ES2226428T3 - Nac1- un gen de planta que codifica para un factor de transcripcion implicado en el desarrollo del cotiledon y de la raiz lateral. - Google Patents

Abstract

Se describe un nuevo miembro de la familia NAC de Arabidopsis, NAC1. Este gen se aisló originalmente mediante la capacidad de su ADNc de alterar la morfología celular de la levadura S. pombe cuando se sobreexpresaba (Xia y col., 1996). El análisis Northern mostró que NAC1 se expresaba de forma específica tisular, con altos niveles en la raíz y bajos niveles en las hojas. Los experimentos con preparaciones completas in situ mostraron la expresión en raíces en división activa y meristemos de los brotes. La NAC1 comparte una alta homología en la secuencia de aminoácidos con otros miembros de los productos de los genes NAC en el N terminal. Los estudios de unión al ADN in vitro utilizando una proteína recombinante GSTNAC1 y diferentes derivados de NAC1 truncados demostraron una interacción entre la región -90 del promotor 35S y el dominio N terminal conservado de la proteína. Interesantemente, los ensayos en levaduras muestran que el C terminal del NAC1 fusionado con el dominio de unión al ADNde GAL4 puede activar la transcripción. El análisis de diferentes fusiones por deleción mostró que el dominio de transactivación está localizado en el C terminal de la proteína NAC1. Además, los ensayos con híbridos dobles demostraron que NAC1 puede homodimerizar y que el dominio de dimerización está localizado en la región N terminal conservada de la proteína. Se encontró una supuesta señal de localización nuclear bipartita de 21 pb en el dominio NAC N terminal conservado. Se produjeron Arabidopsis transgénicas usando el constructo de fusión GFP-NAC1 bajo el control de un sistema promotor-GVG inducible por dexametasona (Dex). El análisis de las líneas transgénicas que expresaban la proteína de fusión GFP-NAC1 bajo la condición de inducción por Dex reveló la localización nuclear del polipéptido quimérico in vivo. Estos datos indican que NAC1 pertenece a una familia recientemente identificada de factores de transcripción.

Description

NAC1- un gen de planta que codifica para un factor de transcripción implicado en el desarrollo del cotiledón y de la raíz lateral.

Antecedentes de la invención

Los genes NAC (incluyendo NAM, ATAF1, ATAF2 y CUC2) pertenecen a una familia de genes relativamente grande únicamente encontrados hasta ahora en plantas. Estos genes codifican para proteínas que están conservadas en sus \sim170 aminoácidos N terminales, pero que son altamente divergentes en sus C terminales. Estudios genéticos previos en petunias (Souer y col., 1996) y Arabidopsis (Aida y col., 1997) han sugerido que algunos miembros de la familia NAC juegan un papel en el establecimiento de un patrón del meristemo de los brotes y de las flores.

Los embriones de petunia portadores de la mutación sin meristemo apical (nam) no consiguen desarrollar un meristemo apical en los brotes. Los brotes ocasionales en plántulas nam portan flores que desarrollan diez primordios en lugar de cinco en el segundo verticilo. Los mutantes dobles con el gen homeótico pétalos verdes muestran que el nam actúa independientemente de la identidad del órgano en el verticilo 2, y también afecta a número de primordios en el verticilo 3. Sorprendentemente, el ARNm de nam se acumula en las células de los alrededores de los meristemos y los primordios. Se ha demostrado que nam juega un papel en la determinación de las posiciones de los meristemos y los primordios (Souer y col., 1996).

Las mutaciones en CUC1 y CUC2 (de COTILEDÓN EN FORMA DE COPA, "CUP-SHAPED COTYLEDON"), que son genes de Arabidopsis, provocan defectos en la separación de los cotiledones (órganos embrionarios), sépalos y estambres (órganos florales), así como en la formación de los meristemos apicales de los brotes. Estos defectos son más aparentes en el mutante doble. Los fenotipos de los mutantes sugieren un mecanismo común de separación de órganos adyacentes dentro del mismo verticilo en ambos embriones y flores. El gen CUC2 se clonó, y se averiguó que codifica para una proteína homóloga de la proteína NAM de la petunia (Aida y col., 1997).

Las publicaciones y otros materiales usados en esta invención para esclarecer los antecedentes de la invención o proporcionar detalles adicionales respecto a la práctica, están respectivamente agrupados, por conveniencia, en la Lista de Referencias anexa.

Resumen de la invención

Se describe un nuevo miembro de la familia NAC de Arabidopsis, NAC1. Este gen se aisló originalmente mediante la capacidad de su ADNc de alterar la morfología celular de la levadura S. pombe cuando se sobreexpresaba (Xia y col., 1996). El análisis Northern mostró que NAC1 se expresaba de forma específica tisular, con altos niveles en la raíz y bajos niveles en las hojas. Los experimentos con preparaciones completas in situ mostraron la expresión en raíces en división activa y meristemos de los brotes.

La NAC1 comparte una alta homología en la secuencia de aminoácidos con otros miembros de los productos de los genes NAC en el N terminal. Los estudios de unión al ADN in vitro utilizando una proteína recombinante GST- NAC1 y diferentes derivados de NAC1 truncados demostraron una interacción entre la región -90 del promotor 35S y el dominio N terminal conservado de la proteína. Interesantemente, los ensayos en levaduras muestran que el C terminal del NAC1 fusionado con el dominio de unión al ADN de GAL4 puede activar la transcripción. El análisis de diferentes fusiones por deleción mostró que el dominio de transactivación está localizado en el C terminal de la proteína NAC1. Además, los ensayos con híbridos dobles demostraron que NAC1 puede homodimerizar y que el dominio de dimerización está localizado en la región N terminal conservada de la proteína. Se encontró una supuesta señal de localización nuclear bipartita de 21 pb en el dominio NAC N terminal conservado. Se produjeron Arabidopsis transgénicas usando el constructo de fusión GFP-NAC1 bajo el control de un sistema promotor-GVG inducible por dexametasona (Dex). El análisis de las líneas transgénicas que expresaban la proteína de fusión GFP-NAC1 bajo la condición de inducción por Dex reveló la localización nuclear del polipéptido quimérico in vivo. Estos datos indican que NAC1 pertenece a una familia recientemente identificada de factores de transcripción.

Un aspecto de la invención es una planta transgénica que comprende un gen que codifica para NAC1 o una proteína funcionalmente equivalente (lo que significa una proteína que se une al mismo sitio de unión del ADN como lo hace NAC1, y que es idéntica en al menos el 70%, preferiblemente idéntica al 80%, más preferiblemente idéntica al 90%, y aún más preferiblemente idéntica al menos en el 95%, a NAC1) que hace que la planta transgénica crezca más grande que una planta no transgénica. La planta puede ser más grande porque es más pesada, porque tiene unas hojas más grandes, porque tiene tallos más gruesos, porque tiene más raíces y/o porque tiene unas raíces más grandes.

Un segundo aspecto de la invención es un gen que codifica para NAC1 o una proteína funcionalmente equivalente, en el que las plantas que son transgénicas para este gen crecen más grandes que una planta no transgénica.

Un tercer aspecto de la invención es NAC1 o una proteína funcionalmente equivalente, en el que si una planta se hace transgénica para un gen que codifica para NAC1 o dicha proteína funcionalmente equivalente, dicha planta transgénica crecerá más grande que una planta que no es transgénica.

Otro aspecto de la invención es una célula de una planta transgénica que contiene un gen que codifica para NAC1 o una proteína funcionalmente equivalente, que hace que la célula de la planta crezca más grande que una célula no transgénica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: expresión específica tisular del gen NAC1. Autorradiografía de inmunotransferencias en gel de ARN que contiene 10 ig de los ARN totales aislados de diferentes tejidos, según se indica. Se recogieron plántulas a partir de plantas de dos semanas de edad. Se recogieron hojas caulíferas (hoja), tallos principales y laterales (tallo), ramilletes de flores (flor) y silicuas de diferentes etapas de plantas de 35 a 40 días de edad crecidas en tierra. Las raíces se tomaron de plántulas de crecimiento vertical de dos semanas sobre placas SM. El filtro se hibridó con NAC1 radiomarcado en su C terminal, y después se resondó con la sonda de ADNr radiomarcado de 18S como control de carga.

Figura 2: estudio con preparación completa in situ de plántulas y flores NAC1. Las hibridaciones con preparaciones completas in situ se realizaron en plántulas y flores con una sonda específica antisentido marcada con digoxigenina (DIG) en su C terminal (A, B, C, D y E) y con una sonda sentido marcada con DIG (F y G). A y F son plántulas de 12 días de edad. Los materiales radiculares son de plántulas de 12 días, y D es una plántula de 7 días de edad. Las flores se tomaron de plantas de 40 días de edad crecidas en tierra.

Figura 3: unión de la proteína de fusión GST-NAC1 a la región -90 del promotor 35S de CaMV. (A) Afinidad de la proteína de fusión GST-NAC1 en la unión a las regiones -90 del promotor 35S. Las cantidades de proteínas son las siguientes: carril 1, 500 ng de proteína GST; los carriles 2 a 9 son proteínas de fusión NAC1; carriles 2 y 6, 10 ng; carriles 3 y 7, 100 ng; carriles 4 y 8, 250 ng; carriles 5 y 9, 500 ng). Como competidor frío se usó el mismo fragmento de ADN sin marcar. (B) Mapa de las diferentes deleciones de la fusión de NAC1 con GST. (C) Diferentes deleciones de la unión de la proteína de fusión NAC1 con la región -90 del promotor 35S de CaMV. Se usaron 20 ng de cada proteína recombinada.

Figura 4: interacción específica entre NAC1 y NAC1 en el ensayo del sistema de levadura de híbridos dobles. Las células de levadura HF7c fueron cotransformadas con plásmidos que expresaban GAL4^{BD} aislado o una fusión GAL4^{BD}-NAC1 y los plásmidos que expresaban GAL4^{AD} aislado o fusionado con NAC1. (A) Las células se extendieron en placas con o sin histidina más 3-AT 10 mM (Sigma) según la distribución mostrada en el centro de la imagen. La capacidad de crecer en ausencia de histidina depende de la reconstitución funcional de una actividad GAL4. (B) El mapa de las diferentes deleciones de la proteína de fusión NAC1 al vector pGA. (C) La capacidad de interacción entre las diferentes deleciones de las versiones de NAC1 en un ensayo en un sistema de híbridos dobles.

Figura 5: localización del dominio de transactivación en la proteína NAC1. Se clonaron diferentes versiones de deleción de NAC1 en el vector de unión al ADN Gal4 y el transformado en cepas de levadura es HF7c. La mezcla de transformación se colocó en placas MM con o sin complemento de histidina con los aminoácidos necesarios. Los resultados se tomaron de placas de tres días de crecimiento.

Figura 6: influencia de la sobreexpresión de NAC1 en plantas. (A) Plantas silvestres crecidas en ausencia de Dex. (B) Plantas silvestres crecidas en presencia de Dex. (C) Plantas transgénicas crecidas en ausencia de Dex. (D) Plantas transgénicas crecidas en presencia de Dex.

Figura 7: cambios en el desarrollo de los cotiledones en plantas antisentido específico C terminal. El SEM muestra la superficie abaxial del cotiledón. A y D (detalle) son silvestres, B y E (detalle) no son un fenotipo grave, C y F, G (detalle) son un fenotipo grave. Los recuadros con las letras A, B y C muestran las regiones que están detalladas.

Figura 8: se hicieron germinar semillas de plantas silvestres o transgénicas con NAC1 antisentido en medio MS o MS más Dex. (A) Tipo silvestre en ausencia de Dex; (B) Tipo silvestre inducido con Dex; (C) Tipo transgénico en ausencia de Dex; y (D) Tipo transgénico inducido con Dex.

Descripción detallada de la invención

Se aisló en gen nac1 en un proyecto para aislar el citoesqueleto vegetal, las células relacionadas con el ciclo y las proteínas relacionadas con la polaridad, usando Schizosaccharomyces pombe. Se transformó una biblioteca de ADNc de A. thaliana bajo el control del promotor nmt1 represible por tiamina de pREP5N en células silvestres de S. pombe. Un transformante mostró células elongadas y multiséptimas cuando el promotor era reprimido. Se aisló un clon de ADNc a partir de este transformante y se retransformó en S. pombe para confirmar que el cambio en la forma celular es debido a la expresión del ADNc. El ADNc aislado (At012) codifica para un único marco abierto de lectura (ORF) de 324 aminoácidos (ID SEC Nº 2). La supuesta secuencia proteínica se buscó frente al GenBank. Una búsqueda BLAST indicó que la proteína es nueva. Se encontró que el N terminal de la proteína contenía un dominio NAC, un dominio que se encuentra en los miembros de la familia de genes NAC (NAM, ATAF1, ATAF2, CUC2). Este dominio cubre los primeros 175 aminoácidos de la proteína. El resto de la proteína codificada por nac1 no tiene una alta homología con ninguna secuencia conocida.

La homología, en los polipéptidos, se mide típicamente usando programas informáticos de análisis de secuencia. Véase, por ejemplo, el Sequence Analysis Software Package de Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. El programa informático de análisis proteínico empareja secuencias similares usando medidas de homología asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparragina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

La familia de los genes NAC sólo se ha identificado en plantas. Estos genes codifican proteínas que están altamente conservadas en el N terminal pero que varían en el resto de la proteína. Los dos primeros miembros, ATAF1 y ATAF2, eran de Arabidopsis, y se aislaron por su capacidad de activar el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) en levaduras (H. Hirt, números de acceso al GenBank X74755 y X74756). El ADNc SENU5, aislado en estudios de envejecimiento de las hojas del tomate (número de acceso al GenBank Z75524; John y col., 1997), y de ka proteína NAM (Souer y col., 1996), el producto del gen nam de la petunia, son necesarios para el adecuado desarrollo de los meristemos apicales en los brotes, y se ha propuesto que determinan la localización de los meristemos. CUC2 (Aida y col., 1997) es un miembro de la familia NAM, y es un homólogo de Arabidopsis de NAM. La proteína NAP de Arabidopsis también es un miembro de la familia (Sablowski y Meyerowitz, 1998). Finalmente, GRAB1 (número de acceso al GenBank AJ010829) y GRAB2 (número de acceso al GenBank AJ010830) son dos miembros referidos más recientemente de la familia NAC. Estos proceden del trigo y pueden interactuar con la proteína RepA del virus enano del trigo (WDV). La trans-sobreexpresión de los genes GRAB1 y GRAB2 bajo el control del promotor 35S puede inhibir la replicación del WDV en cultivos celulares de trigo.

El trabajo aquí referido detalla el dominio NAC en cinco bloques basados en la conservación y la carga de cada bloque. La alineación de la secuencia de la proteína NAC1 con todas estas proteínas reveló que NAC1 tiene unas características similares a las de otros miembros de la familia NAC, que corresponde al recientemente identificado dominio NAC.

La estructura genómica de nac1 se analizó comparando la secuencia genómica con la secuencia del ADNc. El gen NAC1 está localizado en el cromosoma 1. Incluye dos intrones en la región codificante N terminal. El primer intrón tiene 1215 pares de bases y aparece dentro del codón para el aminoácido 67. El segundo intrón tiene 102 pares de bases y está localizado entre los codones de los aminoácidos 160 y 161. Se realizó una búsqueda de dominios, y condujo a la identificación de una supuesta señal de localización nuclear bipartita dentro del dominio NAC de NAC1. Esta secuencia de señalización de 21 aminoácidos está localizada desde el aminoácido 117 hasta el 137, y fue la primera encontrada en un miembro de la familia NAC. La realización de la misma búsqueda con los otros miembros referidos de la familia NAC no pudo revelar una señal similar. Se observaron homólogos NAC en una base de datos EST del arroz, pero no se observaron homólogos en otros organismos, tales como mamíferos, Drosophila y levaduras.

Regulación del desarrollo del gen NAC1

Para investigar los papeles del gen NAC1 durante el desarrollo de la planta se analizó su patrón de expresión mediante un análisis Northern usando una sonda específica nac1. Dado que los miembros de la familia NAC están muy conservados en sus N terminales, incluso a nivel del ADN, se usó una sonda C terminal. Se usaron 10 ig de ARN total de cada tejido para la hibridación. Se detectó un nivel de expresión relativamente alto de ARN de nac1 en las raíces (Figura 1). Se observó un nivel de expresión más bajo en plántulas de dos semanas de edad que contenían todo el tejido vegetal. Se detectó una expresión muy baja en material obtenido a partir de tallos y hojas. No se detectó expresión en etapas mezcladas de las silicuas ni en flores maduras e inflorescencias mezcladas, incluso después de una larga exposición.

Los estudios de preparaciones completas in situ de plantas de 7 días y de 12 días se realizaron usando ambas sondas sentido y antisentido de la región codificante C terminal del gen. Se observó expresión de nac1 en raíces en división activa y en meristemos apicales de los brotes (Figura 2). La expresión era especialmente alta en la región en división de la punta de la raíz (Figuras 2A y 2B) y la región de formación de raíces laterales (Figura 2C). Se detectó una expresión más baja en cotiledones y hojas jóvenes. Estos resultados se corresponden en su totalidad con los resultados del Northern. No se detectó una hidridación específica clara en la flor (Figura 2E). Tampoco se detectó ninguna señal en silicuas ni en tallos (datos no mostrados). No se observó ninguna señal específica en plántulas hibridadas con la sonda de ARN sentido (Figuras 2F y 2G).

Unión al ADN y dominios de unión al ADN

Las dos primeras familias de genes NAC, ATAF1 y ATAF2, se clonaron mediante su capacidad de activar un constructo promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) en levaduras. Estas dos proteínas, así como otros genes de la familia NAC, están conservadas en el dominio NAC N terminal. Las proteínas GRAB1 y GRAB2 del trigo también se unen a la región -500 del promotor 35S. El promotor 35S del CaMV contiene diversos elementos de unión al ADN conocidos. Se han identificado numerosos factores de transcripción vegetales que se unen a diferentes elementos de la región reguladora del promotor.

Para ensayar si la proteína NAC1 podría unirse al promotor 35S se usó inicialmente como sonda la región -90 del promotor 35S. Se clonó nac1 en el vector de fusión pGEX-4-2T de GST y se transformó en E. coli. La proteína de fusión recombinante GST se purificó, y se realizó un ensayo para ensayar la unión específica al ADN. Dado que se estaba ensayando una proteína de fusión GST, se usó la propia GST como control. La GST no tuvo capacidad para unirse a la región -90 del promotor 35S, incluso cuando se usaron 500 ng de proteína purificada (véase la Figura 3A). Se ensayaron diferentes cantidades de proteína GSTNAC1 purificada. Se detectó unión con tan poco como 10 ng de proteína, y con sólo 4 horas de exposición de la lámina (Figura 3A). Debe mencionarse que la proteína GST purificada sólo contenía aproximadamente el 10% de la forma de fusión GST intacta. La mayor parte de la proteína se degradó durante el crecimiento bacteriano y la purificación. Esto es debido a que después de añadir IPTG para inducir la expresión de la proteína, la bacteria no puede crecer bien, y la proteína comienza a degradarse antes de la purificación. La adición de un exceso de ADN competidor del promotor 35S frío impidió la formación del complejo ADN-proteína de una forma dependiente de la concentración (Figura 3A). Estos resultados demuestran que la proteína NAC1 se une específicamente a la región -90 del promotor 35S.

También se ensayó la unión de NAC1 a un elemento AS-1 y a una forma mutante del elemento, -83 a -63 del promotor 35S. Se han identificado factores de transcripción en cremallera vegetales que se unen a esta región. La afinidad de unión era reducida, y no se encontró una diferencia clara entre el elemento AS-1 original y la forma mutada. Este resultado indica que NAC1 tenía un sitio de unión al ADN diferente al de los factores de transcripción bZIP, y que las secuencias alrededor del elemento AS-1 son importantes para la unión específica de NAC1.

Para ensayar el dominio de unión al ADN de NAC1, se clonaron diferentes formas de deleción de nac1 en el vector de fusión GST, y las proteínas de fusión se aislaron para ensayar la capacidad de unión del ADN a la región -90 del promotor 35S. En este ensayo se usaron 20 ng de cada proteína. Los resultados se muestran en la Figura 3C. La forma truncada GSTNAC1 contenía los primeros 199 aminoácidos, el dominio NAC intacto. Esto mantenía una unión específica similar a la sonda de ADN. Una versión truncada que contenía únicamente los 3 primeros bloques intactos del dominio NAC y parte del bloque IV perdió la capacidad de unión al ADN. De forma similar, el complemento de esta forma de deleción, el resto de la proteína que contenía parte del bloque IV y el bloque V intacto, no se une a la sonda de ADN. En conjunto, estos resultados indican que el dominio de unión al ADN está localizado en el dominio NAC, y que el bloque IV es importante para la unión al ADN y que el bloque V no es suficiente para la unión al ADN.

Homodímeros de NAC1 y el dominio de dimerización

Los factores de transcripción generalmente forman dímeros cuando se unen al ADN. Para determinar si NAC1 forma dímeros usamos una técnica de híbridos dobles. El procedimiento se uso de forma eficaz para ensayar la dimerización y para estudiar la interacción proteína-proteína, incluyendo la dimerización. Se fusionó la NAC1 intacta tanto con un dominio de activación del ADN de Gal4 como con un dominio de unión al ADN, y se cotransformaron en una levadura indicadora. Se observó una clara interacción cuando NAC1 fue expresado por ambos vectores. Las levaduras fueron capaces de crecer en tres días, incluso cuando se aplicó 3-AT 10 mM al bloque de interacciones no específicas (Figura 4A). Debe mencionarse que cuando la NAC1 sólo se expresa en el vector de unión al ADN, puede autoactivar a bajos niveles el sistema, de forma que la levadura puede crecer muy lentamente (Figura 4A).

Para identificar la región de NAC1 requerida para la dimerización, construimos una serie de deleciones y analizamos su capacidad para formar complejos en levaduras. En primer lugar se realizó una deleción del C terminal desde el aminoácido 200 hasta el final de la proteína. Esto dejó una proteína con los primeros 199 aminoácidos. Este fragmento de proteína de 199 aminoácidos contiene el dominio NAC intacto, y fue capaz de formar dímeros con NAC1 intacta. Esta versión de 199 aminoácidos no dio señal de fondo, al igual que la versión silvestre completa de NAC1. Por lo tanto, la versión de 199 aminoácidos se usó como compañero fijo para ensayar otras deleciones. Se prepararon varias deleciones diferentes en el vector del dominio de activación (Figura 4B). Cuando se preparó la misma deleción (ausencia de la secuencia más allá del aminoácido 199) en pGA la interacción fue tan fuerte como con la proteína intacta. Pero cuando la deleción afectaba al bloque IV del dominio NAC y el constructo sólo contenía los primeros tres bloques intactos del dominio NAC, se anuló la formación de dímeros (Figura 4C). La deleción del N terminal, dejando sólo la última mitad del bloque IV y el bloque V intacto, dio como resultado una proteína incapaz de formar dímeros. Los datos apoyan fuertemente la conclusión de que el dominio NAM de NAC1 contiene el dominio de dimerización. El bloque IV es importante para la formación de dímeros, pero el bloque V por sí mismo no es suficiente para formar un dímero. La proteína NAC1 puede formar homodímeros, y esto se confirmó mediante filtración en gel. Cuando la bacteria expresaba una proteína de los primeros 199 aminoácidos de NAC1, el péptido purificado, incluyendo el dominio NAC completo, se movía al doble de tamaño en un gel natural al de un gel desnaturalizado.

Transactivación y dominio de transactivación

En el ensayo de híbridos dobles de levadura encontramos que NAC1 puede autoactivar el sistema a un nivel bajo, pero la deleción C terminal no puede. Por lo tanto, usamos un procedimiento modificado de un híbrido con el factor de transcripción híbrido para identificar el dominio de activación del gen NAC1. Se usó el vector pGBT8, que contiene sólo el dominio de unión al ADN de Gal4 pero no el dominio de activación. Se clonaron diferentes deleciones del gen NAC1 en este plásmido en una fusión con el dominio de unión al ADN de Gal4, y los plásmidos resultantes se transformaron en levaduras que contenían el gen indicador UAS_{gal1}-CYC1-HIS3. La selección se realizó sobre placas de histidina menos. Si la parte de la proteína de fusión contenía actividad de activación, debería reconstruirse la transcripción de Gal4 y activar el promotor de HIS3. Con síntesis de histidina, la levadura puede crecer en un medio sin histidina. El dominio de activación de Gal4 se usó como control positivo, y dio una actividad completa, según se muestra en la Figura 5. Como se mencionó anteriormente, la proteína NAC1 completa sólo dio una baja actividad de activación. La fusión N terminal que contenía los primeros 132 aminoácidos o los primeros 199 aminoácidos no dio actividad. De forma similar, una fusión con un fragmento peptídico de los aminoácidos 143-199 no dio actividad. Por el contrario, una fusión que contenía los aminoácidos 133 hasta el carboxi terminal activó completamente el gen indicador, dando una señal tan fuerte como el control positivo del factor de transcripción de Gal4. El uso de una fusión que contenía sólo los aminoácidos 143-269 también dio una actividad completa. Esto es una región aminoacídica altamente ácida. La fusión C terminal que contenía sólo los últimos 54 aminoácidos dio como resultado una baja actividad. Los resultados indican que el dominio de activación de NAC1 está localizado en el C terminal.

Debido a que la familia NAC sólo se ha observado en plantas y no en otros organismos, era importante comprobar la actividad de transactivación en plantas. Se proyectó un experimento in vivo para comprobar el dominio de activación. Se construyeron dos plásmidos. El primero portaba el casete terminal MCS-Nos de unión al ADN de Gal4 marcado con un promotor 35S de CaMV. El gen ensayado puede clonarse en MCS en marco con el dominio de unión al ADN de Gal4. El otro plásmido contiene el gen indicador constructo 6xUAS-TATA-Luc, que puede expresar luciferasa si algunas proteínas pueden unirse al elemento 6xUAS para activar el promotor. El cobombardeo con los dos plásmidos juntos a diferentes combinaciones demostró que el sistema es reproducible y aplicable. Usamos el dominio de activación del virus VP16 como control positivo, y dio una actividad muy alta. Por el contrario, ni el segundo plásmido solo (pTALuc) ni junto con el vector pGal dieron una actividad luciferasa significativa. Se obtuvo un resultado similar al del sistema de levadura. Se identificó una actividad de transactivación completa en el péptido de los aminoácidos 143-269. Los últimos 54 aminoácidos también dieron la actividad baja. El N terminal de NAC1 no dio actividad, ni tampoco el propio vector de control. Tanto en sistemas vegetales y de levadura, se ha demostrado que NAC1 contiene un dominio de transactivacion, y la región correspondiente a esta actividad está entre los aminoácidos 142-269.

Plantas de Arabidopsis transgénicas que sobreexpresan y subexpresan NAC1

En este estudio se usó un sistema transgénico inducible por glucocorticoides según se describió previamente (Aoyama y Chua, 1997). Un factor de transcripción regulado por glucocorticoides está codificado por GVG, cuya transcripción está controlada por el promotor 35S de CaMV. La transcripción del transgen está controlada por el promotor activado por glucocorticoides (6XUAS_{gal4}). Se clonaron los 1287 pares de bases del ADNc completo que codificaba para NAC1 (ID SEC Nº 1) en el vector de transformación vegetal binario pTA7002 en ambas direcciones, y separadamente se transformó en el ecotipo Arabidopsis thaliana lansberg mediante un procedimiento de transformación de las raíces. Se eligieron las líneas genéticas sobreexpresadas y subexpresadas del medio que contenía higromicina. Se eligieron seis líneas transgénicas independientes de sobreexpresión y 4 líneas independientes de subexpresión. Todas las líneas se segregaron para un locus de ADN-T según las proporciones de segregación resistentes a higromicina.

Las seis plantas transgénicas sobreexpresantes eran de tres fenotipos diferentes. Cuatro de las líneas eran de un fenotipo, mientras que las dos líneas restantes mostraron cada una un fenotipo diferente. Estos dos últimos fenotipos son similares a las plantas antisentido, como se describirá a continuación. Los estudios sobre las primeras cuatro líneas de fenotipo similar mostraron que esas plantas crecían más rápidamente y más grandes que las plantas no transgénicas, ambas en condiciones de crecimiento in vitro y en tierra. Se produjeron más raíces laterales cuando se emplearon condiciones inductoras, tales como sobre una placa vertical o en crecimientos plantcon. Los datos se presentan para condiciones de crecimiento in vitro. Se transfirieron plántulas de diferentes edades desde medio MS tanto a medio MS como a medio MS más dexametasona (Dex) 10 iM, y después se examinaron tras una semana de crecimiento. Se pesaron diez plantas de cada línea homocigótica después de limpiar el agar o la tierra de las plantas. Las plántulas de una semana de edad transferidas a medio Dex fueron de 1,1 a 1,3 veces más pesadas que las plantas no inducidas, las plántulas de 15 días fueron de 1,3 a 1,8 veces más pesadas, y las plántulas de 25 días de edad fueron de 1,4 a 2,6 veces más pesadas. El incremento de peso de las plantas inducidas procedía de unas hojas más grandes, unos tallos más gruesos y más raíces, siendo el tamaño de la hoja el contribuyente principal. Se analizaron las células epidérmicas foliares de diferentes partes de las plantas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La SEM mostró que el tamaño celular de las hojas viejas era más grande que el tamaño celular de control, mientras que no hubo una diferencia clara en el tamaño celular de las hojas de nuevo crecimiento. En la Figura 6 se muestran raíces de crecimiento vertical de una línea representativa. En las líneas inducidas con Dex se produjeron más raíces laterales y más largas. El ARN total se preparó a partir de plantas de 48 horas inducidas y falsos controles, y se midió mediante transferencias Northern sondadas con la sonda específica C terminal para nac1. Los resultados indicaron que las cuatro líneas transgénicas muestran que el transgen está expresado. El tamaño del ARNm del transgen es mayor que el tamaño del ARNm natural, y se distingue fácilmente.

Las dos líneas de sobrexpresión restantes, así como las cuatro líneas seleccionadas de plantas trangénicas antisentido, mostraron compartir algunas de las diferentes combinaciones de fenotipos. Una de las dos líneas de sobreexpresión y una de las líneas antisentido mostraron el fenotipo de cotiledón curvado hacia arriba en la etapa de plántula. No se detectaron fenotipos claros en etapas posteriores de desarrollo vegetativo de inflorescencias. Dos líneas antisentido mostraron fenotipos muy típicos en la etapa de plántula, así como el mutante cuc2. En este caso, se detectaron rosetas de plántulas con cotiledones únicos en forma de corazón, fusionados y más graves, a un bajo porcentaje, alrededor del 7-10% de las plántulas en germinación. La mayoría de estas plántulas, que no pueden producir el meristemo apical en los brotes, murieron más tarde.

Una de las líneas antisentido y una de las líneas de sobreexpresión no parecieron nada diferentes a las plantas inducidas durante todas las etapas de crecimiento vegetativo y de la plántula. Pero en la etapa de desarrollo de las inflorescencias, los órganos florales estaban afectados, particularmente pétalos y estambres. Los fenotipos se hallaron en las primeras numerosas flores de las inflorescencias. Las flores que tenían pétalos y estambres cortos, y las que tenían los fenotipos más graves, la flor no pudo abrirse. Algunas de ellas pueden abrirse, pero pueden observarse unos estambres claramente cortos. Estas flores eran machos y hembras estériles. Este tipo de fenotipo superpone la sobreexpresión de otro miembro de la familia NAC de Arabidopsis, el gen NAP.

Subexpresión en plantas de Arabidopsis transgénicas del gen NAC1 específico C terminal

Dado que los miembros de la familia de genes NAC están altamente conservados en el N terminal, no sólo a nivel de aminoácidos sino también a nivel de la secuencia de nucleótidos, los ácidos nucleicos antisentido de esta región afectarán a genes homólogos, según se muestra en la petunia. Por lo tanto, se prepararon constructos antisentido específicos del C terminal usando el vector pTA7002, y se transformaron en Arabidopsis según se describió anteriormente. Para este constructo usamos el fragmento C terminal de 0,6 kb BamHI-NotI. Las transferencias Northern sólo desarrollaron una banda, correspondiente al gen NAC1 en todos los tejidos cuando se usó este fragmento como sonda para las cuatro de las 6 líneas homocigóticas que elegimos para su análisis. No se detectaron fenotipos claros durante ninguna de las restantes etapas de crecimiento de la planta. Aquí se describe una línea representativa de las plantas antisentido C específica. Los cotiledones de las plántulas silvestres o no inducidas mostraron una ligera curvatura hacia abajo y una superficie suave. En la primera semana de germinación no se detectó un fenotipo claro en el desarrollo de los cotiledones, pero en plántulas de 10 días de edad, del 20 al 25% mostraron el fenotipo de cotiledones severos curvados hacia arriba. Unos pocos también mostraron un fenotipo curvado hacia atrás. El fenómeno puede detectarse fácilmente bajo microscopía luminosa o incluso apreciarse directamente ocularmente. En la etapa tardía pueden observarse unos puntos negros en la superficie de los cotiledones. Las células epidérmicas abaxiales se examinaron mediante SEM, y se encontró una expansión celular anormal sobre todas las superficies de los cotiledones, aunque se observaron diferentes niveles de severidad (Figura 7). Estas células perdieron la estructura normal en puzzle y se volvieron desordenadas, con diferentes tamaños y formas celulares (Figuras 7C, 7F y 7G). Los cotiledones del 75 al 80% de las plántulas que no mostraron un fenotipo severo o claramente curvado hacia arriba bajo microscopía luminosa también fueron examinados mediante SEM.

Los resultados de la SEM indicaron que las células superficiales de estos cotiledones también eran anormales. Las células parecían hinchadas y más expandidas.

Los fenotipos de las raíces se detectaron fácilmente en plántulas de crecimiento vertical. Las semillas germinaron en medio MS o MS más Dex. Después de una semana de germinación, las plántulas se transfirieron al mismo medio nuevo y crecieron de forma continuada durante una semana, y entonces se examinaron. Se produjeron unas pocas raíces en las plántulas que contenían la expresión antisentido C terminal. Tres líneas tenían raíces laterales más cortas o en menor cantidad, y una línea no tenía prácticamente raíces laterales. Las plántulas que tenían raíces laterales más cortas o en menor cantidad fueron examinadas al microscopio, y se encontró que las raíces laterales podían brotar pero no alargarse. Por lo tanto, las plántulas parecían contener menos raíces en comparación con plántulas no inducidas (Figura 8). Se obtuvieron unos resultados similares en plantas antisentido C terminal crecidas en líquido. Se añadieron plántulas de una semana de edad a medio MS líquido o MS más Dex, y después de 12 días de crecimiento las raíces no inducidas son mayores que las raíces inducidas de las plántulas.

La presente invención se detalla adicionalmente en los siguientes Ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustración, y no pretenden limitar la invención en modo alguno. Se utilizan técnicas estándar bien conocidas en la materia, o técnicas descritas específicamente a continuación.

Ejemplo 1 Material vegetal y condiciones de crecimiento

Para los experimentos se usó el ecotipo Arabidopsis thaliana lansberg. Se esterilizó la superficie de semillas con un lejía al 20% más Triton X-100 al 0,01%, y se lavaron tres veces con agua estéril. Tras el lavado final, se añadió agarosa al 0,15% a las semillas y se colocaron en placas con MS o MS más dexametasona (Dex) a diferentes concentraciones con un 3% de sacarosa. Las placas se incubaron a 4ºC durante dos días y se transfirieron a una sala de cultivo tisular a 22ºC en condiciones de día largo (16 horas de luz/8 horas de oscuridad). Después de dos a tres semanas, las plántulas se plantaron en tierra y se hicieron crecer en una cámara de crecimiento con un fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad a 22ºC y un 75% de humedad.

Para el tratamiento con Dex, se disolvió dexametasona (Sigma) en DMSO hasta conseguir una disolución de almacenamiento 100 mM de dexametasona, que se almacenó a -20ºC. Para plantas crecidas in vitro, se añadió Dex a las placas a 0,1, 1 y 10 iM. La Dex se añadió continuadamente al medio una vez por semana. Se usaron photocon y plantcon. Primero se disolvió la Dex en agua estéril a un volumen de 1/25 de medio, y después se añadió a la superficie del medio. Para el tratamiento de plantas crecidas en tierra, de añadió Dex a agua estéril que contenía un 0,01% de Tritón X-100 30 iM, y después se pulverizó para cubrir todas las superficies de la planta, una vez cada dos días. Para los falsos controles se pulverizó agua estéril que contenía un 0,01% de Tritón X-100 en el mismo número de plantas.

Ejemplo 2 Constructos para transformación y transformación de las plantas

Se usó como vector el plásmido de transformación binario pTA7002, que contenía el sistema completo de dos componentes inducible por glucocorticoides (Aoyama y Chua, 1997). Para los constructos de sobreexpresión y antisentido completo, se cortó en extremos romos un fragmento de 1287 pares de bases de SalI-NotI que contenía el ADNc completo que codificaba para NAC1, y se clonó en XhoI digerido y en el vector pTA7002 tratado con fosfatasa alcalina intestinal de becerro. Para preparar un constructo antisentido específico C terminal, el fragmento de 605 pares de bases BamHI-NotI que contenía la región específica C terminal del ADNc que codificaba para NAC1 se cortó en extremos romos y se clonó en el vector pTA7002, según se mencionó anteriormente. Para los constructos transgénicos que contienen el casete de fusión GFP-NAC1, un fragmento NaeI-SalI generado mediante PCR que sólo contenía la región codificante de NAC1 se clonó en el vector de fusión GFP intermedio pGFP2(GA)5II digerido por NaeI y SalI, para producir el plásmido pGFPNAC1. Entonces la fusión GFPNAC1 se cortó mediante XbaI más PacI y se clonó en el vector pTA7002 usando los mismos procedimientos que anteriormente. Se usaron las raíces de Arabidopsis thaliana lansberg como material vegetal para la transformación (Valvekens y col., 1988). Se hicieron germinar semillas T2 en placas SM que contenían 20 ig/ml de higromicina B para seleccionar las plantas resistentes, y se transfirieron a tierra para generar y obtener semillas T3 homocigóticas. Para el análisis detallado se usaron dos líneas independientes de plantas T4 homocigóticas con una única inserción a partir de cada constructo.

Ejemplo 3 Análisis Northern y análisis in situ con preparaciones completas

Se aisló el ARN total de diferentes tejidos usando el kit de preparación de ARN Qiagen. El análisis de transferencia Northern se realizó según Nagy y col. (1988). Para las sondas, se marcó un fragmento de PCR que cubría los aminoácidos 200 a 324 con \beta-^{32}P-dCTP usando un kit de marcado Rediprimed (Amersham International). Se fijaron plantas o flores completas para hibridaciones in situ con preparaciones completas. Se marcó ARN antisentido de la región específica C terminal de NAC1 con digoxigenina UTP (Boehringer Biochemica, Mannheim, Alemania). La hibridación se detectó con el fragmento Fab de anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina. Como sondas de control se prepararon transcritos sentido a partir del mismo clon, usando la transcriptasa T3.

Ejemplo 4 Análisis de un híbrido doble de levadura

El análisis de híbrido doble (Bartel y col., 1993; Fields y Song, 1989; Chevray y Nathans, 1992; Lee y col., 1995) se aplicó al análisis de dimerización. Se usó la cepa de levadura HF7c (MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu2-3.112 gal4-542 gal 80-538 LYS::GAL1_{UAS}- GAL1_{TATA}-HIS3 URA3::GAL4_{17mers(X3)}-CyC1_{TATA}-LacZ que contiene los dos genes indicadores LacZ e His3. La cotransformación de la levadura con los plásmidos portadores de los diferentes dominios de unión al ADN de Gal4 y la fusión del dominio de activación de Gal4 se realizó mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Burke y Olson, 1986; Rudolph y col., 1985; Sakai y col., 1984. En cualquier otro sitio se han descrito otras condiciones en detalle, y son bien conocidas por los expertos en la materia. Para corroborar la interacción entre las dos proteínas de fusión se ensayó la actividad \beta-galactosidasa mediante un ensayo de filtro en paralelo.

Se clonaron dos versiones de NAC1 en el dominio de unión al ADN de Gal4 en el vector pGBT8, un derivado de pGBT9 (Clontech) que contiene un policonector más versátil. El plásmido pGBNAC11-324 contiene el marco abierto de lectura completo para NAC1 fusionado con el dominio de unión al ADN de Gal4. El plásmido pGBNAC11-199 sólo contiene el ácido nucleico que codifica para los primeros 199 aminoácidos en el mismo vector. Se fusionaron diferentes versiones truncadas de NAC1 con el vector pGAD424 del dominio de activación de Gal4. El plásmido pGANAC11-324 contiene el marco abierto de lectura completo para NAC1. El plásmido pGANAC11-199 contiene el ácido nucleico que codifica para los primeros 199 aminoácidos de NAC1. El plásmido pGANAC11-142 contiene el ácido nucleico que codifica para los primeros 142 aminoácidos de NAC1, y el plásmido pGANAC1143-324 contiene el ácido nucleico que codifica para los aminoácidos desde el 143 hasta el C terminal del péptido.

Ejemplo 5 Transfección de células epidérmicas mediante bombardeo con partículas

Se cortaron pétalos en trozos de 2 x 2 cm y se colocaron sobre un filtro empapado con medio MS líquido. Se usaron 2 ig de cada combinación de plásmidos para cada brote, a un vacío de 68,58 cm de mercurio usando una presión de helio de 74,8 atm. Tras el bombardeo, las placas se incubaron en una sala de crecimiento vegetal hasta el día siguiente (16 horas) y se pulverizó luciferina 50 mM (Promega) sobre el material. Los resultados se comprobaron después de 10 minutos de incubación.

Ejemplo 6 Producción de proteínas de fusión GST y unión al ADN

El producto de la PCR que contenía la región codificante completa del gen NAC1 se clonó en pGEX-4-2T para producir el constructo de fusión pGST-NAC1. GST-NAC1 1-199 se generó digiriendo pGST-NAC1 con BAMHI y SalI y tratando con Klenow y religando para producir pGST-NAC1 1-199, que sólo contiene los primeros 199 aminoácidos de la proteína NAC1. GST-NAC1 1-132 se obtuvo cortando pGST-NAC1 con XhoI más SalI y religando. GST-NAC1 133-324 se construyó clonando un fragmento XhoI-NotiI del clon de ADNc original en pGEX-4-2T. Los plásmidos se transformaron en BL21(DE3) de E.coli. Los transformantes se hicieron crecer hasta una DO_{600} de 0,6 a 0,9, y después fueron inducidos para expresar la proteína de fusión a 30ºC durante 4 horas mediante la adición de IPTG a 0,4 mM. Las células se lavaron una vez con PBS y se resuspendieron en tampón GST (GCB: Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 1%, \beta-mercaptoetanol 10 mM, 5 ig/ml de cada leupeptina, pepstatina y aprotinina, y PMSF 1mM). Las células se lisaron mediante ultrasonidos en hielo (5 x 30 segundos) y los lisados se clarificaron mediante centrifugación (15 minutos a 12.000 rpm). La proteína de fusión fue recuperada mediante cromatografía de afinidad en lechos de glutatión-Sepharosa (Pharmacia). La reacción de unión al ADN contenía 2 x 10^{5} cpm de sonda de ADN, 5 il de 4 x tampón de reacción (NaCl 100 mM, HEPES 40 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, glicerol al 20%, \beta-mercaptoetanol 140 mM), 0,5 ig de polidIdC (Pharmacia), 1 il de Nonidet P40 al 1% y diferentes cantidades de proteínas, en un volumen total de 20 il. Se usaron 10 il de reacción sobre un gel natural 1/2 TBE al 4-6%. Un fragmento de BamHI de 100 pares de bases que contenía la región -90 de 35S se marcó con \beta-^{32}PdCTP en una reacción de marcaje de Klenow.

Lista de referencias bibliográficas

Aida, M. y col. (1997). The Plant Cell 9: 841-857.

Aoyama, T. y Chua, N-H. (1997). Plant J. 11: 605-612.

Bartel, P. L. y col. (1993). "Using the 2-hybrid system to detect protein-protein interactions". En Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, Oxford University Press, págs. 153-179.

Burke, D. T., y Olson, M. V. (1986). DNA 5: 325-332.

Chevray, P. M. y Nathans, D. N. (1992).Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 5789-5793.

Fields, S. y Song, O-K (1989). Nature 340: 245-246.

John, I. y col. (1997). Plant Mol. Biol.. 33: 641-651.

Lee, J. E., y col. (1995). Science 268: 836-844.

Nagy, F. y col. (1988). En Plant Molecular biology Manual, B4 (Gelvin, S. y Schilperoort, R. eds.). Dordrecht, Holanda; Kluwer Academic Publishers, págs. 1-12.

Rudolph, H. y col. (1985). Gene 36: 87-95.

Sablowski, R. W. M., y Meyerowitz, E. M. (1998). Cell 92: 93-103.

Sakai, K. y col. (1984). Mol. Cell. Biol. 4: 651-656.

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Valvekens, D. y col. (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 5536-5540.

Xia, Q. Y col. (1996). Plant J. 10: 761-769.

<110> Xie, Qi

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Chua, Nam-Hai

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Institute of Molecular Agrobiology, The National University of Singapore

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<120> NAC1 - UN GEN DE PLANTA QUE CODIFICA PARA UN FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN IMPLICADO EN EL DESARROLLO DEL COTILEDÓN Y DE LA RAÍZ LATERAL

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<130> 2248-115

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<140> No asignado aún

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<141> 11-02-1999

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1287

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CDS

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<222> (89) .. (1060)

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<400> 1

1

2

3

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<210> 2

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<211> 324

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 2

4

5

Claims (19)

1. Un ácido nucleico aislado que comprende las bases 89-1060 de la ID SEC nº 1.

2. Una proteína aislada formada por una secuencia aminoacídica mostrada según la ID SEC Nº 2.

3. Una proteína aislada al menos el 70% de dicha proteína de la reivindicación 2, en la que dicha proteína aislada es un homólogo funcional de NAC1 y puede formar dímeros, unirse a los mismos sitios de unión al ADN que NAC1 y hacer que plantas transformadas con un ácido nucleico que codifica para la proteína crezcan más grandes que una planta no transformada con un ácido nucleico que codifica para la proteína.

4. Un ácido nucleico que codifica para la proteína de la reivindicación 3.

5. Una planta transgénica que es transgénica para un ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Una célula de una planta transgénica que es transgénica para un ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

7. Un procedimiento para hacer crecer una planta que comprende la transformación de dicha planta con el ácido nucleico de la reivindicación 4 y el crecimiento de dicha planta, en el que dicha planta crecerá más grande que una planta silvestre.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho ácido nucleico está controlado por un promotor activado por glucocorticoides.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha planta se trata con un glucocorticoide.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho glucocorticoide es dexametasona.

11. Un procedimiento para hacer crecer una planta alterada genéticamente más grande que una versión silvestre de dicha planta, que comprende la sobreexpresión del polipéptido NAC1 de la ID SEC Nº 2 en dicha planta alterada, y en el que la expresión de NAC1 hace que la planta alterada genéticamente crezca más grande que la planta silvestre.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha planta alterada produce hojas más grandes que dicha versión silvestre.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha planta alterada produce raíces más grandes que dicha versión silvestre.

14. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha planta alterada produce más raíces laterales que dicha versión silvestre.

15. Un procedimiento para hacer crecer una planta alterada genéticamente más grande que una versión silvestre de dicha planta, que comprende la sobreexpresión de una proteína de la reivindicación 3 en dicha planta alterada.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha planta alterada produce hojas más grandes que dicha versión silvestre.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha planta alterada produce raíces más grandes que dicha versión silvestre.

18. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha planta alterada produce más raíces laterales que dicha versión silvestre.

19. Una planta transgénica producida mediante la inserción de un ácido nucleico de la reivindicación 4 en una planta silvestre.