y el cribado de los hibridomas es efectuado por una reacción de antígeno-anticuerpo tras multiplicaciones y cultivos de los clones de hibridomas. Esta técnica es pesada y de un rendimiento limitado y el cribado no resulta fácil.

Recientemente, se ha utilizado otro método, que utiliza bacteriófagos recombinantes. Los principios y las diversas realizaciones de este procedimiento están, por ejemplo, descritos por D.R. Burton, Tiptech - Mayo de 1991, Vol. 9, 169-175; D.J. Chiswell y col., Tiptech - Marzo de 1992, Vol. 10, 80-84; H.R. Hoogenboom y col., Rev. Fr. Transfus. Hémobiol., 1993, 36, 19-47 (véanse también las solicitudes de patente PCT WO 92/01047 y 92/20791).

Esta técnica consiste en insertar, en un vector, un repertorio de genes de regiones variables de anticuerpos en asociación con un gen de bacteriófago en condiciones que permitan la expresión del gen en forma de una proteína de fusión que se presenta en la superficie del fago, exponiendo las regiones variables de las cadenas variables ligera y pesada asociadas por sus puentes disulfuro en forma de un fragmento Fab de anticuerpo, y en seleccionar directamente los fagos por un método rápido de separación que utiliza el antígeno específico inmovilizado, por ejemplo por cromatografía de inmunoafinidad. Los fagos seleccionados, después de la elución, pueden infectar una bacteria y ser utilizados para una producción directa o pera repetir ciclos de selección. Este método es particularmente potente, ya que permite la creación, en teoría, de bancos muy importantes y un cribado extremadamente fino, eficaz y rápido del banco. Un fago que se presta particularmente bien a este procedimiento es el fago filamentoso fd, en el cual se puede fusionar el fragmento codificante de una de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo con el gen de la proteína menor de superficie e insertar el fragmento codificante de la otra cadena, de tal forma que, después de la infección de bacterias por el fago, se obtiene una población de fagos portadores en su superficie de una proteína de fusión que presenta las cadenas pesada y ligera en una configuración capaz de reconocer el antígeno y, por lo tanto, apropiada para el cribado.

Además de su simplicidad, esta técnica presenta grandes ventajas. En asociación con la amplificación previa del banco de genes de anticuerpo, se puede llegar a seleccionar un fago que presente un fragmento de anticuerpo específico en una población muy grande de fagos, del orden de 10^{7}, lo que puede permitir buscar los genes de anticuerpos humanos sin tener que proceder forzosamente a la inmunización previa del donante.

Por cribado, seguido de religación, o a partir de dos bancos separados de genes de cadenas ligeras y de cadenas pesadas, se pueden obtener fagos que asocian una cadena ligera y una cadena pesada al azar.

El número de clones diferentes que se pueden obtener está, sin embargo, limitado por el rendimiento de la selección y por el grado de eficacia de la transformación bacteriana.

Se ha descrito un medio para aumentar el número de asociaciones conseguidas asociando las cadenas ligeras de un primer banco con las cadenas pesadas de un segundo banco por P. WATERHOUSE y col., Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, Nº 9, 2265-2266. Permite obtener hasta 10^{12} clones utilizando un sistema de recombinación específica de sitios loxP sensible a la acción de una recombinasa Cre. Sin embargo, la asociación sigue siendo reversible. Además, no existe ningún control de la acción de la recombinasa y los vectores recombinantes no tienen ninguna ventaja selectiva con respecto a los otros vectores.

Ahora bien, teniendo en cuenta el rendimiento de la etapa de selección de los fagos recombinantes, que, en realidad, no conserva más que una fracción de los fagos de interés, es deseable obtener los rendimientos más altos posibles de vectores recombinantes con lo menos posible de vectores no recombinantes.

En el marco de una solicitud anterior (WO 95/21914, depositada el 2 de Febrero de 1995 bajo la prioridad francesa FR 94 01519 del 10 de Febrero de 1994), los autores de la presente invención han descrito un procedimiento de producción de bancos multicombinatorios, y especialmente en forma de fagos o de fagémidos, a partir de dos repertorios de genes, uno de cadenas ligeras y otro de cadenas pesadas, que permite obtener un número elevado de clones.

Este sistema posee propiedades de no reversibilidad y de selectividad mejoradas por el hecho de que aparece un nuevo marcador de selección tras la recombinación.

Las propiedades de no reversibilidad se deben a la ausencia de medios de excisión, tanto en los vectores como en la cepa huésped. Los ejemplos que ilustran esta solicitud se caracterizan así por la ausencia de la proteína de excisión Xis, tanto en los vectores como en la cepa Xis^{-}. Por otra parte, el carácter estable de las secuencias de unión obtenidas de la recombinación de los sitios de recombinación específicos contribuye a la no reversibilidad del sistema.

La presente invención se dirige al perfeccionamiento de este procedimiento, especialmente al aumento de su rendimiento y de su facilidad de utilización, así como de la diversidad de clones generados.

Con este objetivo, la presente invención permite realizar, después de dos sucesos recombinatorios, un intercambio de secuencias entre los dos vectores. Este intercambio da lugar a dos vectores recombinantes, uno de los cuales posee las dos unidades de transcripción para las cadenas pesada y ligera, pero cuyo tamaño es inferior al de un vector que resultaría de una fusión entre los dos vectores de partida. Siendo más pequeño el vector final, su replicación y su empaquetamiento son más eficaces y su producción resulta, por tanto, mejorada, lo que aumenta igualmente el número de clones finales.

La invención permite además ampliar considerablemente la elección de cepas utilizables como células huésped, en la medida en que ya no sea necesario que la cepa utilizada posea en su genoma el gen de la integrasa, siendo este gen portado ahora por uno de los dos vectores de partida y encontrándose de nuevo en el vector final.

Esto permite eliminar las cepas que posean el gen de la integrasa integrado en su genoma y seleccionar cualquier cepa que sea altamente infecciosa y productora de fagos (TG1, 71-18 o NM522).

Las cepas 71-18 (Stratagène; Yanisch-Perron, C. y col (1985), Gene 33, 103-109) y NM522 (New England Biolabs; Woodcock, D.L. y col. (1989), Nucl. Acids. Res. 17, 1563-1575) se han revelado como particularmente buenas productoras de fagos. Permiten una multiplicación del número de fagos producidos por un factor de 10 a 50 con respecto especialmente a la cepa E. coli D1210HP difundida por Stratagène.

La invención tiene por objeto un procedimiento de producción de bancos multicombinatorios en donde, partiendo de un primer repertorio de genes codificantes de una población de uno de dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, de forma covalente o no, especialmente de regiones variables de uno de los tipos de cadena ligera y de cadena pesada de anticuerpo, y de al menos un gen codificante del otro tipo de polipéptido, especialmente una región variable del otro tipo de cadena de anticuerpo o preferiblemente de un segundo repertorio de genes codificantes de una población de dicho otro tipo, se introducen los genes de dicho primer repertorio en un primer vector para formar una población de vectores portadores de los diferentes genes de dicho primer repertorio, y se introduce dicho gen de dicho otro tipo o los genes de dicho segundo repertorio en un segundo vector y se procede a una recombinación de dichos primer y segundo vectores en condiciones que permitan a uno de los vectores contener, tras la recombinación, un gen de uno de los dos tipos y un gen del otro tipo y expresar los dos genes en forma de polipéptidos asociados susceptibles de aparecer en la superficie exterior del producto de dicho vector, permaneciendo en ella y estando asociados entre sí de forma multimérica o simulando un multímero, caracterizado por el hecho de que dichos primeros y segundos vectores presentan medios para intercambiar, por recombinación(es) irreversible(s), cada uno una parte, de forma que se generen, tras la(s) recombinación(es), vectores finales recombinantes, uno de los cuales contiene un gen de uno de los dos tipos y un gen del otro tipo.

Ventajosamente, el procedimiento según la invención se caracteriza por el hecho de que los vectores de partida contienen, respectivamente, dos sitios de recombinaciones específicas de uno o de dos sistemas de recombinación específica, especialmente los sitios attB de E. coli y attP del fago lambda, que están dispuestos para permitir dos sucesos recombinatorios bajo el efecto de una recombinasa o integrasa asociada para formar en cada uno de los vectores finales resultantes de la recombinación dos secuencias de uniones estables, tales como attL y attR.

Preferiblemente, los dos sitios de recombinación comprendidos en cada uno de los vectores de partida están en orientación inversa.

En una variante ventajosa, los vectores de partida contienen, respectivamente, dos sitios attP del fago lambda y dos sitios attB de E. coli.

Preferiblemente, uno de los dos vectores de partida incluye además una secuencia codificante de una recombinasa o de una integrasa. Esta variante ventajosa permite poder utilizar cualquier cepa que sea altamente infecciosa y productora de fago, por ejemplo, TG1, 71-18 ó NM522, sin tener que limitarse a las únicas cepas que poseen en su genoma el gen de una u otra de estas enzimas. Las cepas NM522 y 71-18 se revelan como particularmente interesantes en este contexto de utilizaciones. Preferiblemente, la enzima que se utiliza para controlar la etapa de recombinación entre los vectores de partida es una recombinasa inducible, y especialmente una recombinasa termoinducible.

Ventajosamente, en el procedimiento de la invención, el vector final recombinante obtenido a partir de los vectores de partida que contiene los genes que se han de expresar está dispuesto para presentar un marcador de selección inicialmente no funcional y que se hace funcional por la recombinación. Este marcador es, por ejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico, especialmente un gen del grupo formado por los genes de resistencia a las tetraciclinas, a la gentamicina, a la kanamicina y al cloranfenicol, con su promotor.

Preferiblemente, este marcador de selección lleva un promotor apropiado para el gen, siendo el promotor inicialmente insertado en uno de los vectores de partida y el gen marcador en el otro. El gen de selección y su promotor pueden estar separados, por ejemplo, por una secuencia antifinalizadora, especialmente la secuencia NutL. Los vectores de partida contienen también al menos un origen de replicación de fago o un origen de replicación de plásmido, estando dichos orígenes dispuestos de manera que los vectores finales recombinantes no contengan cada uno más que un origen de replicación de fago y/o de plásmido.

En el procedimiento según la invención, uno de los dos genes que se han de expresar está fusionado a una secuencia codificante para todo o parte de un polipéptido de la cápside de un fago. Esta secuencia corresponde, por ejemplo, al gen codificante de la proteína III del fago lambda. Ventajosamente, dicho gen que ha de ser expresado y la secuencia a la que se fusiona están situados en uno de los vectores de partida, de forma que estén presentes en el producto fagémido recombinante que contiene los dos genes que han de ser expresados.

La invención tiene igualmente por objeto los vectores obtenidos o susceptibles de ser obtenidos por el procedimiento antes descrito, especialmente los vectores de tipo plásmido o fagémido, que se caracterizan por la presencia de una secuencia codificante para uno de los dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, especialmente una parte variable de cadena ligera de anticuerpo, y una secuencia codificante para el otro de dichos dos tipos, especialmente una parte variable de cadena pesada de anticuerpo, estando dichas secuencias acompañadas, en los marcos convenientes, por los elementos que permiten su expresión en un huésped y estando dichas secuencias separadas por secuencias de unión estable, especialmente attR y attL.

Estos vectores, especialmente de tipo plásmido, llevan preferiblemente una secuencia funcional codificante de una recombinasa o de una integrasa y, de forma particularmente ventajosa, incluyen igualmente secuencias de unión estable separadas por un espaciador.

La invención tiene también por objeto bancos multicombinatorios de vectores, formados por los vectores según la invención y que asocian, de forma aleatoria, una secuencia codificante de uno de dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, especialmente una parte variable de cadena ligera de anticuerpo, y una secuencia codificante del otro de dichos dos tipos, especialmente una parte variable de cadena pesada de anticuerpo.

La invención tiene finalmente por objeto los anticuerpos o las partes de anticuerpos de tipo Fab susceptibles de ser obtenidos tras la selección de los bancos de vectores según la invención con ayuda de los marcadores de selección, cribado después destinado a seleccionar los clones que expresan asociaciones de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos que tienen las afinidades buscadas contra los antígenos determinados, expresión luego de los clones cribados en un sistema de expresión y finalmente extracción y/o purificación de los anticuerpos o de las partes de anticuerpos de tipo Fab producidos en el sistema de expresión. Las técnicas de selección y de cribado están, por ejemplo, descritas en Parmley, S.F. y col., Gene 73 (1988), 305-318. Las técnicas de extracción y de purificación están, por ejemplo, descritas en Neu, H.C. y col. (1965), J. Biol. Chem. 240, 3685-3692.

Se describe ahora un ejemplo de construcción de un vector recombinante según la invención combinando las partes variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de un mismo clon anti-gp160 de HIV, vector que demuestra ser capaz de expresar los genes de dichas partes variables ligeras y pesadas y de presentar sus productos de expresión en su superficie o, como variante, de ampliarlos en forma de una asociación cadena pesada-cadena ligera que reconoce el antígeno gp160.

Se podrá utilizar la misma técnica para realizar las construcciones multicombinatorias asociando los genes de un repertorio de partes variables de cadena ligera a un gen de parte variable de cadena pesada, o un repertorio de partes variables de cadena pesada a un gen de parte variable de cadena ligera, o dos repertorios de partes variables pesadas y ligeras.

Figuras

La figura 1 representa una vista esquemática del plásmido pM858, que posee una unidad de transcripción para las regiones variables de cadenas ligeras en fusión con el gen III.

La figura 2 representa una vista esquemática del fagémido pM867, que posee una unidad de transcripción para las regiones variables de cadenas pesadas.

La figura 3 representa una vista esquemática de los vectores recombinantes obtenidos tras intercambio de secuencia entre el plásmido pM858 y el fagémido pM867.

La figura 3A representa el fagémido multicombinatorio de 7,2 kb, que posee las dos unidades de transcripción para las cadenas pesada y ligera.

La figura 3B representa el plásmido recombinante de 6,5 kb, que posee el gen de la integrasa.

Descripción de los vectores

Para el detalle de las técnicas de biología molecular utilizadas en la construcción de los vectores, se remitirá a la solicitud WO 95/21914, aquí incorporada como referencia.

Plásmido pM858 (7,2 kb): Plásmido que posee el origen de replicación de "alto número de copias" Co1E1, una unidad de transcripción para las regiones variables de cadenas ligeras en fusión con el gen III (Promotor lacZ-secuencia señal PelB-VH del gen III), el gen N seguido del gen codificante del marcador de selección para la gentamicina, el marcador de selección para la ampicilina y dos secuencias de recombinación attP en orientación inversa separadas por un espaciador que debe ser de al menos 2 kb.

Fagémido pM867 (6,5 kb): Vector que posee el origen de replicación de "bajo número de copias" p15A y la integrasa del fago lambda, así como el represor termosensible cI857, el marcador de selección para la kanamicina y dos secuencias de recombinación attB en orientación inversa separadas por las secuencias siguientes: una unidad de transcripción para las regiones variables de cadenas pesadas (LacZ-pelB-VH), el origen de replicación del fago F1 y el promotor del triptófano Trp seguido del antifinalizador NutL en la misma orientación.

Tras la recombinación (2 sucesos recombinatorios), hay intercambio de las secuencias que separan las secuencias de recombinación entre el plásmido y el fagémido de partida. Se obtiene un fagémido recombinante con dos secuencias attR en orientación inversa y separadas por los elementos del plásmido de partida, es decir, la unidad de transcripción de las regiones variables de cadenas pesadas, el origen F1 y el promotor Trp seguido de NutL. En el fagémido recombinante que posee las dos unidades de transcripción para las cadenas pesada y ligera, también se crea una unidad de transcripción para un nuevo marcador de selección, aquí la gentamicina (promotor Trp-NuTL-N-gentamicina).

Las otras propiedades de este sistema (no-reversibilidad, nuevo marcador de selección tras la recombinación) son idénticas a las del sistema anterior descrito en WO 95/21914.

I - Descripción de las diferentes etapas de construcción de los dos vectores de partida

I. Creación de un plásmido que posee un origen de replicación ColE1, un gen de resistencia a la ampicilina, un gen de resistencia a la gentamicina (sin su promotor), el gen de la proteína N, el cassette de clonación de las cadenas ligeras y dos secuencias de recombinación attP que flanquean un espaciador de aproximadamente 2 kb.

Este vector servirá de punto de partida para insertar el banco de cadenas ligeras (regiones variables).

1. Inserción de la 1ª secuencia de recombinación attP (271 pb) tras amplificación por PCR sobre el fago \lambda (bases 27571 a 27820) entre los sitios EcoRI y KpnI del plásmido pUC18 (2686 pb) (orientación controlada).

Se obtiene el plásmido pM 852 (2957 pb).

1

2. Inserción del gen de resistencia a la gentamicina (gen aacC1) copulado a la segunda secuencia de recombinación attP.

- Se amplifica la secuencia attP por PCR a partir del fago \lambda desde la base 27571 hasta la 27820 con los cebadores siguientes:

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2

- Se amplifica el gen aacC1 de 732 pb a partir del plásmido pSS11 9 (ref.: STIBITZ, S., Methods in Enzymology, Vol. 235, 458-465, 1994).

3

- Una segunda amplificación por PCR permite reunir las dos secuencias anteriores gracias a los cebadores siguientes:

4

El fragmento que lleva el gen aacC1 y la secuencia attP, digerido por XbaI, es clonado en el vector pM852 a nivel de los sitios SmaI y XbaI con destrucción del sitio SmaI (orientación controlada).

Se obtiene el plásmido pM854 (3960 pb).

3. Deleción de una parte de la secuencia flanqueante del gen de la \beta-galactosidasa en el plásmido pM854 por digestión con HindIII y SspI y tratamiento después de los extremos del vector con Klenow y ligación del plásmido sobre sí mismo con destrucción de los dos sitios de restricción.

Se obtiene el plásmido pM855 (3378 pb).

4. Se destruye el sitio de restricción XbaI mediante digestión del vector pM855 por Xba1 y tratamiento de sus extremos con Klenow.

Se obtiene el plásmido pM856 (3382 pb).

5. Inserción de un cassette de expresión de la cadena ligera (promotor lac, secuencia señal PelB y la cadena ligera (642 pb) de un clon anti-gp 160 de HIV fusionada al gen III), copulado al sistema que aporta una nueva resistencia al fagémido recombinante (gen de la proteína N y gen aacC1 desprovisto de su promotor).

Se obtiene el fragmento completo (2609 pb) a partir del plásmido pM845 (descrito a continuación) por digestión completa mediante SphI y digestión parcial mediante Asp718. El fragmento es clonado, tras tratamiento de sus extremos con Klenow, en el plásmido pM856 copulado por SphI y tratado, también él, con Klenow, con destrucción del sitio phI.

Se obtiene el plásmido pM857 (5991 pb).

6. Se suprime el plásmido pM857 del gen aacC1 por escisión con KpnI-BamHI (768 pb) y se tratan luego sus extremos con Klenow. Se insertará un espaciador de aproximadamente 2 kb entre estos dos sitios. La secuencia de este espaciador está aún por determinar.

Se obtiene el plásmido pM858 (aproximadamente 7200 pb).

II. Creación de un vector de tipo fagémido portador de dos orígenes de replicación P15A y f1, un gen de resistencia a la kanamicina y dos secuencias recombinantes attB que flanquean el cassette de clonación de las cadenas pesadas, así como del promotor del triptófano y de la secuencia nutL.

Este vector servirá de punto de partida para insertar un banco de cadenas pesadas (regiones variables).

El plásmido de base para la construcción es el plásmido pM825 (descrito en la solicitud WO 95/21914).

1. Inserción de una segunda secuencia de recombinación attB de 23 pb en forma de nucleótidos sintéticos en el sitio SphI. Se obtuvieron las dos orientaciones posibles de clonación. La orientación que nos interesa es la de las dos attB en sentidos opuestos.

Se obtiene el plásmido pM851 (3079 pb).

Cebador AttB Sph^{+}: 5' CCTGCTTTTTTATACTAACTTGCATG 3'

Cebador AttB Sph^{-}: 3' GTACGGACGAAAAAATATGATTGAAC 5'

2. Se amplifica un fragmento de 2118 pb (que cubre las bases 997 a 3079 + 0 a 36) del pM851 por PCR. Comprende las dos secuencias de recombinación attB, el gen de resistencia a la kanamicina y el origen de replicación P15A con creación de un sitio AscI en cada extremo y eliminación de los sitios EcoRI y SphI existentes.

Se obtiene el plásmido pM861 (2126 pb).

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3. Mutagénesis del sitio de restricción XhoI situado en posición 925 con el kit de Clontech.

Se obtiene el plásmido pM862 (2126 pb).

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4. Inserción de un sitio múltiple de clonación "polylinker" sintético de 36 pb que contiene los sitios XbaI, NcoI, SphI y EcoRI a nivel del sitio AscI único del vector pM862 (orientación controlada).

Se obtiene el plásmido pM863 (2162 pb).

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5. Inserción en el vector pM863 de un fragmento de 1122 pb que contiene la secuencia nutL, la secuencia del promotor del triptófano y el origen de replicación f1. Este fragmento es extraído del vector pM847 (descrito a continuación) por digestión con NheI y BspHI y después clonado en el vector pM863 a nivel de los sitios XbaI y NcoI (orientación controlada).

Se obtiene el fagémido pM864 (3284 pb).

6. Inserción en el vector pM864 de un fragmento de 1080 pb correspondiente al cassette de expresión de las cadenas pesadas (promotor lac, secuencia señal PelB y la cadena pesada (684 pb) de un clon anti-gp160 de HIV).

Se extrae este fragmento del vector pM847 por digestión con SphI + EcoRI y se clona después en el vector pM864 a nivel de los sitios SphI y EcoRI (orientación controlada).

Se obtiene el fagémido pM865 (4363 pb).

7. Inserción del gen de la integrasa de \lambda y de su promotor amplificado por PCR (1280 pb) a parir del plásmido pCW107 (Wülfing y Plückthun, Gene 136, 199-203: 1993). Este fragmento será insertado a nivel de los sitios NheI y StuI del fagémido pM865 (orientación controlada).

Se obtiene el fagémido pM866 (aproximadamente 5643 pb).

8. Inserción de la secuencia cI857 bajo la dependencia del promotor pR de \lambda, amplificado por PCR (820 pb) a partir del plásmido pCW107. Esta secuencia es necesaria para permitir la expresión de la integrasa tras un choque térmico a 42ºC. Este fragmento será insertado a nivel de los sitios AvaII y BspHI del fagémido pM866.

Se obtiene el fagémido pM867 (aproximadamente 6463 pb).

Las dos últimas etapas 7 y 8 son susceptibles de modificación.

La construcción de estos dos vectores permite utilizar no importa qué cepa bacteriana para la recombinación (tipo XL1 Blue).

II. Descripción de los plásmidos pM845 y pM847 utilizados para la construcción de los vectores de partida

I. Construcción del plásmido pM845, que posee un origen de replicación ColE1, un gen de resistencia a la kanamicina, una secuencia de recombinación attB y un cassette que permite la clonación y la expresión de las cadenas ligeras fusionadas al producto del gen III.

1. Clonación del gen aacC1 (Gm^{R}) en el plásmido pM826.

- Amplificación por PCR del gen aacC1 (575 pb) desprovisto de su promotor a partir del pSS1129 (Stibitz, S., Methods in Enzymology, Vol. 235, 458-465, 1994) e inserción a nivel del sitio único AscI del pM826 descrito en la solicitud WO 95/21914.

Se obtiene el plásmido pM840 (3611 pb).

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2. Cambio del origen de replicación P15A del plásmido pM840 por el origen de alto número de copias ColE1.

- Amplificación por PCR de ColE1 (953 pb) a partir del vector pM840 desprovisto del origen P15A (2750 pb).

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- Montaje de los dos fragmentos de PCR gracias a los sitios MluI y BamHI de nueva creación.

Se obtiene el plásmido pM842 (3692 pb).

3. Clonación del gen III en 3' de la cadena ligera en el plásmido pM842.

- Amplificación por PCR del gen III (658 pb) a partir del fagémido pM841 e inserción en 3' de la cadena ligera conservando el marco de lectura (con un codon Ambre entre los dos) entre los sitios XbaI y SphI.

Se obtiene el plásmido pM844 (4339 pb).

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4. Clonación de la proteína N (necesaria para el funcionamiento del antifinalizador nutL) en 3' de attB y en 5' del gen aacC1.

- Amplificación por PCR del gen de la proteína N (453 pb) a partir del fago lambda (bases 35022 a 35465) y del gen aacC1 (575 pb) a partir de pSS1129 y asociación luego de los dos fragmentos gracias a una segunda PCR con los cebadores 5' N Mlu y Genta 3'.

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- Inserción del fragmento de PCR de 1022 pb en el sitio AscI de pM844 tras deleción del gen aacC1 anteriormente clonado.

Se obtiene el plásmido pM845 (4785 pb).

II. Construcción del fagémido pM847 que posee un origen de replicación P15A, un gen de resistencia a la ampicilina, una secuencia de recombinación attP y un cassette para la clonación y la expresión de las cadenas pesadas.

1. Clonación del antifinalizador nutL en el fagémido pM834 (descrito en WO 95/21914).

- Destrucción del sitio NotI situado en 3' del promotor lac por digestión y luego rellenado con Klenow.

- Síntesis de cuatro oligonucleótidos que recubren los 120 pb de la secuencia nutL del fago lambda (bases 35467 a 35586) e inserción a nivel del sitio NotI situado en 3' de la secuencia de recombinación attP. Es válida una sola orientación para que el antifinalizador funcione tras la recombinación.

Se obtiene el fagémido pM839 (4937 pb).

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2. Cambio del origen de replicación ColE1 en el fagémido pM839 por el origen de débil número de copias P15A.

- Amplificación por PCR de P15A (833 pb) a partir del pM840 y del vector pM839 desprovisto del origen ColE1 (4007 pb).

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- Montaje de los dos fragmentos de PCR gracias a los sitios XbaI y SphI de nueva creación.

Se obtiene el fagémido pM841 (4828 pb).

3. Deleción del gen III situado en 3' de la cadena pesada, pero sin el gen III (4150 pb) y ligación tras digestión por el sitio único SpeI. Se obtiene el fagémico pM846 (4144 pb).

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4. Cambio del promotor cat por el promotor trp.

- Amplificación por PCR del promotor del triptófano bicistrónico (233 pb) a partir del vector pM800 (disponible en el laboratorio) e inserción a nivel del sitio KpnI situado en 3' de la secuencia nutL tras la deleción del promotor cat anteriormente clonado. Se obtiene el fagémido pM847 (4194 pb).

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III - Recombinación entre los dos vectores pM858 y pM867

Los dos vectores antes citados servirán de punto de partida para obtener bancos de anticuerpos multicombinatorios. En el ejemplo representado, la recombinación se efectuará entre las cadenas V_{L} y V_{H} del clon anti-gp 160 de HIV utilizado. Sin embargo, si los dos vectores son construidos a partir de bancos de genes de cadenas pesadas y/o de genes de cadenas ligeras de anticuerpos, permitirán obtener un banco multicombinatorio de anticuerpos que se podrá luego cribar.

Transformados en una cepa adecuada (D1210HP), los dos vectores podrán asociarse gracias a las secuencias AttP y AttB, blancos de un factor de recombinación int inducible. Los mecanismos de recombinación están descritos en el capítulo 9 del libro "The recombination of genetic material" (Miller, H.V., Viral and cellular control of site-specific recombination, 1988, pp. 360-384, editado por Brooks Low K., Academic Press). El vector multicombinatorio (7200 pb) así creado poseerá un origen de replicación, un gen de resistencia a la gentamicina y los dos cassettes que permiten la expresión de las cadenas V_{L} y V_{H}.

1) Se procede a la transformación por electroporación de la cepa de E. coli XL-1 Blue (difundida por Stratagène).

2) Etapas de la recombinación.

- Se procede a la transformación de esta cepa por el plásmido pM858 (que contiene las cadenas V_{L}) y, en paralelo, se transforma una cepa compatible mediante el fagémido pM867 (portador de las cadenas V_{H}).

A partir de la cepa transformada por el fagémido pM867, se prepara éste en forma de fago y se infecta luego el cultivo de XL-1 Blue que contiene el plásmido pM858 a 30ºC (densidad óptica DO = 0,6).

Después de 30 minutos de infección a 30ºC, se somete el cultivo a un choque térmico a 42ºC durante una hora para desencadenar la recombinación bajo el efecto de la recombinasa inducible.

Tras haber vuelto a poner el cultivo a 30ºC y haber añadido gentamicina, se extienden los clones sobre medio de agar que contiene gentamicina. Se añade una hora después el fago "helper" VCSM13 (Kan^{R}) de Stratagène a razón de 10^{12} pfu/100 ml de cultivo. Se añade luego, dos horas después, kanamicina a una concentración final de 70 \mug/ml y se deja el cultivo varias horas a 30ºC.

El análisis de los clones después de la recombinación de los vectores pM858 y pM867 muestra que la asociación se ha desarrollado bien. Se obtiene un fagémido recombinante de 7200 pb estable, que expresa un Fab y que es siempre capaz de infectar la cepa XL-1 Blue. Los puntos de unión AttL y AttR fueron verificados por secuenciación.

IV. Preparación de un banco multicombinatorio a partir de un banco de cadenas ligeras y de un banco de cadenas pesadas

La etapa de inserción I.4 de la región variable de la cadena ligera del clon anti-gp 160 de HIV amplificado por PCR es substituida por una inserción similar de las regiones variables de las cadenas ligeras de un banco de cadenas ligeras de anticuerpos amplificado por PCR con ayuda de un sistema de cebadores conocido conveniente apropiado para el tipo de cadena ligera buscada, o de una pluralidad de sistemas de cebadores si se desea efectuar la multicombinación a partir de poblaciones de diferentes tipos de cadenas ligeras. Los sistemas de cebadores que permiten la amplificación de las cadenas ligeras son muy conocidos y están descritos por W.D. Huse y col., Science, Vol. 246 (1989), 1275-1281.

Del mismo modo, para la clonación de las cadenas pesadas, se reemplaza la etapa de inserción II.1 de la cadena pesada de un clon anti-gp 160 de HIV por la inserción de un banco de regiones variables de cadenas pesadas amplificado por PCR con ayuda de los sistemas de cebadores convenientes descritos por M.J. Campbell y col., Molecular Immunology, Vol. 29, Nº 2 (1992), 193-203, o por W.D. Huse y col., antes citado.

Después de las etapas de recombinación, se seleccionan los clones resistentes a la gentamicina y se procede luego al cribado destinado a seleccionar los clones que expresan asociaciones de cadena ligera y de cadena pesada de anticuerpos que tienen las afinidades buscadas contra los antígenos determinados, según las técnicas descritas, por ejemplo, por S.F. Parmley y col., Gene 73 (1988), 305-318.

Los clones obtenidos de las etapas de selección y de cribado permiten entonces producir las moléculas Fab correspondientes. El fagémido utilizado contiene un codon Ambre en la unión de la cadena pesada del Fab y de la gp3. Cuando, a modo de ejemplo, se transforma una cepa de E. coli supresora de Ambre, XL1-Blue (Stratagène, La Jolla, CA, EE.UU.) con el fagémido, el Fab se expresa en la superficie del fago. A modo de ejemplo, en una cepa bacteriana no supresora, TOP10 (Stratagène, La Jolla, CA, EE.UU.), la síntesis proteica se interrumpe en el extremo de la cadena pesada. Gracias a la secuencia señal del gen codificante de la pectasa liasa "pelB" de E. cartovora, el Fab es entonces transportado al periplasma. Se extrae luego por choque osmótico (Neu, H.C. y col. (1965), J. Biol. Chem. 240, 3685-3692). En función de la naturaleza del Fab, se pueden emplear diferentes técnicas cromáticas conocidas para purificarlo: intercambio de iones, afinidad, cribas moleculares, etc.

Claims (14)

1. Procedimiento de producción de bancos multicombinatorios en donde, partiendo de un primer repertorio de genes codificantes para una población de uno de dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, de forma covalente o no, especialmente de regiones variables de uno de los tipos de cadena ligera y de cadena pesada de anticuerpo, y de al menos un gen codificante para el otro tipo de polipéptido, especialmente una región variable del otro tipo de cadena de anticuerpo, o, preferiblemente, de un segundo repertorio de genes codificantes para una población de dicho otro tipo:

- se introducen los genes de dicho primer repertorio en un primer vector de partida para formar una población de vectores finales portadores de los diferentes genes de dicho primer repertorio;

- se introduce dicho gen de dicho otro tipo o los genes de dicho segundo repertorio en un segundo vector de partida,

conteniendo dichos vectores de partida, respectivamente, dos sitios attP del fago lambda y dos sitios attB de E. coli en orientación inversa, para permitir dos sucesos recombinatorios bajo el efecto de una recombinasa o integrasa asociada para formar en cada uno de los vectores finales resultantes de la recombinación dos secuencias estables attL y attR, y

- se procede a dos sucesos recombinatorios irreversibles,

de forma que se generen, tras la recombinaciones, dos vectores finales recombinantes, uno de los cuales contiene un gen de uno de los dos tipos y un gen del otro tipo, permitiendo dicho vector expresar los dos genes en la superficie de un fago en forma de polipéptidos mantenidos y asociados entre sí de forma multimérica o simulando un multímero.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde uno de los vectores de partida contiene una secuencia codificante de una recombinasa o de una integrasa.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el vector final recombinante obtenido a partir de dichos vectores de partida y que contiene los genes que se han de expresar está organizado para presentar un marcador de selección inicialmente no funcional y que se hace funcional por la recombinación.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, donde el marcador de selección lleva un gen que permite la selección, cuando se expresa, y un promotor apropiado para el gen, estando el promotor insertado en uno de los vectores de partida y el gen marcador en el otro.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el gen de selección y su promotor están separados por una secuencia antifinalizadora, especialmente la secuencia NutL.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 5, donde el marcador es el gen de resistencia a un antibiótico, especialmente un gen del grupo formado por los genes de resistencia a las tetraciclinas, a la gentamicina, a la kanamicina y al cloranfenicol, con su promotor.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, donde dichos vectores de partida contienen al menos un origen de replicación de fago o un origen de replicación de plásmido, estando organizados dichos orígenes de tal forma que los vectores finales recombinantes no contengan cada uno más que un origen de replicación de fago y/o de plásmido.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, donde uno de los genes que se han de expresar está fusionado a una secuencia codificante de todo o de parte de un polipéptido de la cápside de un fago.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde la secuencia de fusión corresponde al gen codificante de la proteína III del fago lambda.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 y 9, donde dicho gen y su secuencia fusionada están situados en uno de los vectores de partida de tal forma que estén presentes en el producto fagémido recombinante.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, donde se utiliza, para controlar la etapa de recombinación entre los vectores de partida, una recombinasa inducible, y especialmente termoinducible.

12. Vector susceptible de ser obtenido por el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, y especialmente un vector de tipo plásmido o fagémido, que contiene una secuencia codificante de uno de los dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, especialmente una parte variable de cadena ligera de anticuerpo, y una secuencia codificante del otro de dichos dos tipos, especialmente una parte variable de cadena pesada de anticuerpo, yendo acompañadas dichas secuencias, en marcos convenientes, de los elementos que permiten su expresión en un huésped, estando separadas dichas secuencias por las secuencias de unión estables attR y attL.

13. Vector según la reivindicación 12, que contiene secuencias de unión estables separadas por un espaciador.

14. Bancos multicombinatorios de vectores, formados por los vectores según una de las reivindicaciones 12 y 13 y asociando, de forma aleatoria, una secuencia codificante de uno de los dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, especialmente una parte variable de cadena ligera de anticuerpo, y una secuencia codificante del otro de dichos dos tipos, especialmente una parte variable de cadena pesada de anticuerpo.