ES2226338T3

ES2226338T3 - Vacuna que comprenden interleucina 12 y antigeno del virus del herpes simple.

Info

Publication number: ES2226338T3
Application number: ES99905946T
Authority: ES
Inventors: Eric M. Mishkin; John H. Eldridge
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1998-02-12
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2019-02-10
Also published as: CN1224422C; DE69919984D1; AU764036B2; CN1299287A; JP2002502884A; IL137811A0; IL137811A; CA2320041A1; KR20010040867A; PT1053017E; EP1053017A2; DK1053017T3; EP1053017B1; BR9907883A; AU2598199A; KR100622716B1; ATE275421T1; WO1999040938A2; WO1999040938A3; DE69919984T2

Abstract

Composición inmunogénica que comprende una mezcla de antígeno del virus herpes simple y una cantidad adyuvante de interleucina 12, una suspensión acuosa mineral de alumbre y comprendiendo opcionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

Description

Vacunas que comprenden interleucina 12 y antígeno del virus del herpes simple.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune utiliza diversos mecanismos para atacar a los patógenos; sin embargo, no necesariamente se activan todos estos mecanismos después de la inmunización. La inmunidad protectora inducida por la vacunación depende de la capacidad de la vacuna para generar la respuesta inmune apropiada para resistir o eliminar el patógeno. Dependiendo del patógeno, ello puede necesitar una respuesta mediada por células y/o una respuesta humoral.

El paradigma actual sobre la función de las células T auxiliares en la respuesta inmune es que las células T se pueden separar en subconjuntos con base en las citocinas que producen y en que los diferentes perfiles de citocinas observados en dichas células determina su función. Dicho modelo de las células T incluye dos subconjuntos principales: células TH-1 que producen IL-2 e interferón \gamma (IFN-\gamma) que aumenta tanto la inmunidad celular como la humoral, y células TH-2 que producen IL-4, IL-5 e IL-10 que incrementan la respuesta humoral inmune (Mosmann et al., J. Immunol. 126:2348 (1986)). Es frecuentemente deseable incrementar la potencia inmunogénica de un antígeno para obtener una respuesta inmune más fuerte en el organismo que se está inmunizando fortaleciendo así la resistencia del huésped al agente portador del antígeno. Una sustancia que incrementa la inmunogenicidad de un antígeno administrado se conoce como que tiene actividad adyuvante. Por ejemplo, se ha demostrado que ciertos linfoquinas tienen actividad adyuvante, incrementando de esta forma la respuesta inmune a un antígeno (Nencioni et al., J. Immunol. 139:800-804 (1987); EP 285441 a Howard et al.).

La glicoproteína D (gD) es una glicoproteína de la envoltura del virus Herpex1 simples (HSV) tipos I y II. La gD de HSV ha demostrado ser un potente inductor de la inmunidad protectora contra las infecciones primarias y recurrentes por HSV en modelos animales [Mishkin et al., Vaccine 9:147-155 (1991); Landolfi et al., Vaccine 11:407-414 (1993)].

La IL-12 es producida por diversas células presentadoras de antígenos, principalmente los macrófagos y monocitos. Es un elemento crítico para la inducción de las células TH-1 expuestas a células T. La producción de IL-12 ó la capacidad para responder a ésta se ha demostrado que resulta esencial para el desarrollo de las respuestas protectoras tipo TH-1, por ejemplo, durante las infecciones parasitarias, más notablemente Leishmaniasis (Scott et al., patente U.S. nº. 5.571.515). Los efectos de IL-12 están mediados por ING-\gamma producidos por las células NK y las células auxiliares T. El IFN-\gamma es crítico para la inducción de anticuerpos IgG2a a los antígenos proteicos T dependientes [Finkelman and Holmes, Annu. Rev. Immunol. 8:303-33 (1990)] para la respuesta de IgG3 los antígenos independientes de T IgG3 [Snapper et al., J. Ep. Med. 175:1367-1371 (1992)]. La interleucina 12 (IL-12), inicialmente denominada factor estimulador de las células asesinas naturales, es una citocina heterodimérica [Kobayashi et al., J. Exp. Med. 170:827 (1989)]. La expresión y el aislamiento de la proteína IL-12 en células huésped recombinantes se describe en la solicitud de patente internacional WO 90/05147, publicada el 17 de Mayo 1990.

El documento WO96/14871 da a conocer composiciones inmunogénicas que comprenden un inmunógeno disuelto, o distribuido de otra forma, en un disolvente hidrófobo en ausencia de una fase hidrófila. En una forma de realización esta técnica anterior da a conocer que se co-disuelve un inmunógeno con una o más citocinas para incrementar la respuesta. Se indica que los ejemplos de citocinas adecuadas incluyen la IL-4, IL-10, IL-12 y el interferón \gamma.

El documento WO94/22473 da a conocer la mejora de la potencia de las vacunas en un huésped mamífero mediante la estimulación de la proliferación de los progenitores de las células B. En una forma de realización la potencia de la vacuna a gD de HSV asociada con alumbre se mejora mediante la administración de IL-7.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para vacunas que comprenden una mezcla de proteína D de virus del herpes simple, interleucina IL-12 y un mineral en suspensión. La IL-12 puede estar adsorbida en la suspensión mineral o simplemente mezclada con esta. En una forma de realización particular de la invención, la IL-12 está adsorbida en una suspensión mineral tal como alumbre (hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio). En una forma de realización particular, la IL-12 es IL-12 humana. La invención también se refiere a composiciones de vacunas que además comprenden un vehículo fisiológicamente aceptable. La invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende una mezcla de glicoproteína D de herpes simples y una cantidad adyuvante de IL-12, una suspensión mineral y, opcionalmente, comprendiendo un vehículo fisiológicamente aceptable.

Las composiciones de la presente invención modulan la respuesta inmune protectora al antígeno; es decir, la composición de vacuna es capaz de mejorar cuantitativamente y cualitativamente la respuesta de los anticuerpos del huésped vacunado y aumentar cuantitativamente la inmunidad celular en una respuesta protectora contra un patógeno. En una forma de realización particular de la invención, el antígeno es un antígeno vírico de herpes simples (HSV), tal como la glicoproteína D del cubierta del virus del herpes simple tipo I y/ó tipo II.

La presente invención también se refiere a procedimientos para preparar una composición de vacuna que comprende mezclar gD de HSV e IL-12 con una suspensión mineral. En particular, la IL-12 se adsorbe en la suspensión mineral. La invención también se refiere a procedimientos para inducir o incrementar, la respuesta inmune humoral y/o mediada por células del vacunado, para producir una respuesta inmune protectora, que comprende administrar a un vertebrado una cantidad efectiva de una composición de vacuna que comprende una mezcla de gD de HSV, IL-12 y un mineral en suspensión en una solución fisiológicamente aceptable. En particular, la IL-12 se adsorbe en la suspensión mineral.

Descripción detallada de la invención

Los estudios descritos en la presente solicitud se refieren a la utilidad de la IL-12 como adyuvante en una vacuna del virus del herpes simple (HSV). En consecuencia, la presente invención se refiere a composiciones de vacuna que comprenden una mezcla de gD de HSV, IL-12 y un mineral en suspensión. En una forma de realización particular de la presente invención, la IL-12 se adsorbe en una suspensión de mineral tal como el alumbre (por ejemplo, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio). Tales composiciones de vacuna modulan la respuesta inmune protectora contra HSV; es decir, la composición de vacuna es capaz de inducir la inmunidad mediada por células del huésped vacunado en una respuesta protectora contra el antígeno patógeno.

La IL-12 se puede obtener a partir de diversas fuentes adecuadas. Se puede producir mediante procedimientos de ADN recombinante; por ejemplo, el gen codificante de la IL-12 ha sido clonado y expresado en sistemas de huéspedes, lo que permite la producción de grandes cantidades de IL-12 humana pura. También de utilidad en la presente invención son los fragmentos o subunidades de la IL-12 con actividad biológica. Además, ciertas líneas de linfocitos T producen niveles elevados de IL-12, proveyendo de esta forma una fuente fácilmente disponible. Las fuentes comerciales de IL-12 pura humana y murina incluyen Genetics Institute, Inc. (Cambridge, MA)

El antígeno de la presente invención, p. ej., un antígeno HSV, se puede utilizar para inducir una respuesta inmune en el antígeno en un vertebrado tal como un huésped mamífero. Por ejemplo, el antígeno puede ser una proteína antigénica gD de HSV o una parte de ésta que retiene la capacidad para estimular la respuesta inmune.

El procedimiento de la presente invención comprende administrar a un mamífero, particularmente a un ser human u otro primate, una dosis inmunológicamente efectiva de una composición de vacuna que comprende una mezcla de un antígeno, p. ej., un antígeno gD de HSV una cantidad adyuvante de IL-12 y un mineral en suspensión. En particular, la IL-12 está adsorbida en la suspensión de mineral. Tal como se utiliza en la presente solicitud, una "cantidad adyuvante" de IL-12 significa una dosis de desde 1 nanogramo hasta aproximadamente 20 microgramos y más particularmente desde aproximadamente 100 nanogramos hasta aproximadamente 5 microgramos. Tal como se utiliza en la presente solicitud, una dosis de la composición de vacuna "inmunológicamente efectiva" significa una dosis que es adecuada para inducir una respuesta inmune. La dosificación en particular dependerá de la edad, peso y condición médica del mamífero a ser tratado, así como también del procedimiento de administración. Las dosis adecuadas serán fácilmente determinadas por los expertos en la materia. La composición de vacuna se puede administrar opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable, tal como disolución salina tamponada con fosfato o polioles de etanol o glicerina o propilenglicol. También se puede incluir una pequeña cantidad de detergente para incrementar la estabilidad de la vacuna.

La composición de vacuna puede opcionalmente comprender adyuvantes adicionales, tales como aceites vegetales o emulsiones de los mismos, sustancias surfactantes, p. ej., hexadecilamina, ésteres de aminoácidos octadecílicos, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetil dioctadecilamonio, N,N-dicoctadecil-N'-N'bis(2-hidroxietil-propano diamina), metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; poliaminas, p. ej., piran, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol; péptidos, p. ej., dipéptido de muramilo, dimetilglicina, tuftsina; complejos inmunoestimulantes; emulsiones de aceites; lipopolisacáridos tales como MPL®, (lípido A monofosforil 3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana); y geles minerales.

Los antígenos de la presente invención también se pueden incorporar en liposomas, coquelatos, polímeros biodegradables tales como poliláctidos, poliglicolidos y polilactido-co-glicolidos, o ISCOMS (complejos inmunoestimulantes) y también se pueden utilizar ingredientes activos suplementarios. Los antígenos de la presente invención también se pueden administrar en combinación con toxinas bacterianas y sus derivados atenuados. Los antígenos de la presente invención también se pueden administrar en combinación con otras linfoquinas que incluyen, sin quedar limitadas, interleucina-2, IFN-\gamma y GM-CSF.

Las vacunas se pueden administrar a un ser humano o a un animal a través de diversas rutas de administración que incluyen, pero sin quedar limitadas a, paraenteral, intraarterial, intradérmica, transdérmica (tal como mediante la utilización de un polímero de liberación retardada), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral e intranasal. La cantidad de antígeno utilizada en dichas vacunas oscilará dependiendo de la identidad del antígeno. El ajuste y manipulaciones de los rangos de dosis establecidos utilizados con los antígenos vehículo tradicionales para la adaptación a la presente vacuna está dentro de la capacidad de los expertos en la materia. Las vacunas de la presente invención están dirigidas al tratamiento de animales inmaduros y adultos de sangre caliente y, en particular, seres humanos. Típicamente, el antígeno y la combinación de IL-12/alumbre se administrarán a la vez.

La acción adyuvante de la IL-12 presenta múltiples implicaciones importantes. La capacidad adyuvante de la IL-12 puede incrementar la concentración de anticuerpos protectores producidos contra el antígeno en el organismo vacunado. Como consecuencia, se puede lograr una vacunación efectiva (es decir, protectora) con una cantidad menor de antígeno a la que normalmente sería necesaria. Tal reducción en la cantidad necesaria de antígeno puede conducir a una utilización más amplia de las vacunas cuya preparación resulta difícil y costosa. Además, la utilización de IL-12 como adyuvante puede incrementar la capacidad de los antígenos que son débilmente antigénicos o que son antígenos pobres para inducir una respuesta inmune. También podría proporcionar una vacunación más segura cuando el antígeno es tóxico en la concentración normalmente necesaria para una inmunización efectiva. Mediante la reducción de la cantidad de antígeno, el riesgo de reacciones tóxicas se reduce.

Típicamente, los regímenes de vacunación demandan la administración de antígenos a lo largo de un período de semanas o meses para estimular una respuesta inmune "protectora". Una respuesta inmune protectora es una respuesta inmune suficiente para proteger el organismo inmunizado de la enfermedad causada por un patógeno en particular o por patógenos contra los que está dirigida la vacuna. La IL-12, cuando se administra con un antígeno, tal como un antígeno de HSV, y se mezcla con o adsorbe en un mineral (p.ej., alumbre) en suspensión puede acelerar la generación de una respuesta inmune protectora. Ello puede reducir la duración de los regímenes de vacunación efectivos. En algunos casos, puede conducir a la generación de una respuesta protectora con una sola dosis. Las composiciones de vacuna de la presente invención también resultan útiles terapéuticamente, para reducir el número y la gravedad de los episodios sintomáticos en los sujetos ya infectados con HSV.

Como resultado del trabajo descrito en la presente solicitud, la coadministración de la vacuna de la subunidad de HSV con IL-12 adsorbida en alumbre en suspensión ha demostrado inducir un perfil de respuesta abrumador asociado a TH-1; ello es un patrón novedoso de inducción inmune para la vacuna de subunidad de gD. Tal como se describe a continuación en la presente solicitud, se han determinado los rangos de dosis de IL-12 funcionales en modelos preclínicos de inmunización con gD soluble y adsorbido en fosfato de aluminio. Los resultados descritos en la presente solicitud también muestran que la inmunización con la combinación citoquina/glicoproteína con o sin alumbre induce un perfil de anticuerpos asociado a TH-1.

La administración conjunta de vacuna e IL-12/alumbre tiene efectos adyuvantes en la capacidad de respuesta a vacuna de subunidad tal como indica el incremento en el nivel de anticuerpos anti-gD medido mediante ELISA y por neutralización del virus.

La glicoproteína D (gD), una glicoproteína de la envoltura de los virus del herpes simple tipo I y II que ha demostrado ser necesaria para la infectividad del virus y ser una diana principal de la respuesta inmune humoral y celular, sirve como un candidato primario de vacuna destinado a ser utilizado contra las infecciones primarias y recurrentes de virus herpes en seres humanos. En múltiples ensayos preclínicos la administración de la vacuna de subunidad gD formulada con inmunoadsorbentes a base de alumbre u otros inmunoadsorbentes actualmente aceptados para la utilización en seres humanos, se ha demostrado que induce un perfil de respuesta inmune atribuible a la estimulación de predominantemente linfocitos T auxiliares TH-2. Sin embargo, parece ser que la interacción de la enfermedad recurrente de herpes y el establecimiento de una función inmune apropiada necesitarán la inducción de una potente respuesta con perfil TH-1.

Los resultados de los trabajos descritos en la presente solicitud indican que la administración conjunta de IL-12 con gD soluble y adsorbida en AlPO_{4} produce un incremento cuantitativo en la respuesta inmune humoral y celular, así como también un cambio cualitativo en la respuesta humoral. Ello lo demuestra el perfil de subclases de IgG inducido por la vacunación en presencia de IL-12. Desde luego, la inducción preferencial de anticuerpos IgG2a, con su eficiente capacidad para la fijación de complemento es una de las características de un perfil de respuesta TH-1. La inmunomodulación de la respuesta inmune por administración de IL-12 también resulta evidente por el desplazamiento de la proporción y la magnitud de la secreción de IFN-\gamma (asociada a TH-1) en comparación con IL-4 (asociada a TH-2).

Además, es particularmente importante advertir la inducción de actividad citolítica del antígeno en los ratones inmunizados con vacuna de subunidad soluble administrada simultáneamente con IL-12. Este patrón de respuesta sugiere que la administración de IL-12 produce una cambio fundamental en el carácter de la respuesta inmune a vacunas de subunidad gD, debido a que las vacunas de subunidad gD raramente, si es que lo han hecho alguna vez, han demostrado capacidad para inducir actividad citolítica en estudios anteriores.

El espectro de respuestas inmunes inducida por dicha nueva formulación está relacionado de cerca con el inducido por las infecciones víricas naturales y está asociado con un patrón de inmunidad observado en los seres humanos seropositivos libres de enfermedad. En conjunto, estos resultados sugieren que la inmunoprotección mediada por la IL-12 proporciona un beneficio significativo para el establecimiento de un perfil de respuesta inmune efectiva en las intervenciones inmunoterapéuticas y/o profilácticas contra las enfermedades producidas por el virus del herpes simple.

Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar la presente invención y no se han de considerar como una limitación del ámbito de la presente invención.

Ejemplos Materiales y procedimientos Expresión y purificación de glicoproteía D del virus del herpes simple y preparación de la vacuna

La preparación de la proteína D (gD) del virus herpes simples ha sido descrita con anterioridad por Landolfi et al., [Vaccine 11(4):407-414 (1993)].

Diseño experimental

Se distribuyeron al azar ratones hembra Balb/C en los grupos indicados en la Tabla 1 (N = 10/grupo). En los días 0 y 21, los animales recibieron inóculos de la vacuna gD descrita anteriormente, por sí solos o mezclados con diversas dosis de IL-12, intramuscularmente en el muslo. Los animales fueron sangrados individualmente antes de la vacunación y a continuación a intervalos de 7 días. Se sacrificaron cinco ratones de cada grupo en los días 28 y 35 para cosechar células inmunes del bazo y lavados vaginales. El análisis del suero y los lavados vaginales incluyó la cuantificación por inmunoensayo asociado a enzima (EIA) de la respuesta inmune por las subclases de anticuerpos IgA e IgG al antígeno gD. La actividad de anticuerpos funcionales se ensayó mediante la capacidad del suero para neutralizar la infectividad por HSV. Las actividades mediadas por células se evaluaron en ensayos de linfocitos T citolíticos, análisis de linfoproliferación y patrones de secreción de citocinas.

Análisis EIA

Las respuestas de anticuerpo específico a gD de HSV de los sueros individuales se cuantificaron por EIA tal como se describe en York et al., [Baccine 13:1706-1712 (1995)].

En breve, se recubrieron placas de 96 pocillos durante 1 hora con gD purificada a una concentración de 20 ng/pocillo. Las placas se lavaron tres veces con 0,01 M PBS y 0,1% Tween-20, a continuación se bloquearon utilizando una disolución de PBS y 1% BSA. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se lavaron tres veces con 0,01 M PBS y 0,1% Tween-20. a continuación se añadieron diluciones seriadas del doble de suero en disolución salina tamponada con 0,05 M Tris a pocillos por duplicado y se incubaron durante 1 hora. Los pocillos se lavaron con 0,01 M PBS y 0,1% Tween-20 antes de añadir el anticuerpo secundario. Dicho anticuerpo consistió en IgG de cabra contra ratón marcado con peroxidasa de rábano (HRP) (diluido 1:2000 en TBS y 0,1% Tween-20) e IgG1 e IgG2a de cabra contra ratón biotinilada (400 ng/ml en TBS y 0,1% Tween-20). A los pocillos de detección de IgG1 e IgG2a se les añadió avidina-HRP a una concentración de 50 ng/ml. Después de una hora de incubación, los pocillos se lavaron antes de añadir el sustrato ABTS (sal diamónica de ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotioazolina)-6 sulfónico). La OD del color resultante se cuantificó a 405 nm y el título se determinó por extrapolación del punto final.

Neutralización del suero

Se valoró el título neutralización de HSV de los sueros individuales utilizando un procedimiento de ensayo de microneutralización tal como se describió anteriormente [Mishkin et al., Vaccine 9:147-153 (1991)].

En breve, crecieron células Vero a confluencia en placas de 96 pocillos de fondo plano. Los sueros a ensayar se inactivaron por calentamiento durante 30 minutos a 56ºC y a continuación se sometieron a diluciones seriadas del doble en medio de cultivo para dar volúmenes de 0,1 ml. A continuación se añadió un volumen igual de HSV1 o HSV2 (que contuvo aproximadamente 100 pfu de virus). Para los ensayos dependientes de complemento, se incluyó también 10% (peso/peso) complemento de cobaya. Las mezclas de virus/suero/(complemento) se incubaron durante 1 hora a 37ºC (5% CO_{2}) con agitación suave, antes de la adición directamente sobre las monocapas de células Vero. Se incluyeron en cada ensayo controles de virus (es decir, el medio sin suero), medio (es decir células no infectadas) y el complemento (es decir, medio sin suero o complemento). A continuación de la incubación a 37ºC, las células se recubrieron con 1% metilcelulosa. Las placas se incubaron a 37ºC (5% CO_{2}) hasta que se pudieron contar aproximadamente 50 placas en los pocillos controles de virus (es decir, 48-72 horas). Se enumeraron las placas y se definió el título como el inverso de la última dilución de suero que produjo una reducción de más del 50% en el número de
placas.

Respuesta linfoproliferativa

Los procedimientos para ensayar la linfoproliferación específica de HSV se han descrito anteriormente [Ishizaka et al., Viral Immunology 4:187-193 (1991)]. Se cosecharon células de bazo de los ratones y se mezclaron en RPMI suplementado (Roswell Park Memorial Institute número de medio nº 16640, un medio corriente para cultivo de tejidos utilizado en los sistemas de cultivo de linfocitos). Las células se sembraron a 2 x 10^{5} células viables/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano en 0,1 ml. Se incluyeron 5 réplicas de pocillos para cada antígeno estimulante in vitro utilizado. Estos incluyeron medio, homogenizados de células Vero, HSV1 (10^{5} pfu/pocillo inactivadas por calor), HSV2 (10^{5} pfu/pocillo inactivadas por calor) y glicoproteína D purificada de HSV2 (bgD2) recombinante expresada en baculovirus (20 ng/pocillo). Cada una de éstas fue suministrada en un volumen de 0,1 ml.

Las placas se incubaron a continuación durante 5 días a 37ºC (5% CO_{2}). Cinco a seis horas antes de la cosecha, cada pocillo fue pulsado con 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina en 25 ml de RPMI. Las células se cosecharon en filtros de fibra de vidrio utilizando un cosechador de células y la actividad incorporada se determinó utilizando un contador Betaplate.

Actividad citotóxica de las células T

Tal como se ha descrito con anterioridad (York et al., 1995) las células de bazo se utilizaron para la estimulación secundaria de la actividad CTL específica. En los presentes experimentos, las células de bazo se cosecharon 14 semanas post-inmunización. Se prepararon suspensiones de células de bazo y se trataron con 0,17% NH_{4}Cl (5 ml/bazo) durante 4 minutos a temperatura ambiente para eliminar hosmóticamente los eritrocitos. Las células se lavaron, contaron y ensayaron par determinar viabilidad por exclusión de azul Trypan.

Se utilizaron células de bazo de animales no inmunizados como presentadoras de antígeno (APC). Éstas se sometieron a irradiación-\gamma (2000R) y se infectaron a continuación con HSV1 (cepa NS) y HSV2 (cepa 186) con una multiplicidad de infección (MOI) de 5 durante 1 hora a 37ºC (5% CO_{2}) con agitación. Las células se lavaron una vez, se resuspendieron a 5 x 10^{6} células/ml y se incubaron durante otras 4 horas. A continuación se inactivó el virus mediante exposición a radiación UV de longitud de onda corta durante 15 minutos. Se añadió APC (1 ml que contuvo 5 x 10^{6} células) a 2 x 10^{7} células afectoras/pocillo en 5 ml de medio. Los cultivos se incubaron a continuación durante 5 días antes del ensayo de actividad citolítica por liberación de ^{51}Cr.

Las células efectoras se cosecharon de las placas a continuación de la re estimulación in vitro y se ensayaron para determinar la viabilidad mediante exclusión de azul de Trypan. Las concentraciones de células se ajustaron a continuación en el medio y se sembraron por triplicado en alícuotas de 200 \mul para producir la deseada proporción de efector:diana (E:T). A continuación se produjeron diluciones al doble.

Se cosecharon células diana A20 en números adecuados para ensayo. Éstas se infectaron con HSV1 y HSV2 a un MOI de 10 durante un periodo inicial de absorción de una hora, se lavaron y se incubaron durante 3 horas adicionales. Las células A20 no infectadas, utilizadas como controles, se infectaron simuladamente de la misma forma. Tras un período de incubación de 3 horas, 5 x 10^{6} a 1 x 10^{7} células diana A20 fueron precipitadas y resuspendidas en 0,2 ml de suero bovino fetal, al que se añadieron 200 \muCi de ^{51}Cr y se incubaron durante 1 hora (37ºC, 5% CO_{2}). A continuación se lavaron las células dos veces en 10 ml de RPMI, se resuspendieron en 1 ml de medio y se diluyeron para producir alícuotas de 100 con la proporción E:T adecuada.

Las células efectoras y las células diana se incubaron (37ºC, 5% CO_{2}) durante 4 horas, al final de las cuales se recogieron cuidadosamente 100 \mul de sobrenadante de cada pocillo y se valoró la emisión gamma en un contador gamma. La liberación total se determinó utilizando triplicados de pocillos de dianas marcadas tratadas con 2% Tween-20. La liberación espontánea se contó a partir de triplicados de pocillos de células diana marcadas incubadas durante 4 horas en medio solamente. El porcentaje de liberación específica se calculó utilizando la fórmula siguien-
te:

% \ \text{liberación específica} = \frac{(CPM_{experimental}) - (CPM_{espontánea})}{(CPM_{total}) - (CPM_{espontánea})} \ x 100

Análisis de citocinas

Tal como se describió anteriormente (York et al.,1995), el ensayo de inmunomancha unida a enzima (ELISPOT) se utilizó para contar directamente las células que secretan IL-4 e IFN-\gamma. En condiciones de esterilidad, se recubrieron placas mililitro de 96 pocillos de nitrocelulosa Milipore HA con volúmenes de 100 \mul de anticuerpo monoclonal anti-citocina a una concentración de 5 \mug/ml (anti-IFN-\gamma) o 2 \mug/ml (anti IL-4) en PBS estéril. Las placas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente y a continuación se lavaron 4 veces con agua estéril y a continuación 3 veces con PBS y 0,05% Tween-20. A continuación se bloquearon los pocillos utilizando 0,2 ml de RPMI 1640 y 1% BSA y se incubaron en 5% CO_{2} (37ºC) durante 10 minutos.

Durante este tiempo, se prepararon suspensiones de células a la concentración deseada.

La solución bloqueadora se eliminó lavando tres veces con PBS y 3 veces con PBS que contenía 0,05% Tween-20. Las células, a concentraciones y diluciones preestablecidas (es decir 1 x 10^{6}/pocillo), se inocularon en volúmenes de 0,1 ml en pocillos por triplicado. Las placas se incubaron durante 20 horas en un incubador de CO_{2} (37ºC). Las células se extrajeron mediante 3 lavados cada uno de ellos con PBS seguido de PBS y 0,05% Tween-20. A continuación se preparó MoAb biotinilado en PBS y 0,05% Tween-20 + 1% FBS a una concentración final de 0,25 \mug anti-IFN-\gamma/ml o 4 \mug anti-IL-4/ml y se añadió 0,1 ml de la disolución de anticuerpo a los pocillos. Las placas se incubaron durante la noche a 4ºC en una cámara húmeda.

Las manchas se revelaron mediante el lavado de las placas 3 veces con PBS y 0,05% Tween-20 antes de la adición de 0,1 ml/pocillo de anticuerpo de cabra contra biotina conjugado a peroxidasa diluido 1:400 en PBS y 0,05% Tween-20 + 1% FBS.

Para visualizar las manchas, las placas se lavaron 3 veces con PBS antes de la adición de 0,2 ml de sustrato. Esto se preparó mediante la disolución de 10 mg de 3-amino-9-etilcarbazol a 1 ml de dimetilformamida en un vial de vidrio seguido por la adición de 30 ml de tampón de 0,1 M acetato sódico. Justo antes de su utilización, se añadieron 15 \mul de H_{2}O_{2} a la disolución de sustrato. Las manchas se revelaron durante 5-15 minutos a temperatura ambiente y se detuvo el revelado mediante la adición de agua del grifo. Las manchas se contaron utilizando un microscopio de disec-
ción.

Resultados Respuesta de EIA

Las respuestas de las clases y subclases de IgG anti-gD se sumarizan en la Tabla 1. A los títulos inferiores a 50 (la primera dilución de suero) se les asignó un título de 25. El día 7, únicamente los ratones inoculados con HSV1 vivo mostraron títulos significativos de IgG total (Tabla1a). Sin embargo, se registró un nivel medible de actividad en los sueros de los animales que recibieron gD soluble e IL-12. En el día 28, se observó un patrón de respuesta incrementada en los ratones que recibieron vacuna de unidad soluble e IL-12 a todas las dosis de citosina, cuando se comparó con la vacuna soluble solamente. Aquí, las respuestas fueron máximas en los sueros de los ratones a los que se administró gD soluble con 1,0 \mug de IL-12. En los ratones que recibieron glicoproteína adsorbida en AlP0_{4}, únicamente se observaron respuestas de IgG con EIA incrementada solamente en los animales inmunizados con AlPO_{4} y gD más 0,2 \mug de IL-12, lo que produjo un incremento de aproximadamente 2 veces. En el día 35, se observó un efecto adyuvante de IL-12 dependiente de la dosis, en la respuesta total de anticuerpo IgG a gD soluble (sin AlPO_{4}).

La administración conjunta de 0,2, 1,0 y 5,0 \mug de IL-12 con gD produjo repuestas incrementadas 5-, 24- y 215 veces, respectivamente. Por el contrario, cuando la IL-12 se añadió a la gD adsorbida en AlPO_{4}, la respuesta máxima se produjo con 0,2 \mug de IL-12.

En el día 7, no se observó respuesta de IgG1 (Tabla 1b) en ninguno de los grupos de tratamiento excepto en el de los animales infectados con HSV1, en los que se observó un bajo nivel de actividad. A los títulos inferiores a 50 (la primera dilución de suero) se les asignó un título de 25. En el día 28, se observó la máxima repuesta de IgG1 anti-gD en los sueros de los ratones inmunizados glicoproteína adsorbida en AlPO_{4} sin IL-12. Desde luego, la adición de IL-12 a la vacuna adsorbida en AlPO_{4} produjo en una reducción clara y dosis dependiente de dicha respuesta. Por el contrario, la administración conjunta de IL-12 con gD soluble produjo una respuesta IgG1 incrementada en comparación con la de la subunidad. Sin embargo, ninguna formulación de IL-12 produjo un nivel de actividad tan grande como el observado sólo para la subunidad adsorbida en AlPO_{4}. En el día 35, los títulos de IgG1 decrecieron en todos los grupos. En este tiempo, los títulos de IgG1 en los ratones que recibieron gD soluble con IL-12 habían alcanzado niveles comparables a los observados a continuación de la inmunización con vacuna de subunidad adsorbida en AlPO_{4}.

Las respuestas de IgG2a anti-gD (Tabla 1c) fueron evidentes al día 7 en los animales inoculados con HSV1. A los títulos inferiores de 50 (la primera dilución de suero) se les asigno un título de 25. Una respuesta modesta se observó también en este tiempo con gD soluble que se había administrado con 0,2 o 5,0 \mug de IL-12. En el día 28, la administración de IL-12 produjo títulos de IgG2a sustancialmente incrementados. Ello fue particularmente evidente en los animales que recibieron gD soluble, en los que se observaron incrementos del título superiores a 1000 veces. La administración conjunta de IL-12 y vacuna adsorbida en AlPO_{4} también produjo un incremento significativo de los anticuerpos IgG2a específicos a gD. En este caso, la respuesta de anticuerpo IgG2a fue máxima cuando se utilizaron 0,2 \mug de IL-12, lo que sugiere que la IL-12 unida a alumbre incrementa significativamente la actividad biológica. En el día 35, el patrón de respuesta observado para la IgG total fueron en paralelo a la respuesta de IgG2a e indicó que la administración conjunta de IL-12 y la vacuna de subunidad gD produjo un efecto adyuvante significativo, así como también la inducción de títulos elevados de anticuerpo IgG2a.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1a Incremento mediante IL-12 de la respuesta de anticuerpo IgG en plasma a la inmunización con gD de HSV-2

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TABLA 1b Incremento mediante IL-12 de la respuesta de anticuerpo IgG1 en plasma a la inmunización con gD de HSV-2

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TABLA 1c Incremento mediante IL-12 de la respuesta de anticuerpo IgG2a en plasma a la inmunización con gD de HSV-2

3

Respuesta de anticuerpo secretado

Se ensayaron las secreciones vaginales para la actividad de anticuerpo tras la inmunización con gD formulada con IL-12. Se observó IgA anti-gD (Tabla 2a) en múltiples grupos de tratamiento. Los títulos máximos tuvieron lugar en las secreciones derivadas de ratones que recibieron gD soluble y 1,0 \mug de IL-12. Dicho grupo también mostró el título más elevado de IgG anti-gD (Tabla 2b) en el día 28. Se observó un título de IgG relativamente robusto en los ratones a los que se administró gD adsorbida en AlPO_{4} con 0,2 \mug de IL-12. A los títulos inferiores a 5 (la primera dilución de antisuero) se les asignó un título de 3. En el día 35, no hubo una significativa IgA específica a gD en los fluidos de lavados de vagina de ninguno de los grupos. Sin embargo, los animales inmunizados tanto con gD soluble o adsorbido en AlPO_{4} más 5,0 \mug de IL-12 mostraron marcados títulos de IgG específica al antígeno en los lavados de vagina.

TABLA 2a Respuestas de IgA anti-HSV-2 de la mucosa a gD formulada con IL-12

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TABLA 2b Respuesta de IgG anti HSV2 de la mucosa a gD formulada con IL-12

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Títulos de neutralización de HSV2 en suero

Los títulos de anticuerpo neutralizante incrementados por complemento (Tabla 3) aumentaron en forma dependiente de la dosis en el suero de los ratones que recibieron gD soluble con IL-12. Estos títulos se incrementaron en 5-, 15- y 50 veces con niveles de citocina de 0,2, 1,0 y 5,6 \mug, respectivamente. A los títulos inferiores a 10 (primera dilución de suero) se les asignó un título de 5. Tal como en el caso de la respuesta anti-gD medida por ELISA, la máxima respuesta neutralizante de virus inducida por gD adsorbida en alumbre fue inducida con 0,2 \mug de IL-12.

TABLA 3 Incremento por IL-12 de la respuesta plasmática de anticuerpo neutralizante a la inmunización con gD

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Respuestas linfoproliferativas

Las repuestas blastogénicas in vitro al antígeno recordado se resumen en la Tabla 4. Un antígeno de recuerdo es un antígeno que el huésped ha encontrado anteriormente; en el caso presente, el antígeno de recuerdo para los ratones inmunizados es gD. La utilización del término con respecto al HSV-1 y HSV-2 asume un elevado nivel de reactividad cruzada con la gD expresada por virus. No se observó ningún grupo que demostrase un elevado nivel de actividad inespecífica a los antígeno control de células Vero. Las respuestas heterólogas a los antígenos de HSV-1 se maximizaron en las células cosechadas de los ratones inmunizados con gD soluble y adsorbida en AlPO_{4} con 1,0 \mug de IL-12. Se registraron patrones de respuesta similares mediante estimulación in vitro con antígenos de HSV2 y gD. De forma interesante, las células de bazo de los ratones inoculados con HSV-1 mostraron respuesta a gD de HSV-2 en el experimento actual.

TABLA 4 Respuestas linfoproliferativas GD/IL-12

7

Respuestas de citocinas

Los perfiles de citocinas fueron determinados para grupos de ratones seleccionados utilizando una dosis de
1,0 \mug de IL-12 y se resumen en la Tabla 5. En comparación con la administración de gD soluble o adsorbida en AlPO_{4} administrada sola, la adición de IL-12 produjo un incremento significativo en la secreción de IFN-\gamma relativo a
IL-4.

TABLA 5 Perfiles de citocinas

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Actividad citolítica

Las respuestas CTL para los animales inmunizados con gD más 1,0 \mug de IL-12, o vacunas de control se resumen en la Tabla 6. Los animales inmunizados con HSV-1 produjeron una actividad citolítica relativamente uniforme a una proporción E:T que osciló entre 25:1 y 3:1. Se observaron niveles de muerte comparables en los cultivos de inmunocitos derivados de ratones inmunizados con gD soluble más 1,0 \mug de IL-12. No se observó una actividad citolítica selectiva en las células de bazo de ningún otro grupo vacunado o control.

TABLA 6 Actividad CTL

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Equivalentes

Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de verificar, utilizando únicamente experimentación de rutina, muchos equivalentes a las formas de realización específicas de la presente invención descritas en la presente solicitud. Se pretende que dichos equivalentes queden comprendidos en el ámbito de la presente invención.

Claims

1. Composición inmunogénica que comprende una mezcla de antígeno del virus herpes simple y una cantidad adyuvante de interleucina 12, una suspensión acuosa mineral de alumbre y comprendiendo opcionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

2. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que la interleucina 12 está adsorbida en la suspensión mineral.

3. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que la interleucina 12 es interleucina 12 humana.

4. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que el alumbre es hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.

5. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que el antígeno del virus del herpes simple se selecciona de entre el grupo consistente en glicoproteína D de herpes simples tipo 1, glicoproteína D de herpes simples tipo II y combinaciones de éstas.

6. Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha composición es una composición de vacuna.

7. Composición inmunogénica según la reivindicación 6, en la que la cantidad adyuvante de interleucina 12 está comprendida entre aproximadamente 1 nanogramo y aproximadamente 20 microgramos por dosis de vacuna.

8. Composición inmunogénica que comprende una mezcla de antígeno del virus del herpes simple, una cantidad adyuvante de interleucina 12 y una suspensión acuosa mineral de alumbre y comprendiendo opcionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable para su utilización como medicamento.

9. Utilización de una mezcla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de una composición de vacuna para inducir una respuesta inmune a un antígeno del virus del herpes simple.